KR20180059480A - 액체 시료로부터 다중 신호들을 측정하는 방법 및 장치 - Google Patents

액체 시료로부터 다중 신호들을 측정하는 방법 및 장치 Download PDF

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KR20180059480A
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마리오 야사
스티븐 피. 트레이노프
바바라 알. 마우럴
데이비드 캐넬
필립 제이. 와이어트
빈센트 시에
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와이어트 테크놀로지 코포레이션
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Abstract

하나 이상의 균질화 요소들이 다중 검출기 광학 측정 시스템 통한 흐름에서 채용된다. 균질화 요소들은 측정 셀 내 피크 테일링 및 비균질 시료 프로파일과 같은 다중 검출기 관류 시스템에 공통적인 문제들을 보정한다. 균질화 요소들은 코일형 주입구 튜브, 셀의 주입구 근처의 흐름 분배기, 및 셀의 배출구에서의 흐름 분배기를 포함한다. 이러한 시료의 균질화는 측정 셀 내의 플러그 흐름을 모방하고 각 검출기가 각각의 개별적인 대응하는 보여진 샘플 체적에서 동일한 시료 조성을 보게 한다. 이러한 시스템은 초고압 액체 크로마토그래피(UHPLC)에 의해 생성된 것들과 같은 좁은 크로마토그래픽 피크들의 다중 각도 광 산란(MALS) 측정들을 수행할 때 특히 유용하다.

Description

액체 시료로부터 다중 신호들을 측정하는 방법 및 장치
본 출원은 2015년 9월 22일자로 출원된 미국 가출원 제 62/221,879 호에 대한 우선권을 주장한다.
관련 특허들
본 발명의 배경 및 응용과 관련된 다음의 참고 문헌들은 여기에 참고로 통합된다.
스티븐 피. 트레이노프(Steven P. Trainoff), 2008년 6월 10일자로 발행된 미국 특허 번호 제 7,386,427 B2 호, "내부 검출기 대역 확장 효과들을 교정하는 방법(Method for correcting the effects of interdetector band broadening)"
2011년 3월 22일자로 발행된 스티븐 피. 트레이노프의 미국 특허 번호 제 7,911,594 B2 호, "내부 검출기 대역 확장의 효과들을 보정한 후 시료의 물리적 특성들을 도출하기 위한 방법(Method to derive physical properties of a sample after correcting the effects of interdetector band broadening)"
개리 알. 재닉(Gary R. Janik) 외, 1999년 5월 4일자로 발행된 미국 특허 번호 제 5,900,152 호, "광학 유동 셀들에서의 비균질성들을 감소시키기 위한 장치(Apparatus to reduce inhomogeneities in optical flow cells)".
개리 알. 재닉 외, 1997년 10월 14일에 발행된 미국 특허 번호 제 5,676,830 호, "크로마토그래픽 검출기들에서 대역 확장을 감소시키기 위한 방법 및 장치(Method and apparatus for reducing band broadening in chromatographic detectors)".
스티븐 디. 필립스(Steven D. Phillips) 외, 1986년 10월 14일자로 발행된 미국 특허 번호 제 4,616,927 호, "광 산란 측정들을 위한 시료 셀(Sample cell for light scattering measurements)".
레이몬드 피. 더블유. 스캇(Raymond P. W. Scott) 및 엘레나 카츠(Elena Katz), 1991년 7월 16일자로 발행된 미국 특허 번호 제 5,032,183 호, "크로마토그래피 시스템들에서 유용한 저분산 유체 도관(Low dispersion fluid conduit useful in chromatography systems)".
스티븐 피. 트레이노프, 2011년 7월 19일에 발행된 미국 특허 번호 7,982,875 호, "액체 시료로부터의 산란광 신호들을 측정하기 위한 개선된 방법 및 장치(Improved method and apparatus for measuring the scattered light signals from a liquid sample)".
정의들
"입자"에 의해, 그의 접합체들 및 공중합체들, 바이러스들, 박테리아, 바이러스 유사 입자들, 리포솜들, 폴리스티렌 라텍스 입자들, 나노 입자들, 및 1 내지 수천 나노미터의 대략적인 크기 범위 내의 모든 이러한 입자들과 함께 단백질 및 중합체 분자들과 같은 이러한 객체를 말한다.
준-탄성 광 산란(quasi-elastic light scattering; QELS), 동적 광 산란(dynamic light scattering; DLS), 및 광자 상관 분광법(photon correlation spectroscopy; PCS)이라는 용어들은 동일한 현상, 즉 브라운 운동(Brownian motion)을 하는 입자들로부터의 산란광의 측정을 설명하기 위해 자주 사용된다. 본 명세서에서 우리는 QELS라는 용어를 사용할 것이지만, QELS는 본 기술 분야에서 자주 사용되는 다른 언급된 용어들과 동일하다는 것을 알아야 한다. QELS는 다른 광산란 측정 기술들과 구별되는데, 그 중 가장 일반적인 것은 입자 용액들로부터 산란된 광의 각도 의존성을 측정하는 "차동 광 산란(Differential Light Scattering)"이라고 예전에 불렸던 다각도 광 산란(Multi-angle light scattering; MALS)이다.
본 명세서 전반에 걸쳐 광학 측정 셀들이 참조될 것이다. 가장 일반적인 형태로 여기에서 논의될 두 가지 셀 유형들이 존재한다. 첫 번째는 필립스(Phillips)의 미국 특허 제 4,616,927 호에 기술된 바와 같은 셀로서, 셀을 통한 액체 시료 및 용매의 흐름 방향은 조명 빔에 본질적으로 평행한 동일한 경로를 따라 진행한다. 이러한 셀 구성을 "수평 셀(parallel cell)"이라고 한다. 여기에서 논의된 대안적인 셀 설계는 유체 유동이 조명 빔을 가로지르는 것을 실행하는 것이다. 이러한 셀 구성을 "수직 셀(perpendicular cell)"이라고 불릴 것이다. 이것은 원통형 컨테이너로부터 산란된 광의 측정에 사용되는 종래의 구조이다. 이러한 명칭은 엄격한 제한을 나타내는 것이 아니라 오히려 일반적인 설명 및 지정만을 제공한다는 것이 주의되어야 한다. 예를 들어, 수평 셀을 가로지르는 빔은 작은 각도로 기울어져서, 셀의 입구에서 빔이 내경의 바닥을 거의 스치고, 반면에 출구에서 이는 거의 내경의 상부를 거의 스치고, 흐름과 빔이 정확히 평행하지 않더라도 여전히 "수평 셀"로 간주될 수 있다. 실제로, 본 발명의 몇몇 실시예들에서, 반사를 최소화하고, 잡음을 감소시키는 등을 위해 상기 빔을 시료를 통해 각도로 지향시키는 것이 바람직할 수 있다. 상기 및 명세서 전체에서 논의된 광학 측정 셀들은 액체 시료가 통과하는 내경을 포함하는 관류 셀들(flow through cells)이다. 이들 내경들은 일반적으로 원형 또는 거의 원형 단면이지만, 시료 내경은 이러한 형상으로 제한되는 것으로 고려되지 않아야 한다. 본 발명은 직사각형, 반원형, 타원형, 삼각형 등의 다양한 형상들뿐만 아니라 단면 및 경로의 불규칙한 형상의 내경 단면들을 갖는 셀들에 적용 가능하다.
액체 시료에서 다양한 크기들, 질량들 및 전하들의 입자들이 그들의 구성 성분들로부터 분리될 수 있는 많은 수단이 존재한다. 본 개시에서 초고성능 액체 크로마토그래피(ultra-high pressure liquid chromatography; UHPLC)로 일반적으로 지칭되는 기술에 주로 초점을 맞출 것이지만, 오늘날 사용되는 대부분의 분리 기술은 속 액체 크로마토그래피(genus liquid chromatography)하의 종들이고, 모든 액체 크로마토그래피 기술들은 여기에 개시된 발명으로부터 이익을 얻을 수 있다는 것이 주의되어야 한다. 따라서, 이하의 설명은 주로 UHLPC(때로는 등록 상표 UPLC?, Waters Corporation, Milford, Massachusetts라고도 불림)로 언급되지만, 본 발명으로부터 가장 이익을 얻는 방법이기 때문에, 본 발명은 또한 종종 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography; SEC) 또는 겔 투과 크로마토그래피(gel permeation chromatography; GPC)로 지칭되는 고압 액체 크로마토그래피(HPLC), 및 역상 크로마토그래피와 같은 다른 액체 크로마토그래피 기술들에 또한 적용 가능하다. 또한, 본 발명은 분리된 시료가 튜브를 통해 검출 셀로 전달되는, 장 흐름 분획화(field flow fractionation; FFF)와 같은 다른 흐름 기반 분리 기술들과 함께 사용하는 데에도 적용 가능하다.
용액 중의 거대 분자 또는 입자 종들의 분석은 통상적으로 적절한 용매 중에서 시료를 준비하고, 이후 액체 크로마토그래피(LC) 컬럼 또는 장 흐름 분획화(FFF) 채널과 같은 분리 시스템에 부분 표본(aliquot)을 주입함으로써 달성되고, 시료 내에 포함된 서로 다른 종들의 입자들은 그들의 다양한 선거구로 분리된다. 일반적으로 크기, 질량 또는 컬럼 친화성에 기초한 그러한 수단에 의해 일단 분리되면, 시료들은 광 산란, 굴절률, UV 흡수, 전기 영동 이동도, 점도계 응답 등을 사용하여 분석이 된다. 본 개시에서는 주로 다각도 광 산란(MALS)에 관한 것이다.
일반적인 HPLC-MALS 셋업이 도 2에 도시된다. 용매는 일반적으로 용매 저장소(202)로부터 탈기 장치(degasser; 203)를 통해 HPLC 펌프(201)에 의해 추출되고 이후 필터링 수단(204)을 통해 주입 밸브(211)로 펌핑된다. 액체 시료(205)은 일반적으로 주사기(syringe; 206)에 의해 주입 밸브(211)의 시료 루프(212) 내로 주입된다. 그러나, 시료는 기술된 수동 수단보다는 자동 주입기에 의해 흐름 스트림에 첨가될 수 있다. 유체 시료는 이후 주사기로부터 하나 이상의 HPLC 칼럼들(207)을 통과하여, 시료 내에 함유된 분자들 또는 입자들이 크기별로 분리되고, 가장 큰 입자가 먼저 용리된다(eluting). 분리된 시료는 이후 폐기소로 가기 전에 MALS 검출기(208) 및 차동 굴절계(differential refractometer; 209)와 같은 농도 검출기를 순차적으로 통과한다. 시료 내의 분자들 또는 입자들의 물리적 속성들을 측정할 수 있는 다른 기구들도 흐름 스트림을 따라 존재할 수 있다. 예를 들어, UV/Vis 흡광도 검출기(absorbance detector) 및/또는 점도계(viscometer)가 일련의 기기들 내에 존재할 수 있다. 일반적으로, 기기에서 생성된 데이터는 데이터를 수집, 저장 및 분석하고 결과들을 사용자에게 보고할 수 있는 컴퓨터로 송신된다.
상기에 논의된 바와 같이, 부분 표본을 함유하는 시료를 도 2에 도시된 HPLC 시스템, 또는 본 발명에 보다 근접하여 관련하여 UHPLC 시스템과 유사하지만 칼럼들(207)이 HPLC 칼럼들보다는 하나 이상의 UHPLC 칼럼들인 UHPLC 시스템과 같은 분리 시스템으로 주입되고, 펌프(201)는 UHPLC 시스템들이 작동하는 보다 높은 압력들을 생성할 수 있다. 컬럼들은 시료를 크기별로 성분 분율들로 분리한다. 이러한 용리 및 분리 분율들의 각각은 튜빙(tubing)을 통해 측정 체적을 통과하는 "피크"를 생성한다. 각 검출 기기는 측정 볼륨을 통과할 때 피크로부터 신호를 차례로 측정한다. 단일 부분 표본은 임의의 수의 피크들을 생성할 수 있는데, 예를 들어 단일 입자 크기의 단순 분산 시료(monodisperse sample)은 단 하나의 피크를 생성할 것이다. 각 시료 피크가 측정 체적을 통과함에 따라 셀을 통과할 때 임의의 주어진 순간에 분석되는 시료와 관련된 신호가 검출될 것이다. 이러한 유한 측정은 흔히 "슬라이스들(slices)"이라고 하며, 각 슬라이스는 셀을 통해 흐르는 용리액(eluent)의 주어진 부피에서 검출되는 시료의 순간 측정을 나타낸다. 이들 신호들은 디지털화되어 컴퓨터에 저장되고, 결과 데이터는 일반적으로 도 3에 도시된 것과 같은 피크(301)로서 사용자에게 보고되고, 피크(peak)의 각 요소는 주어진 슬라이스를 나타낸다. 주어진 슬라이스에서 데이터, 이 경우에는 단일 슬라이스(302a)에 대응하는 복수의 각도들(302)에 걸친 광 산란 데이터는 ASTRA?(Wyatt Technology Corporation, Goleta, California)와 같은 소프트웨어 프로그램을 이용하여 관찰 및 분석될 수 있다. 도 3에 도시된 데이터는 또한 차동 굴절계로부터 기록된 신호(303)를 포함한다.
MALS 검출 시스템들은 종종 수평 내경(horizontal bore)이 측정 빔이 셀을 가로지르는 경로 및 유체 흐름 모두의 영역을 규정하는 흐름 셀을 채용했다. 그러한 셀은 필립스(Phillips) 외에 의해, 1986년 10월 14일에 발행된 미국 특허 제 4, 616, 927 호에 기술되었다. 여기에 수평 셀이라 칭해지는 셀은 도 4에 도시된 바와 같이 직경을 관통하는 내경을 갖는 원통의 단면이다. 이러한 셀 설계는 또한 측면 렌즈의 역할을 해서, 빔(401)이 셀의 원주 주위의 다양한 각도로 배치된 복수의 검출기들(도시되지 않음)이 시료에 의해 그로부터 산란된 광을 수용하도록 지향되는 검출 영역(402) 근처의 라인 소스의 역할을 한다. 따라서, 이러한 혁신적인 설계는 주어진 산란각에서 검출기로부터 더 많은 광을 모으는 것이 허용되지만, 이러한 이점은 이러한 설계에 필요한 더 큰 시료 체적으로 인해 주어진 측정 각도에서 흐름 경로를 따라 라인 소스의 너비를 따라 자연스럽게 발생하는 시료 농도의 일부 평균의 희생에서 온다. 주어진 각도에서 산란되는 광의 양이 증가되는 또 다른 수단은 2011년 7월 19일에 발행된 미국 특허 제 7,982,875 호의 스티븐 피. 트레이노프에 의해 개시되었고, 필립스 셀에 대한 변형이고, 시료 셀은 수직 및 측면 렌즈 양쪽 모두의 역할을 한다.
대응적으로 낮은 체적 피크들을 생성하는 시료 체적을 낮추는 산업의 추세로 인해 초고압 액체 크로마토그래피(Ultra High Pressure Liquid Chromatography; UHPLC)가 출현했다. 결과적으로 UHPLC 피크들을 측정하기 위한 MALS 검출 시스템들은 감도와 체적을 적절하게 조절해야 한다. 상기에 논의된 바와 같은 수평 셀 또는 도 5(a)에 도시되고 수직 셀로 지칭된 바와 같은 대체 구조 중 하나인 측정 셀을 통과하는 액체 시료는 시료가 셀에 들어갈 때 시료의 흐름 역학에 의해 크게 영향받는다. 수직 셀에서, 시료 흐름(501)은 빔(504)에 수직인 셀 구조(503)의 내경(502)으로 들어간다. 측정 셀 주위에 위치한 검출기들의 어레이는 산란광을 수집한다. 이상적으로 각 검출기는 동일한 조명된 체적을 볼 것이지만, 상이한 각도들에 위치된 검출기에서 보이는 시료 체적의 기하학적 구조의 완벽하지 않은 정렬 및 변경에 의해, 반드시 약간 다른 체적을 볼 수 있고 따라서 시료가 셀 전체에 균일하게 분포되는 것이 필수적이다. 상이한 각도로 배치된 검출기들의 시야에 기초한 산란된 체적의 기하학적 구조의 가변성의 예가 도 5b에 도시된다. 직경 2r의 레이저 빔(504)은 측정 셀의 내경(502)을 통과한다. 3개의 검출기들(D1, D2, D3)이 셀 주위에 배치되고, 각각은 셀의 중앙 근처에서 조명된 시료로부터의 산란을 검출하도록 지시된다. 그러나, 3개의 검출기들의 각각은 고유한 시야를 가지고, 이에 따라 대응하는 관측된 산란 체적들(d1, d2, d3)이 변하는 검출 영역들이 된다. 이러한 예에서, 레이저 빔에 대해 90°에 위치된 검출기(D3)는 가장 작은 산란 체적을 가질 것이고, 저각도(low angle)에 위치된 검출기(D3)는 가장 큰 산란 체적을 가질 것이다. 시료 농도가 측정된 산란 체적들(d1, d2, d3) 전체에 걸쳐 균일하면, 신호들은 단순히 1로 정규화될 수 있다. 그러나, 빔을 통과하는 시료 프로파일이 불균일하다면, 각 시료는 상이한 크기의 산란 체적을 볼 수 있을 뿐만 아니라, 산란 체적들의 기하학적 구조의 변화는 각각의 검출기가 그를 통과하는 상이한 시료를 보도록 초래할 것이다. 따라서, 시료가 개별 검출기들에 의해 보여지는 측정된 산란 체적들 범위 전체에서 균일한 것이 매우 중요하다.
도 1은 MALS 측정의 기하학적 개략도.
도 2는 MALS 측정과 연관된 다양한 요소들의 전형적인 HPLC-MALS 구성을 도시하는 도면.
도 3은 단일 슬라이스에 대해 디스플레이된 MALS 데이터를 포함하는 전체 피크에 걸쳐 수집된 MALS 및 농도 데이터의 예를 도시하는 도면.
도 4는 광 산란 측정을 위한 수평 셀 구조 및 필립스의 연관된 매니폴드 시스템을 도시하는 도면.
도 5는 도 4의 셀의 흐름 경로와 그 흐름 경로에서 대안적인 광 산란 셀 구성을 도시하는 도면.
도 6은(a) 푸아죄유 흐름(Poiseuille flow)으로 인해 흐를 수 있는 흐름 시료,(b) 시료 셀로부터의 산란광을 수집하는 3개의 오정렬된 검출기들의 시야, 및(c) 플롯 오정렬로 인한 각 검출기에 의한 시간 시프트를 도시하는 강도 대 시간 그래프들.
도 7은 구부러지거나 부적절하게 지향된 주입구 튜빙(inlet tubing)으로부터의 딘 흐름(Dean flow)으로 인한 측정 셀 내의 흐름 프로파일들의 예를 도시하는 도면.
도 8은 단일 농도 프로파일 프론트(single concentration profile front)가 약간 상이한 검출 체적들을 보는 2개의 검출기들을 통과하는 시간의 차이를 도시하는 도면.
도 9는 주입구 튜브 내에서 비대칭 흐름 프로파일들을 보정하는 나선형의 코일 주입구 튜브를 채용하는 본 발명의 측정 시스템의 실시예의 개략도.
도 10은 통과하는 시료의 흐름 프로파일 농도 윤곽들의 그래픽 표현을 갖는 본 발명의 흐름 시스템의 일 실시예를 도시하는 도면. 이러한 특정 실시예는 측정 셀의 주입구 및 배출구 모두에서 흐름 분배기(flow distribution)를 채용하는 것을 주의하라.
도 11은 수평 셀 구성에서 환상 흐름 분배기를 채용하는 흐름 셀 어셈블리를 도시하는 도면.
도 12는 본 발명의 측정 시스템을 위한 흐름 분배기의 바람직한 실시예를 도시하고, 정사각형 흐름 차단기(square shaped flow interrupter)가 다른 쌍의 원형 개스킷들 사이에 차례로 삽입되는 두 개의 메시 시트들(meshed sheets) 사이에 삽입된 원형 개스킷 내에 안착된다.
도 13은 표준 장착물들과 코일형 주입구 및 배출구 튜브들의 연결을 또한 허용하는 흐름 셀 매니폴드(flow cell manifold)에 함께 유지된 도 12의 한 쌍의 흐름 배분기 삽입들을 포함하는 다수의 개시된 요소들을 이용하는 본 발명의 바람직한 실시예를 도시하는 도면.
도 14는 측정 셀에서의 흐름 프로파일들의 시각화를 나타내는 도면으로서, 프로파일들은 구부러진 주입구 튜빙에 의해 야기된 딘 흐름(Dean Flow)으로 인해 비대칭성을 나타낸다.
도 15는 주입구 튜빙이 흐름 셀과 결합하기 전에 완전히 직선인, 거의 이상적인 구성의 셀 내의 흐름 프로파일을 도시하는 도면.
도 16은 흐름 셀과 결합 전에 튜빙 내의 25mm 굽힘 반경(bend radius)으로 인한 시료 프로파일의 비대칭을 도시하는 도면.
도 17은 도 16에 도시된 것과 동일한 굽힘 조건들을 갖는 시료 프로파일을 도시하지만, 이 도면에서는 코일형 주입구 튜빙 및 메시 흐름 분배기가 채용되는 본 발명의 일 실시예를 도시하는 도면.
도 18은 검출기들(a) 및(b)가 오정렬되지 않은 2개의 크로마토그램들을 대조하는 도면. 오정렬은 심각한 에러들을 초래할 수 있다.
시료 균일성의 문제들은 피크 폭들이 측정 셀의 시료 체적에 비교되기 때문에 UHPLC에서 특히 분명하다. 모세관 튜브를 따른 층류(laminar flow)는 UHPLC 시스템으로부터 측정 셀로 분리된 시료의 이동 동안 푸아죄유 흐름이 발생한다. 푸아죄유 흐름에서 속도 프로파일은 튜빙의 벽에서의 유체 흐름이 0인 포물선이고, 튜브의 중심에서의 흐름은 이론적으로 시료 지역의 평균 흐름의 1.5 배인 최대치이다. 도 6에 도시된 바와 같이, 푸아죄유 흐름 프로파일(601)은 분리 시스템을 나가는 좁은 시료 피크(602)가 튜빙 또는 측정 셀의 길이인 내경을 통과할 때 시간에 걸쳐 넓어지게 한다. 이들 조건들 하에서, 각각의 검출기가 약간 상이한 조명 체적을 보이는 검출기들의 임의의 온화한 오정렬은 각각의 검출기가 시간에서 주어진 순간에 셀을 통과하는 시료의 약간 상이한 부분을 측정하게 할 수 있다. 예를 들어, 시료가 검출 셀 아래로 이동하고 시간 t=2에서 시료로서 표시된 지점에서 빔(603)이 셀을 가로지르는 도 6a에 도시된 시료 프로파일들을 고려하자. 빔 인터페이스에서의 시료의 단면이 도 6b에 도시된다. 시간 t=2에서, 시료의 정면은 섹션(604)으로 표시된 영역에 도달하고, 섹션(605)은 용매만으로 구성된다. 3개의 상이한 광 산란 검출기들은 셀의 중심을 향해 배향되지만, 정렬의 약간의 변경들은 조명된 빔의 상이한 영역들을 보게 한다. 따라서, 제 1 검출기(606)는 영역(606a)으로부터 산란된 광을 검출하고, 검출 영역 내의 빔의 일부는 시료(604)을 조명한다. 제 2 검출기(607)는 광이 시료(604)로부터 배타적으로 산란되는 상이한 영역(607a)을 보고, 시간 t=2에서 제 3 검출기(608)는 시료 산란을 전혀 보지 못한다. 이러한 효과는 각각의 검출기에 대해 기록된 강도 피크들의 시간 이동을 야기한다; 각각의 검출기에 대한 강도 대 시간 그래프가 도 6c에 도시된다. 완벽한 정렬이 달성된 경우, 즉, 각각의 검출기가 정확히 동일한 측정 체적을 보는 경우, 각 검출기에 기록된 강도에 대한 이러한 시간 변화는 동일한 방식으로 존재하지 않을 것이지만, 측정들은 여전히 상기에 논의된 각각의 검출기에 의해 보여진 빔과 고체 산란각의 교차에 의해 정의된 상이한 산란 체적으로 인한 피크들의 일부 일시적인 오정렬을 겪을 수 있다는 것이 주의되어야 한다.
시료가 측정 셀에 들어갈 때, 분산은 딘 흐름(Dean Flow) 및 대류 확산(convective diffusion)의 현상에 의해 악화되고, 주입구 튜빙의 약간의 구부러짐으로 인한 반경의 불균일성은 개별 검출기들에 도달하는 광 산란 신호의 시간 지연에 의해 측정에 오차를 비대칭적으로 도입하여 시료가 셀에 들어가게 한다. 이는 문헌 에이. 카우프만(A. Kaufman) 외, "작은 내경 액체 크로마토그래피를 위한 포스트-컬럼 광분해 반응기들에서 추가-컬럼 대역 확산 문제들(Extra-Column Band Spreading Concerns in Post-Column Photolysis Reactor for Microbore Liquid Chromatography), Current Separations, 17(1) 9-16(1998))에서 보여지고, 구부러지거나 코일형 튜브들에서의 피크 분산은 무차원 파라미터 Dn2Sc로 나타낼 수 있고, Dn은 딘 수(Deam number)이고,
Figure pct00001
여기서, rt와 rc는 각각 튜브 내부 직경과 튜브 굽힘 반경이고 Re는 레이놀즈 수(Reynolds number)이고 Sc는 슈미트 수(Schmidt number)이고,
Figure pct00002
여기서 Dm은 시료 확산 계수, η는 용매 점도, p는 용매 밀도이다. 100 미만의 Dn2Sc는 피크 분산에 거의 영향을 주지 않고 큰 값들은 중요한 영향을 미칠 수 있음이 발견되었다. 도 7은 다양한 무리의 시료 농도로 구성된 측정 셀에 들어오는 푸아죄유 프로파일을 갖는 시료를 보여준다. 각각의 윤곽선(701, 702, 703, 704, 705)은 주어진 시료 농도 무리의 경계를 나타낸다. 시료가 내경과 완벽하게 평행한 튜브를 통해 셀에 진입하고 딘 흐름(Dean Flow)로부터 기여를 갖지 않는 경우, rc=∞, 시료 경계들은 도 7(b)에 도시된 바와 같이 조명 빔(706)에 의해 교차되는 시료 셀의 내경에 의해 정의된 평면에서 동심을 이룬다. 그러나, 도 7(a)에 나타낸 바와 같이, 예를 들어 부적당하게 각이 지거나 연결된 주입구 튜빙에 의해 또는 만곡된 튜브로부터의 딘 흐름의 결과로서 방사상의 불균일성에 의해 야기되는 임의의 비대칭성은 도 7(c) 및 도 7(d)에 도시된 프로파일과 같은 프로파일을 야기할 것이다. 위에서 논의한 것처럼, 통과하는 시료에 의한 조명 광선으로부터 산란된 광을 검출하도록 배향된 3개의 개별 검출기들을 갖는 MALS 검출 시스템을 고려할 경우, 각 검출기가 셀의 동일한 영역에 완벽하게 정렬되는 경우, 시료가 비대칭적으로 분포될 때조차도, 상기에 논의된 각각의 검출기의 검출 기하학적 구조에서 변화가 허용하는 정도까지, 시료의 동일한 무리를 "볼" 방법을 알 수 있다. 그러나, 완벽한 정렬은 바람직하지만 실제로는 결코 달성되지 않고, 따라서 도 6에 이전에 도시된 바와 같이, 각각의 검출기는 시료가 조명 빔을 통과할 때 상이한 농도 영역을 측정할 것이다. 따라서, 주어진 시간의 순간에 3개의 검출기들 각각의 시야 내에 있는 시료 체적의 작은 변화들이 항상 있을 것이다. 이러한 문제는 더 많은 검출기들의 추가로 더욱 악화된다.
검출기들 사이의 시간 이동은 단일 농도 윤곽이 도시되고 2개의 개별 검출기들의 시야에 의해 정의된 2개의 검출 체적들이 있는 도 8에 의해 더 설명된다. 이러한 경우, 검출 체적들에는 d1 및 d2가 표시된다. 윤곽선(801)은 시료의 주어진 농도의 경계를 나타낸다. 2개의 검출기들이 윤곽선(801)을 따라 시료를 보는 시간은 검출기 시야의 측 방향 위치에 따라 변한다. 시간 t=0에서, 어떠한 검출기도 조명된 시료 체적을 보지 못한다. t=0과 t=2 사이에서 시료가 모세관을 통과할 때 윤곽선(801)이 아래로 이동한다. 시간 t=1에서, D2는 시간 t=2에서 윤곽선(801)을 따르는 시료를 보고, D1은 윤곽선을 보고, 따라서 시간 지연(Δt)은 단순히 t2-t1이다. 다시, 강도 대 시간 피크는 도 8c에 그래프로 도시된다.
분리된 피크들로부터의 광 산란의 정확한 측정을 복잡하게 하는 다른 문제는 모세관을 따라 축 방향으로 넓어지고 튜빙 내의 층류에 의해 직접적으로 야기되는 피크 테일링(peak tailing)를 포함한다. 튜빙의 모서리들에서의 유속은 0이므로 이 경계 부근의 임의의 시료는 측정 셀에 용리하기 위해 매우 오랜 시간이 걸릴 수 있다.
따라서, 분리 후, 특히 UHPLC 분리 후의 MALS 및 다른 광학 측정들의 신뢰성을 향상시키기 위해, 모든 이들 문제들: 피크 테일링, 측정 셀로의 불균일한 시료 프로파일 유입 및 튜빙 내에서의 푸아죄유 흐름 및 시료 셀은 여기에 개시된 본 발명의 방법 및 장치에 의해 처리될 수 있다. 본 발명은 가능할 때마다 셀을 통한 시료의 플러그 흐름(plug flow)을 촉진시키고 시료 셀 내의 흐름 프로파일의 대칭성을 향상시키려고 한다. 플러그 흐름은 튜브를 통과하는 흐름의 단순한 속도 프로파일이며, 튜브 직경을 지나는 각 요소는 동일한 속도를 갖는다. 따라서, 플러그 흐름은 상기에 논의된 푸아죄유 흐름과는 정반대이다.
처리되어야 할 첫번째 문제는 시료가 흐름 셀로 들어갈 때 튜빙 내에서의 시료의 비균일성이다. 도 9에 도시된 본 발명의 일 실시예는, 하기에 논의된 바와 같이, 흐름 셀 내로 시료가 들어가기 전에 딘 흐름(Dean Flow)으로 인한 푸아죄유 흐름 및 기여들을 중단시키도록 설계된 코일형 튜빙(902)의 길이를 이용한다. 코일형 튜빙은 흐름 경로를 가로지르는 방사형 혼합을 촉진하여, 유체가 셀에 들어갈 때 주입구 튜빙의 너비에 걸쳐 동일한 분포를 생성하여, 흐름 셀에 들어가기 위해 내경에 대한 대칭적인 흐름 프로파일을 초래한다. 코일형 튜빙은 또한 테일러 분산을 촉진시켜 전단 흐름(shear flow)이 튜브 벽에서 시료의 유효 확산 계수를 증가시킨다. 이러한 효과는 위에서 논의된대로 피크 테일링을 완화하는 데 도움이 된다. 일반적으로 스테인레스 강(stainless steel)으로 만들어진 좁은 내경 튜브(902)는 나선형 코일로 형성되고, 튜빙의 회전 반경은 바람직하게는 튜브의 내부 반경의 약 15배이다. 코일형 튜빙은 구불구불한 경로를 포함하는 것보다 이러한 유형의 혼합에 대해 덜 효율적일 수 있지만, 보다 쉽게 제조되어 유용한 형상으로 유지된다. 시료가 코일형 튜빙(902)을 통과한 후, 조명 빔을 통해 측정 셀을 따라 셀 배출구로 전달되고, 시료가 체인 내 다른 기기로 전달되거나 폐기소로 전달될 때 코일형 튜빙의 길이에 또한 접속될 수 있는 배출구 셀로 전달된다. 셀 주위에는 복수의 산란각들에서 조명 빔에 의해 시료로부터 산란된 광을 수집하는 일 세트의 광 검출기들이 있다.
시료 셀 자체 내의 균일한 시료 흐름을 촉진시키기 위해, 본 발명의 장치는 유체의 유입 분출구(incoming jet)의 경로에 배치된 흐름 분배기 및/또는 셀의 배출구 후 및 배출구 튜빙 전에 배치된 흐름 분배기를 사용할 수 있다. 도 10은 본 발명의 일 실시예의 요소들의 단면을 도시한다. 주입구 튜빙(1001)은 흐름이 주입구 입력 체적부(1002)로 들어가게 하고, 이후 주입구 흐름 분배기(1003)의 역할을 하는 다공성 배리어를 통과한다. 평균 유체 속도의 제곱에 비례하는 주입구 튜브와 검출 셀 사이의 임피던스 불일치가 존재한다. ΔP1은 전체 주입구 입력 체적(1002)을 채우기 위해 시료에 대해 요구되는 압력차를 규정한다. ΔP2는 흐름 분배기(1003)를 통해 주입구 입구로부터 셀 입력 체적으로 전달하기 위해 시료에 대해 요구되는 압력차를 규정한다. 셀 입력 체적(1004)에 진입하기 전에 흐름이 셀을 통해 유체 흐름을 가로질러 횡 방향으로 적절히 분포되도록 하기 위해, ΔP2>>ΔP1. 일반적으로 주입구 튜빙의 내부 직경의 10배 정도인 검출 셀의 직경은 시료 셀의 공칭 배압(nominal back pressure)보다 10,000배 큰 배압을 생성할 필요가 있다. 이러한 조건이 달성될 때, 체적(1002) 내부의 모든 곳에서 균일하기 때문에, 분배기(1003)를 통한 유속을 근사할 수 있다. 주입구에 코일을 포함하는 일 실시예는 시료가 오리피스(1001)를 통해 균일하게 되게 한다. 흐름 분배기(1003)를 통해 균일한 속도가 주어지면, 시료는 양호한 근사, 플러그 흐름을 달성하는 상부 표면을 가로질러 균일하게 분포할 것이다.
예를 들어, ΔP1-ΔP2는 2psi에서 측정되는 하나의 실험 구성에서, 이는 측정 셀에 들어갈 때 시료 분포만을 개선할 계산된 요구된 배압보다 1000배 더 크다. 흐름 분배기(1003)를 통과한 후, 흐름은 셀 입력 체적(1004)에 진입하고 이후 측정 셀(1006)의 내부 내경(1005)으로 전달된다. 광 빔(1007)은 셀을 통과하고 광 검출기들은 셀 주위의 링에 배치되어 산란광을 검출한다. 광 검출기들의 수는 일반적으로 빔 방향에 대해 90°에 위치한 단일 검출기로부터 다양한 각도로 배치된 복수의 검출기들에 이르기까지 다양할 수 있다.
흐름 분배기 자체는 많은 형태들을 취할 수 있다. 본 발명의 일 바람직한 실시예에서, 흐름 분배기는 25㎛의 구멍 크기를 갖는 스테인레스 강 와이어 메쉬(stainless steel wire mesh)이다. 본 발명자들에 의한 실험들은 이러한 구성이 시스템 배압 및 플러깅(plugging)의 가능성을 최소화하면서 균일한 흐름 프로파일에 상당한 이점을 제공한다는 것이 확인되었다. 흐름 분배기로서 스테인레스 강 메쉬의 사용의 추가된 이점은 수성 및 유기 용매들 모두와의 그의 호환성, 내구성 및 저렴한 비용을 포함한다. 주입구에서의 메쉬는 셀로의 시료를 복수의 오리피스들로 주입하는 단일 오리피스(1001)를 이동시키고, 각각의 오리피스는 시료의 일부를 셀로 도입한다. 셀에 들어가는 결과적인 흐름은 각각의 작은 오리피스에서 복수의 푸아죄유 분포들과 유사하며, 평균할 때 흐름 셀에 진입할 때 플러그 흐름을 함께 근사한다. 시료가 측정 체적을 가로지를 때 플러그 흐름이 이후 다시 대규모 푸아죄유 프로파일로 복구된다. 디스크 형상의 프릿(frit)은 또한 흐름 분배기(flow distributor)의 역할을 할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 스풀 형상의 환형 흐름 분배기가 사용될 수 있다. 이것은 병렬 흐름 셀 구성을 이용하는 광 산란 측정들에 특히 유용한다; 스크린 또는 프릿이 많은 구성들에서 측정 내경을 따라 통과하는 광 빔을 차단할 것이기 때문이다. 환형 흐름 분배기가 사용되는 수평 셀 MALS 어셈블리의 일 실시예의 예가 도 11(a)에 도시되고, 환형 분배기 자체의 측면 및 평면도가 도 11(b)에 도시된다. 이러한 구성에서, 시료는 고정 주입구 매니폴드(1101)에 진입하고, 분배기의 둘레 주위로 연장되는 채널(1103)에 의해 흐름이 환형 분배기(1102)로 지향된다. 분배기의 내부 표면(1104)은 다공성이고, 이후, 유체의 작은 분사들이 분배기의 비어있는 영역(1112)을 먼저 채움으로써 방사상으로 흐름 셀의 내경에 진입한다. 다공성 요소(1104)는 환형 프릿 또는 스크린으로 제조될 수 있거나, 또는 그 내부에 드릴링되거나 에칭된 일련의 반경 방향 구멍들을 갖는 고체 환형 블록으로서 구성될 수 있다. 환형 분배기는 빔(1108)이 통과하고 고정 링(1109)에 의해 매니폴드 내로 유지되는 셀 구조체(1105)와 윈도우(1107) 사이의 개스킷들 또는 O-링들과 같은 밀봉 수단(1106)에 의해 포함된다. 환형 채널을 채우기 위해 요구되는 압력(ΔP2)은 분배기의 다공성 요소들을 통과하기 위해 요구되는 압력(ΔP1)에 비해 작기 때문에, 조건 ΔP2<<ΔP1이 만족되고, 상기 증분에 후속하여, 그 안으로 전달되는 시료는 셀 자체에 들어가기 전에 잘 혼합된다. 환형 흐름 분배기는 병렬 셀 구성과 함께 사용하기에 이상적이다. 위에서 설명한 것과 유사한 평면 분배기와 환형 흐름 분배기를 조합할 수 있다. 예를 들어, 프릿 요소는 영역(1103)에 진입하기 전에 시료를 추가로 균질화시키기 위해 주입구 튜빙과 주입구 매니폴드(1110)의 접합부 근처의 위치에 배치될 수 있다. 대안으로, 환형 흐름 분배기는 실제로는, 윈도우가 전혀 필요가 없는 경우, 밀봉 윈도우가 투명할 필요 없이 및 수직 구성에서 셀과 함께 사용될 수 있고, 도 11c에 도시된 바와 같이, 환형 분배기는 고체 단부(1111)를 포함할 수 있고, 그에 의해 유체 흐름은 오직 하나의 방향, 즉 셀로 허용된다. 추가로, 환형 분배기는 주입구에서 흐름 분배기와 함께 또는 흐름 분배기 없이 시료 셀의 배출구에 배치될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예가 흐름 경로, 측정 셀의 입구 또는 출구(또는 양쪽 모두) 내에 배치된 새로운 흐름 차단기를 사용한다. 흐름 차단기는 많은 형태들, 도 12에 설명되는 바람직한 실시예를 취할 수 있고, 크로마토그래피 시스템에서 사용될 용매에서 화학적으로 안정한 물질로 만들어진 고체 차단 요소(1203)는 셀 내부 또는 외부로의 유체의 유입 분사를 차단한다. 이러한 차단 요소(1203)는 일반적으로 Teflon이라는 상품명(The Chemours Company, Wilmington Delaware)으로 일반적으로 지칭되는 물질인, 일반적으로 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE)으로 제조된 일반적으로 원형의 개스킷(1204) 내에 배치된다. 차단 요소(1203)는 개스킷(1204)의 개구 내에서 측면 방향으로 움직이지 않고 안착될 수 있도록 선택된 측면 치수들을 갖고 정사각형 또는 정삼각형과 같은 형상으로 바람직하게 형성될 수 있다. 개스킷(1204) 및 차단 요소(1203)는 그에 의해 시료가 주입구 튜빙으로부터 측정 셀로 통과할 수 있는 명확하고 한정된 흐름 경로를 형성한다. 개스킷 및 차단 요소는 스테인레스 강 또는 니켈과 같은 크로마토그래피 시스템에서 사용될 용매에서 불활성인 물질로 구성된 2개의 스크린 요소들(1202) 사이에 삽입된다. 스크린들(1202)은 상대적으로 균일한 유체 경로를 제공하고, 흐름 경로를 따라 삽입된 요소들(1203, 1204)을 적소에 고정시킬 수 있다. 결과적인 삽입은 개스킷(1204)과 동일한 치수들일 수 있거나 결과의 층들이 포함되는 매니폴드의 공간 요건들을 충족시키도록 변할 수 있는 2개 이상의 원형 PTFE 개스킷들(1201) 사이에 또한 삽입된다. 도 12(b)는 어셈블리된 흐름 분배 시스템의 평면도를 도시한다.
여기에 설명된 다중 검출기 측정 셀을 통한 흐름이 관리될 수 있는 수단의 임의의 조합 및 모든 조합들이 본 발명의 일부이고, 다음의 예는 MALS 측정을 최적화하기 위해 몇몇 요소를 조합하는 바람직한 실시예를 설명한다. 이러한 실시예에서, 튜빙(1304)의 코일 섹션은 두 개의 절반부들로 구성된 매니폴드의 상부 섹션(1303)에 장착하는 주입구 연결부에 의해 연결된다. 2개의 매니폴드 절반부들(1303, 1308) 사이에 광학적으로 투명한 측정 셀(1302)이 삽입된다. 매니폴드의 2개 절반부들은 볼트들, 클램프들 또는 다른 수단에 의해 함께 유지될 수 있다. 입구 튜빙(1304)을 통한 흐름은 주입구 부속품을 통과하고, 이러한 실시예에서 도 12에 도시된 흐름 차단기인 주입구 흐름 분배기(1305)와 접촉하게 된다. 흐름은 주입구 흐름 차단기(1305)로부터 측정 셀(1302)으로 및 그를 통해 전달되고, 여기서 레이저에 의해 생성되는 것과 같이 미세한 광 빔(1301)에 의해 조명된다. 측정 셀에 관해서, 시료에 의해 조사된 빔으로부터 산란된 광을 측정하기 위해 복수의 광 검출기들이 배치된다. 측정 셀을 빠져나갈 때, 시료는 출구 흐름 차단기(1306)를 통과하여 출구 부속품에 의해 매니폴드 요소(1308) 내의 위치에 유지된 출구 튜브(1307)로 통과한다. 주입구 및 배출구 부속품들은 일반적으로 폴리에테르 에테르 케톤(PEEK) 또는 스테인레스 강과 같은 재료로 만들어진다. 출구 튜빙(1307)을 통과하는 흐름은 이후 유사한 부속품들, 코일형 튜빙 및 흐름 분배기들 또는 차단기들을 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있는 체인 내의 다른 측정 장치로 전달될 수 있다. 유입구 및 배출구 튜빙은 도 13에서 짧은 길이의 단단히 감긴 튜빙(1304, 1307)으로서 각각 도시되지만, 견고하게 감긴 튜빙, 느슨하게 감긴 튜빙, 푸아죄유 흐름 차단기(Poiseuille flow disruptor)(도 13에 나타낸 작은 길이들과 같은)만 기능하는 상당한 거리, 또는 칼럼과 측정 셀 사이의 거리만큼 합리적으로 가능한 길이만큼 감긴 길이들로 확장되는 튜빙을 포함하여, 코일형 튜빙에 대해 다양한 다른 구성들이 존재할 수 있음을 주의되어야 한다. 동일한 구성들이 또한 가능하고, MALS 기기와 MALS 기기로부터 다운스트림의 다음 측정 기기 사이에서 사용될 수 있다. MALS 기기는 먼저 분리 시스템에 후속하여 일직선으로 정렬하는 것이 가장 바람직할지라도 반드시 필요한 것은 아닌 것이 또한 인식되어야 한다.
코일형 튜빙은 일반적으로 스테인리스 강으로 구성되지만, 본 개시는 이러한 재료에만 한정되지 않는다. 코일 형상을 유지할 수 있거나 또는 HPLC, UHPLC 또는 FFF와 같은 다른 분리 시스템에서 요구되는 압력을 여전히 견디면서 코일 형상을 유지하도록 제조될 수 있는 다른 물질들이 또한 사용될 수 있다. 예를 들면, PEEK 튜빙은 코일형이고 튜빙 외부의 와이어 지지대에 의해 이러한 코일형 구성으로 유지될 수 있다. 또한, UHPLC 측정들을 위한 바람직한 내경 크기는 100㎛일 수 있지만, 본 개시는 이러한 크기로 한정되는 것으로 고려되어서는 안되고, 코일 형상을 유지하거나 코일 형상을 유지할 수 있는 임의의 표준 또는 맞춤 크로마토그래피 튜빙을 포함할 수 있다. 이러한 코일형 튜빙의 가능한 내부 크기들은 가변 내부 내경 직경의 튜빙뿐만 아니라 127㎛, 178㎛, 254㎛, 508㎛ 및 1016㎛를 포함한다.
검출기 래그(detector lag)의 측정 및 농도 윤곽선들의 시각화
상기에 논의된 정렬되지 않은 검출기들 사이의 농도 윤곽들의 측정 래그는 표준 UHPLC 시료를 용매 스트림에 주입하고 여러 산란 각도들에서 CCD 카메라로 시스템을 통과하는 것을 모니터링함으로써 실험적으로 입증되었다. 시료가 통과할 때 내경의 너비에 따른 좁은 스트립을 모니터링되고 복수의 위치들에서의 강도가 기록된다. 시간 지연은 측정 체적 내의 각 위치에 기록된 강도 최대값의 도달 시간에 기초하여 계산되었다. 몇 번의 실험 결과들은 도 14 내지 도 17에서 보여질 수 있다. 제시된 데이터는 결과 시간 지연들을 보여주고, 몇몇 조건들에 대한 시료 전면의 시각화를 제공한다.
도 14는 측정 셀에서의 시료 프로파일에 대한 딘 흐름의 영향을 그래프로 도시한다. 트레이스 1은 주입구 튜빙이 레이저 빔 입구쪽으로 약간 구부러진 흐름 시료 프로파일을 보여준다. 트레이스 2는 결과적인 시료 프로파일을 도시하고, 입구 튜빙은 전방 모니터를 향해 레이저 반대 방향으로 구부러진다. 트레이스 3은 가능한 한 똑같은 방식으로 셀에 연결된 튜빙의 프로파일을 보여준다. 이러한 데이터는 입구 튜빙의 작은 구부러짐들이 셀 자체에서 극적으로 상이한 흐름 프로파일들을 생성할 수 있음을 나타내고, 이는 이전에 논의한 약간 오정렬된 감지기들의 시간 지연 문제들을 유발할 것이다.
도 15는 흐름 셀로의 입구 튜빙이 완전히 직선이어서 거의 굽힘 반경을 갖지 않는 거의 이상적인 구성을 도시한다. 사용된 흐름 레이트는 0.3mL/min이었고, 입구 튜빙의 내부 직경은 100㎛이고 입구 튜빙 길이는 250mm였다. 스테인리스 강 스크린이 흐름 분배기로서 사용된다. 데이터에서 알 수 있듯이, 윤곽 프론트는 시료 프로파일에서 여전히 명확한 시간 의존성이 존재하지만 비교적 대칭적이다.
대조적으로, 도 16은 시료 프로파일에 대한 심각한 비대칭을 보여준다. 이전 예에서와 같이, 사용된 흐름 레이트는 0.3mL/min이고, 입구 튜빙의 내부 직경은 100㎛이고 입구 튜빙 길이는 250mm였다. 스테인리스 강 스크린이 흐름 분배기로서 사용되었다. 그러나, 이 예에서, 입구 튜빙은 셀에 들어가기 전에 25mm의 굽힘 반경을 가졌다. 이 경우 25mm 굽힘에 대한 Dn2Sc 파라미터는 약 3500이고, 튜브 곡률(tube curvature)을 나타내는 최소값보다 훨씬 높으면 피크 분산에 영향을 미친다.
마지막으로, 도 17은 수집된 데이터를 나타내고, 셀의 주입구로 들어가는 튜빙은 약 25mm의 굽힘 반경을 가지지만, 셀에 들어가기 직전 및 25mm 굽힘 후에 튜빙에 코일이 추가된다. 또한, 사용된 흐름 레이트는 0.3mL/min이고, 입구 튜빙의 내부 직경은 0.004"이고, 입구 튜빙 길이는 250mm이고, 코일 굽힘 반경은 1.6mm이다. 스테인레스 강 스크린은 흐름 분배기로서 사용되었다. 명확하게 볼 수 있듯이, 흐름 분배 스크린을 갖는 코일의 추가는 프로파일을 도 15에 도시된 것과 유사한 대칭 상태로 복귀시키고, 튜빙은 비실용적으로 직선적이다. 이 경우, 1.6mm 코일에 대한 Dn2Sc 파라미터는 약 67000이고, 25mm 굽힘 값의 거의 20배이다. 주입구 굽힘과 비교하여 코일의 훨씬 큰 Dn2Sc 값은 코일에 의해 생성된 분산을 초래하여 튜브 내의 시료 흐름에 더 큰 영향을 미치고 시료 셀에 들어가기 전에 방사형 및 축 방향 모두에서 훨씬 더 균일한 시료 농도를 초래한다.
도 18은 흐름 셀 내의 동일한 시료 체적에 정렬되지 않은 크로마토그램 트레이스들의 결과들을 3개의 검출기들과 대조한다. 검출기 트레이스들은 작은 오정렬이 도 18a에 도시된 검출기 트레이스들 사이의 시간 지연을 초래한다는 것을 강조하기 위해 동일한 진폭으로 정규화된다. 검출기들 사이의 50msec의 시간 지연은 최대 10%의 반경 오류를 초래할 수 있다. 대조적으로, 각각의 검출기가 유사한 시료 체적을 보고 있는 도 18b에 도시된 데이터는 3개의 검출기 신호들 모두가 상당한 지연 시간없이 잘 정렬되어 시료 반경의 정확한 측정을 초래한다.
광 산란 기술 및 거대 분자들의 특성화의 기술 분야의 당업자에게 명백한 바와 같이, 그들의 실시를 위해 나열된 기본적인 요소들로부터 벗어나지 않는 본 발명의 방법들 및 장치들의 많은 명백한 변형들이 존재하고; 모든 그러한 변형들은 앞서 설명된 본 발명의 명백한 구현이지만, 다음의 청구 범위를 참조하여 포함된다.

Claims (30)

  1. 관류 셀(flow through cell)에서 액체 시료를 균질화하기 위한 장치에 있어서,
    다수의 검출기 요소들에 의해 보이는, 주입구 및 배출구를 포함하고,
    상기 검출기 요소들의 각각은 실질적으로 동일한 시료 조성을 조사하고,
    상기 셀의 상기 주입구 및 배출구는:
    A. 상기 주입구에 연결된 코일형 튜브로서, 상기 코일형 튜브의 내경 반경(bore radius)에 대한 굽힘 반경(bend radius)의 비가 50 미만인, 상기 코일형 튜브;
    B. 상기 셀 주입구로 들어가기 전에 상기 시료가 통과하는 흐름 분배기;
    C. 상기 셀 배출구를 나간 후에 상기 시료가 통과하는 흐름 분배기로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 균질화 요소들을 포함하는, 액체 시료를 균질화하기 위한 장치.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 셀은 투명하고, 상기 액체 시료가 통과하는 경로는 내경을 포함하고,
    상기 장치는:
    A. 상기 투명 측정 셀의 상기 내경 내에 시료를 조명하기 위한 수단; 및
    B. 상기 시료로부터 광 신호를 측정하는 복수의 검출기들을 더 포함하는, 액체 시료를 균질화하기 위한 장치.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 코일형 튜브는 나선형인, 액체 시료를 균질화하기 위한 장치.
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 시료를 조명하기 위한 상기 수단은 상기 액체 시료의 흐름 경로에 실질적으로 평행인 상기 내경의 길이를 따라 통과하도록 지향되는, 액체 시료를 균질화하기 위한 장치.
  5. 제 2 항에 있어서,
    상기 시료를 조명하기 위한 상기 수단은 상기 액체 시료의 상기 흐름 경로에 실질적으로 수직으로 통과하도록 지향되는, 액체 시료를 균질화하기 위한 장치.
  6. 제 2 항에 있어서,
    상기 균질화 요소는 흐름 분배기이고, 상기 흐름 분배기는
    A. 상기 액체 시료가 통과하는 주입구 튜빙; 및
    B. 상기 주입구 튜빙와 상기 내경 사이에 위치된 주입구 입력 체적을 더 포함하고,
    상기 흐름 분배기는 상기 주입구 입력 체적과 상기 내경 사이에 배치되고,
    또한, ΔP1는 상기 주입구 입력 체적을 채우기 위해 상기 시료에 요구되는 압력차를 규정하고; ΔP2는 상기 흐름 분배기를 통해 상기 내경으로 통과하도록 상기 시료에 대해 요구된 압력차를 규정하고; 상기 주입구 입력 체적의 크기들은 ΔP2 >>ΔP1이도록 선택되고, 그에 의해 상기 흐름 분배기의 통과 전에 상기 주입구 입력 체적에서 상기 액체 시료의 균질화를 촉진하는, 액체 시료를 균질화하기 위한 장치.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 흐름 분배기는 메시 스크린(mesh screen)인, 액체 시료를 균질화하기 위한 장치.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 흐름 분배기는 프릿(frit)인, 액체 시료를 균질화하기 위한 장치.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 메시 스크린은 스테인리스 강(stainless steel)으로 구성되는, 액체 시료를 균질화하기 위한 장치.
  10. 제 6 항에 있어서,
    상기 주입구 입력 체적은 0.2μL인, 액체 시료를 균질화하기 위한 장치.
  11. 제 7 항에 있어서,
    상기 메시 스크린은 25㎛의 공극 크기(pore size)를 갖는, 액체 시료를 균질화하기 위한 장치.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 흐름 분배기는:
    A. 고체 흐름 차단 요소;
    B. 상기 흐름 차단 요소가 배치되는 내부 개구를 갖는 제 1 개스킷;
    C. 상기 제 1 개스킷과 상기 흐름 차단 요소를 그 사이에 삽입하여 상기 제 1 개스킷의 일 측면상에 상기 흐름 경로를 따라 배치된 한 쌍의 고정 스크린 요소들; 및
    D. 상기 흐름 경로를 따라 배치된 한 쌍의 제 2 개스킷들로서, 그의 각각은 상기 한 쌍의 고정 스크린 요소들 및 상기 제 1 개스킷 및 상기 흐름 차단 요소를 그 사이에 삽입하여 상기 고정 스크린 요소들 중 하나와 접촉하는, 상기 한 쌍의 제 2 개스킷들을 포함하는, 액체 시료를 균질화하기 위한 장치.
  13. 제 12 항에 있어서,
    A. 상기 제 1 개스킷은 원형 내부 개구를 갖고,
    B. 상기 흐름 차단기의 형상은 다각형이고;
    C. 상기 흐름 차단기의 치수들은 그의 모서리들이 상기 제 1 캐스킷의 상기 내부 개구의 표면과 접촉하도록 선택되는, 액체 시료를 균질화하기 위한 장치.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 코일형 튜브는 주로 스테인리스 강으로 구성되는, 액체 시료를 균질화하기 위한 장치.
  15. 제 1 항에 있어서,
    상기 코일형 튜브는 127 미크론의 공칭 내부 직경을 갖는, 액체 시료를 균질화하기 위한 장치.
  16. 제 2 항에 있어서,
    상기 내경은 직경이 1㎜이고 길이가 4㎜인, 액체 시료를 균질화하기 위한 장치.
  17. 제 2 항에 있어서,
    상기 시료를 조명하기 위한 상기 수단은 레이저인, 액체 시료를 균질화하기 위한 장치.
  18. 제 2 항에 있어서,
    상기 복수의 검출기들은 상기 조명된 시료로부터 산란된 광을 측정하는, 액체 시료를 균질화하기 위한 장치.
  19. 제 2 항에 있어서,
    상기 셀과 하나 이상의 상기 검출기들 사이에 배치된 광 필터 수단을 더 포함하는, 액체 시료를 균질화하기 위한 장치.
  20. 액체 시료를 함유하는 입자의 속성들을 측정하는 방법에 있어서,
    A. 분석될 액체 시료를 함유하는 상기 입자를 준비하는 단계;
    B. 상기 시료가 튜빙의 길이를 따라 상기 분리 수단으로부터 검출 기기로 흐르게 하는 단계로서, 상기 검출 기기는
    a. 투과광 측정 셀로서,
    ⅰ. 상기 시료를 통과하는 내경;
    ⅱ. 상기 내경으로의 시료 주입구;
    ⅲ. 상기 내경으로부터 시료 배출구를 포함하는, 상기 투과광 측정 셀;
    b. 상기 내경 내 상기 시료를 조명하기 위한 수단; 및
    c. 상기 조명된 시료로부터 광 신호를 검출하기 위해 위치된 복수의 광 검출기들을 포함하는, 상기 투과광 측정 셀을 포함하는, 상기 시료가 상기 분리 수단으로부터 상기 검출 기기로 흐르게 하는 단계;
    C. 균질화 요소들의 그룹 중 하나 이상을 통해 상기 시료를 흐르게 함으로써 상기 광 측정 셀을 통한 통과 전에 상기 시료를 균질화하는 단계로서, 상기 균질화 요소들은
    a. 상기 코일형 튜브의 내경 반경에 대한 굽힘 반경의 비가 50 미만인 상기 시료 주입구에 연결된 코일형 튜브;
    b. 상기 액체 시료가 상기 내경으로의 진입 전에 통과하는 흐름 분배기; 및
    c. 상기 액체 시료가 상기 내경을 나온 후 통과하는 흐름 분배기로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 상기 시료를 균질화하는 단계;
    D. 상기 시료를 조명하는 단계;
    E. 상기 광 검출기에 의해 상기 조명된 시료로부터 동시의 광 신호들을 수집하는 단계; 및
    F. 상기 액체 시료의 물리적 속성들을 결정하기 위해 상기 수집된 광 신호들을 분석하는 단계를 포함하는, 입자의 속성들을 측정하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    A. 분리 수단으로의 주입에 의해 상기 시료를 그의 구성 요소들로 분리하는 단계; 및
    B. 상기 분리된 시료가 상기 분리 수단으로부터 상기 검출 기기로 흐르게 하는 단계를 더 포함하는, 입자의 속성들을 측정하는 방법.
  22. 제 20 항에 있어서,
    상기 수집된 광 신호들은 복수의 산란각들에서 상기 시료로부터 산란된 광을 포함하는, 입자의 속성들을 측정하는 방법.
  23. 제 20 항에 있어서,
    상기 시료 조명 수단은 레이저 빔인, 입자의 속성들을 측정하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서,
    상기 레이저 빔은 상기 시료의 흐름과 동일한 검출에서 상기 내경을 가로지르는, 입자의 속성들을 측정하는 방법.
  25. 제 23 항에 있어서,
    상기 레이저 빔은 상기 시료의 흐름의 방향에 실질적으로 수직인 상기 내경을 가로지르는, 입자의 속성들을 측정하는 방법.
  26. 액체 혼합물을 균질화하기 위한 장치에 있어서,
    주입구 및 배출구 애퍼처들 양쪽 모두를 포함하는 관류 셀로의 상기 혼합물의 주입 전에, 시료 부분 표본을 추가한 순수한 용매를 포함하고,
    균질화 수단은 상기 혼합물이 상기 관류 셀을 통한 흐름으로 진입하기 전에 흐르게 하도록 한정되는 다음의 요소들:
    A. 내경 반경에 대한 굽힘 반경의 비가 50 미만인 코일형 튜브; 및
    B. 상기 셀 주입구로 진입하기 전에 상기 혼합물이 통과하는 흐름 분배기 중 하나 이상을 포함하는, 액체 혼합물을 균질화하기 위한 장치.
  27. 제 26 항에 있어서,
    상기 혼합물은 또한 그의 배출구 애퍼처를 통해 상기 셀을 떠난 후 다음의 요소들:
    A. 상기 코일형 튜브의 내경 반경에 대한 굽힘 반경의 비가 50 미만인 코일형 튜브; 및
    B. 상기 셀 배출구를 떠날 때 상기 혼합물이 통과하는 흐름 분배기 중 하나 이상을 통해 상기 혼합물이 흐르도록 한정함으로써 상기 셀을 떠날 때 균질화되는, 액체 혼합물을 균질화하기 위한 장치.
  28. 제 26 항에 있어서,
    상기 흐름 분배기는 메시 스크린을 포함하는, 액체 혼합물을 균질화하기 위한 장치.
  29. 제 26 항에 있어서,
    상기 흐름 분배기는
    A. 고체 흐름 차단 요소;
    B. 상기 흐름 차단 요소가 배치되는 내부 개구를 갖는 제 1 개스킷;
    C. 상기 제 1 개스킷 및 상기 흐름 차단 요소를 사이에 삽입하여 상기 제 1 개스킷의 어느 하나의 측면상에 상기 흐름 경로를 따라 배치된 한 쌍의 고정 스크린 요소들; 및
    D. 상기 흐름 경로를 따라 배치된 한 쌍의 제 2 개스킷들로서, 그의 각각은 상기 한 쌍의 고정 스크린 요소들, 상기 제 1 개스킷 및 상기 흐름 차단 요소를 사이에 삽입하여 상기 고정 스크린 요소들 중 하나의 접촉하는, 상기 한 쌍의 제 2 개스킷들을 포함하는, 액체 혼합물을 균질화하기 위한 장치.
  30. 제 27 항에 있어서,
    상기 흐름 분배기는
    E. 고체 흐름 차단 요소;
    F. 상기 흐름 차단 요소가 배치되는 내부 개구를 갖는 제 1 개스킷;
    G. 상기 제 1 개스킷 및 상기 흐름 차단 요소를 사이에 삽입하여 상기 제 1 개스킷의 어느 한 측면상에 상기 흐름 경로를 따라 배치된 한 쌍의 고정 스크린 요소들; 및
    H. 상기 흐름 경로를 따라 배치된 한 쌍의 제 2 개스킷들로서, 상기 한 쌍의 제 2 개스킷들의 각각은 상기 한 쌍의 고정 스크린 요소들, 상기 제 1 개스킷, 및 상기 흐름 차단 요소를 사이에 삽입하여 상기 고정 스크린 요소들 중 하나와 접촉하는, 액체 혼합물을 균질화하기 위한 장치.
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