KR20180044431A - Nuc-1031의 단일 이성질체가 풍부한 조성물 및 이의 제조방법 및 용도 - Google Patents

Nuc-1031의 단일 이성질체가 풍부한 조성물 및 이의 제조방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 제 1단계 반응 생성물의 이성질체 분리를 실시하여 추가로 두 단계의 화학합성을 거쳐 단일 이성질체 SP-1의 HPLC 순도가 90 % 이상인 고순도의 화합물 SP-1의 조성물을 제조하는 화합물 SP-1이 풍부한 조성물의 제조방법을 제공한다. 본 발명은 또한 체외 종양세포 증식 억제 효과가 NUC-1031 및 화합물 RP-1보다 현저하게 높은 화합물 SP-1이 풍부한 조성물, 상기 조성물의 용도 및 상기 조성물 및 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

Description

NUC-1031의 단일 이성질체가 풍부한 조성물 및 이의 제조방법 및 용도
본 발명은 NUC-1031의 단일 이성질체가 풍부한 조성물 및 이의 제조방법, 이 조성물의 용도, 및 이 조성물 및 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 결정 형태의 화합물 SP-1 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
NUC-1031은 NuCana BioMed 회사에 의해 개발된 겜시타빈(gemcitabine)의 프로드러그(prodrug)이며, 말기 고형종양, 췌장암, 유방암 등 암의 치료약으로 현재 제 2상 임상시험 중이다. NUC-1031의 CAS 번호는 840506-29-8이고, 아래의 식 1로 표시되는 구조를 가지며, RP-1 및 SP-1이라는 2개의 단일 이성질체를 갖는다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
WO2005012327 명세서 제 70페이지에는 NUC-1031의 구체적인 구조 및 제조방법이 기재되어 있다. 구체적으로, 용매로서 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran, THF)/피리딘(pyridine)을 사용하여, NMI의 존재 하에, 겜시타빈 및 벤질-(벤조일-L-알라닌)-클로로포스페이트(benzyl-(benzoyl-L-alanine)-chlorophosphate)를 1:3의 몰 비로 2시간 반응시켜 조생성물(crude product)을 얻고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 디클로로메탄(dichloromethane)/메탄올(methanol)(95:5)로 용출함으로써 거품 상태의 고체를 얻었다. 수율은 불과 16 %였다.
WO2014076490A1에는 아래의 NUC-1031의 제조방법이 기재되어 있다.
Figure pct00004
3'-Boc-보호된 겜시타빈(100 mg)을 2몰 당량의 페닐(벤질-L-알라닌)클로로포스페이트(phenyl(benzyl-L-alanine)chlorophosphate)(150 mg)와 반응시켜, 0.5몰 당량의 트리스(아세틸아세톤)철(III)(tris(acetylacetone)Fe(III))(56 mg)을 촉매로서, 1.5몰 당량의 DIPEA(55 μL)를 염기로서, 10 mL의 테트라하이드로퓨란을 반응 용매로서 이용하여, 질소 기체 하에 실온에서 24 시간 반응시켰다. 수율은 45 %이며, 이성질체는 Rp:Sp의 비율이 3:1이었다.
"Application of ProTide Technology to Gemcitabine : A Successful Approach to Overcome the Key Cancer Resistance Mechanisms Leads to a New Agent (NUC-1031) in Clinical Development (Journal of Medicinal Chemistry, Volume 57, Issue 4, Pages 1531-1542)" 에는 디클로로메탄을 용매로 사용하여 TFA의 존재 하에서 아래 식의 화합물 5f에서 히드록시 보호기(hydroxyl group)를 이탈시키고, 마지막으로 실리카겔 컬럼으로 정제하여 NUC-1031을 제조하는 방법이 기재되어 있으며, 수율은 70 %이고, 이성질체의 함량은 각각 48 % 및 52 %였다.
Figure pct00005
지금까지의 선행 기술에는 NUC-1031의 단일 이성질체의 제조방법에 관한 보고는 없었다. NUC-1031의 분자 구조 중의 키랄 P의 2개의 거울상 이성질체는 구조가 매우 유사하여 극성이 매우 유사하기 때문에, NUC-1031의 이성질체 혼합물로부터 고순도의 단일 이성질체를 단리(isolate)하는 것은 매우 어렵고, 특히 정제 과정에서 순도와 수율을 양립시키는 것은 더욱 어렵다. 본 발명자들은 당업계의 통상적인 방법인 결정화(crystallization), 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), C18 결합 실리카 역상 분취 크로마토그래피(reversed phase C18 silica gel-bonded preparative chromatography), 구형 실리카겔 순상 분취 크로마토그래피(normal phase preparative chromatography with spherical silica based packing), 키랄 컬럼 분리(chiral chromatographic separation) 등 다양한 방법으로 NUC-1031을 정제하려고 시도했으나, 어느 것도 90 % 이상의 순도를 갖는 단일 이성질체를 분리할 수 없었다.
당업계에 공지된 바와 같이, 일반적으로 키랄 화합물을 약물로 사용하는 경우, 이성질체의 입체배위 및 약리학의 관계는 다음과 같이 나눌 수 있다.
(1) 약물의 약리 효과는, 완전히 또는 주로, 거울상 이성질체 중 하나에 의해 발생된다. 예를 들어, (S)-나프록센((S)-naproxen)은 R 이성질체보다 35 배나 강력한 진통 효과가 있다. (2) 2개의 이성질체는 정반대의 약리학적 효과를 갖는다. 예를 들어, 피세나돌(picenadol)의 우선성 이성질체는 오피오이드(opioid) 수용체의 작용제이나, 좌선성 이성질체는 오피오이드 수용체의 길항제이다. (3) 이성질체 중 하나는 심각한 유해작용이 있다. 예를 들어, 구충약인 테트라이미다졸(tetraimidazole)의 구토 반응은 D 이성질체에 의해 발생된다. (4) 약리학적 효과 중 하나는 높은 입체 선택성을 가지고 있지만 다른 약리학적 효과는 입체 선택성이 낮거나, 또는 입체 선택성이 없다. 예를 들어, 진해약 메토르판(methorphan)의 중독성은 주로 그 L 이성질체에 의해 발생되는데, 진해 효과의 강도는 양방이 동등하다. (5) 2개의 거울상 이성질체의 약리학적 효과는 다르지만, 두 약물을 병용하는 편이 유리하다. 예를 들어, 항고혈압제인 네비보롤(nebivolol)의 D 이성질체는 베타-수용체(β-receptor) 차단제이며, L 이성질체는 말초혈관의 저항을 낮출 수 있고 심장에 대한 보호 효과가 있다.
NUC-1031 분자는 여러 키랄 원자를 갖는 것으로 알려져 있다. NUC-1031에서 단일 이성질체를 단리하고, 그 생물학적 활성을 개별적으로 연구하여, NUC-1031의 약리학적 효과, 독성이나 부작용 또는 유해반응 등을 검토함으로써, 보다 좋은 활성, 보다 적은 독성이나 부작용을 갖는 비슷한 약물을 개발하는 것은 매우 중요하다. 임상 연구의 요구를 만족할 수 있는 고순도의 단일 이성질체의 제조 및 NUC-1031의 약리학적 활성에 중요한 역할을 하는 단일 이성질체의 특정은 현재에도 당업계에서 조속한 해결이 요구되고 있는 과제이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 제 1 측면은 화합물 SP-1이 풍부한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 제 2 측면은 상기 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제 3 측면은 암의 치료약을 제조하기 위한 상기 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 제 4 측면은 또한 상기 조성물을 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 제 5 측면은 또한 결정 형태의 화합물 SP-1 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
제 1 측면에서, 본 발명은 조성물의 화합물 SP-1의 순도가 90 % 이상이며, 또한 조성물의 화합물 SP-1과 화합물 RP-1의 중량비가 90:10 이상인 화합물 SP-1이 풍부한 조성물을 제공한다. (용어 "순도"는 상기 조성물의 화합물 SP-1의 중량 백분율을 나타낸다.)
Figure pct00006
Figure pct00007
또한, 상기 조성물에서 화합물 SP-1의 순도는 97 % 이상이며, 상기 조성물의 화합물 SP-1과 화합물 RP-1의 중량비는 97:3 이상이다.
나아가, 상기 조성물에서 화합물 SP-1의 순도는 99 % 이상이며, 상기 조성물의 화합물 SP-1과 화합물 RP-1의 중량비는 99:1 이상이다.
제 2 측면에서, 본 발명은,
(1) 화합물 61501h 및 화합물 61501g를 염기성 조건 하에서 반응시킨 후, 화합물 61501f와 추가적으로 반응시켜 화합물 61502를 제조하는 단계;
Figure pct00008
(2) 화합물 61502를 결정화함으로써 화합물 61501b를 단리하는 단계;
Figure pct00009
(3) 화합물 61501b 및 화합물 61501c를 반응시켜 화합물 61501a를 제조하는 단계; 및
Figure pct00010
(4) 화합물 61501a의 히드록시 보호기를 이탈시켜 화합물 SP-1이 풍부한 조성물을 얻는 단계;
Figure pct00011
를 포함하는 상기 어느 하나의 조성물의 제조방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 (1)은 바람직하게는 반응을 질소 기체 하에서 실시하여, 화합물 61501h를 적절한 용매(예를 들어, 디클로로메탄, 이소프로판올(isopropanol), DMF, 디옥산(dioxane) 등)에 첨가하며, 적절한 온도(바람직하게는 -80℃)에서 화합물 61501g 및 적절한 알칼리 성분(예를 들어, 트리에틸아민(triethylamine), DIPEA, NMM, 피리딘, 피페리딘(piperidine))을 추가하고, 적하완료한 후, 바람직하게는 실온에서 밤새 반응시킨 후, 반응액에 화합물 61501f 및 적절한 알칼리 성분(예를 들어, 트리에틸아민, DIPEA, NMM, 피리딘, 피페리딘)을 첨가하고, 반응 종료 후, 용매를 증류하고 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 및 물에 의해 추출 분리하여 목적 화합물 61502을 얻는다.
단계 (2)에서는 단계 (1)에서 얻어진 화합물을 추가적으로 결정화하고 이성질체 61501b를 단리한다. 바람직하게는 결정화 용매는 에틸 아세테이트와 석유에테르(petroleum ether)이며, 더욱 바람직하게는 화합물 61502을 에틸 아세테이트에 첨가하여 교반한 후, 석유에테르를 서서히 적하하고 결정을 석출하여 목적 화합물 61501b를 얻는다. 여기서 화합물 61502와 에틸 아세테이트의 중량 대 부피비(weight-to-volume ratio)는 2:5 내지 4:5인 것이 바람직하다. 상기 중량 대 부피비에서 중량의 단위는 g이고, 부피의 단위는 mL이다. 에틸 아세테이트와 석유에테르의 부피비는 1:4 내지 1:6 또는 1:3이다.
상기 단계 (3)에서는 바람직하게는 질소 기체 하에 적절한 용매(예를 들어, 테트라하이드로퓨란, 디클로로메탄) 및 적절한 온도(예를 들어, -10℃ 내지 5℃, 바람직하게는 0℃) 조건에서, 화합물 61501c를 그리냐르(Grignard) 시약(예를 들어, tert-부틸 마그네슘 클로라이드(tert-butylmagnesium chloride), 바람직하게는 tert-부틸 마그네슘 클로라이드의 테트라하이드로퓨란 용액(tert-butylmagnesium chloride in tetrahydrofuran))과 접촉시켜 약 0.5 내지 3 시간 반응시킨 후, 단계 (2)에서 단리한 화합물 61501b를 추가하여 반응이 종료될 때까지 반응시킨다. 반응액에 물을 첨가하고 에틸 아세테이트로 추출하여 조생성물(crude product) 61501a를 얻는다. 상기 조생성물은 결정화, 컬럼 크로마토그래피 등의 통상적인 방법에 의해 추가적으로 정제할 수 있다. 바람직하게는 디클로로메탄-메탄올을 용리액으로 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제한다.
상기 단계 (4)에서는 바람직하게는 질소 기체 하에 적절한 용매(예를 들어, 디클로로메탄, 에틸 아세테이트) 및 적절한 온도(예를 들어, -10℃ 내지 5℃, 바람직하게는 0℃) 조건에서, 촉매로서 산(예를 들어, 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid), 염화수소(hydrogen chloride)/에틸 아세테이트)에 의해 화합물 61501a의 히드록시 보호기를 이탈시켜 반응 종료 후, 약염기성 수용액(예를 들어, 포화 중탄산나트륨 용액(saturated sodium bicarbonate solution)) 및 유기용매(예를 들어, 에틸 아세테이트)를 추가하여 유기층을 분리하고 농축 건조시켜, 조생성물 SP-1을 얻는다. 더욱 바람직하게는, 예를 들어 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 디클로로메탄-메탄올을 용리액(eluent)으로 하여 상기 조생성물을 정제한다.
또한, 상기 단계 (3)에서 상기 화합물 61501c는 화합물 61501d로부터 제조된다.
Figure pct00012
보다 바람직하게는 적절한 용매(예를 들어, 테트라하이드로퓨란, 디클로로메탄, 이소프로판올 또는 이들과 물의 혼합용액) 중에서 염기성(예를 들어, 탄산나트륨(sodium carbonate), 중탄산나트륨(sodium bicarbonate) 등) 조건에서 화합물 61501d를 디-tert-부틸 디카보네이트(di-tert-butyl dicarbonate)와 반응시킴으로써 얻을 수 있다.
본 발명의 제 3 측면은 암의 치료약을 제조하기 위한 상기 조성물의 용도를 제공하는 것이다. 또한, 상기 암은 췌장암, 말기 고형종양, 난소종양, 비소세포폐암, 유방암, 방광암, 자궁경부암, 중피종, 식도암, 위암, 직장암, 간암, 담관암, 비인두암, 고환암, 림프종 또는 두경부암을 포함한다. 보다 바람직하게는 상기 암은 췌장암, 말기 고형종양, 난소종양, 유방암을 포함한다.
본 발명의 제 4 측면은 또한 상기 조성물을 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 상기 약학적 조성물은 본 발명에서 제공하는 화합물 SP-1이 풍부한 조성물 및 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다.
상기 약학적 조성물은 정맥 내, 피하, 복강 내, 근육 내, 흡입, 직장 및 국소(뺨 측(buccally) 또는 설하 등)의 투여를 포함한 경구 또는 비경구 투여가 가능하다.
그 중 경구 투여용 약학적 조성물은 정제, 캡슐, 과립제 또는 현탁제를 포함한다. 경구 투여를 위한 정제는 본 발명에서 제공하는 약학적 조성물을 활성 성분으로 포함하고, 1종 이상의 약학적으로 허용되는 부형제, 예를 들어 희석제, 붕해제, 결합제, 활택제, 감미료, 향미제, 착색제 및 방부제를 포함할 수 있다. 콘스타치(corn starch) 및 알긴산(alginic acid)이 붕해제로 사용되는 경우, 적절한 불활성 희석제로서는 탄산나트륨, 탄산칼슘(calcium carbonate), 인산나트륨(sodium phosphate), 인산칼슘(calcium phosphate) 및 유당(lactose)을 들 수 있다. 결합제는 전분 및 젤라틴(gelatin)을 들 수 있고, 윤활제는 스테아린산 마그네슘(magnesium stearate), 스테아린산(stearic acid) 또는 활석(talc)일 수 있다. 상기 정제는 위장의 흡수를 지연시키기 위해 글리세롤 모노스테아레이트(glycerol monostearate) 또는 글리세롤 디스테아레이트(glycerol distearate)로 코팅할 수 있다.
경구 투여를 위한 캡슐로서는, 경질 캡슐 및 연질 캡슐을 들 수 있다. 경질 캡슐은 활성 성분으로서의 본 발명에서 제공하는 약학적 조성물과 고체 희석제를 포함한다. 연질 캡슐은 활성 성분으로서의 본 발명에서 제공하는 약학적 조성물과 물 또는 기름(예를 들어, 땅콩 오일, 액체 파라핀(liquid paraffin) 또는 올리브유)를 포함한다.
직장 투여용 좌약은, 좌약의 기제가 코코아버터 또는 살리실산염(salicylate)일 수 있다.
질 내 투여를 위한 제제는 활성 성분인 조성물 및 당업계에 알려진 일반적인 담체를 포함하는, 페서리(pessaries), 탐폰(tampons), 크림, 젤, 페이스트, 폼 또는 스프레이 형태이다.
정맥 내, 복강 내, 피하 및 근육 내 투여용 제형에 사용되는 경우, 본 발명에서 제공하는 조성물은 일반적으로 멸균 용액 또는 멸균 현탁액이며, 또한 적절한 pH 및 삼투압을 갖는다. 상기 제제의 제조는 당업계에 알려진 일반적인 방법에 따라 준비할 수 있다.
상기 조성물의 투여량은 0.1 내지 300 mg/kg체중/일이며, 바람직하게는 0.5 mg/kg체중/일이고, 보다 바람직한 적절한 투여량은 1 내지 50 mg/kg체중/일이며, 더욱 바람직하게는 1 내지 50 mg/kg체중/일이다. 1일 2회, 3회, 4회 또는 5회에 걸쳐 간격을 두고 투여하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 활성 성분 10 내지 1500 mg, 더욱 바람직하게는 활성 성분 20 내지 1000 mg, 가장 바람직하게는 활성 성분 50 내지 700 mg을 1개의 투여량 단위로 포함한다.
다른 측면으로, 본 발명은 결정 형태의 화합물 SP-1, 특히 실질적으로 순수한 결정 형태를 제공한다. 바람직하게는, 상기 결정 형태는 물을 함유하지 않거나 또는 실질적으로 함유하지 않는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 결정 형태의 화합물 SP-1은 a = 11.36Å, b = 34.84Å, c = 15.12Å의 단위 격자를 갖고, 그 부피가 5554 Å3이다. 신규 결정형의 감정을 위해, 본 발명은 X선 회절 분석 데이터 및 이들 데이터의 측정 조건을 하기와 같이 제공한다.
온도 123(2) K
파장 0.71073 Å
공간군(space group) 단사정계(monoclinic), P2 1
셀(cell) 크기 a = 11.3607(19) Å
b = 34.841(5) Å
c = 15.118(2) Å
α = 90°
β = 111.857(4)°
γ = 90°
부피 5553.8(15) Å3
Z 8
밀도 (계산 값) 1.388 Mg/m3
흡수 계수 0.166 mm-1
F (000) 2416
결정 크기 2.26 × 0.26 × 0.23 mm
데이터 수집 시 θ 범위 1.97 ~ 27.63°
수집한 반사/독립적인 반사 123782/13011[R(int) = 0.1357]
강도 감쇠(completeness) 98.9 %
정밀화 방법 F2에 관한 전체행렬 최소제곱법
데이터/억제/파라미터(parameters) 13011/3/1403
F2 적합도 1.858
최종적인 R 지수 [(I>2sigma(I))] R1 = 0.1853, wR2 = 0.4314
최대 차이의 피크(peak)와 골(hole) 1.575 및 1.177 e.A-3
결정 형태의 화합물 SP-1은, 본 발명의 상기 방법 또는 구체적인 실시예에 기재된 방법에 의해 제조된 화합물 SP-1을 용매, 예를 들어, 저급 알코올(lower alcohol) 및 물로 이루어진 용매에 첨가하여 계의 온도를 30 내지 50 ℃에서 0 내지 5 ℃로 서서히 하강시킴으로써 막대형 단결정을 얻는 방법으로 제작할 수 있다. 바람직하게는 상기 저급 알코올은 탄소수 1 내지 3의 알코올(예를 들어, 메탄올, 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol) 또는 이소프로판올)이며, 더욱 바람직하게는, 상기 저급 알코올은 에탄올이다. 저급 알코올과 물의 비율은 1:3 (v/v)인 것이 바람직하다.
다른 측면으로, 본 발명은 또한, 상기 결정 형태의 화합물 SP-1과 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 결정 형태의 화합물 SP-1은, 예를 들어, 췌장암, 말기 고형종양, 난소종양, 비소세포폐암, 유방암, 방광암, 자궁경부암, 중피종, 식도암, 위암, 직장암, 간암, 담관암, 비인두암, 고환암, 림프종 또는 두경부암 등 NUC-1031의 공지의 적응증과 같은 적응증의 치료에 사용할 수 있다. 상기 결정 형태의 화합물 SP-1과 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물은 임의의 종래 경로, 예를 들어, 경구(정제 또는 캡슐 등) 또는 코와 폐 투여(흡입) 등에 의해 투여할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 화합물 SP-1이 풍부한 조성물은 BxPC-3, MIA PaCa-2 및 OVCAR-3 종양세포에 대한 강한 세포독성 효과를 나타내어, 그 IC50 값이 약 0.01 nM 내지 0.05 nM이며, 체외 종양세포 증식 억제 효과가 화합물 RP-1의 약 10배이다. 본 발명에서 제공하는 화합물 SP-1이 풍부한 조성물은, 겜시타빈 및 화합물 RP-1에 비해 더 나은 체내 항종양 활성을 가진다. 약물동태학적(pharmacokinetic) 평가 결과에 의하면, 본 발명에서 제공하는 화합물 SP-1이 풍부한 조성물은 종양조직 활성 대사산물 dFdCTP의 농도가 화합물 RP-1보다 현저히 높다.
또한, 본 발명에서 제공하는 조성물은 단일 이성질체 SP-1의 함량이 높은 것으로서, 임상에서 NUC-1031의 약리학적 활성에 대한 추가 연구 및 향후 좋은 활성 및 낮은 부작용을 갖는 신규 항암제 개발을 위한 기초원료를 제공한다. 또한, 본 발명자들은 독창적으로 제 1단계의 반응 종료 후에 단일 이성질체를 단리하기 때문에, 이성질체 혼합물 및/또는 라세미 혼합물에서 단일 이성질체를 단리하는 종래의 방법에 비해 원료를 대폭 절약할 수 있다. 또한, 제 1단계 반응의 이성질체 분리는 결정화 방법으로 실시하기 때문에, 조작이 간편하고, 종래의 키랄 칼럼에 의한 분리에 비해 비용을 크게 절약할 수 있다. 또한, 본 발명에서 제공하는 제조방법의 전체 경로는 조작이 간단하고, 설비에 대한 요구가 낮고, 고순도의 제품을 얻을 수 있기 때문에 공업 생산에 적합하다.
또한, 본 발명이 제공하는 화합물 SP-1을 구조 분석하여 상기 화합물의 화학 구조를 확인하고 단결정 분석을 통해 인 원자 P1(S)과, C9(S), C18(R), C19(R), C21(R)의 절대배위를 확인했다. 본 발명은 신규한 화합물 SP-1의 결정(crystal)도 제공한다.
도 1은 실시예 2의 방법으로 제조된 화합물 61501b의 HPLC 분석 스펙트럼을 나타낸 것이다. 도면 중 화합물 61501b의 HPLC 순도는 100.0 %이며, 피크 데이터는 다음과 같다.
Figure pct00013

도 2는 실시예 5의 방법으로 제조된 화합물 SP-1의 HPLC 분석 스펙트럼을 나타낸 것이다. 도면 중 화합물 SP-1의 HPLC 순도 100.0 %이며, 피크 데이터는 다음과 같다.
Figure pct00014

도 3은 실시예 5의 방법으로 제조된 화합물 SP-1의 31P-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다. 도면 중 δP는 3.64이다.
도 4는 실시예 5의 방법으로 제조된 화합물 SP-1의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5는 비교예 2의 방법으로 제조된 화합물 1의 31P-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다. 그림 중 δP는 3.81, 3.64이다.
도 6은 화합물 SP-1 단결정의 현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 7은 화합물 SP-1 단결정의 시뮬레이션 XRPD와 단결정 반사 XRPD의 비교를 나타낸 것이다.
도 8은 화합물 SP-1 단결정의 단위세포를 나타낸 것이다.
도 9는 화합물 SP-1의 입체 구조를 나타낸 것이다.
도 10은 화합물 SP-1의 입체 구조를 나타낸 것이다.
도 11은 비교예 2에서 화합물 1을 제조하는데 사용된 화합물 61502의 HPLC 스펙트럼을 나타낸 것이다. 이성질체 61501e와 61501b의 비율은 26.25 % : 72.03 %이다.
도 12는 비교예 2의 방법에 의해 제조된 화합물 1의 HPLC 스펙트럼을 나타낸 것이다. 이성질체 RP-1과 SP-1 비율은 10.82 % : 89.18 %이며, 피크 데이터는 다음과 같다.
Figure pct00015

도 13은 화합물 SP-1, 화합물 RP-1 및 NUC-1031의 체외 종양세포 증식 억제 효과에 대한 IC50 값 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 인간 췌장암의 마우스 피하 이식 모델에서 화합물 SP-1, 화합물 RP-1 및 NUC-1031의 약력학적(pharmacodynamic) 평가를 나타낸 것이다.
도 15는 피험 약물인 화합물 SP-1 및 화합물 RP-1의 일회(single) 투여 후, MIA PaCa-2 인간 췌장암의 마우스 피하 이식 모델에서 약물동태학적 평가를 나타낸 것이다.
다음에 실시예에 의해 본 발명의 내용을 더욱 구체적으로 해석, 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것에 불과하며, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 하기 실시예에서 구체적인 조건을 명시하지 않는 실험 방법은 정상적인 조건 또는 제조업체의 권장 조건에서 실시한다. 별도의 설명이 없는 한, 모든 백분율, 비율(rates), 비(ratios) 또는 부(parts)는 중량에 관한 것이다.
단결정 시료의 현미경 사진은 스테레오 현미경 PXS9-T (Shanghai CeWei Photoelectric Technology Co.Ltd. 제조)로 실온에서 촬영한 것이다. 단결정 회절 데이터는 Bruker D8 ADVANCE 단결정 회절 장치(Mo Kα, λ = 0.71073 Å)에 의해 123(2) K에서 얻은 것이다.
본 발명의 실시예에 기재된 화합물 RP-1은 화합물 RP-1의 질량 백분율이 95 % 이상인 화합물 RP-1이 풍부한 조성물을 가리킨다. 사용된 화합물 SP-1은 화합물 SP-1의 질량 백분율이 90 % 이상이며, 바람직하게는 99 % 이상인, 본 발명에 기재된 화합물 SP-1이 풍부한 조성물을 가리킨다. 화합물 RP-1은 화합물 SP-1과 같은 제조방법에 의해 얻을 수 있지만, 화합물 61502 이성질체 분리 후 화합물 61501e을 얻고 화합물 61501b 대신 화합물 61501e을 후속 반응에 사용하여 화합물 RP -1을 얻는 점에서 차이가 있다.
본 발명의 중량/부피 백분율 단위는 당업자에게 주지되어 있는 것으로, 예를 들면, 100 mL의 용액 내의 용질의 중량을 말한다. 별도의 정의가 없는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 전문용어 및 과학 용어는 당업자에게 주지되어 있는 것과 같은 의미를 가진다. 또한, 본 명세서의 기재와 같거나 유사한 임의의 방법 및 재료는 모두 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바람직한 실시 방법 및 재료는 예시를 위한 것에 지나지 않는다.
본 발명에 있어서, 화합물 SP-1의 순도는 HPLC법에 의해 측정한다. HPLC는 다음의 컬럼 및 조건에서 실시한다. 컬럼: 옥타데실실란(octadecylsilane) 결합 실리카를 충전제(filler)로 사용하는 것(YMC-hydrosphere C18 컬럼, 150 mm × 4.6 mm, 3 μm); 이동상: 0.1 % 인산-메탄올(10 내지 50 : 90 내지 50); 유량(flow rate): 1.0 mL/분; 검출 파장: 272 nm.
본 발명의 중간체인 화합물 61501b의 순도 또한 HPLC법에 의해 측정한다. HPLC는 다음의 컬럼 및 조건에서 실시한다. 컬럼: YMC hydrosphere, 150 mm × 4.6 mm, 3 μm; 이동상: 40 % 내지 85 % 메탄올, 2 ‰ 인산/물; 실행 시간: 46 분; 기울기 용리(gradient elution), 필요에 따라 이동상 용매 비율을 조정; 유량: 1.0 mL/분.
<실시예 1> 화합물 61502의 제조
Figure pct00016
-80℃에서 61501h 20 g이 있는 디클로로메탄 용액 60 mL에 61501g 20.6 g을 넣고, 이어 트리에틸아민 19.3 g의 용액(20 mL 디클로로메탄에 희석)을 추가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물에 61501f를 추가하고 이어 트리에틸아민 19.3 g의 용액(20 mL 디클로로메탄에 희석)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 직접 탈용매화(desolvation)하고 잔류물을 에틸 아세테이트 200 mL와 물 400 mL에 용해시켰다. 에틸 아세테이트를 분리한 후, 에틸 아세테이트(2 × 100 mL)에서 수상(aqueous phase)을 2번 씻었으며, 한 번에 에틸 아세테이트 100 mL를 사용하였다. 에틸 아세테이트 상을 합하고, 이를 식염수(saline)로 세척한 후, 무수 황산나트륨(anhydrous sodium sulfate)으로 건조하였다. 에틸 아세테이트를 증류에 의해 제거하여 목적 화합물 61502를 얻고 이를 다음 정제에 직접 사용하였다.
<실시예 2> 화합물 61501b의 제조
Figure pct00017
화합물 61502 120g을 에틸 아세테이트 240 mL에 녹여 교반을 계속하고, 실온에서 석유에테르 720 mL를 천천히 적하하여 결정을 석출한 후에 여과액을 여과에 의해 제거함으로써 화합물 61501b 총 49.5 g을 얻었다. 수율은 41.2 %이며, HPLC 순도는 100.0 %이다(도 1 참조).
<실시예 3> 화합물 61501c의 제조
Figure pct00018
실온에서 화합물 61501d 20g, 테트라하이드로퓨란 200 mL 및 물 100 mL의 혼합 용액에 탄산나트륨 35.4 g을 넣고, 이어 디-tert-부틸 카보네이트(di-tert-butyl carbonate) 17.5 g을 넣고 반응이 끝날 때까지 실온에서 교반을 계속하였다. 에틸 아세테이트(3 × 200 mL)로 혼합물을 3회 추출하였으며, 한 번에 에틸 아세테이트 200 mL를 사용하였다. 에틸 아세테이트를 합하여 식염수로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 용매를 증류에 의해 제거한 후, 실리카겔 크로마토그래피(2.5 % 내지 10 % 메탄올/디클로로메탄)에 의해 잔류물을 정제하여 화합물 61501c 18 g을 얻었다. 수율은 67 %이다.
<실시예 4> 화합물 61501a의 제조
Figure pct00019
0℃에서 화합물 61501c 5g이 있는 테트라하이드로퓨란 용액 25 mL에 농도 1.0 mol/L의 tert-부틸 마그네슘 클로라이드 용액 41.28 mL를 가해 1 시간 동안 교반시킨 후, 실시예 2에서 얻은 화합물 61501b 12.42 g을 넣고 반응이 끝날 때까지 실온에서 교반을 계속하였다. 혼합물에 염화암모늄(ammonium chloride) 포화수용액 250 mL를 넣고 에틸 아세테이트(3 × 250 mL)에 의해 수상을 3회 추출하였고, 한 번에 에틸 아세테이트 250 mL를 사용하였다. 에틸 아세테이트 상을 합하여 식염수로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고 탈용매화 하였다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(이동상: 메탄올/디클로로메탄(메탄올 비율을 2.5 %에서 5 %로 상승), 기울기 용리)에 의해 정제하여 화합물 61501a 6.7 g을 얻었다. 수율은 71.3 %이며, HPLC 순도는 95.1 %이다.
<실시예 5> 화합물 S P -1의 제조
Figure pct00020
0℃에서 화합물 61501a 6.7 g이 있는 디클로로메탄 용액 33.5 mL에 트리플루오로 아세트산(trifluoroacetic acid) 20.1 mL를 첨가하고 반응이 끝날 때까지 보온하고 교반하였다. 혼합물을 탈용매화 한 후 중탄산나트륨 용액 150 mL를 넣고 에틸 아세테이트로 3회 추출하였으며, 한 번에 에틸 아세테이트 150 mL를 사용하였다. 에틸 아세테이트 상을 합하여 식염수로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 탈용매화 한 후, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(이동상: 메탄올/디클로로메탄(메탄올 비율을 2.5 %에서 10 %로 상승), 기울기 용리)에 의해 정제하여 화합물 SP-1 4.1 g을 얻었다. 수율은 72 %이며, HPLC 순도는 100.0 %이다 (도 2 참조); 31P-NMR (202 MHz, MeOD): δP 3.64. (도 3 참조); 1H-NMR (500 MHz, MeOD): δH: 7.56, 7.52 (2d, J = 7.5 Hz, 1H, H-6), 7.38-7.33 (m, 7H, ArH), 7.26-7.19 (m, 3H, ArH), 6.25 (apparent q, J = 7.5 Hz, 1H, H-1'), 5.88, 5.84 (2 × d, J = 7 .5 Hz, 1H, H-5), 5.18-5.12 (m, 2H, OCH2Ph), 4.49-4.42 (m, 1H, H-5'), 4.38-4.31 (m, 1H, H-5'), 4.25-4.18 (m, 1H, H-3'), 4.07-4.01 (m, 2H, H-4', CHCH3), 1 .38 (apparent t, J = 8.5 Hz, 3H, CHCH3) (도 4 참조).
<실시예 6> 화합물 S P -1의 제조
Figure pct00021
0℃에서 화합물 61501a 2g이 있는 에틸 아세테이트 10 mL 용액에 염화수소(hydrogen chloride)/에틸 아세테이트(7 mol/L, 6 mL)를 첨가하고 반응이 끝날 때까지 보온하고 교반하였다. 용매를 증류한 후, 중탄산나트륨 용액 50 mL를 넣고 에틸 아세테이트로 3회 추출하였으며, 한 번에 에틸 아세테이트 50 mL를 사용하였다. 에틸 아세테이트 상을 합하여 식염수로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 유기 용매를 증류한 후 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(이동상: 메탄올/디클로로메탄(메탄올 비율을 2.5 %에서 10 %로 상승), 기울기 용리)에 의해 정제하여 화합물 SP-1 1225 mg을 얻었다. 수율은 70 %이며, HPLC 순도는 99.21 %이다; 31P-NMR (202 MHz, MeOD): δP 3.64.; 1H-NMR (500 MHz, MeOD): δH: 7.56, 7.52 (2d, J = 7.5 Hz, 1H, H-6), 7.38-7.33 (m, 7H, ArH), 7.26-7.19 (m, 3H, ArH), 6.25 (apparent q, J = 7.5 Hz, 1H, H-1'), 5.88, 5.84 (2 × d, J = 7.5 Hz, 1H, H-5), 5.18-5.12 (m, 2H, OCH2Ph), 4.49-4.42 (m, 1H, H-5'), 4.38-4.31 (m, 1H, H-5'), 4.25-4.18 (m, 1H, H-3'), 4.07-4.01 (m, 2H, H-4', CHCH3) 1.38 (apparent t, J = 8.5 Hz, 3H, CHCH3).
<실시예 7> 결정 형태의 화합물 S P -1의 제조
실시예 5에서 얻은 화합물 SP-1을 에탄올/물(1/3, v/v) 계에 첨가하고 50℃에서 0.01℃/분의 속도로 5℃까지 서서히 온도를 낮춰 막대모양의 단결정을 얻었다(도 6 참조). 얻어진 단결정을 XRPD 측정한 결과는 도 7에 나타낸 바와 같으며, 단결정 단위세포 패턴(pattern)은 도 8에 나타낸 바와 같다. 단결정 분석하여 화합물 SP-1 분자의 절대배위가 인 원자 P1(S)과 C9(S), C18(R), C19(R), C21(R)임을 확인하였고, 입체구조는 도 9 및 10에 나타낸 바와 같다.
<실시예 8> 결정 형태의 화합물 S P -1의 제조
실시예 6에서 얻은 화합물 SP-1을 에탄올/물(1/3, v/v) 계에 첨가하고 30℃에서 0℃까지 서서히 온도를 낮춰 실시예 7과 동일한 결정 형태의 화합물 SP- 1을 얻었다.
<비교예 1> 화합물 1의 제조
Figure pct00022
Figure pct00023
(1) 화합물 615012a의 제조
0℃에서 화합물 61501c 2 g이 있는 테트라하이드로퓨란 10 mL 용액에 tert-부틸 마그네슘 클로라이드 용액(1.0 mol/L, 16 mL)을 가하고 1 시간 동안 교반시킨 후, 화합물 61502 5 g(이성질체 61501e와 61501b의 비율이 26.25 % : 72.03 %로, 도 11 참조)을 가하고 반응이 끝날 때까지 실온에서 교반을 계속하였다. 혼합물에 물 50 mL를 넣고 에틸 아세테이트(3 × 100 mL)로 수상을 3회 추출하였으며, 한 번에 에틸 아세테이트 100 mL를 사용하였다. 에틸 아세테이트 상을 합하여 식염수로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고 탈용매화 하였다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용리액: 메탄올/디클로로메탄 2.5 % 내지 5 %, 기울기 용리)에 의해 정제하여 화합물 615012a 1.9 g을 얻었으며, 수율은 53 %이다.
(2) 화합물 1의 제조
0℃에서 화합물 615012a 3.98 g이 있는 디클로로메탄 10 mL 용액에 트리플루오로 아세트산 12 mL를 넣고 반응이 끝날 때까지 보온하고 교반하였다. 혼합물을 탈용매화 한 후 중탄산나트륨 용액 100 mL를 넣고 에틸 아세테이트로 3회 추출하였으며, 한 번에 에틸 아세테이트 80 mL를 사용하였다. 에틸 아세테이트 상을 합하여 식염수로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 탈용매화 한 후 여러 번 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(이동상: 메탄올/디클로로메탄(메탄올 비율을 2.5 %에서 10 %로 상승), 기울기 용리)에 의해 정제하여 1.1 g의 화합물 1을 얻었다. HPLC 순도는 100 %이며, 이성질체 RP-1 및 SP-1의 비율은 10.82 % : 89.18 %이다(도 12 참조). 31P-NMR (202 MHz, MeOD)의 δP는 3.81, 3.64이고, δP 3.81은 이성질체 RP-1의 31P의 흡수 위치이며, δP 3.64는 이성질체 SP-1에서 31P의 흡수 위치이다.
약리학적 활성의 측정
<실시예 9> 체외 종양세포 증식 억제의 IC 50 값 측정
CTG법에 의하여, BxPC-3, MIA PaCa-2 및 OVCAR-3 종양세포주에 대한 화합물 SP-1, 화합물 RP-1 및 NUC-1031의 50 % 세포 증식 억제 농도(IC50)를 측정하였다.
대수증식기(exponential growth phase)의 세포를 회수하여 Vi-Cell XR 세포 카운터(counter)로 생존 세포 수를 측정하였다. 각 세포에 대응하는 배지로 세포 현탁액을 3.33 × 104/mL 또는 5.56 × 104/mL까지 조정하였다. 96웰(well) 세포 배양 플레이트(plate)의 각 웰 당 세포 현탁액 90 μL를 넣었고, 최종 세포 농도는 BxPC-3 및 MIA PaCa-2는 3000세포/웰이었으며, OVCAR-3은 5000세포/웰이었다. DMSO에 각 시험 화합물을 용해하여 10 mM의 원액(stock solution)이 되도록 하였다. 원액 및 DMSO를 사용하여 3.16 × 연속희석액(serial dilution)을 제조하였다. 이후, 각각 배지로 100배 희석하였다. 마지막으로, 각 세포 1웰 당 그에 상응하는 10배 농도의 용액 10 μL를 각각 첨가하였으며, 1개의 약물농도를 3웰씩 반복하였다(화합물의 제조방법 및 시료 첨가 설계: IC50 실험 웰 플레이트의 시료 첨가 설계 참조). 최종 측정에 이용한 시험 화합물 및 대조 화합물의 농도 범위는 다음 페이지의 화합물의 제조 방법 및 시료 첨가 설계를 참조한다. 시험 화합물 및 대조 화합물은 1웰 당 DMSO의 최종 농도가 0.1 %가 되도록 희석하였다. 37℃, 5 % CO2 배양기에서 72 시간(BxPC-3 및 MIAPaCa-2) 또는 96 시간(OVCAR-3) 배양하였다. 72 또는 96 시간의 약물 처리 후 CTG의 설명서에 따라 각 웰마다 미리 녹여 실온까지 온도를 맞춘(equilibrated) CTG 용액 50 μL(배양 부피의 1/2)를 첨가하고 마이크로 플레이트 발진기(shaker)로 2 분 혼합하고 실온에서 10 분 방치한 후 Envision2104 플레이트 리더(reader)에 의해 형광 신호값을 측정하였다.
세포생존율은 Vsample / Vvehicle control × 100 %의 식으로 계산했다. 식에서 Vsample은 약물처리군의 측정(reading)값이며, Vvehicle control은 용매대조군의 평균값이다. 소프트웨어 GraphPad Prism 5.0을 이용하여, S형(S-shape) 투여량(dose)-생존율 곡선을 비선형 회귀 모델을 사용하여 플롯하고(plot) IC50 값을 계산하였다. 3개의 세포주에서 시험 화합물의 세포증식 IC50의 결과는 하기 표 1과 같다.
3개의 세포주에서 시험 화합물의 세포증식 IC 50 결과
세포주 화합물 (SP-1) 화합물 (RP-1) NUC-1031
IC50(nM) Max inh.(%) IC50(nM) Max inh.(%) IC50(nM) Max inh.(%)
BxPC-3 0.045 66.48 0.554 61.54 0.263 65.82
MIA PaCa-2 0.012 71 0.126 69.2 0.063 65.03
OVCAR-3 0.013 58.22 0.167 54.19 0.095 56.3
상술한 실험 결과에 의하면, 화합물 SP-1, 화합물 RP-1 및 NUC-1031은 BxPC-3, MIA PaCa-2 및 OVCAR-3 종양세포에 대하여 모두 강한 세포독성을 나타내고, IC50 값은 약 0.01 nM 내지 1 nM의 범위에 있다. 화합물 SP-1의 체외 종양세포 증식 억제 효과는 화합물 RP-1의 약 10배이며, 도 13에서도 분명히 나타난다.
<실험예 10> 인간 췌장암의 마우스 피하 이식 모델에서 시험약인 화합물 S P -1, 화합물 R P -1 및 NUC-1031의 약력학적 평가
세포 배양: MIA PaCa-2 세포는 10 % 소 태아 혈청(fetal bovine serum) 및 2.5 % HS를 포함하는 DMEM 배양액에서 배양하였다. 대수증식기의 MIA PaCa-2 세포를 회수하여 누드 마우스의 피하 종양 접종을 위한 적절한 농도가 되도록 PBS에 다시 현탁하였다.
동물의 모델링 및 그룹화: 6 내지 8주령(종양세포 접종시의 마우스의 예상 주령)이고, 18 내지 22 g인 암컷 BALB/c 누드 마우스 총 52 마리를 Shanghai Lingchang Biological Technology Co., LTD.로부터 구입하였다. 40 마리에 30 %의 여분을 더하여 총 52 마리의 마우스가 필요하였다. 1 그룹이 8 마리가 되도록 5개의 그룹으로 나누었다. 모든 실험 마우스를 배리어 시스템(barrier system) 내에서 사육하였고, 최소한 7일 전에 환경에 적응시켰다. 각 마우스에 3 × 106개의 MIA PaCa-2 세포를 오른쪽 등(back)에 피하 접종하고 세포를 1:1의 PBS 및 마트리겔(matrigel)에 다시 현탁하였다(0.1 mL/마리). 종양의 성장을 정기적으로 관찰하고 종양이 평균 150 내지 200 mm3 크기까지 성장했을 때, 종양의 크기 및 마우스의 체중에 따라 무작위로 그룹을 선택하여 시험 약물을 투여하였다. 자세한 투여방법, 투여량 및 투여 경로는 표 2와 같다.
MIA PaCa-2 동물 모델에서 시험 약물의 투여 경로, 투여량 및 투여용법(regimen)
그룹 번호 동물 수 투여종류 투여량
(mmol/kg)		 투여량
(mg/kg)		 투여부피
(μL/g)		 투여방법 투여주기
1 8 용매대조
(vehicle control)		 -- -- 10 i.p. BIW×4
2 8 겜시타빈 0.19 50 10 i.p. BIW×4
3 8 화합물SP-1 0.19 110 10 i.p. BIW×4
4 8 화합물RP-1 0.19 110 10 i.p. BIW×4
5 8 NUC-1031 0.19 110 10 i.p. BIW×4
[비고]
i.p.: 복강 내 주사
BIW: 주 2회 투여
실험 관찰 지표 및 계산
상대적 종양억제율 TGI(%)는 TGI % = (1-T/C) × 100 %이다. T/C %는 상대적인 종양 증식율이며, 즉 특정 시점의 대조군에 대한 치료군의 상대적인 종양 부피 또는 종양 중량의 백분율이다. T와 C는 각각 치료군과 대조군의 특정 시점의 상대적인 종양 부피(RTV) 또는 종양 중량(TW)이다.
계산식은 다음과 같다.
T/C % = TRTV/CRTV × 100 %
(TRTV: 치료군의 평균 RTV; CRTV: 용매대조군의 평균 RTV; RTV = Vt/V0. V0는 그룹화 시 상기 동물의 종양 부피이며, Vt는 처리 후 상기 동물의 종양 부피이다).
또는 T/C % = TTW/CTW × 100 %
(TTW: 치료군의 실험 종료 시의 평균 종양 중량; CTW: 대조군의 실험 종료 시의 평균 종양 중량).
실험 결과:
겜시타빈을 일주일에 2회, 4주 연속 투여한 결과, 종양에 대한 좋은 억제 효과가 관찰되었고 상대적 종양억제율은 55 %에 달했다. 겜시타빈과 동일한 몰 양의 화합물 SP-1, 화합물 RP-1 및 NUC-1031을 일주일에 2회, 4주 연속 투여한 결과, 상대적 종양억제율(TGI, %)은 각각 79 %, 22 %, 54 % 로 나타났다. 즉, 화합물 SP-1은 화합물 RP-1보다 뛰어난 체내 항종양 활성을 나타내었다(도 14 참조).
<실시예 11> MIA PaCa-2 인간 췌장암의 마우스 피하 이식 모델에서 시험약인 화합물 S P -1 및 화합물 R P -1의 일회(single) 투여 후 약동학적 평가
세포 배양: MIA PaCa-2 세포는 10 % 소 태아 혈청 및 2.5 % HS를 포함하는 DMEM 배양액에서 배양하였다. 대수증식기의 MIA PaCa-2 세포를 회수하여 누드 마우스의 피하 종양 접종을 위한 적절한 농도가 되도록 PBS에 다시 현탁하였다.
동물의 모델링 및 그룹화: 6 내지 8주령(종양세포 접종시의 마우스의 예상 주령)이고, 18 내지 22 g인 암컷 BALB/c 누드 마우스 총 47 마리를 Shanghai Lingchang Biological Technology Co., LTD.로부터 구입하였다. 36 마리에 30 %의 여분을 더하여 총 47 마리의 마우스가 필요하였다. 1 그룹이 6 마리가 되도록, 6개의 그룹으로 나누었다. 모든 실험 마우스를 배리어 시스템 내에서 사육하였고, 최소한 7일 전에 환경에 적응시켰다. 각 마우스에 3 × 106개의 MIA PaCa-2 세포를 오른쪽 등(back)에 피하 접종하고 세포를 1:1의 PBS 및 마트리겔에 다시 현탁하였다(0.1 mL/마리). 종양의 성장을 정기적으로 관찰하고 종양이 평균 200 내지 250 mm3 크기까지 성장했을 때, 종양의 크기 및 마우스의 체중에 따라 무작위로 그룹을 선택하여 시험 약물을 투여하였다. 자세한 투여방법, 투여량 및 투여 경로는 표 3과 같다.
MIA PaCa-2 동물 모델에서 시험 약물의 투여 경로, 투여량 및 투여용법(regimen)
그룹 번호 동물 수 투여종류 투여량
(mmol/kg)		 투여량
(mg/kg)		 투여부피
(μL/g)		 투여
방법		 일회 투여 후 종양조직을 채취한 시점(Timepoint of resecting tumor after single administration)
1 6 화합물SP-1 0.19 110 10 i.p. 0.5h
2 6 화합물SP-1 0.19 110 10 i.p. 2h
3 6 화합물SP-1 0.19 110 10 i.p. 24h
4 6 화합물RP-1 0.19 110 10 i.p. 0.5h
5 6 화합물RP-1 0.19 110 10 i.p. h
6 6 화합물RP-1 0.19 110 10 i.p. 4h
[비고]
i.p.: 복강 내 주사
BIW: 주 2회 투여
투여하고 0.5, 2 및 24 시간 후 각 종양 조직을 채취하였다. 종양을 채취한 후 즉시 액체 질소로 급속 동결하였다. 종양 중량을 측정하고 얼음조(ice bath) 하에 1:5의 비율이 되도록 20 % 메탄올/물에서 균질화 하였고, LC-MS/MS에 의해 종양 조직의 활성 대사물인 dFdCTP의 농도를 측정하였다.
실험 결과:
110 mg/kg의 화합물 SP-1 및 화합물 RP-1을 복강 주사한 실험 결과는 도 15에 나타낸다. 화합물 SP-1을 복강 내 주사한 후 0.5, 2 및 24 시간 후 종양 조직 활성 대사산물 dFdCTP의 농도는 각각 12.0, 5.97 및 0.504 μg/g이고, 화합물 RP- 1을 복강 주사한 후 0.5, 2 및 24 시간 후 종양 조직 활성 대사산물 dFdCTP의 농도는 각각 3.03, 1.67 및 0.157 μg/g이었다. 화합물 BP124a을 투여하고 0.5, 2 및 24 시간 후 종양 조직 활성 대사산물 dFdCTP의 농도는 각각 화합물 RP-1의 3.96배, 3.57배 및 3.21배였다(도 15 참조).

Claims (13)

  1. (1) 화합물 61501h 및 화합물 61501g를 염기성 조건 하에서 반응시킨 후, 화합물 61501f와 추가적으로 반응시켜 화합물 61502를 제조하는 단계;
    Figure pct00024

    (2) 화합물 61502를 결정화하여 화합물 61501b를 단리(isolate)하는 단계;
    Figure pct00025

    (3) 화합물 61501b 및 화합물 61501c를 반응시켜 화합물 61501a를 제조하는 단계; 및
    Figure pct00026

    (4) 화합물 61501a의 히드록시 보호기를 이탈시켜 화합물 SP-1을 얻는 단계;
    Figure pct00027

    를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물 SP-1의 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 화합물 61501c는 화합물 61501d로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 제조방법
    Figure pct00028
    .
  3. 제 1항에 있어서, 단계 (2)의 결정화 용매는 에틸 아세테이트/석유에테르인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 화합물 61502 및 에틸 아세테이트의 중량 대 부피비(weight-to-volume ratio)는 2:5 내지 4:5이고, 에틸 아세테이트와 석유에테르의 부피비는 1:4 내지 1:6인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 제조된 화합물 SP-1의 순도가 90% 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제 5항에 있어서, 제조된 화합물 SP-1의 순도가 99% 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 저급 알코올 및 물로 이루어진 용매 중에서 화합물 SP-1을 결정화시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 용매는 1부(part)의 C1~3의 알코올 및 3부의 물로 이루어진 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. a = 11.36Å, b = 34.84Å, c = 15.12Å이고 부피가 5554Å3인 격자를 갖는 결정 형태의 화합물 SP-1.
  10. 도 7에 나타낸 바와 같은 X선 분말 회절(X-ray powder diffraction, XRPD) 패턴을 갖는 결정 형태의 화합물 SP-1.
  11. 췌장암, 말기 고형종양, 난소종양, 비소세포폐암, 유방암, 방광암, 자궁경부암, 중피종, 식도암, 위암, 직장암, 간암, 담관암, 비인두암, 고환암, 림프종 또는 두경부암을 포함하는 암의 치료약의 제조에 사용하는 것을 특징으로 하는 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에서 제조된 화합물 SP-1의 용도.
  12. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에서 제조된 화합물 SP-1 및, 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  13. 제 9항 및 제 10항 중 어느 한 항의 결정 형태의 화합물 SP-1 및, 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
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