KR20130100415A

KR20130100415A - 난황으로부터 제조된 미백효능을 지닌 인산화단백질이 함유된 화장품 조성물

Info

Publication number: KR20130100415A
Application number: KR1020120021575A
Authority: KR
Inventors: 남기창; 안동욱; 조철훈; 손준호
Original assignee: 순천대학교 산학협력단
Priority date: 2012-03-02
Filing date: 2012-03-02
Publication date: 2013-09-11

Abstract

본 발명은 난황으로부터 제조된 미백효능을 지닌 인산화단백질이 함유된 화장품 조성물에 관한 것으로, 유독성 유기용매를 사용하지 않고서도 난황의 인산화단백질을 분획하여 친환경적이고 잔류 유기용매에 의한 독성 위해요소를 극복할 수 있을 뿐 아니라, 난황 인산화단백질의 대량생산이 가능하며 미백 등의 다양한 기능성을 지닌 화장품 천연소재로 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 난황으로부터 제조된 미백효능을 지닌 인산화단백질의 제조방법은 난황을 물에 희석하는 단계와; 상기 희석된 난황을 원심분리 후, 1차 침전물을 수득하는 단계와; 상기 수득된 1차 침전물을 물에 희석하여 균질화 한 후 다시 원심분리 후 2차 침전물을 수득하는 단계와; 상기 수득된 2차 침전물을 에탄올과 혼합하거나 냉동 또는 열처리 후, 원심분리하여 인지질을 제거하는 단계와; 상기 인지질이 제거된 침전물을 염용액에 녹인 후, 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 및 상기 수득된 상층액의 염을 제거하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 한다.
특히, 계란의 난황은 콜레스테롤을 다량 함유하고 있어 성인병 위험을 겪는 중장년층과 심혈관질환자로부터 섭취가 꺼려지는 부위로, 난황의 성분을 분리하여 각각의 용도로 활용할 경우 계란 이용의 부가가치를 창출하고 다양한 형태의 화장품 개발이 가능하다.

Description

난황으로부터 제조된 미백효능을 지닌 인산화단백질이 함유된 화장품 조성물{COSMETICS INGREDIENT CONTAINING EGG YOLK PHOSPHOPROTEIN AS MELANOGENESIS INHIBITOR}

본 발명은 난황으로부터 제조된 미백효능을 지닌 인산화단백질이 함유된 화장품 조성물에 관한 것으로, 유독성 유기용매를 사용하지 않고서도 난황의 인산화단백질을 분획하여 친환경적이고 잔류 유기용매에 의한 독성 위해요소를 극복할 수 있을 뿐 아니라, 난황 인산화단백질의 대량생산이 가능하며 미백 등의 다양한 기능성을 지닌 화장품 천연소재로 이용할 수 있다.

멜라닌은 피부와 머리카락의 색깔을 좌우하는 주요인이다. 자외선으로부터 피부를 보호하기 위하여 멜라닌은 표피층 밑에 합성된다. 그러나 과도한 멜라닌 축적은 melasma, age spot 등의 피부침작을 일으키고 피부암 발생으로 확대될 수 있다. 멜라닌 생성을 조절하는 단백질의 억제효능을 지닌 물질은 의약 및 화장품 분야에서 큰 관심거리로 대두되고 있다.

최근 식품소재는 인체 활동의 유지 및 성장을 위한 단순한 에너지 공급 및 기초적인 영양원으로서의 역할뿐만 아니라 인간이 누릴 수 있는 건강에 대한 이로운 역할을 할 수 있는 생체기능성 물질(bioactive compounds)의 원천으로 관심이 모아지고 있다. 그러나 지금까지 식품에 적용되는 생리활성을 지닌 기능성 물질들은 대부분 한약재 및 허브 등과 같이 식물성 소재로부터 분획되거나 추출된 경우가 대부분이었다. 식물성 유래의 기능성 물질들은 자체적으로 또는 다른 일반식품 형태에 적용되어 그 기능성과 다양성을 부여하고 있다.

식품의 카테고리에서 큰 비중을 차지하는 식육이나 계란과 같은 동물성 식품은 영양적 가치가 강조되는 반면, 그 기능적 특성에 대한 관심과 연구가 미비하였으며, 동물성 식품으로부터 기능성 소재로서의 활용을 위한 특정 물질의 분리 및 산업적 활용에 대한 연구가 극히 제한되어 온 실정이다. 계란은 비교적 저렴한 대표적인 동물성 식품의 하나로 경제성을 지닐 수 있는 기능성 소재의 원천식품으로 기대되며, 주기적인 소비위축 및 공급과잉으로 인한 불안정한 수급을 극복할 수 있는 부가가치 활용 방안이 필요하고, 안전성이 취약한 신선식품으로 장기간 유통 가능한 기능성 소재로의 활용이 요구되고 있는 실정이다. 더욱이 기능성 강화 축산식품을 위한 소재 및 신기술이 대두되고 있으나, 앞서 언급된 바와 같이 식물성 물질로부터 추출되거나 분획된 물질이 대부분이어서 이러한 식물 유래의 기능성 소재를 그대로 축산식품에 이용할 경우 식물이 지니는 특유의 풍미가 육류 고유의 맛과 향을 지배(masking effect)하거나 조화롭지 못한 이질적인 풍미를 부여하여 식육 및 육제품에 그대로 적용하기 곤란한 경우가 많은 문제점을 지니고 있다.

생체기능성 물질(Bioactive compounds) 중에서 인산화된 펩타이드(phosphorylated peptides, phosphopeptides)는 그 고유의 분자생물학적 구조 및 기능으로 인해 많은 관심의 대상이 되고 있다. 인산화된 펩타이드(Phosphopeptides)는 실질적으로 포스포세린의 무리들(clusters of phosphoserines)을 포함하고 있는데, 이로 인해 다양한 금속 이온(bivalent or trivalent metal ions)과 결합하여 킬레이트화 되는 성질을 지니고 있다. 계란의 난황에 존재하는 단백질의 하나인 포스비틴(phosvitin)은 특유의 분자구조인 다수의 인산화된 잔기(phosphorylated residues)를 지닌 인산화단백질로서 다양한 생리활성을 나타낼 것으로 주목된다.

이러한 난황 인산화단백질을 분리하여 이용하기 위한 시도가 미비한 실정이며, 현재까지의 연구 단계는 난황 인산화단백질의 분리를 위해 유기용매를 사용한 실험실 수준의 저용량 분리방법에 머물러 있는 실정이며, 식품 첨가물 수준의 소재로 이용되기 위한 친환경적이며 경제성을 지닌 효율적인 대량생산 방법 및 체계가 확보되지 않은 실정이다. 통상적으로 알려진 인산화단백질 분리 방법들은 수율이 매우 낮고, 공정이 복잡하고 시간이 많이 소요되며 헥산과 같은 유독성 유기용매를 사용함으로써 식용으로서의 적합도가 낮고 경제적인 대용량의 분리가 불가능한 방법이다. 그리고, 현재 시약으로 제조되어 시판되는 정제된 인산화단백질의 하나인 포스비틴(phosvitin)의 판매가격은 g당 1,660천원으로 매우 고가로 산업에 적용할 수 있는 소재로서 한계를 지니고 있으며, 친환경적 공정 요소와 경제성을 지닌 유독성 유기용매를 사용하지 않은 난황 인산화단백질의 추출물을 함유한 미백 효능을 지닌 화장품 소재로 인식하거나 이용된 사례는 전무한 실정이다.

KR 10-2011-0113317 A2 (2011.10.17)

본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하고자 발명한 것으로, 난황으로부터 인산화단백질을 제조함에 있어서 유독성 유기용매를 사용하지 않고 무독성 유기용매인 에탄올 사용이나 온도처리를 통해 난황의 인산화단백질을 분획함으로써 친환경적이며 잔류 유기용매에 의한 독성 위해요소를 극복하고, 미백 등의 다양한 기능성을 지닌 화장품 천연소재로 이용할 수 있도록 함에 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따른 난황으로부터 제조된 미백효능을 지닌 인산화단백질이 함유된 화장품 조성물은 스킨, 로션, 에센스, 크림 제형으로 제조될 수 있다.

또한, 난황으로부터 제조된 미백효능을 지닌 인산화단백질의 제조방법은 난황을 물에 희석하는 단계와; 상기 희석된 난황을 원심분리 후, 1차 침전물을 수득하는 단계와; 상기 수득된 1차 침전물을 물에 희석하여 균질화 한 후 다시 원심분리 후 2차 침전물을 수득하는 단계와; 상기 수득된 2차 침전물을 에탄올과 혼합하거나 냉동 또는 열처리 후, 원심분리하여 인지질을 제거하는 단계와; 상기 인지질이 제거된 침전물을 염용액에 녹인 후, 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 및 상기 수득된 상층액의 염을 제거하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 미백효능을 지닌 난황 인산화단백질의 제조방법은 수용액과 무독성 유기용매를 이용함으로써 유독성 유기용매를 사용하지 않고서도 난황의 안산화단백질을 분획할 수 있는 친환경적이며 잔류 유기용매에 의한 독성 위해요소를 극복하는 효과가 있으며, 본 발명에 따라 제조된 난황 인산화단백질은 미백 등의 다양한 기능성을 지닌 화장품 천연소재로 이용할 수 있다.

특히, 계란의 난황은 콜레스테롤을 다량 함유하고 있어 성인병 위험을 겪는 중장년층과 심혈관질환자로부터 섭취가 꺼려지는 부위로, 난황의 성분을 분리하여 각각의 용도로 활용할 경우 계란 이용의 부가가치를 창출하고 다양한 형태의 화장품 개발이 가능하다.

도 1은 인산화단백질의 유무를 확인하기 위해서 웨스턴 블로팅하여 나타낸 것이다.
도 2는 cell viability 에 따른 인산화단백질의 농도를 나타낸 것이다.
도 3은 인산화단백질의 B16F10 cell에서 cAMP expression level 및 melanogenic protein의 발현수준을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 난황으로부터 제조된 미백 효능을 지닌 인산화단백질이 함유된 화장품 조성물의 온도순환에 따른 안정성을 평가한 것이다.

본 발명은 난황으로부터 제조된 미백 효능을 지닌 인산화단백질이 함유된 화장품 조성물에 관한 것으로, 더 상세하게는 난황으로부터 수용액과 무독성 유기용매를 이용함으로써 유독성 유기용매를 사용하지 않고서도 인산화단백질을 분획하여 인산화단백질이 함유된 스킨, 로션, 에센스, 크림 제형의 화장품 조성물을 제조하는 것이다.

먼저, 상기 난황으로부터 제조된 인산화단백질은,

무독성 유기용매를 사용하여 난황으로부터 인산화단백질을 제조하는 것으로,

(a) 난황을 물에 희석하는 단계;

(b) 상기 희석된 난황을 원심분리 후, 1차 침전물을 수득하는 단계;

(c) 상기 수득된 침전물을 물에 희석하여 균질화 한 후, 다시 원심분리 후 2차 침전물을 수득하는 단계;

(d) 상기 수득된 2차 침전물을 에탄올과 혼합한 후, 원심분리하여 인지질을 제거하는 단계;

(e) 상기 인지질이 제거된 침전물을 염용액에 녹인 후, 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 및

(f) 상기 수득된 상층액의 염을 제거하는 단계로 제조된 것이다.

또한, 상기 염이 제거된 상층액을 냉동건조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

여기서, 상기 난황은 계란, 오리알, 메추리알, 타조알 중 어느 하나를 선택하거나 둘 이상을 혼합한 것이며, 상기 난황을 2~3배의 물에 희석함으로써 pH를 6.0~8.0으로 유지하기 위함이다.

그리고, 상기 (a)단계에서 희석된 난황을 20~40분 동안 원심분리하여 1차 침전물을 수득하며, 상기 1차 침전물은 인산화단백질이 포함되어 있다.

그리고, 상기 (b)단계에서 수득된 1차 침전물을 3~5배의 물에 희석하여 균질화 한 후, 20~40분 동안 원심분리하여 2차 침전물을 수득하며, 상기 2차 침전물은 인산화단백질이 포함되어 있다.

그리고, 상기 (c)단계에서 수득된 2차 침전물을 3~5배의 에탄올과 혼합한 후, 10~20분 동안 원심분리하여 인지질을 제거하는 것으로, 상기 에탄올은 무독성 용매이며 안전성을 높일 뿐 아니라, 인체에 무해하기 때문에 식품 및 화장품으로 이용이 가능하고, 안전성 확보를 위한 엄격한 공정관리 등과 같은 비용의 증가가 발생하지 않으므로 경제적이다.

그리고, 상기 (d)단계에서 인지질이 제거된 침전물을 7~10배의 염용액에 녹인 후, 20~40분 동안 원심분리하여 인산화단백질이 함유된 상층액을 수득하는 것으로 상기 염용액은 염화나트륨(NaCl)용액인 것을 특징으로 하며, 상기 염화나트륨(NaCl)용액의 농도는 10~15%인 것이 바람직하다.

그리고, 상기 (e)단계에서 수득된 상층액에 남겨진 염을 제거할 경우에 그 방법으로는 초여과 또는 투석을 할 수 있다.

상기 (f)단계의 염 제거공정 이후에 냉동건조공정을 더 포함하는 것은 인산화단백질의 수득률 및 순도를 높이기 위함이다.

그리고, 상기 난황으로부터 제조된 인산화단백질은,

유기용매를 사용하지 않고 열처리하여 난황으로부터 인산화단백질을 제조하는 것으로,

(a) 난황을 물에 희석하는 단계;

(c) 상기 수득된 1차 침전물을 물에 희석하여 균질화한 후, 다시 원심분리 후 2차 침전물을 수득하는 단계;

(d) 상기 수득된 2차 침전물을 냉동 또는 열처리시키는 단계;

(e) 상기 온도처리된 2차 침전물에 물을 첨가하여 균질화한 후, 원심분리하여 인지질을 제거하는 단계;

(f) 상기 인지질이 제거된 침전물을 염용액에 녹인 후, 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 및

(g) 상기 수득된 상층액의 염을 제거하는 단계로 제조된 것이다.

그리고, 상기 (C)단계에서 수득된 2차 침전물을 -20℃ 이하에서 1시간 이상 냉동시키거나, 100℃ 이상에서 1시간 이상 열처리시키는 것으로, 유기용매를 사용하지 않고 인산화단백질을 원활하게 제조할 수 있게 된다.

그리고, 상기 (d)단계에서 온도처리된 2차 침전물에 0.3~0.5배의 물을 첨가하여 균질화 한 후, 20~40분 동안 원심분리하여 인지질을 제거하는 것이다.

염제거를 위한 공정은 ultrafiltration(10 kDa molecular weight cut-off)을 통해 대용량 생산이 가능하며, pH를 4.0으로 조정한 후 다시 4,070×g에서 30분간 원심분리를 실시한 후, 상층액을 동결건조한다. 화장품 제조의 경우 염을 제거하여 수용액 상태나 동결건조하여 분말상태로 상용화함으로써 적용 범위가 넓고 단백질 분리비용의 원가도 낮출 수 있다.

상기의 방법으로 제조된 난황으로 부터 제조된 인산화단백질을 포함한 화장품 조성물을 제조함으로써 친환경적이며 잔류 유기용매에 의한 독성 위해요소를 극복하는 효과가 있으며, 미백 등의 다양한 기능성을 지닌 화장품 천연소재로 이용할 수 있다.

또한, 난황으로부터 제조된 미백 효능을 지닌 인산화단백질이 함유된 화장품 조성물은 스킨, 로션, 에센스, 크림 제형으로 제조할 수 있다.

난황으로부터 제조된 미백 효능을 지닌 인산화단백질이 함유된 스킨 제형의 화장품 조성물은

난황으로부터 제조된 인산화단백질과,

정제수, 글리세린, 1,3-부틸렌글리콜(1,3-Butylene glycol),베타인(betaine), 1,2-헥산디올(1,2-Hexanediol), 디소듐 이디티에이(Disodium EDTA), 카보머(Carbomer)를 혼합한 수상혼합물과,

알코올, 토코페롤 아세테이트(Tocopheryl Acetate), 하이드로제네이드 캐스터 오일(Hydrogenated castor oil), 향료를 혼합한 에탄올상혼합물과,

중화제인 트리에탄올 아민(Triethanol Amine)으로 이루어진 것이다.

난황으로부터 제조된 미백 효능을 지닌 인산화단백질이 함유된 로션 제형의 화장품 조성물은

난황으로부터 제조된 인산화단백질과,

정제수, 글리세린, 1,3-부틸렌글리콜, 디소듐 이디티에이, 베타인, 1,2-헥산디올, 잔탐검(Xanthan gum), 카보머를 혼합한 수상혼합물과,

글리세롤 모노스테아레이트(Glycerol Mono stearate), 소르비탄 모노스테아레이트(Sorbitan MonoStearate), 세테아릴 알코올(Cetearyl Alchol), 아라키딜 알코올 (Arachidyl Alcohol), 토코페릴 아세테이트(Tocopheryl Acetate), 사이클로 펜타실록산(Cyclopentasiloxane), 디메틸실리콘오일(Dimethylpolysiloxane), 이소프로필 팔미테이트(Isopropyl Palmitate), 미네랄 오일, 바셀린을 혼합한 유상혼합물과,

향료와, 중화제인 트리에탄올 아민으로 이루어진 것이다.

난황으로부터 제조된 미백 효능을 지닌 인산화단백질이 함유된 에센스 제형의 화장품 조성물은

난황으로부터 제조된 인산화단백질과,

정제수, 디소듐이디티에이, 글리세린, 1,3-부틸렌글리콜, 1,2-헥산디올, 글리코실 트레할로스(Glycosyl Trehalose), 소듐 아크릴레이트(Sodium Acrylate), 잔탄검, 카보머를 혼합한 수상혼합물과,

아라키딜 알코올, 글리세롤 모노스테아레이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 이소프로필 팔미테이트, 사이클로 펜타실록산, 미네랄 오일을 혼합한 유상혼합물과,

향료와, 중화제인 트리에탄올 아민으로 이루어진 것이다.

난황으로부터 제조된 미백 효능을 지닌 인산화단백질이 함유된 크림 제형의 화장품 조성물은

난황으로부터 제조된 인산화단백질과,

정제수, 글리세린, 1,3-부틸렌글리콜, 디소듐 이디티에이, 베타인, 1,2-헥산디올, 소듐 아크릴레이트, 잔탐검, 카보머를 혼합한 수상혼합물과,

글리세롤 모노스테아레이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 스테아린산 (Stearic Acid), 세테아릴 알코올(Cetearyl Alchol), 폴리소베이트 60(Polysorbate 60), 글리세릴 모노스테아레이트, 토코페릴 아세테이트, 사이클로 펜타실록산, 디메틸폴리실록산(Dimethylpolysiloxane), 미네랄 오일, 이소프로필 팔미테이트, 카프릴릭(Caprylic), 바셀린을 혼합한 유상혼합물과,

향료와, 중화제인 트리에탄올 아민으로 이루어진 것이다.

이하에서 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위를 제한하는 것이 아님은 당업자에게 있어서 명백한 사실이다. 즉, 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 당업자에 의하여 용이하게 실시될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

실시예 1: 에탄올을 이용한 난황 인산화단백질의 제조

계란 흰자로부터 계란노른자(난황)를 분리하여, 2배의 증류수에 희석한 후,희석된 난황용액을 30분 동안 3,220×g에 원심분리하였다. 상층액은 제거하고 1차침전물을 수득하였다. 그리고 나서, 1차 침전물을 4배의 증류수에 희석한 후 균질화하고 30분 동안 3,220×g에 원심분리하였다. 상층액은 제거하고 2차 침전물을 수득하였다. 2차 침전물에 포함되어 있는 인지질은 4배의 85% 에탄올을 사용하여 제거한 후, 남은 침전물을 15분 동안 3,220×g에 원심분리하고 침전물을 수득하였다. 인지질이 제거된 침전물은 9배의 10% 농도인 염화나트륨(NaCl)에 녹이고, pH는 4.0으로 조절하며, 30분 동안 3,220×g에 원심분리하여 상층액을 Whatman No. 1 여과지를 통해서 걸러서 수득한 후, 염을 제거하기 위해 투석하였다.

실시예 2: 유기용매 사용을 배제한 난황 인산화단백질의 제조

계란 흰자로부터 계란노른자(난황)를 분리하여, 2배의 증류수에 희석한 후,희석된 난황용액을 30분 동안 3,220×g에 원심분리하였다. 상층액은 제거하고 1차침전물을 수득하였다. 그리고 나서, 1차 침전물을 4배의 증류수에 희석한 후 균질화하고 30분 동안 3,220×g에 원심분리하였다. 상층액은 제거하고 2차 침전물을 수득하였다. 수득된 2차 침전물을 -20℃ 이하에서 1시간 냉동하거나 100℃에서 1시간 열처리하였다. 상기 온도 처리한 2차 침전물에 물을 1/3 배 정도 첨가하여 1분간 균질화시킨 후, 30분 동안 3,220×g에 원심분리하여 인지질을 제거하였다. 인지질이 제거된 침전물은 9배의 10% 농도인 염화나트륨(NaCl)에 녹이고, pH는 4.0으로 조절하며, 30분 동안 3,220×g에 원심분리하여 상층액을 Whatman No. 1 여과지를 통해서 걸러서 수득한 후, 염을 제거하기 위해 투석하였다.

실시예 3 : 웨스톤 블로팅(Western blotting)

실시예 1 및 2에 따른 최종물질에서 인산화단백질의 유무를 확인하기 위해서 웨스틴 블로팅 테스트를 하였다.

그 결과는 도 1에 나타내었다. 왼쪽에서부터 첫번째는 인산화단백질의 대조구이며, 두번째는 아무것도 처리하지 않은 것이며, 세번째는 실시예 1 및 2에 따른 최종물질이다. 따라서, 최종물질에서 인산화단백질이 추출되었다는 것을 알 수 있다. 수확량은 달걀 노른자의 1g당 인산화단백질의 12mg을 포함한다는 보고에 근거하여 산출되었다.(Juneja and Kim, 1997) 결과적으로, 10% 염화나트륨(NaCl)에 의해 얻어진 마지막 용액에 있는 인산화단백질의 수득률은 대략 97%인 것처럼 보였다. 인지질이 제거된 침전물 100g 중에 10% 염화나트륨에 의해 추출된 상층액을 나타낸 것이다. Yield(%)는 달걀 노른자의 1g는 12mg 인산화단백질을 포함한다는 것을 추정할 때 얻어지는 수득률로 약 95.54%이다.

실험 1 : 난황인산화단백질 분획물의 화장품 소재로서의 기능성 분석

1) Tyrosinase activity 및 melanin 합성 억제 효능

천연물 또는 화합물의 피부미백효과 검증을 위해 쓰이는 보편적인 in vitro test인 mushroom tyrosinase를 이용한 tyrosinase inhibition effect를 관찰하였다. 난황으로부터 제조된 인산화단백질의 농도가 높아짐에 따라 tyrosinase inhibition effect 또한 높아졌다.

그 결과는 아래 표 1에 나타내었다.

		Percentage of control
	Concentration (㎍/mL)	Tyrosinase activity	Melanin content
인산화단백질	5	64.1 ± 4.26^a	98.8 ± 0.25^a
	10	59.9 ± 0.90^bc	96.3 ± 1.31^a
	50	57.7 ± 0.61^c	82.5 ± 1.69^b
Ascorbic acid	5	62.6 ± 2.45^ab	83.9 ± 4.72^b
	10	43.8 ± 1.28^d	75.9 ± 0.45^c
	50	32.5 ± 1.06^e	58.0 ± 1.38^d

2) B16F10을 이용한 cell viability

B16F10 melanoma cells를 이용한 MTT assay 방법(통상적인 방법이므로 구체적인 조건 명시는 생략함)에 의한 cell viability 측정 결과 난황으로부터 제조된 인산화단백질의 농도가 5~500μg/mL 범위에서 변화가 없는 것으로 나타나 세포독성학적으로 안전한 것을 알 수 있다.

3) B16F10 cell을 이용한 tyrosinase inhibition activity

In vitro 실험과 함께 in vivo로 B16F10 melanoma cells를 이용하여 세포내 tyrosinase inhibition activity를 측정한 결과 in vitro 실험 결과에 비해 ascorbic acid와 난황으로부터 제조된 인산화단백질의 활성 차이가 현저히 줄어들었음을 알 수 있다.

그 결과는 도 2에 나타내었다.

4)B16F10 cell에서 cAMP expression level 및 melanogenic protein의 발현

난황으로부터 제조된 인산화단백질을 농도별 투여 결과 B16F10 cell에서 cAMP 발현이 낮아지고 이에 따라 tyrosinase 발현이 현저하게 낮아짐을 알 수 있었다. 이와 함께 이러한 기작에 관여하는 단백질(효소)인 tyrosinase-related protein 1(TRP-1), TRP-2, microphthalmia-associated transcription factor(MITF)의 발현 수준도 현저히 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. 이는 mRNA 발현 양상과도 동일함을 알 수 있었다. 난황으로부터 제조된 인산화단백질 5, 10, 50μg/mL 수준에서 tyrosinase 70, 64, 60%, TRP-1 95, 90 ,87%, TRP-2 99,98,88%, MITF 97, 86, 68%의 감소효과가 있다.

그 결과는 도 3에 나타내었다.

상기의 결과를 요약해 볼 때 계란 난황에서 추출한 인산화단백질은 피부 미백효과를 나타내기에 충분한 가능성을 내포하고 있어 기능성 화장품의 소재로 적용이 가능할 것이다.

실험 2 : 난황인산화단백질을 첨가한 화장품 제형

1) 스킨제형 실험

본 발명에 따른 난황으로부터 제조된 인산화단백질을 첨가한 스킨은 표 2의 처방에 따라 제조하였다. 수상(A)과 에탄올상(B)을 나누어 완전 용해시킨 후, agi mixer(T.K. Homo Mixer Mark Ⅱ, Tokushu kika kogyo Co., Ltd. Osaka, Japan)를 이용하여 1,500rpm에서 2분간 혼합하고, C상을 넣고 3분간 혼합 시킨 후 D상을 첨가하여 3분간 혼합시켰다.

Phase	INCI name	Contents (%)
Phase	INCI name	S-00	S-0.5	S-1	S-2	S-3	S-4
수상 (A)	PURIFIED WATER	74.30	73.80	73.30	72.30	71.30	70.30
	GLYCERINE	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00
	1,3-BUTYLENE GLYCOL	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00
	BETAIN	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00
	1,2-HEXANEDIOL	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00
	DISODIUM EDTA	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02
	CARBOMER	10.00	10.00	10.00	10.00	10.00	10.00
에탄 올상 (B)	ALCOHOL	6.00	6.00	6.00	6.00	6.00	6.00
	TOCOPHERYL ACETATE	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02
	HYDROGENATED CASTOROIL	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50
	FRAGRANCE	0.06	0.06	0.06	0.06	0.06	0.06
C	TRIETHANOLAMINE	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10
D	난황으로부터 제조된 인산화단백질	0.00	0.50	1.00	2.00	3.00	4.00
	합계	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0

2) 로션제형 실험

본 발명에 따른 난황으로부터 제조된 인산화단백질을 첨가한 로션은 표 3의 처방에 따라 제조하였다. 수상(A)과 유상(B)을 나누어 80℃까지 가열하여 용해시킨 후, Homo mixer (T.K. Homo Mixer Mark Ⅱ, Tokushu kika kogyo Co., Ltd. Osaka, Japan)를 이용하여 3,000rpm에서 3분간 유화하였다. D, E상을 넣고 3분간 유화한 후, 30℃까지 냉각한 후 탈포하였다.

Phase	INCI name	Contents (%)
Phase	INCI name	L-00	L-0.5	L-1	L-2	L-3	L-4
수상 (A)	PURIFIED WATER	58.52	58.02	57.52	56.52	55.52	54.52
	GLYCERINE	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00
	1,3-BUTYLENE GLYCOL	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00
	DISODIUM EDTA	0.03	0.03	0.03	0.03	0.03	0.03
	BETAIN	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00
	1,2-HEXANEDIOL	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00
	XANTHAN GUM	4.00	4.00	4.00	4.00	4.00	4.00
	CARBOMER	10.00	10.00	10.00	10.00	10.00	10.00
유상 (B)	GLYCEROL MONOSTEARATE	0.60	0.60	0.60	0.60	0.60	0.60
	SORBITAN MONOSTEARATE	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50
	CETEARYL ALCHOL	0.20	0.20	0.20	0.20	0.20	0.20
	ARACHIDYLALCOHOL /BEHENYLALCOHOL /ARACHIDYLGLUCOSIDE	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50
	TOCOPHERYL ACETATE	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05
	CYCLOPENTASILOXANE	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00
	DIMETHYLPOLYSILOXANE	0.40	0.40	0.40	0.40	0.40	0.40
	ISOPROPYL PALMITATE	4.00	4.00	4.00	4.00	4.00	4.00
	MINERAL OIL	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00
	VASELINE	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00
D	TRIETHANOLAMINE	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10
D	FRAGRANCE	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10
E	난황으로부터 제조된 인산화단백질	0.00	0.50	1.00	2.00	3.00	4.00
	합계	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0

3) 에센스제형 실험

본 발명에 따른 난황으로부터 제조된 인산화단백질을 첨가한 에센스는 표 4의 처방에 따라 제조하였다. 수상(A)을 80℃까지 가열하여 용해시킨 후 유상(B) 또한 80℃까지 가열하여 수상(A+B)상과 같이 Homo mixer (T.K. Homo Mixer Mark Ⅱ, Tokushu kika kogyo Co., Ltd. Osaka, Japan)를 이용하여 3,000rpm에서 3분간 유화하고, 45℃까지 냉각하였다. C, D상을 넣고 3분간 유화한 후, 30℃까지 냉각한 후 탈포하였다.

Phase	INCI name	Contents (%)
Phase	INCI name	E-00	E-0.5	E-1	E-2	E-3	E-4
수상 (A)	PURIFIED WATER	66.32	65.82	65.32	64.32	63.32	62.32
	DISODIUM EDTA	0.020	0.020	0.020	0.020	0.020	0.020
	GLYCERINE	4.000	4.000	4.000	4.000	4.000	4.000
	1,3-BUTYLENE GLYCOL	3.000	3.000	3.000	3.000	3.000	3.000
	1,2-HEXANEDIOL	3.000	3.000	3.000	3.000	3.000	3.000
	GLYCOSYL TREHALOSE/HYDROGENATED STARCH HYDRXLSATE	2.000	2.000	2.000	2.000	2.000	2.000
	SODIUM ACRYLATE /SODIUM ACRYLOY METHYL TAURATE COPOLYMER /ISOHEXA DECANE/POLYSORBATE 80	0.300	0.300	0.300	0.300	0.300	0.300
	XANTHAN GUM	4.000	4.000	4.000	4.000	4.000	4.000
	CARBOMER	6.000	6.000	6.000	6.000	6.000	6.000
유상 (B)	ARACHIDYLALCOHOL /BEHENYLALCOHOL/ ARACHIDYLGLUCOSIDE	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000
	GLYCEROL MONOSTEARATE	0.800	0.800	0.800	0.800	0.800	0.800
	SORBITAN MONOSTEARATE	0.400	0.400	0.400	0.400	0.400	0.400
	ISOPROPYL PALMITATE	2.000	2.000	2.000	2.000	2.000	2.000
	CYCLOPENTASILOXANE	4.000	4.000	4.000	4.000	4.000	4.000
	MINERAL OIL	3.000	3.000	3.000	3.000	3.000	3.000
C	TRIETHANOLAMINE	0.060	0.060	0.060	0.060	0.060	0.060
C	FRAGRANCE	0.100	0.100	0.100	0.100	0.100	0.100
D	난황으로부터 제조된 인산화단백질	0.000	0.500	1.000	2.000	3.000	4.000
		100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0

4) 크림제형 실험

본 발명에 따른 난황으로부터 제조된 인산화단백질을 첨가한 크림은 표 5의 처방에 따라 제조하였다. 수상과 유상을 나누어 80℃까지 가열하여 용해시킨 후, Homo mixer (T.K. Homo Mixer Mark Ⅱ, Tokushu kika kogyo Co., Ltd. Osaka, Japan)를 이용하여 3,000rpm에서 3분간 유화하고, C,D상을 넣고 8분간 유화한 후, 30℃까지 냉각한 후 탈포하였다.

Phase	INCI name	Contents (%)
Phase	INCI name	C-00	C-0.5	C-1	C-2	C-3	C-4
수상 (A)	PURIFIED WATER	42.30	41.80	41.30	40.30	39.30	38.30
	GLYCERINE	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00
	1,3-BUTYLENE GLYCOL	4.00	4.00	4.00	4.00	4.00	4.00
	DISODIUM EDTA	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02
	BETAIN	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
	1,2-HEXANEDIOL	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00
	SODIUM HYALURONATE	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
	XANTHAN GUM	4.00	4.00	4.00	4.00	4.00	4.00
	CARBOMER	20.00	20.00	20.00	20.00	20.00	20.00
유상 (B)	GLYCEROL MONOSTEARATE	1.20	1.20	1.20	1.20	1.20	1.20
	SORBITAN MONOSTEARATE	0.70	0.70	0.70	0.70	0.70	0.70
	STEARIC ACID	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
	CETEARYL ALCHOL	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00
	POLYSORBATE 60	0.80	0.80	0.80	0.80	0.80	0.80
	GLYCERYL MONOSTEARATE	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
	TOCOPHERYL ACETATE	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10
	CYCLOPENTASILOXANE	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00
	DIMETHYLPOLYSILOXANE	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50
	MINERAL OIL	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00
	ISOPROPYL PALMITATE	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00
	CAPRYLIC/CAPRIC ACID TRIGLYCERIDE	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00
	VASELINE	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
C	TRIETHANOLAMINE	0.20	0.20	0.20	0.20	0.20	0.20
C	FRAGRANCE	0.18	0.18	0.18	0.18	0.18	0.18
D	난황으로부터 제조된 인산화단백질	0.00	0.50	1.00	2.00	3.00	4.00
		100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0

5) 온도에 따른 안정성 시험법

온도에 따른 안정성 시험법은 소정의 온도조건(0, 25, 38, 45℃)에 보관하여 경시적 변화에 따른 상태변화를 아래 표 6의 조건으로 평가하였다.

Temp.	Period (day)	Check points
0 25 38 45	1 3 5 7 15 30 60	Separation Precipitation Discoloration Creaming deterioration Viscosity pH etc.

일반적 보존 시험과 특수가혹 보존 시험에서 실시하는 안정성 시험법에는 온도(0, 25, 40℃)에 따른 안정성과 온도순환(cycle chamber)에 따른 안정성 시험법이 있다. 온도에 따른 안정성 시험법 중 고온(40℃)에서는 외관의 산패, 변색, 변취, 점도, 증발, 부유, 침전, 탁도(투명도), 분리 등을 관찰할 수 있고, 저온(0℃)에서는 응고, 침전, 탁도(투명도), 결정 석출, 분리 등의 화학적물리적 변화를 관찰할 수 있다. 이들 현상은 사용성에 큰 영향을 줄 뿐만 아니라, 화장품이 갖는 미적외관, 이미지 손실에도 큰 영향을 준다. 온도순환에 따른 안정성 시험법은 4계절이 분명한 우리나라에서 화장품의 저온 및 고온의 보관조건에 따른 물성변화를 관찰하기 위하여 실시하고 있으며, 또한 온도 변화에 따라 유화가용화에서의 물성변화를 관찰하기 위하여 실시한다. 제품의 대부분은 고온에서 가수분해 현상 및 기타 현상 등이 빨리 일어나며, 저온인 경우는 부피팽창, 용해도차에 의한 계면막 손상, 침전 등이 일어난다. 0, 25, 40℃의 온도에 보관한 난황으로부터 제조된 인산화단백질을 첨가한 skin, lotion, serum, cream은 60일 동안 모든 온도 조건에서 안정성을 나타내었으며, 온도 순환(-15, -10, -5, 0, 5, 10, 25, 40℃)에 따른 안정성을 관찰한 결과도 10cycle 모두에서 상의 분리와 변색, 변취 없이 안정함을 확인할 수 있었다.

6) 온도순환(Cycle chamber)에 따른 안정성 시험법

인산화단백질이 첨가된 skin, lotion, serum and cream 을 투명 용기에 담아 -15, -10, -5, 0, 5, 10, 15, 25, 37.5, 40℃에서 각각 24시간 보관한 후 이를 1 cycle로 하여 10회 반복 시행하여 온도 순환에 따른 안정성을 평가하였다.

그 결과는 도 4에 나타내었다.

7) 화장품의 점도 및 경도 측정

점도는 액체가 일정한 방향으로 흐를 때, 그 흐름에 대한 물질의 저항이 생기는데, 이 성질을 점도라고 한다. 점도는 brookfield 점도계를 이용한 점도 측정법과 우베로오데형 모세관 점도계를 이용한 점도 측정법이 있다. 본 실험에 사용된 brookfield 점도계는 비뉴톤 유동적 점성액체의 점도를 측정하는 방법으로서, 점성액을 일정한 가속도로 회전하는 로우더(spindle)에 움직이는 액의 점성저항을 용수철로 검출하여 점도를 환산하는 방법이다. 또한 점도값은 온도에 영향을 받으며, 그 변화 점도는 유체의 종류에 따라 다르므로 spindle, speed 조건, sample container size, sample 온도, 시간, 기포 등에 따라 점도 값이 달라질 수 있다. 인산화단백질을 농도별로 첨가한 결과 lotion, serum, cream 제형에서 인산화단백질을 첨가하지 않은 화장품에 비해 첨가한 화장품의 점도가 다소 감소함을 보였으며, 인산화단백질의 농도가 높아짐에 따라 점도 및 경도가 감소하는 것을 확인하였다. 하지만, 60일 동안의 점도 및 경도의 제형 변화는 나타나지 않아 안정함을 확인할 수 있었다.

Claims

난황으로부터 제조된 미백효능을 지닌 인산화단백질이 함유된 것을 특징으로 난황으로부터 제조된 미백효능을 지닌 인산화단백질이 함유된 화장품 조성물.
난황으로부터 제조된 미백 효능을 지닌 인산화단백질이 함유된 스킨 제형의 화장품 조성물에 있어서,
난황으로부터 제조된 인산화단백질과,
정제수, 글리세린, 1,3-부틸렌글리콜(1,3-Butylene glycol),베타인(betaine), 1,2-헥산디올(1,2-Hexanediol), 디소듐 이디티에이(Disodium EDTA), 카보머(Carbomer)를 혼합한 수상혼합물과,
알코올, 토코페롤 아세테이트(Tocopheryl Acetate), 하이드로제네이드 캐스터 오일(Hydrogenated castor oil), 향료를 혼합한 에탄올상혼합물과,
중화제인 트리에탄올 아민(Triethanol Amine)으로 이루어진 스킨 제형인 것을 특징으로 하는 난황으로부터 제조된 미백효능을 지닌 인산화단백질이 함유된 화장품 조성물.
난황으로부터 제조된 미백 효능을 지닌 인산화단백질이 함유된 로션 제형의 화장품 조성물에 있어서,
난황으로부터 제조된 인산화단백질과,
정제수, 글리세린, 1,3-부틸렌글리콜, 디소듐 이디티에이, 베타인, 1,2-헥산디올, 잔탐검(Xanthan gum), 카보머를 혼합한 수상혼합물과,
글리세롤 모노스테아레이트(Glycerol Mono stearate), 소르비탄 모노스테아레이트(Sorbitan MonoStearate), 세테아릴 알코올(Cetearyl Alchol), 아라키딜 알코올 (Arachidyl Alcohol), 토코페릴 아세테이트(Tocopheryl Acetate), 사이클로 펜타실록산(Cyclopentasiloxane), 디메틸실리콘오일(Dimethylpolysiloxane), 이소프로필 팔미테이트(Isopropyl Palmitate), 미네랄 오일, 바셀린을 혼합한 유상혼합물과,
향료와, 중화제인 트리에탄올 아민으로 이루어진 로션 제형인 것을 특징으로 하는 난황으로부터 제조된 미백효능을 지닌 인산화단백질이 함유된 화장품 조성물.
난황으로부터 제조된 미백 효능을 지닌 인산화단백질이 함유된 에센스 제형의 화장품 조성물에 있어서,
난황으로부터 제조된 인산화단백질과,
정제수, 디소듐이디티에이, 글리세린, 1,3-부틸렌글리콜, 1,2-헥산디올, 글리코실 트레할로스(Glycosyl Trehalose), 소듐 아크릴레이트(Sodium Acrylate), 잔탄검, 카보머를 혼합한 수상혼합물과,
아라키딜 알코올, 글리세롤 모노스테아레이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 이소프로필 팔미테이트, 사이클로 펜타실록산, 미네랄 오일을 혼합한 유상혼합물과,
향료와, 중화제인 트리에탄올 아민으로 이루어진 에센스 제형인 것을 특징으로 하는 난황으로부터 제조된 미백효능을 지닌 인산화단백질이 함유된 화장품 조성물.
난황으로부터 제조된 미백 효능을 지닌 인산화단백질이 함유된 크림 제형의 화장품 조성물에 있어서,
난황으로부터 제조된 인산화단백질과,
정제수, 글리세린, 1,3-부틸렌글리콜, 디소듐 이디티에이, 베타인, 1,2-헥산디올, 소듐 아크릴레이트, 잔탐검, 카보머를 혼합한 수상혼합물과,
글리세롤 모노스테아레이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 스테아린산 (Stearic Acid), 세테아릴 알코올(Cetearyl Alchol), 폴리소베이트 60(Polysorbate 60), 글리세릴 모노스테아레이트, 토코페릴 아세테이트, 사이클로 펜타실록산, 디메틸폴리실록산(Dimethylpolysiloxane), 미네랄 오일, 이소프로필 팔미테이트, 카프릴릭(Caprylic), 바셀린을 혼합한 유상혼합물과,
향료와, 중화제인 트리에탄올 아민으로 이루어진 크림 제형인 것을 특징으로 하는 난황으로부터 제조된 미백효능을 지닌 인산화단백질이 함유된 화장품 조성물.
제 1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 난황으로부터 제조된 인산화단백질은,
(a) 난황을 물에 희석하는 단계;
(b) 상기 희석된 난황을 원심분리 후, 1차 침전물을 수득하는 단계;
(c) 상기 수득된 침전물을 물에 희석하여 균질화 한 후, 다시 원심분리 후 2차 침전물을 수득하는 단계;
(d) 상기 수득된 2차 침전물을 에탄올과 혼합한 후, 원심분리하여 인지질을 제거하는 단계;
(e) 상기 인지질이 제거된 침전물을 염용액에 녹인 후, 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 및
(f) 상기 수득된 상층액의 염을 제거하는 단계로 제조된 것을 특징으로 하는 난황으로부터 제조된 미백효능을 지닌 인산화단백질이 함유된 화장품 조성물.
제 1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 난황으로부터 제조된 인산화단백질은,
(a) 난황을 물에 희석하는 단계;
(b) 상기 희석된 난황을 원심분리 후, 1차 침전물을 수득하는 단계;
(c) 상기 수득된 1차 침전물을 물에 희석하여 균질화한 후, 다시 원심분리 후 2차 침전물을 수득하는 단계;
(d) 상기 수득된 2차 침전물을 냉동 또는 열처리시키는 단계;
(e) 상기 온도처리된 2차 침전물에 물을 첨가하여 균질화한 후, 원심분리하여 인지질을 제거하는 단계;
(f) 상기 인지질이 제거된 침전물을 염용액에 녹인 후, 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 및
(g) 상기 수득된 상층액의 염을 제거하는 단계로 제조된 것을 특징으로 하는 난황으로부터 제조된 미백효능을 지닌 인산화단백질이 함유된 화장품 조성물.
제 6항에 있어서,
상기 염이 제거된 상층액을 냉동건조하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 난황으로부터 제조된 미백효능을 지닌 인산화단백질이 함유된 화장품 조성물.
제 7항에 있어서,
상기 염이 제거된 상층액을 냉동건조하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 난황으로부터 제조된 미백효능을 지닌 인산화단백질이 함유된 화장품 조성물.