KR20110093436A - 수산 동물로부터 추출된 카노신 및 이의 추출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명에서는, 수산동물의 육을 원료로 사용하는 카노신 (carnosine) 추출방법을 제공하고자 하며, 보다 구체적으로 수산 동물의 육을 원료로 사용하여 이온교환처리를 하는 단계 및 한외여과처리를 통한 분자량을 조절하는 단계를 포함하는 카노신 (carnosine)의 추출방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 이전까지 원료로 사용된 바 없는 수산동물의 육을 원료로 사용한 것으로, 본 발명의 추출방법에 의해 추출된 카노신은 항산화력, 세포손상 억제력 및 세포재생력이 뛰어남으로 이를 이용하여 약학, 건강식품 또는 화장품에 사용될 수 있을 것이다.

Description

수산 동물로부터 추출된 카노신 및 이의 추출방법 {Carnosine extracted from Marine animals and the Method thereof}

본 발명은 수산 동물로부터 추출된 카노신 (carnosine) 및 이의 추출방법에 관한 것이다.

카노신 (Carnosine)은 β-alanine과 histidine이 펩타이드 결합을 이루고 있는 디펩타이드 화합물로서 약 100년 전 러시아 과학자인 Gluevitch와 Amiradgibi (1900)에 의해 처음으로 발견 되었다. 초기 Decker (1992)와 Chan 등 (1993)은 카노신 (carnosine)의 항산화능과 자유라디칼 및 금속이온 제거능에 대해 보고한 바 있으며, 이후 연구된 결과에 따르면 카노신 (carnosine)의 생리적 기능은 분자내 이미다졸 고리 (imidazole ring)에 의한 완충작용 (Harris 등, 1990), 금속 킬레이트능 (Quinn 등, 1992) 및 자유라디칼 (Boldyrev 등 , 1995)과 활성당분자의 소거능에 기인하는 것으로 추정되고 있다 (Lee 등, 1999). 최근 다른 항산화제와는 달리 항염증 작용 및 동맥경화와 당뇨병의 치료에 카노신 (carnosine)이 효과가 있을 것이라는 보고도 있다. 또한, 카노신은 시력 손상을 지연시켜 노인성 백내장의 예방 및 치료에도 효과가 있으며, 심장질환이나 간질환의 치료 및 예방 효과가 있을 것이라는 보고도 있다. 그러나 카노신 (carnosine)의 효과에 대해서 그 가능성만을 제시하는 수준에서 그치고 있어 향후 이와 관련하여 더 많은 연구가 진행되어야 할 것으로 생각된다.

지금까지 카노신 (carnosine)의 추출은 주로 쇠고기와 칠면조, 닭 등과 같은 육상 동물의 단백질을 원료로 이루어져 왔다(Chan 등, 1993; Gopalakrishnan 등, 1999). 이들을 원료로 한 카노신 (carnosine)의 추출 시 단백질 잔여물 외에도 철과 같은 산화전구체 등이 혼입되는 단점이 있으며 그 결과 최종 추출물의 항산화능에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다 (Kanner 등, 1991; Chan, 1993; Decker ,1993).

현재까지 해양생물자원을 원료로 한 펩타이드의 검색이나 추출에 대한 연구는 미미한 실정이다. 김 등 (1996, 2000)에 의해 수산가공 부산물을 이용한 기능성 펩타이드 개발에 관한 연구가 시도된 바 있으나 아직 초기 단계에 있다고 할 수 있다. 뿐만 아니라, 해양생물자원으로부터 카노신 (carnosine)의 효과적인 추출방법에 대해서는 아직 보고된 바가 없는 실정이다.

본 발명에서는 지금까지 시도된 바 없는 수산 동물을 원료로 하여 카노신 (carnosine)을 추출하는 방법을 제공하고자 하며, 카노신을 유효성분으로 포함하는 항산화제 조성물, 세포손상 억제 조성물 및 세포재생 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명에서는 수산동물의 육을 원료로 사용한 카노신 (carnosine)의 추출방법을 제공하고자 하며, 상기의 추출방법에 의해 추출된 카노신 (carnosine)을 제공하고자 한다. 또한 카노신 (carnosine)을 유효성분으로 하는 항산화제 조성물, 세포손상 억제 조성물 또는 세포재생 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명자들은, 지금까지 시도된 바 없는 수산 동물을 원료로 카노신 (carosine)을 추출하고자, 우선적으로 최적의 효과적인 카노신(carosine) 추출이 가능한 수산 동물을 선별하였다. 이렇게 선별된 수산 동물을 이용하여 항산화능에 영향을 미치는 단백질 잔여물 및 Fe과 같은 산화전구체 물질 등 부산물이 최소화할 수 있는 추출방법을 개발하였으며, 추출된 카노신의 인체의 생리적 기능에 중요한 역할을 담당하는 지질 및 단백질의 산화 억제, 인체 DNA 손상 방지 및 회복에 대한 영향 등을 조사하고 기능과 특성을 규명함으로 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하도록 하겠다.

본 발명에서는 (a) 수산 동물의 육을 분쇄하여 분쇄물을 제조하는 단계, (b) 상기 분쇄물에 피크르산(picric acid)를 혼합하여 이온교환처리를 하는 단계 및 (C) 상기 이온교환처리된 시료를 한외여과처리를 통한 분자량을 조절하는 단계를 포함하는 카노신 (carnosine)을 추출하는 방법을 제공한다.

상기 수산 동물로는 물에 사는 모든 동물을 포함하나, 바람직하게는 가다랑어, 눈다랑어, 황다랑어와 같은 다랑어류와 같은 회유성 어류, 먹장어, 묵꾀장어, 칠성장어, 갯장어, 뱀장어, 붕장어, 칠성장어, 무태장어와 같은 장어류, 철갑상어, 그리고 수산 포유동물인 고래 등의 척추동물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일례로, 상기 뱀장어는 히스티딘계 저분자 펩티드의 함량이 높고 카노신의 함량이 높기 때문에 카노신의 추출원료로 적절할 수 있다.

상기 (a)단계에서, 수산 동물의 육은 통상의 방법으로 분쇄하는 것으로 분쇄물의 크기는 특별히 한정되는 것은 아니나, 분쇄물의 크기가 작은 것이 수산동물의 육의 유효성분을 효율적으로 추출하는데 유리할 수 있다.

상기 (b) 단계에서, 뱀장어 육에 피크르산(picric acid)를 가해 마쇄한 뱀장어 육을 균질화시킬 수 있다. 이때, 수산동물의 육의 분쇄물 대 피크르산(picric acid)의 비율은, 1% 피크르산으로 처리할 경우 상기 분쇄물 부피비를 기준으로 1: 2 내지 20 (분쇄물; 피크르산), 바람직하게는 1:5 내지 15일 수 있다. 상기 피크르산(picric acid)는 육단백질을 가수분해시키는 효과가 있으므로 상기 비율이 이온교환처리에 적용하기에 적절하다.

상기 (c) 단계에서, 상기 이온교환처리된 시료를 한외여과처리를 통한 분자량을 조절할 수 있는데, 상기 분자량을 조절하는 필터로는 그 종류에 있어 특별히 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 membrane filter일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 XM50, YM30, YM10, YM3, YM1 또는 YC05일 수 있다. 이때 상기 필터에 의해 조절된 분자량은 0.1 내지 800Da, 바람직하게는 200Da 내지 500Da일 수 있다.

본 발명에서는 상기 추출방법에 의해 추출된 카노신 (carnosine)을 제공한다. 본 발명의 추출방법에 의해 제조된 카노신은 하기 실시예에 의해 입증된 바와 같이, 단백질이나 Fe과 같은 산화전구체 물질 등의 불순물이 크게 감소되어 증대된 항산화력을 지니며, 세포손상 억제력 및 세포재생력을 지닌다.

또한, 본 발명에서는 카노신 (carnosine)을 유효성분으로 포함하는 항산화제 조성물, 세포손상 억제 조성물 또는 세포재생 조성물을 제공한다.

상기 카노신을 유효성분으로 포함하는 항산화제 조성물은 일례로, 높은 환원력과 높은 라디칼 소거능을 지니고, carbonyl group 생성 및 단백질 변성을 억제할 수 있다. 또한, 상기 카노신을 유효성분으로 포함하는 세포손상 억제 조성물은 일례로 DNA 손상을 억제할 수 있는 조성물일 수 있고, 상기 카노신을 유효성분으로 포함하는 세포재생 조성물은 일례로, DNA를 복구하여 재생시키는 조성물일 수 있다.

본 발명의 카노신은 천연물질로부터 추출된 것으로 부작용이 적고 안정적이어서, 식품, 의약품, 화장품 등 원료로서 사용 가능하며, 또한 약학적으로 허용되는 범위에서 직접 복용할 수도 있을 것이다.

본 발명은 상기 카노신을 유효성분으로 포함하는 항산화제 약학조성물, 세포손상 억제 약학조성물 또는 세포재생 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 카노신을 0.1 내지 90 중량%으로 포함한다.

본 발명의 카노신을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며 (예: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 최신판; Mack Publishing Company, Easton PA), 예를 들면 과립제, 세립제, 산제, 경질캡슐제, 연질캡슐제, 시럽제, 유제, 현탁제 또는 액제 등의 경구 투여용 약학 조성물로서 투여해도 되고, 정맥내 투여, 근육내 투여, 또는 피하 투여용 주사제, 점액제, 좌제, 경피흡수제, 경점막 흡수제, 점비제, 점이제, 점안제, 흡입제, 크림제, 연고제, 파프제 등의 비경구 투여용 의약조성물로서 투여하는 것도 가능하다. 분말형태의 약학조성물로서 조제된 제제를 사용시에 용해하여 주사제 또는 점액제로서 사용해도 된다.

약학 조성물의 제조에는 고체 또는 액체의 제제용 첨가물을 사용할 수 있다. 제제용 첨가물은 유기 또는 무기 중 어느 것이어도 된다. 즉, 경구용 고형제제를 제조하는 경우는, 주약에 부형제, 추가로 필요에 따라 결합제, 붕괴제, 활택제, 착색제 등을 첨가한 후, 통상적인 방법에 의해 정제, 피복정제, 과립제, 산제, 캡슐제 등 형태의 제제를 조제할 수 있다. 사용되는 부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분 (corn starch), 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘, 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스 (tragacanth), 젤라틴, 셀락 (shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린, 펙틴 (pectin) 등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수 있다. 착색제로서는 통상 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 이들의 정제, 과립제에는 당의 (糖衣), 젤라틴코팅, 기타 필요에 따라 적절히 코팅할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제 등을 첨가할 수 있다.

경구 투여를 위한 액체제제, 예를 들면 유제, 시럽제, 현탁제, 액제의 제조에는 일반적으로 사용되는 불활성인 희석제, 예를 들면 물 또는 식물유를 사용할 수 있다. 이 제제에는 불활성인 희석제 이외에 보조제, 예를 들면 습윤제, 현탁 보조제, 감미제, 방향제, 착색제 또는 보존제를 배합할 수 있다. 액체제제를 조제한 후, 젤라틴과 같은 흡수될 수 있는 물질의 캡슐 속에 충전해도 된다. 비경구 투여용 제제, 예를 들면 주사제 또는 좌제 등의 제조에 사용되는 용제 또는 현탁제로서는, 예를들면 물, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 벤질알코올, 올레산에틸, 레시틴을 들 수 있다. 좌제의 제조에 사용되는 기제로서는, 예를 들면 카카오버터, 유화 카카오버터, 라우린버터, 위텝졸을 들 수 있다. 제제의 조제방법은 특별히 한정되지 않고, 당업계에서 범용되고 있는 방법은 모두 이용 가능하다.

주사제의 형태로 하는 경우에는, 담체로서 예를 들면 물, 에틸알코올, 마크로골 (macrogol), 프로필렌글리콜, 구연산, 초산, 인산, 젖산, 젖산나트륨, 황산 및 수산화나트륨 등의 희석제; 구연산나트륨, 초산나트륨 및 인산나트륨 등의 pH 조정제 및 완충제; 피로아황산나트륨, 에틸렌디아민사초산, 티오글리콜산 및 티오젖산 등의 안정화제 등을 사용할 수 있다. 또한, 이 경우, 등장성 용액을 조제하기 위해 충분한 양의 식염, 포도당, 만니톨 또는 글리세린을 제제 중에 배합해도 되고, 통상의 용해 보조제, 무통화제 또는 국소 마취제 등을 사용하는 것도 가능하다.

연고제, 예를 들면 페이스트, 크림 및 겔의 형태로 하는 경우에는, 통상 사용되는 기제, 안정제, 습윤제 및 보존제 등을 필요에 따라 배합할 수 있어, 통상적인 방법에 의해 성분을 혼합하여 제제화할 수 있다. 기제로서는 예를 들면 백색 바셀린, 폴리에틸렌, 파라핀, 글리세린, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘 및 벤토나이트 등을 사용할 수 있다. 보존제로서는 파라옥시안식향산 메틸, 파라옥시안식향산 에틸, 파라옥시안식향산 프로필 등을 사용할 수 있다. 첩부제 (貼付劑)의 형태로 하는 경우에는, 통상의 지지체에 상기 연고, 크림, 겔 또는 페이스트 등을 통상적인 방법에 의해 도포할 수 있다. 지지체로서는 면, 스테이플 파이버 (staple fiber) 및 화학섬유로 되는 직포 또는 부직포 ; 연질 염화비닐, 폴리에틸렌 및 폴리우레탄 등의 필름 또는 발포체 시트를 적합하게 사용할 수 있다.

본 발명의 약학의 투여량은 특별히 한정되지 않지만, 성인 1일당 유효성분인 상기 물질의 중량으로서 통상 1kg당 0.1㎍ ∼ 10g/kg일 수 있다. 이 투여량을 환자의 연령, 병태, 증상에 따라 적절히 증감 (增減)하는 것이 바람직하다. 상기 1일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일 (數日) 간격으로 간헐 (間歇)투여해도 된다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 상기 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

본 발명은 카노신을 유효성분으로 포함하는 항산화제 건강식품 조성물, 세포손상억제 건강식품 조성물 또는 세포재생 건강식품 조성물을 제공하고자 한다.

상기 카노신을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 카노신의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 30 중량 %로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.01 내지 30 g, 바람직하게는 0.2 내지 5g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 카노신을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다

본 발명은 카노신을 유효성분으로 포함하는 항산화제 화장품 조성물, 세포손상 억제 화장품 조성물 또는 세포재생 화장품 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물의 적용대상에는 특별한 제한이 없으며, 본 발명의 조성물은 사람뿐만 아니라 동물 예를 들면, 사육동물이나 애완동물을 포함한 모든 동물에게 적용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 모발 또는 두피, 피부에 직접 도포 또는 산포하는 등의 방법에 의해 사용될 수 있다.

상기 조성물은 당업자에게 공지된 피부 활성 화합물을 함유하는 화장용 조성물일 수 있다. 본 발명의 화장품의 형태는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 형태로도 제조될 수 있는데 (예: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 최신판), 예컨대, 에멀젼, 로션, 크림 (수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액 (무수 및 수계), 무수 생성물 (오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말, 비누 등의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장품에는, 필요에 따라 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 범위에서, 통상의 성분들, 예컨대 유분, 계면활성제, 보습제, 다가알콜, 증점제, 수용성 고분자, 피막형성제, 비수용성 고분자, 분말, 안료, 염료, 레이크, 저급 알콜, 자외선 흡수제, 금속이온 킬레이트제, 유기아민류, pH 조정제, 약효성분, 당류, 방부제, 산화방지제, 향료, 물 등을 첨가할 수 있다.

상기 화장품 조성물의 제조에 통상 사용되는 성분들은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 성분들을 선택하여 사용할 수 있는데, 몇 가지를 예시하면, 예컨대 유분으로서는 올리브유, 아보카도유, 피마자유, 야자유 등을 사용할 수 있고, 계면활성제로서는 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리옥시에틸렌경화피마자유 등을 사용할 수 있으며, 보습제로서는 글리세린, 1,3-부틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등을 사용할 수 있으며, 증점제로서는 카르복시비닐폴리머, 카르복시메틸 셀룰로오스 등을 사용할 수 있으며, 자외선 차단제로서는 파라아미노안식향산, 옥틸메톡시신나메이트, 2-에톡시에틸-p-메톡시신나메이트 등을 사용할 수 있으며, 아민류로서는 모노에탄올아민, 트리에탄올아민 등을 사용할 수 있으며, 산화방지제로서는 토코페롤류, 디부틸하이드록시톨루엔 등을 사용할 수 있으며, 방부제로서는 에틸파라벤, 부틸파라벤, 안식향산나트륨 등을 사용할 수 있다.

상기 화장품에 있어서의 카노신의 배합량은, 화장품의 형태인 상기 물질의 종류 등에 따라 당업자가 적절히 선택 가능하지만, 예를 들면 0.001 중량%~50 중량%일 수 있으나, 사용 용도, 상태 등에 따라 중량비는 변할 수 있다.

본 발명의 화장품은 완제품의 최종 용도와 특성에 따라서 도포한다. 예를 들면 보습용, 또는 피부-완화용 (skin-soothing) 화장품를 매일 한번, 필요에 따라서는 그보다 더 자주 또는 그보다 더 적은 횟수로 사용할 수 있다. 기타 적합한 도포 방법은 통상의 최적화 방법에 따라 결정한다.

본 발명의 추출방법을 사용하여 수산 동물로부터 카노신 (carnosine)을 추출할 수 있는데, 이렇게 추출된 카노신은 단백질이나 Fe과 같은 산화전구체 물질 등의 불순물이 크게 감소되어 증대된 항산화력을 지니며, 높은 세포손상 억제력과 세포재생력을 지닌다. 본 발명의 카노신은 천연물질에서 추출된 것으로 안전하고 부작용이 적기 때문에 항산화제 조성물, 세포손상 억제 조성물 또는 세포재생 조성물로 식품, 의약품, 화장품 등 원료로서 활용될 수 있기에 산업적 가치가 클 것이다.

도1은 가열처리를 함으로 뱀장어 카노신을 추출하는 과정을 나타낸 것이다.
도2는 이온교환처리를 함으로 뱀장어 카노신을 추출하는 과정을 나타낸 것이다.
도3은 한외여과처리를 통한 분자량을 조절함으로 뱀장어 카노신을 추출하는 과정을 나타낸 것이다.
도4는 카노신 스탠다드와 히스티딘을 포함한 뱀장어로부터 정제된 낮은 분자량의 펩티드의 HPLC 크로마토그램 (HPLC chromatogram)을 나타낸 것이다.
도5는 이온교환처리와 한외여과처리 (ultrafiltration)의 HPLC 크로마토그램 (HPLC chromatogram)을 나타낸 것이다.
도6은 단백질 변성에 카노신이 미치는 영향을 알아보기 위해, 오브알브민 (ovalbumin)에 뱀장어 카노신을 첨가한 후 차아염소산염 (hypochlorite)와 반응시켠 단백질을 변성시킨 후 전기영동을 한 것이다.
도7은 200μM H₂O₂ 로 유도된 인간 백혈구 DNA의 손상에 대해 뱀장어 카노신 (4mM) 0㎍/㎖ , 10㎍/㎖ , 50㎍/㎖, 100㎍/㎖을 첨가하여 보호효과를 나타낸 것이다.
도8은 200μM H₂O₂ 로 유도된 인간 백혈구 DNA의 손상에 대해 뱀장어 카노신 (2mM) 0㎍/㎖ , 10㎍/㎖ , 50㎍/㎖, 100㎍/㎖을 첨가하여 보호효과를 나타낸 것이다.
도9는 200μM H₂O₂ 로 유도된 인간 백혈구 DNA의 손상에 대해 뱀장어 카노신 (1mM) 0㎍/㎖ , 10㎍/㎖ , 50㎍/㎖, 100㎍/㎖을 첨가하여 보호효과를 나타낸 것이다
도10은 DNA 손상에 따른 comet image 분석결과를 나타낸 것이다.
도11은 200μM H₂O₂ 로 유도된 인간 백혈구 DNA의 손상에 대해 뱀장어 카노신 (4mM) 0㎍/㎖ , 10㎍/㎖ , 50㎍/㎖, 100㎍/㎖을 첨가하여 재생효과를 나타낸 것이다.
도12은 200μM H₂O₂ 로 유도된 인간 백혈구 DNA의 손상에 대해 뱀장어 카노신 (2mM) 0㎍/㎖ , 10㎍/㎖ , 50㎍/㎖, 100㎍/㎖을 첨가하여 재생효과를 나타낸 것이다.
도13는 200μM H₂O₂ 로 유도된 인간 백혈구 DNA의 손상에 대해 뱀장어 카노신(1mM) 0㎍/㎖ , 10㎍/㎖ , 50㎍/㎖, 100㎍/㎖을 첨가하여 재생효과를 나타낸 것이다

본 발명은 이하 실시예, 실험예 및 제제예로써 상세히 설명하지만, 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예, 실험예 및 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제제예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

실시예1 : carnosine 추출용 시료

본 실험에 사용한 뱀장어 (Anguilla japonica)는 부산광역시 남천동 남천해변시장에서 평균체중 300-400g, 체장 50-70cm의 뱀장어를 구입하여 살아있는 상태로 실험실로 운반하여 실험에 사용하였다.

Carnosine과 P-bromoaniline, ferrozine ,linoleic acid, 2,2-Diphenyl- 1-picrylhydrazyl free radical과 ascorbic acid는 sigma chemical (St. Louis .USA)에서 구입하였으며 그 외의 모든 시약은 특급시약을 사용하였다.

< 실험예 >

실험예1 : 성분 분석

실험예 1-1 일반성분 분석

수분은 상압가열 건조법, 조단백질은 semimicro kjedahl법, 조지방은 soxhlet법, 조회분은 건식회화 법으로 정량하였다 (A.O.A.C, 1995).

뱀장어의 Proximate 구성

Ingredients	Content (%)
Moisture	60.66 ± 0.52*
Crude Protein	17.93 ± 0.42
Crude Lipid	19.98 ± 0.11
Crude Ash	1.18 ± 0.07

_{*데이터는 평균±표준편차( standard deviation )(n=3)로 표현됨}

상기 표1에 나타난 바와 같이, 수분 60.66± 0.52%, 단백질 17.93± 0.42%, 지질 19.98± 0.11%, 회분 1.18± 0.07%로 나타났다. 황 (1999)의 보고에 의하면 먹장어와 갯장어의 경우 단백질은 각각 16.62%, 19.6%, 지질은 7.03%, 11.9%를 함유하고 있다고 하였다. 본 연구의 시료로 사용한 뱀장어의 지질함량은 갯장어나 먹장어보다 높은 결과를 나타내었다.

실험예1 -2 유리아미노산 분석

히스티딘계 저분자 펩타이드인 carnosine 추출을 위한 원료로서 뱀장어의 적합성을 확인하고자 수산 어류 중 히스티딘계 저분자 펩타이드가 많이 함유된 것으로 알려진 뱀장어와 가다랑어를 대상으로 유리 아미노산 함량을 분석하였다.

유리아미노산은 가다랑어 육 또는 뱀장어 육 5g에 5-sulfosalicylic acid 250㎎을 넣고 잘 혼합하여 균질화시켜 제단백 시킨 후 원심분리 (3,000×g, 15min) 하였다. 상층액은 0.20㎛ membrane filter로 여과한 다음 lithium citrate buffer (pH 2.2)로 일정량 희석하여 아미노산 자동 분석기 (Hitachi model 835-50, Japan)로 분석하였다.

상기 표2에 나타난 바와 같이, 뱀장어의 경우 carnosine이 전체 유리아미노산 조성의 약 70%의 함량을 나타내었으며, 가다랑어는 histidine이 50.84%, anserine이 34.32%로 전체 유리 아미노산의 85%이상을 차지하는 것으로 나타났다. 뱀장어에는 anserine이 함유되어 있지 않으나 가다랑어에는 carnosine과 anserine을 모두 함유하고 있는 것으로 나타났고, anserine의 함량이 carnosine에 비해 8배 정도 높은 것으로 조사되었다. 이상의 결과에서 뱀장어의 경우 히스티딘계 저분자 펩타이드 중 anserine은 함유되어 있지 않고, carnosine만 함유하고 있다는 사실은 뱀장어가 carnosine 추출용 원료로 적합하다는 사실을 보여주는 결과라 판단되었다.

실시예2 : 뱀장어 carnosine 추출방법

실시예2 -1 : 가열처리

뱀장어 육 중량의 2배에 해당하는 탈 이온수를 가해 2분간 마쇄한 뱀장어 육을 homogenizer로 2분간 4회 균질화한 후 8,000×g에서 30분간 원심 분리시켜 침전물을 제거한 후 whatman #4번 필터를 이용하여 여과한 액을 60℃, 80℃, 100℃에서 10분간 가열처리 후 다시 8,000×g에서 15분간 원심 분리시켜 침전물을 제거한 후 Whatman No. 4 필터로 여과하였다 (도1).

Treatments		Contents (㎍/㎖)
	Protein	Total Fe	Carnosine
Unheated	146.96 ±5.42*	9.23 ±0.66	480.35 ±6.99
60℃	66.54 ±6.15	3.63 ±0.75	436.98 ±13.16
80℃	53.63 ±2.93	2.70 ±0.26	465.41 ±16.13
100℃	46.13 ±3.54	2.17 ±0.21	483.54 ±3.68

_{*데이터는 평균±표준편차(standard deviation)(n=3)로 표현됨}

_{비가열구: 가열처리하지 않은 샘플을 의미함}

_{60℃, 80℃ 및 100℃ : 10분간 60℃, 80℃ 및 100℃로 열을 가해 추출된 샘플을 의미함}

상기 표3에 나타난 바와 같이, 비가열처리구의 단백질 함량과 총철함량(total Fe) 및 carnosine 함량은 각각 146.96±5.42㎍/㎖, 9.23±0.66㎍/㎖, 480.35±6.99㎍/㎖이었으며, 60, 80, 100℃로 가열처리하였을 때 단백질 함량은 비가열처리구에 비해 각각 55%, 63%, 68% 감소 되었으며, 총철 함량은 60%, 70%, 76% 감소된 것으로 조사되었다.

그리고 carnosine 함량은 60℃와 80℃로 가열하였을 때 약 9%와 3% 정도 감소하였다. 그러나 100℃로 가열한 경우에는 비가열시와 비슷한 수준을 나타내어 100℃로 가열하였을 때 단백질 및 총철과 같은 불순물의 제거에 가장 효과가 좋은 결과를 나타내었다.

실시예2 -2 : 이온교환처리

뱀장어 육에 10배가량의 1% 피크르산 (picric acid)를 가해 마쇄한 뱀장어 육을 균질화한 후 8,000×g에서 30분간 원심 분리시켜 침전물을 제거한 상층 액을 Dowex-2 chloride column (2.5×30)㎝을 이용하여 단백질 잔여물과 피크르산 (picric acid)를 제거하였다 (도2).

Composition	Contents (㎍/㎖)
Protein	25.29 ±1.05*
Total Fe	4.76 ± 0.15
Carnosine	502.41 ± 1.12

_{*데이터는 평균±표준편차( standard deviation )(n=3)로 표현됨}

상기, 표4에서 나타난 바와 같이, 단백질 함량은 비가열 처리구에 비해 82%, 100℃ 가열 처리구에 비해 45% 정도 감소한 것으로 나타났으며, carnosine 함량은 약 3%정도 증가하였다. 총철(total Fe) 함량은 비가열 처리구에 비해 48% 정도 낮은 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2-3 : 한외여과처리를 통한 분자량 조절

저분자 펩타이드인 carnosine 분리를 위해서 가열 처리 및 이온교환 처리한 시료를 membrane filter (XM50, YM30, YM10, YM3, YM1, YC05)로 걸러서 분자량을 최종 500Da이하까지 조절하였으며 여과액을 -50℃ 이하로 냉동시킨 후 동결건조 하여 실험용 시료로 사용하여 분자량을 조절한 동결 건조한 추출물의 단백질, 총철, carnosine 함량을 측정하였다.(도3).

1) 하기 도4에서 나타난 바와 같이, 먼저 비가열처리구의 경우 분자량 조절에 의해 약 52%의 단백질 함량 감소를 나타내었으며, 가열처리구는 60, 80, 100℃ 가열온도에 따라 각각 27%, 50%, 46%의 단백질 함량의 감소를 나타내었다. 총철 함량의 변화는 가열처리구의 경우 각각 14%, 22%, 23% 감소하였으며, carnosine 함량은 가열처리구가 각각 23%, 17%, 20%의 함량 증가함을 확인할 수 있었다.

2) 하기 도5에서 나타난 바와 같이, 이온교환 처리한 추출물을 한외여과법으로 분자량을 조절하였을 때 나타난 함량변화에서 단백질 및 총철함량은 약 47%, 43% 정도 감소되었으며, carnosine 함량은 약 6% 정도 증가하였다. 100℃ 가열 처리구에 비하여 단백질 및 철 함량은 각각 45%, 5% 정도 낮았으며, carnosine 함량은 비슷한 수준을 보였다.

상기와 같은 결과에 근거하여 하기 실험예는 이온교환처리와 한외여과처리를 순차적으로 병행한 추출방법으로 실험을 진행하였다.

실험예3 : 항산화능 평가

실험예3 -1 환원력

Carnosine은 histidine과 β-alanine이 결합된 이분자 펩타이드로서 carnosine의 항산화능이 둘 중 어느 것에 의해 발현되는지 확인함과 동시에 뱀장어 carnosine의 항산화능을 평가하기 위하여 histidine, β-alanine 및 taurine을 대조구로 하여 환원력을 측정하고, 뱀장어로부터 추출한 carnosine의 환원력은 Oyaizu(1988)의 방법에 따라서 측정하였다. 대조구의 시료로는 탈이온수를 사용하였으며 실험방법은 다음과 같다. 시료 2㎖에 0.2M phosphate buffer (pH 6.6) 2㎖와 2㎖의 1% potassium ferricyanide를 첨가한 후 혼합물을 50℃에서 20분간 반응시키고 2㎖의 10% tricholoroacetic acid를 각각의 반응물에 첨가한 후 반응물 2㎖에 증류수 2㎖와 0.4㎖의 0.1% ferric chloride를 시험관에 첨가하고 정확히 10분후에 700nm에서 흡광도를 측정하여 환원력을 평가하였다.

자유 아미노산(free amino acids)가 뱀장어 카노신(eel carnosine)의 환원력(Reducing power)

Sample	Concentration (㎎/㎖)
	1	2	3	4
Histidine	** 0.016 ±0.002	0.02 ± 0.002	0.028 ± 0.003	0.033 ± 0.004
β- Alanine	0.016 ±0.002	0.019 ± 0.002	0.020 ± 0.006	0.026 ± 0.007
Taurine	0.018 ±0.002	0.019 ± 0.003	0.018 ± 0.001	0.018 ± 0.002
Eel carnosine	0.072 ±0.009	0.114 ± 0.011	0.175 ± 0.01	0.229 ± 0.012

_{*평균±표준편차( standard deviation )(n=3)로 표현됨}

_{**700 nm 에서의 흡광도값( Absorbance value )}

표5에서 나타난 바와 같이, β-alanine과 taurine의 경우 농도 증가에 따른 환원력의 차이는 없는 것으로 나타났으나 뱀장어 carnosine 그리고 histidine의 경우 농도에 따라서 환원력이 높아지는 결과를 나타내었다. 특히 뱀장어 carnosine이 대조구에 비해 높은 환원력을 나타내었다.

실험예3 -2 DPPH 라디칼 소거능

뱀장어 carnosine의 αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거능 시험은 Shimada 등 (1992)의 방법에 따라 측정하였다. 공시험구의 시료로는 탈이온수를 사용하였으며 0.5㎖의 각각의 시료에 0.4mM DPPH 시험용액 1.0㎖를 첨가한 후 혼합물을 교반시키고 실온에서 30분간 정치시킨 후 517nm에서 흡광도를 측정하여 DPPH 라디칼 소거능을 측정하였으며 소거능은 다음과 같은 방법으로 계산하였다.

(Blank absorbance - Sample absorbance)× 100 % /Blank absorbance

자유 아미노산(free amino acids)과 뱀장어 카노신(eel carnosine)의 0.4mM DPPH 라디칼 소거능(radical Scavenging effect)

Sample	Concentration (㎎/㎖)
	1	2	3	4
Eel carnosine	22.04 ± 2.39 * *	24.49 ± 2.11	27.20 ± 1.28	32.38 ± 2.13
Histidine	4.41 ± 0.77	9.11 ± 0.15	17.65 ± 0.99	21.69 ± 1.09
β- Alanine	6.33 ± 0.5	7.62 ± 0.23	8.94 ± 0.55	10.34 ± 1.02
Taurine	10.14 ± 0.82	11.40 ± 0.55	10.92 ± 0.58	11.19 ± 0.40

_{* 517 nm 에서 흡광도( Absorbance ). 1, 2, 3, 4(㎎/㎖) 아스코르브산( ascrobic acid )의 소거능(scavenging effect)은 각각 28.59%, 29.29%, 29.51,및 29.73%이다.}

_{* * 평균±표준편차( standard deviation )(n=3)로 표현됨}

표6에 나타난 바와 같이, 대조구로 histidine과 β-alanine, taurine 및 L-ascorbic acid를 사용한 결과 실험구와 대조구 모두 라디칼 소거능을 나타내었는데 β-alanine, taurine 및 L-ascorbic acid의 경우 농도 증가에 따른 라디칼 소거능 증가는 없었다. 그러나 뱀장어 carnosine과 histidine은 농도가 증가함에 따라 라디칼 소거능도 증가하였다. 뱀장어 carnosine의 라디칼 소거능은 농도별로 22.04±2.39%, 24.49±2.11%, 27.20±1.28% 및 32.38±2.13%를 나타내 가장 높았다. L-ascorbic acid의 라디칼 소거능은 농도별로 각각 28.59%, 29.29%, 29.51% 및 29.73%로 나타났으며, 기타 유리아미노산 중에서 histidine은 4.41±0.77%, 9.11±0.15%, 17.65±0.99% 및 21.69±1.09%로 나타났다. 보고에 의하면 carnosine이 superoxide , hydrogen peroxide, hydroxyl radical 등과 반응하는 능력을 가지고 있다는 것이 확인 되었으며, carnosine의 이러한 기능은 histidine 잔기의 수소 공여능 (hydrogen donor)에 의한 것으로 추정되고 있다 (Diez 등, 2003; Boldrev 등, 1995).

실험예 4 Carbonyl group 함량 측정

실험예 4-1 Carbonyl group 함량 측정

단백질의 산화반응에 따른 carbonyl group의 생성율 측정은 Hipkiss (1998)의 방법에 따라 ovalbumin 10㎎을 10㎖의 potassium phosphate (100mM, pH7)에 용해시킨 후 일정량의 hypochlorite를 첨가하고 37℃에서 1시간동안 반응시켰으며 hypochlorite 처리한 단백질을 5% Trichloroacetic acid(TCA)로 침전시킨 후 원심분리를 통해 상층액을 제거하고 침전물을 5% TCA로 2번 수세하고 일정량의 2M HCl에 다시 용해시킨 후 500㎕의 10mM 2,4-DNPH를 첨가하고 37℃에서 2시간동안 반응 시킨 후 동량의 2M NaOH를 첨가한 후 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

ovalbumin으로부터 카르보닐 그룹 (carbonyl groups)의 제거에 대한 뱀장어 카노신의 효과

Concentration ( mM )	CO group lost (%) *
10	7.81 ± 2.16 **
20	18.37 ±1.24
30	32.57 ±2.04
40	51.39 ±1.86

_{* hypochlorite 와 함께 실온( room temperature )에서 7일간 배양한 Ovalbumin}

_{* * 평균±표준편차( standard deviation )(n=3)로 표현됨}

실험예 4-2 단백질 글리케이션

최종당화산물의 전구체 물질인 Methyl glyoxal과 carnosine과의 반응성을 살펴보기 위해 Hipkiss (1998)의 방법에 따라 ovalbumin 10㎎을 10㎖의 potassium phosphate (100mM, pH7)에 용해시킨 후 뱀장어 carnosine을 일정 농도로 첨가하고 30분후 일정량의 methyl glyoxal을 첨가하여 37℃에서 1 시간 동안 반응시킨 후 분석용 시료로 사용하였다.

실험예 4-3 SDS - PAGE

단백질 산화반응에 의해 생성되는 가교결합 및 글리케이션에 미치는 뱀장어 carnosine의 영향을 알아보기 위해 SDS 전기영동을 행하였다. 전기영동은 Mini-Protein 3 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)을 사용하여 Laemmli (1970)의 방법에 따라 행하였다. 7.5% polyacrylamide gel을 사용하였으며 시료를 각각 30㎕씩 well에 주입하고 25mM Tris-192mM glycine 완충용액 (pH 8.3)을 전극액으로 사용하여 전기영동 하였다. 전기영동 후 SDS-gel의 염색은 Coomassie brilliant blue R-250을 사용하였고, 염색이 끝난 겔은 빙초산/에탄올/증류수 혼합액 (v/v/v, 1:2:7)으로 탈색하였다.

1) 상기 표7에선 나타난 바와 같이, Ovalbumin에 hypochlorite와 뱀장어 carnosine을 첨가한 후 carbonyl group 감소율을 측정한 결과에서 10, 20, 30, 40mM 뱀장어carnosine을 첨가하였을 때 각각 7.81±2.16%, 18.37±1.24%, 32.57±2.04%, 51.39±1.86%의 carbonyl group 감소를 나타내었다. hypochlorite 양을 20㎕, 40㎕로 각각 첨가한 결과에서도 carnosine 농도가 증가함에 따라 carbonyl group 생성이 크게 억제되는 것으로 나타났다.

2) 도6에서 나타난 바와 같이, 단백질 변성에 carnosine이 미치는 영향을 좀 더 자세히 알아보기 위해 ovalbumin에 뱀장어 carnosine을 0mM, 20mM, 40mM의 농도로 첨가한 후 hypochlorite와 반응시켜 단백질을 변성시킨 후 전기영동을 행한 결과를 에 나타내었다. 1번은 hypochlorite 처리를 하지 않은 ovalbumin이고, 2번은 뱀장어 carnosine을 첨가하지 않고 hypochlorite 만으로 처리한 것이며 3과 4번은 hypochlorite와 함께 carnosine을 각각 20mM과 40mM로 첨가한 결과이다. carnosine 무첨가구의 경우 hypochlorite에 기인한 단백질 가교결합에 의해 형성되어진 고분자의 단백질 밴드가 윗부분에서 나타난 반면, hypochlorite 무처리 ovalbumin과 carnosine을 첨가한 시료에서는 단백질 가교결합이 일어나지 않아 변성되지 않은 ovalbumin 밴드가 확인되었다.

실험예 5 Comet assay 법을 이용한 DNA 의 산화적 손상 측정

DNA의 산화적 손상과 뱀장어 carnosine 첨가에 의한 DNA 손상의 억제 정도를 확인하기 위해 Singh 등 (1988)의 방법을 변형하여 Comet assay를 실시하였다.

건강한 24세와 25세의 비흡연 남성으로 부터 채취한 세포 현탁액에 0.5% low melting agarose (LMA) 75㎕를 혼합하고 0.5% normal melting agarose 150㎕가 precoating 된 slide 위로 백혈구와 LMA 현탁액이 골고루 분산되게 한 후 cover slip으로 덮어 4℃에서 10분간 냉장 보관하였다. Gel이 굳으면 cover slip을 벗기고 그 위에 다시 0.7% LMA 용액 75㎕를 slide 위에 첨가한 후 다시 cover slip을 덮어 gel이 굳을 때까지 냉장 보관하였다. Gel이 굳은 것을 확인한 뒤 cover slip을 제거한 후 slide를 차가운 alkali lysis buffer (2.5M NaCl, 100mM Na₂ EDTA, 10mM Tris, 1% Triton X-100, 10% DMSO, 1% laurosylsarcosinate, pH 10)에 담그고 4℃의 암실에서 1시간 동안 두면서 세포 단백질을 제거하였다. Lysis가 끝난 slide를 alkaline 용액 (300mM NaOH, 10mM Na₂ EDTA, pH 13)이 포함된 전기영동 탱크에 넣고 40분 동안 4℃에서 unwinding 시킨 후 25V/300± 3mA에서 20분간 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후 slide를 0.4M Tris (pH 7,4)용액으로 5분씩 두 번 세척하여 중성화 시켰으며, ethanol 3mL로 3분 동안 고정시킨 후 Comet image 분석을 위해 20㎕농도의 ethidium bromide로 핵을 형광 염색하고 cover slip으로 덮은 뒤 형광 현미경 (Leica MZ16 FA, Germany)으로 관찰하였다. 그 후 CCD camera (Nicon, Japan)를 통해 얻어진 각각의 세포핵 image는 Kormet 4.0 comet image analyzing system (Kinetic Imaging, UK)로 분석하였다. Comet assay에 의한 백혈구 DNA 손상정도는 핵으로부터 이동한 DNA파편의 거리 (tail length, TL) 또는 tail length에 tail내 함유된 DNA%를 곱해준 tail moment (TM)값을 측정하여 백혈구에서 DNA 손상정도를 측정하였다.

실험예 5-1 : 보호 효과

인간의 백혈구 DNA를 대상으로 H₂O₂에 의해 야기된 유전자 독성 (genotoxic)에 대한 뱀장어 carnosine의 보호 효과에 대해서 comet assay법을 사용하였다. 뱀장어 carnosine의 농도를 각각 1mM, 2mM, 4mM로 조제한 시료를 이용하여 0㎍/㎖ , 10㎍/㎖ , 50㎍/㎖, 100㎍/㎖의 함량으로 첨가시킨 후 30분 후에 200 μM H₂O₂ 첨가하여 인간 백혈구 DNA를 손상시킨 결과를 살펴보았다.

도7에서 나타난 바와 같이, 무첨가구의 경우 DNA가 손상되어 이에 따른 DNA tail %가 71%를 나타낸 반면에 4mM carnosine을 10㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖ 첨가한 경우 각각 56%, 39%, 19%를 나타내었으며, 이에 따른 세포손상 억제 효과는 각각 21%, 44%, 72%로 나타났다. 도8에서 나타난 바와 같이 2mM carnosine을 10㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖ 첨가한 경우 각각 57%, 36%, 21%를 나타내었으며, 이에 따른 세포손상 억제 효과는 각각 18%, 49%, 69%로 나타났다. 도9에서 나타난 바와 같이, 1mM carnosine을 첨가한 경우는 DNA tail %가 각각 57%, 35%, 12%를 나타내었으며, 세포손상 억제 효과는 각각 19%, 49%, 69%이었다. 특히 각기 다른 농도의 carnosine을 100㎍/㎖로 첨가하였을 경우 손상되지 않은 DNA와 동일한 보호효과가 있는 것으로 조사되었으며, 도10에서 나타난 바와 같이. DNA 손상에 따른 Comet image 분석결과 손상되지 않은 DNA에 비해 무첨가구의 경우 DNA 꼬리가 길게 생성된 반면에 뱀장어 carnosine을 첨가한 경우 첨가량이 증가할수록 손상된 꼬리가 짧아지는 결과를 나타내었다. 특히 100㎍/㎖의 함량으로 첨가한 결과 손상된 꼬리가 없는 구형을 나타내었다.

실험예 5-2 재생 효과

손상된 DNA에 대한 재생효과를 살펴보기 위해 200μM H₂O₂ 를 첨가하여 인간 백혈구 DNA를 손상시킨 30분 후 뱀장어 carnosine을 농도별로 0㎍/㎖, 10㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖ 첨가하였다.

도11에서 나타난 바와 같이, 무첨가구의 경우 DNA가 손상되어 이에 따른 DNA tail %가 69%를 나타낸 반면에 4mM 뱀장어 carnosine을 10㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖ 첨가한 경우 각각 44%, 24%, 18%를 나타내었으며, 이에 따른 세포 재생 효과는 각각 35%, 64%, 72%로 나타났다. 도12에 나타난 바와 같이, 2mM carnosine 첨가시 각각 58%, 20%, 16%를 나타내었으며, 이에 따른 세포손상 재생 효과는 각각 15%, 70%, 76%로 나타났고, 도13에 나타난 바와 같이 1mM carnosine 첨가시 DNA tail %가 각각 52%, 22%, 17%, 세포손상 재생 효과는 각각 25%, 67%, 75%였다. 특히 carnosine 100㎍/㎖ 첨가하였을 경우 손상된 DNA를 손상되지 않은 DNA와 동일하게 재생시키는 결과를 나타내었다.

상기 실험예에서 살펴본 바와 같이 뱀장어 carnosine은 DNA의 보호효과 뿐만 아니라 손상된 DNA의 재생능력 또한 매우 우수한 것으로 나타났다.

< 제제예 >

제제예 1.화장품 조성물의 제제예

제제예 1-1. 유연화장수 (함량 : 중량%)

상기 카노신 0.001

글리세린 3.0

부틸렌 글리콜 2.0

프로필렌 글리콜 2.0

카복시비닐폴리머 0.1

에탄올 10.0

트리에탄올아민 0.1

방부제, 미량색소, 미량향료, 미량정제수 잔량

총계 100.0

제제예 1-2. 영양크림 (함량 : 중량%)

상기 카노신 0.001

밀납 10.0

폴리소르베이트60 1.5

소르비탄세스퀴올레이트 0.5

유동파라핀 10.0

스쿠알란 5.0

카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 5.0

트리에탄올아민 0.2

방부제, 미량색소, 미량향료, 미량정제수 잔량

총계 100.0

제제예 1-3. 헤어비누의 제조(함량 : 중량%)

상기 카노신 0.001

이산화티탄 0.2

폴리에틸렌글리콜 0.8

글리세린 0.5

에틸렌디아민테트라아세트산 0.05

나트륨 1.0

색소 적량

비누향 적량

화장비누베이스 (수분 13, 중량부) 잔량

계 100.0

제제예 2. 약학 조성물의 제제예

제제예 2-1. 연고제의 제조

상기 카노신 3g

데스판테놀 1.5g

스테아린산 1.0g

유동파라핀 5.0g

경납 4.0g

세탄올 3.0g

프로필렌글리콜 13.0g

트리에탄올아민 1.5g

디부틸하이드록시톨루엔 0.025g

에틸벤조에이트 0.0225g

프로필벤조에이트 0.015g

폴리소르베이트 0.1g

정제수 65.0g

상기의 성분들을 사용하여 통상의 연고제의 제조방법에 따라 연고제를 제조하였다.

상기와 같은 방법으로 제조된 연고제를 1일 2회, 1회에 0.5 내지 1g씩을 3내지 6개월 동안 지속적으로 환부에 도포한다.

제제예 2-2. 로손제

상기 카노신 1.0g

덱스판테놀 1.5g

글리세린 0.6g

하이드록시프로필셀롤로즈 0.085g

비검 0.0255g

정제수 적량

상기의 성분들을 사용하여 통상의 로숀제의 제조방법에 따라 로숀제를 제조하였다.

상기와 같은 방법으로 제조된 로숀제를 1일 2회, 1회에 0.5 내지 1ml씩을 3 내지 6개월 동안 지속적으로 환부에 도포할 수 있다.

제제예 2-3. 캅셀제의 제조

상기 카노신 10 g

결정성 셀룰로오스 3 g

락토오스 14.8 g

마그네슘 스테아레이트 0.2 g

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 2-4. 주사제의 제조

상기 카노신 10 g

만니톨 180 g

주사용 멸균 증류수 2974 g

Na2HPO412H2O 26 g

통상의 주사제의 제조방법에 따라 2 리터 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 2-5. 액제의 제조

상기 카노신 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 3. 건강식품 조성물의 제제예

제제예3 -1. 건강식품의 제조

상기 카노신 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 3-2. 건강음료의 제조

상기 카노신 100 ㎎

비타민 C 15 g

비타민 E(분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B1 0.25 g

비타민 B2 0.3g

물 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

Claims (10)

1. (a) 수산 동물의 육을 분쇄하여 분쇄물을 제조하는 단계;
   (b) 상기 분쇄물에 피크르산(picric acid)를 혼합하여 이온교환처리를 하는 단계;
   (c) 상기 이온교환처리된 시료를 한외여과처리를 통한 분자량을 조절하는 단계:
   를 포함하는 카노신(carnosine)을 추출하는 방법.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 (b)단계에서 1% 피크르산 (picric acid)의 비율을, 상기 분쇄물 부피비를 기준으로 1: 2 내지 20 (분쇄물: 피크르산)로 혼합하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 (c)단계에 있어서 조절된 분자량이 0.1 내지 800 인 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 수산 동물은 뱀장어인 것을 특징으로 하는 방법.
   
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 추출방법에 의해 추출된 카노신 (carnosine).
   
6. 카노신 (carnosine)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화제 조성물.
   
7. 카노신 (carnosine)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포손상 억제 조성물.
   
8. 카노신(carnosine)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포재생 조성물.
9. 제8항에 있어서,
   상기 세포재생은 손상된 DNA를 복구하여 재생시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 카노신은 제1항의 추출방법에 의한 것임을 특징으로 하는 조성물.
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    

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