KR102329070B1

KR102329070B1 - 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 관절염의 개선, 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102329070B1
Application number: KR1020200023468A
Authority: KR
Inventors: 나천수
Original assignee: 농업회사법인 주식회사 생명의나무
Priority date: 2019-04-23
Filing date: 2020-02-26
Publication date: 2021-11-19
Also published as: KR20200124154A

Abstract

본 발명은 노각나무 잎 추출물과 꾸지뽕나무 잎 추출물을 함유하는 관절염의 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 노각나무 잎 추출물과 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물은 연골세포에 손상을 미치는 효소인 MMP-1, 3, 13의 유전자 발현을 효과적으로 억제하여, 관절염을 예방하고 개선 또는 치료하는데 현저한 효과를 나타낸다.

Description

노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 관절염의 개선, 예방 또는 치료용 조성물{A composition for improving, preventing and treating arthritis comprising extract of Stewartia pseudocamellia Maxim. leave and Cudrania tricuspidata leaves}

본 발명은 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 함유하는 관절염의 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

관절염은 크게 퇴행성 관절염(골관절염, osteoarthritis)과 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis)으로 구분된다. 퇴행성 관절염은 골관절염이라고도 불리는 가장 흔히 볼 수 있는 관절염으로서 중년 또는 노년에 주로 발생하고, 무릎 관절 및 엉덩이 관절과 같이 체중을 많이 받는 관절에 통증, 경직감 및 운동장애 등을 초래하는 질환이다. 과거에는 단순히 노화현상으로 생각하였으나, 현재는 연령, 유전적 요소, 비만, 관절의 모양, 호르몬 등의 여러 가지 원인이 복합적으로 이루어짐으로써 증상이 다르게 나타나는 것으로 생각되고 있다.

퇴행성 관절염은 주로 관절연골의 점진적 손상에 따라 만성 염증이 형성되고, 이에 따라 주변 조직의 퇴행화 과정을 수반하는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, 물리적인 스트레스의 누적에 의하여 연골조직에 NF-kB 및 AP-1과 같은 전사인자들이 활성화되어 만성염증이 일어나게 되면 COX-2, LOX 등의 염증반응을 매개, 증폭시키는 인자들이 발현되고, 주변의 혈행이 억제되며, 매트릭스 메탈로프로테이나제(matrix metalloproteinases, MMPs), 히알루로니다제(hyaluronidase), iNOS 등 조직 파괴인자들이 과발현되어 연골조직을 파괴하게 되며, 이로 인하여 주변의 근육, 건, 인대 등과 같은 조직에도 영향을 끼쳐 심한 통증을 일으킨다.

반면, 류마티스성 관절염은 여러 관절에 다발성으로 나타나는 염증성 자가면역질환이다. 류마티스성 관절염 증상을 가진 환자의 활막조직과 활액은 염증성 세포들(대식세포, T-세포, B 세포, 수지상 세포(dendritic cells) 등)이 과도하게 작용하여 만성염증을 일으키고, 관절 및 연골 손상을 야기하고 통증을 유발하는 것을 특징으로 한다.

한편, 노각나무는 쌍떡잎식물 물레나물목 차나무과의 낙엽활엽 교목으로 한국ㆍ일본 등지에 분포하며, 산 중턱 이상에서 자란다. 노각나무의 높이는 7~15m이고, 나무 껍질은 흑적갈색으로 큰 조각으로 벗겨져 오래 될수록 배롱나무처럼 미끈해진다. 잎은 어긋나고 타원형 또는 넓은 타원형이며 끝은 뾰족하고 밑은 둥글거나 뭉뚝하다. 잎의 크기는 길이 4~10cm, 나비 2~5cm로 가장자리에 물결 모양의 톱니가 있다.

노각나무의 꽃은 양성으로 6~7월에 백색으로 피며, 새가지의 밑동 겨드랑이에 달린다. 꽃대는 길이 1.5~2 cm이고, 포는 달걀모양 또는 둥근 모양이다. 꽃받침은 둥글고 융모가 있으며, 꽃잎은 달걀을 거꾸로 세운 모양이고 5~6개이며, 꽃의 암술대는 5개로 갈라져 합쳐지고 수술은 5개이다. 노각나무의 열매는 삭과로 10월에 익고, 5각뿔형이고, 목재는 장식재ㆍ고급가구재 등으로 사용된다.

또한, 꾸지뽕나무는 양지바른 산기슭이나 마을 주변에 자라는 작은키나무이다. 높이 3-8m이다. 가지에 가시가 있다. 잎은 난형으로 3갈래로 갈라지기도 하며, 길이 6-10cm, 폭 3-6cm, 위쪽이 점차 좁아지다가 끝은 둔해진다. 꽃은 5-6월에 암수딴그루에 핀다. 수꽃차례는 작은 꽃들이 모여 머리모양을 이루며, 짧고 부드러운 털이 모여 난다. 열매는 수과, 여러 개가 모여 공 모양을 이루며, 다육질이고 붉은색에서 검은색으로 익는다. 우리나라 황해도 이남의 서해안과 남해안 서부지역에 주로 자생한다. 일본과 중국에도 분포한다. 열매는 식용 또는 약용하며, 잎을 누에 사료로 쓰이고 있다.

한국등록특허 제10-1578068호

본 발명의 목적은 노각나무 잎과 꾸지뽕나무 잎으로부터 추출된 추출물을 포함하는 복합 추출물을 연골세포의 손상을 억제 또는 개선시킬 수 있는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 관절염 예방 또는 개선용 식품 조성물로 응용하고자 하는 것이다.

본 발명의 일 측면에 따르면,

노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물을 유효성분으로 함유하는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.

상기 복합 추출물의 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

상기 복합 추출물은 노각나무 잎 추출물과 꾸지뽕나무 잎 추출물이 1:1 내지 1:100의 중량비로 포함될 수 있고, 바람직하게는 1:5 내지 1:20, 더욱 바람직하게는 1:7 내지 1:15, 가장 바람직하게는 1:10의 중량비로 포함될 수 있다.

본 발명의 다른 일 측면에 따르면,

노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물을 유효성분으로 함유하는 관절염 예방 또는 개선용 식품 조성물이 제공된다.

상기 복합 추출물은 노각나무 잎 추출물과 꾸지뽕나무 잎 추출물이 1:1 내지 1:100의 중량비로 포함될 수 있다.

본 발명의 노각나무 잎과 꾸지뽕나무 잎으로부터 추출된 추출물을 포함하는 복합 추출물은 연골세포에 손상을 미치는 효소인 MMP-1, 3, 13의 유전자 발현을 효과적으로 억제하여, 관절염을 예방하고 개선 또는 치료하는데 현저한 효과를 나타내며, 특히 노각나무 잎 추출물 또는 꾸지뽕나무 잎 추출물을 단독으로 사용한 것에 비하여 관절염 예방 또는 치료에 시너지 효과를 나타낼 수 있다.

도 1은 실험예 1에 따른 노각나무 잎 추출물의 세포 독성 실험 결과이다.
도 2는 실험예 1에 따른 꾸지뽕나무 잎 추출물의 세포 독성 실험 결과이다.
도 3은 제조예 3의 노각나무 잎 + 꾸지뽕나무 잎 혼합 추출물의 세포 독성 실험 결과이다.
도 4 및 도 5는 실험예 2의 MMPs 발현 저해 활성 분석 결과이다.
도 6 내지 도 9는 실험예 3의 염증성 사이토카인 발현 저해 활성 분석 결과이다.
도 10 내지 도 13은 실험예 3에 따른 제조예 3의 혼합 추출물처리 농도별 염증성 사이코카인 저해 효과 분석 결과이다.
도 14는 실험예 4에 따른 제조예 3의 혼합 추출물 처리 농도별 NO 생성량 측정 결과이다.
도 15는 실험예 4에 따른 제조예 3의 혼합 추출물 처리 농도별 iNOS 단백질 생성량 측정 결과이다.
도 16은 실험예 4에 따른 제조예 3의 혼합 추출물 처리 농도별 iNOS mRNA 발현 수준 측정 결과이다.
도 17은 실험예 5에 따른 제조예 3의 혼합 추출물의 처리 농도별 COX-2 단백질 생성량 측정 결과이다.
도 18은 실험예 5에 따른 제조예 3의 혼합 추출물의 처리 농도별 COX-2 mRNA 발현 수준 측정 결과이다.
도 19는 본 발명의 동물 실험 진행 과정을 나타낸 것이다.
도 20 내지 도 22는 실험예 6의 동물실험에 따른 염증성 사이토카인 생성 수준을 분석한 결과이다.
도 23은 실험예 7에 따른 실험 마우스의 비장 크기 비교 사진이다.
도 24는 실험예 7에 따른 실험 마우스의 비장 무게 측정 결과이다.
도 25는 실험예 7에 따른 실험 마우스의 림프절 크기를 비교한 사진이다.
도 26은 실험예 7에 따른 실험 마우스의 림프절 무게 측정 결과이다.
도 27은 실험예 8에 따른 프로테오글리칸(Proteoglycan)의 합성 수준 분석 결과이다.
도 28은 실험예 9에 따른 실험 마우스의 발과 발목의 관절 부종을 관찰한 사진이다.
도 29는 실험예 9에 따른 실험 마우스의 체중 변화를 분석한 결과이다.
도 30은 실험예 10에 따른 실험 마우스에 대한 관절염의 전체적 면역 증상을 평가 결과이다.
도 31은 실험예 10에 따른 실험 마우스의 발가락 관절 변형 정도를 측정한 결과이다.
도 32는 실험예 11에 따른 관절염 부종의 정도 분석 결과이다.
도 33은 실험예 11에 따른 부종에 의한 발과 발목의 두게 측정 결과이다.
도 34는 실험예 12에 따른 실험 마우스의 발의 전반적 염증 상태 분석 결과이다.
도 35는 실험예 13에 따른 무릎 관절 상태 분석 결과이다.
도 36은 실험예 14에 따른 진통 효과 테스트 결과이다.

이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 설명한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 노각나무 잎과 꾸지뽕나무 잎을 각각 또는 혼합하여 용매에 투입하고 80 내지 120 ℃의 온도에서 1 내지 10 시간 동안 추출한 후 여과 및 농축하는 것을 특징으로 하는 꾸지뽕나무 잎 추출물의 제조방법을 제공한다.

구체적으로 상기 노각나무 잎과 꾸지뽕나무 잎을 각각 또는 혼합한 상태로 건조시켜 분쇄한 후, 건조 중량의 1 내지 30 배, 바람직하게는 5 내지 15배 부피의 용매에 투입하고, 80 내지 120 ℃의 온도에서 1 내지 5시간 동안 추출하는 것이 바람직하다.

이때, 상기 용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 또는 이들의 혼합물인 것이 바람직한데, 더욱 바람직하게는 물을 사용하는 것으로, 열수추출하는 것이 바람직하다.

추출 공정을 수행한 후에는 부직포로 여과하여 불순물을 제거하고, 여액을 고형분 함량이 15% 이상이 되도록 농축하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 농축한 다음 농축물을 동결건조 또는 열풍건조 또는 분사 방식에 의한 건조 등을 통하여 노각나무 잎 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 분말화하는 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 용어 ‘추출물’은 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 또한, 상기 추출물이나 분획물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물에 포함된다.

한 구체예에서, 상기 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물은 유기용매 추출물을 제2의 유기용매로 재분획한 분획물일 수 있다. 여기에서, 유기용매 추출물이라 함은 광의로는 앞서 설명한 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물의 오일 분획, 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물의 액상 분획, 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물의 왁스 분획을 모두 포함하며, 협의로는 이 중 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물의 액상 분획을 의미한다. 그러므로, 한 구체예에서, 상기 유기 추출물을 제2의 유기용매로 재분획한 분획물은 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물의 액상 분획을 제2의 유기 용매로 재분획한 분획물을 의미할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물은 저급 알코올 추출물을 제2의 유기용매로 재분획한 분획물일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물은 에탄올 추출물을 헥산으로 재분획한 분획물일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 ‘추출물’은 노각나무 잎 및 꾸지뽕나무 잎에 추출용매를 처리하여 얻은 조추출물뿐만 아니라 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물의 가공물도 포함한다. 예를 들어, 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물은 광의로는 노각나무 잎 및 꾸지뽕나무 잎 자체를 동물에게 투여할 수 있도록 제형화된 노각나무 잎 및 꾸지뽕나무 잎 가공물, 예컨대, 노각나무 잎 및 꾸지뽕나무 잎 분말도 포함하는 의미를 갖는다. 비록 본 발명에서 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물로 실험을 진행하긴 하였으나, 노각나무 잎 및 꾸지뽕나무 잎 가공물과 같은 형태로도 목적하는 효과를 달성할 수 있음은 당업자라면 예상 가능할 것이다.

한편, 본 명세서에서 용어 ‘유효성분으로 포함하는’이란 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 조성물 내에서 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물은 예를 들어, 0.001 mg/kg 이상, 바람직하게는 0.1 mg/kg 이상, 보다 바람직하게는 10 mg/kg 이상, 보다 더 바람직하게는 100 mg/kg 포함된다. 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물은 천연물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 꾸지뽕나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 관절염 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

상기 꾸지뽕나무 잎 추출물의 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 알코올 음료류, 과자류, 다이어트바, 유제품, 육류, 초코렛, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.

본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 꾸지뽕나무 잎 추출물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)] 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 꾸지뽕나무 잎 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 꾸지뽕나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 관절염의 개선, 예방 또는 치료용 식품 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 건강기능식품이란, 꾸지뽕나무 잎 추출물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 보이는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강기능식품에 있어서의 꾸지뽕나무 잎 추출물의 첨가량은, 대상인 건강기능식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 환제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다. 한 구체예에서, 본 발명의 건강기능식품은 환제, 정제, 캡슐제 또는 음료의 형태일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 꾸지뽕나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 약학 조성물을 연골세포에 손상을 미치는 효소인 MMP-1, 3, 13의 유전자 발현을 억제할 수 있다.

상기 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13은 MMP(matrix metalloproteinase)계열로, 인체의 연골세포에 손상을 미치는 효소로서 상기 효소가 발현됨에 따라 연골세포에 손상을 유도하는 역할을 한다.

즉, 상기 MMP의 활성을 저해하여 연골세포의 손상을 억제함으로써 관절 내 염증을 억제하여 관절염을 예방 또는 치료하는 것이 중요하다.

따라서 본 발명에서는 후술하는 실시예를 통해, 꾸지뽕나무 잎 추출물이 인체 내 연골세포에 적용되어, MMP 효소의 활성을 저해하여 관절염을 예방 또는 치료하는데 효과적임을 확인하였다.

또한 상기 약학 조성물은 염증 유도 사이토카인인 TNF-α의 발현을 억제할 수 있다.

한편, 본 명세서에서 용어 ‘유효성분으로 포함하는’이란 본 발명의 꾸지뽕나무 잎 추출물이 관절염을 억제하는데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.

이에, 본 발명에 따른 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물은 상기 약학 조성물의 총 중량에 대하여 꾸지뽕나무 추출물을 0.1 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하나, 상기 함량으로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있으며, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시립, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀루로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들며, 전분, 탄산칼슘(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여법이라면 어느 것이나 사용 가능하고, 전신 투여 또는 국소 투여가 가능하나, 전신 투여가 더 바람직하며, 정맥 내 투여가 가장 바람직하다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 0.03 g/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 8 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하의 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.

또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실 험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.

[실시예]

제조예 1: 노각나무 잎 열수 추출물

전라남도 신안군 일대에서 채집한 노각나무(Stewartia pseudocamellia Maxim.) 잎을 자연 건조 시킨 후 사용하였다. 건조된 노각나무 잎을 물과 1:10(w/v)의 비율로 100 ℃에서 4시간 동안 열수추출(COSMOS-660 동서기계)한 후 부직포로 여과하여 불순물을 제거하였다. 여과된 노각나무 잎 추출액을 고형분 함량이 15% 이상이 되도록 감압 농축하여 노각나무 잎의 열수 추출물을 수득하였다.

제조예 2: 꾸지뽕나무 잎 열수 추출물

노각나무(Stewartia pseudocamellia Maxim.) 잎 대신에 꾸지뽕나무(Cudrania tricuspidata) 잎을 사용한 것을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 꾸지뽕나무 잎의 열수 추출물을 제조하였다.

제조예 3: 꾸지뽕나무 잎 + 노각나무 잎 혼합 열수 추출물

제조예 1의 노각나무 잎의 열수 추출물과 제조예 2의 꾸지뽕나무 잎의 열수 추출물을 1:10의 중량비로 혼합하여 혼합 열수 추출물을 제조하였다.

[실험예: 생체 외 실험]

실험예 1: 세포 독성 확인(MTT)

제조예 1의 노각나무 잎 추출물과 제조예 2의 꾸지뽕나무 잎 추출물 각각에 대하여 관절활액세포(fibroblast-like synoviocyte, FLS)에 대한 세포 독성 실험을 수행하였고, 제조예 1의 노각나무 잎 추출물의 세포 독성 실험 결과를 도 1에 나타내었고, 제조예 2의 꾸지뽕나무 잎 추출물의 세포 독성 실험 결과를 도 2에 나타내었으며, 제조예 3의 노각나무 잎 + 꾸지뽕나무 잎 혼합 추출물의 세포 독성 실험결과를 도 3에 나타내었다.

도 1 내지 3에서 확인할 수 있듯이, 노각나무 잎 추출물, 꾸지뽕나무 잎 추출물을 최대 1000 ㎍/㎖의 농도에서 처리하여도 FLS의 독성에는 별다른 영향이 없음을 확인할 수 있었으며, 그의 혼합 추출물을 최대 2000 ㎍/㎖의 농도에서 처리하여도 FLS의 독성에는 별다른 영향이 없는 것으로 나타나 추출물의 고농도 섭취가 가능함을 확인할 수 있었다.

실험예 2: MMPs 발현 저해 활성 분석

제조예 1의 노각나무 잎 추출물 20 ㎍/㎖(실험군 1), 제조예 2의 꾸지뽕나무 잎 추출물 200 ㎍/㎖(실험군 2), 제조예 3의 노각나무 잎 추출물 20 ㎍/㎖ + 꾸지뽕나무 잎 추출물 200 ㎍/㎖(실험군 3)을 각각 분석 시료로 사용하였다.

in vitro 상에서 염증 환경을 조성하기 위하여 관절혈액세포(fibroblast-like cynoviocyte, FLS)에 염증 유도 물질을 처리한 후, 각 시료의 유전자 발현 저해 활성을 분석하였다. 염증 유도 물질로는 널리 사용되고 있는 TNF-α(Tumor necrosis factor)를 사용하였으며, 사전 실험 결과 FLS에서는 TNF-α를 1 ng/㎖의 농도로 6시간 이상 처리하면 관절염에 관련된 인자들의 발현이 증가함을 확인하였다.

6-well cell culture plate를 사용하여 10% FBS, 1% antibiotics가 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 FLS 세포를 균일하게 분배하고 80% 이상 자라면 serum-free 배지에 TNF-α 단독 또는 TNF-α와 각 시료를 혼합하여 처리 농도별로 녹여 각 well 당 2 mL씩 18시간 동안 처리하였다. 18시간 후 각 well에서 용액을 제거하고 RNA-Bee 용액을 사용하여 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA의 농도를 측정하고 5 μg의 RNA를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 사용하여 각 target gene에 따른 primer를 사용하여 PCR을 수행하였으며, 2% agarose gel을 사용하여 전기영동 후 결과를 이미지화 하였다.

각 추출물 및 혼합물의 연골 손상 방지 활성을 확인하기 위하여 연골을 파괴하여 손상을 입히는 효소인 MMPs(matrix metalloproteinases)의 유전자 발현 저해 활성을 분석하고, 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.

도 4 및 도 5에 따르면, 실험군 1, 2 및 3 모두 TNF-α로 유도된 MMPs 유전자 발현을 저해하는 것으로 나타났으나, 실험군 3의 혼합 추출물에서 저해 효과가 더 높게 나타났다.

실험예 3: 염증성 사이토카인 발현 저해 활성 분석

실험예 2과 동일한 실험군 1 내지 3을 분석 시료로 사용하였다.

6-웰 플레이트를 사용하여 10% FBS, 1% antibiotics가 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 FLS 세포를 균일하게 분배하고 80% 이상 자라면 serum-free 배지에 TNF-α 단독 또는 TNF-α와 각 시료를 혼합하여 처리 농도별로 녹여 각 well 당 2 mL씩 18시간 동안 처리하였다. 18시간 후 각 well에서 용액을 제거하고 RNA-Bee 용액을 사용하여 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA의 농도를 측정하고 5 μg의 RNA를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 사용하여 각 target gene에 따른 primer를 사용하여 PCR을 수행하였으며, 2% agarose gel을 사용하여 전기영동 후 결과를 이미지화 하였다.

실험군들의 대표적인 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-1β, TNF-α의 유전자 발현 저해 활성을 분석하였고, 그 결과를 도 6 내지 도 9에 나타내었다.

도 6 내지 도 9에 따르면, 실험군 1, 2 및 3 모두 TNF-α로 유도된 염증성 사이토카인들의 발현을 저해하는 것으로 나타났으나, 그 중 노각나무 잎과 구찌뽕나무 잎의 혼합 추출물에서 저해 효과가 더 높은 것으로 나타났다.

한편, 상기 실험에서 염증성 사이토카인 저해 효과가 높은 제조예 3의 혼합 추출물에 대하여 처리 농도별 염증성 사이토카인 저해 효과를 분석하였다. 구체적으로, Raw 264.7 cell은 DMEM 배지를 이용하여 5×10⁵cells/㎖로 조절한 후 6-웰 플레이트에 접종하고, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 세포에 1 ㎍/㎖의 LPS를 처리한 후 1시간 후에 제조예 3의 혼합 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 후 얻어진 상층액의 pro-inflammatory cytokine 함량을 측정하였으며, 정량은 ELISA kit를 이용하여 정량하였다. 이와 같이, 제조예 3의 혼합 추출물 처리 농도에 따른 염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6, TNF-α의 mRNA 발현 수준을 측정하였고(##P < 0.01 : vs Ctl., **P < 0.01 : vs LPS), 그 결과를 도 10 내지 도 13에 나타내었다.

도 10은 PCR 수행 후 결과 이미지이고, 도 11은 IL-1β의 mRNA 발현 수준을 나타낸 그래프이고, 도 12는 IL-6의 mRNA 발현 수준을 나타낸 그래프이고, 도 13은 TNF-α의 mRNA 발현 수준을 나타낸 그래프이다. 이에 따르면, 실험예 3의 혼합 추출물은 독성이 나타나지 않는 1000㎍/㎖ 농도 처리시 IL-6 발현이 현저히 저해된 것으로 나타났고, TNF-α의 발현은 상대적으로 낮은 농도인 200㎍/㎖ 처리시에도 유의적으로 감소하였다.

실험예 4: NO 생성 및 iNOS 단백질과 mRNA 발현 수준 분석

NO 발현을 측정하기 위하여 Raw 264.7 세포를 실험예 3과 동일한 조건으로 배양하고 LPS를 1 ㎍/㎖농도로 처리하였다. 1시간 후 serum free DMEM 로 희석된 제조예 3의 혼합 추출물을 농도별로 처리한 후 24시간 인큐베이터에서 배양하였다. 배양이 끝난 세포의 상등액과 그리스 시약(Sigma)을 1:1 비율로 혼합한 뒤 10분간 반응시켰다. 이후, ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준농도 곡선은 sodium nitrite (NaNO₂)를 serial dilution하여 얻었으며, 각 군의 평균 흡광도 값을 측정한 후 NO 생성량(μM)을 측정하고 (^##P < 0.01 : vs Ctl., ^**P < 0.01 : vs LPS or Ctl.), 그 결과를 도 14에 나타내었다. 이에 따르면, 제조예 3의 혼합 추출물을 200㎍/㎖ 처리시부터 유의적으로 NO 생성 농도가 낮아졌으며, 1000㎍/㎖ 처리시에는 10 μM 미만으로 매우 낮은 NO 생성 농도를 나타내었다.

한편, 제조예 3의 혼합 추출물의 농도별 처리시 iNOS 단백질과 iNOS mRNA 발현 수준을 측정하여(##P < 0.01 : vs Ctl., **P < 0.01 : vs LPS) iNOS 단백질 발현 측정 결과를 도 15에 나타내었고, iNOS mRNA 발현 측정 결과를 도 16에 나타내었다.

이에 따르면, 제조예 3의 혼합 추출물을 200㎍/㎖ 처리시부터 iNOS 단백질 발현이 유의적으로 낮아졌으며, 500㎍/㎖ 처리시부터는 iNOS mRNA 발현이 유의적으로 낮아졌다. 또한, 제조예 3의 혼합 추출물을 1000㎍/㎖ 농도로 처리한 경우 iNOS 단백질과 mRNA 발현이 약 10% 수준으로 현저히 낮아진 것으로 나타났다.

실험예 5: COX-2 단백질 및 mRNA 발현 수준 분석

실험예 3과 동일한 조건으로 Raw 264.7 세포를 배양하고 염증 유도하고, 제조예 3의 혼합 추출물의 농도별 처리시 COX-2 단백질과 COX-2 mRNA 발현 수준을 측정하여(##P < 0.01 : vs Ctl., *P < 0.05,**P < 0.01 : vs LPS) COX-2 단백질 발현 측정 결과를 도 17에 나타내었고, COX-2 mRNA 발현 측정 결과를 도 18에 나타내었다.

이에 따르면, 제조예 3의 혼합 추출물을 200㎍/㎖ 처리시부터 COX-2 단백질과 COX-2 mRNA 발현이 유의적으로 낮아진 것으로 나타났다.

실험에 사용한 프라이머 정보 및 PCR 수행 조건은 아래의 표 1에 정리한 바와 같다.

Gene	Sequence	Size (bp)	Tm (℃)	Cycle
iNOS	F : ttg aag ccc cgc tac tac tc	510	64	30
	R : gag cac gct gag tac ctc at
COX-2	F : ggt ctg gtg cct ggt ctg at	724	64	30
	R : gtc ctt tca agg aga atg gt
IL-1β	F : tgt ctt tcc cgt gga cct tc	475	64	30
	R : ttg ggg aac tct gca gac tc
IL-6	F : ttg gga ctg atg ctg gtg ac	510	64	30
	R : cca ctc ctt ctg tga ctc ca
TNF-α	F : aaa aga tgg ggg gct tcc ag	524	64	30
	R : tac cag ggt ttg agc tca gc
GAPDH	F : ttc acc acc atg gag aag gc	492	64	30
	R : tgc ctg ctt cac cac ctt ct

[실험예: 생체 내 실험]

도 19는 이하 동물 실험 진행과정을 나타낸 것이다. 이를 참조하여 동물 실험의 진행 과정을 설명하도록 한다.

(1) 마우스 적응

6 내지 7주령의 수컷 마우스 2주의 적응 기간을 거치게 하였다.

(2) CIA 유도

이후, 마우스에 CFA(Complete Freund's Adjuvant)와 1：1 (v/v)비율로 섞은 Bovine Type II collagen 100㎕를 꼬리 부분에 피하로 주사하여 류마티스 관절염(collagen-induced arthritis, CIA)을 유도하였다. 이후, 14일 동안 2일마다 한번씩 체중을 측정하고, 제조예 2의 꾸지뽕 추출물 200mg/kg(체중), 제조예 3의 혼합 추출물 200mg/kg(체중)을 경구 투여하였다.

(3) CIA 부스팅(boosting)

이후 IFA(Incomplete Freund's Adjuvant)와 1：1 (v/v)비율로 섞은 Bovine Type II collagen 100㎕를 꼬리 부분에 피하로 주사하여 CIA를 부스팅하였다. 이후 14일 동안(실험시작 후 28일 경과) 2일마다 한번씩 체중을 측정하고, 관절염 진행 과정을 관찰 및 측정하였다.

(4) Synchronizing

이후 LPS 20㎍를 복강 내 주사(IP injection)하고 22일 동안(실험시작 후 50일 경과) Synchronizing 하였다.

(5) 관찰

이후 실험 마우스들을 희생시켜 이하 실험예들과 관련된 항염증 효과를 측정하였다.

실험예 6: 염증성 사이토카인 생성 수준 분석

실험 마우스의 혈액을 채취하여 염증성 사이토카인 IL-6, TNF-α, IL-1β의 생성 수준 분석을 수행하고(^##P < 0.01 : vs Ctl., ^**P < 0.01 : vs Veh. ,^***P < 0.01 : vs CTE), 그 결과를 도 20 내지 도 22에 나타내었다.

이에 따르면, 꾸지뽕 추출물 투여군(CTE)과 꾸지뽕 + 노각나무 혼합 추출물 투여군(CTE Mix.)은 모두 IL-6, TNF-α, IL-1β 생성 억제능을 나타내었으며, 혼합 추출물 투여군이 꾸지뽕 단독 추출물 투여군에 비하여 유의적으로 더 높은 IL-6, TNF-α, IL-1β 생성 억제능을 나타내었다.

실험예 7: 면역 관련 조직의 무게 변화 분석

실험 마우스의 비장의 크기를 비교한 사진을 도 23에 나타내었으며, 비장의 무게를 측정(^##P < 0.01 : vs Ctl., ^*P < 0.05,^**P < 0.01 : vs Veh., ,^***P < 0.01 : vs CTE)한 결과를 도 24에 나타내었다.

도 23에 따르면, 비장(spleen)의 크기가 육안으로 관찰하였을 때 꾸지뽕 추출물 투여군(CTE)과 꾸지뽕 + 노각나무 혼합 추출물 투여군(CTE Mix.)은 추출물 비투여군(Vehicle)에 비하여 상당히 작은 크기로 보인다.

도 24에 따르면, 비장(spleen)의 무게가 추출물 비투여군(Vehicle)에 비해 꾸지뽕 추출물 투여군의 무게가 유의적으로 감소하였으며, 혼합 추출물 투여군은 꾸지뽕 추출물 단독 투여군에 비해서도 무게가 유의적으로 감소한 것으로 나타났다.

한편, 실험 마우스의 림프절 크기를 비교한 사진을 도 25에 나타내었으며, 림프절의 무게를 측정(^##P < 0.01 : vs Ctl., ^**P < 0.01 : vs Veh., ^***P < 0.01 : vs CTE)한 결과를 도 26에 나타내었다.

도 25에 따르면, 림프절(Lymph node)의 크기가 육안으로 관찰할 때 꾸지뽕 추출물 투여군(CTE)과 꾸지뽕 + 노각나무 혼합 추출물 투여군(CTE Mix.)은 추출물 비투여군(Vehicle)에 비하여 상당히 작은 크기로 보인다.

도 26에 따르면, 림프절의 무게가 추출물 비투여군(Vehicle)에 비해 꾸지뽕 추출물 투여군, 혼합 추출물 투여군 모두 유의한 수준으로 감소하였다.

실험예 8: 프로테오글리칸(Proteoglycan)의 합성 수준 분석

관절 조직 및 구조 변화 지표를 분석하기 위하여 실험 마우스의 연골 프로테오클리칸의 합성 수준으로 측정하여 (^##P < 0.01 : vs Ctl., ^**P < 0.01 : vs Veh., ,^***P < 0.01 : vs CTE) 그 결과를 도 27에 나타내었다.

이에 따르면, 꾸지뽕 추출물 투여군(CTE)과 꾸지뽕 + 노각나무 혼합 추출물 투여군(CTE Mix.)은 추출물 비투여군(Vehicle)에 비하여 프로테오클리칸의 농도가 높게 측정되었으며, 혼합 추출물 투여군이 꾸지뽕 단독 추출물 투여군에 비하여 프로테오글리칸 농도가 유의적으로 더 높게 측정되었다.

실험예 9: 관절 부종 및 체중 변화 분석

임상적 증상 지표를 분석하기 위하여 실험 마우스의 발과 발목의 관절 부종을 관찰한 사진을 도 28에 나타내었다.

이에 따르면, 추출물 비투여군(Vehicle)에 비하여 꾸지뽕 추출물 투여군(CTE)과 꾸지뽕 + 노각나무 혼합 추출물 투여군(CTE Mix.)의 부종이 완화되었음을 육안으로 확인할 수 있었으며, 꾸지뽕 단독 추출물 투여군에 비하여 혼합 추출물 투여군은 관절염을 유발하지 않은 대조군과 거의 같은 수준으로 부종이 가라앉고 정상적인 상태가 되었음을 확인하였다.

한편, 실험기간 동안 관절염 진행에 따른 체중 변화를 측정하여(^#P < 0.05, ^##P < 0.01 : vs Ctl., ^*P < 0.05,^**P < 0.01 : vs Veh.), 그 결과를 도 29에 나타내었다.

이에 따르면, 추출물 비투여군(Vehicle)은 실험개시일 30일 경과시부터 급격한 체중 감소를 보이다가 40일 경과시부터 서서히 체중을 회복하였으며, 이에 비해 꾸지뽕 추출물 투여군(CTE)과 꾸지뽕 + 노각나무 혼합 추출물 투여군(CTE Mix.)은 30일이 경과된 후에도 체중이 감소하지 않고 대체로 안정적으로 증가하였다. 또한, 꾸지뽕 단독 추출물에 비하여 체중이 더욱 높게 유지됨을 확인할 수 있다.

실험예 10: 관절염 증상 분석

실험 마우스의 관절염의 전체적 면역 증상을 0 내지 4의 스코어로 하여 평가하고(^##P < 0.01 : vs Ctl., ^*P < 0.05,^**P < 0.01 : vs Veh.), 그 결과를 도 30에 나타내었으며, 이때 높은 점수일수록 관절염의 전체적인 증상이 높은 것이다.

이에 따르면, 추출물 비투여군(Vehicle)은 실험개시일 22일 경과 후부터 관절염 증상이 급격히 증가하며, 30일 이후에도 3점에 가까운 높은 점수를 유지하다가 38일 경과시에는 3점을 더 높아져 이를 유지하였다. 이에 반해, 실험기간 동안 관절염 증상이 꾸지뽕 추출물 투여군(CTE)과 꾸지뽕 + 노각나무 혼합 추출물 투여군(CTE Mix.)은 실험개시일 20일 이후 관절염 증상이 높아져 28일 경과시 약 1.5점에 가까이 평가되지만, 이후에는 증상이 서서히 완화되어 실험 종료시에는 관절염 증상이 매우 완화되었다. 특히, 혼합 추출물 투여군은 꾸지뽕 단독 추출물 투여군에 비하여 관절염 증상이 더 적고, 관절염 증상이 거의 해소되었다.

한편, 실험 마우스의 발가락 관절의 변형 정도를 0 내지 20의 스코어로 측정하고(^##P < 0.01 : vs Ctl., ^**P < 0.01 : vs Veh.) 그 결과를 도 31에 나타내었다. 이에 따르면, 실험개시일 28일 이후 추출물 비투여군(Vehicle)은 발가락 관절의 변형이 급격히 증가하여 38일 경과시에는 16점으로 발가락 관절 변형이 매우 크게 측정되었다. 이에 반해, 꾸지뽕 추출물 투여군(CTE)과 꾸지뽕 + 노각나무 혼합 추출물 투여군(CTE Mix.)은 발가락 변형 정도가 추출물 비투여군(Vehicle)에 비하여 현저히 작으며, 꾸지뽕 추출물 투여군(CTE)에 비하여 혼합 추출물 투여군의 발가락 변형 정도가 더욱 낮게 측정되었다.

실험예 11: 관절염 부종의 정도 분석

실험 마우스의 관절염의 심각한 정도 즉 부종 정도를 0 내지 24의 스코어로 하여 평가하고(^##P < 0.01 : vs Ctl., ^*P < 0.05,^**P < 0.01 : vs Veh.), 그 결과를 도 32에 나타내었으며, 이때 높은 점수일수록 관절염의 전체적인 증상이 높은 것이다.

이에 따르면, 실험개시일 28일 이후 추출물 비투여군(Vehicle)은 부종이 급격히 증가하여 38일 경과시에는 20점으로 매우 크게 측정되었으며 실험 종료시까지 부종의 회복이 거의 되지 않았다. 이에 반해, 꾸지뽕 추출물 투여군(CTE)과 꾸지뽕 + 노각나무 혼합 추출물 투여군(CTE Mix.)은 부종의 정도가 추출물 비투여군(Vehicle)에 비하여 현저히 작으며, 꾸지뽕 추출물 투여군(CTE)에 비하여 혼합 추출물 투여군은 부종의 정도가 매우 경미하였으며, 실험 44일 경과시 부터는 꾸지뽕 추출물 투여군에 비하여 유의적(P < 0.01 : vs CTE )으로 부종이 감소하였으며, 실험종료시에는 대조군과 거의 유사한 수준으로 나타났다.

한편, 부종에 의한 발과 발목의 두께를 측정하여 그 결과를 도 33에 나타내었다(^#P < 0.05, ^##P < 0.01 : vs Ctl., ^*P < 0.05,^**P < 0.01 : vs Veh.). 여기서 (a)는 앞발의 두께, (b)는 뒷발의 두께. (c)는 뒷발목의 두께의 측정 결과이다.

이에 따르면, 추출물 비투여군(Vehicle)은 발과 발목의 두께가 실험개시일 24일 후부터 증가하기 시작하여 30일 이후에는 급격히 증가하여 38일 이후부터 약 4.5mm 의 두께로 부종이 있는 상태가 지속되었지만, 꾸지뽕 추출물 투여군(CTE)과 혼합 추출물 투여군은 부종이 약간 나타나기는 하였으나 매우 경미 하였으며 특히 혼합 추출물 투여군(CTE Mix.)은 대조군과 차이가 없는 정도였다.

실험예 12: 염증 상태 분석

실험 마우스의 발의 전반적인 염증상태 및 기능성을 분석하여 0 내지 6의 스코어로 평가(^##P < 0.01 : vs Ctl., ^**P < 0.01 : vs Veh.)하고 그 결과를 도 34에 나타내었다. 여기서, 높은 스코어일수록 염증상태가 나쁨을 의미한다.

이에 따르면 전반적인 발의 염증상태가 추출물 비투여군(Vehicle)의 경우 실험개시 30일 이후에 급격히 악화되어 36일 이후에 5점 정도의 악화된 상태가 유지되는 것으로 나타났다. 이에 반해, 꾸지뽕 추출물 투여군(CTE)은 실험개시 14일 이후 염증상태가 1 내지 2점 정도로 약간 나빠지고 이와 같은 수준으로 유지하였고, 혼합 추출물 투여군(CTE Mix.)은 실험개시 34일 이후에 염증상태가 매우 빠르게 호전되고, 38일 경과시부터는 꾸지뽕 추출물 투여군과도 유의한 차이(P < 0.01 : vs CTE)를 나타내면서 대조군과 거의 유사한 수준으로 회복된 것으로 나타났다.

실험예 13: 무릎 관절 상태 분석

실험 마우스의 무릎 관절 상태를 분석하여 0 내지 4의 스코어로 평가(^##P < 0.01 : vs Ctl., ^**P < 0.01 : vs Veh.)하고 그 결과를 도 35에 나타내었다. 여기서, 높은 스코어일수록 무릎 관절 상태가 나쁨을 의미한다.

이에 따르면, 추출물 비투여군(Vehicle)은 실험 개시 28일 이후부터 32일 이내에 약 3점 정도로 급격히 나빠져 실험 종료시까지도 관절이 악화된 상태를 유지하였다. 이에 반해, 꾸지뽕 추출물 투여군(CTE)은 관절 상태가 1.5점 미만으로 유지 되었으며, 혼합 추출물 투여군(CTE Mix.)은 꾸지뽕 추출물 투여군에 비해서도 유의적(P < 0.01 : vs CTE )으로 낮은 스코어를 나타내었다.

실험예 14: 진통 효과 테스트

실험 마우스의 발과 발목 부위에 통증을 유발한 후 10분 동안 나타내는 통증 반응을 0 내지 8의 스코어로 평가(^##P < 0.01 : vs Ctl., ^*P < 0.05,^**P < 0.01 : vs Veh.)하여 그 결과를 도 36에 나타내었다. 여기서 점수가 높을수록 통증 반응이 큰 것이다.

이에 따르면, 추출물 비투여군(Vehicle)은 실험 개시 22일 이후부터 계속적으로 통증이 증가하여 44일 경과시에는 32일 이내에는 7점으로 최고치를 나타내었고, 실험 종료시까지도 통증 반응이 크게 줄어들지 않았다. 이에 반해, 꾸지뽕 추출물 투여군(CTE)은 관절 상태가 1.5점 미만으로 유지 되었으며, 혼합 추출물 투여군(CTE Mix.)은 꾸지뽕 추출물 투여군에 비해서도 유의적(P < 0.01 : vs CTE )으로 낮은 스코어를 유지한 것으로 나타났다.

하기에 본 발명의 분말을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

제조예 1의 노각나무 잎 추출물 50 mg

제조예 2의 꾸지뽕나무 잎 추출물 500 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

제조예 1의 노각나무 잎 추출물 30 mg

제조예 2의 꾸지뽕나무 잎 추출물 300 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

제조예 1의 노각나무 잎 추출물 20 mg

제조예 2의 꾸지뽕나무 잎 추출물 200 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

제조예 1의 노각나무 잎 추출물 60 mg

제조예 2의 꾸지뽕나무 잎 추출물 600 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO_4,12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

제조예 1의 노각나무 잎 추출물 400 mg

제조예 2의 꾸지뽕나무 잎 추출물 4 g

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100g으로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 과립제의 제조

제조예 1의 노각나무 잎 추출물 100 mg

제조예 2의 꾸지뽕나무 잎 추출물 1,000 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 mg

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 과립제에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 과립제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 기능성 음료의 제조

제조예 1의 노각나무 잎 추출물 100 mg

제조예 2의 꾸지뽕나무 잎 추출물 1,000 mg

구연산 1,000 mg

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 mL

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

<110> NA, CHUN SOO <120> A composition for improving, preventing and treating arthritis comprising extract of Stewartia pseudocamellia Maxim. leave and Cudrania tricuspidata leaves <130> PCT627 <150> KR 10-2019-0047233 <151> 2019-04-23 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS F <400> 1 ttgaagcccc gctactactc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS R <400> 2 gagcacgctg agtacctcat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 F <400> 3 ggtctggtgc ctggtctgat 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 R <400> 4 gtcctttcaa ggagaatggt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta F <400> 5 tgtctttccc gtggaccttc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta R <400> 6 ttggggaact ctgcagactc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 F <400> 7 ttgggactga tgctggtgac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 R <400> 8 ccactccttc tgtgactcca 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha F <400> 9 aaaagatggg gggcttccag 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha R <400> 10 taccagggtt tgagctcagc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH F <400> 11 ttcaccacca tggagaaggc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH R <400> 12 tgcctgcttc accaccttct 20

Claims

노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물을 유효성분으로 함유하고,
상기 복합 추출물은 노각나무 잎 추출물과 꾸지뽕나무 잎 추출물이 1:1 내지 1:100의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 복합 추출물의 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 또는 이들의 혼합물인 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 복합 추출물은 노각나무 잎 추출물과 꾸지뽕나무 잎 추출물이 1:5 내지 1:20의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물을 유효성분으로 함유하고,
상기 복합 추출물은 노각나무 잎 추출물과 꾸지뽕나무 잎 추출물이 1:1 내지 1:100의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제4항에 있어서,
상기 복합 추출물의 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 또는 이들의 혼합물인 관절염 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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