WO2020218733A2 - 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 관절염의 개선, 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 관절염의 개선, 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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나천수
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/82—Theaceae (Tea family), e.g. camellia

Definitions

  • the present invention relates to a composition for the improvement, prevention or treatment of arthritis containing a juniper leaf extract and a Cudrania tree leaf extract.
  • Degenerative arthritis also called osteoarthritis
  • rheumatoid arthritis is the most common arthritis that occurs mainly in middle or old age, and causes pain, stiffness, and movement disorders in joints that receive a lot of weight, such as knee joints and hip joints.
  • degenerative arthritis mainly involves the formation of chronic inflammation due to the gradual damage to the articular cartilage, and thus a process of degeneration of surrounding tissues.
  • chronic inflammation occurs as transcription factors such as NF-kB and AP-1 are activated in cartilage tissue by accumulation of physical stress, factors that mediate and amplify the inflammatory response such as COX-2 and LOX are expressed.
  • tissue destruction factors such as matrix metalloproteinases (MMPs), hyaluronidase, and iNOS are overexpressed to destroy cartilage tissue, thereby destroying the surrounding muscles, It also affects tissues such as tendons and ligaments, causing severe pain.
  • rheumatoid arthritis is an inflammatory autoimmune disease that occurs in multiple joints.
  • inflammatory cells macrophages, T-cells, B cells, dendritic cells, etc.
  • nogak tree is a deciduous broad-leaved arboreous tree of the dicotyledonous plant Mullenumulaceae, and is distributed in Korea and Japan, and grows above the hillside.
  • the height of the juniper tree is 7 ⁇ 15m, and the bark is blackish reddish brown, peeled into large pieces, and the older it gets, the more smooth it is like a pear tree.
  • Leaves are alternate, elliptical or broad oval, pointed at the end, rounded or blunt at the bottom.
  • the size of the leaf is 4 ⁇ 10cm long and 2 ⁇ 5cm wide, with wavy sawtooth at the edge.
  • the flowers of the juniper are benign, and blooms white in June-July, and hangs on the underarm of the new branch.
  • the flower stalk is 1.5-2 cm long, and the bract is egg-shaped or round.
  • the calyx is round and has villi, and the petals are in the shape of an egg upside down, 5-6, and the pistil of the flower is divided into 5 and joined together, and the stamens are 5.
  • the fruit of the juniper is a capsule, ripening in October, and has a pentagonal shape, and the wood is used for decoration and luxury furniture.
  • the Cudrania tree is a small tall tree that grows at the foot of a sunny mountain or around a village. It is 3-8m in height. There are thorns on the branch. The leaves are ovate, sometimes split into 3 branches, 6-10cm long, 3-6cm wide, and gradually narrow at the top, and the ends become dull. Flowers bloom on male and female trees in May-June. In the male inflorescence, small flowers gather to form a head shape, and short and soft hairs gather. Fruits are achene, a number of pieces gathered to form a ball, fleshy, and ripen from red to black. It mainly grows in the western and southern coastal areas of the south of Hwanghae-do, Korea. It is also distributed in Japan and China. Fruits are edible or medicinal, and leaves are used as feed for silkworms.
  • An object of the present invention is applied as a pharmaceutical composition for preventing or treating arthritis or a food composition for preventing or improving arthritis capable of inhibiting or improving the damage of chondrocytes to a complex extract comprising an extract extracted from the leaves of Nogak and Cudrania trees I want to.
  • compositions for the prevention or treatment of arthritis containing a complex extract comprising a juniper leaf extract and a Cudrania tree leaf extract as an active ingredient.
  • the extraction solvent of the complex extract may be water, an alcohol having 1 to 4 carbon atoms, or a mixture thereof.
  • the complex extract may be included in a weight ratio of 1: 1 to 1: 100, preferably 1:5 to 1:20, more preferably 1:7 to 1:15 , Most preferably may be included in a weight ratio of 1:10.
  • a food composition for preventing or improving arthritis containing as an active ingredient a complex extract comprising a Nogak tree leaf extract and a Cudrania tree leaf extract.
  • the extraction solvent of the complex extract may be water, an alcohol having 1 to 4 carbon atoms, or a mixture thereof.
  • the complex extract may be included in a weight ratio of 1: 1 to 1: 100 of the leaf extract and Cudrania tree leaf extract.
  • a complex extract comprising a juniper leaf extract and a Cudrania tree leaf extract for the manufacture of a medicine for preventing or treating arthritis.
  • a method for treating arthritis comprising administering a pharmaceutical composition containing as an active ingredient a complex extract including a Juniper leaf extract and a Cudrania tree leaf extract to a patient with arthritis.
  • the complex extract containing the extracts extracted from the leaves of Nogak tree and Cudrania tree of the present invention effectively inhibits gene expression of MMP-1, 3, 13, which are enzymes that damage cartilage cells, to prevent, improve or treat arthritis It exhibits a remarkable effect in the prevention or treatment of arthritis, especially compared to the use of the Nogak tree leaf extract or Cudrania tree leaf extract alone.
  • 10 to 13 are the results of analysis of the inhibitory effect of inflammatory psychokines according to the concentration of the mixed extract treatment of Preparation Example 3 according to Experimental Example 3.
  • Figure 19 shows the progress of the animal experiment of the present invention.
  • Cudrania tree leaf extract characterized in that the leaves of Nogak tree and Cudrania tree leaves are added to a solvent, respectively, or mixed and extracted for 1 to 10 hours at a temperature of 80 to 120 °C, followed by filtration and concentration. It provides a method of manufacturing.
  • the solvent is preferably water, an alcohol having 1 to 4 carbon atoms, or a mixture thereof, more preferably water is used, and hot water extraction is preferred.
  • the concentrate is lyophilized or dried by hot air drying or spraying to powder the extract of the leaves of Nogak and Cudrania trees, but is not limited thereto.
  • extract also includes a fraction obtained by further fractionating the extract. That is, the complex extract including the Nogak tree leaf extract and the Cudrania tree leaf extract includes not only those obtained using the above-described extraction solvent, but also those obtained by additionally applying a purification process thereto. In addition, the extract or fraction obtained by passing through an ultrafiltration membrane having a certain molecular weight cut-off value, separation by various chromatography (made for separation according to size, charge, hydrophobicity or affinity), etc. Fractions obtained through various purification methods are also included in the complex extract including the Nogak tree leaf extract and Cudrania tree leaf extract of the present invention.
  • the complex extract including the Nogak tree leaf extract and Cudrania tree leaf extract may be a fraction obtained by re-fractionating the organic solvent extract with a second organic solvent.
  • organic solvent extract in a broad sense refers to the oil fraction of the complex extract including the extract of Nogak tree leaf and Cudrania tree leaf extract described above, the liquid fraction of the complex extract including Nogak tree leaf extract and Cudrania tree leaf extract, It includes all the wax fractions of the complex extract including the Nogak tree leaf extract and the Cudrania tree leaf extract, and among them, it refers to the liquid fraction of the complex extract including the Nogak tree leaf extract and the Cudrania tree leaf extract.
  • the fraction obtained by re-fractionating the organic extract with a second organic solvent is a fraction obtained by re-fractionating the liquid fraction of the complex extract including the Nogak tree leaf extract and the Cudrania tree leaf extract with a second organic solvent.
  • the complex extract including the Nogak tree leaf extract and Cudrania tree leaf extract may be a fraction obtained by re-fractionating a lower alcohol extract with a second organic solvent.
  • the complex extract including the juniper leaf extract and the Cudrania tree leaf extract may be a fraction obtained by re-fractionating the ethanol extract with hexane.
  • extract includes not only crude extract obtained by treating the leaves of Nogak tree and Cudrania tree leaves with an extraction solvent, but also the processed product of complex extracts including Nogak tree leaf extract and Cudrania leaf extract.
  • the complex extract including the juniper leaf extract and the Cudrania tree leaf extract may be prepared in a powder state by additional processes such as distillation under reduced pressure and freeze drying or spray drying.
  • the complex extract comprising the leaf extract and Cudrania tree leaf extract of the present invention is, in a broad sense, a processed tree leaf and Cudrania tree leaf, formulated so as to administer the leaf itself to an animal, For example, it has the meaning of including juniper leaf and Cudrania tree leaf powder.
  • a complex extract including a hinoki tree leaf extract and a Cudrania tree leaf extract in the present invention it is expected by those skilled in the art that the desired effect can be achieved even in the form of a hinoki tree leaf and Cudrania tree leaf processed product. It will be possible.
  • the term "including as an active ingredient” means including an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of the complex extract including the Nogak tree leaf extract and the Cudrania tree leaf extract.
  • the complex extract comprising the hinoki tree leaf extract and the Cudrania tree leaf extract is, for example, 0.001 mg/kg or more, preferably 0.1 mg/kg or more, more preferably Preferably, 10 mg/kg or more, and even more preferably 100 mg/kg are included.
  • the complex extract containing the juniper leaf extract and the Cudrania tree leaf extract is a natural product and does not have side effects on the human body even when administered in excessive amounts
  • the quantitative upper limit of the complex extract including the juniper leaf extract and the Cudrania tree leaf extract contained in the composition of the present invention The skilled person can select and carry out within an appropriate range.
  • Another aspect of the present invention provides a food composition for preventing or improving arthritis containing a Cudrania tree leaf extract as an active ingredient.
  • the extraction solvent of the Cudrania tree leaf extract may be water, an alcohol having 1 to 4 carbon atoms, or a mixture thereof.
  • the food composition according to the present invention may be formulated in the same manner as the pharmaceutical composition and used as a functional food or added to various foods.
  • Foods to which the composition of the present invention can be added include, for example, beverages, alcoholic beverages, confectionery, diet bars, dairy products, meat, chocolate, pizza, ramen, other noodles, gum, ice cream, vitamin complexes, health supplements. Etc.
  • the food composition of the present invention may include not only a Cudrania tree leaf extract as an active ingredient, but also an ingredient commonly added during food production, and includes, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients, flavoring agents, and flavoring agents. do.
  • examples of the aforementioned carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose, and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose, oligosaccharides, and the like; And polysaccharides, for example, common sugars such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents [taumatin, stevia extract (eg, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.)] and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be used.
  • synthetic flavoring agents sacharin, aspartame, etc.
  • the food composition of the present invention is made of drinks and beverages, citric acid, liquid fructose, sugar, glucose, acetic acid, malic acid, fruit juice, and various plant extracts, in addition to the Cudrania tree leaf extract of the present invention may be further included. have.
  • the present invention provides a health functional food comprising a food composition for improving, preventing or treating arthritis comprising the extract of Cudrania chinensis leaves as an active ingredient.
  • Health functional foods are foods prepared by adding Cudrania tree leaf extract to food materials such as beverages, teas, spices, gums, confectionery, or encapsulated, powdered, or suspension.
  • food materials such as beverages, teas, spices, gums, confectionery, or encapsulated, powdered, or suspension.
  • the health functional food of the present invention obtained in this way is very useful because it can be consumed on a daily basis.
  • the added amount of Cudrania tree leaf extract in such health functional foods cannot be uniformly regulated depending on the type of health functional food to be targeted, but can be added within the range that does not damage the original taste of the food. It is usually 0.01 to 50% by weight, preferably 0.1 to 20% by weight.
  • it is usually added in the range of 0.1 to 100% by weight, preferably 0.5 to 80% by weight.
  • the health functional food of the present invention may be in the form of a pill, tablet, capsule or beverage.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating arthritis comprising the extract of Cudrania chinensis leaf as an active ingredient.
  • the extraction solvent of the Cudrania tree leaf extract may be water, an alcohol having 1 to 4 carbon atoms, or a mixture thereof.
  • the pharmaceutical composition may inhibit gene expression of MMP-1, 3, 13, which are enzymes that damage cartilage cells.
  • the MMP-1, MMP-3, and MMP-13 are MMP (matrix metalloproteinase) series, which are enzymes that damage chondrocytes of the human body, and play a role in inducing damage to chondrocytes as the enzyme is expressed.
  • MMP matrix metalloproteinase
  • the Cudrania tree leaf extract was applied to cartilage cells in the human body, thereby inhibiting the activity of the MMP enzyme to prevent or treat arthritis.
  • the pharmaceutical composition may inhibit the expression of TNF- ⁇ , an inflammation-inducing cytokine.
  • the term “including as an active ingredient” means that the extract of Cudrania tree leaves of the present invention contains an amount sufficient to suppress arthritis.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating arthritis according to the present invention preferably comprises 0.1 to 50% by weight of Cudrania tree extract based on the total weight of the pharmaceutical composition, but is not limited to the content.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further include suitable carriers, excipients, and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceuticals, and powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, granules, aerosols, respectively, according to conventional methods. It can be formulated in the form of oral dosage forms such as, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions.
  • Carriers, excipients, and diluents that may be included in the pharmaceutical composition according to the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium Silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxy benzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oils.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations include at least one excipient in the pharmaceutical composition of the present invention, such as starch, calcium carbonate, and sugar. It is prepared by mixing sucrose, lactose, or gelatin. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups, etc.In addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents, various excipients such as wetting agents, sweetening agents, fragrances, and preservatives may be included. have.
  • Preparations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, and suppositories.
  • the non-aqueous solvent and suspension propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate may be used.
  • As a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerol gelatin, and the like may be used.
  • composition of the present invention may be administered orally or parenterally, any parenteral administration method may be used, systemic administration or local administration may be possible, but systemic administration is more preferable, and intravenous administration is most preferable.
  • the preferred dosage of the composition of the present invention varies depending on the condition and weight of the patient, the degree of disease, the form of the drug, the route and duration of administration, but may be appropriately selected by those skilled in the art. However, for desirable effects, the composition of the present invention is preferably administered at 0.0001 to 0.03 g/kg per day, preferably 0.001 to 8 mg/kg. Administration may be administered once a day, or may be divided several times. The above dosage does not in any way limit the scope of the present invention.
  • Leaves of Stewartia pseudocamellia Maxim. collected in Sinan-gun, Jeollanam-do were naturally dried and used.
  • the dried leaves of juniper were extracted with hot water at 100° C. for 4 hours at a ratio of 1:10 (w/v) to water (COSMOS-660 Dongseo Machinery), and then filtered through a nonwoven fabric to remove impurities.
  • the filtered extract of Nogak tree leaf was concentrated under reduced pressure so that the solid content was 15% or more to obtain a hot water extract of Nogak tree leaf.
  • a hot-water extract of Cudrania tricuspidata was prepared in the same manner as in Preparation Example 1, except that Cudrania tricuspidata leaves were used instead of the leaves of Stewartia pseudocamellia Maxim.
  • a mixed hot water extract was prepared by mixing the hot water extract of the leaves of the Nogak tree of Preparation Example 1 and the hot water extract of the leaves of the Cudrania tree of Preparation Example 2 at a weight ratio of 1:10.
  • Cytotoxicity test for joint synovial cells was performed for each of the Nogak tree leaf extract of Preparation Example 1 and the Cudrania tree leaf extract of Preparation Example 2, and the cells of the Nogak tree leaf extract of Preparation Example 1
  • the toxicity test results are shown in FIG. 1, and the cytotoxicity test results of the Cudrania tree leaf extract of Preparation Example 2 are shown in FIG. 2, and the cytotoxicity test results of the mixed extract of Nogak tree leaf + Cudrania tree leaf of Preparation Example 3 are shown. It is shown in 3.
  • Nogak tree leaf extract of Preparation Example 1 20 ⁇ g / ml (Experimental Group 1), Cudrania tree leaf extract of Preparation Example 2 200 ⁇ g / ml (Experimental group 2), Preparation Example 3
  • Nogak tree leaf extract 20 ⁇ g / ml + Cudrania leaves 200 ⁇ g/ml of extract (Experimental Group 3) was used as an analysis sample, respectively.
  • fibroblast-like cynoviocytes FLS were treated with an inflammation-inducing substance, and the gene expression inhibitory activity of each sample was analyzed.
  • TNF- ⁇ Tumor necrosis factor
  • TNF- ⁇ Tumor necrosis factor
  • RNA-Bee solution The concentration of the isolated RNA was measured, and cDNA was synthesized using 5 ⁇ g of RNA. Using the synthesized cDNA, PCR was performed using primers for each target gene, and the results were imaged after electrophoresis using 2% agarose gel.
  • experimental groups 1, 2, and 3 all showed inhibition of TNF- ⁇ -induced MMPs gene expression, but the inhibitory effect was higher in the mixed extract of experimental group 3.
  • fibroblast-like cynoviocytes FLS were treated with an inflammation-inducing substance, and the gene expression inhibitory activity of each sample was analyzed.
  • TNF- ⁇ Tumor necrosis factor
  • TNF- ⁇ Tumor necrosis factor
  • RNA-Bee solution The concentration of the isolated RNA was measured, and cDNA was synthesized using 5 ⁇ g of RNA. Using the synthesized cDNA, PCR was performed using primers for each target gene, and the results were imaged after electrophoresis using 2% agarose gel.
  • the inflammatory cytokine inhibitory effect of each treatment concentration was analyzed for the mixed extract of Preparation Example 3 having a high inflammatory cytokine inhibitory effect.
  • Raw 264.7 cells were adjusted to 5 ⁇ 10 5 cells/ml using DMEM medium, inoculated into a 6-well plate, and cultured in a 5% CO 2 incubator for 24 hours. After the cells were treated with 1 ⁇ g/ml LPS, 1 hour later, the mixed extract of Preparation Example 3 was treated by concentration and cultured for 24 hours. The pro-inflammatory cytokine content of the supernatant obtained after cultivation was measured, and the quantification was quantified using an ELISA kit.
  • Figure 10 is a result image after PCR
  • Figure 11 is a graph showing the mRNA expression level of IL-1 ⁇
  • Figure 12 is a graph showing the mRNA expression level of IL-6
  • Figure 13 is the mRNA expression level of TNF- ⁇ It is a graph showing Accordingly, it was found that the mixed extract of Experimental Example 3 significantly inhibited IL-6 expression when treated at a concentration of 1000 ⁇ g/ml without toxicity, and the expression of TNF- ⁇ was found to be at a relatively low concentration of 200 ⁇ g/ml Also significantly decreased.
  • Raw 264.7 cells were cultured under the same conditions as in Experimental Example 3, and LPS was treated at a concentration of 1 ⁇ g/ml. After 1 hour, the mixed extract of Preparation Example 3 diluted with serum free DMEM was treated by concentration and cultured in an incubator for 24 hours. After the culture was completed, the supernatant of the cells and the grease reagent (Sigma) were mixed in a 1:1 ratio and reacted for 10 minutes. Thereafter, the absorbance was measured at 540 nm using an ELISA reader.
  • the standard concentration curve was obtained by serial dilution of sodium nitrite (NaNO 2 ), and after measuring the average absorbance value of each group, the NO production amount ( ⁇ M) was measured ( ## P ⁇ 0.01: vs Ctl., ** P ⁇ 0.01: vs LPS or Ctl.), the results are shown in FIG. 14. According to this, the concentration of NO production was significantly lowered from the treatment of the mixed extract of Preparation Example 3 at 200 ⁇ g/ml, and the concentration of NO production was very low as less than 10 ⁇ M at the time of treatment at 1000 ⁇ g/ml.
  • Fig. 15 shows the results of measuring iNOS mRNA expression.
  • iNOS protein expression was significantly lowered from 200 ⁇ g/ml treatment of the mixed extract of Preparation Example 3, and iNOS mRNA expression was significantly decreased from 500 ⁇ g/ml treatment.
  • the mixed extract of Preparation Example 3 was treated at a concentration of 1000 ⁇ g/ml, the expression of iNOS protein and mRNA was significantly reduced to about 10% level.
  • Bovine Type II collagen which was mixed with CFA (Complete Freund's Adjuvant) at a ratio of 1:1 (v/v), was injected subcutaneously into the tail to induce rheumatoid arthritis (CIA). Thereafter, the body weight was measured once every two days for 14 days, and 200mg/kg (weight) of the Cudrania extract of Preparation Example 2 and 200mg/kg (weight) of the mixed extract of Preparation Example 3 were administered orally.
  • CFA Complete Freund's Adjuvant
  • both the Cudrania chinensis extract group (CTE) and the Cudrania chinensis + Nogak tree extract-administered group (CTE Mix.) exhibited the ability to inhibit IL-6, TNF- ⁇ , and IL-1 ⁇ production, and the mixed extract-administered group was in the group administered Cudrania chinensis extract alone. Compared to that, it showed significantly higher inhibition of IL-6, TNF- ⁇ , and IL-1 ⁇ production.
  • FIG. 23 A picture comparing the size of the spleen of the experimental mouse is shown in FIG. 23, and the weight of the spleen was measured ( ## P ⁇ 0.01: vs Ctl., * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01: vs Veh.,, * ** P ⁇ 0.01: vs CTE) The results are shown in FIG. 24.
  • the Cudrania extract-administered group (CTE) and the Cudrania root + Nogak-tree mixed extract-administered group (CTE Mix.) appear to be considerably smaller in size than the non-extracted group (Vehicle). .
  • FIG. 25 a picture comparing the size of the lymph nodes of the experimental mice is shown in FIG. 25, and the weight of the lymph nodes is measured ( ## P ⁇ 0.01: vs Ctl., ** P ⁇ 0.01: vs Veh., *** P ⁇ 0.01 : vs CTE) is shown in Figure 26.
  • Cudrania extract-administered group CTE
  • Cudrania + Nogak tree mixed extract-administered group CTE Mix.
  • the weight of the lymph nodes was reduced to a significant level in both the Cudrania extract-administered group and the mixed extract-administered group compared to the non-extracted group (Vehicle).
  • the concentration of proteoclycan was measured higher in the Cudrania chinensis extract administration group (CTE) and the Cudrania chinensis + Nogak tree mixed extract administration group (CTE Mix.) compared to the non-extracted extract group (Vehicle), and the mixed extract administration group was the Cudrania extract alone extract administration group. Compared to the proteoglycan concentration was measured significantly higher.
  • FIG. 28 In order to analyze the clinical symptom index, a photograph of swelling of the joints of the feet and ankles of the experimental mice is shown in FIG. 28.
  • the extract non-administration group (Vehicle) showed a rapid weight loss from 30 days after the start of the experiment, and then gradually recovered its weight from 40 days, compared to the group administered with Cudrania extract (CTE) and Cudrania + Nogak tree extract. (CTE Mix.) generally increased stably without losing weight even after 30 days. In addition, it can be seen that the body weight is maintained higher than that of the extract alone kkujippong.
  • the symptoms of arthritis rapidly increased from 22 days after the start of the experiment, and even after 30 days, it maintained a high score close to 3 points, but increased by 3 points after 38 days.
  • the symptoms of arthritis were assessed close to 1.5 points after 28 days, as the symptoms of arthritis increased after the 20th day of the experiment, in the group administered with Cudrania chinensis extract (CTE) and the group administered with Cudrania chinensis extract + Nogak tree extract (CTE Mix.). After that, symptoms were gradually relieved, and arthritis symptoms were very relieved at the end of the experiment.
  • the mixed extract group had fewer symptoms of arthritis and almost alleviated the symptoms of arthritis compared to the group administered with the extract of Cudrania mulberry alone.
  • the degree of toe deformity was significantly smaller in the cuspidpon extract administration group (CTE) and the cudrania chinensis + nogak tree mixed extract administration group (CTE Mix.) compared to the extract non-administration group (Vehicle), and the mixed extract administration group compared to the Cudrania chinensis extract administration group (CTE).
  • the degree of toe deformation of was measured to be lower.
  • the severity of arthritis of the experimental mice was evaluated with a score of 0 to 24 ( ## P ⁇ 0.01: vs Ctl., * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01: vs Veh.), and the results were evaluated. As shown in Fig. 32, the higher the score, the higher the overall symptom of arthritis.
  • the swelling of the non-administration group (Vehicle) increased rapidly, and after 38 days, it was measured as high as 20 points.
  • the degree of edema was significantly smaller in the Cudrania extract administration group (CTE) and the Cudrania chinensis + Nogak tree mixed extract administration group (CTE Mix.) compared to the non-extract vehicle (Vehicle), and the mixed extract administration group compared to the Cudrania extract administration group (CTE).
  • the degree of edema was very mild, and after 44 days of the experiment, the edema decreased significantly (P ⁇ 0.01: vs CTE) compared to the group administered with kkujippong extract, and at the end of the experiment, it was almost similar to that of the control group.
  • the thickness of the feet and ankles began to increase from 24 days after the start of the experiment, and rapidly increased after 30 days, and the state of edema persisted to a thickness of about 4.5 mm from the 38th day.
  • edema was slightly observed in the Cudrania chinensis extract group (CTE) and the mixed extract group, it was very mild.
  • the mixed extract group CTE Mix.
  • the knee joint state of the experimental mice was analyzed and evaluated with a score of 0 to 4 ( ## P ⁇ 0.01: vs Ctl., ** P ⁇ 0.01: vs Veh.) and the results are shown in FIG. 35.
  • the higher the score the worse the knee joint condition.
  • the extract-non-administration group (Vehicle) rapidly deteriorated to about 3 points within 32 days from 28 days after the start of the experiment, and the joint was maintained in a deteriorated state even until the end of the experiment.
  • the joint condition of the Cudrania extract group (CTE) was maintained at less than 1.5 points, and the mixed extract administration group (CTE Mix.) showed a significantly lower score (P ⁇ 0.01: vs CTE) compared to the Cudrania extract administration group. .
  • Pain reactions exhibited for 10 minutes after inducing pain in the feet and ankles of experimental mice were evaluated with a score of 0 to 8 ( ## P ⁇ 0.01: vs Ctl., * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01: vs. Veh.) and the results are shown in FIG. 36.
  • the above ingredients are mixed and filled in an airtight cloth to prepare a powder.
  • tablets are prepared by tableting according to a conventional tablet preparation method.
  • the above ingredients are mixed and filled into gelatin capsules to prepare a capsule.
  • Vitamin A acetate 70 ⁇ g
  • Vitamin B12 0.2 ⁇ g
  • composition ratio of the vitamin and mineral mixture is relatively suitable for granules, but it is possible to arbitrarily modify the mixing ratio. After mixing the above ingredients according to a conventional granule preparation method, granules And can be used to prepare a health functional food composition according to a conventional method.
  • the resulting solution After mixing the above ingredients according to a normal health drink manufacturing method, stirring and heating the resulting solution at 85°C for about 1 hour, the resulting solution is filtered and obtained in a sterilized 2 L container, sealed and sterilized, and stored in a refrigerator. It is used to prepare the functional beverage composition of the invention.
  • composition ratio is composed of ingredients suitable for a relatively preferred beverage in a preferred embodiment, but the mixing ratio may be arbitrarily modified according to regional and ethnic preferences, such as the demand class, the country of demand, and the purpose of use.
  • the complex extract comprising the extract extracted from the leaves of the juniper leaf and the Cudrania tree of the present invention is applied as a pharmaceutical composition for preventing or treating arthritis or a food composition for preventing or improving arthritis capable of suppressing or improving damage to cartilage cells, It can be applied to treat arthritis using this.

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Abstract

본 발명은 노각나무 잎 추출물과 꾸지뽕나무 잎 추출물을 함유하는 관절염의 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 노각나무 잎 추출물과 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물은 연골세포에 손상을 미치는 효소인 MMP-1, 3, 13의 유전자 발현을 효과적으로 억제하여, 관절염을 예방하고 개선 또는 치료하는데 현저한 효과를 나타낸다.

Description

노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 관절염의 개선, 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 함유하는 관절염의 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
관절염은 크게 퇴행성 관절염(골관절염, osteoarthritis)과 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis)으로 구분된다. 퇴행성 관절염은 골관절염이라고도 불리는 가장 흔히 볼 수 있는 관절염으로서 중년 또는 노년에 주로 발생하고, 무릎 관절 및 엉덩이 관절과 같이 체중을 많이 받는 관절에 통증, 경직감 및 운동장애 등을 초래하는 질환이다. 과거에는 단순히 노화현상으로 생각하였으나, 현재는 연령, 유전적 요소, 비만, 관절의 모양, 호르몬 등의 여러 가지 원인이 복합적으로 이루어짐으로써 증상이 다르게 나타나는 것으로 생각되고 있다.
퇴행성 관절염은 주로 관절연골의 점진적 손상에 따라 만성 염증이 형성되고, 이에 따라 주변 조직의 퇴행화 과정을 수반하는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, 물리적인 스트레스의 누적에 의하여 연골조직에 NF-kB 및 AP-1과 같은 전사인자들이 활성화되어 만성염증이 일어나게 되면 COX-2, LOX 등의 염증반응을 매개, 증폭시키는 인자들이 발현되고, 주변의 혈행이 억제되며, 매트릭스 메탈로프로테이나제(matrix metalloproteinases, MMPs), 히알루로니다제(hyaluronidase), iNOS 등 조직 파괴인자들이 과발현되어 연골조직을 파괴하게 되며, 이로 인하여 주변의 근육, 건, 인대 등과 같은 조직에도 영향을 끼쳐 심한 통증을 일으킨다.
반면, 류마티스성 관절염은 여러 관절에 다발성으로 나타나는 염증성 자가면역질환이다. 류마티스성 관절염 증상을 가진 환자의 활막조직과 활액은 염증성 세포들(대식세포, T-세포, B 세포, 수지상 세포(dendritic cells) 등)이 과도하게 작용하여 만성염증을 일으키고, 관절 및 연골 손상을 야기하고 통증을 유발하는 것을 특징으로 한다.
한편, 노각나무는 쌍떡잎식물 물레나물목 차나무과의 낙엽활엽 교목으로 한국ㆍ일본 등지에 분포하며, 산 중턱 이상에서 자란다. 노각나무의 높이는 7~15m이고, 나무 껍질은 흑적갈색으로 큰 조각으로 벗겨져 오래 될수록 배롱나무처럼 미끈해진다. 잎은 어긋나고 타원형 또는 넓은 타원형이며 끝은 뾰족하고 밑은 둥글거나 뭉뚝하다. 잎의 크기는 길이 4~10cm, 나비 2~5cm로 가장자리에 물결 모양의 톱니가 있다.
노각나무의 꽃은 양성으로 6~7월에 백색으로 피며, 새가지의 밑동 겨드랑이에 달린다. 꽃대는 길이 1.5~2 cm이고, 포는 달걀모양 또는 둥근 모양이다. 꽃받침은 둥글고 융모가 있으며, 꽃잎은 달걀을 거꾸로 세운 모양이고 5~6개이며, 꽃의 암술대는 5개로 갈라져 합쳐지고 수술은 5개이다. 노각나무의 열매는 삭과로 10월에 익고, 5각뿔형이고, 목재는 장식재ㆍ고급가구재 등으로 사용된다.
또한, 꾸지뽕나무는 양지바른 산기슭이나 마을 주변에 자라는 작은키나무이다. 높이 3-8m이다. 가지에 가시가 있다. 잎은 난형으로 3갈래로 갈라지기도 하며, 길이 6-10cm, 폭 3-6cm, 위쪽이 점차 좁아지다가 끝은 둔해진다. 꽃은 5-6월에 암수딴그루에 핀다. 수꽃차례는 작은 꽃들이 모여 머리모양을 이루며, 짧고 부드러운 털이 모여 난다. 열매는 수과, 여러 개가 모여 공 모양을 이루며, 다육질이고 붉은색에서 검은색으로 익는다. 우리나라 황해도 이남의 서해안과 남해안 서부지역에 주로 자생한다. 일본과 중국에도 분포한다. 열매는 식용 또는 약용하며, 잎을 누에 사료로 쓰이고 있다.
본 발명의 목적은 노각나무 잎과 꾸지뽕나무 잎으로부터 추출된 추출물을 포함하는 복합 추출물을 연골세포의 손상을 억제 또는 개선시킬 수 있는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 관절염 예방 또는 개선용 식품 조성물로 응용하고자 하는 것이다.
본 발명의 일 측면에 따르면,
노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물을 유효성분으로 함유하는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.
상기 복합 추출물의 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
상기 복합 추출물은 노각나무 잎 추출물과 꾸지뽕나무 잎 추출물이 1:1 내지 1:100의 중량비로 포함될 수 있고, 바람직하게는 1:5 내지 1:20, 더욱 바람직하게는 1:7 내지 1:15, 가장 바람직하게는 1:10의 중량비로 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면에 따르면,
노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물을 유효성분으로 함유하는 관절염 예방 또는 개선용 식품 조성물이 제공된다.
상기 복합 추출물의 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
상기 복합 추출물은 노각나무 잎 추출물과 꾸지뽕나무 잎 추출물이 1:1 내지 1:100의 중량비로 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면에 따르면,
관절염 예방 또는 치료용 의약 제조를 위한 노각나무 잎 추출물과 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물의 용도가 제공된다.
본 발명의 다른 일 측면에 따르면,
관절염 환자에게 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 관절염의 치료방법이 제공된다.
본 발명의 노각나무 잎과 꾸지뽕나무 잎으로부터 추출된 추출물을 포함하는 복합 추출물은 연골세포에 손상을 미치는 효소인 MMP-1, 3, 13의 유전자 발현을 효과적으로 억제하여, 관절염을 예방하고 개선 또는 치료하는데 현저한 효과를 나타내며, 특히 노각나무 잎 추출물 또는 꾸지뽕나무 잎 추출물을 단독으로 사용한 것에 비하여 관절염 예방 또는 치료에 시너지 효과를 나타낼 수 있다.
도 1은 실험예 1에 따른 노각나무 잎 추출물의 세포 독성 실험 결과이다.
도 2는 실험예 1에 따른 꾸지뽕나무 잎 추출물의 세포 독성 실험 결과이다.
도 3은 제조예 3의 노각나무 잎 + 꾸지뽕나무 잎 혼합 추출물의 세포 독성 실험 결과이다.
도 4 및 도 5는 실험예 2의 MMPs 발현 저해 활성 분석 결과이다.
도 6 내지 도 9는 실험예 3의 염증성 사이토카인 발현 저해 활성 분석 결과이다.
도 10 내지 도 13은 실험예 3에 따른 제조예 3의 혼합 추출물처리 농도별 염증성 사이코카인 저해 효과 분석 결과이다.
도 14는 실험예 4에 따른 제조예 3의 혼합 추출물 처리 농도별 NO 생성량 측정 결과이다.
도 15는 실험예 4에 따른 제조예 3의 혼합 추출물 처리 농도별 iNOS 단백질 생성량 측정 결과이다.
도 16은 실험예 4에 따른 제조예 3의 혼합 추출물 처리 농도별 iNOS mRNA 발현 수준 측정 결과이다.
도 17은 실험예 5에 따른 제조예 3의 혼합 추출물의 처리 농도별 COX-2 단백질 생성량 측정 결과이다.
도 18은 실험예 5에 따른 제조예 3의 혼합 추출물의 처리 농도별 COX-2 mRNA 발현 수준 측정 결과이다.
도 19는 본 발명의 동물 실험 진행 과정을 나타낸 것이다.
도 20 내지 도 22는 실험예 6의 동물실험에 따른 염증성 사이토카인 생성 수준을 분석한 결과이다.
도 23은 실험예 7에 따른 실험 마우스의 비장 크기 비교 사진이다.
도 24는 실험예 7에 따른 실험 마우스의 비장 무게 측정 결과이다.
도 25는 실험예 7에 따른 실험 마우스의 림프절 크기를 비교한 사진이다.
도 26은 실험예 7에 따른 실험 마우스의 림프절 무게 측정 결과이다.
도 27은 실험예 8에 따른 프로테오글리칸(Proteoglycan)의 합성 수준 분석 결과이다.
도 28은 실험예 9에 따른 실험 마우스의 발과 발목의 관절 부종을 관찰한 사진이다.
도 29는 실험예 9에 따른 실험 마우스의 체중 변화를 분석한 결과이다.
도 30은 실험예 10에 따른 실험 마우스에 대한 관절염의 전체적 면역 증상을 평가 결과이다.
도 31은 실험예 10에 따른 실험 마우스의 발가락 관절 변형 정도를 측정한 결과이다.
도 32는 실험예 11에 따른 관절염 부종의 정도 분석 결과이다.
도 33은 실험예 11에 따른 부종에 의한 발과 발목의 두게 측정 결과이다.
도 34는 실험예 12에 따른 실험 마우스의 발의 전반적 염증 상태 분석 결과이다.
도 35는 실험예 13에 따른 무릎 관절 상태 분석 결과이다.
도 36은 실험예 14에 따른 진통 효과 테스트 결과이다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 노각나무 잎과 꾸지뽕나무 잎을 각각 또는 혼합하여 용매에 투입하고 80 내지 120 ℃의 온도에서 1 내지 10 시간 동안 추출한 후 여과 및 농축하는 것을 특징으로 하는 꾸지뽕나무 잎 추출물의 제조방법을 제공한다.
구체적으로 상기 노각나무 잎과 꾸지뽕나무 잎을 각각 또는 혼합한 상태로 건조시켜 분쇄한 후, 건조 중량의 1 내지 30 배, 바람직하게는 5 내지 15배 부피의 용매에 투입하고, 80 내지 120 ℃의 온도에서 1 내지 5시간 동안 추출하는 것이 바람직하다.
이때, 상기 용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 또는 이들의 혼합물인 것이 바람직한데, 더욱 바람직하게는 물을 사용하는 것으로, 열수추출하는 것이 바람직하다.
추출 공정을 수행한 후에는 부직포로 여과하여 불순물을 제거하고, 여액을 고형분 함량이 15% 이상이 되도록 농축하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 농축한 다음 농축물을 동결건조 또는 열풍건조 또는 분사 방식에 의한 건조 등을 통하여 노각나무 잎 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 분말화하는 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 ‘추출물’은 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 또한, 상기 추출물이나 분획물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물에 포함된다.
한 구체예에서, 상기 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물은 유기용매 추출물을 제2의 유기용매로 재분획한 분획물일 수 있다. 여기에서, 유기용매 추출물이라 함은 광의로는 앞서 설명한 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물의 오일 분획, 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물의 액상 분획, 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물의 왁스 분획을 모두 포함하며, 협의로는 이 중 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물의 액상 분획을 의미한다. 그러므로, 한 구체예에서, 상기 유기 추출물을 제2의 유기용매로 재분획한 분획물은 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물의 액상 분획을 제2의 유기 용매로 재분획한 분획물을 의미할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물은 저급 알코올 추출물을 제2의 유기용매로 재분획한 분획물일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물은 에탄올 추출물을 헥산으로 재분획한 분획물일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 ‘추출물’은 노각나무 잎 및 꾸지뽕나무 잎에 추출용매를 처리하여 얻은 조추출물뿐만 아니라 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물의 가공물도 포함한다. 예를 들어, 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물은 광의로는 노각나무 잎 및 꾸지뽕나무 잎 자체를 동물에게 투여할 수 있도록 제형화된 노각나무 잎 및 꾸지뽕나무 잎 가공물, 예컨대, 노각나무 잎 및 꾸지뽕나무 잎 분말도 포함하는 의미를 갖는다. 비록 본 발명에서 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물로 실험을 진행하긴 하였으나, 노각나무 잎 및 꾸지뽕나무 잎 가공물과 같은 형태로도 목적하는 효과를 달성할 수 있음은 당업자라면 예상 가능할 것이다.
한편, 본 명세서에서 용어 ‘유효성분으로 포함하는’이란 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 조성물 내에서 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물은 예를 들어, 0.001 mg/kg 이상, 바람직하게는 0.1 mg/kg 이상, 보다 바람직하게는 10 mg/kg 이상, 보다 더 바람직하게는 100 mg/kg 포함된다. 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물은 천연물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 꾸지뽕나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 관절염 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 꾸지뽕나무 잎 추출물의 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 알코올 음료류, 과자류, 다이어트바, 유제품, 육류, 초코렛, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.
본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 꾸지뽕나무 잎 추출물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)] 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 꾸지뽕나무 잎 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 꾸지뽕나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 관절염의 개선, 예방 또는 치료용 식품 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 건강기능식품이란, 꾸지뽕나무 잎 추출물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 보이는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강기능식품에 있어서의 꾸지뽕나무 잎 추출물의 첨가량은, 대상인 건강기능식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 환제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다. 한 구체예에서, 본 발명의 건강기능식품은 환제, 정제, 캡슐제 또는 음료의 형태일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 꾸지뽕나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 꾸지뽕나무 잎 추출물의 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
상기 약학 조성물을 연골세포에 손상을 미치는 효소인 MMP-1, 3, 13의 유전자 발현을 억제할 수 있다.
상기 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13은 MMP(matrix metalloproteinase)계열로, 인체의 연골세포에 손상을 미치는 효소로서 상기 효소가 발현됨에 따라 연골세포에 손상을 유도하는 역할을 한다.
즉, 상기 MMP의 활성을 저해하여 연골세포의 손상을 억제함으로써 관절 내 염증을 억제하여 관절염을 예방 또는 치료하는 것이 중요하다.
따라서 본 발명에서는 후술하는 실시예를 통해, 꾸지뽕나무 잎 추출물이 인체 내 연골세포에 적용되어, MMP 효소의 활성을 저해하여 관절염을 예방 또는 치료하는데 효과적임을 확인하였다.
또한 상기 약학 조성물은 염증 유도 사이토카인인 TNF-α의 발현을 억제할 수 있다.
한편, 본 명세서에서 용어 ‘유효성분으로 포함하는’이란 본 발명의 꾸지뽕나무 잎 추출물이 관절염을 억제하는데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.
이에, 본 발명에 따른 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물은 상기 약학 조성물의 총 중량에 대하여 꾸지뽕나무 추출물을 0.1 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하나, 상기 함량으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있으며, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시립, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀루로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들며, 전분, 탄산칼슘(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여법이라면 어느 것이나 사용 가능하고, 전신 투여 또는 국소 투여가 가능하나, 전신 투여가 더 바람직하며, 정맥 내 투여가 가장 바람직하다.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 0.03 g/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 8 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하의 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실 험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.
[실시예]
제조예 1: 노각나무 잎 열수 추출물
전라남도 신안군 일대에서 채집한 노각나무(Stewartia pseudocamellia Maxim.) 잎을 자연 건조 시킨 후 사용하였다. 건조된 노각나무 잎을 물과 1:10(w/v)의 비율로 100 ℃에서 4시간 동안 열수추출(COSMOS-660 동서기계)한 후 부직포로 여과하여 불순물을 제거하였다. 여과된 노각나무 잎 추출액을 고형분 함량이 15% 이상이 되도록 감압 농축하여 노각나무 잎의 열수 추출물을 수득하였다.
제조예 2: 꾸지뽕나무 잎 열수 추출물
노각나무(Stewartia pseudocamellia Maxim.) 잎 대신에 꾸지뽕나무(Cudrania tricuspidata) 잎을 사용한 것을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 꾸지뽕나무 잎의 열수 추출물을 제조하였다.
제조예 3: 꾸지뽕나무 잎 + 노각나무 잎 혼합 열수 추출물
제조예 1의 노각나무 잎의 열수 추출물과 제조예 2의 꾸지뽕나무 잎의 열수 추출물을 1:10의 중량비로 혼합하여 혼합 열수 추출물을 제조하였다.
[실험예: 생체 외 실험]
실험예 1: 세포 독성 확인(MTT)
제조예 1의 노각나무 잎 추출물과 제조예 2의 꾸지뽕나무 잎 추출물 각각에 대하여 관절활액세포(fibroblast-like synoviocyte, FLS)에 대한 세포 독성 실험을 수행하였고, 제조예 1의 노각나무 잎 추출물의 세포 독성 실험 결과를 도 1에 나타내었고, 제조예 2의 꾸지뽕나무 잎 추출물의 세포 독성 실험 결과를 도 2에 나타내었으며, 제조예 3의 노각나무 잎 + 꾸지뽕나무 잎 혼합 추출물의 세포 독성 실험결과를 도 3에 나타내었다.
도 1 내지 3에서 확인할 수 있듯이, 노각나무 잎 추출물, 꾸지뽕나무 잎 추출물을 최대 1000 ㎍/㎖의 농도에서 처리하여도 FLS의 독성에는 별다른 영향이 없음을 확인할 수 있었으며, 그의 혼합 추출물을 최대 2000 ㎍/㎖의 농도에서 처리하여도 FLS의 독성에는 별다른 영향이 없는 것으로 나타나 추출물의 고농도 섭취가 가능함을 확인할 수 있었다.
실험예 2: MMPs 발현 저해 활성 분석
제조예 1의 노각나무 잎 추출물 20 ㎍/㎖(실험군 1), 제조예 2의 꾸지뽕나무 잎 추출물 200 ㎍/㎖(실험군 2), 제조예 3의 노각나무 잎 추출물 20 ㎍/㎖ + 꾸지뽕나무 잎 추출물 200 ㎍/㎖(실험군 3)을 각각 분석 시료로 사용하였다.
in vitro 상에서 염증 환경을 조성하기 위하여 관절혈액세포(fibroblast-like cynoviocyte, FLS)에 염증 유도 물질을 처리한 후, 각 시료의 유전자 발현 저해 활성을 분석하였다. 염증 유도 물질로는 널리 사용되고 있는 TNF-α(Tumor necrosis factor)를 사용하였으며, 사전 실험 결과 FLS에서는 TNF-α를 1 ng/㎖의 농도로 6시간 이상 처리하면 관절염에 관련된 인자들의 발현이 증가함을 확인하였다.
6-well cell culture plate를 사용하여 10% FBS, 1% antibiotics가 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 FLS 세포를 균일하게 분배하고 80% 이상 자라면 serum-free 배지에 TNF-α 단독 또는 TNF-α와 각 시료를 혼합하여 처리 농도별로 녹여 각 well 당 2 mL씩 18시간 동안 처리하였다. 18시간 후 각 well에서 용액을 제거하고 RNA-Bee 용액을 사용하여 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA의 농도를 측정하고 5 μg의 RNA를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 사용하여 각 target gene에 따른 primer를 사용하여 PCR을 수행하였으며, 2% agarose gel을 사용하여 전기영동 후 결과를 이미지화 하였다.
각 추출물 및 혼합물의 연골 손상 방지 활성을 확인하기 위하여 연골을 파괴하여 손상을 입히는 효소인 MMPs(matrix metalloproteinases)의 유전자 발현 저해 활성을 분석하고, 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.
도 4 및 도 5에 따르면, 실험군 1, 2 및 3 모두 TNF-α로 유도된 MMPs 유전자 발현을 저해하는 것으로 나타났으나, 실험군 3의 혼합 추출물에서 저해 효과가 더 높게 나타났다.
실험예 3: 염증성 사이토카인 발현 저해 활성 분석
실험예 2과 동일한 실험군 1 내지 3을 분석 시료로 사용하였다.
in vitro 상에서 염증 환경을 조성하기 위하여 관절혈액세포(fibroblast-like cynoviocyte, FLS)에 염증 유도 물질을 처리한 후, 각 시료의 유전자 발현 저해 활성을 분석하였다. 염증 유도 물질로는 널리 사용되고 있는 TNF-α(Tumor necrosis factor)를 사용하였으며, 사전 실험 결과 FLS에서는 TNF-α를 1 ng/㎖의 농도로 6시간 이상 처리하면 관절염에 관련된 인자들의 발현이 증가함을 확인하였다.
6-웰 플레이트를 사용하여 10% FBS, 1% antibiotics가 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 FLS 세포를 균일하게 분배하고 80% 이상 자라면 serum-free 배지에 TNF-α 단독 또는 TNF-α와 각 시료를 혼합하여 처리 농도별로 녹여 각 well 당 2 mL씩 18시간 동안 처리하였다. 18시간 후 각 well에서 용액을 제거하고 RNA-Bee 용액을 사용하여 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA의 농도를 측정하고 5 μg의 RNA를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 사용하여 각 target gene에 따른 primer를 사용하여 PCR을 수행하였으며, 2% agarose gel을 사용하여 전기영동 후 결과를 이미지화 하였다.
실험군들의 대표적인 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-1β, TNF-α의 유전자 발현 저해 활성을 분석하였고, 그 결과를 도 6 내지 도 9에 나타내었다.
도 6 내지 도 9에 따르면, 실험군 1, 2 및 3 모두 TNF-α로 유도된 염증성 사이토카인들의 발현을 저해하는 것으로 나타났으나, 그 중 노각나무 잎과 구찌뽕나무 잎의 혼합 추출물에서 저해 효과가 더 높은 것으로 나타났다.
한편, 상기 실험에서 염증성 사이토카인 저해 효과가 높은 제조예 3의 혼합 추출물에 대하여 처리 농도별 염증성 사이토카인 저해 효과를 분석하였다. 구체적으로, Raw 264.7 cell은 DMEM 배지를 이용하여 5×105 cells/㎖로 조절한 후 6-웰 플레이트에 접종하고, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 세포에 1 ㎍/㎖의 LPS를 처리한 후 1시간 후에 제조예 3의 혼합 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 후 얻어진 상층액의 pro-inflammatory cytokine 함량을 측정하였으며, 정량은 ELISA kit를 이용하여 정량하였다. 이와 같이, 제조예 3의 혼합 추출물 처리 농도에 따른 염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6, TNF-α의 mRNA 발현 수준을 측정하였고(##P < 0.01 : vs Ctl., **P < 0.01 : vs LPS), 그 결과를 도 10 내지 도 13에 나타내었다.
도 10은 PCR 수행 후 결과 이미지이고, 도 11은 IL-1β의 mRNA 발현 수준을 나타낸 그래프이고, 도 12는 IL-6의 mRNA 발현 수준을 나타낸 그래프이고, 도 13은 TNF-α의 mRNA 발현 수준을 나타낸 그래프이다. 이에 따르면, 실험예 3의 혼합 추출물은 독성이 나타나지 않는 1000㎍/㎖ 농도 처리시 IL-6 발현이 현저히 저해된 것으로 나타났고, TNF-α의 발현은 상대적으로 낮은 농도인 200㎍/㎖ 처리시에도 유의적으로 감소하였다.
실험예 4: NO 생성 및 iNOS 단백질과 mRNA 발현 수준 분석
NO 발현을 측정하기 위하여 Raw 264.7 세포를 실험예 3과 동일한 조건으로 배양하고 LPS를 1 ㎍/㎖농도로 처리하였다. 1시간 후 serum free DMEM 로 희석된 제조예 3의 혼합 추출물을 농도별로 처리한 후 24시간 인큐베이터에서 배양하였다. 배양이 끝난 세포의 상등액과 그리스 시약(Sigma)을 1:1 비율로 혼합한 뒤 10분간 반응시켰다. 이후, ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준농도 곡선은 sodium nitrite (NaNO2)를 serial dilution하여 얻었으며, 각 군의 평균 흡광도 값을 측정한 후 NO 생성량(μM)을 측정하고 (##P < 0.01 : vs Ctl., **P < 0.01 : vs LPS or Ctl.), 그 결과를 도 14에 나타내었다. 이에 따르면, 제조예 3의 혼합 추출물을 200㎍/㎖ 처리시부터 유의적으로 NO 생성 농도가 낮아졌으며, 1000㎍/㎖ 처리시에는 10 μM 미만으로 매우 낮은 NO 생성 농도를 나타내었다.
한편, 제조예 3의 혼합 추출물의 농도별 처리시 iNOS 단백질과 iNOS mRNA 발현 수준을 측정하여(##P < 0.01 : vs Ctl., **P < 0.01 : vs LPS) iNOS 단백질 발현 측정 결과를 도 15에 나타내었고, iNOS mRNA 발현 측정 결과를 도 16에 나타내었다.
이에 따르면, 제조예 3의 혼합 추출물을 200㎍/㎖ 처리시부터 iNOS 단백질 발현이 유의적으로 낮아졌으며, 500㎍/㎖ 처리시부터는 iNOS mRNA 발현이 유의적으로 낮아졌다. 또한, 제조예 3의 혼합 추출물을 1000㎍/㎖ 농도로 처리한 경우 iNOS 단백질과 mRNA 발현이 약 10% 수준으로 현저히 낮아진 것으로 나타났다.
실험예 5: COX-2 단백질 및 mRNA 발현 수준 분석
실험예 3과 동일한 조건으로 Raw 264.7 세포를 배양하고 염증 유도하고, 제조예 3의 혼합 추출물의 농도별 처리시 COX-2 단백질과 COX-2 mRNA 발현 수준을 측정하여(##P < 0.01 : vs Ctl., *P < 0.05,**P < 0.01 : vs LPS) COX-2 단백질 발현 측정 결과를 도 17에 나타내었고, COX-2 mRNA 발현 측정 결과를 도 18에 나타내었다.
이에 따르면, 제조예 3의 혼합 추출물을 200㎍/㎖ 처리시부터 COX-2 단백질과 COX-2 mRNA 발현이 유의적으로 낮아진 것으로 나타났다.
실험에 사용한 프라이머 정보 및 PCR 수행 조건은 아래의 표 1에 정리한 바와 같다.
Gene Sequence Size (bp) Tm (℃) Cycle
iNOS F : ttg aag ccc cgc tac tac tc 510 64 30
R : gag cac gct gag tac ctc at
COX-2 F : ggt ctg gtg cct ggt ctg at 724 64 30
R : gtc ctt tca agg aga atg gt
IL-1β F : tgt ctt tcc cgt gga cct tc 475 64 30
R : ttg ggg aac tct gca gac tc
IL-6 F : ttg gga ctg atg ctg gtg ac 510 64 30
R : cca ctc ctt ctg tga ctc ca
TNF-α F : aaa aga tgg ggg gct tcc ag 524 64 30
R : tac cag ggt ttg agc tca gc
GAPDH F : ttc acc acc atg gag aag gc 492 64 30
R : tgc ctg ctt cac cac ctt ct
[실험예: 생체 내 실험]
도 19는 이하 동물 실험 진행과정을 나타낸 것이다. 이를 참조하여 동물 실험의 진행 과정을 설명하도록 한다.
(1) 마우스 적응
6 내지 7주령의 수컷 마우스 2주의 적응 기간을 거치게 하였다.
(2) CIA 유도
이후, 마우스에 CFA(Complete Freund's Adjuvant)와 1：1 (v/v)비율로 섞은 Bovine Type II collagen 100㎕를 꼬리 부분에 피하로 주사하여 류마티스 관절염(collagen-induced arthritis, CIA)을 유도하였다. 이후, 14일 동안 2일마다 한번씩 체중을 측정하고, 제조예 2의 꾸지뽕 추출물 200mg/kg(체중), 제조예 3의 혼합 추출물 200mg/kg(체중)을 경구 투여하였다.
(3) CIA 부스팅(boosting)
이후 IFA(Incomplete Freund's Adjuvant)와 1：1 (v/v)비율로 섞은 Bovine Type II collagen 100㎕를 꼬리 부분에 피하로 주사하여 CIA를 부스팅하였다. 이후 14일 동안(실험시작 후 28일 경과) 2일마다 한번씩 체중을 측정하고, 관절염 진행 과정을 관찰 및 측정하였다.
(4) Synchronizing
이후 LPS 20㎍를 복강 내 주사(IP injection)하고 22일 동안(실험시작 후 50일 경과) Synchronizing 하였다.
(5) 관찰
이후 실험 마우스들을 희생시켜 이하 실험예들과 관련된 항염증 효과를 측정하였다.
실험예 6: 염증성 사이토카인 생성 수준 분석
실험 마우스의 혈액을 채취하여 염증성 사이토카인 IL-6, TNF-α, IL-1β의 생성 수준 분석을 수행하고(##P < 0.01 : vs Ctl., **P < 0.01 : vs Veh. ,***P < 0.01 : vs CTE), 그 결과를 도 20 내지 도 22에 나타내었다.
이에 따르면, 꾸지뽕 추출물 투여군(CTE)과 꾸지뽕 + 노각나무 혼합 추출물 투여군(CTE Mix.)은 모두 IL-6, TNF-α, IL-1β 생성 억제능을 나타내었으며, 혼합 추출물 투여군이 꾸지뽕 단독 추출물 투여군에 비하여 유의적으로 더 높은 IL-6, TNF-α, IL-1β 생성 억제능을 나타내었다.
실험예 7: 면역 관련 조직의 무게 변화 분석
실험 마우스의 비장의 크기를 비교한 사진을 도 23에 나타내었으며, 비장의 무게를 측정(##P < 0.01 : vs Ctl., *P < 0.05,**P < 0.01 : vs Veh., ,***P < 0.01 : vs CTE)한 결과를 도 24에 나타내었다.
도 23에 따르면, 비장(spleen)의 크기가 육안으로 관찰하였을 때 꾸지뽕 추출물 투여군(CTE)과 꾸지뽕 + 노각나무 혼합 추출물 투여군(CTE Mix.)은 추출물 비투여군(Vehicle)에 비하여 상당히 작은 크기로 보인다.
도 24에 따르면, 비장(spleen)의 무게가 추출물 비투여군(Vehicle)에 비해 꾸지뽕 추출물 투여군의 무게가 유의적으로 감소하였으며, 혼합 추출물 투여군은 꾸지뽕 추출물 단독 투여군에 비해서도 무게가 유의적으로 감소한 것으로 나타났다.
한편, 실험 마우스의 림프절 크기를 비교한 사진을 도 25에 나타내었으며, 림프절의 무게를 측정(##P < 0.01 : vs Ctl., **P < 0.01 : vs Veh., ***P < 0.01 : vs CTE)한 결과를 도 26에 나타내었다.
도 25에 따르면, 림프절(Lymph node)의 크기가 육안으로 관찰할 때 꾸지뽕 추출물 투여군(CTE)과 꾸지뽕 + 노각나무 혼합 추출물 투여군(CTE Mix.)은 추출물 비투여군(Vehicle)에 비하여 상당히 작은 크기로 보인다.
도 26에 따르면, 림프절의 무게가 추출물 비투여군(Vehicle)에 비해 꾸지뽕 추출물 투여군, 혼합 추출물 투여군 모두 유의한 수준으로 감소하였다.
실험예 8: 프로테오글리칸(Proteoglycan)의 합성 수준 분석
관절 조직 및 구조 변화 지표를 분석하기 위하여 실험 마우스의 연골 프로테오클리칸의 합성 수준으로 측정하여 (##P < 0.01 : vs Ctl., **P < 0.01 : vs Veh., ,***P < 0.01 : vs CTE) 그 결과를 도 27에 나타내었다.
이에 따르면, 꾸지뽕 추출물 투여군(CTE)과 꾸지뽕 + 노각나무 혼합 추출물 투여군(CTE Mix.)은 추출물 비투여군(Vehicle)에 비하여 프로테오클리칸의 농도가 높게 측정되었으며, 혼합 추출물 투여군이 꾸지뽕 단독 추출물 투여군에 비하여 프로테오글리칸 농도가 유의적으로 더 높게 측정되었다.
실험예 9: 관절 부종 및 체중 변화 분석
임상적 증상 지표를 분석하기 위하여 실험 마우스의 발과 발목의 관절 부종을 관찰한 사진을 도 28에 나타내었다.
이에 따르면, 추출물 비투여군(Vehicle)에 비하여 꾸지뽕 추출물 투여군(CTE)과 꾸지뽕 + 노각나무 혼합 추출물 투여군(CTE Mix.)의 부종이 완화되었음을 육안으로 확인할 수 있었으며, 꾸지뽕 단독 추출물 투여군에 비하여 혼합 추출물 투여군은 관절염을 유발하지 않은 대조군과 거의 같은 수준으로 부종이 가라앉고 정상적인 상태가 되었음을 확인하였다.
한편, 실험기간 동안 관절염 진행에 따른 체중 변화를 측정하여(#P < 0.05, ##P < 0.01 : vs Ctl., *P < 0.05,**P < 0.01 : vs Veh.), 그 결과를 도 29에 나타내었다.
이에 따르면, 추출물 비투여군(Vehicle)은 실험개시일 30일 경과시부터 급격한 체중 감소를 보이다가 40일 경과시부터 서서히 체중을 회복하였으며, 이에 비해 꾸지뽕 추출물 투여군(CTE)과 꾸지뽕 + 노각나무 혼합 추출물 투여군(CTE Mix.)은 30일이 경과된 후에도 체중이 감소하지 않고 대체로 안정적으로 증가하였다. 또한, 꾸지뽕 단독 추출물에 비하여 체중이 더욱 높게 유지됨을 확인할 수 있다.
실험예 10: 관절염 증상 분석
실험 마우스의 관절염의 전체적 면역 증상을 0 내지 4의 스코어로 하여 평가하고(##P < 0.01 : vs Ctl., *P < 0.05,**P < 0.01 : vs Veh.), 그 결과를 도 30에 나타내었으며, 이때 높은 점수일수록 관절염의 전체적인 증상이 높은 것이다.
이에 따르면, 추출물 비투여군(Vehicle)은 실험개시일 22일 경과 후부터 관절염 증상이 급격히 증가하며, 30일 이후에도 3점에 가까운 높은 점수를 유지하다가 38일 경과시에는 3점을 더 높아져 이를 유지하였다. 이에 반해, 실험기간 동안 관절염 증상이 꾸지뽕 추출물 투여군(CTE)과 꾸지뽕 + 노각나무 혼합 추출물 투여군(CTE Mix.)은 실험개시일 20일 이후 관절염 증상이 높아져 28일 경과시 약 1.5점에 가까이 평가되지만, 이후에는 증상이 서서히 완화되어 실험 종료시에는 관절염 증상이 매우 완화되었다. 특히, 혼합 추출물 투여군은 꾸지뽕 단독 추출물 투여군에 비하여 관절염 증상이 더 적고, 관절염 증상이 거의 해소되었다.
한편, 실험 마우스의 발가락 관절의 변형 정도를 0 내지 20의 스코어로 측정하고(##P < 0.01 : vs Ctl., **P < 0.01 : vs Veh.) 그 결과를 도 31에 나타내었다. 이에 따르면, 실험개시일 28일 이후 추출물 비투여군(Vehicle)은 발가락 관절의 변형이 급격히 증가하여 38일 경과시에는 16점으로 발가락 관절 변형이 매우 크게 측정되었다. 이에 반해, 꾸지뽕 추출물 투여군(CTE)과 꾸지뽕 + 노각나무 혼합 추출물 투여군(CTE Mix.)은 발가락 변형 정도가 추출물 비투여군(Vehicle)에 비하여 현저히 작으며, 꾸지뽕 추출물 투여군(CTE)에 비하여 혼합 추출물 투여군의 발가락 변형 정도가 더욱 낮게 측정되었다.
실험예 11: 관절염 부종의 정도 분석
실험 마우스의 관절염의 심각한 정도 즉 부종 정도를 0 내지 24의 스코어로 하여 평가하고(##P < 0.01 : vs Ctl., *P < 0.05,**P < 0.01 : vs Veh.), 그 결과를 도 32에 나타내었으며, 이때 높은 점수일수록 관절염의 전체적인 증상이 높은 것이다.
이에 따르면, 실험개시일 28일 이후 추출물 비투여군(Vehicle)은 부종이 급격히 증가하여 38일 경과시에는 20점으로 매우 크게 측정되었으며 실험 종료시까지 부종의 회복이 거의 되지 않았다. 이에 반해, 꾸지뽕 추출물 투여군(CTE)과 꾸지뽕 + 노각나무 혼합 추출물 투여군(CTE Mix.)은 부종의 정도가 추출물 비투여군(Vehicle)에 비하여 현저히 작으며, 꾸지뽕 추출물 투여군(CTE)에 비하여 혼합 추출물 투여군은 부종의 정도가 매우 경미하였으며, 실험 44일 경과시 부터는 꾸지뽕 추출물 투여군에 비하여 유의적(P < 0.01 : vs CTE )으로 부종이 감소하였으며, 실험종료시에는 대조군과 거의 유사한 수준으로 나타났다.
한편, 부종에 의한 발과 발목의 두께를 측정하여 그 결과를 도 33에 나타내었다(#P < 0.05, ##P < 0.01 : vs Ctl., *P < 0.05,**P < 0.01 : vs Veh.). 여기서 (a)는 앞발의 두께, (b)는 뒷발의 두께. (c)는 뒷발목의 두께의 측정 결과이다.
이에 따르면, 추출물 비투여군(Vehicle)은 발과 발목의 두께가 실험개시일 24일 후부터 증가하기 시작하여 30일 이후에는 급격히 증가하여 38일 이후부터 약 4.5mm 의 두께로 부종이 있는 상태가 지속되었지만, 꾸지뽕 추출물 투여군(CTE)과 혼합 추출물 투여군은 부종이 약간 나타나기는 하였으나 매우 경미 하였으며 특히 혼합 추출물 투여군(CTE Mix.)은 대조군과 차이가 없는 정도였다.
실험예 12: 염증 상태 분석
실험 마우스의 발의 전반적인 염증상태 및 기능성을 분석하여 0 내지 6의 스코어로 평가(##P < 0.01 : vs Ctl., **P < 0.01 : vs Veh.)하고 그 결과를 도 34에 나타내었다. 여기서, 높은 스코어일수록 염증상태가 나쁨을 의미한다.
이에 따르면 전반적인 발의 염증상태가 추출물 비투여군(Vehicle)의 경우 실험개시 30일 이후에 급격히 악화되어 36일 이후에 5점 정도의 악화된 상태가 유지되는 것으로 나타났다. 이에 반해, 꾸지뽕 추출물 투여군(CTE)은 실험개시 14일 이후 염증상태가 1 내지 2점 정도로 약간 나빠지고 이와 같은 수준으로 유지하였고, 혼합 추출물 투여군(CTE Mix.)은 실험개시 34일 이후에 염증상태가 매우 빠르게 호전되고, 38일 경과시부터는 꾸지뽕 추출물 투여군과도 유의한 차이(P < 0.01 : vs CTE)를 나타내면서 대조군과 거의 유사한 수준으로 회복된 것으로 나타났다.
실험예 13: 무릎 관절 상태 분석
실험 마우스의 무릎 관절 상태를 분석하여 0 내지 4의 스코어로 평가(##P < 0.01 : vs Ctl., **P < 0.01 : vs Veh.)하고 그 결과를 도 35에 나타내었다. 여기서, 높은 스코어일수록 무릎 관절 상태가 나쁨을 의미한다.
이에 따르면, 추출물 비투여군(Vehicle)은 실험 개시 28일 이후부터 32일 이내에 약 3점 정도로 급격히 나빠져 실험 종료시까지도 관절이 악화된 상태를 유지하였다. 이에 반해, 꾸지뽕 추출물 투여군(CTE)은 관절 상태가 1.5점 미만으로 유지 되었으며, 혼합 추출물 투여군(CTE Mix.)은 꾸지뽕 추출물 투여군에 비해서도 유의적(P < 0.01 : vs CTE )으로 낮은 스코어를 나타내었다.
실험예 14: 진통 효과 테스트
실험 마우스의 발과 발목 부위에 통증을 유발한 후 10분 동안 나타내는 통증 반응을 0 내지 8의 스코어로 평가(##P < 0.01 : vs Ctl., *P < 0.05,**P < 0.01 : vs Veh.)하여 그 결과를 도 36에 나타내었다. 여기서 점수가 높을수록 통증 반응이 큰 것이다.
이에 따르면, 추출물 비투여군(Vehicle)은 실험 개시 22일 이후부터 계속적으로 통증이 증가하여 44일 경과시에는 32일 이내에는 7점으로 최고치를 나타내었고, 실험 종료시까지도 통증 반응이 크게 줄어들지 않았다. 이에 반해, 꾸지뽕 추출물 투여군(CTE)은 관절 상태가 1.5점 미만으로 유지 되었으며, 혼합 추출물 투여군(CTE Mix.)은 꾸지뽕 추출물 투여군에 비해서도 유의적(P < 0.01 : vs CTE )으로 낮은 스코어를 유지한 것으로 나타났다.
하기에 본 발명의 분말을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
제조예 1의 노각나무 잎 추출물 50 mg
제조예 2의 꾸지뽕나무 잎 추출물 500 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
제조예 1의 노각나무 잎 추출물 30 mg
제조예 2의 꾸지뽕나무 잎 추출물 300 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
제조예 1의 노각나무 잎 추출물 20 mg
제조예 2의 꾸지뽕나무 잎 추출물 200 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
제조예 1의 노각나무 잎 추출물 60 mg
제조예 2의 꾸지뽕나무 잎 추출물 600 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4,12H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
제조예 1의 노각나무 잎 추출물 400 mg
제조예 2의 꾸지뽕나무 잎 추출물 4 g
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100g으로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 과립제의 제조
제조예 1의 노각나무 잎 추출물 100 mg
제조예 2의 꾸지뽕나무 잎 추출물 1,000 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 mg
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 과립제에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 과립제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7. 기능성 음료의 제조
제조예 1의 노각나무 잎 추출물 100 mg
제조예 2의 꾸지뽕나무 잎 추출물 1,000 mg
구연산 1,000 mg
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 mL
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
본 발명의 노각나무 잎과 꾸지뽕나무 잎으로부터 추출된 추출물을 포함하는 복합 추출물은 연골세포의 손상을 억제 또는 개선시킬 수 있는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 관절염 예방 또는 개선용 식품 조성물로 응용하고, 이를 이용한 관절염 치료 용도로 응용할 수 있다.

Claims (8)

  1. 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물을 유효성분으로 함유하는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 복합 추출물의 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 또는 이들의 혼합물인 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 복합 추출물은 노각나무 잎 추출물과 꾸지뽕나무 잎 추출물이 1:5 내지 1:20의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물을 유효성분으로 함유하는 관절염 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 복합 추출물의 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 또는 이들의 혼합물인 관절염 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 복합 추출물은 노각나무 잎 추출물과 꾸지뽕나무 잎 추출물이 1:1 내지 1:100의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  7. 관절염 예방 또는 치료용 의약 제조를 위한 노각나무 잎 추출물과 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물의 용도.
  8. 관절염 환자에게 노각나무 잎 추출물 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 복합 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 관절염의 치료방법.
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