KR20180063388A - 인진쑥(Artemisia capillaris Thunb.) 수용성 추출물을 유효성분으로 함유하는 급성 간부전 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
인진쑥(Artemisia capillaris Thunb.) 수용성 추출물을 유효성분으로 함유하는 급성 간부전 질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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- Y10S514/893—
Abstract
본 발명은 인진쑥(Artemisia capillaris) 수용성 추출물을 유효성분으로 함유하는 급성 간부전 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물에 관한 것으로, 상기 인진쑥의 수용성 추출물이 G-CSF, IL-4 및 IL-10과 같은 사이토카인의 발현을 증가시켜 T 세포가 Th1 세포로 분화하는 것을 억제하는 대신 Th2 세포 또는 조절 T 세포로 분화하는 과정을 활성화함으로써 염증 반응 및 면역 반응을 억제하는 바, 급성 간부전을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 인진쑥(Artemisia capillaris Thunb.) 수용성 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다.
인진쑥(Artemisia capillaris Thunb.)은 다년생 초분으로 우리나라에서는 식용으로도 사용되며, 다양한 염증질환의 치료에 사용되기도 하는 약용식물 중 하나이기도 하다. 최근 인진쑥의 생리활성에 대한 연구가 매우 활발하게 진행되고 있어, 염증억제작용(Jang et al., 2005), B형 간염 억제 작용(Zhao et al., 2014), 지방용해작용(Jang et al., 2014), 항비만효과(Hong et al., 2009), 항암효과(Choi et al., 2013), 항산화효과(Hong and Lee, 2009), 혈소판응집억제효과(Wu et al., 2001) 등 다양한 효능들이 확인되었다.
특히, 인진쑥의 염증억제 활성과 관련하여 많은 연구들이 이루어졌지만, 대부분이 염증성 대식세포 배양에서 산화질소(NO)의 생산에 영향을 미치는 기능성을 조사하는 시험관 연구의 결과물이다. 많은 인간 염증질환들은 근본적으로 T 세포가 염증반응을 촉진하는 T 세포로 활성화되고, 이들 T 세포가 염증성 대식세포를 활성화하여 산화질소나 염증성 사이토카인을 만들기 때문에 발생한다는 점을 고려한다면, 대식세포 배양을 이용한 시험관 연구만으로는 T 세포 활성화 조절 기능성 물질을 확인하기는 어렵다(Murphy and Reiner 2002; Classen et al., 2009). 그러므로 T 세포의 활성화 과정에 작용하여 면역조절작용을 나타내는 기능성 물질을 확인하기 위해서는, 대식세포를 이용한 시험관 연구가 아닌 다양한 세포들이 상호작용할 수 있는 동물 모델을 이용한 연구가 필수적이다.
한편, 면역체계는 건강한 상태를 유지하기 위하여 다양한 백혈구들이 서로 협동하여 상황에 부합하는 적절한 면역반응이 나타나도록 조절되는 복잡한 체계이다. 이러한 면역반응의 조절에서 핵심적인 역할을 하는 세포들이 T 세포이며, 이들 중 CD4 T 세포는 면역반응의 진행과 억제에서 중요한 역할을 하는 세포이다. CD4 T 세포는 항원과 반응하여 조력 T 세포(helper T cell, Th 세포) 또는 조절 T 세포(regulatory T cell, Treg 세포)로 활성화되어, 면역반응의 특성을 결정하게 된다.
먼저, 조력 T 세포는 B 세포에 작용하여 항체 생산을 도와주고, 대식세포와 반응하여 대식세포를 활성화하며, 세포독성 T 세포(Cytotoxic T cell, CTL)의 활성도 자극한다. 이러한 조력 T 세포는 그들이 유도하는 면역반응의 성격에 따라 다시 Th1 세포 또는 Th2 세포로 구분되는데, 이들 두 그룹의 T 세포는 동일한 성숙 CD4 T 세포로부터 서로 억제적으로 활성화되며, 어느 그룹의 T 세포로 활성화되느냐에 따라 유도되는 면역반응의 성격이 달라진다(Romagnani. 1996). Th1 세포는 B 세포에 작용하여 IgG급 항체 생산을 자극하고, 대식세포에 작용하여 산화질소나 TNF-α를 활성화하여 염증반응을 자극하는 T 세포로, 항원을 제거하는 면역반응을 유도한다. 결과적으로, Th1 세포가 활성화되면 항원의 제거는 효율적으로 나타나게 되지만, 조직손상과 염증반응이 유도되어 결과적으로 염증성질환의 원인이 되기도 한다(Cherwinski et al., 1997). 반면에, Th2 세포는 B 세포에 작용하여 IgE급 항체의 생산을 촉진하는 T 세포로, 알러지 반응을 유도하기도 하지만, 염증반응의 진행을 억제한다. Th2 세포가 활성화되면 염증반응에 의한 조직손상이 최소화되고 조직치유 과정을 유도하기 때문에, 염증질환의 억제에 중요하다(Diaz and Allen. 2007).
반면에 조절 T 세포는 면역반응을 억제하거나 멈추게 하는 역할을 수행하여, 과도한 면역반응을 막아주고 면역항상성을 유지하는데 중요한 역할을 하는 세포이다(Purnama et al., 2013.). 즉, 조력 T 세포와는 달리, 조절 T 세포는 면역반응을 억제하는 기능을 가진 T 세포로, 자가 항원에 대한 면역 반응를 막아주어 자가면역질환을 조절하며, 염증반응을 억제하여 염증질환의 발생이나 진행을 막아주는 T 세포이다. 조절 T 세포는 다른 면역세포와 반응하여 직접적으로 그 세포의 기능을 억제하며, 인터루킨-10(interleukin 10, IL-10)과 같은 사이토카인을 분비하여 면역반응을 억제한다(Sakaguchi, 2004).
이러한 다양한 그룹의 CD4 T 세포들은 모두 흉선에서 성숙하여 생성되며(성숙 T 세포, mature T cell), 이들은 말초 면역기관에서 항원과 반응하여 특정한 면역조절기능을 가진 T 세포로 분화된다. 성숙 T 세포의 활성화에서 T 세포와 항원제시세포의 상호작용 결과 만들어지는 사이토카인들은 특정한 T 세포의 활성화에 큰 영향을 미치게 된다(MacDonald et al., 2005; Murphy and Reiner 2002). 이중 G-CSF, IL-4, IL-10 등의 사이토카인은 성숙 T 세포가 Th2 세포나 Treg 세포로 활성화되도록 유도하는 사이토카인들로, 이들 사이토카인에 의한 T 세포 면역조절작용을 기대할 수 있다. 예를 들어, G-CSF는 골수에서 과립구(granulocyte)의 분화 성숙을 촉진하는 사이토카인으로, 항원제시과정에서 성숙된 CD4 T 세포가 Th1 세포로 활성화되는 것은 억제하고, Th2 세포로 활성화되는 것을 촉진하는 작용을 나타내는 것으로 알려져 있다(Arpinati et al., 2000). 또한, IL-4와 IL-10은 성숙된 CD4 T 세포를 Th2 세포로 활성화하나, Th1 세포로의 활성화는 억제하는 작용을 한다.
전술한 바와 같이, 사이토카인들이 T 세포의 활성화를 조절하며, 어떤 종류의 T 세포가 활성화되느냐에 따라 질병의 발생이나 증세가 크게 영향을 받게 되므로, 특정한 사이토카인의 활성에 영향을 미치는 물질은 면역조절 기능성을 가질 것으로 기대할 수 있다. 이에 따라, 다양한 천연물의 T 세포의 면역 조절 작용에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다(Kopf et al., 2010; Sundberg et al., 2014). 예를 들어, 콩 추출물은 간 조직에서 조절 T 세포의 활성화를 유도하여 간 손상을 줄이는 면역조절 기능을 보여주는 것이 확인되었고, 카페인을 포함한 커피 추출물은 G-CSF의 활성을 증가시켜 알츠하이머 질환에 효과적인 것이 확인되었다(Khoury et al., 2015; Cao et al., 2011). 그러나 아직까지 인진쑥 추출물의 면역 활성을 조절하는 능력에 대한 연구는 미비한 실정이다.
본 발명의 목적은 성숙 T 세포를 Th2 세포 또는 Treg 세포로 분화하는 과정을 촉진하여 급성 간부전을 예방 또는 치료할 수 있는 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 성숙 T 세포를 Th2 세포 또는 Treg 세포로 분화하는 과정을 촉진하여 급성 간부전을 예방 또는 개선할 수 있는 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 인진쑥(Artemisia capillaris) 수용성 추출물 유효성분으로 함유하는 급성 간부전 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 인진쑥(Artemisia capillaris) 수용성 추출물을 유효성분으로 함유하는 급성 간부전 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 인진쑥 수용성 추출물은 특정한 사이토카인의 발현을 증가시킴으로써 성숙 T 세포를 비정상적인 염증 반응 및 면역 반응을 억제할 수 있는 Th2 세포 또는 Treg 세포로 분화하는 과정을 촉진하는 바, 급성 간부전을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 하나의 실시예에 따른 인진쑥 수용성 추출물의 제조 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 다른 하나의 실시예에 따른 인진쑥 수용성 추출물 투여 시 사이토카인 유전자의 발현 효과를 확인한 것이다.
도 3은 본 발명의 또 다른 하나의 실시예에 따른 인진쑥 수용성 추출물의 급성 간부전 치료 효과를 확인한 것이다.
도 4는 본 발명의 또 다른 하나의 실시예에 따른 인진쑥 수용성 추출물 처리 시 급성 간부전 모델 마우스의 간에서 사이토카인 발현에 대한 영향을 확인한 것이다.
도 2는 본 발명의 다른 하나의 실시예에 따른 인진쑥 수용성 추출물 투여 시 사이토카인 유전자의 발현 효과를 확인한 것이다.
도 3은 본 발명의 또 다른 하나의 실시예에 따른 인진쑥 수용성 추출물의 급성 간부전 치료 효과를 확인한 것이다.
도 4는 본 발명의 또 다른 하나의 실시예에 따른 인진쑥 수용성 추출물 처리 시 급성 간부전 모델 마우스의 간에서 사이토카인 발현에 대한 영향을 확인한 것이다.
본 발명의 발명자들은 면역 활성을 조절하여 다양한 질병을 치료할 수 있는 방법을 연구하던 중, 인진쑥에서 얻은 수용성 추출물이 T 세포의 활성화를 조절하여 면역 조절 기능을 나타내는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 인진쑥(Artemisia capillaris) 수용성 추출물을 유효성분으로 함유하는 급성 간부전 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
이때, 상기 인진쑥 수용성 추출물은 인진쑥 지상부를 열수로 추출하여 얻어질 수 있는 바, 인진쑥 지상부는 인진쑥의 줄기 또는 잎을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
즉, 상기 인진쑥 수용성 추출물은 성숙 T 세포가 Th2 세포 또는 조절 T(Treg) 세포로 활성화되는 과정을 촉진할 수 있는 바, 이에 따라 과발현되는 염증 반응을 억제하고, 비정상적으로 활성화된 면역 반응을 억제하여 급성 간부전과 같은 질환을 치료할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 인진쑥 수용성 추출물은 G-CSF, IL-4 및 IL-10으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 사이토카인의 발현을 증가시킴으로써 성숙 T 세포가 Th2 세포 또는 조절 T(Treg) 세포로 활성화되는 과정을 촉진시킬 수 있는 바, 전술한 바와 같이 상기 사이토카인들은 성숙 T 세포의 Th2 세포 또는 Treg 세포로의 활성화 과정에 중요한 역할을 한다.
한편, 상기 인진쑥 수용성 추출물은 전체 조성물 100 중량부에 대하여 0.1 내지 50 중량부로 포함될 수 있는 바, 이러한 수치 범위 내에서 인진쑥 수용성 추출물의 T 세포 활성화 조절 능력이 가장 효과적으로 발현되므로 바람직하다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 상기 인진쑥 수용성 추출물 외에 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다.
또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
더불어, 본 발명은 인진쑥(Artemisia capillaris) 수용성 추출물을 유효성분으로 함유하는 급성 간부전 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
이때, 상기 인진쑥 수용성 추출물은 인진쑥 지상부를 열수로 추출된 것일 수 있고, 상기 인진쑥 지상부는 인진쑥의 줄기 또는 잎을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
즉, 상기 인진쑥 수용성 추출물은 성숙 T 세포가 Th2 세포 또는 조절 T(Treg) 세포로 활성화되는 과정을 촉진할 수 있는 바, 이에 따라 과발현되는 염증 반응을 억제하고, 비정상적으로 활성화된 면역 반응을 억제하여 급성 간부전과 같은 질환을 치료할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 인진쑥 수용성 추출물은 G-CSF, IL-4 및 IL-10으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 사이토카인의 발현을 증가시킴으로써 성숙 T 세포가 Th2 세포 또는 조절 T(Treg) 세포로 활성화되는 과정을 촉진할 수 있다.
상기 인진쑥 수용성 추출물은 건강기능식품 조성물의 100 중량부에 대하여 0.1 내지 90 중량부로 포함될 수 있는 바, 이와 같은 수치 범위에서 T 세포 활성화 조절 능력이 가장 효과적으로 나타날 수 있으므로 바람직하다.
상기 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일 주스, 합성 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강기능식품 조성물은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품 조성물은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품 안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반 시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산 칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류 첨가 알칼리제, 보존 료제제, 타르색소 제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이며, 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐이므로 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 인진쑥 수용성 추출물의 제조
도 1A에 나타난 바와 같이, 건조된 인진쑥(본초원, 김해) 줄기와 잎을 분쇄하고 증류수를 넣은 후, 125℃에서 2시간 반응하여 추출물을 얻고, 이 추출물을 식힌 후 감압농축기를 이용하여 60℃에서 10배 정도 농축한 다음, 4000 rpm에서 30분간 원심분리하여 침전물을 제거하고, 상등액만을 모아서 인진쑥 수용성 추출물(AC0)을 획득하였다.
<실시예 2> 인진쑥 수용성 추출물의 면역 조절 사이토카인 활성화 효과
인진쑥의 면역 조절 능력을 확인하기 위하여, 동물에 인진쑥 수용성 추출물(AC0)을 경구 투여한 다음, 동물의 백혈구에서 면역 조절 사이토카인의 발현량을 실시간 중합효소 연쇄 반응(real-time PCR) 방법으로 정량하였다. 효창사이언스(대구)에서 분양받은 6주령의 ICR 생쥐 한 마리당 인진쑥 수용성 추출물을 2 mg씩 하루 두 번 3일간 경구 투여하였다. 생쥐는 각 3마리씩 한 그룹으로 나누어, 인진쑥 수용성 추출물 투여군과 증류수 투여 대조군 두 그룹으로 나누어 진행하였다. 3일 간 시료를 투여한 후, 생쥐를 희생하여 혈액을 채취하고, 혈액의 백혈구(말초 혈액 단핵구; Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC)에서 RNA를 분리하였다. 이때, RNA의 분리는 QIAmp RNA Blood Mini Kit(Qiagen, USA)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 분리된 RNA에서 Doctor Protein cDNA synthesis Kit(엠지메드, 한국)을 이용하여 cDNA를 합성한 후, Real-time PCR을 이용하여 β-actin, G-CSF, IL-4, IL-10 유전자의 발현 정도를 비교하였다.
Real-time PCR은 Quanti Mix SYBR Kit(PhileKorea Technology, Korea) 및 ABI PRISM 7300 실시간 DNA 증폭기(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 수행하였고, 증폭된 RNA 양을 정량적으로 비교하였다. 구체적으로, 50℃에서 2분, 95℃에서 10분 동안 1 사이클 반응시키고, 95℃에서 15초간 변성(denaturation), 60℃에서 1분씩 결합(annealing) 및 증폭(extension) 과정을 총 40 사이클 반복하였고, 이때 사용된 프라이머의 서열은 하기 <표 1>에 나타난 바와 같았다.
| 유전자 | 종류 | 서열 | 서열번호 |
| β-actin | 정방향 | GGCACCAGGGTGTGATGG | 1 |
| 역방향 | ACGGTTGGCCTTAGGGTTC | 2 | |
| G-CSF | 정방향 | ATGGCTCAACTTTCTGCCCAG | 3 |
| 역방향 | CTGACAGTGACCAGGGGAAC | 4 | |
| IL-4 | 정방향 | GGTCTCAACCCCCAGCTAGT | 5 |
| 역방향 | GCCGATGATCTCTCTCAAGTGAT | 6 | |
| IL-10 | 정방향 | GCTCTTACTGACTGGCATGAG | 7 |
| 역방향 | CGCAGCTCTAGGAGCATGTG | 8 |
이후, 각각의 증폭 결과를 β-actin 유전자의 증폭 결과로 보정하고 2-△△CT 방법을 이용해 정량적으로 비교하였다(Livak and Schmittgen, 2001).
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 인진쑥 수용성 추출물을 경구 투여한 생쥐의 말초혈액 단핵구에서는 대조군에 비해 G-CSF 유전자가 평균 6배(2A), IL-10 유전자가 평균 5배(2B), IL-4 유전자가 평균 3배(2C) 정도 유의성 있게 증가하였다.
상기 결과를 고려해보면, 인진쑥 수용성 추출물에는 소화관에서 흡수되어 혈액의 백혈구에 작용하여 G-CSF, IL-4 및 IL-10 유전자의 발현을 증가시키는 물질이 포함되어 있다는 것을 알 수 있었다. 즉, 상기 세 사이토카인은 서로 협동하여 성숙 CD4 T 세포가 Th2 세포나 조절 T 세포로 활성화되도록 자극하는 인자로 알려져 있는 바, 따라서 인진쑥 수용성 추출물에는 면역 조절 기능성 물질이 포함되었음을 알 수 있다.
<
실시예
3> 인진쑥 수용성 추출물 및 분획의 생체 내 면역 조절 능력 확인
인진쑥 수용성 추출물이 G-CSF, IL-4 및 IL-10 등의 Th2 사이토카인을 활성화한다는 실시예 2의 결과를 토대로, 인진쑥 수용성 추출물이 실제 질병 모델에서 면역 조절 작용을 나타낼 수 있는지를 검증하기 위하여, Th1 세포는 과도하게 활성화되고 조절 T 세포는 억제되어 나타나는 내독소 유도 급성 간부전 동물 모델을 이용하여 이를 확인하였다.
내독소 유도 급성 간부전 동물 모델은 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)와 D-갈락토사민(D-galactosamin, D-GalN)을 생쥐의 복강에 주사하여(LPS/D-GalN model) 생쥐의 간 전체에 조직 손상과 염증 반응을 유도한 모델로서, 인간의 급성 간부전과 유사한 병변을 나타낸다. 이 LPS와 D-GalN이 처리된 동물의 간 조직에서는 Th1 세포가 과도하게 활성화되는 반면 Th2 세포나 조절 T 세포는 감소되는 T 세포 활성화 조절의 이상이 유도되어 간 독성이 나타나는 것으로 알려져 있다(Mcaleer et al., 2009).
이에, 인진쑥 수용성 추출물이 LPS/D-GalN에 의한 간 독성을 억제할 수 있는지를 확인하기 위해, 7주령의 C57BL/6 수컷 생쥐 3마리를 취하여 인진쑥 수용성 추출물(AC0) 2 mg(200 ㎕)을 매일 2번씩 총 6번 생쥐에 경구 투여 한 다음, 마지막 식이를 하고 1시간 후에 생쥐의 복강에 LPS 0.08 ㎍과 D-gal/N 8 mg(200 ㎕)을 주사하여 간 독성을 유도하였다. 대조군 그룹의 생쥐에게는 동량의 물을 같은 방법으로 투여한 후, LPS/D-GalN으로 처리하였다. LPS/D-GalN을 주사하고 6시간 후에 생쥐를 희생하여 혈액과 간을 적출하고 간 독성 여부를 조사하였다.
간 손상의 생화학적 검사를 위해, 생쥐 혈액의 아미노트랜스퍼라아제(aminotransferase, GOT, GPT)의 활성을 Reitman과 Frankel의 방법에 준하여 아산제약의 GOD/GPT kit(AM101-K)를 이용하여 제조사가 제시한 방법대로 측정하였다. 또한, 생쥐에서 간을 떼어내어 간의 표면의 충혈 여부를 육안으로 확인하였으며, 일부 간 조직은 10% 포르말린으로 고정한 후 잘라 절편을 만들었고, 이 조직 절편을 헤마톡실린/에오신으로 염색하여 간 조직의 손상을 현미경으로 확인하였다.
그 결과, 도 3A 및 3B에 나타난 바와 같이, 인진쑥 수용성 추출물을 식이한 생쥐에서는 물을 식이한 대조군 생쥐에 비해 GPT와 GOT 효소 활성이 현저하게 낮아졌다. 또한, 염색된 간 조직을 관찰한 결과, 도 3C에 나타난 바와 같이, 물을 식이한 대조군 생쥐에서는 간소엽 구조의 파괴, 간 동양 혈관(hepatic sinusoid)의 붕괴, 간세포(hepatocyte)의 팽윤, 중심 정맥 주변 염증 세포 침윤 및 간세포의 괴사 등이 나타났으나, 인진쑥 수용성 추출물을 식이한 생쥐의 간에서는 그러한 변화가 나타나지 않았다. 더욱이, 적출한 간의 상태를 육안으로 확인했을 때에도, 도 3D에 나타난 바와 같이, 인진쑥 수용성 추출물을 식이한 생쥐에서는 간엽의 충혈이나 울혈의 흔적이 보이지 않았으나, 물을 식이한 대조군 생쥐의 간에서는 울혈 및 충혈이 확연하게 나타났다.
이러한 결과들은 인진쑥 수용성 추출물의 식이가 LPS/D-GalN에 의한 간 세포 및 간 혈관의 괴사를 막고 간 염증 반응을 억제하여 이들 독성 물질에 의한 간 독성을 방지할 수 있음을 보여준다. 즉, 이는 인진쑥 수용성 추출물은 급선 간부전을 치료할 수 있는 효과가 있음을 시사한다.
<
실시예
4> 인진쑥 수용성 추출 및 분획의 T 세포 활성화 조절 기작 확인
상기 실시예 3에서 나타난 결과, 즉, 인진쑥 수용성 추출물의 LPS/D-GalN에 의한 간 독성 억제 효과가 G-CSF, IL-4, IL-10 활성화와 그에 따른 T 세포 면역 반응 조절 때문인지를 확인하기 위하여, 상기 실시예 3과 같이 LPS/D-GalN으로 처리한 생쥐의 간 조직에서 사이토카인의 발현량을 조사하였다.
먼저 인진쑥 수용성 추출물을 식이한 생쥐와 물을 식이한 대조군 생쥐의 간 조직을 적출한 다음, 간 조직에서 RNA와 cDNA를 준비한 후, 실시간 중합 효소 연쇄 반응(real-time PCR)을 이용하여 G-CSF, IL-10, IL-4, FoxP3 등의 사이토카인 유전자의 전사량을 비교하였다. 구체적으로, MG™ Total RNA Extraction kit(Macrogen, Korea)를 사용하여 생쥐의 간에서 RNA를 분리하였으며, 분리된 RNA에서 Doctor Protein cDNA Synthesis Kir(엠지메드, 한국)을 이용하여 각 유전자의 발현량을 비교하였다. Real-time PCR은 상기 실시예 1에서 수행한 방법대로 수행하였으며, 하기 <표 2>에 나타난 FoxP3의 프라이머 세트를 제외하고는 상기 <표 1>에 나타난 유전자들의 프라이머를 사용하였다.
| 유전자 | 종류 | 서열 | 서열번호 |
| FoxP3 |
정방향 | GGCCCTTCTCCAGGACAGA | 9 |
| 역방향 | GCTGATCATGGCTGGGTTGT | 10 |
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 인진쑥 수용성 추출물을 식이한 생쥐의 간에서는 대조군 생쥐의 간 조직에서보다 G-CSF(4A)와 IL-10(4B) 전사량이 각각 평균 5배 정도 증가하는 것으로 나타났고, IL-4(4C)의 발현은 3배, FoxP3(4D)의 발현은 약 2배 정도 증가하였다. 이러한 결과는 인진쑥 수용성 추출물의 식이가 혈액 백혈구에서 G-CSF, IL-4, IL-10의 전사를 촉진한다는 결과와 매우 유사한 결과로, 인진쑥 수용성 추출물이 생쥐의 소화관에서 흡수되어 간에 작용하여, 간에서 T 세포 면역 조절 기능성을 나타낼 수 있음을 보여주는 것이다.
또한, 인진쑥 수용성 추출물을 식이한 생쥐의 간에서 IL-4 및 IL-10의 발현이 증가하는 것은 Th2 세포가 활성화되었음을 보여주고, FoxP3 및 IL-10의 발현이 증가되는 것은 Treg 세포의 활성화가 유도되었음을 보여준다.
이러한 결과들은 인진쑥 수용성 추출물이 간 조직의 염증 반응을 중지시키고 조직 손상의 치유를 촉진하는 면역 조절 기능을 가지고 있다는 것을 의미한다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.
<110> inje university industry-academic cooperation foundation
<120> Compositions for Preventing or Treating Fulminant Hepatic Failure
Comprising Water Soluble Extraction of Artemisia capillaris
Thunb.
<130> ADP-2016-0478
<160> 10
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
ggcaccaggg tgtgatgg 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
acggttggcc ttagggttc 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
atggctcaac tttctgccca g 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
ctgacagtga ccaggggaac 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
ggtctcaacc cccagctagt 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
gccgatgatc tctctcaagt gat 23
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
gctcttactg actggcatga g 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
cgcagctcta ggagcatgtg 20
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
ggcccttctc caggacaga 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 10
gctgatcatg gctgggttgt 20
Claims (9)
- 인진쑥(Artemisia capillaris) 수용성 추출물을 유효성분으로 함유하는 급성 간부전 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 인진쑥 수용성 추출물은 인진쑥 지상부를 열수로 추출하여 얻어진 것을 특징으로 하는 급성 간부전 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 인진쑥 수용성 추출물은 성숙 T 세포가 Th2 세포 또는 조절 T(Treg) 세포로 활성화되는 과정을 촉진하는 것을 특징으로 하는 급성 간부전 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제 3 항에 있어서, 상기 인진쑥 수용성 추출물은 G-CSF, IL-4 및 IL-10으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 사이토카인의 발현을 증가시킴으로써 성숙 T 세포가 Th2 세포 또는 조절 T(Treg) 세포로 활성화되는 과정을 촉진하는 것을 특징으로 하는 급성 간부전 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 인진쑥 수용성 추출물은 전체 조성물 100 중량부에 대하여 0.1 내지 50 중량부로 포함되는 것을 특징으로 하는 급성 간부전 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 인진쑥(Artemisia capillaris) 수용성 추출물을 유효성분으로 함유하는 급성 간부전 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제 6 항에 있어서, 상기 인진쑥 수용성 추출물은 인진쑥 지상부를 열수로 추출된 것을 특징으로 하는 급성 간부전 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제 6 항에 있어서, 상기 인진쑥 수용성 추출물은 성숙 T 세포가 Th2 세포 또는 조절 T(Treg) 세포로 활성화되는 과정을 촉진하는 것을 특징으로 하는 급성 간부전 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제 8 항에 있어서, 상기 인진쑥 수용성 추출물은 G-CSF, IL-4 및 IL-10으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 사이토카인의 발현을 증가시킴으로써 성숙 T 세포가 Th2 세포 또는 조절 T(Treg) 세포로 활성화되는 과정을 촉진하는 것을 특징으로 하는 급성 간부전 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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| KR1020160153227A KR20180063388A (ko) | 2016-11-17 | 2016-11-17 | 인진쑥(Artemisia capillaris Thunb.) 수용성 추출물을 유효성분으로 함유하는 급성 간부전 질환 예방 또는 치료용 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
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| Publication Number | Publication Date |
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| KR20180063388A true KR20180063388A (ko) | 2018-06-12 |
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100198490B1 (ko) * | 1995-12-15 | 1999-06-15 | 구광시 | 간장질환 치료용 의약 조성물 |
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-
2016
- 2016-11-17 KR KR1020160153227A patent/KR20180063388A/ko active Search and Examination
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100198490B1 (ko) * | 1995-12-15 | 1999-06-15 | 구광시 | 간장질환 치료용 의약 조성물 |
| KR20160008100A (ko) | 2014-06-30 | 2016-01-21 | 명지대학교 산학협력단 | 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015. Vol.2015, Article ID 728137. * |
| Journal of Nutrition and Metabolism. 2016. Vol.2016. Article ID. 3530971. * |
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