KR20180040573A - 신규한 트롬빈 억제제 - Google Patents
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Abstract
신규한 트롬빈 억제제
본 발명은 트롬빈에 높은 수준의 특이성으로 결합할 수 있고 그 활성을 억제할 수 있는 분리된 펩타이드, 변이체 및 그것의 절편을 제공한다. 또한 진단 및 치료의 방법, 의료기구의 코팅 및 핵산 코딩에서 이 펩타이드의 용도를 제공한다.
본 발명은 트롬빈에 높은 수준의 특이성으로 결합할 수 있고 그 활성을 억제할 수 있는 분리된 펩타이드, 변이체 및 그것의 절편을 제공한다. 또한 진단 및 치료의 방법, 의료기구의 코팅 및 핵산 코딩에서 이 펩타이드의 용도를 제공한다.
Description
본 발명은 인간에서 응고장애를 일으키는 트롬빈에 특이적으로 결합하는 분리된 펩타이드, 이의 변이체 및 단편에 관한 것이다. 혈전증 관련 질병의 진단 및 치료 방법 및 의료기기의 코팅 방법에서 상기 펩타이드의 용도가 또한 제공된다.
지혈은 혈관 손상 후 혈액 유출을 최소화하는 생리학적 과정이다. 혈액 응고, 이 과정 중 일부분은 순차적인 방식으로 제한된 단백질 절단에 의해 순환하는 효소원의 활성화와 관련되고, 피브린 응고 형성을 하게 된다. 트롬빈(Flla)은 지혈에서 중심이 되는 역할을 한다[Stubbs M. T. and Bode W. Throm Res 69, 1-58 (1993)]. 그것의 지혈 상승 작용에서: (a) 용해성 피브리노겐을 초기 응고를 형성하기 위해 중합되는 피브린 단량체로 절단하고[Versteeg H. H., et al., Physiol Rev 93, 327-358 (2013)]; (b) 응고를 안정화하기 위해 피브린 단량체에 공유결합으로 가교결합하는 트랜스글루타미나아제(FXIII)를 활성화시키고[Versteeg H. H., et al., Physiol Rev 93, 327-358 (2013)]; (c) 자체 증폭에 필요한 비-효소 보조인자(FV 및 FVII)를 활성화시키고; (d) 결과적으로 내인성 경로를 활성화시키는 FXI를 활성화시키고[Versteeg H. H., et al., Physiol Rev 93, 327-358 (2013)]; 및 (e) 모양변화, 탈과립화 및 응집을 일으키는 프로테아제-활성화된 수용체의 절단에 의해 혈소판을 활성화시킨다[Monroe D. M., et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol 22, 1381-1389 (2002)]. 반대로, 트롬빈은 또한 혈액 응고 과정의 진행 및 확장을 하향 조절함으로써, 항응고제로 중요한 역할을 하고, 트롬보모듈린에 결합하는 동안, 단백질 C를 활성화시키고 이는 FVa 및 FVIIa 보조인자 둘다 불활성화시켜 트롬빈의 추가적인 생성을 완화한다[Di Cera E. Mol Aspects Med 29(4), 203-254 (2008)]. 트롬빈의 역설적인 응고촉진제 및 항응고제의 역할은 필요로 할 때 충분한 혈전을 형성하면서 조절되지 않는 출혈과 폐쇄 혈전 형성간의 균형을 유지한다.
심혈관계 질환은 세계적으로 가장 큰 사망원인이고 비-전염성 질환의 부담에 있어 가장 큰 원인이 된다[Chaudhari K., et al., Nat. Rev. Drug. Discov 13, 571-572 (2014)]. 혈전증의 병리학적 징후인 허혈성 심장질환 및 허혈성 뇌졸증은 심혈관계 질환의 가장 흔한 예시이고, 전세계적으로 4분의 1의 죽음의 이유가 된다[Raskob G. Thromb Haem 112(5), 843-943 (2014)]. 직접적인 트롬빈 억제제(DTI), 직접적인 인자 Xa(FXa) 억제제 및 비타민 K 길항제(VKA)와 같은 항응고제는 항혈전증 약물로서 현재의 치료적 선택의 중요한 부분을 포함한다. 치료적 선택으로 사용되는 DTI의 몇몇 예시는 비발루딘(bivalirudin), 트롬빈 활성화 위치 및 엑소사이트-I(exosite-I)에 결합하는 2가 억제제인 히루딘의 합성 유사체; 아가트로반(argatroban) 및 다비가트란(dabigatran), 활성화 위치에만 결합하는 소분자 1가 DTI; 및 항트롬빈-의존적인 방식으로 트롬빈을 억제하는 저분자량 헤파린(LMWH) 이다[Michiel Coppens, et al., Circ Res 112, 920-931 (2012)]. 항응고요법의 대중적인 옵션임에도 불구하고, 이러한 종류는 좁은 치료 범위, 개별 투약, 높은 출혈 위험, 낮은 생체이용률 및 높은 음식-약물 상호작용과 같은 많은 한계를 가진다[Bauer K. A. Haem 464-470 (2013). 따라서, 더 큰 장점을 가진 신규하고 우수한 항응고제가 요구되고 있다.
흡혈 동물은 혈액 섭취 식단에 적응되어 왔고 성공적인 섭취를 위해 지속적인 혈류를 보장하도록 숙주의 지혈을 조절하는 분자의 조합으로 진화되어왔다. 항응고제 중에서, 트롬빈 억제제는 흡혈 기생충에서 중심적인 단계를 차지한다[Koh C. Y. and Kini R. M. Expert Rev. Haematol 1(2), 135-139 (2008)]. 히루딘(hirudin), 해마딘(haemadin), 트리아빈(triabin), 오르니토도린(ornithodorin) 및 로우드닌(rhodniin)은 흡혈 동물에서 트롬빈 억제제의 특정 계열에 대해 가장 넓게 연구된 여러 예들이다[Huntington J. A. Thromb Haemost 111, 583-589 (2014)]. 이전에, 바리어진(variegin)으로 불리는(PCT/IB2008/002109), 참진드기(hard tick, Amblyomma variegatum)의 침샘 추출물로부터의 경쟁적 트롬빈 억제제이고 빠르고 단단하게 결합하는, 32-잔기를 가진 긴 펩타이드인, 신규한 트롬빈 억제제를 분리하고 특성을 분석하였다[Koh C. Y., J Biol Chem 282 (40), 29101-29113 (2007)].
심혈관계질환 및 뇌혈관질환의 치료를 위한 치료제로서 더 효과적인 펩타이드를 제공할 필요가 있다. 사용 예로는 심장마비, 뇌졸중 및 색전증을 일으키는 동맥 및 정맥의 혈전증의 치료와 예방; 불안정 협심증, 관상동맥 성형술, 관상동맥 중재술 및 심장수술 동안의 항응고요법을 포함한다. 게다가, 이 펩타이드는 또한 시약, 혈액 수집 튜브(blood collection tube)에서 항응고제 및 스텐트, 카테터, 의료용 튜빙과 같은 의료기구의 표면 코팅 물질로서 발전할 수 있다.
본 발명은 상기에 기재된 과제를 해결하거나 개선하고, 트롬빈에 대한 친화도가 향상된 신규 펩타이드 및 이의 변이체를 제공하고자 한다. 새롭게 확인된 펩타이드 '아바트린(avathrin)' 및 '울트라바리어진(ultravariegin)'은 바리어진과 제한적인 서열의 동일성을 보이지만, 그들은 각각 Ki가 545 pM 및 4.4 pM인 유사하게 빠르고 단단한 결합 경쟁 모드에서 선택적으로 트롬빈을 억제한다. 이러한 친화도는 명확한 효능이 없고 지속적인 주입을 필요로 하는 임상에서 사용된 펩타이드-기반 트롬빈 억제제(BivalirudinTM)보다 표적(트롬빈)에 대하여 각각 약 5 및 650배 더 높다. 이 트롬빈 억제제의 다수의 변이체의 고해상도의 3차원 구조 및 구조-기능 관계에 도움을 받아 그들의 주요 기능성 위치를 확인했다. 트롬빈에 대해 향상된 친화도가 있는 이 펩타이드의 새로운 변이체는 고안되었고 합성되었다. 뮤린의 동맥혈전증 모델을 통해 이 펩타이드의 생체내(in vivo) 효능을 성공적으로 입증하였다. 또한 진드기(Ixodid tick)로부터 다른 신규한 펩타이드를 확인하고 연구하였다.
본 발명의 첫번째 양태는 SGGHQTAVPKISKQGLGGDFEEIPSDEIIE(서열번호 1), 이의 변이체 또는 단편, SDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEE(서열번호 2), 이의 변이체 또는 단편, 서열번호 22, 이의 변이체 또는 단편, 서열번호 23, 이의 변이체 또는 단편, 서열번호 24, 이의 변이체 또는 단편, 및 서열번호 25, 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 트롬빈 억제제를 제공한다.
바람직한 구현예에서 아미노산 서열은 다음을 포함하는 군으로부터 선택된다;
QTAVPKISKQGLGGDFEEIPSDEIIE (서열번호 3);
ISKQGLGGDFEEIPSDEIIE (서열번호 4);
SGGHQTAVPKIAKQGLGGDFEEIPSDEIIE (서열번호 5);
SGGHQTAVPKIHKQGLGGDFEEIPSDEIIE (서열번호 6);
SGGHQTAVPRISKQGLGGDFEEIPSDEIIE (서열번호 7);
SGGHQTAVPXISKQGLGGDFEEIPSDEIIE (서열번호 8), X는 β-호모아르기닌이다;
SDEAVRAIPXMYSTAPPGDFEEIPDDAIEE (서열번호 9), X는 β-호모아르기닌이다;
SDQGDVAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEE (서열번호 10);
SDEAVRAEPKMHKTAPPGDFEEIPDDAIEE (서열번호 11);
SDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPEEYLDDES (서열번호 12);
MYSTAPPGDFEEIPDDAIEE (서열번호 13);
SDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDEIEE (서열번호 14);
SDEAVRAIPKMYSQAPPGDFEEIPDDAIEE (서열번호 15);
SDQGDVAEPKMYSTAPPFDFEAIPEEYLDDES (서열번호 16);
SDQGDVAEPXMHSTAPPFDFEAIPEEYLDDES (서열번호 17) 서열번호 2의 변이체, X는 β-호모아르기닌이다;
CDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEE (서열번호 18) 서열번호 2의 변이체;
SDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEECA (서열번호 19) 서열번호 2의 변이체;
MYSTAPPGDFEEIPDDAIEEGCCC (서열번호 20) 서열번호 2의 변이체;
SDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEEGCCC (서열번호 21) 서열번호 2의 변이체;
SGEDHTAVPKMSRKGLGGDFEDIPPEAYERALEAR (서열번호 22);
ELESGDEDSEGGDSQSSPTESAAPRLHQREGGGGDFENVEYDQDQK (서열번호 23);
SDVAPADYESDEGDNDGGHDGSEVAKPKMPRGNGGGGDFEEIPEVE (서열번호 24); 및
TGSDDDDEYDMYESDGDSNEGNDNDEFETAVPRLPNPNSGRDSEHIPMPVN (서열번호 25).
본 발명의 또 다른 양태는 혈전증과 관련된 질병의 예방 또는 치료를 위한 본 발명의 임의의 양태에 따르면 아미노산 서열을 포함하는 분리된 트롬빈 억제제를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 트롬빈 활성을 억제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 임의의 양태에 따른 적어도 하나의 트롬빈 억제제와 트롬빈을 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따른 혈전증과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 임의의 양태에 따른 트롬빈 억제제의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면 본 발명의 임의의 양태에 따른 트롬빈 억제제의 예방 및/또는 치료의 유효량을 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 혈전증과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면 본 발명의 임의의 양태에 따른 적어도 하나의 억제제를 개체 또는 개체로부터 분리된 조직 샘플에 투여하는 단계, 및 트롬빈에 결합된 상기 적어도 하나의 트롬빈 억제제의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 개체에서 트롬빈의 축적을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면 본 발명의 임의의 양태에 따른 적어도 하나의 트롬빈 억제제의 유효량을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면 본 발명의 임의의 양태에 따른 트롬빈 억제제를 코딩하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 바람직한 구현예에서 핵산 서열은 서열번호 1을 코딩하고, TCGGGTGGCCATCAGACTGCTGTTCCGAAGATATCTAAGCAAGGCTTGGGTGGAGACTTTGAAGAAATTCCAAGTGATGAAATAATCGAG (서열번호 26)로 표시된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라 본 발명에 기재된 적어도 하나의 혈전증 억제제를 포함하는 키트를 제공한다.
도 1은 암블리옴마 배리어가튬(Amblyomma variegatum)의 침샘에서 바리어진-유사 전구체 단백질 BAD29729을 코딩하는 mRNA의 위치를 보여준다. 홀마운트 원위치 혼성화(Whole mount in situ hybridization)는 주 침샘관 가까이에 위치한 타입 II 샘꽈리에서 BAD29729의 발현을 드러냈지만, 다른 타입의 샘꽈리(타입 III는 별표로 표시됨)에서는 그렇지 않았다. 화살표는 발현의 위치를 표시한다. A-C. 5일간 먹인 암컷 (A) 및 12일간 먹인 수컷 (B)의 침샘은 2-4 큰 세포 (C)에서 BAD29729의 강한 발현을 보여준다. D-H. 혈액-공급의 과정 동안 유충에서 BAD29729의 발현. 먹이지 않은 (D), 2일간 먹인 (E), 및 4일간 먹인 (F) 유충은 타입 II 샘꽈리의 기저 부분이 염색된 것을 보여준다. 염색은 6일간 먹인 개인 (G)에서 염색이 나타나지 않았고, 완전히 충혈되고 분리된 (H) 유충에서 매우 약하게 나타났다. I. 2일간 먹인 유충의 타입 II 샘꽈리의 클로즈업은 두개의 기저 세포의 염색을 보여준다. 바 100 μm (A-B), 50 μm (D-H) 및 25 μm (C, I). J. 바리어진 및 아바트린의 서열 얼라인먼트(전구체 단백질로부터의 활성 트롬빈 억제성 펩타이드).
도 2는 아바트린의 합성 및 정제를 보여준다. 아바트린은 고체상 펩타이드 합성을 사용하여 합성되었고 역상크로마토그래피를 사용하여 정제되었다. A. 10% 용리제 B 내지 70% 용리제 B의 아세토나이트릴 구배(용리제 A: 0% ACN, 99.9% MilliQ water 및 0.1% TFA; 용리제 B: 0% ACN, 99.9% MilliQ water 및 0.1% TFA)를 사용한 Jupiter Proteo (5 μm, 250 mm X 10 mm, 90 Å) 역상 컬럼에서 아바트린의 정제. B. 10 mM 인산 나트륨 완충액(pH 7.4)에서 용해된 아바트린 및 이의 절단된 변이체의 Far-UV CD 스펙트럼(260 - 190 nm) - IS20. 두개의 스펙트럼은 랜덤 코일의 전형적인 것이다. C. 아바트린의 순도 및 질량은 ESI-MS에 의해 측정되었다. 아바트린은 3가지의 상이한 전하 상태에서 이온화되고, +4, +3 및 +2 전하 상태에 따라 각각 m/z 값이 785.84 amu, 1047.55 amu 및 1570.58 amu로 보여졌다. D. 아바트린의 디콘볼루티드(Deconvoluted) 질량 스펙트럼은 아바트린의 관측된 질량이 예상한 질량인 3139.65 ± 0.83 Da와 일치한다는 것을 보여주었다(표 1).
도 3은 아바트린의 트롬빈 억제성의 활성을 보여준다. A. 트롬빈(0.81 nM)의 아미드 분해(amidolytic) 활성에 대한 아바트린의 다양한 농도의 효과는 10분 동안 전-배양(pre-incubation) 또는 전-배양 없이 S2238 (100 μM)을 사용하여 측정되었다. 아바트린은 용량 의존적 방식으로 트롬빈 아미드 분해 활성의 억제를 보여준다. 억제의 IC50 및 힐 슬롭(Hill slope)은 각각 0분에서 6.95 ± 0.42 nM 및 0.92 ± 0.01; 및 10분에서 4.86 ± 0.36 nM 및 0.94 ± 0.02 nM이다. 각 데이터 포인트는 적어도 세개 실험의 평균 ± 표준 편차이다. B. 다양한 농도의 아바트린 존재 하에서 S2238 (100 μM)을 사용한 트롬빈(0.81 nM) 아미드 분해 분석이 수행되었고 아바트린 존재 하에서 트롬빈 억제의 선형 증가 곡선이 얻어졌다 - 빠른 결합 억제제의 특성. C. 아바트린의 다양한 농도 존재 하에서 잔류하는 트롬빈 아미드 분해 활성은 상이한 농도의 S2238에서 측정되었고 K i'(겉보기의 K i)가 결정되었다. 반응은 트롬빈(0.81 nM)의 첨가로 시작되었다. 데이터는 GraphPad Prizm 소프트웨어를 사용한 Morrison tight binding equation에 맞춰졌다. 각 데이터 포인트는 적어도 세개 실험의 평균 ± 표준 편차이다. D. S2238 농도에 대한 K i'의 플롯은 선형적으로 증가하고, 이는 아바트린이 경쟁적인 억제제임을 나타낸다. 억제성 상수 K i는 545.3 ± 3.1 pM으로 결정되었다.
도 4는 트롬빈 섬유소원 용해 활성의 억제를 보여주고, 아바트린, IS20, GL16 및 울트라바리어진은 용량 의존적 방식으로 피브리노겐 응고 시간을 지연시켰다.
도 5는 아바트린의 세린 프로테아제 선택성을 보여준다. 아바트린은 응혈원, 항응고제, 섬유소원 용해 및 전형적인 세린 프로테아제를 포함하는 13개의 세린 프로테아제(트롬빈, 트립신, fIXa, fXIa, fXa, 키모트립신, tPA, fVIIa, 플라스민, APC, 칼리크레인(kallikrein), 우로키나아제 및 fXIIa)에 대한 선택성이 스크리닝되었다. 아미드 분해 분석에서 사용된 프로테아제 및 기질의 최종 농도는 다른 기재가 없으면 각각 괄호 안의 nM 및 μM으로 주어진다: α-트롬빈/S2238 (0.81/100), 트립신/S2222 (0.87/100), fIXa//Spectrozyme® fIXa (333/0.4), fXIa/S2366 (0.125/1000), fXa/S2765 (0.24/650), 키모트립신/S2586 (1.2/0.67), tPA/S2288 (36.9/1000), fVIIa/S2288 (460/1200), 플라스민/S2251 (3.61/1200), APC/S2366 (2.74/600), 칼리크레인/S2302 (0.93/1100), 우로키나아제/S2444 (32 U/ml/650), fXIIa/S2302 (20/1000). 트롬빈의 활성은 아바트린의 더 낮은 농도(1000 nM, 100 nM 및 10 nM)에서 시험되었고 반면에 다른 프로테아제는 아바트린의 훨씬 더 높은 농도(100 μM, 10 μM 및 1 μM)에서 시험되었다. 각 데이터 포인트는 적어도 세개 독립된 실험의 평균 ± 표준편차이다.
도 6은 트롬빈에 의한 아바트린의 절단을 보여준다. A. 트롬빈에 의한 아바트린 절단의 HPLC 크로마토그램에 의한 평가. 아바트린(150 μM)은 다양한 시간 동안 트롬빈(5 μM)과 함께 항온처리되었고 반응 혼합물은 RP-HPLC을 사용하여 분리되었다; 절단 산물의 질량은 ESI-MS로 분석되었다. 0분(상부 패널)에서, 전장(full length) 아바트린(질량 3139 Da)에 상응하는 단일 피크가 확인되었다. 120분(중간 패널)에서, 아바트린 피크뿐만 아니라 N-말단 절단 산물(SGGHQTAVPK; 질량 982 Da) 및 C-말단 절단 산물(ISKQGLGGDFEEIPSDEIIE; 질량 2176 Da)에 상응하는 두개의 새로운 피크가 확인되었다. 600분(하부 패널)에서, N- 및 C-말단 절단 산물에 상응하는 두개의 피크가 관측된 반면에 아바트린 피크는 관측되지 않았고, 이는 완전한 절단을 의미한다. B. 트롬빈에 의한 시간-의존적 아바트린의 절단. 아바트린, 그것의 N- 및 C-말단 절단 산물의 상대 백분율은 곡선 아래 부분을 계산함으로써 측정되었다. 각 데이터 포인트는 적어도 세개 독립된 실험의 평균 ± 표준 편차이다. C. 아바트린의 억제성 성질에 대한 트롬빈 절단의 효과. 아바트린은 트롬빈(0.81 nM)과 함께 최대 36시간 동안 항온처리되었고, 발색 기질 S2238에 대한 트롬빈 아미드 분해 활성을 억제하는 그것의 능력에 대해 상이한 시점에서 분석되었다. 아바트린 25 nM에서, 억제제는 트롬빈(0.81 nm)의 30배 과잉으로 존재하였고, 이 비율은 절단 산물의 HPLC 분석에서 사용된 것과 유사하다. 비록 약 10시간에 전장 아바트린이 완전히 절단되었지만, 24시간 후에 절단 산물은 원래의 억제성 활성의 >50%으로 유지되었다. 따라서 절단 산물, 특히 아바트린의 C-말단 절단 산물은 트롬빈에 결합된 채로 나타나고 트롬빈을 계속해서 억제한다. 각 데이터 포인트는 적어도 세개 독립된 실험의 평균 ± 표준편차이다.
도 7은 트롬빈 아미드 분해 활성에 대한 절단된 아바트린 돌연변이의 효과를 보여준다. A. 트롬빈(0.81 nM)의 아미드 분해 활성에 대한 QT26 및 IS20의 효과를 측정하였다. 두개의 펩타이드는 트롬빈을 용량 의존적인 방식으로 억제한다. QT26은 각각 0분에 8.94 ± 0.64 nM 및 0.88 ± 0.03; 10분에 13.54 ± 0.81 및 0.92 ± 0.03인 IC50 및 힐 슬롭을 가졌다. IS20은 각각 0분에 12.38 ± 0.32 nM 및 0.86 ± 0.02; 10분에 22.70 ± 0.94 nM 및 0.87 ± 0.01인 IC50 및 힐 슬롭을 가졌다. 각 데이터 포인트는 적어도 세개 독립된 실험의 평균 ± 표준편차이다. B. GL16 (3, 10, 30, 100, 및 300 μM)은 트롬빈의 아미드 분해 활성을 억제할 수 없었다; 대신에 높은 농도에서, 약간 트롬빈에 의한 S2238 가수분해를 약간 증가시켰다. 각 데이터 포인트는 적어도 세개 독립된 실험의 평균 ± 표준편차이다. C 및 D. QT26 및 IS20 존재 하에서 트롬빈 아미드 분해 활성이 측정되었고 K i(겉보기의 K i)가 결정되었다. QT26 및 IS20 둘다 강하게 결합하는 억제제였다. 각 데이터 포인트는 적어도 세개 실험의 평균 ± 표준편차이다. E. S2238 농도에 대한 K i' 플롯은 선형적으로 증가했고, 이는 QT26는 경쟁적인 억제제인 것을 나타낸다. 억제성 상수 K i는 760.32 ± 0.91 pM로 결정되었다. F. S2238 농도에 대한 K i' 플롯은 곡선으로 감소했고, 이는 IS20이 비-경쟁적인 억제제인 것을 나타낸다(α<1임). 억제성 상수 K i는 5760 ± 230 pM로 결정되었다.
도 8은 아바트린과 비교하여 아바트린 변이체의 트롬빈 아미드 분해 활성에 대한 효과를 보여준다. 모든 변이체는 용량 의존적인 방식으로 트롬빈 활성을 억제하였다. A. S12A는 각각 101.20 ± 1.32 nM 및 0.62 ± 0.01인 IC50 및 힐 슬롭을 가졌다. S12A의 IC50는 아바트린보다 20배 낮았고, 이는 트롬빈 억제를 위한 아바트린에서 Ser12의 중요성을 보여준다. S12H는 각각 18.51 ± 0.32 nM 및 0.88 ± 0.02인 IC50 및 힐 슬롭을 가졌다. 각 데이터 포인트는 적어도 세개 실험의 평균 ± 표준편차이다. B. L16P, G17P는 각각 181.32 ± 3.76 nM 및 0.54 ± 0.02인 IC50 및 힐 슬롭을 가졌다. G2D, Q5D는 각각 12.98 ± 1.23 nM 및 0.71 ± 0.03인 IC50 및 힐 슬롭을 가졌다. 각 데이터 포인트는 적어도 세개 독립된 실험의 평균 ± 표준편차이다. C. β-아바트린은 각각 332.16 ± 1.32 nM 및 0.62 ± 0.01인 IC50 및 힐 슬롭을 가졌다. 비록 β-아바트린은 최대 72시간 동안 절단되지 않았지만, 이의 효력에 있어 심각한 저하가 있었다. 각 데이터 포인트는 적어도 세개 독립된 실험의 평균 ± 표준편차이다. D. K10R은 각각 1.15 ± 0.45 nM 및 1.10 ± 0.01인 IC50 및 힐 슬롭을 가졌다. K10R은 활성에 있어 5배를 얻었지만 아바트린(3시간)에 비해 훨씬 더 빠른 속도로 절단되었다. 각 데이터 포인트는 적어도 세개 독립된 실험의 평균 ± 표준편차이다. E. β-바리어진은 각각 117.90 ± 1.16 nM 및 0.93 ± 0.05인 IC50 및 힐 슬롭을 가졌다. 각 데이터 포인트는 적어도 세개 독립된 실험의 평균 ± 표준편차이다.
도 9는 트롬빈에 의한 아바트린 변이체 K10R (A) 및 β-아바트린 (B)의 절단에 대한 HPLC 크로마토그램을 보여준다. 펩타이드는 다양한 시간 동안 트롬빈과 함께 항온처리되었고 반응 혼합물은 RP-HPLC을 사용하여 분리되었고 절단 산물의 질량은 ESI-MS를 사용하여 분석하였다. 3시간 후(아바트린보다 훨씬 더 빠른 속도) K10R-아바트린이 완전히 절단되는데 반하여, β-아바트린은 72시간 후에도 절단되지 않았다.
도 10은 아바트린 변이체의 억제에 대한 동력학적 파라미터를 보여준다. A. S12H, B. G2D,Q5D 및 C. K10R 존재 하에 잔류하는 트롬빈 아미드 분해 활성은 S2238의 상이한 농도에서 측정되었고 K i(겉보기의 K i)가 측정되었다. 반응은 트롬빈(0.81 nM)의 첨가와 함께 시작되었다. S12H, G2D, Q5D 및 K10R은 각각 1.23 ± 0.04 nM, 0.93 ± 0.01 nM 및 0.17 ± 0.00 nM의 Ki 값을 가지며, 강하게 결합하는 트롬빈 억제제였다. 각 데이터 포인트는 적어도 세개 독립된실험의 평균 ± 표준편차이다.
도 11은 β-아바트린 및 S12A에 의한 트롬빈의 억제에 대한 라인위버-버크(Lineweaver-Burke) 플롯을 보여준다. β-아바트린(300 nM; A) 및 S12A (30 nM; B) 존재 하에 잔류하는 트롬빈 아미드 분해 활성은 S2238의 다양한 농도에서 측정되었다(실선, 억제제 없음; 점선, 억제제 있음). β-아바트린 및 S12A 둘다 등몰 농도에서 트롬빈을 억제할 수 없었기 때문에, 그들은 강하게 결합하는 트롬빈의 억제제가 아니다. 이중 역수 플롯은 β-아바트린 및 S12A는 각각 32.04 ± 0.36 nM 및 6.07 ± 0.18 nM의 K i 값을 가졌음을 보여준다. 각 데이터 포인트는 적어도 세개 독립된 실험의 평균 ± 표준편차이다.
도 12는 아바트린 트롬빈 복합체의 결정 구조의 모델을 보여준다. A. 트롬빈-아바트린 복합체의 개요. 아바트린은 청록색으로 도시되는 트롬빈의 표면 표현과 함께 스틱 모델(탄소: 노랑색; 질소: 파란색; 산소: 빨간색)로 도시된다. 6개의 잔기 A(5QTAVPK10) 및 10개의 잔기 A(19DFEEIPSDEI28)는 트롬빈 활성 위치 및 엑소사이트-1 틈의 근접한 곳에서 확인되었다. B. (A)와 유사한 관점에서, 아바트린에 대한 계산된 전자 밀도 맵이 도시된다. 2Fo-Fc 맵(회색, 1.0 시그마 레벨에서 윤곽선) 및 Fo-FC 맵(양성 맵에서 녹색, 3.0 시그마에서 윤곽선, 음성 맵에서 빨간색, 3.0 시그마에서 윤곽선). C. 잘리기 쉬운 결합에 대한 아바트린 펩타이드 N-말단(노란색 스틱)의 4.5 Å 반경 내에서 트롬빈 잔기(청록색 선)가 이들 간의 상호작용을 묘사하는 것으로 도시된다. D. 엑소사이트-I에 결합된 아바트린 펩타이드 N-말단(노란색 스틱)의 4.5 Å 반경내 에서 트롬빈 잔기(청록색 선)는 그들 사이의 상호작용을 묘사하는 것으로 도시된다. E. (C)와 유사한 관점에서, 아바트린에 대한 계산된 전자 밀도 맵이 도시된다. 2Fo-Fc 맵(회색, 1.0 시그마 레벨에서 윤곽선) 및 Fo-FC 맵(양성 맵에서 녹색, 3.0 시그마에서 윤곽선, 음성 맵에서 빨간색, 3.0 시그마에서 윤곽선). F. (D)와 유사한 관점에서, 아바트린에 대한 계산된 전자 밀도 맵이 도시된다. 2Fo-Fc 맵(회색, 1.0 시그마 레벨에서 윤곽선) 및 Fo-FC 맵(양성 맵에서 녹색, 3.0 시그마에서 윤곽선, 음성 맵에서 빨간색, 3.0 시그마에서 윤곽선).
도 13은 아바트린에 의한 혈전(clot) 결합 트롬빈의 억제를 보여준다. 혈전-결합 트롬빈(0.81 nM)의 아미드 분해 활성에 대한 아바트린의 효과는 S2238 (100 μM)를 사용하여 측정되었다. 아바트린은 혈전 결합 트롬빈을 용량 의존적인 방식으로 1.74 ± 0.35 μM의 IC50로 억제한다.
도 14는 히루로그-1(hirulog-1)과 비교하여 염화 제2철-유도된 경동맥 혈전증 뮤린 모델에서 폐색 시간에 대한 아바트린의 효과를 보여준다. 100 μl 식염수(0.9%)에서 용해된 아바트린 또는 히루로그-1의 두개의 투약 용량(3 mg/kg 및 10 mg/kg)은 마우스(n=6)의 꼬리 정맥을 통해 정맥 내로 주사되었다. 혈전증은 10% FeCl3 가 포화된 여과지(2 mm x 2 mm)에 두어 유도되었고, FeCl3-유도된 혈전증 후에 폐색 시간(TTO)이 측정되었다. 대조군 동물은 100 μl 식염이 정맥 안으로 또는 복막으로 투여되었다(n=6). 대조군 동물에서 7.24 ± 1.46분인 TTO는 3 mg/kg 및 10 mg/kg 아바트린이 투여된 동물에서 각각 15.03 ± 3.23분 및 22.51 ± 4.19분까지 증가하였다. 3 mg/kg 및 10 mg/kg 히루로그-1가 투여된 마우스에서 TTO는 각각 9.76 ± 3.15분 및 15.23 ± 3.39분이었다. 두개 그룹간의 유의적인 차이점은 t-검정을 사용하여 계산되었다(*P<0.001). 이 모델에서 아바트린은 히루로그-1과 비교하여 더 나은 효능을 보여준다.
도 15는 바리어진 계의 펩타이드에 의한 트롬빈 아미드 분해 분석의 억제를 보여준다. 상이한 농도(0.0003 - 3000 nM)에서 선택된 펩타이드는 트롬빈을 억제하는 그들의 능력이 시험되었다. 암블리옴마 배리어가튬의 시아롬(sialome)으로부터 확인된 펩타이드, 울트라바리어진은 IC50이 0.26 ± 0.008 nM인 가장 강력한 펩타이드였다. 다른 모든 펩타이드는 14 내지 130 nM 범위의 IC50을 가졌다.
도 16은 울트라바리어진 변이체 UV003 및 UV004에 의한 트롬빈 억제를 보여준다. A 및 C. 트롬빈 아미드 분해 활성을 억제하는 그들의 능력에 대해 상이한 농도(0.03 nM 내지 100 nM)로 시험되었고 울트라바리어진과 비교되었다. UV003 및 UV004는 각각 0.60 ± 0.20 nM 및 0.46 ± 0.08 nM의 IC50 값으로 트롬빈을 억제하였다. B 및 D. UV003 및 UV004의 존재 하에서 잔류하는 트롬빈 아미드 분해 활성을 상이한 농도의 S2238에서 측정하였고 그들의 K i가 결정되었다. UV003 및 UV004의 K i는 각각 4.21 ± 0.96 pM 및 4.55 ± 0.37 pM으로 나타났다.
도 17은 울트라바리어진 변이체 UV005 및 UV011에 의한 트롬빈 억제를 보여준다. A 및 C. 트롬빈 아미드 분해 활성을 억제하는 그들의 능력에 대해 상이한 농도(0.03 nM 내지 100 nM)로 시험되었고 울트라바리어진과 비교하였다. UV005 및 UV011은 0.91 ± 0.47 pM 및 1.66 ± 0.77 nM 의 IC50 값으로 트롬빈을 억제하였다. B 및 D. UV005 및 UV001의 존재 하에서 잔류하는 트롬빈 아미드 분해 활성을 상이한 농도의 S2238에서 측정하였고 그들의 K i가 결정되었다. UV005 및 UV001의 K i는 16.0 ± 3.05 및 1387 ± 230 pM으로 나타났다.
도 18은 울트라바리어진 변이체 UV012, UV013, 바리어진 YS, UV007, UV008, UV014 및 UV015에 의한 트롬빈 억제를 보여준다. A, C 및 E. 트롬빈 아미드 분해 활성을 억제하는 그들의 능력에 대해 상이한 농도(0.003 nM 내지 3000 nM)로 시험되었고 울트라바리어진과 비교하였다. 다른 변이체의 IC50 값은 표 5에 기재되어있다. B 및 D. UV012, UV013, 바리어진 YS, UV007, UV008, UV014 및 UV015의 존재 하에서 강한-결합 억제제 방정식에 데이터를 적합시킴으로써 이들의 K i 값을 결정하는 것에 대해 잔류하는 트롬빈 아미드 분해 활성. 각 변이체의 K i 값은 표 4에 기재되어있다.
도 19는 울트라바리어진의 억제성 상수 K i를 보여준다. 바리어진 계의 가장 강력한 멤버인 울트라바리어진의 K i를 대표적으로 나타낸다. 울트라바리어진은 트롬빈에 강하게 결합하는 억제제이다. 상이한 농도의 울트라바리어진은 상이한 농도의 S2238(50 μM, 100 μM, 150 μM, 200 μM, 250 μM, 300 μM, 350 μM 및 400 μM)와 혼합되었고 Ki'가 결정되었다. 반응은 트롬빈(0.81 nM)의 첨가와 함께 시작되었다. 데이터는 GraphPad prizm 소프트웨어를 사용한 모리슨 방정식에 적합시켰다(n = 3, 오차 막대는 표준 편차를 나타냄). (B) 기질 농도에 대한 Ki'의 플롯은 선형적으로 증가하였고, 이는 울트라바리어진이 트롬빈의 아미드 분해 활성을 경쟁적으로 억제하였음을 나타내고, 억제성 상수 Ki는 4.4 ± 0.35 pM로 결정되었다(오차막대는 표준편차를 나타냄).
도 20은 트롬빈에 의한 울트라바리어진의 절단을 보여준다. 트롬빈과 함께 항온처리된 울트라바리어진의 시간 경과 분석은 울트라바리어진은 확실히 트롬빈에 의해 절단된다는 것을 보여주었다. 상이한 시간 포인트 동안 항온처리된 반응 혼합물의 RP-HPLC 분리는 절단 산물을 분리하고 정량화하기 위해 수행되었다. 울트라바리어진의 절단 산물의 정량화는 피크 통합(peak integration) 및 곡선 아래의 영역의 계산을 통해 이루어졌다. 트롬빈과 함께 항온처리하는 시간이 증가할수록, 울트라바리어진 전장의 양이 감소하고 Lys10-Met11 결합의 절단과 상응하는 절단 산물이 관측되었다. 18시간에 울트라바리어진은 완전히 절단되고, 오직 절단 산물에 상응하는 피크만 관측될 수 있었다.
도 21은 울트라바리어진의 세린 프로테아제 선택성을 보여준다. 울트라바리어진은 13개의 세린 프로테아제에 대하여 스크리닝되었다: 섬유소원 용해 세린 프로테아제(플라스민 및 TPA), 항응고제 세린 프로테아제(우로키나아제), 응혈 촉진성의 세린 프로테아제(FXIIa, FXIa, FXa, FIXa, FVIIa, 칼리크레인 및 트롬빈), 및 전형적인 세린 프로테아제(트립신 및 키모트립신). 트롬빈은 울트라바리어진의 세가지의 농도에 대하여 시험되었다: 100, 10 및 1 nM. 다른 프로테아제에 대하여 훨씬 더 높은 농도의 아바트린이 사용되었다: 100, 10 및 1 μM.
도 22는 리피세팔루스 산귀니어스(Rhipicephalus sanguineus) 펩타이드의 억제성 상수 K i를 보여준다. 리피세팔루스 산귀니어스 펩타이드의 K i를 상이한 농도의 S2238(50 μM, 100 μM, 150 μM, 200 μM, 250 μM, 300 μM, 350 μM 및 400 μM)로 상이한 농도의 펩타이드와 혼합하여 측정하였다. 반응은 트롬빈(0.81 nM)의 첨가와 함께 시작되었다. 데이터는 GraphPad prizm 소프트웨어를 사용한 모리슨 방정식에 적합하였다(n = 3, 오차 막대는 표준 편차를 나타냄). (B) 기질 농도에 대한 Ki' 플롯은 선형적으로 증가하였고, 이는 펩타이드는 경쟁적으로 트롬빈 아미드 분해 활성을 억제하고 억제성 상수 K i는 8.79 ± 0.65 nM로 결정되었다(오차 막대는 표준 편차를 나타냄).
도 23은 13개의 세린 프로테아제: 섬유소원 용해 세린 프로테아제(플라스민 및 TPA), 항응고제 세린 프로테아제(우로키나아제), 응혈촉진성의 세린 프로테아제(FXIIa, FXIa, FXa, FIXa, FVIIa, 칼리크레인 및 트롬빈), 및 전형적인 세린 프로테아제(트립신 및 키모트립신)에 대해 스크리닝된 리피세팔루스 산귀니어스 펩타이드의 세린 프로테아제 선택성을 보여준다. 트롬빈은 펩타이드의 세가지 농도: 1000, 100, 및 10 nM에 대하여 시험되었다. 다른 프로테아제에 대하여 훨씬 더 높은 농도의 펩타이드가 사용되었다:100, 10 및 1 μM.
도 24는 암블리옴마 아메리카눔(Amblyomma americanum ) 및 히알롬마 마르지나튬 루피프스(Hryalomma marginatum rufipes ) 펩타이드의 억제성 상수 K i를 보여준다. 두개 펩타이드의 K i는 상이한 농도의 S2238(50 μM, 100 μM, 150 μM, 200 μM, 250 μM, 300 μM, 350 μM 및 400 μM)로 상이한 농도의 펩타이드와 혼합하여 결정되었다. 반응은 트롬빈(0.81 nM)의 첨가와 함께 시작되었다. 데이터는 GraphPad prizm 소프트웨어를 사용한 모리슨 방정식에 적합하였다(n = 3, 오차 막대는 표준 편차를 나타냄). (B) 기질 농도에 대한 Ki' 플롯은 선형적으로 증가하였고, 이는 두개의 펩타이드 모두 트롬빈 아미드 분해 활성을 경쟁적으로 억제하는 것을 보여준다(오차 막대는 표준 편차를 나타냄). 암블리옴마 아메리카눔 및 히알롬마 마르지나튬 루피프스의 펩타이드의 K i는 각각 1.63 ± 0.61 nM 및 6.135 ± 0.39 nM로 결정되었다.
도 25는 (A) 암블리옴마 아메리카눔 펩타이드 및 (B) 히알롬마 마르지나튬 루피프스의 세린 프로테아제 선택성을 보여준다. 두개의 펩타이드는 섬유소원 용해 세린 프로테아제(플라스민 및 TPA), 항응고제 세린 프로테아제(우로키나아제), 응혈촉진성의 세린 프로테아제(FXIIa, FXIa, FXa, FIXa, FVIIa, 칼리크레인 및 트롬빈), 전형적인 세린 프로테아제(트립신 및 키모트립신)에 대하여 스크리닝되었다. 트롬빈은 펩타이드의 세가지 농도: 1000, 100 및 10 nM에 대하여 시험되었다. 다른 프로테아제에 대하여 훨씬 더 높은 농도의 펩타이드가 사용되었다: 100, 10 및 1 μM.
도 26은 피를 뽑은 후에 상이한 시점에서 측정된, 상이한 트롬빈 억제제 히루딘, 울트라바리어진, 아바트린, 바리어진 및 시트레이트로 항응고된 혈액에서 ADP-유도된 혈소판 응집에 대한 반응을 도시한다.
도 27은 아바트린 및 트롬빈 엑소사이트에 대한 다른 억제제를 보여준다. 트롬빈 엑소사이트의 표면 표현은 청록색으로 표시되고; 트롬빈 억제제는 스틱 모델로 표시된다. 아바트린(노란색), 바리어진(자홍색) 및 히루로그-1(녹색)의 C-말단 부분은 덮어씌워진다.
도 28은 암블리옴마 배리어가튬, 암블리옴마 아메리카눔 및 암블리옴마 카제네스(Amblyomma cajannense)의 침샘의 전사체로부터 동정된 바리어진 및 관련 펩타이드와 아바트린의 서열 얼라이먼트를 보여준다. 각 전사체는 3 내지 5개의 성숙한 펩타이드로 번역후 절단되는 전구체 단백질을 코딩한다. 오직 하나의 각 전사체로부터의 대표적인 펩타이드 서열이 도시된다.
본 명세서에 언급된 참고 문헌은 편의상 참고 문헌의 리스트 형태로 나열되어 있고 실시예의 마지막에 추가되어있다. 참고 문헌의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
도 2는 아바트린의 합성 및 정제를 보여준다. 아바트린은 고체상 펩타이드 합성을 사용하여 합성되었고 역상크로마토그래피를 사용하여 정제되었다. A. 10% 용리제 B 내지 70% 용리제 B의 아세토나이트릴 구배(용리제 A: 0% ACN, 99.9% MilliQ water 및 0.1% TFA; 용리제 B: 0% ACN, 99.9% MilliQ water 및 0.1% TFA)를 사용한 Jupiter Proteo (5 μm, 250 mm X 10 mm, 90 Å) 역상 컬럼에서 아바트린의 정제. B. 10 mM 인산 나트륨 완충액(pH 7.4)에서 용해된 아바트린 및 이의 절단된 변이체의 Far-UV CD 스펙트럼(260 - 190 nm) - IS20. 두개의 스펙트럼은 랜덤 코일의 전형적인 것이다. C. 아바트린의 순도 및 질량은 ESI-MS에 의해 측정되었다. 아바트린은 3가지의 상이한 전하 상태에서 이온화되고, +4, +3 및 +2 전하 상태에 따라 각각 m/z 값이 785.84 amu, 1047.55 amu 및 1570.58 amu로 보여졌다. D. 아바트린의 디콘볼루티드(Deconvoluted) 질량 스펙트럼은 아바트린의 관측된 질량이 예상한 질량인 3139.65 ± 0.83 Da와 일치한다는 것을 보여주었다(표 1).
도 3은 아바트린의 트롬빈 억제성의 활성을 보여준다. A. 트롬빈(0.81 nM)의 아미드 분해(amidolytic) 활성에 대한 아바트린의 다양한 농도의 효과는 10분 동안 전-배양(pre-incubation) 또는 전-배양 없이 S2238 (100 μM)을 사용하여 측정되었다. 아바트린은 용량 의존적 방식으로 트롬빈 아미드 분해 활성의 억제를 보여준다. 억제의 IC50 및 힐 슬롭(Hill slope)은 각각 0분에서 6.95 ± 0.42 nM 및 0.92 ± 0.01; 및 10분에서 4.86 ± 0.36 nM 및 0.94 ± 0.02 nM이다. 각 데이터 포인트는 적어도 세개 실험의 평균 ± 표준 편차이다. B. 다양한 농도의 아바트린 존재 하에서 S2238 (100 μM)을 사용한 트롬빈(0.81 nM) 아미드 분해 분석이 수행되었고 아바트린 존재 하에서 트롬빈 억제의 선형 증가 곡선이 얻어졌다 - 빠른 결합 억제제의 특성. C. 아바트린의 다양한 농도 존재 하에서 잔류하는 트롬빈 아미드 분해 활성은 상이한 농도의 S2238에서 측정되었고 K i'(겉보기의 K i)가 결정되었다. 반응은 트롬빈(0.81 nM)의 첨가로 시작되었다. 데이터는 GraphPad Prizm 소프트웨어를 사용한 Morrison tight binding equation에 맞춰졌다. 각 데이터 포인트는 적어도 세개 실험의 평균 ± 표준 편차이다. D. S2238 농도에 대한 K i'의 플롯은 선형적으로 증가하고, 이는 아바트린이 경쟁적인 억제제임을 나타낸다. 억제성 상수 K i는 545.3 ± 3.1 pM으로 결정되었다.
도 4는 트롬빈 섬유소원 용해 활성의 억제를 보여주고, 아바트린, IS20, GL16 및 울트라바리어진은 용량 의존적 방식으로 피브리노겐 응고 시간을 지연시켰다.
도 5는 아바트린의 세린 프로테아제 선택성을 보여준다. 아바트린은 응혈원, 항응고제, 섬유소원 용해 및 전형적인 세린 프로테아제를 포함하는 13개의 세린 프로테아제(트롬빈, 트립신, fIXa, fXIa, fXa, 키모트립신, tPA, fVIIa, 플라스민, APC, 칼리크레인(kallikrein), 우로키나아제 및 fXIIa)에 대한 선택성이 스크리닝되었다. 아미드 분해 분석에서 사용된 프로테아제 및 기질의 최종 농도는 다른 기재가 없으면 각각 괄호 안의 nM 및 μM으로 주어진다: α-트롬빈/S2238 (0.81/100), 트립신/S2222 (0.87/100), fIXa//Spectrozyme® fIXa (333/0.4), fXIa/S2366 (0.125/1000), fXa/S2765 (0.24/650), 키모트립신/S2586 (1.2/0.67), tPA/S2288 (36.9/1000), fVIIa/S2288 (460/1200), 플라스민/S2251 (3.61/1200), APC/S2366 (2.74/600), 칼리크레인/S2302 (0.93/1100), 우로키나아제/S2444 (32 U/ml/650), fXIIa/S2302 (20/1000). 트롬빈의 활성은 아바트린의 더 낮은 농도(1000 nM, 100 nM 및 10 nM)에서 시험되었고 반면에 다른 프로테아제는 아바트린의 훨씬 더 높은 농도(100 μM, 10 μM 및 1 μM)에서 시험되었다. 각 데이터 포인트는 적어도 세개 독립된 실험의 평균 ± 표준편차이다.
도 6은 트롬빈에 의한 아바트린의 절단을 보여준다. A. 트롬빈에 의한 아바트린 절단의 HPLC 크로마토그램에 의한 평가. 아바트린(150 μM)은 다양한 시간 동안 트롬빈(5 μM)과 함께 항온처리되었고 반응 혼합물은 RP-HPLC을 사용하여 분리되었다; 절단 산물의 질량은 ESI-MS로 분석되었다. 0분(상부 패널)에서, 전장(full length) 아바트린(질량 3139 Da)에 상응하는 단일 피크가 확인되었다. 120분(중간 패널)에서, 아바트린 피크뿐만 아니라 N-말단 절단 산물(SGGHQTAVPK; 질량 982 Da) 및 C-말단 절단 산물(ISKQGLGGDFEEIPSDEIIE; 질량 2176 Da)에 상응하는 두개의 새로운 피크가 확인되었다. 600분(하부 패널)에서, N- 및 C-말단 절단 산물에 상응하는 두개의 피크가 관측된 반면에 아바트린 피크는 관측되지 않았고, 이는 완전한 절단을 의미한다. B. 트롬빈에 의한 시간-의존적 아바트린의 절단. 아바트린, 그것의 N- 및 C-말단 절단 산물의 상대 백분율은 곡선 아래 부분을 계산함으로써 측정되었다. 각 데이터 포인트는 적어도 세개 독립된 실험의 평균 ± 표준 편차이다. C. 아바트린의 억제성 성질에 대한 트롬빈 절단의 효과. 아바트린은 트롬빈(0.81 nM)과 함께 최대 36시간 동안 항온처리되었고, 발색 기질 S2238에 대한 트롬빈 아미드 분해 활성을 억제하는 그것의 능력에 대해 상이한 시점에서 분석되었다. 아바트린 25 nM에서, 억제제는 트롬빈(0.81 nm)의 30배 과잉으로 존재하였고, 이 비율은 절단 산물의 HPLC 분석에서 사용된 것과 유사하다. 비록 약 10시간에 전장 아바트린이 완전히 절단되었지만, 24시간 후에 절단 산물은 원래의 억제성 활성의 >50%으로 유지되었다. 따라서 절단 산물, 특히 아바트린의 C-말단 절단 산물은 트롬빈에 결합된 채로 나타나고 트롬빈을 계속해서 억제한다. 각 데이터 포인트는 적어도 세개 독립된 실험의 평균 ± 표준편차이다.
도 7은 트롬빈 아미드 분해 활성에 대한 절단된 아바트린 돌연변이의 효과를 보여준다. A. 트롬빈(0.81 nM)의 아미드 분해 활성에 대한 QT26 및 IS20의 효과를 측정하였다. 두개의 펩타이드는 트롬빈을 용량 의존적인 방식으로 억제한다. QT26은 각각 0분에 8.94 ± 0.64 nM 및 0.88 ± 0.03; 10분에 13.54 ± 0.81 및 0.92 ± 0.03인 IC50 및 힐 슬롭을 가졌다. IS20은 각각 0분에 12.38 ± 0.32 nM 및 0.86 ± 0.02; 10분에 22.70 ± 0.94 nM 및 0.87 ± 0.01인 IC50 및 힐 슬롭을 가졌다. 각 데이터 포인트는 적어도 세개 독립된 실험의 평균 ± 표준편차이다. B. GL16 (3, 10, 30, 100, 및 300 μM)은 트롬빈의 아미드 분해 활성을 억제할 수 없었다; 대신에 높은 농도에서, 약간 트롬빈에 의한 S2238 가수분해를 약간 증가시켰다. 각 데이터 포인트는 적어도 세개 독립된 실험의 평균 ± 표준편차이다. C 및 D. QT26 및 IS20 존재 하에서 트롬빈 아미드 분해 활성이 측정되었고 K i(겉보기의 K i)가 결정되었다. QT26 및 IS20 둘다 강하게 결합하는 억제제였다. 각 데이터 포인트는 적어도 세개 실험의 평균 ± 표준편차이다. E. S2238 농도에 대한 K i' 플롯은 선형적으로 증가했고, 이는 QT26는 경쟁적인 억제제인 것을 나타낸다. 억제성 상수 K i는 760.32 ± 0.91 pM로 결정되었다. F. S2238 농도에 대한 K i' 플롯은 곡선으로 감소했고, 이는 IS20이 비-경쟁적인 억제제인 것을 나타낸다(α<1임). 억제성 상수 K i는 5760 ± 230 pM로 결정되었다.
도 8은 아바트린과 비교하여 아바트린 변이체의 트롬빈 아미드 분해 활성에 대한 효과를 보여준다. 모든 변이체는 용량 의존적인 방식으로 트롬빈 활성을 억제하였다. A. S12A는 각각 101.20 ± 1.32 nM 및 0.62 ± 0.01인 IC50 및 힐 슬롭을 가졌다. S12A의 IC50는 아바트린보다 20배 낮았고, 이는 트롬빈 억제를 위한 아바트린에서 Ser12의 중요성을 보여준다. S12H는 각각 18.51 ± 0.32 nM 및 0.88 ± 0.02인 IC50 및 힐 슬롭을 가졌다. 각 데이터 포인트는 적어도 세개 실험의 평균 ± 표준편차이다. B. L16P, G17P는 각각 181.32 ± 3.76 nM 및 0.54 ± 0.02인 IC50 및 힐 슬롭을 가졌다. G2D, Q5D는 각각 12.98 ± 1.23 nM 및 0.71 ± 0.03인 IC50 및 힐 슬롭을 가졌다. 각 데이터 포인트는 적어도 세개 독립된 실험의 평균 ± 표준편차이다. C. β-아바트린은 각각 332.16 ± 1.32 nM 및 0.62 ± 0.01인 IC50 및 힐 슬롭을 가졌다. 비록 β-아바트린은 최대 72시간 동안 절단되지 않았지만, 이의 효력에 있어 심각한 저하가 있었다. 각 데이터 포인트는 적어도 세개 독립된 실험의 평균 ± 표준편차이다. D. K10R은 각각 1.15 ± 0.45 nM 및 1.10 ± 0.01인 IC50 및 힐 슬롭을 가졌다. K10R은 활성에 있어 5배를 얻었지만 아바트린(3시간)에 비해 훨씬 더 빠른 속도로 절단되었다. 각 데이터 포인트는 적어도 세개 독립된 실험의 평균 ± 표준편차이다. E. β-바리어진은 각각 117.90 ± 1.16 nM 및 0.93 ± 0.05인 IC50 및 힐 슬롭을 가졌다. 각 데이터 포인트는 적어도 세개 독립된 실험의 평균 ± 표준편차이다.
도 9는 트롬빈에 의한 아바트린 변이체 K10R (A) 및 β-아바트린 (B)의 절단에 대한 HPLC 크로마토그램을 보여준다. 펩타이드는 다양한 시간 동안 트롬빈과 함께 항온처리되었고 반응 혼합물은 RP-HPLC을 사용하여 분리되었고 절단 산물의 질량은 ESI-MS를 사용하여 분석하였다. 3시간 후(아바트린보다 훨씬 더 빠른 속도) K10R-아바트린이 완전히 절단되는데 반하여, β-아바트린은 72시간 후에도 절단되지 않았다.
도 10은 아바트린 변이체의 억제에 대한 동력학적 파라미터를 보여준다. A. S12H, B. G2D,Q5D 및 C. K10R 존재 하에 잔류하는 트롬빈 아미드 분해 활성은 S2238의 상이한 농도에서 측정되었고 K i(겉보기의 K i)가 측정되었다. 반응은 트롬빈(0.81 nM)의 첨가와 함께 시작되었다. S12H, G2D, Q5D 및 K10R은 각각 1.23 ± 0.04 nM, 0.93 ± 0.01 nM 및 0.17 ± 0.00 nM의 Ki 값을 가지며, 강하게 결합하는 트롬빈 억제제였다. 각 데이터 포인트는 적어도 세개 독립된실험의 평균 ± 표준편차이다.
도 11은 β-아바트린 및 S12A에 의한 트롬빈의 억제에 대한 라인위버-버크(Lineweaver-Burke) 플롯을 보여준다. β-아바트린(300 nM; A) 및 S12A (30 nM; B) 존재 하에 잔류하는 트롬빈 아미드 분해 활성은 S2238의 다양한 농도에서 측정되었다(실선, 억제제 없음; 점선, 억제제 있음). β-아바트린 및 S12A 둘다 등몰 농도에서 트롬빈을 억제할 수 없었기 때문에, 그들은 강하게 결합하는 트롬빈의 억제제가 아니다. 이중 역수 플롯은 β-아바트린 및 S12A는 각각 32.04 ± 0.36 nM 및 6.07 ± 0.18 nM의 K i 값을 가졌음을 보여준다. 각 데이터 포인트는 적어도 세개 독립된 실험의 평균 ± 표준편차이다.
도 12는 아바트린 트롬빈 복합체의 결정 구조의 모델을 보여준다. A. 트롬빈-아바트린 복합체의 개요. 아바트린은 청록색으로 도시되는 트롬빈의 표면 표현과 함께 스틱 모델(탄소: 노랑색; 질소: 파란색; 산소: 빨간색)로 도시된다. 6개의 잔기 A(5QTAVPK10) 및 10개의 잔기 A(19DFEEIPSDEI28)는 트롬빈 활성 위치 및 엑소사이트-1 틈의 근접한 곳에서 확인되었다. B. (A)와 유사한 관점에서, 아바트린에 대한 계산된 전자 밀도 맵이 도시된다. 2Fo-Fc 맵(회색, 1.0 시그마 레벨에서 윤곽선) 및 Fo-FC 맵(양성 맵에서 녹색, 3.0 시그마에서 윤곽선, 음성 맵에서 빨간색, 3.0 시그마에서 윤곽선). C. 잘리기 쉬운 결합에 대한 아바트린 펩타이드 N-말단(노란색 스틱)의 4.5 Å 반경 내에서 트롬빈 잔기(청록색 선)가 이들 간의 상호작용을 묘사하는 것으로 도시된다. D. 엑소사이트-I에 결합된 아바트린 펩타이드 N-말단(노란색 스틱)의 4.5 Å 반경내 에서 트롬빈 잔기(청록색 선)는 그들 사이의 상호작용을 묘사하는 것으로 도시된다. E. (C)와 유사한 관점에서, 아바트린에 대한 계산된 전자 밀도 맵이 도시된다. 2Fo-Fc 맵(회색, 1.0 시그마 레벨에서 윤곽선) 및 Fo-FC 맵(양성 맵에서 녹색, 3.0 시그마에서 윤곽선, 음성 맵에서 빨간색, 3.0 시그마에서 윤곽선). F. (D)와 유사한 관점에서, 아바트린에 대한 계산된 전자 밀도 맵이 도시된다. 2Fo-Fc 맵(회색, 1.0 시그마 레벨에서 윤곽선) 및 Fo-FC 맵(양성 맵에서 녹색, 3.0 시그마에서 윤곽선, 음성 맵에서 빨간색, 3.0 시그마에서 윤곽선).
도 13은 아바트린에 의한 혈전(clot) 결합 트롬빈의 억제를 보여준다. 혈전-결합 트롬빈(0.81 nM)의 아미드 분해 활성에 대한 아바트린의 효과는 S2238 (100 μM)를 사용하여 측정되었다. 아바트린은 혈전 결합 트롬빈을 용량 의존적인 방식으로 1.74 ± 0.35 μM의 IC50로 억제한다.
도 14는 히루로그-1(hirulog-1)과 비교하여 염화 제2철-유도된 경동맥 혈전증 뮤린 모델에서 폐색 시간에 대한 아바트린의 효과를 보여준다. 100 μl 식염수(0.9%)에서 용해된 아바트린 또는 히루로그-1의 두개의 투약 용량(3 mg/kg 및 10 mg/kg)은 마우스(n=6)의 꼬리 정맥을 통해 정맥 내로 주사되었다. 혈전증은 10% FeCl3 가 포화된 여과지(2 mm x 2 mm)에 두어 유도되었고, FeCl3-유도된 혈전증 후에 폐색 시간(TTO)이 측정되었다. 대조군 동물은 100 μl 식염이 정맥 안으로 또는 복막으로 투여되었다(n=6). 대조군 동물에서 7.24 ± 1.46분인 TTO는 3 mg/kg 및 10 mg/kg 아바트린이 투여된 동물에서 각각 15.03 ± 3.23분 및 22.51 ± 4.19분까지 증가하였다. 3 mg/kg 및 10 mg/kg 히루로그-1가 투여된 마우스에서 TTO는 각각 9.76 ± 3.15분 및 15.23 ± 3.39분이었다. 두개 그룹간의 유의적인 차이점은 t-검정을 사용하여 계산되었다(*P<0.001). 이 모델에서 아바트린은 히루로그-1과 비교하여 더 나은 효능을 보여준다.
도 15는 바리어진 계의 펩타이드에 의한 트롬빈 아미드 분해 분석의 억제를 보여준다. 상이한 농도(0.0003 - 3000 nM)에서 선택된 펩타이드는 트롬빈을 억제하는 그들의 능력이 시험되었다. 암블리옴마 배리어가튬의 시아롬(sialome)으로부터 확인된 펩타이드, 울트라바리어진은 IC50이 0.26 ± 0.008 nM인 가장 강력한 펩타이드였다. 다른 모든 펩타이드는 14 내지 130 nM 범위의 IC50을 가졌다.
도 16은 울트라바리어진 변이체 UV003 및 UV004에 의한 트롬빈 억제를 보여준다. A 및 C. 트롬빈 아미드 분해 활성을 억제하는 그들의 능력에 대해 상이한 농도(0.03 nM 내지 100 nM)로 시험되었고 울트라바리어진과 비교되었다. UV003 및 UV004는 각각 0.60 ± 0.20 nM 및 0.46 ± 0.08 nM의 IC50 값으로 트롬빈을 억제하였다. B 및 D. UV003 및 UV004의 존재 하에서 잔류하는 트롬빈 아미드 분해 활성을 상이한 농도의 S2238에서 측정하였고 그들의 K i가 결정되었다. UV003 및 UV004의 K i는 각각 4.21 ± 0.96 pM 및 4.55 ± 0.37 pM으로 나타났다.
도 17은 울트라바리어진 변이체 UV005 및 UV011에 의한 트롬빈 억제를 보여준다. A 및 C. 트롬빈 아미드 분해 활성을 억제하는 그들의 능력에 대해 상이한 농도(0.03 nM 내지 100 nM)로 시험되었고 울트라바리어진과 비교하였다. UV005 및 UV011은 0.91 ± 0.47 pM 및 1.66 ± 0.77 nM 의 IC50 값으로 트롬빈을 억제하였다. B 및 D. UV005 및 UV001의 존재 하에서 잔류하는 트롬빈 아미드 분해 활성을 상이한 농도의 S2238에서 측정하였고 그들의 K i가 결정되었다. UV005 및 UV001의 K i는 16.0 ± 3.05 및 1387 ± 230 pM으로 나타났다.
도 18은 울트라바리어진 변이체 UV012, UV013, 바리어진 YS, UV007, UV008, UV014 및 UV015에 의한 트롬빈 억제를 보여준다. A, C 및 E. 트롬빈 아미드 분해 활성을 억제하는 그들의 능력에 대해 상이한 농도(0.003 nM 내지 3000 nM)로 시험되었고 울트라바리어진과 비교하였다. 다른 변이체의 IC50 값은 표 5에 기재되어있다. B 및 D. UV012, UV013, 바리어진 YS, UV007, UV008, UV014 및 UV015의 존재 하에서 강한-결합 억제제 방정식에 데이터를 적합시킴으로써 이들의 K i 값을 결정하는 것에 대해 잔류하는 트롬빈 아미드 분해 활성. 각 변이체의 K i 값은 표 4에 기재되어있다.
도 19는 울트라바리어진의 억제성 상수 K i를 보여준다. 바리어진 계의 가장 강력한 멤버인 울트라바리어진의 K i를 대표적으로 나타낸다. 울트라바리어진은 트롬빈에 강하게 결합하는 억제제이다. 상이한 농도의 울트라바리어진은 상이한 농도의 S2238(50 μM, 100 μM, 150 μM, 200 μM, 250 μM, 300 μM, 350 μM 및 400 μM)와 혼합되었고 Ki'가 결정되었다. 반응은 트롬빈(0.81 nM)의 첨가와 함께 시작되었다. 데이터는 GraphPad prizm 소프트웨어를 사용한 모리슨 방정식에 적합시켰다(n = 3, 오차 막대는 표준 편차를 나타냄). (B) 기질 농도에 대한 Ki'의 플롯은 선형적으로 증가하였고, 이는 울트라바리어진이 트롬빈의 아미드 분해 활성을 경쟁적으로 억제하였음을 나타내고, 억제성 상수 Ki는 4.4 ± 0.35 pM로 결정되었다(오차막대는 표준편차를 나타냄).
도 20은 트롬빈에 의한 울트라바리어진의 절단을 보여준다. 트롬빈과 함께 항온처리된 울트라바리어진의 시간 경과 분석은 울트라바리어진은 확실히 트롬빈에 의해 절단된다는 것을 보여주었다. 상이한 시간 포인트 동안 항온처리된 반응 혼합물의 RP-HPLC 분리는 절단 산물을 분리하고 정량화하기 위해 수행되었다. 울트라바리어진의 절단 산물의 정량화는 피크 통합(peak integration) 및 곡선 아래의 영역의 계산을 통해 이루어졌다. 트롬빈과 함께 항온처리하는 시간이 증가할수록, 울트라바리어진 전장의 양이 감소하고 Lys10-Met11 결합의 절단과 상응하는 절단 산물이 관측되었다. 18시간에 울트라바리어진은 완전히 절단되고, 오직 절단 산물에 상응하는 피크만 관측될 수 있었다.
도 21은 울트라바리어진의 세린 프로테아제 선택성을 보여준다. 울트라바리어진은 13개의 세린 프로테아제에 대하여 스크리닝되었다: 섬유소원 용해 세린 프로테아제(플라스민 및 TPA), 항응고제 세린 프로테아제(우로키나아제), 응혈 촉진성의 세린 프로테아제(FXIIa, FXIa, FXa, FIXa, FVIIa, 칼리크레인 및 트롬빈), 및 전형적인 세린 프로테아제(트립신 및 키모트립신). 트롬빈은 울트라바리어진의 세가지의 농도에 대하여 시험되었다: 100, 10 및 1 nM. 다른 프로테아제에 대하여 훨씬 더 높은 농도의 아바트린이 사용되었다: 100, 10 및 1 μM.
도 22는 리피세팔루스 산귀니어스(Rhipicephalus sanguineus) 펩타이드의 억제성 상수 K i를 보여준다. 리피세팔루스 산귀니어스 펩타이드의 K i를 상이한 농도의 S2238(50 μM, 100 μM, 150 μM, 200 μM, 250 μM, 300 μM, 350 μM 및 400 μM)로 상이한 농도의 펩타이드와 혼합하여 측정하였다. 반응은 트롬빈(0.81 nM)의 첨가와 함께 시작되었다. 데이터는 GraphPad prizm 소프트웨어를 사용한 모리슨 방정식에 적합하였다(n = 3, 오차 막대는 표준 편차를 나타냄). (B) 기질 농도에 대한 Ki' 플롯은 선형적으로 증가하였고, 이는 펩타이드는 경쟁적으로 트롬빈 아미드 분해 활성을 억제하고 억제성 상수 K i는 8.79 ± 0.65 nM로 결정되었다(오차 막대는 표준 편차를 나타냄).
도 23은 13개의 세린 프로테아제: 섬유소원 용해 세린 프로테아제(플라스민 및 TPA), 항응고제 세린 프로테아제(우로키나아제), 응혈촉진성의 세린 프로테아제(FXIIa, FXIa, FXa, FIXa, FVIIa, 칼리크레인 및 트롬빈), 및 전형적인 세린 프로테아제(트립신 및 키모트립신)에 대해 스크리닝된 리피세팔루스 산귀니어스 펩타이드의 세린 프로테아제 선택성을 보여준다. 트롬빈은 펩타이드의 세가지 농도: 1000, 100, 및 10 nM에 대하여 시험되었다. 다른 프로테아제에 대하여 훨씬 더 높은 농도의 펩타이드가 사용되었다:100, 10 및 1 μM.
도 24는 암블리옴마 아메리카눔(Amblyomma americanum ) 및 히알롬마 마르지나튬 루피프스(Hryalomma marginatum rufipes ) 펩타이드의 억제성 상수 K i를 보여준다. 두개 펩타이드의 K i는 상이한 농도의 S2238(50 μM, 100 μM, 150 μM, 200 μM, 250 μM, 300 μM, 350 μM 및 400 μM)로 상이한 농도의 펩타이드와 혼합하여 결정되었다. 반응은 트롬빈(0.81 nM)의 첨가와 함께 시작되었다. 데이터는 GraphPad prizm 소프트웨어를 사용한 모리슨 방정식에 적합하였다(n = 3, 오차 막대는 표준 편차를 나타냄). (B) 기질 농도에 대한 Ki' 플롯은 선형적으로 증가하였고, 이는 두개의 펩타이드 모두 트롬빈 아미드 분해 활성을 경쟁적으로 억제하는 것을 보여준다(오차 막대는 표준 편차를 나타냄). 암블리옴마 아메리카눔 및 히알롬마 마르지나튬 루피프스의 펩타이드의 K i는 각각 1.63 ± 0.61 nM 및 6.135 ± 0.39 nM로 결정되었다.
도 25는 (A) 암블리옴마 아메리카눔 펩타이드 및 (B) 히알롬마 마르지나튬 루피프스의 세린 프로테아제 선택성을 보여준다. 두개의 펩타이드는 섬유소원 용해 세린 프로테아제(플라스민 및 TPA), 항응고제 세린 프로테아제(우로키나아제), 응혈촉진성의 세린 프로테아제(FXIIa, FXIa, FXa, FIXa, FVIIa, 칼리크레인 및 트롬빈), 전형적인 세린 프로테아제(트립신 및 키모트립신)에 대하여 스크리닝되었다. 트롬빈은 펩타이드의 세가지 농도: 1000, 100 및 10 nM에 대하여 시험되었다. 다른 프로테아제에 대하여 훨씬 더 높은 농도의 펩타이드가 사용되었다: 100, 10 및 1 μM.
도 26은 피를 뽑은 후에 상이한 시점에서 측정된, 상이한 트롬빈 억제제 히루딘, 울트라바리어진, 아바트린, 바리어진 및 시트레이트로 항응고된 혈액에서 ADP-유도된 혈소판 응집에 대한 반응을 도시한다.
도 27은 아바트린 및 트롬빈 엑소사이트에 대한 다른 억제제를 보여준다. 트롬빈 엑소사이트의 표면 표현은 청록색으로 표시되고; 트롬빈 억제제는 스틱 모델로 표시된다. 아바트린(노란색), 바리어진(자홍색) 및 히루로그-1(녹색)의 C-말단 부분은 덮어씌워진다.
도 28은 암블리옴마 배리어가튬, 암블리옴마 아메리카눔 및 암블리옴마 카제네스(Amblyomma cajannense)의 침샘의 전사체로부터 동정된 바리어진 및 관련 펩타이드와 아바트린의 서열 얼라이먼트를 보여준다. 각 전사체는 3 내지 5개의 성숙한 펩타이드로 번역후 절단되는 전구체 단백질을 코딩한다. 오직 하나의 각 전사체로부터의 대표적인 펩타이드 서열이 도시된다.
본 명세서에 언급된 참고 문헌은 편의상 참고 문헌의 리스트 형태로 나열되어 있고 실시예의 마지막에 추가되어있다. 참고 문헌의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
발명의 상세한 설명
정의
편의상 본 명세서, 실시예, 첨부된 청구항에 채용된 특정 용어를 여기에 모아놓았다.
본 발명에서 용어 "포함하는"은 다양한 구성요소, 성분 또는 단계가 본 발명을 실시하는데 함께 사용될 수 있는 것으로 정의된다. 그에 따라, 용어 "포함하는"은 더 제한적인 용어 "본질적으로 구성되는" 및 "구성되는"을 아우르는 것이다.
본 발명에서 용어 "분리된"은 자연적으로 발생되는 생물체의 세포 내 다른 생물학적 구성요소, 예를 들어, 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 및 단백질로부터 실질적으로 분리되거나 그로부터 떨어져 생성되거나, 그로부터 정제된(핵산, 펩타이드 또는 단백질과 같은) 생물학적 구성요소로 정의된다. 따라서 분리된 핵산, 펩타이드 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 및 단백질을 포함한다. 용어는 또한 화학적으로 합성된 핵산뿐만 아니라 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 핵산, 펩타이드 및 단백질을 포함한다.
본 발명에서 용어 "변이체"는 적어도 하나의 핵산의 치환, 결실 또는 첨가를 통한 표준 서열로부터 변이된 적어도 하나의 핵산 서열을 가지지만 트롬빈을 인식하고 결합하고 억제하는 능력을 보유한 아미노산 서열을 코딩하는 것으로 정의된다. 용어 "변이체"는 또한 적어도 하나의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가를 통한 적어도 하나의 표준 서열로부터 변이되지만, 트롬빈을 인식하고, 결합하고 억제하는 능력을 보유한 아미노산 서열에 적용된다. 특히, 변이체는 자연적으로 발생될 수 있거나 재조합 또는 합성하여 생산될 수 있다. 보다 특히, 변이체는 표준 서열과 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 예를 들어, 서열번호 7에 제시된 아바트린KIOR 아미노산 서열은 서열번호 1에 제시된 아바트린 아미노산 서열에서 아미노산을 치환함으로써 생성되었고 서열번호 1의 변이체로 간주될 수 있다. 용어 "변이체"는 "보존적인" 변화를 갖는 트롬빈의 펩타이드 억제제를 포함할 수 있으며, 여기에서 치환된 아미노산이 유사한 구조적 또는 화학적인 특성을 가진다(예를 들어, 류신을 이소류신으로 교체함). 보다 드물게, 변이체는 "비-보존적" 변화를 가질 수 있다(예를 들어, 글라이신을 트립토판으로 교체함). 유사한 사소한 변이는 또한 아미노산 결실 또는 삽입 또는 둘 다 모두를 포함할 수 있다. 어떤 아미노산 잔기가 생물학적 활성을 저해하지 않고 치환, 삽입 또는 결실될 수 있는지를 결정하는 지침은 당업계에 잘 알려진 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 DNASTAR® 소프트웨어를 사용하여 찾을 수 있다(DNASTAR, Inc. Madison, Wisconsin, USA). 변이체의 다른 형태는 서열번호 9에 "X"로 제시된 β-울트라바리어진(SDEAVRAIPXMYSTAPPGDFEEIPDDAIEE)에서 베타-호모아르기닌과 같은 변이된 아미노산으로의 아미노산 치환을 포함한다. 서열 목록의 목적상, 베타-호모아르기닌은 "X" 또는 "Xaa"로 표시될 것이다.
본 발명에서 용어 "단편"은 하나 이상의 아미노산으로 변이되지만 표준 서열로서 트롬빈 상의 동일한 형태학적 에피토프을 인식하고 결합하는 능력을 보유하는 아미노산 서열을 의미한다. 예를 들어, 서열번호 3에 제시된QTAVPKISKQGLGGDFEEIPSDEIIE(QT26) 아미노산 서열은 서열번호 1(SGGHQTAVPKISKQGLGGDFEEIPSDEIIE)에 제시된 아바트린 서열보다 더 짧으며, 트롬빈을 인식하고, 결합하고 억제하는 능력을 보유하고 있기 때문에, 서열번호 1의 단편으로 간주될 수 있다. 마찬가지로, 서열번호 4에 제시된 IS20(ISKQGLGGDFEEIPSDEIIE) 아미노산 서열은 서열번호 1(SGGHQTAVPKISKQGLGGDFEEIPSDEIIE)에 제시된 아바트린 서열보다 짧으며, 트롬빈을 인식하고, 결합하고 억제하는 능력을 보유하기 때문에 서열번호 1의 단편으로 간주될 수 있다.
본 발명에서 용어 "샘플"은 그것의 가장 넓은 의미로 사용된다. 트롬빈을 포함하는 것으로 의심되는 생물학적 샘플은 체액 또는 조직을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "치료"는 예방을 위한, 개선하기 위한, 치료학적인 또는 치유력이 있는 치료를 의미한다.
본 발명에서 용어 "개체"는 척추동물, 특히 포유동물, 보다 특히 인간을 의미한다. 연구의 목적상, 개체는 특히 예를 들어, 마우스, 래트, 및 이와 유사한 것인 적어도 하나의 동물 모델이 될 수 있다. 특히, 혈전 및/또는 혈전-연관된 질병의 치료를 위해, 개체는 인간일 수 있다.
본 발명의 한 양태에서 SGGHQTAVPKISKQGLGGDFEEIPSDEIIE (서열번호 1), 이의 변이체 또는 단편, SDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEE (서열번호 2), 이의 변이체 또는 단편, 서열번호 22, 이의 변이체 또는 단편, 서열번호 23, 이의 변이체 또는 단편, 서열번호 24, 이의 변이체 또는 단편, 및 서열번호 25, 이의 변이체 또는 단편 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 트롬빈 억제제를 제공한다. 본 발명에 개시된 바와 같이 이러한 서열은 변이될 수 있지만, 여전히 트롬빈 활성을 억제하는 능력을 보유한 것으로 이해될 수 있다.
예를 들어, 서열번호 1 및 서열번호 2의 잔기 7(A), 9(P), 10(K), 19-21(DFE), 23(I) 및 24(P)는 변화에 대한 내성이 가장 적기 때문에 트롬빈 억제 활성에 중요하다는 것을 발견하였다. 만약 이러한 주요 잔기의 대부분이 남아있다면, 30% 동일성만큼 낮은 펩타이드 변이체를 생성하여도 트롬빈 억제 활성을 보유하였다.
바람직한 구현예에서 분리된 트롬빈 억제제는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 또는 서열번호 25와 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 보다 바람직하게 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 더 바람직하게, 분리된 트롬빈 억제제는 서열번호 1 또는 서열번호 2와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 보다 바람직하게 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서 분리된 트롬빈 억제제 아미노산 서열은 다음을 포함하는 군으로부터 선택된다;
QTAVPKISKQGLGGDFEEIPSDEIIE (서열번호 3) 서열번호 1의 단편;
ISKQGLGGDFEEIPSDEIIE (서열번호 4) 서열번호 1의 단편;
SGGHQTAVPKIAKQGLGGDFEEIPSDEIIE (서열번호 5) 서열번호 1의 S12A 변이체;
SGGHQTAVPKIHKQGLGGDFEEIPSDEIIE (서열번호 6) 서열번호 1의 S12H 변이체;
SGGHQTAVPRISKQGLGGDFEEIPSDEIIE (서열번호 7) 서열번호 1의 KIOR 변이체;
SGGHQTAVPXISKQGLGGDFEEIPSDEIIE (서열번호 8) 서열번호 1의 β-호모아르기닌 변이체;
SDEAVRAIPXMYSTAPPGDFEEIPDDAIEE (서열번호 9) 서열번호 2 의 β-호모아르기닌 변이체.
SDQGDVAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEE (서열번호 10) 서열번호 2의 변이체;
SDEAVRAEPKMHKTAPPGDFEEIPDDAIEE (서열번호 11) 서열번호 2의 변이체;
SDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPEEYLDDES (서열번호 12) 서열번호 2의 변이체;
MYSTAPPGDFEEIPDDAIEE (서열번호 13) 서열번호 2의 변이체;
SDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDEIEE (서열번호 14) 서열번호 2의 변이체;
SDEAVRAIPKMYSQAPPGDFEEIPDDAIEE (서열번호 15) 서열번호 2의 변이체;
SDQGDVAEPKMYSTAPPFDFEAIPEEYLDDES (서열번호 16) 서열번호 2의 변이체;
SDQGDVAEPXMHSTAPPFDFEAIPEEYLDDES (서열번호 17) 서열번호 2의 변이체;
CDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEE (서열번호 18) 서열번호 2의 변이체;
SDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEECA (서열번호 19) 서열번호 2의 변이체;
MYSTAPPGDFEEIPDDAIEEGCCC (서열번호 20) 서열번호 2의 변이체;
SDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEEGCCC (서열번호 21) 서열번호 2의 변이체;
SGEDHTAVPKMSRKGLGGDFEDIPPEAYERALEAR (서열번호 22);
ELESGDEDSEGGDSQSSPTESAAPRLHQREGGGGDFENVEYDQDQK (서열번호 23);
SDVAPADYESDEGDNDGGHDGSEVAKPKMPRGNGGGGDFEEIPEVE (서열번호 24); 및
TGSDDDDEYDMYESDGDSNEGNDNDEFETAVPRLPNPNSGRDSEHIPMPVN (서열번호 25);
바람직하게 상기 억제제는 서열번호 2, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 트롬빈 억제제는 트롬빈 섬유소원 용해 활성 및/또는 트롬빈 아미드 분해 활성을 억제한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 트롬빈 억제제는 아미드 분해 분석에서 평가할 때, 400 nM 미만, 바람직하게 300 nM 미만, 200 nM 미만, 100 Nm 미만, 50 nm 미만, 10 nM 미만, 바람직하게 9 nM 미만, 8 nM 미만, 7 nM 미만, 6 nM 미만, 5 nM 미만, 4 nM 미만, 3 nM 미만, 2 nM 미만 또는 1 nM 미만의 IC50을 갖는다. 더 바람직하게, IC50은 2 nM 미만이다. 구체적으로 인용된 것들 사이의 IC50 값은 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 트롬빈 억제제는 아미드 분해 분석에서 평가할 때, 6000 nM 미만, 바람직하게 2000 미만, 500 미만, 400 nM 미만, 300 nM 미만, 200 nM 미만, 100 Nm 미만, 50 nm 미만, 10 nM 미만, 바람직하게 9 nM 미만, 8 nM 미만, 7 nM 미만, 6 nM 미만, 5 nM 미만, 4 nM 미만, 3 nM 미만, 2 nM 미만 또는 1 nM 미만의 Ki를 갖는다. 더 바람직하게 Ki는 2 nM 미만이다. 구체적으로 인용된 것들 사이의 Ki 값은 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
본 발명의 또 다른 양태는 트롬빈 활성과 관련된 질병의 예방 또는 치료를 위한 본 발명의 임의의 양태에 따른 아미노산 서열을 포함하는 분리된 트롬빈 억제제를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 트롬빈 활성을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 임의의 양태에 따른 적어도 하나의 트롬빈 억제제와 트롬빈을 접촉시키는 단계를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 트롬빈 억제제는 혈액 수집 튜브에서 항응고제로서 존재하거나, 스텐트, 카테터 및 다른 의료용 튜빙과 같은 의료기구의 표면 코팅 물질로서 존재한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 혈전과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 임의의 양태에 따른 트롬빈 억제제의 용도가 제공된다. 바람직한 구현예에서, 혈전과 관련된 질병은 심장마비, 뇌졸중 및 색전증을 유발하는 동맥 및 정맥 혈전증; 불안정한 협심증, 관상동맥 성형술, 경피 관상동맥 중재술 및 심장수술 동안의 응고로부터 선택된다.
본 발명의 방법에 따라 치료 조성물을 투여하기 위한 적합한 방법은, 이에 제한되는 것은 아니나, 전신 투여, 비경구적 투여(혈관내, 근육내, 동맥내 투여를 포함함), 구강 투여(oral delivery), 국소 투여, 구강 투여(buccal delivery), 직장 투여, 질 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 외과적 이식, 국소 주입, 초고속도 주입/충격을 포함한다. 적용 가능한 경우, 연속적인 주입은 표적 위치에서 약물 축적을 향상시킬 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,180,082호).
투여 경로와 관계없이, 본 발명의 펩타이드는 전형적으로 원하는 반응을 달성하기 위한 유효량을 투여한다. 본 발명에서 사용된 바와 같은 용어 "유효량" 및 "치료학적 유효량"은 주목할 만한 생물학적 반응(예를 들어, 혈전의 양 또는 혈전-관련 질병의 감소)을 생성하기에 충분한 치료용 조성물(예를 들어, 트롬빈 억제제 폴리펩타이드 및 약학적 식염수, 담체 또는 첨가제를 포함하는 조성물)의 양을 의미한다. 본 발명의 치료용 조성물에서 활성 성분의 실제 투약 수준은 특정 개체 및/또는 용도에 대해 원하는 치료학적 반응을 달성하기에 효과적인 활성 폴리펩타이드의 양을 투여하기 위해 달라질 수 있다. 물론, 임의의 특정한 경우에 유효량은 치료용 조성물의 활성, 제제, 투여 경로, 다른 약물 또는 치료와의 병용, 치료되는 상태의 중증도, 및 신체적 조건 및 치료받는 개체의 과거 병력을 포함하는 다양한 요인에 의해 결정될 것이다. 바람직하게, 최소 용량을 투여하고, 용량-제한 독성의 부재 하에 용량이 최소 유효량으로 증가한다. 치료학적 유효 용량의 결정 및 조정뿐만 아니라 그러한 조정을 언제 및 어떻게 하는지에 대한 평가는 당업자에 알려져있다.
용량 및 제제에 대한 추가적인 지침을 위해, 미국 특허 제5,326,902호 및 제 5,234,933호; PCT 국제공개 WO 93/25521; Berkow, et al., (1997) The Merck Manual of Medical Information, Home ed. Merck Research Laboratories, Whitehouse Station, N.J.; Goodman, et al., (2006) Goodman & Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics, 11th ed. McGraw-Hill Health Professions Division, New York을 참조한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 트롬빈 활성과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 개체에게 본 발명의 임의의 양태에 따른 트롬빈 억제제의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 혈전과 관련된 질병은 심장마비, 뇌졸중 및 색전증을 유발하는 동맥 및 정맥 혈전증; 불안정한 협심증, 관상동맥 성형술, 경피 관상동맥 중재술 및 심장수술 동안의 응고로부터 선택된다.
본 발명의 트롬빈 억제제는 또한 예를 들어 혈종을 갖거나 갖지 않는 타박상을 국소적으로 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 펩타이드 억제제는 이전에 히루딘으로 시도한 것과 유사한 처방으로 크림으로 투여될 수 있고, 280 UI/100 g을 일측성 급성 근골격 손상(타박상)에 5일 동안 일일 3-4회 투여하여 적용하였다[Stamenova PK., et al, Eur Rev Med Pharmacol Sci. 5(2):37-42 (2001)]. 트롬빈 억제제는 또한 AV 단락(AV shunt) 혈전증, 타박상, 염좌, 근육 파열, 외상 혈종, 부종, 홍반, 정맥류, 정맥주위염 및 치질, 특히 혈전-색전 합병증과 관련된 치질의 항문 정맥주위염을 치료하기 위한 국소 적용(r-hirudin 1120IU/40 g; MINAPHARM Pharmaceuticals, Cairo, Egypt)으로 제형화되었다[Thrombexx® at minapharm.com 참조]. 본 발명의 분자는 히루딘 크기의 절반보다 작으며, 이는 국소로 적용될 때, 피부 장벽을 가로지르는 활성 성분(예를 들어, 트롬빈 억제제)의 침투를 증가시켜야 한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면 개체 또는 개체로부터 분리된 조직 샘플에 본 발명의 임의의 양태에 따른 적어도 하나의 억제제를 투여하는 단계 및, 트롬빈이 결합된 적어도 하나의 상기 트롬빈 억제제의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 개체에서 트롬빈의 축적을 검출하는 방법을 제공한다.
바람직한 구현예에서, 다음을 포함하는, 개체에서 트롬빈 축적을 검출하는 방법을 제공한다:
a. 환자로부터 조직 샘플을 얻는 단계; 및
b. 본 발명의 임의의 양태에 따른 적어도 하나의 억제제와 샘플을 접촉시키고 트롬빈과 적어도 하나의 트롬빈 억제제 사이의 결합을 검출함으로써, 샘플에서 트롬빈이 축적된 것인지 검출하는 단계.
바람직하게, 트롬빈 억제제는 SGGHQTAVPKISKQGLGGDFEEIPSDEIIE (서열번호 1), 이의 변이체 또는 단편, 및 SDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEE (서열번호 2), 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 방법의 또 다른 바람직한 구현예에서, 트롬빈 억제제는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25를 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게, 상기 억제제는 서열번호 2, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21을 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면 본 발명의 임의의 양태에 따른 적어도 하나의 억제제를 개체 또는 상기 개체로부터 분리된 조직 샘플에 투여하는 단계, 및 트롬빈에 결합된 상기 트롬빈 억제제의 존재를 감지하는 단계를 포함하는 방법으로서, 정상 트롬빈 수준에 결합된 억제제의 수준과 비교하여 트롬빈에 결합된 상기 억제제의 상승된 수준의 검출이 상기 질병 또는 병태를 나타내는 것인, 혈전과 관련된 질병 또는 병태를 진단하는 방법을 제공한다.
본 방법의 또 다른 바람직한 구현예에서, 트롬빈 억제제는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25를 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게 상기 억제제는 서열번호 2, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21을 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면 적어도 하나의 본 발명의 임의의 양태에 따른 트롬빈 억제제의 유효량을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면 본 발명의 임의의 양태에 따른 트롬빈 억제제를 코딩하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 바람직한 구현예에서 핵산 서열은 서열번호 1을 코딩하고; TCGGGTGGCCATCAGACTGCTGTTCCGAAGATATCTAAGCAAGGCTTGGGTGGAGACTTTGAAGAAATTCCAAGTGATGAAATAATCGAG (서열번호 26)로 표시된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 서열번호 1 및 서열번호 2, 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 트롬빈 억제제를 코딩한다.
바람직한 구현예에서, 분리된 핵산 분자는 서열번호 2 이의 단편 또는 변이체를 코딩하고; TCAGACGAAGCTGTCAGGGCGATTCCCAAGATGTACTCGACTGCCCCACCGGGAGATTTCGAAACAATCCCTGACGACGCTATTGAGGAG (서열번호 27), 이의 단편 또는 변이체로 표시되는 핵산 서열의 변이로서 얻어질 수 있다. 바람직하게 서열번호 27의 핵산 서열은 서열번호 2의 펩타이드를 생산하기 위해 Thr22를 코딩하는 코돈을 Glu22를 코딩하는 적절한 코돈으로 교체함으로써 변이된다. 이는 원래 뉴클레오티드 서열(서열번호 27)이 본 발명에 따른 적절한 트롬빈 억제제를 코딩하는 것으로 이해할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 핵산은 서열번호 26 또는 서열번호 27, 이의 변이체 또는 유도체로 표시되는 서열을 갖는다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면 본 발명에 기재된 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면 본 발명의 임의의 양태에 따른 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주 세포는 원핵 생물 또는 진핵 생물일 수 있지만, 바람직하게 진핵 생물이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 임의의 양태에 따른 적어도 하나의 혈전 억제제 또는 의약을 포함하는 혈전과 관련된 질병 또는 병태를 예방 또는 치료하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 본 발명의 혈전 억제제로 코팅된 스텐트, 카테터 또는 다른 형태의 튜브와 같은 의료 기구를 포함한다.
본 발명에 전형적으로 기술되었지만, 본 발명의 실례로서 제공되지만 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지는 않은, 하기 실시예의 참고를 통해 동일한 내용은 더 용이하게 이해될 것이다. 방법, 기술 및 화학 물질은 주어진 참고 문헌 또는 표준 생명공학 및 분자 생물학 텍스트북의 프로토콜에 설명된 것이다.
실시예
재료 및 방법
칼리크레인, 인간 피브리노겐 및 소의 트립신은 Merck. Chemicals Ltd. (Nottingham, UK)로부터 구매하였다. 소의 키모트립신, 염화제2철 6수화물 및 소의 혈청 알부민은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구매하였다. 다른 모든 세린 프로테아제는 Hematologic Technologies, Inc. (Essex Junction, VT, USA)의 것이었다. 재조합 트롬빈은 Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute (Kaketsuken, Japan)의 기증품이었다. 발색 기질은 Chromogenix 및 Spectrozyme으로부터 구매하였고 FIXa는 American Diagnostica의 것이었다. 사용된 모든 다른 화학물질과 시약은 분석용 등급(analytical grade)의 것이었다.
펩타이드
합성 및 정제
모든 펩타이드를 Intavis MultiPep RSi 펩타이드 합성기(Intavis Bioanalytical Instruments, Cologne, Germany) 의 고체상 펩타이드 합성을 사용하여 합성하였고, 이전에 문헌[Koh CY, et al., J Biol Chem 282: 29101-13 (2007)]에 기술된 바와 같이 수지로부터 분해하였다. 크루드(crude) 펩타이드를 AKTA purifier from with a Jupiter Proteo (5 μm, 250 mm X 10 mm, 90 Å) 컬럼이 있는 GE Healthcare (Uppsala, Sweden)의 AKTA 정제기에서 역상 HPLC를 사용하여 정제하였다. 모든 펩타이드의 순도 및 질량을 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)의 LCQ Fleet Ion Trap MS를 사용한 ESI-MS에 의해 측정하였다.
CD 분광학
10 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.4)에서 용해된 아바트린, QT26 및 IS20의 Far-UV CD 스펙트럼(260-190 mm)을 Jasco™ J-810 분광편광계(Easton, MD)를 이용하여 측정하였다. 모든 측정을 실온에서 50 nm/min 스캔 속도, 2 nm 대역폭 및 0.2 nm 분해능의 0.1-cm 경로 길이 큐벳을 사용하여 수행하였다.
트롬빈의 아미드 분해 및 섬유소원 용해 활성 및 프로테아제 활성의 억제
모든 펩타이드에 대한 트롬빈 아미드 분해 활성 분석을 100 mM NaCl 및 1 mg/ml 소의 혈청 알부민을 함유한 50 mM 트리스 완충액(pH 7.4)의 96-웰 미량 정량판에서 수행하였다. 전형적으로 100 μl의 펩타이드 및 100 μl의 트롬빈은 100 μl의 S2238이 반응 웰에 첨가되기 전에 다른 기간 동안 항온처리되었다. p-니트로아닐린의 생성 속도를 Tecan (Mannedorf, Switzerland)의 Tecan InfinitePro M200 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 10분 동안 405 nm에서 흡광도를 측정함으로써 추적하였다. 용량-반응 곡선은 IC50 값 및 힐 계수(Hill coefficient)를 계산하기 위해 GraphPad Prizm 소프트웨어(San Diego, CA, USA)를 사용하여 준비하였다. 억제성 상수를 결정하기 위해, S2238의 상이한 농도가 사용되었고, 모리슨의 강한 결합 방정식을 사용하여 잔류 속도가 결정되었다. 펩타이드의 트롬빈 섬유소원 용해 활성의 억제를 이전 [문헌 Koh CY, et al., J Biol Chem 282: 29101-13 (2007)]에 기술된 바와 같이, Tecan (Mannedorf, Switzerland)의 Sunrise 마이크로플레이트 리더를 사용하여 650 nm에서 흡광도를 측정함으로써 시험하였다. 아바트린의 선택성을 13개의 세린 프로테아제(도 5)에 대하여 조사하였다. 이 세린 프로테아제의 아미드 분해 활성에 대한 아바트린의 효과는 각각의 발색 기질을 사용하여 측정하였다. 트롬빈에 의한 아바트린의 절단, 아바트린(150 μM)은 150 mM NaCl 및 1 mg/ml BSA을 함유한 50 mM 트리스 완충액(pH 7.4)에서 트롬빈(5 μM)과 함께 항온처리되었다. 상이한 항온처리 시간 후에, 반응은 1% TFA(pH 1.8)로 퀀칭(quench)되었고 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)의 Dionex 나노-HPLC 시스템에 부여된 Jupiter Proteo 컬럼(4 μm, 90Å, 100 x 1.0 mm) 상에 로딩되었고, 용리제 A로서 0.05% TFA 및 99.95% MilliQ 물, 및 용리제 B로서 0.05% TFA, 19.95% MilliQ 물 및 80% ACN의 아세토니트릴 구배를 사용하여 용리되었다. 모든 피크의 질량은 절단 산물을 확인하기 위해 측정하였고, 곡선 아래 면적을 계산하고 피크를 통합함으로써 정량화하였다. 트롬빈 억제적 활성에 대해 상이한 전-항온처리 시간의 효과를 측정하기 위해, 아미드 분해 분석은 다양한 항온처리 시간(최대 36시간까지) 동안 수행하였다.
X-선 결정기술
재조합 α-트롬빈(150 mM NaCl 내)을 20 mM NH4HCO3에서 3000 MWCO 스핀 필터(spin filter)를 사용하여 탈염시켰고 결정화 전에 동결건조시켰다. 다른 억제성 복합체, 트롬빈과 바리어진, 히루젠(hirugen) 및 히루로그의 결정화 조건이 사용되었고 추가로 최적화되었다[문헌: Koh CY, et al., PLoS One 2011; 6.; Skrzypczak-Jankun E, et al., J Mol Biol 221: 1379-93 (1991)]. 아바트린(81.7 μM)은 375 mM NaCl을 함유한 50 mM HEPES 완충액(pH 7.4)에서 용해되었다. 트롬빈은 최종 농도가 54.5 μM가 되도록 아바트린 용액에서 용해되었다. 결정화는 정체 적제 증기 확산법(hanging drop vapor diffusion method)을 사용하여 달성되었다. 전형적으로, 아바트린 및 트롬빈을 함유하는 1 μl의 혼합물은 1 μl의 침전제(100 mM HEPES, pH 7.4, 20 내지 25% (w/v) PEG 8000)와 혼합되었고 4°C 에 두었다. 결정은 약 6주 후에 나타났다. 결정은 25% (v/v) 글리세롤로 보충된 모액을 함유하는 저온보호물질 용액에 담가두었고, 찬 질소 가스 스트림(Oxford Cryosystem, Oxford, UK)내에서 100K에서 냉각하였다. 180개 프레임의 데이터 세트는 회전하는 양극 Rigaku X선 발생기가 장착된 CCD를 사용하여 수집되었다(180° 진동). 데이터 세트는 Mosflm [Battye TGG, et al., Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr 67: 271-81 (2011)] 및 AIMLESS [Evans PR, and Murshudov GN. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr 69: 1204-14 (2013)] 각각을 사용하여 처리되었고 측정되었다[Leslie AGW, and Powell HR. Evolving methods for macromolecular Crystallography. 2007]. 복합체의 구조는 Phaser 프로그램 및 트롬빈-바리어진 결정 구조를 템플릿으로서[McCoy AJ. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr International Union of Crystallography 63: 32-41 (2006)] 사용하여 분자의 치환에 의해 결정되었다. 모델 구성 및 정교화는 COOT를 사용하여 수행하였다[ETmsley P, and Cowtan K. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr International Union of Crystallography 60: 2126-32 (2004)].
혈전-
결합된
트롬빈 억제
혈전-결합된 트롬빈 활성을 S2238을 사용하여 시험하였다. 요약하면, 피브린 혈전은 100 μL의 2 mg/mL 피브리노겐(50 mM HEPES 완충액, pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mg/mL CaCl2 내)을 100 μL 30 nM 트롬빈과 함께 항온처리함으로써 제조하였다. 37°C 에서 2시간 후에, 혈전은 동일한 완충액으로 광범위하게 세척하였다. 이 세척은 24시간 동안 매 3시간 마다 반복하였다. 그 후 상이한 농도의 아바트린이 혈전에 첨가되었고 60분 동안 항온처리되었다. 발색 기질, S2238(최종 농도 200 μM)은 그 후 첨가되었고 반응 혼합물은 37°C 에서 90분 동안 항온처리되었다. 분취량을 취했고, 기질 가수분해는 405 nm에서 Tecan Infinite®Pro 마이크로플레이트 리더를 사용하여 마지막 지점에서 추산하였다. 실험은 4회 반복 수행하였고, 억제 백분율을 표시하였다.
염화제2철
-유도된 경동맥 혈전증 모델
모든 동물 실험은 싱가포르 국립대학교 동물 관리 및 사용 위원회 기관에 의해 승인된 프로토콜 041/12에 따라 수행하였다. 염화제2철 유도된 경동맥 혈전증 모델은 이전 [문헌 Eckly A, et al., J Thromb Haemost 9: 779-89 (2011)]에 기술된 바와 같이 미미한 수정과 함께 수행하였다. 전형적으로 C57BL/6 수컷 마우스(9-11 주령, 24.5-27.5 g)는 케타민(75 mg/kg) 및 메데토미딘(medetomidine, 1 mg/kg)의 복강내 주사로 마취하였다. 100 μL의 상이한 용량의 아바트린은 마우스의 꼬리 정맥을 통해 주입하였다. 오른쪽 경동맥은 비절개박리(blunt dissection)을 사용하여 절개하였고, 혈관 손상은 경동맥 상부에 FeCl3가 포화된 2 mm X 2 mm의 여과지를 적용하여 발생시켰다. 3분 후, 여과지를 제거하였고, 정맥은 살균한 생리식염수로 세척하였다. 폐색 시간을 측정하기 위해, 미니어쳐 도플러 유속 탐침(Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA)이 경동맥 근처에 놓았고 혈류는 ADInstruments (Dunedin, New Zealand)을 Transonic® 유량계를 사용하여 기록하였다. 손상 후 혈류 모니터링의 최대 시간은 30분이었다. 마우스는 실험이 완전히 끝난 즉시 마취로부터 회복되기 전에 경추 탈골에 의해 안락사시켰다.
펩타이드로
혈액 튜브에 혈액의 수집
개개의 펩타이드는 10X 펩타이드 용액을 제조하기 위해 식염수로 완충된 인산에서 용해되었다(즉, 펩타이드의 농도는 시험되는 최종 농도보다 10배 더 높음). 0.3 ml의 10X 펩타이드 용액은 첨가제 없이 혈액 튜브에 넣었다. 혈액을 건강한 지원자로부터 시린지를 사용하여 뽑았고, 펩타이드 용액으로 혈액 튜브로 2.7 ml의 혈액을 피펫팅하기 전에 즉시 50 ml 코니칼 원심관(팔콘 튜브)로 옮겼다. 펩타이드의 최종 농도는 표 5 및 6에 기재되어 있다.
혈액 튜브에서
펩타이드의
항-응고 효과
상이한 농도의 다양한 펩타이드가 있는 혈액 튜브는 정해진 시간에 시험되기 전까지 상온에서 세워진 채로 놓았다. 상이한 시점에서, 튜브를 여러 번 뒤집었고 혈전 형성의 징후로서 불용성 물질을 육안으로 관측하였다.
펩타이드가
첨가된 혈액 튜브에서 혈소판 기능의 보존
상이한 농도의 다양한 펩타이드가 있는 혈액 튜브는 정해진 시간에 시험되기 전까지 상온에서 세워진 채로 놓았다. 상이한 시점에서, 튜브를 여러 번 뒤집었고 제조사의 권고한 프로토콜에 따라 작용제로서 아데노신 2인산(ADP)이 이용되는 Mutiplate® 응집 측정기를 사용한 혈소판 응집 테스트를 위해 혈액 샘플을 꺼냈다.
결과
암블리옴마
배리어가튬
(
Amblyomma
variegatum
)의 침샘에서
바리어진
-유사
전사체의
발견
바리어진 서열을 기반으로 한 디제너레이트 프라이머는 9일간 먹인 암컷 암블리옴마 배리어가튬의 침샘으로부터 219-잔기 전구체 단백질(BAD29729)을 코딩하는 전사체(AB183707)를 증폭시켰다. 이 전구체는 추정되는 분비 신호 및 5개의 동일한 30-잔기 반복을 포함하며, 그 사이에 추정되는 절단 부위가 있어, 전구체를 5개의 활성 펩타이드로 번역 후 절단이 가능하도록 한다. 침샘에서 이 전구체 단백질의 발현은 원위치 혼성화(in situ hybridization)로 확인되었다. 이 프로브는 타입 2의 침샘 샘꽈리의 큰 기저의 과립 세포의 세포질에서 혼성화된다. 약충 및 성인 암컷 및 수컷 진드기의 침샘의 전사체의 위치 측정(localization)은 발현의 시작에서 개별적인 가변성뿐만 아니라 먹이를 주는 과정 동안의 발현 차이를 입증하였다. 가장 강한 발현은 2-4일간 먹인 약충, 5일간 먹인 암컷, 12일간 먹인 수컷에서, 즉 암컷이 충혈되어 분리가 시작되는 시점에서 측정되었다(도 1A- I). 219개의 아미노산 서열에서 단지 작게 뻗어있는 서열이 활성을 위해 충분하다고 간주하였고, 따라서 서열번호 1 아바트린(30개 아미노산)을 합성하였다. 서열번호 1을 코딩한 뉴클레오티드 서열은 서열번호 21에서 시작된다.
이 전사체에 의해 코딩되는 활성 펩타이드는 바리어진과 40% 서열 동일성을 보여주었다. 이 펩타이드는 또한 바리어진과 비교하여 주요 기능성 잔기에서 몇몇 차이를 보였다:
(i) 바리어진은 빠른 결합 동력에 중요하다고 여겨지는 산성 N-말단을 가지고 있다[Koh CY, et al., J Biol Chem 282: 29101-13 (2007)]. 반대로, 산성 잔기는 전형적으로 바리어진-유사 펩타이드에 존재하지 않는다;
(ii) 바리어진은 His12와 트롬빈의 Ser195와의 가능한 수소 결합에 의해 활성 부위 촉매 삼중체의 전하 중계 시스템을 파괴함으로써 트롬빈을 억제한다[Koh CY, et al., PLoS One 2011; 6]. 이 바리어진-유사 펩타이드에서, 기능성 히스티딘은 세린으로 대체된다;
(iii) 천연형 바리어진의 Thr14는 글라이코실화되고, 합성 바리어진보다 14배 더 높은 친화도를 보여준다[Koh CY, et al., J Biol Chem 282: 29101-13 (2007)]. 바리어진-유사 펩타이드에서는, 글라이코실화될 수 없는 글루타민이 이 위치에 존재하였다;
(iv) 바리어진의 Pro16 및 Pro17은 백본에 꼬임을 도입하고, 이는 아마도 활성 위치와 엑소사이트-I 결합 부분 사이의 결합에서 형태적 유연성을 제한한다[Koh CY, et al., PLoS One 2011; 6]. 바리어진-유사 펩타이드의 유사한 영역은 3개의 글라이신을 포함하고 있어 펩타이드에 더 많은 유연성을 부여한다.
이러한 모든 차이점은 이들 바리어진-유사 펩타이드의 구조-기능 관계를 평가하는 원동력을 제공하였다. 따라서 인간 α-트롬빈에 대한 억제 효과를 추가로 특성화하기 위해 전구체 단백질(BAD29729)로부터 활성 펩타이드를 합성하였다.
아바트린은
강력하고 선택적인 트롬빈의 억제제이다.
아바트린(암블리옴마 배리어가튬 트롬빈 억제제)이라 불리는 활성 펩타이드는 fmoc-기반의 고체상 펩타이드 합성에 의해 합성되었고 동질성으로 정제되었다(도 2). 아바트린은 IC50 및 힐 슬롭이 각각 6.95 ± 0.42 nM 및 0.92 ± 0.01인 용량-의존적인 방식으로 작은 펩티딜 발색 기질 S2238에 대한 트롬빈 아미드 분해 활성을 억제하였다. 유의적인 억제(14.33 ± 1.39 %)는 전형적인 강한-결합 억제제의 기술[Copeland R a. Enzymes: A practical Introduction to Structure, mechanism, and data analysis. 2000]에 맞는 트롬빈 및 아바트린의 등몰 농도(0.81 nM 트롬빈; 1 nM 아바트린)에서 관측되었다(도 3A). 반응 진행 곡선은 혼합하는 동안 빠른 결합모드임을 나타내는 안정-상태 평형이 달성되었다는 것을 보여주었다(도 3B). 트롬빈의 반응 속도는 겉보기의 억제성 상수, K i′를 얻기 위해 상이한 농도의 아바트린 존재 하에서 측정하였다. K i' 플롯은 S2238의 농도가 증가함에 따라 선형적으로 증가하였고, 이는 아바트린은 S2238 (545.3 ± 3.1 pM의 K i)에 대하여 트롬빈의 경쟁적인 억제제임을 나타낸다(도 3C, 3D). 따라서, 아바트린은 빠르고 강하게 결합하고, 경쟁적인 트롬빈의 억제제이다. 아바트린은 또한 용량-의존적인 방식으로 피브리노겐 응고 시간을 연장시키고, 이는 또한 트롬빈의 섬유소원 용해 활성을 억제한다는 것을 나타낸다(도 4).
아바트린의 선택성을 13개의 세린 프로테아제에 대하여 스크리닝함으로써 조사하였다. 10 nM에서, 아바트린은 트롬빈 활성의 65%를 억제하였다. 그러나 심지어 100 μM에서, 다른 프로테아제의 억제는 <30%이었고(도 5), 이는 아바트린은 트롬빈에 대한 선택성 선호도가 적어도 수만배인 고도의 선택적인 억제제라는 것을 나타낸다.
아바트린은
연장된 트롬빈 억제를 나타낸다.
트롬빈 펩티딜 기질 S2238의 경쟁적인 억제는, 아바트린이 활성 위치에 결합하고, 따라서 바리어진 및 비발리루딘과 같은 모든 다른 고분자 기질 또는 억제제와 유사하게, 트롬빈에 의한 단백질 분해성 절단에 취약할 수 있음을 나타낸다. 시간이 지남에 따라 효소와 함께(30:1 비율) 항온처리함으로써 트롬빈에 의한 아바트린의 절단을 조사하였고 역상 크로마토그래피(RP-HPLC) 및 전자분무 이온화 질량분석법(ESI-MS)에 의해 반응을 분석하였다. 항온처리시, SGGHQTAVPK (981.3 Da) 및 ISKQGLGGDFEEIPSDEIIE (2176.3 Da)에 상응하는 두개의 새로운 피크가 확인되었고, 이는 Lys10-Ile11 잘리기 쉬운 결합에서 절단을 나타낸다(도 6A). 절단은 크로마토그램의 피크 아래의 영역을 계산함으로써 정량화하였다(도 6B). 시간이 길어짐에 따라, 절단 산물의 양은 증가하였고, 반면에 펩타이드 전장은 감소하였고 아바트린은 ~10시간에 완전히 절단되었다. 억제 활성에 대한 절단의 효과를 평가하였다(도 6C). 절단 실험에서 사용된 동일한 아바트린: 트롬빈 비율(1:30)에서, 트롬빈 아미드 분해 활성의 >45%는 24시간에 억제되었고, 이는 심지어 아바트린이 완전히 절단된 후에도 트롬빈의 연장된 억제를 나타낸다. 바리어진은 잘리기 쉬운 결합에서 절단된 펩타이드 C-말단이 절단 후 계속해서 트롬빈을 억제하는 것과 유사한 거동을 보였다. 아바트린의 절단 산물이 유사하게 트롬빈을 억제하는지 시험하기 위해, 상응하는 펩타이드(IS20)를 정제하였고, 억제에 대한 시험을 하였다. IS20은 12.38 ± 0.32 nM의 IC50로 트롬빈 아미드 분해 활성을 억제하였다(도 7A). K i'는 S2238 농도가 증가함에 따라 곡선으로 감소하였고, 이는 IS20은 작은 펩티딜 기질에 관하여 전체 K i가 5.76 ± 0.23 nM인 비-경쟁적인 억제제임을 나타낸다(도 7B 및 7C). IS20은 또한 용량-의존적인 방식으로 트롬빈의 섬유소원 용해 활성을 억제하였다(도 4). 따라서 아바트린은 트롬빈에 대해 강한 결합 친화도를 가진 C-말단 펩타이드를 통해 연장된 억제를 나타냈다.
아바트린에
대한 트롬빈 결합 부분
아바트린에 대한 트롬빈 결합 부분의 위치를 측정하기 위해 QT26 및 GL16이라 불리는 아바트린의 두개의 추가의 절단된 변이체를 합성하였다. 4개 및 15개 아바트린의 N-말단 잔기가 각각 QT26 및 GL16에서 결실되었다. 두개의 펩타이드는 트롬빈 아미드 분해 및 섬유소원 용해 활성을 억제하는 능력에 대해 시험하였다. QT26은 트롬빈 아미드 분해 활성(IC50 = 8.94 ± 0.64 nM 및 Ki = 760.32 ± 0.91 pM) (도 7A, 7D 및 7E) 및 섬유소원 용해 활성(도 4)을 억제하였다. 아바트린 전장과 비교하여, QT26에서 4개의 N-말단 잔기의 결실로 인한 활성의 상실은 최저치이다. 반대로, GL16은 심지어 300 μM에서도 아미드 분해 활성을 억제하지 않았고, 대신에 약간의 활성화(5-10%)를 보여주었다(도 7F). 그러나, 섬유소원 용해 활성은 억제하였다(도 4). 종합하면, 이는 QT26은 활성 위치 및 엑소사이트-I 결합 서열을 모두 함유하지만 GL16은 오직 엑소사이트-I 결합 서열만을 함유한다는 것을 나타낸다. 잘리기 쉬운 결합이 Lys10-Ile11 사이에 있으므로, 아바트린의 활성 위치 결합 부분은 서열 5QTAVPKISKQ14에 위치한다.
트롬빈-
아바트린
상호작용의 구조-기능 관계
상기에 요약한 바와 같이 바리어진과 아바트린 사이의 낮은 전체 서열 동일성, 및 몇몇 주요 기능성 잔기의 변이에도 불구하고, 기능적으로 아바트린은 트롬빈 억제성 활성에서 바리어진과 높은 유사성을 보였다. 두개의 서열에서 차이의 중요성을 추가로 조사하기 위해, 바리어진을 이용한 이전의 구조-기능 연구에 의해 알려진 일련의 아바트린 치환 돌연변이를 평가하였다[Koh CY, et al., PLoS One 2011; 6]:
(i) 트롬빈의 촉매 삼중체를 파괴할 가능성이 있는 바리어진의 주요 기능성 잔기- VHis12는 아바트린의 ASer12으로 대체한다. ASer12을 Ala(S12A)로 대체하거나 His(S12H)로 대체한 두가지 돌연변이를 합성하였다. S12A는 유사한 바리어진 돌연변이(도 8A)에서 관찰된 것과 유사한 효능의 감소(>10배)를 나타내었고, 이는 아바트린 억제 효과에 대한 ASer12의 중요성을 시사한다. S12H은 아바트린에 비해 2배 더 적은 효능인 18.51 ± 0.32 nM의 IC50으로 트롬빈을 억제하였고, 이는 세린은 그 위치에 히스티딘을 가지는 경우보다 아바트린을 더 강한 트롬빈 억제제로 만들어주는 것임을 시사한다.
(ii) 바리어진은 N-말단에 2개의 Glu 잔기를 함유하고, 이 두개의 산성 잔기는 바리어진을 트롬빈 엑소사이트-II로 향하도록 조종하고 빠른 결합 억제성 모드를 부여하는 것으로 의심되었다[Koh CY, et al., J Biol Chem 282: 29101-13 (2007)]. 비록 아바트린은 산성 N-말단 없이 빠른 결합 동력을 보이지만, 아바트린의 트롬빈 억제 활성에 대한 산성 N-말단의 역할에 대한 조사에 관심을 가졌다. 하나의 이중 돌연변이 펩타이드 G2D, Q5D에서, 산성 잔기는 아바트린 N-말단에 도입하여 바리어진에 빠른 결합 동력을 부여하는 정전기적 조종의 가능한 역할을 모방하였다[Koh CY, et al., J Biol Chem 282: 29101-13 (2007)]. 이 돌연변이는 아바트린 및 QT26에 비해 약간의 약해진(<2배) 억제를 보여줬다. 따라서 산성 N-말단의 존재는 이전에 가설을 제기한 바와 같이 빠른 결합 동력에 중요하지 않을 것이다[Koh CY, et al., J Biol Chem 282: 29101-13 (2007)].
(iii) 아바트린(15GLGG18)의 유연한 글리신-풍부 링커에 비해, 바리어진의 활성 위치와 엑소사이트-I 사이의 더 단단한 프롤린-풍부 링커가 더 유익하다는 가설을 시험하기 위해, 이중 돌연변이 펩타이드 L16P, G17P를 합성하였고 시험하였다. 이 펩타이드는 아바트린(도 8B)과 비교하여 활성에서 >25배의 감소를 나타냈으며(도 8B), 이는 아바트린에는 링커의 유연성이 필요함을 나타낸다.
(iv) 트롬빈은 P1에서 아르기닌 잔기를 선호하는 것으로 알려져 있고[Berliner LJ. Journal of Chemical Information and Modeling. (1992)] P1의 Arg를 Lys으로 치환하는 것은 10배의 활성 감소를 일으킨다[Gallwitz M, et al., PLoS One 2012; 7]. 바리어진 및 아바트린 모두 P1에 라이신을 가지고 바리어진에서 P1 Lys의 Arg로의 변이는 활성이 약간 증가하는 결과를 나타냈다(<3배) [Koh CY, et al., PLoS One 2011; 6]. 그러므로, 아바트린의 P1 Lys을 Arg로 치환하였고(K10R), 활성에 있어 유사하게 3배 내지 4배로 활성이 증가하는 것을 관찰하였다(IC50, 1.15 ± 0.45 nM) (도 8C). 그러나 트롬빈에 의한 이 펩타이드의 절단은 또한 더 빨리 진행되고, 이는 3시간 내 완전히 절단되는 결과를 나타냈다(도 9A).
(v) 다음으로, 잘리기 쉬운 펩타이드 결합(VLys10-VIle11)이 단백질 절단의 안정적인 결합(β-homoArg10-Ile11)으로 치환되었던 β-아바트린으로 불리는 변이체를 합성하였다. β-아바트린은 아바트린에 비해 >100배 덜 강력하고 332 ± 1.32 nM의 IC50으로 트롬빈을 억제하였다(도 8D). 최대 72시간 동안 트롬빈에 의해 절단되지 않았지만(도 9B), 펩타이드 백본을 따라 추가적인 탄소 원자로 인한 이동은 활성에 아주 불리하게 작용하는 것으로 나타났다. 활성의 유사한 감소는 또한 펩타이드가 절단 내성을 가지도록 잘리기 쉬운 결합의 치환이 만들어진 히루로그 변이체에서도 관측되었다[Bourdon P. Biochem Biophys Res Commun 177: 1049-55 (1991)]. 이러한 펩타이드의 K i 값은 도 10 및 11에 제시된다. 아바트린 및 아바트린 변이체 펩타이드의 결과는 표 1 및 2에 요약되어있다.
| 펩타이드 | 예상된 질량 ( Da ) | 측정된 질량 ( Da ) |
| 아바트린 | 3139.42 | 3139.65 ± 0.83 |
| QT26 | 2801.10 | 2801.21 ± 0.37 |
| IS20 | 2176.36 | 2176.32 ± 0.12 |
| GL16 | 1719.82 | 1719.79 ± 0.34 |
| S12A | 3123.42 | 3123.63 ± 0.75 |
| S12H | 3189.49 | 3189.77 ± 0.28 |
| L16P,G17P | 3163.44 | 3163.48 ± 0.41 |
| G2D,Q5D | 3184.42 | 3184.40 ± 0.53 |
| K10R | 3167.44 | 3167.70 ± 0.42 |
| β- 아바트린 | 3179.44 | 3179.51 ± 0.78 |
| 펩타이드 | 서열 | IC 50 (nM) | 힐 슬롭 | K i (nM) |
| 아바트린 | SGGHQTAVPKISKQGLGGDFEEIPSDEIIE | 6.95 ± 0.42 | 0.92 ± 0.02 | 0.545 ± 0.003 |
| QT26 | QTAVPKISKQGLGGDFEEIPSDEIIE | 8.94 ± 0.64 | 0.88 ± 0.03 | 0.760 ± 0.009 |
| IS20 | ISKQGLGGDFEEIPSDEIIE | 12.17 ± 0.32 | 0.86 ± 0.02 | 5.760 ± 0.230 |
| GL16 | GLGGDFEEIPSDEIIE | N.I.* | N.I. | N.I. |
| S12A | SGGHQTAVPKIAKQGLGGDFEEIPSDEIIE | 101.20 ± 1.32 | 0.62 ± 0.01 | 6.075 ± 0.180 |
| S12H | SGGHQTAVPKIHKQGLGGDFEEIPSDEIIE | 18.51 ± 0.32 | 0.88 ± 0.02 | 1.230 ± 0.046 |
| L16P,G17P | SGGHQTAVPKISKQGLPGDFEEIPSDEIIE | 181.32 ± 3.76 | 0.54 ± 0.02 | N.D.** |
| G2D,Q5D | SGGHDTAVPKISKQGLGGDFEEIPSDEIIE | 12.98 ± 1.23 | 0.71 ± 0.03 | 0.932 ± 0.015 |
| K10R | SGGHQTAVPRISKQGLGGDFEEIPSDEIIE | 1.15 ± 0.45 | 1.10 ± 0.01 | 0.172 ± 0.002 |
| β-아바트린 | SGGHQTAVPβISKQGLGGDFEEIPSDEIIE | 332.16 ± 1.32 | 0.62 ± 0.01 | 32.04 ± 0.36 |
| *N.I. 억제 없음, **N.D. 측정되지 않음 | ||||
트롬빈-
아바트린
복합체의 결정 구조
트롬빈-아바트린 복합체는 C2 공간군에서 결정화되었고 2.09 Å의 해상도로 정제되었다(표 3). 대부분 트롬빈 잔기에 대한 전자밀도는 경쇄 말단의 잔기; 중쇄의 C-말단 및 자가분해 루프를 제외하고 잘 정의되어있다. 유감스럽게도, 결합된 아바트린의 모든 잔기가 모델의 확실한 구축을 위해 충분한 정도로 밀도가 분명하지 않다. 처음 4개(1SGGH4) 및 마지막 2개(29IE30)의 잔기에 대한 밀도가 관측되지 않았다. 아바트린에 대한 전자 밀도는 또한 AIle11 및 AGly18 사이의 잘리기 쉬운 결합에 대한 불연속적인 C-말단이다. 따라서 잘리기 쉬운 결합에 대한 활성 위치 결합 부분 N-말단(5QTAVPK10) 및 엑소사이트-I 결합 부분(19DFEEIPSDEI28)을 나타내는 펩타이드의 두개의 부분을 구축하였다(도 12A 및 B). 아바트린의 절단은 결정화 동안 일어난다고 가정하였다. 절단 후, AIle11 및 AGly18 사이의 잔기는 트롬빈과의 복합체에서 규칙적인 결합 구조를 갖지 않았다. 낮은 밀도 때문에, AGln5, AGlu22 및 ASer25의 곁사슬은 또한 만들어질 수 없었다.
| 데이터 수집& 처리 | |
| 파장 (Å) | 1.54 |
| 공간군 | C2 |
| 단위 격자 파라미터 [a, b, c (Å); β (°)] | 69.5, 71.6, 71.7; 99.9 |
| 해상도 (Å) | 33.1 - 2.09 |
| 특이한 반사(Unique reflections) | 19156 (1390) |
| 완전성 (%) | 92.7 (82.9) |
| R merge | 0.052 (0.137) |
| R pim | 0.031 (0.083) |
| CC 1/2 | 1.00 (0.97) |
| 평균 I/σ(I) | 16.5 (7.7) |
| 다중도 | 3.8 (3.6) |
| 정제 | |
| 해상도 (Å) | 33.1 - 2.09 |
| R work | 0.179 |
| R free | 0.216 |
| RMSD 결합 (Å) | 0.008 |
| RMSD 각 (°) | 1.32 |
| 원자 수(트롬빈/아바트린/물) | 2322/119/185 |
| 선호하는 영역에서의 잔기 (%)# | 97.6 |
| 허가된 영역에서의 잔기 (%) | 2.4 |
| 허가되지 않은 영역에서의 잔기 (%) | 0 |
| 원자의 평균 B 계수(트롬빈/아바트린/물) (Å2) | 24.2/46.2/26.2 |
| *괄호 안의 값은 가장 높은 해상도 쉘(shell)에 대한 값이다. #라마찬드란 조사구 통계는 몰프로비티 서버(Molprobity server)에 의해 보고된다. |
|
아바트린에 의한 트롬빈 억제는 작은 펩티딜 기질과 경쟁적인 억제를 보인 아미드 분해 분석으로부터 예상된 바와 같이 활성 위치의 차단을 통해 나타난다. 모델은 절단 후 활성 위치의 상태를 보여주었고, 트롬빈 전하 중계 시스템이 제 위치에 있는 것처럼 보였다. TSer195의 Oγ은 THis57의 Nε로부터 2.7 Å 떨어져 있고, THis57의 Nδ는 TAsp102의 Oδ로부터 2.7 Å 떨어져있다. 절단이 일어났기 때문에, ALys10(P1)의 Cα는 친핵체(TSer195의 Oγ)로부터 3.2 Å 더 멀리 이동해있는 것으로 보인다. ALys10 카보닐 산소는 여전히 TGly193의 백본 질소로부터 3.1 Å 거리에 위치한 산소음이온 홀(oxynion hole)에서 안정화되어 있다. P1 ALys10은 특이성 포켓의 아래에 TAsp189와 수소결합을 형성하는 곁사슬 아민과 함께 예상된 바와 같이 S1 서브 위치(subsite)에 결합한다. 전형적인 가장자리-표면 pi 상호작용과 유사하게 P2 APro9 피롤리딘 고리는 THis57 및 TTyr60A의 방향족 곁사슬과 상호작용하는 것으로 보인다. P3 AVal8 곁사슬은 용매에 노출되고 특정 상호작용이 없다. 반대로 P4 AAla7 곁사슬의 메틸기는 완전히 TAsn98, TLeu99, TIle174 및 TTrp216에 의해 형성된 소수성 포켓에 파묻혔다. P5 AThr6 및 P6 AGln5는 모두 펩타이드가 엑소사이트-II에 접근함에 따라 용매에 노출되지만, 이 지점을 지나서 아바트린에 대한 전자 밀도가 부족하여 펩타이드가 엑소사이트-II를 향해 확장이 되는지 결정할 수 없다(도 12C).
잘리기 쉬운 결합에 대해 C-말단에 바로 위치한 잔기는 엑소사이트-I 부근까지 좋은 전자 밀도를 보이지 않았다. 전체적으로, 아바트린의 이 부분은 히루젠, 히루로그-1 및 바리어진과 같은 엑소사이트-I 그루브에 결합한다[Koh CY, et al., PLoS One 2011; 6; Skrzypczak-Jankun E, et al., J Mol Biol 221: 1379-93 (1991); Qiu X, et al., Biochemistry 31: 11689-97 (1992)]. 정전기 및 소수성 상호작용 모두 이 결합에 대해 중요한 것으로 보인다. 아바트린 C-말단과 엑소사이트-I 사이의 3개의 정전기적 상호작용(AAsp19-TArg73, AGlu21-TArg75 및 AGlu27-TArg77A)이 관측되었다(도 12D). 3개의 소수성 곁사슬(APhe20, AIle23 및 AIle28)은 아바트린-트롬빈 계면에 파묻힌다. AIle23 및 AIle28은 TPhe34, TLeu65, TArg67, TTyr76 및 TIle82에 의해 형성된 큰 소수성 포켓 안으로 파묻힌다. 추가적으로, 부분적으로 노출된 APro24는 TTyr76의 페놀 고리와 약간의 유리한 접촉을 하는 것으로 보인다. 잔기 AGlu22 및 ASer25는 용매에 노출되고 곁사슬 밀도가 부족하므로 트롬빈과의 상호작용은 해석할 수 없다. 또한, AIle29 및 AGlu30의 배치를 허용하지 않는 AIle28 이후에 매우 낮은 전자 밀도가 관찰된다.
혈전-
결합된
트롬빈 억제
지혈 피브린 응고는 활성 트롬빈을 잡아 그 순환을 제한한다[Francischetti IMB, et al., Biochemistry 38: 16678-85 (1999)]. 이 혈전-결합된 트롬빈은 헤파린-항트롬빈 III 복합체에 의해 억제되는 것으로부터 보호되고, 활성 트롬빈의 저장소로서 작용하여 재-혈전증에 중요한 역할을 한다고 생각된다[Francischetti IMB, et al., Biochemistry 38: 16678-85 (1999); Bridge KI, et al.,Thromb Haemost 112: 1-8 (2014)]. 그러므로, 혈전-결합된 트롬빈의 억제는 재-혈전증을 방지할 수 있다. 따라서 혈전-결합된 트롬빈을 억제하는 아바트린의 능력을 평가하였다. 아바트린은 혈전-결합된 트롬빈을 용액 중의 트롬빈보다 높은 1.74 ± 0.35 μM의 IC50인 용량-의존적인 방식으로 억제하였다(도 13). 아카트로반(argatroban)과 같은 활성 위치 억제제는 혈전-결합된 트롬빈을 2.7 μM의 IC50인 농도 의존적인 방식으로 신속하고 가역적으로 억제한다[Berry C, et al., Thromb Haemost 72: 381-6 (1994)].
FeCl
3
-유도된 경동맥 혈전증 모델
아바트린의 생체 내 항혈전 효능을 평가하기 위해, 마우스에서 FeCl3-유도된 경동맥 혈전증 모델을 사용하였다[Wan C, et al., J Thromb Haemost 13: 248-61 (2015); Eckly a, et al., J Thromb Haemost 2011; 9: 779-89]. 평균 폐색 시간(TTO)은 아바트린을 정맥 안으로 주사한 마우스에서 용량-의존적인 방식으로 증가하였다. 대조군 동물에서 7.24 ± 1.46분인 TTO가 3 및 10 mg/kg 주사한 동물에서 각각 15.03 ± 3.23 및 22.51 ± 4.19분까지 증가하였다. 아바트린의 효능은 비교 약제(comparator drug)로서 히루로그-1과 비교하였다. 3 및 10 mg/kg의 히루로그-1을 주사한 마우스에서의 TTO는 각각 9.70 ± 3.15 및 15.22 ± 3.39분이었다. 따라서, 아바트린은 히루로그-1과 비교하여 더 나은 항혈전증 효능을 보였다(도 14).
진드기
전사체로부터
펩타이드
서열의 확인
바리어진 및 아바트린과 유사한 펩타이드 서열은 암블리옴마 배리어가튬(Amblyomma variegatum ), 리피세팔루스 풀첼루스( Rhipicephalus pulchellus ), 암블리옴마 아메리카눔(blyomma americanum ), 암블리옴마 카제네스( Amblyomma cajenesse), 암블리옴마 마쿨라튬( Amblyomma maculatum ) 및 히알롬마 마르지나튬 루피프스(Hyalomma marginatum rufipes )의 공지된 전사체의 독립형 BLAST 분석을 수행하여 확인하였다. 이 서열은 수동으로 바리어진 및 아바트린과 정렬시키고, 추가 분석을 위해 각 진드기의 하나의 펩타이드를 선택하였다.
다른
펩타이드의
아미드 분해 활성의 억제 및 선택성
A. 배리어가튬 및 다른 참진드기로부터의 아바트린 전사체와 유사한 좀 더 많은 단백질 서열은 NCBI 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 이 서열 중 일부는 합성되어 트롬빈 억제 활성에 대해 조사되었다(도 15 및 표 4). 이들 서열은 수탁번호 DAA34688.1, DAA34160.1 및 DAA34258.1을 가진다. 아바트린 전사체와 유사하게, 짧은 바리어진-유사 성숙한 펩타이드에 대한 번역 후 변이를 통해 처리될 수 있는 여러 반복을 포함한다. 대표적인 서열을 합성하였고, 트롬빈 억제에 대해 조사하였고, 울트라바리어진으로 명명하였다. 울트라바리어진은 바리어진과 50% 동일하다.
| 펩타이드 | 분자량(Da) | IC50 (nM) | 친화도(nM) |
| 아바트린 | 3139.4 | 6.95 ± 0.42 | 0.545 ± 0.02 |
| 바리어진 | 3609.2 | 4.17 ± 0.93 | 0.283 ± 0.01 |
| 울트라바리어진 | 3293.5 | 0.26 ± 0.008 | 0.001 |
| 암블리옴마 아메리카눔 | 3830.4 | 14.29 ± 0.12 | 1.631 ± 0.61 |
| 암블리옴마 마쿨라튬 | 4940.6 | 130.20 ± 1.74 | - |
| 리피세팔루스 산귀니어스 | 4773.1 | 42.38 ± 0.62 | 8.79 ± 0.61 |
| 히알롬마 마르지나튬 루피프스 | 5660.7 | 32.48 ± 3.94 | 6.135 ± 0.39 |
울트라바리어진은 서열번호 2로 표시되는 30-잔기 펩타이드이며 데이터베이스 전사체로부터 유래된 212개 아미노산 단백질 서열의 30개 잔기 스트레치를 기반으로 한다. 그러나, 212개 아미노산 단백질 서열에서 발견되는 30개 잔기 스트레치로부터 울트라바리어진에서 하나의 아미노산 잔기를 치환하였다(서열번호 2에 도달하기 위한 Thr22Glu). 서열번호 2의 펩타이드는 4.4 pM의 K i로 트롬빈을 억제한다는 것을 발견하였다. 342 pM의 K i를 갖는 바리어진과 비교하여, 울트라바리어진은 70배 이상 더 강력하다. 트롬빈 억제에 있어 울트라바리어진의 구조-기능 관계를 더 이해하기 위해, 좀 더 많은 울트라바리어진의 변이체를 다음과 같이 합성하였다. UV003, UV004 및 UV005는 울트라바리어진-바리어진 혼성 펩타이드이다. 울트라바리어진 서열을 기반으로 하여, UV003에서 N-말단의 처음 7개 잔기는 바리어진 서열로 교체하였다. UV004에서 같은 방식으로 이어서 7개의 잔기를 교체하였다. UV005에서 울트라바리어진의 마지막 6개의 잔기를 바리어진의 마지막 8개 잔기로 교체하였다(바리어진은 2개의 추가 잔기를 가진다). UV003 및 UV004의 K i는 울트라바리어진과 유사한 것으로 발견되었고, 이는 N-말단의 처음 14개 잔기에서 울트라바리어진 서열의 바리어진 서열로의 교체는 그 활성에 있어 크게 중요하지 않음을 보여준다(도 16). 그러나, UV005는 트롬빈에 대한 친화도가 약 3.6배 감소함을 보였다. 그러므로 바리어진과 울트라바리어진 간의 억제성 활성의 주요한 차이는 그들의 C-말단으로부터 나온다. 울트라바리어진의 C-말단의 서열은 바리어진에 비해 더 강력한 억제제가 되도록 만든다(도 17A 및 C).
울트라바리어진 C-말단의 역할을 확인하기 위해, 트롬빈에 의한 울트라바리어진의 C-말단 절단 산물을 합성하였고, UV011로 시험하였다(도 17B 및 D). 이 펩타이드는 1.39 pM의 K i를 가지며, 이는 바리어진 C-말단 절단 산물(MH22, Ki = 14.1 nM)보다 약 10배 더 나은 것이고, 아바트린 C-말단 절단 산물(IS20, K i = 5.76 nM)보다 약 4배 더 나은 것이다. UV012에서 Ala27의 Glu로 변이는 또한 울트라바리어진과 비교하여 친화도를 5배 감소시켰다. Thr14의 Gln로 변이는 울트라바리어진 활성을 변화시키지 않았다(도 18A 및 B). 울트라바리어진이 UTyr12-USer13을 가지는 것과 같이 그 위치의 바리어진 서열 VHis12-VLys13에서 Tyr-Ser로 변이시키는 것은 바리어진 활성을 크게 향상시키지 않았다(도 18C 및 D). 모든 울트라바리어진 펩타이드의 결과는 표 5에 요약되어있다.
N- 또는 C-말단에 있는 시스테인 잔기를 가지는 4개의 펩타이드를 합성하고, 활성을 시험한다. 시스테인 잔기를 가진 펩타이드 변이체는 코팅을 위해 표면에 펩타이드를 공유 결합으로 고정시키는 방법을 제공한다. 지금까지, 펩타이드의 말단에 시스테인의 추가는 시스테인이 없는 유사한 서열과 비교하여 활성에 있어 전형적으로 약간이지만 받아들일 만한 정도로 감소시켰다. 펩타이드의 IC50 및 K i 는 표 5에 나열되어있다.
| 서열 | 분자량 ( Da ) |
IC
50
(nM)
|
K i (pM) | |
| 울트라바리어진 | SDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEE | 0.40 ± 0.09 | 4.40 ± 0.35 | |
| UV003 | SDQGDVAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEE | 0.60 ± 0.20 | 4.21 ± 0.97 | |
| UV004 | SDEAVRAEPKMHKTAPPGDFEEIPDDAIEE | 0.46 ± 0.08 | 4.55 ± 0.374 | |
| UV005 | SDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPEEYLDDES | 0.91 ± 0.47 | 16.0 ± 3.05 | |
| UV011 | MYSTAPPGDFEEIPDDAIEE | 1.66 ± 0.75 | 1387 ± 230 | |
| UV012 | SDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDEIEE | 0.94 ± 0.68 | 23.0 ± 8.05 | |
| UV013 | SDEAVRAIPKMYSQAPPGDFEEIPDDAIEE | 0.341 ± 0.07 | 4.49 ± 1.61 | |
| 바리어진 YS | SDQGDVAEPKMYSTAPPFDFEAIPEEYLDDES | 3.16 ± 0.55 | 671 ± 76.8 | |
| UV007 | CDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEE | 0.601 ± 0.069 | 6.27 ± 1.64 | |
| UV008 | SDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEECA | 1.82 ± 0.769 | 78.6 ± 34.5 | |
| UV014 | MYSTAPPGDFEEIPDDAIEEGCCC | 1.98 ± 0.665 | 2470 ± 450 | |
|
UV015
|
SDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEEGCCC | 1.00 ± 0.129 | 8.52 ± 1.37 |
상기에 보고된 다른 진드기로부터의 펩타이드의 트롬빈 아미드 분해 활성의 억제 및 선택성을 조사하였다. 모든 펩타이드는 선택적으로 트롬빈을 억제하는 것으로 발견되었다. 이 펩타이드의 동력학 및 선택성은 상세하게 도 19 내지 25에 나타낸다.
혈액 수집 기구에서 안정화제로서 트롬빈 억제제
상온에서, 세가지의 농도: 75 μM, 150 μM 및 300 μM에서 항응고 효과에 대한 바리어진, 울트라바리어진 및 아바트린을 조사하였다. 바리어진은 특허 출원(WO2012075407A2)에서 혈액 튜브에서 첨가제로서 이전에 포함되었지만 아바트린 및 울트라바리어진은 포함되지 않았다. 아바트린(K i = 545 pM)은 바리어진(K i = 318 pM)과 유사한 친화도를 가지고 바리어진과 비견할만한 항응고 효과를 보였다(표 6).
| 최종 농도( 마이크로몰 ) | |||
| 300 | 150 | 75 | |
| 혈전 형성이 관측되는 시간(h) | |||
| 울트라바리어진 | 101-139 | 101-139 | 91-101 |
| 아바트린 | 52-66 | 52-66 | 46-52 |
| 바리어진 | 52-66 | 52-66 | 46 |
| β- 바리어진 | 4 | 3-4 | 3-4 |
혈전 형성이 관측되는 시간은 같은 농도에서 아바트린과 바리어진은 동일하다(예를 들어, 150 μM에서 52-66시간). 예상한 바와 같이, 울트라바리어진은 아바트린 및 바리어진을 능가하였다(표 3). 이는 후자의 두 펩타이드와 비교하여, 울트라바리어진(K i = 1.5 pM)의 >200배 더 강한 친화도와 일관되는 것이다. 심지어 시험된 가장 낮은 농도에서, 울트라바리어진(75 μM에서 91-101시간)의 항응고 효과는 시험된 바리어진/아바트린(300 μM에서 52-66시간)의 가장 높은 농도에서보다 더 길게 지속되었다. 반대로, 또 다른 변이체(β-바리어진)는 K i >30 nM을 가지고(즉, 바리어진 보다 >100배 더 약함), 3-4시간 동안 혈전 형성을 막을 수 있다. 데이터는 트롬빈에 대한 펩타이드의 친화도가 혈액 튜브에서 항응고 효과와 상관관계가 있음을 보여주었다.
혈소판 기능 검사를 위한 혈액의 확장된 안정성
Multiplate® 분석기를 사용하여 150 μM 및 300 μM에서 울트라바리어진, 아바트린 및 바리어진으로 항응고된 혈액의 혈소판 응집 반응을 검사하였다. ADP(6.5 μM)를 작용제로 사용하였다. 시트레이트 및 히루딘을 두개의 대조군으로 사용하였다. 얻어진 결과는 표 7 및 도 26에 나타낸다.
| 상이한 시점에서 멀티플레이트 AUC (U) | ||||||||||
| 1.5시간 | 4시간 | 24시간 | 48시간 | 72시간 | ||||||
| 0.109 M 시트레이트 | 37 | 32.2 | 12.9 | 1.4 | 0.7 | |||||
| > 15 ㎍ /ml 히루딘 $ | 69.5 | 50.2 | 36.2 | 29.1 | 26.9 | |||||
| 최종 펩타이드 농도 | ||||||||||
| 300 μM | 150 μM | 300 μM | 150 μM | 300 μM | 150 μM | 300 μM | 150 μM | 300 μM | 150 μM | |
| 울트라바리어진 | 66.3 | 55.7 | 46.1 | 52 | 39.5 | 43.1 | 25.4 | 7.4 | 15.4 | 9.6 |
| 아바트린 | 62.4 | 60.9 | 46.8 | 53.6 | 43.3 | 55.8 | 3.5 | * | * | * |
| 바리어진 | 52.3 | 65.2 | 33.9 | 48.6 | 40.5 | 41.9 | 18.9 | * | * | * |
| *혈전 형성으로 인해 판독 값이 얻어지지 않았다. $ 히루딘 Vacuette®튜브 생산 정보에 기재된 바와 같은 히루딘의 농도 |
||||||||||
신뢰성 있는 판독 값으로 간주할 수 있는 반응의 하한에 관한 문헌에 합의가 없기 때문에, 32 U의 컷-오프를 사용하기로 결정하였다(도 26, 점선). 이는, 혈소판 기능 검사의 표준화 CLSI 가이드 라인 H58-P에서 권장하는 최대 분석 시간인 4시간에서 실험의 시트레이트-함유된 혈액에 의해 주어진 반응이다.
울트라바리어진, 아바트린 및 바리어진을 포함한 혈액 튜브는 모두 금 표준, 시트레이트와 비교하여 안정화 창(stabilization window)에 있어 최소 6배 증가를 보였다. 처음 24시간에서, 히루딘(도 26, 오렌지색)을 포함한 혈액은 울트라바리어진(도 26, 회색), 아바트린(도 26, 파란색) 및 바리어진(도 26, 노란색)과 유사하게 행동하였고, 이는 히루딘 또한 강력하고 직접적인 트롬빈 억제제임을 고려할 때 놀라운 것이 아닐 수 있다. 트롬빈에 대한 울트라바리어진 및 히루딘의 비교적 강한 친화도는 다른 2개의 펩타이드와 비교하여 48시간 및 72시간에서 더 높은 응집 반응을 일으키게 한다. 그러나 이 판독 값은 설정한 32 U 컷-오프 약간 아래의 값이다(도 26).
고찰
상기에 상세히 설명된 바와 같이 아바트린과 바리어진 사이의 낮은 전체 서열 동일성(40%) 및 주요 기능성 잔기의 변이에도 불구하고, 아바트린은 바리어진과 유사한 방식으로 기능하는 것으로 보인다. 둘 다 유사한 억제 상수를 가지며(바리어진의 K i = 342 pM, 아바트린의 K i = 545 pM), 활성 위치 및 엑소사이트-I를 표적으로 하여 빠르고 강하게 결합하는 2가 억제제로서 트롬빈을 억제한다. 바리어진 및 아바트린 모두 정석으로 트롬빈에 결합하고, 따라서 결합시 트롬빈에 의해 절단된다. 트롬빈에 의한 바리어진의 절단(완료까지 4시간)은 아바트린(완료까지 10시간)에 비해 더 빠르게 진행된다. 아바트린의 느린 절단은 AGly15, AGly17 및 AGly18에 의해 부여된 전반적인 유연성 때문일 수 있다. 두 펩타이드의 절단 산물은 작은 펩티딜 기질에 관하여 비-경쟁적으로 트롬빈을 억제하며, 바리어진 절단 산물(MH22)의 친화도는 아바트린의 절단 산물(IS20)에 비해 약 2배 낮았다[Koh CY, et al., ChemBioChem 10: 2155-8 (2009)]. 아바트린의 느린 절단 속도는 평형 상태에서 펩타이드의 절단을 위한 유리 트롬빈의 이용가능성을 감소시키는 IS20의 높은 친화도 때문일 수 있다. N-말단의 산성 잔기는 빠른 결합 동력학을 결정하지 않는 반면에, 12번 위치의 세린은 히스티딘에 비해 약간의 더 나은 친화도 부여를 보이는 것이 나타났다. 바리어진 및 아바트린 사이의 서열 비교는 구조-기능 연구에 집중하도록 했으며, 트롬빈-억제제 상호작용을 이해하는데 도움을 주었다.
트롬빈-아바트린 복합체의 구조는 트롬빈-히루로그-1 복합체(279 잔기에 대한 0.41 Å의 RMSD)의 구조와 가장 유사하고, 이는 두 경우 모두 절단된 펩타이드로 결정화된 펩티딜 2가 트롬빈 억제제이기 때문이다[Skrzypczak-Jankun E, et al., J Mol Biol 221: 1379-93 (1991); Bourdon P, et al., FEBS Lett 294: 163-6 (1991)]. 히루로그-1은 아바트린에 비해 더 짧은 펩타이드이지만, 두 펩타이드 모두 그들의 트롬빈 활성 위치 및 엑소사이트-I 결합 서열에 있어 상당한 수준의 동일성을 보인다. 절단 후, 잘리기 쉬운 결합에 대한 N-말단 부분 및 엑소사이트-I 부분만이 각각의 구조로 구축될 수 있다. 두 결정 모두 유사한 단위 세포 부피를 가진다(C2; a/b/c = 70/72/72 Å; β = 100°). 반대로, 트롬빈-바리어진 복합체는 상이한 결정 형태로 결정화되고(C2; a/b/c = 125/51/62 Å; β = 99°), 절단된 C-말단 펩타이드만이 결합되는 것으로 보인다.
아바트린 및 히루로그-1 모두 트롬빈의 동일한 S1 포켓에 결합하는 P1 잔기를 가진다. 비록 히루로그-1의 P1 Lys이 물 분자를 통해 S1 포켓의 바닥에서 TAsp189에 결합하지만[Bode W. Blood Cells, Mol Dis 36: 122-30 (2006)], ALys10 및 TAsp189 사이의 직접적인 상호작용을 관찰하였다. 히루로그-1을 이용한 동일한 연구는 Arg이 Lys으로 교체되었을 때 친화도에 있어 10배의 감소를 보였지만, 구조에서 관찰된 직접적인 상호작용에 따라 ALys10에서 Arg로의 변이와 함께 작은 변화(~3배)를 관찰하였다. 히루로그-1 및 아바트린은 동일한 P2 아미노산(Pro)를 공유하고 따라서 S2 서브사이트에 유사한 방식으로 상호작용한다. 히루로그-1 P3은 아바트린 P4 AAla7가 차지한 동일한 소수성 포켓을 차지하는 D-Phe이다[Skrzypczak-Jankun E, et al., J Mol Biol 221: 1379-93 (1991)]. 모든 효소적 분석법에서 사용되는 발색 기질 S2238은 히루로그-1-P3 내지 P1(D-Phe-Pipecolic acid-Arg)과 거의 동일하다. 아바트린과 히루로그-1은 트롬빈의 동일한 사이트에 결합하는 점을 고려하면, 억제의 경쟁적인 메커니즘은 구조에 따른 것이다.
아바트린(DFEEIPSDEIIE), 히루로그-1(DFEEIPEEYL) 및 바리어진(DFEAIPEEYLDDES)의 엑소사이트-I 결합 부분의 처음 6개 잔기는 거의 동일하다(밑줄 침). 이들 잔기는 또한 결정 구조에서 잘 정렬된다(도 27). 트롬빈과 3개 펩타이드와의 상호작용은 거의 모든 구조에 걸쳐 보존된다. 이 부분의 단일 비-보존되는 잔기(AGlu22 vs. HGlu57 vs. VAla22)는 특정 상호작용 없이 모든 3개의 구조에서 용매에 노출된다. 바리어진 및 히루로그-1은 다음의 4개 잔기를 공유한다, EEYL, 이는 아바트린의 서열 SDEI와 상응한다. 이들 잔기는 히루로그-1-트롬빈 복합체가 아닌 아바트린 및 바리어진-트롬빈 복합체에서 관찰된다. 아바트린의 상응하는 4개 잔기(SDEI) 중에, ASer25 및 AAsp26은 용매에 노출된다. AGlu27 및 VGlu26은 구조적으로 동등하고, TArg77A와 정전기적 상호작용을 가진다. 이어지는 잔기의 분석은 정확한 밀도의 부족으로 방해된다.
증폭을 위한 프라이머를 디자인하기 위해 바리어진 서열을 사용했음에도 불구하고, 바리어진 유전자를 증폭시키지 않았고, 이는 먹이를 주는 상이한 지점에서 이 진드기의 많은 유전자에 의해 생성된 펩타이드의 높은 수준의 가변성을 시사한다. 더 놀랍게도, 아바트린 및 바리어진 모두 다수의 반복체를 함유하는 더 큰 전구체 단백질로서 합성되고, 트롬빈 억제 활성을 가진 짧은 활성 펩타이드로 처리되는 것으로 보인다. 낮은 전체 서열 동일성 및 몇몇 주요 기능성 잔기의 변이에도 불구하고, 두 펩타이드는 트롬빈에 대한 유사한 억제성 메커니즘 및 효과를 가진다. 데이터베이스 검색은 암블리옴마 배리어가튬(BM291228: 3개 펩타이드, 불완전한 전사체; BM293052: 5개 펩타이드; BM289492: 5개 펩타이드), 암블리옴마 아메리카눔(ACG76173: 5개 펩타이드, 불완전한 전사체) 및 암블리옴마 카제네스(ACAJ0085C_1: 4개 펩타이드)에서 바리어진-유사 펩타이드의 반복체를 함유하는 그러한 전구체 단백질의 더 유사한 서열을 밝혀냈다[Nene V, et al., Int J Parasitol 32: 1447-56 (2002); Batista IFC, et al., Toxicon 51: 823-34 (2008)] (도 28). 리피세팔루스 산귀니어스 및 히알롬마 마르지나튬 루피프스와 같은 다른 참 진드기의 침샘에서 유사한 펩타이드의 존재에 대한 증거가 또한 있다. 대부분의 전구체는 3개 내지 5개 펩타이드로 가공될 수 있으며, 펩티딜 트롬빈 억제제와 밀접하게 관련된 신규한 계를 형성한다. 트롬빈 억제제의 계를 익소트린(Ixothrins; Ixodidae thrombin inhibitors)으로 명명한다. 익소트린은 이황화결합이 없는 작은 트롬빈 억제제이고, 참진드기(hard tick) 과에서 발견된다. 그들은 트롬빈의 엑소사이트 1 및 활성 위치에 결합한다. 익소트린의 다수 카피는 한 전구체에서 생산된다. 각 전구체는 신호 펩타이드를 가지고, 번역후 가공은 소포체 또는 침샘에서 일어나 익소트린이 성숙된다. 펩티딜 트롬빈 억제제의 생산에서 그러한 다중-산물 접근은 참진드기 사이에 널리 퍼져있는 것으로 보인다. 비록, 다양성이 또한 단일 전구체 단백질로 이루어진 첫번째 예시 중 하나일 것이라고 생각되지만, 단일 숙주 응고 분자를 표적으로 하는 침샘 구성요소의 다양성은 드문 것이 아니다[Francischetti IMB, et al., J Proteomics 71: 493-512 (2008); Fontaine A, et al., Parasit Vectors BioMed Central Ltd; 4: 187 (2011)].
결론적으로, 참진드기가 매우 유사한 전반적인 구조와 기능을 유지하면서 다수의 다양화된 서열을 적용시킴으로써 응고에 있어 중요한 효소인 트롬빈을 불활성화시키는 것을 입증하였다. 아바트린 및 몇몇 다른 펩타이드는 서열의 유사성에도 불구하고, FeCl3-유도된 경동맥 혈전증 모델에서 히루로그-1에 비해 혈전증을 더 잘 예방하는 것을 입증하였다. 이 분자 군은 외과적인 수술 동안 동맥 혈전증 및 재폐색의 예방, 안정성 및 효능 프로파일의 상세한 평가 후의 정형외과 수술 및 심근경색의 관리와 같은 몇몇 임상적 징후 및 심혈관계 수술에 유용한 항응고제를 생산할 수 있다[Bauer K A. Hematology Am Soc Hematology Educ Program 2013: 464-70 (2013)].
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<212> PRT
<213> Amblyomma variegatum
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<213> Amblyomma variegatum
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<213> Amblyomma variegatum
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<220>
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<220>
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<220>
<221> MOD_RES
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<220>
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<223> ultravariegin-variegin hybrid
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<220>
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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Pro Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Asp Ala Ile Glu Glu
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1 5 10 15
Pro Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Asp Ala Ile Glu Glu Cys Ala
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<220>
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Cys Cys
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<211> 35
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Ser Gly Glu Asp His Thr Ala Val Pro Lys Met Ser Arg Lys Gly Leu
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Gly Gly Asp Phe Glu Asp Ile Pro Pro Glu Ala Tyr Glu Arg Ala Leu
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Glu Ala Arg
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Ser Pro Thr Glu Ser Ala Ala Pro Arg Leu His Gln Arg Glu Gly Gly
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Gly Gly Asp Phe Glu Asn Val Glu Tyr Asp Gln Asp Gln Lys
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<213> Rhipicephalus sanguineus
<400> 24
Ser Asp Val Ala Pro Ala Asp Tyr Glu Ser Asp Glu Gly Asp Asn Asp
1 5 10 15
Gly Gly His Asp Gly Ser Glu Val Ala Lys Pro Lys Met Pro Arg Gly
20 25 30
Asn Gly Gly Gly Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Val Glu
35 40 45
<210> 25
<211> 51
<212> PRT
<213> Hyalomma marginatum
<400> 25
Thr Gly Ser Asp Asp Asp Asp Glu Tyr Asp Met Tyr Glu Ser Asp Gly
1 5 10 15
Asp Ser Asn Glu Gly Asn Asp Asn Asp Glu Phe Glu Thr Ala Val Pro
20 25 30
Arg Leu Pro Asn Pro Asn Ser Gly Arg Asp Ser Glu His Ile Pro Met
35 40 45
Pro Val Asn
50
<210> 26
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Avathrin
<400> 26
tcgggtggcc atcagactgc tgttccgaag atatctaagc aaggcttggg tggagacttt 60
gaagaaattc caagtgatga aataatcgag 90
<210> 27
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ultravariegin native
<400> 27
tcagacgaag ctgtcagggc gattcccaag atgtactcga ctgccccacc gggagatttc 60
gaaacaatcc ctgacgacgc tattgaggag 90
Claims (23)
- 서열번호 1, 이의 변이체 또는 단편, 및 서열번호 2, 이의 변이체 및 단편, 서열번호 22, 이의 변이체 또는 단편, 서열번호 23, 이의 변이체 또는 단편, 서열번호 24, 이의 변이체 또는 단편 및 서열번호 25, 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 트롬빈 억제제.
- 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인, 분리된 트롬빈 억제제.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 억제제는 서열번호 2, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21을 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 것인, 분리된 트롬빈 억제제.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제는 트롬빈 섬유소원 용해 활성 및/또는 트롬빈 아미드 분해 활성을 억제하는 것인, 분리된 트롬빈 억제제.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 아미드 분해 분석으로 평가시, 트롬빈 억제제가 400 nM 미만, 바람직하게 300 nM 미만, 200 nM 미만, 100 nM 미만, 50 nM 미만, 10 nM 미만, 바람직하게 9 nM 미만, 8 nM 미만, 7 nM 미만, 6 nM 미만, 5 nM 미만, 4 nM 미만, 3 nM 미만, 2 nM 미만 또는 1 nM 미만의 IC50를 가지는 것인, 트롬빈 억제제.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 아미드 분해 분석으로 평가시, 트롬빈 억제제가 6000 nM 미만, 바람직하게 2000 nM 미만, 500 nM 미만, 400 nM 미만, 300 nM 미만, 200 nM 미만, 100 nM 미만, 50 nM 미만, 10 nM 미만, 바람직하게 9 nM 미만, 8 nM 미만, 7 nM 미만, 6 nM 미만, 5 nM 미만, 4 nM 미만, 3 nM 미만, 2 nM 미만 또는 1 nM 미만의 Ki를 가지는 것인, 트롬빈 억제제.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 아미노산 서열을 포함하는, 혈전과 관련된 질병의 예방 또는 치료를 위한 분리된 트롬빈 억제제.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 트롬빈 억제제와 트롬빈을 접촉시키는 단계를 포함하는, 트롬빈 활성을 억제하는 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 적어도 하나의 트롬빈 억제제는 혈액 수집 튜브에서 항응고제로서 존재하는 것인, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 적어도 하나의 트롬빈 억제제는 의료 기구, 예컨대 스텐트, 카테터 및 다른 의료용 튜빙의 표면 코팅 물질로서 존재하는 것인, 방법.
- 트롬빈 활성과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 의약의 제조를 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 트롬빈 억제제의 용도.
- 제11항에 있어서, 상기 관련된 질병은 심장마비, 뇌졸중 및 색전증을 유발하는 동맥 및 정맥 혈전증; 불안정한 협심증, 관상동맥 성형술, 경피 관상동맥 중재술 및 심장 수술 동안의 응고, 심부정맥혈전증; 혈전정맥염; 폐색전증; 기원이 심장, 죽상경화판, 판막 또는 혈관 보철물 또는 미지의 기원일 수 있는 색전 및 미세색전 에피소드; 파종성 혈관내 응고로부터 선택되는 것인, 용도.
- 제11항에 있어서, 상기 의약은 AV 단락(AV shunt) 혈전증, 타박상, 염좌, 근육 파열, 외상 혈종, 부종, 홍반, 정맥류, 정맥주위염 및 치질, 특히 혈전-색전 합병증과 관련된 치질의 항문 정맥주위염의 예방 및/또는 치료를 위한 국소용인, 용도.
- 혈전과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 개체에게 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 트롬빈 억제제의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 혈전과 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 관련된 질병은 심장마비, 뇌졸중 및 색전증을 유발하는 동맥 및 정맥 혈전증; 불안정한 협심증, 관상동맥 성형술, 경피 관상동맥 중재술 및 심장 수술 동안의 응고, 심부정맥혈전증; 혈전정맥염; 폐색전증; 기원이 심장, 죽상경화판, 판막 또는 혈관 보철물 또는 미지의 기원일 수 있는 색전 및 미세색전 에피소드; 파종성 혈관내 응고로부터 선택되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 억제제를 개체 또는 상기 개체로부터 분리된 조직 샘플에 투여하는 단계 및 트롬빈에 결합된 상기 트롬빈 억제제의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 방법으로서, 정상 트롬빈 수준에 결합된 억제제의 수준과 비교하여 트롬빈에 결합된 상기 억제제의 상승된 수준의 검출은 상기 질병 또는 병태를 나타내는 것인, 혈전증과 관련된 질병 또는 병태를 진단하는 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 억제제를 개체 또는 상기 개체로부터 분리된 조직 샘플에 투여하는 단계 및 트롬빈에 결합된 상기의 적어도 하나의 트롬빈 억제제의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 개체에서 트롬빈의 축적을 검출하는 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 혈전 억제제의 유효량을 포함하는 약학적 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 억제제를 코딩하는 분리된 핵산 분자.
- 제19항에 있어서, 상기 분자가 서열번호 26 및 서열번호 27, 이의 변이체 또는 단편으로 표시되는 군으로부터 선택되는 것인, 핵산분자.
- 제19항 또는 제20항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
- 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 적어도 하나의 혈전 억제제를 포함하는, 트롬빈 활성을 조절하기 위한 키트.
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