CN108367256B - 测量来自液体样品的多个信号的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

在流通、多检测器光学测量系统中采用一个或多个均化元件。均化元件校正多检测器流通系统常见的问题，诸如峰拖尾和测量池内非均匀样品轮廓。均化元件包括盘绕入口管；在池的入口附近的流动分配器，和在池的出口处的流动分配器。该样品的均化模拟测量池内的塞式流动并且能够使每个检测器观察每个个体对应观察的样品体积中相同的样品组成。当执行窄色谱峰的多角度光散射(MALS)测量诸如超高压液体色谱(UHPLC)所产生的那些时，该系统是特别有益的。

Description

测量来自液体样品的多个信号的方法和装置
优先权
本申请要求2015年9月22日提交的美国临时申请号62/221,879的优先权。
相关申请
以下涉及本发明的背景和应用的参考文献通过引用并入本文。
Steven P.Trainoff，2008年6月10日授权的美国专利号7,386,427B2，“Methodfor correcting the effects of interdetector band broadening”。
Steven P.Trainoff，2011年3月22日授权的美国专利号7,911,594B2，“Method toderive physical properties of a sample after correcting the effects ofinterdetector band broadening”。
Gary R.Janik等人，1999年5月4日授权的美国专利号5,900,152，“Apparatus toreduce inhomogeneities in optical flow cells”。
Gary R.Janik等人，1997年10月14日授权的美国专利号5,676,830，“Method andapparatus for reducing band broadening in chromatographic detectors”。
Steven D.Phillips等人，1986年10月14日授权的美国专利号4,616,927，“Samplecell for light scattering measurements”。
Raymond P.W.Scott和Elena Katz，1991年7月16日授权的美国专利号5,032,183，“Low dispersion fluid conduit useful in chromatography systems”。
Steven P.Trainoff，2011年7月19日授权的美国专利号7,982,875，“Improvedmethod and apparatus for measuring the scattered light signals from a liquidsample”。
定义
通过“颗粒”，我们指如蛋白和聚合物分子连同它们的缀合物和共聚物、病毒、细菌、病毒状颗粒、脂质体、聚苯乙烯乳胶颗粒、纳米颗粒以及在一至数千纳米的近似大小范围内的所有这类颗粒的这类物体。
术语准弹性光散射(QELS)、动态光散射(DLS)和光子关联光谱(PCS)经常用于描述相同的现象，即来自经历布朗运动的颗粒的散射光的测量。在本说明书中，我们将使用术语QELS，但应该注意的是，QELS等同于本领域中经常使用的其他提及的术语。QELS不同于其他光散射测量技术，其中最常见的是多角度光散射(MALS)，以前称为“差示光散射”，其测量从颗粒的溶液散射的光的角相关(angular dependence)。
贯穿整个说明书，将参考光学测量池(cell)。存在将在本文中讨论的最一般形式的两种池类型。第一种是池，诸如Phillips在美国专利号4,616,927中所描述的池，其中液体样品和溶剂通过该池的流动方向沿基本平行于照射光束的相同路径行进。该池配置将被称为“平行池”。本文讨论的可选池设计是其中流体流动横向于照射光束行进的池设计。该池配置将被称为“垂直池”。这是用于测量从圆柱容器散射的光的传统结构。应该指出的是，该命名法不应该指示严格的限制，而只是提供一般的描述和指定。例如，穿过平行池的光束可以以小角度倾斜，使得在池的入口处光束几乎掠射孔(bore)的底部，而在出口处它几乎掠射孔的顶部，并且仍然被认为是“平行池”，即使流动和光束不是精确平行的。实际上，在本发明的几个实施方式中，可能希望以一定角度引导光束通过样品，从而使反射最小、减少噪声等。上文和整个说明书中讨论的光学测量池是流通池，其包含液体样品通过其经过的孔。虽然这些孔一般为圆形或接近圆形的横截面，但不应将样品孔视为限于此形状。本发明适用于具有各种形状的孔横截面的池——其包括矩形、半圆形、椭圆形、三角形等，以及横截面和路径中的不规则形状。
有许多手段可以将液体样品中各种尺寸、质量和电荷的颗粒与其组分分离。在本公开中，我们将主要集中在通常被称为超高压液相色谱(UHPLC)的技术上，其也被称为超高效液相色谱，然而应该注意的是，当今使用的大多数分离技术是液相色谱类的种类，并且所有液相色谱技术都可以从本文公开的发明中受益。因此，虽然下面的讨论将主要涉及UHLPC(有时也以商标名称
Figure BDA0001659402750000021
提及，Waters Corporation,Milford,Massachusetts)，因为它是从本发明获益最多的方法，但是本发明也适用于其他液相色谱技术，诸如高压液相色谱(HPLC)，其常常被称为尺寸排阻色谱(SEC)或凝胶渗透色谱(GPC)和反相色谱。此外，本发明还适用于与其他基于流动的分离技术诸如场流分级法(FFF)一起使用，其中分离的样品经由管递送到检测池。
背景技术
溶液中大分子或颗粒种类的分析通常通过在合适的溶剂中制备样品然后将其等分部分注入分离系统，诸如液相色谱(LC)柱或场流分级法(FFF)通道中来实现，其中样品内包含的不同种类的颗粒被分离成它们的各种组分。一旦通过这类手段——一般基于尺寸、质量或柱亲和性——分离，样品经历借助光散射、折射率、UV吸收、电泳淌度、测粘响应等的分析。在本公开中，我们将主要使我们自己关注多角度光散射(MALS)。
在图2中示出了典型的HPLC-MALS设置(setup)。通常由HPLC泵201从溶剂贮存器202通过脱气装置203抽取溶剂，然后泵送通过过滤机构204至注射阀211。一般通过注射器206将液体样品205注入注射阀211的样品回路212。然而，样品可以借助自动注射器而不是所描述的手动机构被添加到流动流中。然后流体样品从注射器流动通过一个或多个HPLC柱207，在HPLC柱207中样品中包含的分子或颗粒被按照大小分离，其中最大颗粒首先洗脱。分离的样品然后顺序经过MALS检测器208和浓度检测器，诸如差示折射计209，之后传至废液。能够测量样品中分子或颗粒的物理性质的其他仪器也可以沿着流动流存在。例如，仪器链中可能存在UV/Vis吸光度检测器和/或粘度计。通常，由该仪器生成的数据被传输到能够收集、存储和分析数据并将结果报告给用户的计算机。
如上所讨论的，将包含等分部分的样品注入分离系统，诸如，图2所示的HPLC系统，或与本发明更紧密联系的UHPLC系统，其类似但其中柱207为一个或更多UHPLC柱而不是HPLC柱，并且泵201能够产生更高的压力，在该压力下UHPLC系统运行。柱将样品按大小分离为其组分级分。这些洗脱和分离的级分中的每一种产生“峰”，其通过管道传至测量体积。每个检测仪器又测量当峰经过测量体积时来自其的信号。单个等分部分可产生任何数目的峰，例如，单个颗粒大小的单分散样品将只产生一个峰。当每个样品峰经过测量体积时，将检测到信号，其与在其经过该池的任何给定时刻下正在分析的样品相关。这些有限的测量通常称为“切片”，每个切片代表在给定体积的洗脱液流过池时检测的样品的瞬时测量。这些信号被数字化并存储在计算机中，并且所得到的数据通常作为峰301——诸如图3中所示的峰——报告给用户，其中峰的每个成分表示给定的切片。可以使用软件程序诸如
Figure BDA0001659402750000031
(Wyatt Technology Corporation,Goleta,California)来查看和分析给定切片处的数据，在这种情况下跨越多个角度302的光散射数据302对应单个切片302a。图3所示的数据还包括从差示折射计记录的信号303。
附图说明
图1显示了MALS测量的几何示意图。
图2显示了与MALS测量相关联的各种元件的典型HPLC-MALS配置。
图3是在整个峰内收集的MALS和浓度数据的实例，其包括为单个切片显示的MALS数据。
图4显示了用于光散射测量的平行池结构和Phillips的相关歧管系统。
图5图解了可选的光散射池配置，对比了其流动路径与图4的池的流动路径。
图6图解了(a)由于泊肃叶流动经历扩展的流动样品，(b)收集来自样品池的散射光的三个失准直检测器的视场，和(c)图解由于失准直每个检测器观察到的时间迁移的强度对时间曲线。
图7显示了由于来自弯曲或不适当地引导入口管的迪安流动(Dean flow)，测量池内实例流动轮廓。
图8显示了单个浓度轮廓前沿通过观察略微不同的检测体积的两个检测器的时间差异。
图9显示了发明性测量系统的实施方式的示意表示，该测量系统采用螺旋盘绕入口管，该入口管校正了入口管内的不对称流动轮廓。
图10图解了发明性流动系统的实施方式，其具有经过其的样品的流动轮廓浓度等值线(contour)的图表表示。注意，该具体实施方式在测量池的入口和出口处都采用了流动分配器。
图11显示了在平行池配置中采用环形流动分配器的流动池组件。
图12图解了发明性测量系统的流动分配器的优选实施方式，其中方形流动中断器位于夹在两个网状片之间的圆形垫圈内，两个网状片又夹在另一对圆形垫圈之间。
图13显示了本发明的优选实施方式，其利用许多公开的元件，包括在流动池歧管中保持在一起的图12的流动分配器夹层(sandwich)对，流动池歧管也允许盘绕入口和出口管与标准配件的连接。
图14呈现了测量池中流动轮廓的视图，其中轮廓显示了由于弯曲入口管引起的迪安流动造成的不对称。
图15图解了接近理想配置的池内的流动轮廓，其中入口管在与流动池连接之前是完美笔直的。
图16图解了由于在与流动池连接之前管中25mm弯曲半径造成的样品轮廓的不对称。
图17图解了如图16中展现的那些，具有相同弯曲条件的样品轮廓，然而，在该图解中，本发明的实施方式中其中采用了盘绕入口管和网状流动分配器。
图18对比了其中检测器(a)和(b)未失准直的两个色谱图。失准直可以导致显著的误差。
具体实施方式
MALS检测系统经常地使用流动池，其中水平孔限定流体流动和测量光束沿其穿过池的路径二者的区域。Phillips等人在1986年10月14日授权的美国专利号4,616,927中描述了这种池。本文称为平行池的池是如图4所示的圆柱体的截面(section)，具有钻穿通过直径的孔。该池设计进一步作为横向透镜，使得光束401作为检测区402附近的线光源，在该检测区402处围绕池的圆周以各种角度定位的多个检测器(未示出)被定向以接收被样品从其散射的光。因此，虽然这种创新设计允许在给定散射角从探测器收集更多光，但是由于该设计需要更大的样品体积，这种益处是以给定测量角度沿流动路径的线光源的宽度自然发生的样品浓度的一些平均为代价的。Steven P.Trainoff在2011年7月19日授权的美国专利号7,982,875中公开了另一种机构，通过其增加了以给定角度散射的光的量，其是对Phillips池的修改，其中样品池充当垂直和横向透镜两者。
工业中相应产生较低体积峰的较低样品体积的趋势已经驱动超高压液相色谱(UHPLC)的出现。由此，用于测量UHPLC峰的MALS检测系统在灵敏度和体积上必须合适地成比例。经过测量池的液体样品在其进入池时被样品的流动力学极大地影响，测量池是上面所讨论的平行池或者是可选的配置，诸如图5(a)中所示并被称为垂直池的配置。在垂直池中，样品流501进入垂直于光束504的池结构503的孔502。位于测量池周围的检测器阵列收集散射的光。理想地，每个检测器将观察相同的照射体积，但是，由于非完美的准直和以不同角度放置的检测器看到的样品体积的几何形状的变化，它们必须观察略微不同的体积并因此样品被均匀分配在整个池是必要的。图5(b)中显示了基于以不同角度放置的检测器的视场的散射体积的几何形状的变化的实例。直径为2r的激光光束504经过测量池的孔502。三个检测器D1、D2和D3被放置在池的周围并且每个被定向以检测来自池中心附近的照射样品的散射。然而，三个检测器中每个具有独特的视场，其导致如此检测区：其对应的观察的散射体积d1、d2和d3改变。在该实例中，与激光光束成90°放置的检测器D3将具有最小的散射体积，而以小角度放置的检测器D3将具有最大的散射体积。如果跨越所有的测量散射体积d1、d2和d3样品浓度是均匀的，那么信号可以简单地标准化为单位一(unity)。然而，如果当经过光束时，样品轮廓是不均匀的，那么不仅每个样品将观察不同大小的散射体积，而且散射体积的几何形状的变化将引起每个检测器观察从其经过的不同样品。因此，样品在个体检测器看到的整个测量的散射体积范围内均匀是至关重要的。
利用UHPLC，样品均匀性的问题是特别明显的，这是因为峰宽与测量池的样品体积相似。在分离的样品从UHPLC系统传送到测量池期间，沿着毛细管的层流会导致泊肃叶流动。在泊肃叶流动中，速度轮廓是抛物线的，其中管壁处的流体流动为零，并且在管中心处的流动处于最大，其理论上是样品区域平均流动的1.5倍。如图6所示，泊肃叶流动轮廓601引起离开分离系统的窄样品峰602当其经过孔时随时间而变宽，为管或测量池的长度。在这些条件下，检测器的任何轻微的失准直——其中每个检测器观察到略微不同的照射体积——可以使得每个检测器在时间上给定的时刻测量经过池的样品的略微不同的截面。例如，考虑图6a中所示的样本轮廓，其中样本正沿着检测池向下行进并且光束603在时间t＝2处样品经过所指示的点处穿过池。图6b显示了光束界面处样品的横截面。在时间t＝2时，样品的前部已经达到截面604所指示的区域，而截面605仅由溶剂组成。三个不同的光散射检测器定向朝向池的中心，但准直中的略微变化使它们看到照射光束的不同区域。因此，第一检测器606检测从区域606a散射的光，其中检测区域内的部分光束照射样品604。第二检测器607看到不同的区域607a，其中光从样品604唯一地散射，并且第三检测器608在时间t＝2时根本看不到样品散射。该效应引起每个检测器记录的强度峰中的时间迁移；图6c表示每个检测器的强度对时间曲线。应该注意的是，如果达到完美准直，也就是说，如果每个检测器观察到准确相同的测量体积，则关于在每个检测器处记录的强度的该时间变化将不会以相同的方式呈现，但是测量可由于上面讨论的每个检测器所观察到的光束与立体散射角的交点所限定的不同散射体积而仍然受到峰的一些时间失准直的困扰。
当样品进入测量池时，分散被迪安流动和对流扩散现象加剧，其中由于光散射信号到达个体检测器的时间延迟，来自入口管道中的轻微弯曲的径向不均匀性使得样品不对称地进入池，将误差引入到测量中。这已经在文献中显示，例如，参见A.Kaufman等人，“Extra-Column Band Spreading Concerns in Post-Column Photolysis Reactors forMicrobore Liquid Chromatography,”Current Separations,17(1)9-16(1998)，可以通过无量纲参数Dn2Sc描述弯曲或盘绕的管中的峰分散，其中Dn是迪安数，
Figure BDA0001659402750000051
其中rt和rc分别为管内直径和管弯曲半径，以及Re为雷诺数和Sc为施密特数，
Figure BDA0001659402750000052
其中Dm为样品扩散系数，η为溶剂粘度和ρ为溶剂密度。已经发现，小于100的Dn2Sc对峰分散具有很小的影响，而更大的值可以具有显著影响。图7显示了具有泊肃叶轮廓的样品进入由各种样品浓度带构成的测量池。每个等值线701、702、703、704、705代表给定的样品浓度带的边界。如果样品通过完美平行于孔的管进入池并且没有来自迪安流动的贡献，rc＝∞，那么样品边界在样品池的孔限定的平面处将是同心的，其中其与照射光束706相交，如图图7(b)所示。然而，如图7(a)所指示，例如通过不合适地成角度的或连接的入口管，或通过源于来自弯曲管的迪安流动的径向不均匀引起的任何不对称将导致诸如图7(c)和7(d)中所示的那些的轮廓。如上所讨论的，如果我们考虑MALS检测系统——其具有三个独立检测器，该检测器被定向以检测样品穿过时被样品散射的来自照射光束的光，我们可以看到如果每个检测器与池的相同区域完美准直，即使当样本是不对称分布时，每个将以上面讨论的每个检测器的检测几何形状的变化允许的程度“看到”相同的样品带。然而，完全准直尽管期望但实际上从未实现，并因此，如前面图6所示，每个检测器将在样品经过照射光束时测量不同浓度区域。因此，在时间上给定的时刻，在三个检测器中的每一个的视场内总是存在样品体积的小变化。随着增加更多的检测器，这个问题进一步恶化。
通过图8进一步解释了检测器之间的时间迁移，其中显示了单个浓度等值线并存在由两个单独的检测器的视场限定的两个检测体积。在这种情况下，检测体积被标记为d1和d2。等值线801表示给定浓度的样品的边界。两个探测器看到等值线801之后的样品的时间基于检测器视场的横向定位而改变。在时间t＝0时，没有检测器正看见样品的照射体积。当样品在t＝0和t＝2之间穿过毛细管行进时，等值线801向下移动。在时间t＝1时，D2看到等值线801之后的样品，在时间t＝2时，D1看到等值线，并且因此时间延迟Δt简单地为t2-t1。再者，在图8c中，图形地显示强度对时间峰。
使来自单独的峰的光散射的准确测量复杂化的另一问题涉及峰拖尾，这是沿着毛细管轴向变宽的结果并且由管内的层流直接引起。管边缘处的流速为零，因此靠近该边界的任何样品可能需要非常长的时间洗脱入测量池。
因此，为了提高分离——特别是UHPLC分离——后MALS和其他光学测量的可靠性，所有这些问题：峰拖尾、进入测量池的非均匀样品轮廓以及管和样品池内的泊肃叶流动，可以通过本文公开的发明性方法和装置解决。本发明试图尽可能促进样品通过池的塞式流动(plug flow)，并提高样品池内流动轮廓的对称性。塞式流动是通过管的流动的简单速度轮廓，其中跨越管直径的每个元件具有相同的速度。因此，塞式流动与上面讨论的泊肃叶流动形成鲜明对比。
待解决的第一个问题是当样品进入流动池时管内样品的不均匀性。图9显示了本发明的一个实施方式，本发明利用一定长度的盘绕管902，如下所讨论其被设计以在样品进入流动池之前扰乱(disrupt)泊肃叶流动和由于迪安流动引起的贡献。盘绕管促进横向于流动路径的径向混合，在流体进入池时，跨越入口管的宽度产生相等的分布，导致关于孔的对称流动轮廓进入流动池。盘绕管还促进泰勒分散，导致剪切流动，从而增加远离管壁的样品的有效扩散系数。这种效应有助于缓解上面讨论的峰拖尾。通常由不锈钢制成的窄孔管902以螺旋形盘管形成，其中管的转弯半径优选为管的内半径的大约15倍。尽管盘绕管对于这种类型的混合可能比包括蛇形路径的混合效率低，但其更容易制造并保持在有用的形状。在样品经过盘绕管902后，它沿测量池经过照射光束至池出口，在那里它传到出口池，当样品传到链中的下一个仪器或废液时，该出口池也可以连接到一段盘绕管。围绕池的是一组光检测器，它们以多个散射角度收集由照射光束从样品散射的光。
为了促进在样品池本身内均匀的样品流动，本发明的装置可以利用放置在流体的入射射流的路径中的流动分配器和/或在池的出口之后并在出口管之前放置的流动分配器。图10显示了本发明的一个实施方式的元件的横截面。入口管1001允许流动进入入口进口体积1002，在那里其然后经过用作入口流动分配器1003的多孔屏障。在入口管和检测池之间存在阻抗失配，其与平均流体速度的平方成比例。ΔP1限定了样品填充整个入口进口体积1002所需的压差。ΔP2限定了样品从入口进口经过流动分配器1003进入池进口体积所需的压差。为了使流动合适地分布——横向于通过池的流体流动，在进入池进口体积1004之前，ΔP2>>ΔP1。检测池的直径——通常为入口管的内直径的约10倍——将需要产生大于样品池的标称背压10,000倍的背压。当达到该条件时，可以将通过分配器1003的流速近似为在体积1002内的任何地方都是均匀的。在入口处还包括盘管的实施方式导致样品跨越孔口(orifice)1001是均匀的。考虑到通过流动分配器1003的均匀速度，样品将自身分布成跨越整个顶表面是均匀的，从而实现了好的近似——塞式流动。
例如，在一个实验配置中，在2psi下测量ΔP1-ΔP2，这是大于计算所需的背压1000倍，其将只在样品进入测量池时改善样品分布。在经过流动分配器1003之后，流动进入池进口体积1004，然后进入测量池1006的内孔1005。光束1007经过池，并且光检测器以绕池的环放置以检测散射光。光检测器的数目可以从一般相对于光束方向90°放置的单个检测器变化到以各种角度放置的多个检测器。
流动分配器本身可以采取多种形式。在本发明的优选实施方式中，流动分配器是孔径为25μm的不锈钢线网。发明人的实验已经证实这种配置为均匀流动轮廓提供了可观的益处，同时使系统背压和堵塞的可能性最小。使用不锈钢网作为流动分配器的添加的益处包括其与水溶液和有机溶剂两者的相容性、耐久性和低成本。入口处的网将注射样品进入池的单个孔口1001转变成多个孔口，其每个将一部分样品引入池。所得到的进入池的流动在每个微孔口处类似于多个泊肃叶分布，当该流动进入流动池时，多个泊肃叶分布一起平均近似塞式流动。然后当样品穿过测量体积时，塞式流动恢复为大规模泊肃叶轮廓。盘状玻璃料也可以用作流动分配器。
在本发明的另一实施方式中，可以使用线轴形(spool shaped)环形流动分配器。这对利用平行流动池配置的光散射测量特别有用；因为在许多配置中筛网或玻璃料将阻挡沿测量孔经过的光束。在图11(a)中显示了其中使用环形流动分配器的平行池MALS组件的实施方式的实例，并且在图11(b)中显示了环形分配器本身的侧视图和俯视图。在该配置中，样品进入保持入口歧管(retaining inlet manifold)1101，并且借助围绕分配器的圆周延伸的通道1103将流动引导入环形分配器1102。分配器的内表面1104是多孔的，并且然后通过首先填充分配器的空区域1112流体的小射流由其径向地进入流动池的孔。多孔元件1104可以由环形玻璃料或筛网制成，或可以构建为实心环形块——其中钻出或蚀刻出一系列径向孔。通过密封机构1106，诸如垫圈或O形环两者，将环形分配器包含在池结构1105和窗口1107之间，光束1108经过其并且其通过保持环1109保持在歧管内。当填充环形通道所需的压力ΔP2与经过分配器的多孔元件所需的压力ΔP1相比较小时，满足条件ΔP2<<ΔP1并且根据上面的讨论，在进入池本身之前，经过进入其中的样品充分地混合。环形分配器与平行池配置一起使用是理想的。可将环形流动分配器与类似于上面所描述的平式分配器结合。例如，玻璃料元件可被放置在入口管与入口歧管1110的结合处附近的位置处，从而在进入区域1103之前进一步均化样品。可选地，环形流动分配器可以与垂直配置的池一起使用，而不需要密封窗口是透明的，实际上，在该情况中根本不需要窗口，并且环形分配器可以包括实心端1111，如图11c所示，由此允许流体仅在一个方向上流动，即进入池。额外地，环形分配器可以被定位在样品池的出口处，该样品池在入口具有或不具有流动分配器。
本发明的另一实施方式利用放置在流动路径内的新型流动扰乱器，其在测量池的进口或出口(或两者)处。流动扰乱器可以采取许多形式，其优选的实施方式在图12中描述，其中由在色谱系统中使用的溶剂中化学稳定的材料制成的实心阻挡元件1203扰乱进入或离开池的流体的入射射流。该阻挡元件1203被放置在通常由聚四氟乙烯(PTFE)制成的大致圆形的垫圈1204内，该材料通常由商品名特氟隆(The Chemours Company,WilmingtonDelaware)指示。阻挡元件1203可以优选地由诸如正方形或等边三角形的形状制成，其中选择横向尺寸，使得其可以位于垫圈1204的开口内，而不沿横向方向移动。垫圈1204和阻挡元件1203由此形成界限清楚的(well-defined)限制的流动路径，样品可以通过其从入口管传到测量池。垫圈和阻挡元件夹在两个筛网元件1202之间，筛网元件1202由在色谱系统中使用的溶剂中惰性的材料组成，诸如不锈钢或镍。筛网1202提供相对均匀的流体路径并且能够沿着流动路径将所夹的(sandwiched)元件1203和1204保持在适当位置。所得到的夹层进一步夹在再两个圆形PTFE垫圈1201之间，所述PTFE垫圈1201可以与垫圈1204具有相同的尺寸，或者其可以改变，使得满足其中包含所得到层的歧管的空间要求。图12(b)显示了组装的流动分配系统的俯视图。
尽管机构——通过其可以控制本文描述的通过多检测器测量池的流动——的任何和全部组合是本发明的一部分，但下面的实例阐述了组合若干元件以优化MALS测量的优选实施方式，如图13所示。在该实施方式中，管1304的盘绕部分通过入口配件连接，该入口配件安装到由两个半部组成的歧管的顶部部分1303。夹在两个歧管半部1303和1308之间的是光学透明的测量池1302。歧管的两个半部可以通过螺栓、夹具或其他机构保持在一起。通过入口管1304的流动经过入口配件并与入口流动分配器1305接触，在本实施方式中，入口流动分配器1305是图12所示的流动扰乱器。流动从入口流动扰乱器1305进入并通过测量池1302，在测量池1302处，其被诸如由激光器产生的细光束1301照射。围绕测量池，放置多个光检测器以测量由样品散射的来自照射光束的光。在离开测量池时，样品经过出口流动扰乱器1306并进入出口管1307，出口管1307通过出口配件保持在歧管元件1308内的适当位置。入口和出口配件通常由诸如聚醚醚酮(PEEK)或不锈钢的材料制成。经过出口管1307的流动然后可以传到链中的另一个测量装置，其可以包含或不包含类似的配件、盘绕管和流动分配器或扰乱器。应该注意的是，入口管和出口管在图13中分别显示为短长度的紧密盘绕管1304和1307，但是对于盘绕管可以存在各种其他配置，包括紧密缠绕的管、松散缠绕的管、延伸显著距离的管、只作为泊肃叶流动扰乱器的管(例如，如图13所示的小长度)，或在柱和测量池之间的距离上尽可能合理地盘绕的长度。MALS仪器和MALS仪器下游的下一个测量仪器之间也可能是或可以使用相同的配置。还应该认识到，虽然通常优选是在分离系统之后，MALS仪器是第一个串联的，但不是必须的。
虽然盘绕管通常由不锈钢构成，但本公开内容并不仅限于这种材料。也可以使用可以保持盘绕形状或可以被制成保持盘绕形状同时仍禁受HPLC、UHPLC或其他分离系统如FFF所需的压力的其他材料。例如，PEEK管可以被盘绕并通过管外部的线支架保持在该盘绕配置中。进一步，尽管UHPLC测量的优选孔径可以是100μm，但本公开内容不应该被认为限于该尺寸，而是可以包括能够保持盘绕形状或被制成保持盘绕形状的任何标准或定制的色谱管。该盘绕管的可能的内部尺寸包括127μm、178μm、254μm、508μm和1016μm，以及可变内孔直径的管。
检测器滞后的测量和浓度等值线的视图
通过将标准UHPLC样品注入溶剂流并利用多个散射角处的CCD照相机监测其经过系统在实验上证明了上述讨论的失准直检测器之间浓度等值线的测量滞后。当样品从其经过时，监测沿孔的宽度的窄条(narrow strip)，并记录多个位置处的强度。基于测量体积内每个位置处记录的强度最大值的到达时间，计算时间延迟。几次运行的结果可以在图14-17中看到。所呈现的数据显示了所得到的时间延迟，并提供了几种条件下样品前端的视图。
图14图形地说明了在测量池中迪安流动对样品轮廓的作用。迹线1显示了入口管略微弯曲朝向激光光束进口的流动样品轮廓。迹线2显示了其中入口管弯曲朝向与激光器相对的前向监测器所得到的样品轮廓。迹线3显示了以尽可能直的方式连接至池的管的轮廓。该数据清楚地指示，入口管中小的弯曲可以产生池自身中显著不同的流动轮廓，其将引起前面讨论的略微失准直的检测器的时间延迟问题。
图15图解了接近理想的配置，其中进入流动池的入口管是完美直的，并因此不具有弯曲半径。使用的流动速率为0.3mL/min，入口管的内直径为100μm并且入口管长度为250mm。使用不锈钢筛网作为流动分配器。由数据可见，等值线前部相对对称，虽然在样品轮廓中仍存在明显的时间相关。
与之相比，图16显示了样品轮廓的严重不对称。如在前面的实例中，使用的流动速率为0.3mL/min，入口管的内直径为100μm并且入口管长度为250mm。使用不锈钢筛网作为流动分配器。然而，在该实例中，在进入池之前，入口管具有25mm的弯曲半径。对于该情况，25mm弯曲的Dn2Sc参数近似为3500，远在指示管曲率对峰分散有影响的最小值以上。
最后，图17显示了收集的数据，其中，再次，进入池的入口的管具有大约25mm的弯曲半径，但是就在进入池的进口之前和25mm弯曲之后添加盘管。再次，使用的流动速率为0.3mL/min，入口管的内直径为0.004”并且入口管长度为250mm，其中盘管弯曲半径为1.6mm。使用不锈钢筛网作为流动分配器。清晰可见，添加具有流动分配筛网的盘管使轮廓返回至对称状态，类似于图15中所见的，其中管无法为直的。对于该情况，1.6mm盘管的Dn2Sc参数近似为67000，几乎是25mm弯曲的值的20倍。与入口弯曲相比盘管的大得多的Dn2Sc值导致由盘管产生的分散对管内样品流动具有更大的影响，导致在进入样品池之前，径向和轴向两者上均匀得多的样品浓度。
图18对比了利用未准直的三个检测器对流动池内相同样品体积的色谱迹线的结果。检测器迹线已经被标准化为相同振幅，以突出小的失准直导致检测器迹线之间的时间延迟，如图18a所见。检测器之间50毫秒的时间延迟可导致上至10％的半径误差。与之相比，图18b中所示的数据——其中每个检测器正观察类似的样品体积——显示了所有三个检测器信号很好地准直，没有可感知的时间延迟，这导致样品半径的准确测量。
光散射和大分子表征的领域内的技术人员将会明白，本发明的方法和装置有许多显而易见的变化，这些变化不偏离我们已经列出的用于其实践的基本要素；所有这些变化都是上文描述的本发明的显而易见的实施，并且通过参考所附的我们的权利要求而被包括在内。

Claims (12)

1.一种装置，其包括：
盘绕管，其包括盘绕管出口，
其中所述盘绕管出口仅连接至流通池的入口，其配置为被检测器元件观察，
其中所述盘绕管的弯曲半径和孔半径的比小于50，
其中所述盘绕管配置为允许液体样品流入所述流通池的入口；和
流动分配器，其在所述流通池的入口处，
其中所述流动分配器配置为允许所述液体样品从所述盘绕管流动，通过所述流动分配器并进入所述流通池，
产生进入所述流通池的流动，
其中当所述流动进入所述流通池时，所述流动近似塞式流动。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述流通池是透明的。
3.根据权利要求1所述的装置，其中所述盘绕管是螺旋形。
4.根据权利要求1所述的装置，其中所述流动分配器为网筛。
5.根据权利要求1所述的装置，其中所述流动分配器为玻璃料。
6.根据权利要求4所述的装置，其中所述网筛由不锈钢组成。
7.根据权利要求4所述的装置，其中所述网筛具有25μm的孔径。
8.根据权利要求1所述的装置，其中所述盘绕管主要由不锈钢组成。
9.根据权利要求1所述的装置，其中所述盘绕管具有127微米的标称内直径。
10.一种方法，其包括：
使含颗粒的液体样品流动通过盘绕管，其包括盘绕管出口，
其中所述盘绕管出口仅连接至流通池的入口，其配置为被检测器元件观察，
其中所述盘绕管的弯曲半径和孔半径的比小于50；和
使所述液体样品从所述盘绕管出口流动通过流动分配器，所述流动分配器在所述流通池的入口处，
产生进入所述流通池的流动，
其中当所述流动进入所述流通池时，所述流动近似塞式流动。
11.一种装置，其包括：
盘绕管，其包括盘绕管出口，
其中所述盘绕管出口仅连接至流通池的入口，其配置为被检测器元件观察，
其中所述盘绕管的弯曲半径与孔半径的比小于50，
其中所述盘绕管配置为允许液体混合物流入所述流通池的入口；和
流动分配器，其在所述流通池的入口处，
其中所述流动分配器配置为允许所述液体混合物从所述盘绕管流动，通过所述流动分配器并进入所述流通池，
产生进入所述流通池的流动，
其中当所述流动进入所述流通池时，所述流动近似塞式流动。
12.根据权利要求11所述的装置，其中所述流动分配器包括网筛。
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