JP2022542519A - 酸化耐性セルピン - Google Patents

Abstract

本開示は、好中球又は膵臓エラスターゼ阻害活性を有するセルピンＢ１ポリペプチドを提供し、エラスターゼ阻害活性はフリーラジカルによる酸化に対する耐性を示す。フリーラジカルは、活性酸素種若しくは活性窒素種又は両方であり得る。幾つかの実施形態において、セルピンＢ１ポリペプチドは、配列番号１と比較して残基３４４でのアミノ酸置換を含む。本明細書において開示されるセルピンＢ１ポリペプチドは、正常な個体と比較したフリーラジカル生成の増加又は環境源におけるフリーラジカルへの曝露の増加に関連する疾患又は遺伝子疾患を有する患者を処置するために使用され得る。

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１９年８月１日付で出願された米国仮特許出願第６２／８８１，８５８号の利益及び優先権を主張する。この仮特許出願の内容全体は、引用することによって全ての目的のために本明細書の一部をなすものとする。

ヒトセルピンＢ１は、セリンプロテイナーゼインヒビター（セルピン）スーパーファミリーのメンバーであり、抗炎症特性を有する。抗炎症特性は、反応部位ループ（ＲＳＬ）により炎症促進性好中球セリンプロテアーゼ（ＮＳＰ）を阻害する能力、並びにＲＳＬのＣ末端に位置するカスパーゼ動員ドメイン結合モチーフ（ＣＢＭ）によりプロカスパーゼの自己会合及び自発的活性化を抑える能力に部分的に起因する（非特許文献１、非特許文献２）。ヒトセルピンＢ１は、２つの重複する反応部位：Ｐｈｅ－３４３及びＣｙｓ－３４４での効率的な反応によりＮＳＰであるカテプシンＧ及びエラスターゼを阻害することができる。

Cooley, et al., 2001 Choi et al., 2019

幾つかの態様では、本開示は、配列番号１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むセルピンＢ１バリアントポリペプチドを提供し、セルピンＢ１バリアントポリペプチドは、好中球又は膵臓エラスターゼ阻害活性を有し、セルピンＢ１バリアントポリペプチドのエラスターゼ阻害活性は、フリーラジカルによる酸化に対する耐性を示す。フリーラジカルは、活性酸素種若しくは活性窒素種又は両方であり得る。幾つかの実施の形態において、セルピンＢ１バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して残基３４４でのアミノ酸置換を含む。幾つかの実施の形態において、アミノ酸置換は、Ｃ３４４Ａ、Ｃ３４４Ｖ、及びＣ３４４Ｇからなる群から選択される。

幾つかの実施の形態において、本明細書に開示されるセルピンＢ１バリアントポリペプチドは、ＩｇＧのＦｃ部分、抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に融合されている。幾つかの実施の形態において、セルピンＢ１バリアントポリペプチドは、ペグ化されている。

また本明細書において、本開示において開示されるセルピンＢ１バリアントポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドも提供される。

また本明細書において、本出願において開示されるセルピンＢ１ポリペプチドのいずれかと薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物も提供される。幾つかの実施の形態において、医薬組成物は、配列番号１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むセルピンＢ１ポリペプチドと、システイン３４４の酸化を防止する還元剤とを含み、ここで、該ポリペプチドは、好中球又は膵臓エラスターゼを阻害することができる。幾つかの実施の形態において、還元剤は、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）である。

また本明細書において、正常な個体と比較したフリーラジカル生成の増加又は環境源におけるフリーラジカルへの曝露の増加に関連する疾患を有する患者を処置する方法も提供される。方法は、セルピンＢ１バリアントポリペプチドを投与することを含み、セルピンＢ１バリアントポリペプチドが配列番号１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含み、セルピンバリアントポリペプチドが、配列番号１の天然タンパク質配列と比較して残基３４４でのアミノ酸置換を含み、上記セルピンＢ１バリアントポリペプチドが、好中球又は膵臓エラスターゼのセリンプロテアーゼ活性を阻害することができ、フリーラジカルによる酸化に対する耐性を示す。幾つかの実施の形態において、フリーラジカルは、活性酸素種、活性窒素種、又は両方である。幾つかの実施の形態において、セルピンバリアントポリペプチドは、配列番号２～４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

また本明細書において、正常な個体と比較したフリーラジカル生成の増加又は環境源におけるフリーラジカルへの曝露の増加に関連する疾患又は遺伝子疾患を有する患者を処置する方法であって、本明細書において開示されるセルピンＢ１バリアントポリペプチドを含む医薬組成物を投与することを含む、方法も提供される。また、正常な個体と比較したフリーラジカル生成の増加又は環境源におけるフリーラジカルへの曝露の増加に関連する疾患又は遺伝子疾患を有する患者を処置する方法であって、野生型セルピンＢ１（配列番号１）である配列又は野生型セルピンＢ１ポリペプチド（配列番号１）と少なくとも９０％同一な配列を含むセルピンＢ１ポリペプチド、及び本明細書において開示される還元剤の医薬組成物を投与することを含む、方法も提供される。

幾つかの実施の形態において、疾患又は遺伝子疾患は、環境中に存在するフリーラジカル（例えば、タバコの煙、電子タバコ装置からの放出物）への曝露、又は正常な個体と比較した自然免疫細胞、粘膜細胞、若しくは腺細胞に存在する酵素によるフリーラジカル生成の増加に関連する。幾つかの実施の形態において、疾患は、感染性疾患、自己免疫疾患、呼吸器疾患、代謝疾患、心血管疾患、神経変性疾患、又は腫瘍疾患の群から選択される。感染性疾患としては、限定されるものではないが、呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、エボラウイルス、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、及び他の日和見病原体により引き起こされる、肺疾患又は全身性疾患、例えば、急性肺損傷（ＡＬＩ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、肺炎、細気管支炎、全身性凝固障害、又は出血性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。自己免疫疾患としては、１型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、及び患者に突発性炎症を繰り返し起こさせる根底にある遺伝子変異（複数の場合もある）を有する無菌性自己炎症性疾患（ＳＡＩＤ）が挙げられるが、これらに限定されない。呼吸器疾患としては、アレルギー性喘息、喫煙者肺気腫、ＣＯＰＤ、及び特発性肺線維症（ＩＰＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。代謝疾患としては、２型糖尿病、インスリン抵抗性、脂質異常症、及び白内障発症が挙げられるが、これらに限定されない。心血管疾患としては、アテローム性動脈硬化症及び高血圧が挙げられるが、これらに限定されない。神経変性疾患としては、パーキンソン病及びアルツハイマー病が挙げられるが、これらに限定されない。腫瘍疾患としては、結腸直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、肺癌、及び膀胱癌が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において開示される酸化耐性セルピンＢ１バリアントポリペプチド又はその組成物は、吸入により、気管内に、局所的に、又は注射により皮下に、静脈内に、若しくは腹腔内に投与され得る。幾つかの実施の形態において、セルピンＢ１バリアントポリペプチド又は野生型セルピンＢ１（配列番号１）は、患者の体重１ｋｇ当たり０．０１ｍｇ～１０００ｍｇ（すなわち、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ）の用量で投与される。幾つかの実施の形態において、セルピンＢ１バリアントポリペプチド又は野生型セルピンＢ１が還元剤と組み合わせて投与され、ここで、還元剤は、野生型セルピンＢ１又はセルピンＢ１バリアントポリペプチドのＣ３４４の酸化を防止するのに十分な量で投与される。幾つかの実施の形態において、還元剤は、患者の体重の１キログラム当たり０．０１ｍｇ～１００ｍｇ（すなわち、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ）の用量で投与される。

また本明細書において、野生型セルピンＢ１又はそのバリアントポリペプチドを産生させる方法も提供され、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）において野生型セルピンＢ１又はそのバリアントポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させることを含み、セルピンＢ１バリアントポリペプチドが配列番号１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含み、セルピンバリアントポリペプチドが、配列番号１の天然タンパク質配列と比較して残基３４４でのアミノ酸置換を含み、セルピンＢ１バリアントポリペプチドが、好中球又は膵臓エラスターゼのセリンプロテアーゼ活性を阻害することができ、セルピンＢ１バリアントポリペプチドがフリーラジカルによる酸化に対する耐性を示す。幾つかの実施の形態において、サッカロミセス・セレビシエは、プロテアーゼを欠損している。

幾つかの実施の形態において、ポリヌクレオチドを発現させる方法は、酵母エピソーム発現プラスミド（Ｙｅｐ）をサッカロミセス・セレビシエに導入することによるものである。幾つかの実施の形態、実施の形態１９の方法において、ポリヌクレオチドは、酵母プロモーターに連結されている。幾つかの実施の形態において、酵母プロモーターは、ＡＤＨ２プロモーターである。幾つかの実施の形態において、ポリヌクレオチドは、酵母にて発現されるようにコドン最適化されている。

幾つかの実施の形態において、セルピンＢ１バリアントポリペプチドは、ＩｇＧのＦｃ部分、抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に融合されているか、又はセルピンＢ１バリアントポリペプチドは、ペグ化されている。

ヒドロキシアパタイト樹脂でのｒｈｓＢ１の精製を示す図である。図１Ａ及び図１Ｂは、ｒｈｓＢ１－ｃｙｓ３４４（野生型）（図１Ａ）及びｒｈｓＢ１－ｓｅｒ３４４（バリアントＣ３４４Ｓ）（図１Ｂ）のセラミックヒドロキシアパタイト樹脂での精製のクロマトグラフィー結果を示す。図１Ａは、樹脂から溶出させたｒｈｓＢ１－ｃｙｓ３４４を含有する２つの主ピークを示すが、図１Ｂは、樹脂から溶出させたＣ３４４Ｓバリアントを含有する１つの大きな主ピークのみを示す。これらのタンパク質ピークは、プールされ、濃縮され、４％～２０％のＳＤＳ－ＰＡＧＥにより解析された。（Ｃ）プールされ、濃縮され、２－メルカプトエタノールなし（「－２－ＭＥ」）（左）で、又は２－メルカプトエタノールあり（「＋２－ＭＥ」）（右）で処理されたｒｈｓＢ１ピーク試料の４％～２０％のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。－２－ＭＥ群及び＋２－ＭＥ群の両方について、試料の順序は以下の通りである：１． 精製されたｒｈｓＢ１－Ｃ３４４Ｓ；２． 精製されたｒｈｓＢ１－ｃｙｓ３４４の第１ピーク（ｒｈｓＢ１Ｍ＊）；３． 精製されたｒｈｓＢ１－ｃｙｓ３４４の第２ピーク（ｒｈｓＢ１Ｄ）；４． ＰＡＧＥ－ＭＡＳＴＥＲ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｌｕｓマーカー（Genscript社；１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、８０ｋＤａ、及び１２０ｋＤａ）。結果は、ｒｈｓＢ１－ｃｙｓ３４４（野生型）の精製が２種のｒｈｓＢ１をもたらすことを示す。図１Ａで溶出した第１の主ピークは、本発明者らがｒｈｓＢ１Ｍ＊と名付けた単量体形態のタンパク質を含有する。図１Ａで溶出した第２の主ピークは、２－ＭＥの添加により単量体に還元され得る分子間ジスルフィド結合した二量体形態のタンパク質を含有する。本発明者らは、この形態のタンパク質をｒｈｓＢ１Ｄと称した。対照的に、図１Ｂにおいて観察されるＣ３４４Ｓバリアントの１つの大きな主ピークは、単量体のｒｈｓＢ１のみを含有し、このことは、ｒｈｓＢ１ ｃｙｓ－３４４（野生型）で観察される分子間ジスルフィド結合形成がｃｙｓ－３４４により媒介されることを確証する。 Ｎ－クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）による酵母可溶化液中のｒｈｓＢ１の酸化を示す図である。図２Ａは、異なる濃度のＮＣＳで酸化されたｒｈｓＢ１を含有する５μＬの酵母可溶化液とのインキュベーション後のＰＰＥ活性の解析の結果を示す。データポイントは、三重反復での分析の平均±ＳＥである。図２Ｂは、１ｍＭのＮＣＳで酸化されたｒｈｓＢ１を含有する酵母可溶化液の４％～２０％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル及びウェスタンブロット分析の結果を示す；１． 処理されていない酵母可溶化液、２． １ｍＭのＮＣＳで酸化された酵母可溶化液、３． Ｓｍａｒｔ ｄｕａｌ ｃｏｌｏｒ ｐｒｅ－ｓｔａｉｎｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｎｄａｒｄ（Genscript社；１６ｋＤａ、２４ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、６２ｋＤａ、及び９４ｋＤａ）。図２Ｃは、１μＬ、３μＬ、又は５μＬのｒｈｓＢ１を含有する酸化された酵母可溶化液によるＰＰＥ阻害のアッセイ結果を示す。データポイントは、三重反復での分析の平均±ＳＥＭである。図２Ｄは、１μＬ、３μＬ、又は５μＬのｒｈｓＢ１を含有する酸化された酵母可溶化液によるウシαキモトリプシン（ＢＣ）阻害の解析結果を示す。データポイントは、三重反復での分析の平均±ＳＥである。 ＰＰＥのｒｈｓＢ１Ｄ及びｒｈｓＢ１Ｍ＊との相互作用を示す図である。図３Ａは、４％～２０％のＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離される、２－ＭＥの非存在下での異なる量のＰＰＥによるｒｈｓＢ１Ｄ又はｒｈｓＢ１Ｍ＊の切断プロファイルを示す。より高分子量の酵素：インヒビター複合体は観察されなかった。ＰＰＥの濃度が増加するにつれて、漸増する量のより低分子量のｒｈｓＢ１分解生成物のみが観察された。レーン１． ＰＰＥのみ；２． ｒｈｓＢ１Ｄのみ；３～５． １：１０００、１：１００、及び１：１０のＰＰＥ：ｒｈｓＢ１Ｄ比；６． ｒｈｓＢ１Ｍ＊のみ；７～９． １：１０００、１：１００、及び１：１０のＰＰＥ：ｒｈｓＢ１Ｍ＊比；Ｍ． マーカー。対照的に、図３Ｂは、２－ＭＥの存在下にてＰＰＥで処理されたｒｈｓＢ１Ｄの結果を示す。この例では、２－ＭＥはｒｈｓＢ１Ｄのジスルフィド結合を還元して、漸増する量のＰＰＥを阻害することができ、ゲル（レーン３～５）上で確認できる安定したより高分子量の複合体を漸増する量のＰＰＥと形成することができる活性な単量体のｒｈｓＢ１（レーン２）を遊離させた。レーン１． マーカー；２． ｒｈｓＢ１Ｄ＋２－ＭＥのみ；３～５． ０．２５、０．５、又は１．０モル比のＰＰＥと共にインキュベートされたｒｈｓＢ１Ｄ＋２－ＭＥ；６． ＰＰＥ＋２－ＭＥのみ。試料は３０分間インキュベートされ、次いで、反応が停止され、「実験手順」に記載されたように解析された。 ｒｈｓＢ１Ｄ及びｒｈｓＢ１Ｍ＊によるＨＮＥの阻害に対する２－ＭＥの影響を示す図である。図４Ａは、漸増する濃度の２－ＭＥの存在下でのｒｈｓＢ１ＤによるＨＮＥ阻害の解析結果を示す。２つの濃度のｒｈｓＢ１Ｄ（２３０ｎＭ又は４６０ｎＭ）が、「実験手順」に記載されたように、ＨＮＥを阻害するそれらの能力について試験された。図４Ｂは、漸増する濃度の２－ＭＥの存在下でのｒｈｓＢ１Ｍ＊によるＨＮＥ阻害の解析結果を示す。２つの濃度のｒｈｓＢ１Ｍ＊（２３０ｎＭ又は４６０ｎＭ）が、「実験手順」に記載されたように、ＨＮＥを阻害するそれらの能力について試験された。これらの図は、２－ＭＥによりｒｈｓＢ１Ｄが、ＨＮＥのインヒビターとして活性である単量体に還元され得ることを確証し、ＰＰＥで得られた結果を確証及び拡張する。結果は、ｒｈｓＢ１Ｄのジスルフィド結合を完全に還元し、最大ＨＮＥ阻害活性を復元するために、少なくとも４０ｍＭの２－ＭＥ濃度が必要とされることを示す。対照的に、ｒｈｓＢ１Ｍ＊への漸増する量の２－ＭＥの添加は、ＨＮＥ阻害活性を復元しなかった。このことは、この単量体形態のｒｈｓＢ１が、不可逆的に酸化された状態のシステイン－３４４を有することを確証する。 ｒｈｓＢ１Ｄ及びｒｈｓＢ１Ｍ＊のＨＮＥとの相互作用を示す図である。図５Ａは、２－ＭＥの存在下（試料群「ＰＢＳ＋４０ｍＭの２－ＭＥ」）又は非存在下（試料群「ＰＢＳ」）での漸増する量のｒｈｓＢ１Ｄによる一定濃度のＨＮＥの阻害を示す。図５Ｂは、４％～２０％のＳＤＳ－ＰＡＧでのゲル電気泳動により分離された、（Ａ）で生成された反応生成物を示す。図５Ｃは、２－ＭＥの存在下又は非存在下での漸増する量のｒｈｓＢ１Ｍ＊による一定濃度のＨＮＥの阻害を示す。図５Ｄは、４％～２０％のＳＤＳ－ＰＡＧでのゲル電気泳動により分離された、図５Ｃで生成された反応生成物を示す。図５Ｂにおける数値、０．７、１．４、２．１は、ｒｈＢ１Ｄ対ＨＮＥのモル比を表す。図５Ｄにおける数値、０．７、１．４、２．１は、ｒｈＢ１Ｍ＊対ＨＮＥのモル比を表す。結果は、ｒｈｓＢ１Ｄを、ＨＮＥを阻害し、ＳＤＳ安定性の複合体を形成することができる活性な単量体に還元するために２－ＭＥが必要とされることを確証する。対照的に、ｒｈｓＢ１Ｍ＊は、２－ＭＥの存在下でＨＮＥと効率的に複合体を形成し、ＨＮＥを阻害することができなかった。 キモトリプシンのｒｈｓＢ１Ｄ及びｒｈｓＢ１Ｍ＊との相互作用を示す図である。図６Ａは、２－ＭＥの存在下（試料群「ＰＢＳ＋４０ｍＭの２－ＭＥ」）又は非存在下（試料群「ＰＢＳ」）での漸増する量のｒｈｓＢ１Ｄによる一定濃度のキモトリプシンの阻害を示す。図６Ｂは、４％～２０％のＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離された、図６Ａで生成された反応生成物を示す。図６Ｃは、２－ＭＥの存在下又は非存在下での漸増する量のｒｈｓＢ１Ｍ＊による一定濃度のキモトリプシンの阻害を示す。図６Ｄは、４％～２０％のＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離された、２－ＭＥの非存在下で（Ｃ）で生成された反応生成物を示す。「Ｉ：Ｅモル比」は、ｒｈＢ１Ｄ対キモトリプシンのモル比（図６Ｂ）又はｒｈＢ１Ｍ＊対キモトリプシンのモル比（図６Ｃ）を表す。結果は、２－ＭＥの存在下又は非存在下で、ｒｈｓＢ１Ｄが等モル比付近又はそれ未満でキモトリプシンを効果的に阻害できることを示す。しかしながら、２－ＭＥによるｒｈｓＢ１Ｄのその活性な単量体形態への解離は、そのキモトリプシン阻害効果を２倍にする。対照的に、ｒｈｓＢ１Ｍ＊も２－ＭＥの存在下又は非存在下でキモトリプシンを阻害することができるが、ｒｈｓＢ１Ｄと比較して効果が３分の１～５分の１であり、その活性は２－ＭＥにより影響を受けない。 カテプシンＧのｒｈｓＢ１Ｄ及びｒｈｓＢ１Ｍ＊との相互作用を示す図である。図７Ａは、２－ＭＥの存在下又は非存在下での漸増する量のｒｈｓＢ１Ｄ及びｒｈｓＢ１Ｍ＊による一定濃度のヒトカテプシンＧの阻害を示す。図７Ｂは、２－ＭＥの存在下又は非存在下でのｒｈｓＢ１Ｄ及びカテプシンＧの相互作用により生成された反応生成物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を示す。図７Ｃは、２－ＭＥの非存在下でのｒｈｓＢ１Ｍ＊及びカテプシンＧの相互作用により生成された反応生成物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を示す。「Ｉ：Ｅモル比」は、ｒｈＢ１Ｄ対カテプシンＧのモル比（図７Ｂ）又はｒｈＢ１Ｍ＊対カテプシンＧのモル比（図７Ｃ）を表す。結果は、２－ＭＥの存在下又は非存在下で、ｒｈｓＢ１Ｄが等モル比で、又はその付近をわずかに越える比率でカテプシンＧを効果的に阻害できることを示す。しかしながら、２－ＭＥによるｒｈｓＢ１Ｄのその活性な単量体形態への解離は、そのカテプシンＧ阻害効果を２倍にする。対照的に、ｒｈｓＢ１Ｍ＊も２－ＭＥの存在下又は非存在下でカテプシンＧを阻害することができるが、ｒｈｓＢ１Ｄと比較して効果が３分の１～５分の１であり、その活性は２－ＭＥにより影響を受けない。 ヒトセルピンＢ１のＣｙｓ－３４４の酸化により活性化される潜在的プログラム細胞死経路を示す図である。この図は、セルピンＢ１におけるＣ３４４の酸化と様々なプログラム細胞死経路の活性化との間の潜在的関係を示す。最初の工程は、セルピンＢ１（ｓＢ１）の露出した反応部位ループ（ＲＳＬ、ｓＢ１から突き出ている延長した青色長方形として示される）上のＣ３４４の酸化的不活性化を含む。酸化されたｓＢ１は、エラスターゼ阻害活性を欠き、カテプシンＧ及びプロテイナーゼ３（ＣａｔＧ、ＰＲ３）に対する減少した阻害活性を有する。酸化されたｓＢ１は、もはやエラスターゼを阻害することができず、代わりに、ＲＳＬにおいて切断され、タンパク質の構造的変化（プロカスパーゼ１、４、及び５の「赤色」のＣＡＲＤドメインが放出された正方形の青色ボックスとして示される）を引き起こし、この構造的変化は、ｉ）ｓＢ１が有する全ての残存するプロテアーゼ阻害活性を破壊し、ｉｉ）カスパーゼ１、４、及び５の自己会合及び活性化を許す。次いで、増加した酵素活性（エラスターゼ、ＣａｔＧ、ＰＲ３、カスパーゼ）は、下流のエフェクタータンパク質（例えば、ガスダーミンＤ（ＧＳＤＭＤ）、プロカスパーゼ３、及びプロインターロイキン（例えば、プロＩＬ１－β））に作用して、ピロトーシス、ＮＥＴｏｓｉｓ、及びネクローシス（非特許文献２；Pappayannopoulos et al., 2010；Burgener at al., 2019）等の多数の異なる種類のプログラム細胞死経路の進行を許す。 ＰＰＥにより切断されたｒｈｓＢ１Ｍ＊及びｒｈｓＢ１Ｄのタンパク質配列決定データを示す図である（実施例１及び５に記載される）。このデータは、どのペプチド結合が酸化されたｓＢ１において切断されているかを示す。 クレードＢセルピンの反応部位ループにおけるシステイン残基を示す図である。この図は、同様に反応部位ループ内にシステイン残基を有する４種の他の相同性の高いヒトクレードＢ（細胞内）セルピンと比較した、ヒトセルピンＢ１（ＭＮＥＩ）の反応部位ループ内のＣ３４４の位置を示す。 異なる種におけるｓＢ１ ＲＳＬタンパク質配列を示す図である。この図は、異なる種のセルピンＢ１の反応部位タンパク質配列のアラインメントを示す。Ｃ３４４がヒト、齧歯類、及びサルにおいて高度に保存されていることに留意されたい。 野生型ヒトセルピンＢ１（Ｃ３４４）が、活性酸素種及び活性窒素種（ＲＯＳ／ＲＮＳ）によりエラスターゼインヒビターとして急速に不活性化されたが、Ｈ_２Ｏ_２により不活性化されなかったことを示す図である。 野生型ヒトセルピンＢ１（Ｃ３４４）の酸化が、他のプロテアーゼを阻害するその能力を減少させたことを示す図である。ｒｈｓＢ１Ｍ＊Ｐは、精製された過酸化亜硝酸により不活化された野生型ｒｈｓＢ１を表し、ｒｈｓＢ１－ＣＬは、ＰＰＥにより切断され、不活性化されたｒｈｓＢ１ ＷＴを表す。 ヒトセルピンＢ１におけるＣ３４４でのアミノ酸置換のエラスターゼ阻害に対する効果を示す図である。 高い酵素：インヒビター比でＣ３４４ＳヒトセルピンＢ１バリアントが、安定な複合体を形成するのではなく、ＰＰＥにより切断され、不活性化されたことを示す図である。 過酸化亜硝酸の存在下でヒトセルピンＢ１ Ｃ３４４Ａバリアントが、エラスターゼ及びキモトリプシン阻害活性を保持していたことを示す図である。 野生型ヒトセルピンＢ１が、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）により生成されたフリーラジカルにより、急速に不活性化されたが、Ｃ３４４Ａバリアントは不活性化されなかったことを示す図である。

用語
他に定義のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。

本明細書及び添付の特許請求の範囲において、多くの用語についての言及がなされることになり、用語は、以下の意味を有するよう定義されるものとする。

本明細書で使用されている用語は、単に特定の実施形態を記述するためのものであり、本発明を限定することは意図していない。本明細書で使用されている単数形（the singular forms "a," "an," and "the"）は、文脈により明らかに異なることが示されていない限り、複数形も含むことが意図されている。

全ての数値指定、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、量、分子量は、範囲を含めて、必要に応じて、０．１又は１．０ずつ（＋）又は（－）に変化する近似値である。必ずしも明示的に記載されるわけではないが、全ての数値指定は、用語「約」により先行され得ると理解されたい。必ずしも明示的に記載されるわけではないが、本明細書に記載される試薬は、単に例示的なものであり、かかるものの等価物は当該技術分野において既知であることも理解されたい。

「任意選択の」又は「任意選択で」は、続いて記載される事象又は状況が起こり得る又は起こり得ないことを意味し、この記載は、事象又は状況が起こる場合及び事象又は状況が起こらない場合を含む。

用語「含む（comprising）」は、組成物及び方法が列挙された要素を含むが、その他を除外しないことを意味することを意図する。「から本質的になる（consisting essentially of）」は、組成物及び方法を定義するために使用される場合、明記された物質又は工程、及び特許請求された本発明の基本的かつ新規な特徴（複数の場合もある）に実質的に影響を及ぼさないものを指す。「からなる（consisting of）」は、列挙されていない微量を超える量の他の成分及び他の実質的な方法工程を除外することを意味する。これらの移行句の各々により定義される実施形態は、本発明の範囲内である。

用語「ｒｈｓＢ１」は、非ヒト宿主細胞で産生される、本明細書において開示される天然のヒトセルピンＢ１ポリペプチド（配列番号１）を指す。

用語「セルピンＢ１ポリペプチド」又は「セルピンＢ１」は、配列番号１の配列を有する天然の（「野生型」とも称される）セルピンＢ１ポリペプチド、又はそのバリアント（すなわち、セルピンＢ１バリアントポリペプチド）を指す。

用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、及び「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド又はそれらの類似体のいずれかの任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得て、既知又は未知の任意の機能を果たし得る。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ又はＳＡＧＥタグ）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマー。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリヌクレオチドの構築前又は後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲーション等により、重合後に更に修飾され得る。またこの用語は、二本鎖分子及び一本鎖分子の両方を指す。特に明記しない限り、又は必要とされない限り、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態及び二本鎖形態を構成することが既知であるか、又は予測される２本の相補的な一本鎖形態の各々の両方を包含する。

ポリヌクレオチドは、以下の４種のヌクレオチド塩基の特定の配列から構成される：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；及びポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、チミンの代わりにウラシル（Ｕ）。したがって、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表記である。

用語「同一性パーセント」は、２つのペプチドの間又は２つの核酸分子の間の配列同一性を指す。同一性パーセントは、比較を目的としてアラインメントされ得る各配列内の位置を比較することにより決定され得る。比較された配列内のある位置が同じ塩基又はアミノ酸により占められている場合、分子はその位置で同一である。本明細書で使用する場合、語句「相同な」若しくは「バリアント」ヌクレオチド配列又は「相同な」若しくは「バリアント」アミノ酸配列は、ヌクレオチドレベル又はアミノ酸レベルでの、少なくとも指定された百分率の同一性を特徴とする配列を指す。相同なヌクレオチド配列としては、本明細書において記載されるヌクレオチド配列の天然に存在するアレルバリアント及び変異をコードする配列が挙げられる。相同なヌクレオチド配列としては、ヒト以外の哺乳動物種のタンパク質をコードするヌクレオチド配列が挙げられる。相同なアミノ酸配列としては、保存的アミノ酸置換を含有し、ポリペプチドが同じ結合及び／又は活性を有するアミノ酸配列が挙げられる。幾つかの実施形態において、相同なヌクレオチド又はアミノ酸配列は、比較配列との少なくとも６０％以上、例えば、少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、少なくとも８５％以上の同一性を有する。幾つかの実施形態において、相同なヌクレオチド又はアミノ酸配列は、比較配列との少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する。幾つかの実施形態において、相同なアミノ酸配列は、１５以下、１０以下、５つ以下、又は３つ以下の保存的アミノ酸置換を有する。同一性パーセントは、例えば、Smith-Watermanアルゴリズム（Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489）を使用するＧＡＰプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、ＵＮＩＸ（商標）用のバージョン８、Genetics Computer Group社、ウィスコンシン州マディソンのUniversity Research Park）により、デフォルト設定を使用して決定され得る。

用語「発現する」は、遺伝子産物の産生を指す。発現に言及する場合、用語「一過性」は、ポリヌクレオチドが細胞のゲノムに組み込まれないことを意味する。

用語「ベクター」は、例えば、形質転換のプロセスにより許容細胞内に入れられる場合に、ベクターが複製され得るようにインタクトなレプリコンを含む非染色体性核酸を指す。ベクターは、細菌等の１つの細胞種で複製し得るが、哺乳動物細胞等の別の細胞では限定された複製能を有する。ベクターは、ウイルス性又は非ウイルス性であり得る。核酸を送達するための例示的な非ウイルスベクターとしては、裸のＤＮＡ；単独で、又はカチオン性ポリマーとの組み合わせでカチオン性脂質と複合体を形成したＤＮＡ；アニオン性及びカチオン性リポソーム；ＤＮＡ－タンパク質複合体、及び場合によっては、リポソームに含有される、カチオン性ポリマー、例えば、不均一なポリリジン、既定の長さのオリゴペプチド、及びポリエチレンイミンと縮合されたＤＮＡを含む粒子；並びにウイルス及びポリリジン－ＤＮＡを含む三元複合体の使用が挙げられる。

用語「患者」、「対象」、「個体」等は、本明細書において互換的に使用され、ｉｎ ｖｉｔｒｏであるかｉｎ ｓｉｔｕであるかにかかわらず、本明細書に記載の方法に適している任意の動物又はその細胞を指す。或る特定の非限定的な実施形態において、患者、対象、又は個体は、ヒトである。

本明細書で使用する場合、用語「正常な個体」は、健常な非喫煙個体を指す。

疾患又は遺伝子疾患とフリーラジカルとの関係に関して、用語「関連する」は、疾患若しくは遺伝子疾患が、環境における若しくは身体内部での高レベルのフリーラジカルへの曝露に少なくとも部分的に起因すること、又は疾患若しくは遺伝子疾患が、正常な個体と比較して身体内でのフリーラジカル生成の増加を引き起こすことを指す。

用語「処置する」又は「処置」は、ヒト等の対象における本明細書に記載される疾患又は障害の処置を包含し、（ｉ）疾患若しくは障害を抑制すること、すなわち、その発症を抑えること；（ｉｉ）疾患若しくは障害を軽減すること、すなわち、障害の退縮を引き起こすこと；（ｉｉｉ）障害の進行を遅らせること；及び／又は（ｉｖ）疾患若しくは障害の１つ以上の症状の進行を阻害するか、軽減するか、若しくは遅らせることを含む。モノクローナル抗体又はナチュラルキラー細胞の対象への「投与」又は対象に「投与する」という用語は、意図した機能を発揮するために抗体又は細胞を導入又は送達する任意の経路を含む。投与は、細胞又はモノクローナル抗体の送達に好適な任意の経路により実施され得る。したがって、送達経路としては、静脈内送達、筋肉内送達、腹腔内送達、又は皮下送達が挙げられ得る。

用語「投与する」は、対象への経口投与、局所接触、坐剤としての投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、病巣内投与、クモ膜下腔内投与、鼻腔内投与、若しくは皮下投与、又は徐放デバイス、例えば、ミニ浸透圧ポンプの植え込みを含む。投与は、非経口及び経粘膜（例えば、口腔内、舌下、口蓋、歯肉、鼻腔内、膣内、直腸、又は経皮）投与が挙げられる任意の経路によるものである。非経口投与としては、例えば、静脈内、筋肉内細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、及び頭蓋内投与が挙げられる。他の送達様式としては、リポソーム製剤の使用、静脈内注入、経皮パッチ等が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、治療上有効量の本明細書に記載される融合タンパク質を投与するための更なる方法を知っているであろう。

用語「治療上有効量」又は「有効量」は、必要とされる投与量及び期間での、所望の治療結果又は予防結果を達成するのに効果的な量又は含量を含む。

本明細書で使用する場合、用語「実質的に同じ」は、酵素阻害活性、例えば、好中球エラスターゼ阻害活性に言及する場合、阻害活性の２つの測定値が互いに２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、８％以下、又は５％以下の差があることを指す。

序論
ヒトセルピンＢ１（ｈｓＢ１）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されたヒト単球中に高濃度で存在する作用の速いエラスターゼインヒビターとして１９８５年に最初に同定され、その後にマクロファージ及び好中球中に存在することが同定された（Remold-O'Donnell et al., J. Exp. Med. 162, 2142-2155（1985）；Remold-O'Donnell et al., J. Exp. Med. 169, 1071-1086（1989）,2）。ｈｓＢ１は約４２ｋＤａの分子量を有し、典型的な分泌シグナルを有さないタンパク質のセルピンスーパーファミリーのクレードＢ分枝のメンバーである（Remold-O'Donnell et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89, 5635-5639（1992））。他のセルピンとの配列アラインメントにより、観察されたＥＩＡを担う反応部位ループ（ＲＳＬ）上の推定Ｐ１残基としてＣｙｓ－３４４が同定された。その後に、エラスターゼ－ｈｓＢ１複合体に由来するＮ末端配列データ及びこのタンパク質のＥＩＡのアルキル化剤であるヨードアセトアミドに対する感受性により、この割り当てが確証された（Remold-O'Donnell et al., J. Exp. Med. 169, 1071-1086（1989）；Cooley et al. Biochemistry 40, 15762-15770（2013））。多数のセルピンが、異なるクラスのプロテイナーゼを効率的に阻害するために、重複する反応部位を利用することが実証されている。これはｈｓＢ１にも当てはまり、ｈｓＢ１は、Ｐｈｅ－３４３を利用して、ウシキモトリプシン、カテプシンＧ（ｃａｔＧ）、マスト細胞キマーゼ、グランザイムＨ（ＧｍｚＨ）、及び前立腺特異抗原（ＰＳＡ）が挙げられるキモトリプシン様プロテアーゼを阻害するだけでなく、Ｃｙｓ－３４４も利用して、好中球プロテイナーゼ３を阻害する（Cooley et al.；Wang et al.,, J. Immunol. 190, 1319-1330（2013））。

セルピンＢ１は、ｉｎ ｖｉｖｏで多数の保護的な抗炎症役割を示す。組換えｈｓＢ１は、嚢胞性線維症における炎症性気道分泌物により媒介される損傷からラット肺を保護するために、緑膿菌（P. aeruginosa）肺感染のマウスモデルにおける細菌の増殖を抑制するために、及び肝移植のラットモデルにおける手術後の急性肺損傷を改善するために、予防的に使用されている（Cooley et al.（1998））。２００７年にBenerafaらは、ヒトｓＢ１のマウスホモログ（ｓｂ１ａ）遺伝子をノックアウトし、細菌感染時の過剰な炎症反応の制御においてこの遺伝子が果たす重要な役割を実証した（Benerafa et al.（2007））。２０１１年にGongらは、同じモデルを使用して、ｓｂ１ａが、ウイルス排除に影響を及ぼすことなく肺インフルエンザにより誘発される過剰な炎症からも保護することを実証した（Gong et al.,（2011））。Benarafa及びO'Donnellのグループによる更なる研究により、ｓｂ１ａが骨髄の好中球を保護し、カテプシンＧの特異的な阻害により好中球及び単球におけるプログラムネクローシスを予防することが明らかにされた（Benerafa et al.,（2011））。２０１２年にFarleyらは、ｓＢ１が、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）によるＲＯＳの生成に部分的に依存するプロセスである、複数の異なる刺激により誘発される好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の形成を調節し得ることを発見した（Choi et al.（2019））。この役割において、ｓｂ１ａは、好中球の細胞質から核に移動することが観察されたが、現在、この移行を駆動するメカニズム及びその核内標的（複数の場合もある）は不明である（Farley et al.（2012））。加えて報告によれば、ｓｂ１ａは、システインカテプシン、最も顕著にはカテプシンＬの阻害によりＴｈ１７表現型Ｔ細胞の増殖を調節する（Zhao et al.（2014））。ごく最近では、El Ouaamariらが、増殖及び生存経路のタンパク質の調節により膵臓のβ島細胞増殖を誘発することによりインスリン抵抗性に対する代償性β細胞反応を促進する因子としてｓＢ１を同定した一方で（El Ouaamari et al.（2016））、Choiらが、炎症性カスパーゼ１、４、５、及び１１の活性化の制限並びにピロトーシスの予防を担う、セルピンＢ１におけるＣＡＲＤ（カスパーゼ動員ドメイン）結合モチーフ（ＣＢＭ）を同定した（非特許文献２）。

他には、ｓＢ１がアポトーシスにおいて直接的な役割を果たすことが示唆されている。１９９８年に、Torrigliaらは、ＤＮアーゼＩＩと称される広範な細胞内カチオン非依存性酸性エンドヌクレアーゼを部分的に配列決定し、それがブタｓＢ１のタンパク質配列と相同であることを発見した（Torringlia et al.（1998））。その後、このグループは、エラスターゼ又はアポトーシスに関与する他の一部のプロテアーゼにより切断される際に、ｓＢ１が構造再編成を受け、Ｌ－ＤＮアーゼＩＩと称する分子の潜在的エンドヌクレアーゼ活性（もし確証されれば、セルピンの実にユニークかつ驚くべき活性）の覆いが取られることを示唆する多数の論文を公開した（Padron-Barthe et al.（2007））。

本出願において、本発明者らは、ｓＢ１におけるＣｙｓ－３４４の露出した物理的位置が、ｓＢ１を炎症性シグナル伝達現象又は酸化還元により媒介されるシグナル伝達現象の間に生成される反応性フリーラジカル種（例えば、ＲＯＳ又はＲＮＳ）に対して感受性にすることを開示する。本出願は、還元された状態のＣｙｓ－３４４の維持が、ｓＢ１がエラスターゼを効率的に阻害するのに必要とされることを開示し、Ｃｙｓ－３４４の酸化が、プロテアーゼ阻害活性が変化した翻訳後修飾された形態（ＰＴＭ）のｓＢ１を生成し得ることを実証する。炎症の初期段階及びおそらく他の酸化還元により媒介される細胞シグナル伝達現象の間に、セルピンＢ１の制御機能は、或る特定の種類のフリーラジカルにより下方調節され得て、これにより、炎症の進行を許す。したがって、本出願は、セルピンＢ１バリアントポリペプチドを含む方法及び組成物を提供し、ここで、セルピンＢ１バリアントポリペプチドは、好中球エラスターゼ阻害活性を有し、好中球エラスターゼ阻害活性は、フリーラジカルによる酸化に耐性を示す。幾つかの例では、セルピンＢ１バリアントポリペプチドは、配列番号１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を有する。これらのセルピンＢ１バリアントポリペプチドは、正常な個体と比較した好中球、単球におけるフリーラジカル生成の増加に関連する疾患又は遺伝子疾患を有する患者を処置するために使用され得る。

Ａ． セルピンＢ１のエラスターゼ阻害活性は、Ｃ３４４－ＳＨが還元された状態の維持を必要とする
本明細書において本発明者らは、構造的に露出したＣｙｓ－３４４（Wang et al., J. Immunol. 190, 1319-1330（2013））が、ｓＢ１をインヒビターからエラスターゼの基質に変換する翻訳後修飾（ＰＴＭ）を受け、このことが、エラスターゼ阻害活性の喪失をもたらし、全てのプロテアーゼ阻害活性の完全な喪失を引き起こし得ることの証拠を提供する。実施例３、実施例１０、及び実施例１１を参照のこと。酵母細胞内で産生された組換えヒトセルピンＢ１（ｒｈｓＢ１）は、エラスターゼ及びキモトリプシンの両方を阻害する（ＥＩＡ及びＣＩＡ）が、ＥＩＡは、酸化剤であるＮ－クロロスクシンイミド、過酸化亜硝酸、及び次亜塩素酸ナトリウム、並びにミエロペルオキシダーゼにより生成されたフリーラジカルによる急速な不活性化に対して感受性を示す（図２、図１２、及び図１７）。さらに本発明者らは、還元剤の非存在下でのｒｈｓＢ１の精製により、修飾された単量体（ｒｈｓＢ１Ｍ＊）及びそれぞれのｒｈｓＢ１単量体のＣｙｓ－３４４間で形成された分子間ジスルフィド結合により生成された二量体（ｒｈｓＢ１Ｄ）という２種の固有のより高分子量形態のｒｈｓＢ１の形成に付随して、ＥＩＡの進行性のかつ特異的な喪失がもたらされる（図５Ａ）が、ＣＩＡの喪失はもたらされない（図６Ａ）ことを示す。完全に還元されたｒｈｓＢ１と異なり、ｒｈｓＢ１Ｍ＊及びｒｈｓＢ１Ｄは、エラスターゼの優れた基質であり、反応部位ループ内の複数の隣接する部位（ＲＳＬ；Ｇｌｙ３３９－Ｉｌｅ３４０、Ａｌａ３４１－Ｔｈｒ３４２、及びＴｈｒ３４２－Ｐｈｅ３４３）で急速に、かつ触媒的に切断される。さらに、ｒｈｓＢ１Ｍ＊及びｒｈｓＢ１ＤがＣＩＡを保持していても、それらの各々の阻害効率は顕著に低減される。

これらの発見は、ｈｓＢ１が、Ｃｙｓ－３４４の還元が維持されている条件下でエラスターゼ及びキモトリプシン様プロテアーゼの両方を阻害することができることを確証する。しかしながら、本発明者らは、炎症、又は或る特定の種類の活性酸素種（ＲＯＳ）若しくは活性窒素種（ＲＮＳ）が関与する、酸化還元により媒介される細胞シグナル伝達現象において、Ｃｙｓ－３４４のＰＴＭが、エラスターゼ、カテプシンＧ、及びプロテイナーゼ３活性の増加により炎症性経路の進行を許す重要な現象であり得ることを提唱する。エラスターゼによるｈｓＢ１の切断された不活性（Ｒ）形態への変換は、反応部位ループにより媒介される全ての直接的プロテアーゼ阻害活性を完全に不活性化し、このタンパク質の三次構造内の他の制御ドメイン（複数の場合もある）（例えば、ＣＢＭ）も破壊し得て、これにより、他の炎症誘発性経路の活性化／増幅を許す。

Ｂ． 酸化耐性セルピンＢ１バリアント
本開示は、好中球エラスターゼ阻害活性を有するセルピンＢ１バリアントポリペプチドを提供し、好中球エラスターゼ阻害活性は、フリーラジカルによる酸化に対して耐性を示す。天然のセルピンＢ１の好中球（及び膵臓）エラスターゼ阻害活性は、還元型のＣ３４４に依存する（「Ｃ３４４依存的なエラスターゼ阻害活性」）。セルピンＢ１のＣ３４４の酸化は、エラスターゼ阻害活性の顕著な減少又は完全な喪失をもたらすため、セルピンＢ１のＣ３４４依存的なエラスターゼ阻害活性は、フリーラジカルによる酸化に感受性である。用語「フリーラジカル」又は「ラジカル」又は「反応性フリーラジカル種」は、通常、不対電子を有し、反応性が高い分子を指す。ラジカルは、極めて高い化学反応性を有し、過剰に生成されるか、又は適切に制御されない場合、細胞に傷害を与え得る。本開示において開示されるフリーラジカルは、任意のシステイン反応性フリーラジカル種、例えば、天然のセルピンＢ１（配列番号１）のＣ３４４を酸化することができ、そのエラスターゼ阻害活性を減少させることができる反応性フリーラジカル種を指す。エラスターゼ阻害活性の減少は、Ｃ３４４が未酸化状態である天然のセルピンＢ１と比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、又は少なくとも６０％であり得る。これらのフリーラジカルとしては、酸素に由来するもの（「活性酸素種」）又は窒素に由来するもの（「活性窒素種」）が挙げられ得るが、これらに限定されない。フリーラジカルによるシステインの酸化は、例えば、Ｓ－ニトロソシステイン、システインスルフェン酸、スルフィン酸、及びスルホン酸、二硫化物、並びに過硫化物が挙げられる種々の酸化生成物を生成し得る。その結果、フリーラジカルによるシステインの酸化は、肺気腫及び癌等の多数の疾患との毒性学的関連を有し得て、身体の抗細菌防御及び抗ウイルス防御を障害し得る。

フリーラジカルは、煙及び汚染粒子等の外因性源に存在するか、又はそれにより誘導され得て、ウイルス若しくは細菌等の病原体、又は個体を「無菌性」自己炎症性疾患（ＳＡＩＤ）に罹患しやすくなる遺伝子疾患に応答して内因性源により生成され得る。内因性ＲＯＳ及びＲＮＳは、自然免疫細胞（例えば、好中球、好酸球、マクロファージ、単球）、粘膜細胞（例えば、肺気道粘膜、腸管粘膜）、及び腺細胞（例えば、甲状腺、乳腺、及び唾液腺）に内在するか、又はそれから分泌される酵素（例えば、ペルオキシダーゼ及び一酸化窒素合成酵素）により生成される。

ＲＯＳの非限定的な例としては、次亜塩素酸、次亜塩素酸イオン、Ｎ－クロロスクシンイミド、過酸化水素、及び次亜塩素酸ナトリウムが挙げられる。ＲＮＳの非限定的な例としては、一酸化窒素（ＮＯ）が挙げられる。幾つかの作用物質は、ＲＯＳ及びＲＮＳ、例えば、過酸化亜硝酸の両方であり得る。反応性フリーラジカル種の他の例としては、Griendling et al.（2016）, Measurement of Reactive Oxygen Species, Reactive Nitrogen Species, and Redox-Dependent Signaling in the Cardiovascular System Circulation Research, Vol. 119, No. 5に記載のものが挙げられるが、これらに限定されない。非限定的な例として、好中球は、Ｈ_２Ｏ_２及びＮａＣｌをＲＯＳである次亜塩素酸及び次亜塩素酸イオン（ＨＯＣｌ、^－ＯＣｌ）に変換するミエロペルオキシダーゼを産生し、次亜塩素酸及び次亜塩素酸イオンは、抗菌性であり、宿主防御機構の重要な一部であるが、細胞膜、ＤＮＡ、及びタンパク質にも損傷を与え得るはるかに強力なフリーラジカルである（Klebanoff, S. J. （2005）. Myeloperoxidase：Friend and Foe. J. Leucocyte Biology. 77：598-625）。マクロファージは、大量の一酸化窒素（ＮＯ）を生成する誘導性一酸化窒素合成酵素２（ｉＮＯＳ）を産生する。Ｈ_２Ｏ_２及びＮＯは、結合して、非常に強力なＲＮＳである過酸化亜硝酸（ＯＮＯＯ^－）を形成し、これは宿主防御機構の重要な一部でもあるが、膜、ＤＮＡ、及びタンパク質にも損傷を与える（Pacher P, Beckmann JS and Liaudet L. （2007）. Nitric Oxide and Peroxynitrite in Health and Disease. Phsiol. Rev., 87（1）：315-424）。

粘膜細胞及び腺細胞は、Ｈ_２Ｏ_２の存在下でチオシアネート（ＳＣＮ）のヒポチオシアナイト（ＯＳＣＮ）への変換を触媒するラクトペルオキシダーゼを産生する。ヒポチオシアナイトは、強力な抗菌活性を有し、ヒト細胞に対して非毒性であるようである（Day BJ. （2019）. The science of licking your wounds：Function of oxidants in the innate immune system. Biochem Pharmacol., 163：451-457）。

本明細書において開示されるセルピンＢ１バリアントポリペプチドは、フリーラジカルの存在下であってもその好中球又は膵臓エラスターゼ阻害活性を保持することができる。バリアントポリペプチドのエラスターゼ阻害活性は、当該技術分野において既知の方法を使用して試験され得る。例えば、エラスターゼがセルピンＢ１バリアントポリペプチドと共にインキュベートされて、続いて、エラスターゼ基質が添加され得る。エラスターゼは基質を切断して、好適な装置を使用して検出され得る比色シグナル又は蛍光シグナルを生成する。１つの例示的な基質は、Ｓｕｃｃ－ＡＡＰＶ－ｐＮＡである。同様のアッセイが、フリーラジカル（ＲＯＳ又はＲＮＳ）又はフリーラジカルを生成する酵素若しくは他の薬剤、例えば、過酸化亜硝酸、次亜塩素酸、又はミエロペルオキシダーゼで処理されたセルピンＢ１バリアントポリペプチドを用いて実行されて、そのエラスターゼ阻害活性が評価され得る。フリーラジカルに曝露された後のセルピンＢ１バリアントポリペプチドのエラスターゼ阻害活性は、曝露前のセルピンＢ１バリアントポリペプチドのエラスターゼ阻害活性と実質的に同じである。エラスターゼ阻害アッセイの１つの実例は、実施例１に記載される。

バリアントポリペプチド（複数の場合もある）は、配列番号１の全長配列にわたり配列番号１と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有し、バリアントポリペプチドは、エラスターゼ（例えば、ヒト好中球エラスターゼ又は膵臓エラスターゼ）のプロテアーゼ活性を阻害することも可能である。幾つかの実施形態において、バリアントポリペプチドは、天然のヒトセルピンＢ１（配列番号１）と比較して、Ｃ３４４Ａ、Ｃ３４４Ｖ、及びＣ３４４Ｇからなる群から選択される単一アミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態において、バリアントポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４の配列を含む。

本明細書において開示される配列同一性又は類似性は、J. of Mol. Biol. Vol. 147, Issue 1：195-197（1981）のSmith及びWatermanの局所配列同一性アルゴリズム；Needleman及びWunschの配列同一性アラインメントアルゴリズム；Pearson及びLipmanの類似性検索法；これらのアルゴリズムのコンピュータ実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Genetics Computer Group社、ウィスコンシン州マディソンの575 Science Drive）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ、及びＴＦＡＳＴＡ）；又は好ましくはデフォルト設定を使用するDevereux et al. Nucleic Acids Res. 12：387-95（1984）により記載されたＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラムが挙げられるが、これらに限定されない当該技術分野において既知の標準的な技術を使用して決定され得る。一実施形態において、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215：403-410に記載されたＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムのコンピュータ実装（デフォルトパラメータを使用する）が配列同一性を決定するために使用され得る。

配列同一性は、配列の目視検査によっても決定され得る。例えば、上記のソフトウェアを使用して、又は手動でアラインメントされた配列Ａと配列Ｂとの間の配列同一性は、配列Ａと配列Ｂとの間の一致する残基の合計を、配列Ａの長さから配列Ａにおけるギャップ残基の数を引き、配列Ｂにおけるギャップ残基の数を引いた結果で除算し、１００を掛けることにより決定され得る。

セルピンＢ１バリアントポリペプチドは、当業者に既知の方法により天然のポリペプチド（配列番号１）を修飾することにより作製され得る。かかる方法としては、所望の変化を有するように設計されたプライマーを使用するＰＣＲ法による変異誘発；標的領域を変異させるためのネステッドプライマー；及び逆方向に向けられたプライマーを使用して未知の配列領域を増幅する逆ＰＣＲ法が挙げられるが、これらに限定されない。多数の他の変異法及び進化法も利用可能であり、関連する技術分野の当業者の技術の範囲内であると思われる。

本明細書に記載されるセルピンＢ１バリアントポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも所望の配列に従って既知の合成プロセスにより化学合成され得る。これらの配列は、以下で更に記載されるように、確立されたクローニング手順を使用して発現ベクターにクローニングされ得る。

発現されたポリヌクレオチド及びポリペプチドの化学的又は酵素的改変が実行され得る。例えば、配列は、標準的方法を使用した脂質、糖、ペプチド、有機又は無機化合物の付加、修飾ヌクレオチド又はアミノ酸の組み込み等により修飾され得る。したがって、本発明は、変異、化学的若しくは酵素的修飾、又は他の利用可能な方法によるセルピンＢ１バリアントポリヌクレオチド又はポリペプチドのいずれかの修飾、及びかかる方法、例えば、様々な修飾アプローチの出発基質として本明細書における配列を使用する方法を実施することにより生成される生成物を提供する。

Ｃ． セルピンＢ１又はセルピンＢ１バリアントを含む医薬組成物
本開示は、天然のセルピンＢ１又は本明細書において開示されるセルピンＢ１バリアントポリペプチドと、１種以上の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も提供する。セルピンバリアントポリペプチドは、好中球エラスターゼ阻害活性を有する。幾つかの実施形態において、好中球エラスターゼ阻害活性は、フリーラジカルによる酸化に対する耐性を示す。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、天然のセルピンＢ１、又は配列番号１と少なくとも９０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有するセルピンＢ１バリアントポリペプチドを含む。幾つかの実施形態において、バリアントポリペプチドは、天然のヒトセルピンＢ１（配列番号１）と比較して、Ｃ３４４Ｇ、Ｃ３４４Ａ、及びＣ３４４Ｖからなる群から選択される単一アミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態において、バリアントポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４の配列を含む。

幾つかの実施形態において、薬学的に許容される担体は、セルピンＢ１ポリペプチドのＣ３４４がフリーラジカルにより酸化されるのを防止することができる還元剤（例えば、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ））である。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、配列番号１の配列を有する天然のセルピンＢ１と還元剤とを含む。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、配列番号１の全長配列にわたり配列番号１と少なくとも９０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有するセルピンＢ１バリアントを含み、バリアントポリペプチドは、好中球エラスターゼ（例えば、ヒト好中球エラスターゼ）又は膵臓エラスターゼ（例えば、ヒト膵臓エラスターゼ）のプロテアーゼ活性を阻害することも可能である。

他の薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤も好適な投与量及び濃度で使用され得る。これらの薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤としては、緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンが挙げられる抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジン；グルコース、マンノース、若しくはデキストリンが挙げられる単糖、二糖、及び他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトール；塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な製剤は、国際公開第９８／５６４１８号（引用することにより明示的に本明細書の一部をなす）に記載されている。皮下投与に適した凍結乾燥製剤は、国際公開第９７／０４８０１号に記載されている。かかる凍結乾燥製剤は、好適な希釈剤を用いて高タンパク濃度に再構成され得て、再構成された製剤は、本明細書における処置される個体に皮下投与され得る。セルピンＢ１ポリペプチド又はそのバリアントを、それを必要とする患者に送達するために、リポフェクチン又はリポソームが使用され得る。

医薬組成物に使用される還元剤の量は異なり得るが、野生型セルピンＢ１ポリペプチド又はセルピンＢ１バリアントポリペプチドのＣ３４４の酸化を防止するのに十分な量でなければならない。

Ｄ． 酸化耐性セルピンを用いた疾患の処置
セルピンＢ１バリアントポリペプチド又はそれを含む医薬組成物は、高レベルのフリーラジカルへの曝露又は環境源（例えば、タバコの煙、電子タバコ装置からの放出物が挙げられる大気汚染物質）に存在するフリーラジカルへの曝露の増加に関連する疾患又は遺伝子疾患を有する患者を処置するために使用され得る。セルピンＢ１バリアントポリペプチド又はそれを含む医薬組成物は、例えば、自然免疫細胞（例えば、好中球、単球、マクロファージ、好酸球）又は組織及び器官に内在する内因性の活性型酵素（例えば、ペルオキシダーゼ又は一酸化窒素合成酵素）による、正常な個体と比較したフリーラジカル生成の増加に関連する疾患又は遺伝子疾患を処置するためにも使用され得る。

これらの疾患の非限定的な例は、感染性疾患、自己免疫疾患、呼吸器疾患、代謝疾患、心血管疾患、神経変性疾患、又は腫瘍疾患の群から選択される。感染性疾患としては、限定されるものではないが、呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、エボラウイルス、緑膿菌、及び他の日和見病原体により引き起こされる、肺疾患又は全身性疾患、例えば、急性肺損傷（ＡＬＩ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、肺炎、細気管支炎、全身性凝固障害、又は出血性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。自己免疫疾患としては、１型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、及び患者に突発性炎症を繰り返し起こさせる根底にある遺伝子変異（複数の場合もある）を有する無菌性自己炎症性疾患（ＳＡＩＤ）が挙げられるが、これらに限定されない。呼吸器疾患としては、アレルギー性喘息、喫煙者肺気腫、ＣＯＰＤ、及び特発性肺線維症（ＩＰＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。代謝疾患としては、２型糖尿病、インスリン抵抗性、脂質異常症、及び白内障発症が挙げられるが、これらに限定されない。心血管疾患としては、アテローム性動脈硬化症及び高血圧が挙げられるが、これらに限定されない。神経変性疾患としては、パーキンソン病及びアルツハイマー病が挙げられるが、これらに限定されない。腫瘍疾患としては、結腸直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、肺癌、及び膀胱癌が挙げられるが、これらに限定されない。フリーラジカルに関連する疾患の例は、Maddu, Diseases Related To Types Of Free Radicals, （2019）, DOI：10. 5772／intechopen. 82879においても記載されており、その内容全体が引用することにより本明細書の一部をなす。

野生型セルピンＢ１又はセルピンＢ１バリアントポリペプチドの医薬組成物は、上記のような疾患又は遺伝子疾患を処置するために治療上有効用量で対象に投与され得る。医薬組成物は、例えば、吸入により、気管内に、局所的に、又は注射により皮下に、静脈内に、若しくは腹腔内に投与され得る。

通常、投与される投与量は、所望の治療効果を達成するのに有効な投与量である。当業者は、投与される用量が、対象の体重、年齢、個体の状態、処置される領域の表面積若しくは体積、及び／又は投与様式が挙げられるがこれらに限定されない多数の因子に応じて異なることを理解するであろう。用量のサイズは、特定の化合物の投与に伴う特定の対象における任意の有害作用の存在、性質、及び程度によっても決定される。好ましくは、望ましい結果をもたらすために必要とされる最小用量及び最小濃度が使用されなければならない。投与量は、小児、高齢者、衰弱した患者、並びに心疾患及び／又は肝臓疾患を有する患者に対して適切に調整されなければならない。投与量を評価するための実験動物モデルを使用した当該技術分野において既知の試験により、更なる指針が得られ得る。幾つかの実施形態において、投与される投与量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、又は１．０ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇの範囲の量の天然のセルピンＢ１（配列番号１）又はセルピンＢ１バリアントポリペプチドを送達する投与量である。幾つかの実施形態において、天然のセルピンＢ１又は本明細書において開示されるセルピンＢ１バリアントポリペプチドは、本明細書において開示される還元剤と組み合わせて（例えば、同時又は逐次的に）投与される。幾つかの実施形態において、還元剤（例えば、ＮＡＣ）は、患者の体重１キログラム当たり０．０１ｍｇ～１００ｍｇの量で送達され得る。

最適な投薬スケジュールは、対象の身体における薬剤蓄積の測定により計算され得る。一般に、投与量は、１日１回以上、週１回以上、又は月１回以上与えられ得る。当業者は、最適な投与量、投薬方法、及び反復数を容易に決定することができる。幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、１日１回以上、例えば、１日１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、又はそれ以上投与される。幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、約１日間～約３１日間、例えば、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、又は３１日間投与される。幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも１日間投与される。他の実施形態において、本発明の組成物は、１週間以上、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、又はそれ以上投与される。更なる他の実施形態において、組成物は、１ヶ月以上、例えば、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、又はそれ以上投与される。

所望の治療効果を達成するために、本発明の組成物は、治療上有効な１日量で複数日間投与され得る。したがって、対象における関連する状態又は本明細書に記載される疾患を処置するための本発明の組成物の治療上有効な投与には、３日間～２週間以上の範囲の期間継続する周期的（例えば、毎日又は１日２回）投与が必要とされる。連続した１日量が治療上有効な用量を達成するのに好ましい手段であるが、薬剤が毎日投与されない場合であっても、対象における薬剤の治療上有効な濃度を維持するのに十分な頻度で投与が繰り返される限り、治療上有益な効果は達成され得る。例えば、毎日、１日おきに、又はより高用量の範囲が用いられ、対象において忍容性がある場合、週２回薬剤が投与され得る。

細胞培養物で決定されたＩＣ_５０（症状の最大半減阻害を達成する薬剤の濃度）を含む濃度範囲を達成するための動物モデルでの用量が設定され得る。かかる情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。便又は腸組織試料中のレベルが、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定され得る。一般に、本発明の組成物の活性成分の等価用量は、典型的な対象で約１ｎｇ／ｋｇ～約１０００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇである。

本発明の組成物の投与量は、症状の重症度、再発頻度、及び／又は治療計画に対する生理的反応に応じて、処置期間を通じてモニタリング及び調整され得る。一般に、当業者は治療計画のかかる調整に関与する。

Ｅ． 天然のセルピンＢ１及びそのバリアントの産生
所望により、本開示は、天然のセルピンＢ１、又は発現効率を最大化するために宿主（例えば、酵母）のコドン使用パターンに適合するように操作されたセルピンＢ１バリアントポリペプチドのコード配列を提供する。コドン最適化の方法は、容易に入手でき、例えば、genomes.urv.es/OPTIMIZERにて無料で利用可能なＯｐｔｉｍｉｚｅｒ、GenScript社（ニュージャージー州ピスカタウェイ）のＯＰＴＩＭＵＭＧＥＮＥ（商標）アルゴリズム、及びDNA 2.0社（カリフォルニア州ニューアーク）のＧＥＮＥＧＰＳ（商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙである。一実施形態において、コード配列は、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）にて発現されるようにコドン最適化されている。幾つかの実施形態において、コード配列は、コドン最適化されていない。

セルピン又はそのバリアントのコード配列は、発現ベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス（例えば、植物ウイルス）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）等にクローニングすることができ、そこに本発明の核酸配列が順方向又は逆方向で挿入される。この実施形態の好ましい態様では、構築物は、例えば、配列に作動可能に連結されたプロモーターが挙げられる、調節配列を更に含む。多数の好適なベクター及びプロモーターが当業者に既知であり、市販されている。幾つかの実施形態において、発現ベクターは、選択マーカーを含有する酵母エピソーム発現プラスミド（ＹＥｐ）である。

幾つかの実施形態において、プロモーターは、酵母プロモーター、例えば、酵母ＡＤＨ２プロモーターである。他の実施形態において、ベクターは、遺伝子操作された酵母２ミクロンプラスミドである。

上記で開示されたコード配列を含む発現ベクターは、種々の宿主種又は宿主株に形質転換され得る。一実施形態において、宿主種は、サッカロミセス・セレビシエである。別の実施形態において、サッカロミセス・セレビシエは、プロテアーゼ欠損となるように遺伝子改変された菌株である。

天然のセルピンＢ１又はセルピンＢ１バリアントポリペプチドと第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質の方法及び組成物も本明細書において提供される。幾つかの実施形態において、第２のポリペプチドは、融合タンパク質の半減期を増加させる。例えば、第２のポリペプチドは、ＩｇＧのＦｃ部分、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、又は抗体を含み得るか、又はそれからなり得る。

幾つかの実施形態において、天然のセルピンＢ１又はセルピンＢ１バリアントポリペプチドは、例えば、ペグ化により翻訳後修飾される。

本開示の方法及び組成物のために使用され得るか、それらと共に使用され得るか、それらの準備に使用され得るか、又はそれらの産物である、材料、組成物、及び構成要素が開示される。これらの材料及び他の材料が本明細書において開示されており、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループ等が開示される場合、これらの化合物の様々な個別的及び集合的な組み合わせ及び順列の各々について具体的な言及は明示的に開示されなくてもよく、各々が本明細書において具体的に意図及び記載されているものと理解される。例えば、方法が開示及び検討され、方法を含む多数の分子になされ得る多数の改変が検討される場合、特に反対の規定がない限り、方法及び可能な変形形態のいずれの組み合わせ及び順列も具体的に意図される。同様に、これらの任意のサブセット又は組み合わせも具体的に意図及び開示される。この概念は、本開示の組成物を使用する方法の工程が挙げられるがこれに限定されない、本開示の全ての態様に適用される。したがって、実行され得る種々の追加の工程が存在する場合、これらの追加の工程の各々が、本開示の方法の任意の具体的な方法工程又は方法工程の組み合わせと共に実行され得て、かかる組み合わせ又は組み合わせのサブセットの各々が具体的に意図されており、開示されたと見なされるべきであると理解される。

以下の実施例は、例示目的にすぎず、特許請求された発明の限定と解釈されるべきでない。意図される発明を成功裡に実行するのを同様に可能にする、当業者が利用可能な種々の代替技術及び手法が存在する。

実施例１：実験手順
材料 － 精製されたヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）及びカテプシンＧ（ＣａｔＧ）は、Lee Biosolutions社（ミズーリ州セントルイス）から購入した。ブタ膵臓エラスターゼ（ＰＰＥ）、ＴＬＣＫ処理ウシαキモトリプシン（ＢＣ）、Ｎ－クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）、ウサギ抗セルピンＢ１ポリクローナル抗体（ＰＮ＃ＳＡＢ１１０１１２１）、及びヤギ抗ウサギＨＲＰコンジュゲートは、Sigma-Aldrich社（ミズーリ州セントルイス）から購入した。エラスターゼ基質であるＮ－Ｓｕｃｃ－ＡＡＰＶ－ｐＮＡ及びＢＣ基質であるＳｕｃｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡは、Bachem Americas社（カリフォルニア州トーランス）から購入した。２－メルカプトエタノール（２－ＭＥ）は、MP Biomedical社（カリフォルニア州サンタアナ）から購入した。チオ硫酸ナトリウム五水和物は、VWR International社（カリフォルニア州バイセイリア）から購入した。クロマトグラフィー樹脂であるＱＸＬ ｆａｓｔ－ｆｌｏｗ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ１００ ＨＲ、及びＨｉｔｒａｐ Ｑ ＨＰは、GE Healthcare Life Sciences社（ペンシルバニア州ピッツバーグ）から購入した。ヒドロキシアパタイト（Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ、タイプ１、４０μｍ）は、Biorad Laboratories社（カリフォルニア州ハーキュリーズ）から購入した。Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ－Ｃ３ ＨＰＬＣカラムは、Agilent Technologies社（カリフォルニア州サンタクララ）から購入した。

酵母における組換えヒトｓＢ１の発現 － 組換えヒトセルピンＢ１（ｒｈｓＢ１）を、酵母（サッカロミセス・セレビシエ）に発現させ、酵母から精製した。Genscript USA社（ニュージャージー州）で酵母ＡＤＨ２プロモーターの制御下の野生型ヒトセルピンＢ１をコードするヒトｍＲＮＡ配列が合成され、大腸菌（e. coli）ベクターｐＵＣ５７にサブクローニングされた。ベクター（２μｇ）をエンドヌクレアーゼで消化し、ＺｙｍｏｃｌｅａｎゲルＤＮＡ回収キット（Zymo Research社、サンディエゴ）を使用して適切にサイズ分類されたＤＮＡ断片を回収した。ｕｒａ選択マーカーを含有する２μｍの酵母プラスミド（ｐＳＢ１００）にこの断片をライゲーションし、サッカロミセス・セレビシエに形質転換した。Ｕｒａ－／８％グルコースプレート上で増殖した幾つかのコロニーを、ウラシルを欠くが、８％のグルコースを含有する合成限定（ＳＤ）培地（Sunrise Sciences社、サンディエゴ）の接種物中で３０℃にて一晩増殖させることによりｒｈＢ１発現についてスクリーニングし、次いで、酵母抽出物／ペプトン／２％のグルコース（ＹＥＰＤ）に移し、更に７２時間増殖させた。試料を２４時間、４８時間、及び７２時間の時点で採取し、増殖（ＯＤ_６００）、タンパク質発現（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、及びｒｈＢ１活性（ブタ膵臓エラスターゼの阻害）について解析した。ｒｈｓＢ１の良好な発現及び活性を示す幾つかのクローンを選択し、グリセロールストックを調製し、－８０℃にて凍結させた。Genscript USA社（ニュージャージー州）で、Ｇ１０３１をＣで置換する部位特異的変異導入により、Ｃｙｓ－３４４→セリン変異がｐＵＣ５７のヒトセルピンＢ１コード配列に導入された。野生型ｒｈｓＢ１タンパク質について記載したように、このバリアント配列を切除し、サブクローニングし、酵母に形質転換した。発現構築物のコード配列をＤＮＡ塩基配列決定により確認した。

組換えヒトｓＢ１の精製 － カラムクロマトグラフィー及び硫安塩析の組み合わせを使用してｒｈｓＢ１を酵母ペースト（５０ｇ～１００ｇ）から精製した。本発明者らは、ｓＢ１の２つのシステイン残基（Ｃｙｓ－２１４、Ｃｙｓ－３４４）の反応性、及び高度に還元的な酵母細胞内環境から開放されたら、それらがどのように振る舞うかに興味があったため、還元剤を全ての精製工程から除去した。要約すると、ビーズ式破砕機（BioSpec Products社、オクラホマ州）を使用して、１ｍＭのＥＤＴＡ（ＴＥ）を含有する１０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）中で細胞をガラスビーズ溶解に供した。可溶化液を２００００×ｇでの遠心分離により清澄化し、ｐＨを８．０に調整し、その後、ＴＥ緩衝液中で平衡化したＱＸＬ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ樹脂を含有するアニオン交換カラム上に直接ロードした。結合したタンパク質を、平衡化緩衝液中１ＭのＮａＣｌまでの５ＣＶの勾配を用いて溶出させた。活性なｒｈｓＢ１を含有する画分を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＰＰＥ阻害アッセイ（酵素阻害アッセイのセクションを参照のこと）を使用して位置付け、プールし、更に精製し、連続的な４５％及び６５％硫安（ＡＳ）塩析工程により濃縮した。これらの工程の各々について、ｒｈｓＢ１を含有するプールに固体のＡＳを添加し、室温にて３０分間混合し、次いで、２００００×ｇで２０分間遠心分離した。６５％のＡＳペレットを最小容量の１０×ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）中に再溶解し、１００ｍＭのＮａＣｌのＴＥ（ｐＨ７．４）中で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ１００ ＨＲ樹脂を含有するサイズ排除カラム上にロードした。タンパク質を５ｍＬ／分で溶出させ、単量体のｒｈＢ１を含有するピークをＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析により位置付けた。ピークの画分をプールし、１０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．９）中で一晩透析し、透析緩衝液中で平衡化したセラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＡ）のカラム上に５ｍＬ／分でロードした。カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、１０ｍＭのＮａＣｌ、０．３Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．９）までの２０カラム容量の勾配を用いて結合したタンパク質を溶出させた。カラムから溶出させたピークを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＰＰＥ阻害によりｒｈｓＢ１含量について試験した。ｒｈｓＢ１を含有する画分をプールし、Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２０限外濾過スピンカラム（Sartorius社、ドイツ）上で濃縮した。１ｍｇ／ｍＬのｒｈｓＢ１溶液で１．１６の公開された吸光係数を使用してタンパク質濃度を決定し、アリコートを－８０℃で凍結させた（１２）。

酵母可溶化液中のｒｈｓＢ１のＮ－クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）による酸化に対する感受性 － ｒｈｓＢ１を発現する酵母ペーストの１００ｍｇ試料を機械的破砕により溶解させた。酵母ペーストの入ったマイクロチューブに、０．７５ｍＬのガラスビーズ（０．５ｍｍ）及び０．７５ｍＬのＴＥ（ｐＨ８．０）を添加し、チューブをミニボルテクサー（VWR scientific社）で１分間、３回混合し、各回の間に氷上で１分間静置した。可溶性のｒｈｓＢ１を含有する可溶化液を、２００００×ｇで１０分間の遠心分離により清澄化した。清澄化した可溶化液のアリコート（９０μＬ）を、各アリコートに１０μＬの１０×ＮＣＳ濃縮物（ＴＥ中、ｐＨ８．０）を添加し、１分間、５分間、又は３０分間のいずれかの間、３０℃でインキュベートすることにより、様々な濃度のＮＣＳ（０ｍＭ～１ｍＭ）にした。過剰な１．０Ｍチオ硫酸ナトリウムを添加することにより反応を停止させた。試料を採取し、ＰＢＳ中でのブタ膵臓エラスターゼ（ＰＰＥ）及びウシキモトリプシン（ＢＣ）の阻害について分析し、ｒｈｓＢ１の分子形態についてＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット法により解析した。

酵素阻害アッセイ：
ブタ膵臓エラスターゼ（ＰＰＥ）アッセイ － ＰＰＥの阻害を、精製中にｒｈｓＢ１を含有する画分を検出するためのツール、並びに酸化された酵母可溶化液及び高度に精製されたタンパク質調製物中に存在するＰＴＭ形態のｒｈｓＢ１の相対的なＰＰＥ阻害活性を評価するためのアッセイの両方として使用した。精製工程をモニタリングするために、様々な量の選択されたクロマトグラフピーク画分を、ＰＰＥ（１００ｎＭ又は２００ｎＭ）と共にマイクロタイタープレート内で２－ＭＥを含有する又は非含有の１９５μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）の最終容量で最高５分間インキュベートした。次いで、エラスターゼ基質であるＳｕｃｃ－ＡＡＰＶ－ｐＮＡを１ｍＭの最終濃度に添加し、遊離パラニトロアニリド（ｐＮＡ）の放出をプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ ３４０ＰＣ、Molecular Devices社）上で４０５ｎｍにて数分間モニタリングした。完全にＰＰＥを阻害した画分を、ｒｈｓＢ１を含有する画分とし、プールし、精製セクションに記載されているように更に処理した。酸化された酵母可溶化液及び高度に精製された調製物中に存在するｒｈｓＢ１タンパク質の相対的な阻害活性を評価するアッセイとして使用される場合、一定濃度のＰＰＥを使用した（１００ｎｍ）。異なる容量の各試料と共にＰＰＥを、マイクロタイタープレート内の２－ＭＥを含有する又は非含有の一定容量（１９５μＬ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で異なる時間インキュベートした。残存するＰＰＥ活性を上記の通り測定した。同様のアッセイが、セルピンＢ１バリアントのヒト膵臓エラスターゼに対する阻害活性を評価するために実行され得る。

ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）アッセイ － ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ；１７０ｎＭ）を、酸化された、又は酸化されていない異なる容量の酵母可溶化液及び異なる量の精製されたｒｈｓＢ１タンパク質調製物と共に、マイクロタイタープレート内で２－ＭＥを含有する又は非含有の一定容量（１９５μＬ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で異なる時間インキュベートした。エラスターゼ基質であるＳｕｃｃ－ＡＡＰＶ－ｐＮＡを添加し、上記の通りモニタリングすることにより残存するＨＮＥ活性を決定した。

ウシキモトリプシンアッセイ － ウシキモトリプシン（ＢＣ；１００ｎＭ）を、酸化された、又は酸化されていない異なる容量の酵母可溶化液及び異なる量の精製されたｒｈｓＢ１タンパク質調製物と共に、マイクロタイタープレート内で２－ＭＥを含有する又は非含有の一定容量（１９５μＬ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で異なる時間インキュベートした。ＢＣ基質であるＳｕｃｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡを添加し、上記の通りモニタリングすることにより残存するＢＣ活性を決定した。

ヒト好中球カテプシンＧ（ＣａｔＧ）アッセイ － ヒト好中球カテプシンＧ（ＣａｔＧ；１００ｎＭ）を、異なる量の精製されたｒｈｓＢ１タンパク質調製物と共に、マイクロタイタープレート内で２－ＭＥを含有する又は非含有の一定容量（１９５μＬ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で異なる時間インキュベートした。基質であるＳｕｃｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡを添加し、ＢＣについて上記したようにモニタリングすることにより残存するＣａｔＧ活性を決定した。

ＰＰＥ、ＨＮＥ、ＢＣ、及びＣａｔＧのｒｈｓＢ１タンパク質との相互作用 － 酵素：ｒｈｓＢ１複合体をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びクマシーブルーＧ２５０による染色により可視化した。典型的には、一定量の酵素を異なる量の精製されたｒｈｓＢ１タンパク質と共に、又は一定量の精製されたｒｈｓＢ１タンパク質を異なる量の酵素と共に、最大限の複合体形成又はｒｈｓＢ１タンパク質のより低分子量形態への最大限の変換のいずれかを達成するのに十分な異なる時間インキュベートした（公開された会合速度定数（４）及び上記の酵素アッセイから得られたデータに基づく）。残存する酵素を低分子量の合成プロテアーゼインヒビターカクテル（Sigma社）の添加により阻害し、試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより解析した。

切断されたｒｈｓＢ１Ｍ＊及びｒｈｓＢ１Ｄのタンパク質配列解析 － ＰＰＥにより切断され、精製されたｒｈｓＢ１Ｍ＊及びｒｈｓＢ１Ｄを、Ｈｉｔｒａｐ Ｑ ＨＰカラム（５ｍＬ）でのイオン交換クロマトグラフィーにより更に精製して、ＰＰＥ及び残存する低分子量の合成プロテアーゼインヒビターを除去した。各々の試料は、カリフォルニア大学デイビス校の分子構造解析施設（カリフォルニア州デイビス）でエドマン分解により７サイクルにて配列決定された。

実施例２：還元剤非存在下での精製は、エラスターゼ阻害活性を欠く翻訳後修飾された形態のｒｈｓＢ１をもたらす
ｒｈｓＢ１を含有する５μＬの酵母可溶化液を異なる濃度のＮＣＳとインキュベートし、酸化させた（図２Ａ）。データポイントは、三重反復での分析の平均±ＳＥである。ｒｈｓＢ１を発現する酵母は、ウェスタンブロット法において抗ｓＢ１抗血清と特異的に交差反応する、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認できる約４２ｋＤａの分子量の主要な単一のタンパク質バンドを示した（図２Ｂ、レーン１）。ｒｈｓＢ１を発現する酵母細胞可溶化液のアリコートは、外来性に添加された還元剤の非存在下でＰＰＥ及びＢＣのインヒビターとして活性であった（図２Ｃ及び図２Ｄ）。したがって、本発明者らは、阻害活性を保持するために選択される還元剤として２－ＭＥを用いるCooley et al（12）の方法を使用してｒｈｓＢ１を精製することを最初に試みたが、得られた生成物がＲＰ－ＨＰＬＣにより判断して相対的に純粋でなく（９０％未満）、場合によっては、ＲＳＬ内での限定的なタンパク質分解に起因して不活性であることが分かった（データ非表示）。したがって、本発明者らは、この方法を改変して、還元剤を除外し、硫安分画及びセラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＡ）樹脂上でのクロマトグラフィーという２つの追加の工程を組み込んだ。本発明者らは、ＱＸＬ ＦＦプールでの硫安分画が、サイズ排除クロマトグラフィーの前にｒｈｓＢ１を更に精製し、濃縮するための迅速な方法であることを発見した。しかしながら、サイズ排除カラムから溶出する生成物がまだ相対的に純粋でなかったため、ＣＨＡクロマトグラフィーを最後の仕上げ工程として組み込んだ。サイズ排除クロマトグラフィープロセス中のｒｈｓＢ１の二量体化に起因する若干の生成物の損失はあったものの、本発明者らは、ＣＨＡクロマトグラフィーにより２つのｒｈｓＢ１含有ピークを分離することができた（図１Ａ）。第１の主ピークは、完全に還元されたｒｈｓＢ１（図１Ｃ、レーン２、３［＋２－ＭＥ］）及びＳｅｒ－３４４バリアント（図１Ｃ、レーン１、２［－２－ＭＥ］）よりわずかに分子量の高い単量体形態のｒｈｓＢ１を含有した。本発明者らは、この化学種をｒｈｓＢ１Ｍ＊と称する。第２のピークは、２－ＭＥが添加されると単量体ｒｈｓＢ１のサイズに減少され得る、約８４ｋＤａのはるかにより高分子量の化学種を含有した（図１Ｃ、レーン３（複数の場合もある）［－／＋２－ＭＥ］）。このサイズは二量体化形態のｒｈｓＢ１のものと一致し、したがって、本発明者らはこの化学種をｒｈｓＢ１Ｄと称する。本発明者らが２－ＭＥを用いてｒｈｓＢ１Ｍ＊及びｒｈｓＢ１Ｄを同じサイズに完全に還元させることができなかったという事実は、各翻訳後修飾の性質が異なり、還元されたチオール基（Ｒ－ＳＨ）を含有する別の分子との単純なジスルフィド結合形成だけではないことを最初に示した。加えて、本発明者らは、精製の間のｒｈｓＢ１Ｄの量の増加に伴うＥＩＡの段階的な喪失を認めたが、ＣＩＡの喪失は認められず、このことは、グルタチオン及びＬ－システイン等の酵母の内因性抗酸化剤から除去されると、反応部位であるＣｙｓ－３４４が翻訳後修飾（ＰＴＭ）に対して感受性になり得ることを示唆する。この仮説を支持するように、ＣＨＡクロマトグラフィーでのＳｅｒ－３４４バリアントの精製は、ｒｈｓＢ１Ｍ＊と同様の位置で溶出する、単量体ｒｈｓＢ１を含有する単一のピークのみをもたらした（図１Ｂ）。さらに、Ｓｅｒ－３４４バリアントタンパク質は、可溶化液中に存在するものと比べてより高分子量ではなく（データ非表示）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにおけるその移動度は、２－ＭＥによる影響を受けなかった（図１Ｃ、レーン１（複数の場合もある））。これらの結果は、ｒｈｓＢ１内のＣｙｓ－２１４又は他の残基での修飾ではなく、Ｃｙｓ－３４４のＰＴＭが、ｒｈｓＢ１Ｍ＊及びｒｈｓＢ１Ｄにおいて生じる分子量シフトの原因である可能性が最も高いことを示す。

実施例３． 酵母可溶化液中のｒｈｓＢ１の直接的な酸化は、ｒｈｓＢ１Ｍ＊において観察されるものと同様のＰＴＭを急速に引き起こす
酵母可溶化液中のｒｈｓＢ１は、ＮＣＳによる酸化に対する感受性（ＥＩＡの喪失により決定される）を示し、ＮＣＳによる酸化はｒｈｓＢ１Ｍ＊において観察されるものと同様の分子量シフトを引き起こした。未処理の可溶化液のアリコート（５μＬ）は、ＰＰＥ（１００ｎＭ）活性を完全に阻害することができたが、このＥＩＡは、ＮＣＳにより酸化されると急速かつ特異的に用量依存的様式で消失した（図２Ａ、図２Ｃ）。６００μＭ超のＮＣＳ濃度がｒｈｓＢ１のＥＩＡを減少させることができ、酸化されていないｒｈｓＢ１よりわずかに分子量の高い特異的なバンドの出現を同時に引き起こした（図２Ｂ、レーン２［ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット］）。本発明者らは、この反応が急速であり、本発明者らが試験した最も早い時点（１分）以内にほぼ完了することを観察した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認できる他のどの主要な酵母タンパク質もこのシフトを起こさなかった。対照的に、ｒｈｓＢ１を含有する酸化された可溶化液は、そのＣＩＡを保持した（図２Ｄ）。

実施例４． ｒｈｓＢ１Ｄ及びｒｈｓＢ１Ｍ＊はブタ膵臓エラスターゼの基質である
２－ＭＥの非存在下では、ｒｈｓＢ１Ｍ＊もｒｈｓＢ１ＤもＰＰＥを阻害することができなかった。代わりに、両方ともより低分子量の化学種に容易に切断された。図３Ａ（レーン３～５及び７～９）は、１：１０～１：１０００の範囲の酵素対インヒビター（Ｅ：Ｉ）モル比により生成された、それぞれｒｈｓＢ１Ｄ及びｒｈｓＢ１Ｍ＊の切断プロファイルを示す。ｒｈｓＢ１Ｄ及びｒｈｓＢ１Ｍ＊の両方が、１：１００以上のＥ：Ｉモル比で３０分の時間内に約３８ｋＤａのより低分子量の化学種に特異的に分解された。セルピンでは、この分解パターンは、特にそのセルピンに起因する酵素阻害機能の特異的喪失を伴う場合、通常、ＲＳＬ内での限定的なタンパク質分解を示す。ｒｈｓＢ１Ｄの場合、約４６ｋＤａの中間の分解種（図３Ａ、レーン４）及び約８ｋＤａ～１０ｋＤａの一過性に染色された分解種も観察された（レーン５）。約４６ｋＤａ種のサイズは、切断されたｒｈｓＢ１分子から放出されたＲＳＬペプチド（約４ｋＤａ）にＣｙｓ－３４４によりジスルフィド結合されたインタクトなｒｈｓＢ１単量体（約４２ｋＤａ）のサイズと一致する。８ｋＤａ～１０ｋＤａの種は、おそらくＣｙｓ－３４４により互いにジスルフィド結合された２つのＲＳＬペプチドを含む。

２５ｍＭの２－ＭＥの存在下では、ｒｈｓＢ１Ｍ＊は、依然としてＰＰＥを効率的に阻害することができず、また上記のようにより低分子量の化学種に分解された（データ非表示）。対照的に、ｒｈｓＢ１Ｄは、２５ｍＭの２－ＭＥにより、用量依存的様式でＰＰＥとＳＤＳ安定性の複合体を形成することができる活性な単量体ｒｈｓＢ１に還元された（図３Ｂ）。しかしながら、このゲルは、形成されたより高分子量のＥ：Ｉ複合体に加えて、上記の切断された形態と同様の別のより低分子量の化学種が０．２５超のＥ：Ｉモル比で生成された（約３８ｋＤａ）ことを明白に示す。

実施例５． ｒｈｓＢ１Ｄ及びｒｈｓＢ１Ｍ＊は、ブタ膵臓エラスターゼにより反応部位ループ内の複数の部位で切断される
ＰＰＥにより切断されたｒｈｓＢ１Ｍ＊の直接的タンパク質配列解析により、別個であるが、重複するｓＢ１のＲＳＬに由来する３つの配列が得られ（表１、図９）、結果はＲＰ－ＨＰＬＣで観察された３つのピークと一致した。存在する主な配列（約４９％）は、Ｔｈｒ－３４２：Ｐｈｅ－３４３結合の切断により生じた。他の２つの配列は、より低量で存在し、Ａｌａ－３３８：Ｇｌｙ－３３９（約２０％）及びＡｌａ－３４１：Ｔｈｒ－３４２（約３１％）結合の切断により生じた。ＰＰＥで切断されたｒｈｓＢ１Ｄの配列解析により全く同じ３つの配列が得られたが、各々の収率が異なった。Ｔｈｒ－３４２：Ｐｈｅ－３４３及びＡｌａ－３４１：Ｔｈｒ－３４２結合の切断の量がそれぞれ３９％及び２３％に減少し、一方でＡｌａ－３３８：Ｇｌｙ－３３９結合の切断が３８％に増加した。これらの結果は、ＰＰＥの報告された特異性と一致し、ｒｈｓＢ１Ｄにおけるジスルフィド結合形成を担う残基としてのＣｙｓ－３４４を裏付ける。Ｃｙｓ－３４４は、この相互作用に参加することができる、ＲＳＬ内に存在する唯一のシステイン残基であり、エラスターゼ切断部位のＣ末端に存在するが、Ｃｙｓ－２１４は３８ｋＤａ種の一部である。

おそらくエドマン分解のプロセス化学に干渉するＮ－アセチルトランスフェラーゼＢ（ＮａｔＢ）によるＮ末端メチオニンのα－アミノ基のアセチル化に起因して、ｒｈｓＢ１のＮ末端アミノ酸からのタンパク質配列データは取得されなかった。これは、他のＮ－アセチル化されたクレードＢセルピン及び細胞内で発現されたタンパク質で観察されている（２９）。

実施例６． 最大エラスターゼ阻害活性を復元するためのｒｈｓＢ１Ｄの還元には、高濃度の２－ＭＥが必要とされる
完全に還元されたｒｈｓＢ１Ｄ又はｒｈｓＢ１Ｍ＊のヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）対する阻害活性を正確に評価するために、本発明者らは、一定量の各々（２３０ｎＭ又は４６０ｎＭ）を異なる濃度の２－ＭＥで滴定し、次いで、それらを一定量のＨＮＥ（１７０ｎＭ）と反応させた。２－ＭＥのみでのＨＮＥ活性に対する効果を評価する適切な対照が含まれた。図４Ａは、２３０ｎＭのｒｈｓＢ１Ｄを含有する溶液における４０ｍＭまでの２－ＭＥの濃度の増加が、初期値の約４０％までのＨＮＥの残存活性の漸進的減少をもたらしたことを示す。これを超える２－ＭＥの濃度（最高０．５Ｍ）は更なる影響を及ぼさなかったが、アッセイにおけるｒｈｓＢ１Ｄの量を２倍にすると、ＨＮＥの完全な阻害がもたらされた。これは、ＥＩＡを完全に復元するために、ｒｈｓＢ１Ｄにおける分子間のＣｙｓ－３４４：Ｃｙｓ－３４４ジスルフィド結合が、比較的高濃度の還元剤（２－ＭＥの場合、少なくとも２５ｍＭ以上）を必要とすることを示す。

対照的に、２－ＭＥでの２３０ｎＭのｒｈｓＢ１Ｍ＊の滴定は、試験された濃度のいずれにおいてもＥＩＡに対する小さな影響しか及ぼさなかった（図４Ｂ）。しかし、４６０ｎＭではこの影響がわずかに増強され、このことは、ｒｈｓＢ１Ｍ＊調製物のごく一部が還元に対して感受性であり、不可逆的に修飾されていなかったことを示唆する。

実施例７． ｒｈｓＢ１Ｄ及びｒｈｓＢ１Ｍ＊はＨＮＥの基質でもある
ｒｈｓＢ１Ｄ及びｒｈｓＢ１Ｍ＊のＨＮＥとの相互作用は、上記のＰＰＥでの結果とよく似た結果を提供した。還元剤の非存在下ではどちらもＨＮＥを顕著に阻害することができず、両方とも図３Ａにおいて観察されるものと同様の分解パターンを示した（図５Ｂ及び図５Ｄ；ＰＢＳ）。図５Ａ及び図５Ｂは、４０ｍＭの２－ＭＥの存在下又は非存在下での一定濃度のＨＮＥと漸増する量のｒｈｓＢ１Ｄとの相互作用を示す。等モル量の活性酵素を完全に阻害するのに必要とされる活性なセルピンのモル量は、しばしば、阻害の化学量論すなわちＳＯＩと称され（３０）、本発明者らが酵素調製物の特異的活性を決定していなかったとしても、図５Ａの動態データから、完全に還元されたｒｈｓＢ１ＤのＨＮＥとのＳＯＩが約２．１であることが明らかである。このデータは、２－ＭＥの非存在下では、複合体が観察されず、二量体が完全に切断されて、ＲＳＬが切断されたｒｈｓＢ１を生じた（図５Ｂ；「ＰＢＳ」）が、２－ＭＥの存在下では、約６８ｋＤａのＨＮＥ：ｒｈｓＢ１複合体が約５７ｋＤａの中間種及び約４２ｋＤａのＲＳＬが切断されたｒｈｓＢ１と共に容易に観察されたように（図５Ｂ、ＰＢＳ＋４０ｍＭの２－ＭＥ）、還元型のｒｈｓＢ１ＤがＨＮＥの阻害に絶対的に必要とされることを確証する。ＨＮＥ阻害が最大である場合、中間種は観察されず、複合体、ＲＳＬが切断されたｒｈｓＢ１、及びインタクトなｒｈｓＢ１のみが可視的であった。中間種は、遊離酵素の複合体に対する作用により生成され得る。

対照的に、還元されたｒｈｓＢ１Ｍ＊のＨＮＥとのＳＯＩは、約１３（データ非表示）であり、ＲＳＬ内で触媒的に切断されている大部分のｒｈｓＢ１Ｍ＊及び少量の中間の約５７ｋＤａ複合体がＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認できる（図５Ｃ、図５Ｄ；ＰＢＳ＋４０ｍＭの２－ＭＥ）。これは、この調製物中の一部のｒｈｓＢ１Ｍ＊が不可逆的に酸化されなかったことの更なる証拠を提供する。

実施例８． ｒｈｓＢ１Ｄ及びｒｈｓＢ１Ｍ＊は、キモトリプシン阻害活性を保持するが、阻害の化学量論が変化している
エラスターゼとは対照的に、ＢＣは、２－ＭＥの存在下又は非存在下でｒｈｓＢ１Ｄ及びｒｈｓＢ１Ｍ＊の両方により阻害されたが、それらのＳＯＩは変化した。本発明者らの動態データは、２－ＭＥの存在下でｒｈｓＢ１Ｄが０．５に近いＳＯＩを有していたことを示した（図６Ａ）。しかしながら、このような低いＳＯＩは、理論的に不可能であり、おそらく、ＢＣ調製物の５０％以下の特異的活性を反映している。２－ＭＥの非存在下ではこの比率は約１．０に増加し、試料のインキュベート時間が最長１時間に延長された場合に、変化しなかった。このことは、反応が完了していたことを示す。２－ＭＥの非存在下でのＳＯＩのこの倍増の１つの説明は、ＢＣがインタクトな二量体のＲＳＬの一方に結合すると、他方のＲＳＬへのアクセスが立体障害され、これにより、１つの二量体分子による１つのＢＣ分子のみの阻害が可能となるということであり得る。或いは、複合体形成に伴う構造的変化が、第２のＲＳＬが効果的にＢＣと相互作用できなくして、複合体を形成できなくする可能性がある。ＳＤＳ－ＰＡＧＥデータは、動態データを確証し、２－ＭＥの存在下又は非存在下で、漸増する量のｒｈｓＢ１Ｄで滴定された際の一定濃度の遊離ＢＣの消失を示した（図６Ｂ）。２－ＭＥの非存在下（ＰＢＳ）では、二量体は、二量体及び酵素からなる約１０９ｋＤａの予測される分子量の複合体を形成するのではなく、約６７ｋＤａのより低分子量のバンド及び微量の約４２ｋＤａのバンドの形成に付随して解離するようであった。前者のバンドは、還元されていないＢＣ（約２５ｋＤａ、ＰＢＳ、Ｅ）と単量体ｒｈｓＢ１（約４２ｋＤａ、ＰＢＳ＋４０ｍＭの２－ＭＥ、Ｉ）との間で形成された複合体の分子量と一致する分子量を有し、後者は、インタクトであるか、又はＲＳＬが切断されたｒｈｓＢ１のいずれかの分子量と一致する。２－ＭＥの存在下では、ＢＣは、約１５ｋＤａ及び約１０ｋＤａの２本の鎖に解離し、このうちの小さい方が活性部位Ｓｅｒ－１９５を保持する。したがって、これらの条件下では、少量のＲＳＬが切断されたｒｈｓＢ１に加えて、非常により小さい複合体及び中間の複合体（約５２ｋＤａ及び約４８ｋＤａ）がｒｈｓＢ１とＢＣとの間で形成される（ＰＢＳ＋４０ｍＭの２－ＭＥ）。

ｒｈｓＢ１Ｍ＊のＢＣとのＳＯＩは、２－ＭＥの非存在下又は存在下で約３であり、２－ＭＥの存在下でＳＯＩがわずかにより低くなる傾向があった（図６Ｃ、図６Ｄ）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、２－ＭＥの非存在下でＢＣと形成される複合体の分子量は、ＲＳＬが切断されたｒｈｓＢ１Ｍ＊が視覚的により明瞭であったことを除き、２－ＭＥの非存在下でのｒｈｓＢ１Ｄで観察されたものと同様であった。この発見は、観察されたより高いＳＯＩと一致する。

実施例９． ｒｈｓＢ１Ｄ及びｒｈｓＢ１Ｍ＊のＣａｔＧとの相互作用は、ＢＣとの相互作用と同様であった
ＣａｔＧはキモトリプシンと密接に関連するため、本発明者らは、そのｒｈｓＢ１Ｄ及びｒｈｓＢ１Ｍ＊との相互作用は、ＢＣとｒｈｓＢ１Ｄ及びｒｈｓＢ１Ｍ＊とについての上記のデータと同様のデータをもたらすであろうと予想した。結果は、動態的に、及び反応産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析により同様の相互作用を示した。還元された二量体は、還元されていない二量体と比較した場合、ＣａｔＧの阻害において２倍効果的なようであったが、各々のＳＯＩは、ｒｈＢ１ＤのＢＣとの相互作用について記載されたＳＯＩの約２倍であった。おそらくこれは、ＣａｔＧ調製物のより高い特異的な活性、複合体形成時のＣａｔＧによるｒｈＢ１Ｄのより高い代謝回転率、又は２つの組み合わせのいずれかを反映している。２つ目の仮説を支持するように、図６Ｂ及び図７ＢのＳＤＳ－ＰＡＧＥプロファイルの比較から、２－ＭＥの非存在下でＢＣとｒｈｓＢ１Ｄとの間で形成される複合体は、ＣａｔＧとｒｈｓＢ１Ｄとの間で形成されるものより非常に安定しており、ごくわずかな中間の複合体又はＲＳＬが切断されたｒｈｓＢ１しか生じないようである。ｒｈｓＢ１Ｍ＊のＢＣ又はＣａｔＧのいずれかとの相互作用についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥプロファイルの比較もこの比較的不安定性を実証し、ＣａｔＧと反応した場合に、ＢＣと反応した場合と比べてより多くのｒｈｓＢ１Ｍ＊が、中間物又は完全な複合体を形成するよりも、ＲＳＬ切断経路に分配する（図６Ｄ、図７Ｃ）。このために、ＣａｔＧのｒｈｓＢ１Ｄ又はｒｈｓＢ１Ｍ＊のいずれかとの相互作用のＳＯＩが、ＢＣのｒｈｓＢ１Ｄ又はｒｈｓＢ１Ｍ＊との相互作用で観察されるＳＯＩよりそれぞれ高い可能性がある。

本明細書に記載される実施例及び実施形態は、例示目的のためにすぎず、それらを考慮しての種々の改変又は変更が当業者に示唆され、本出願の要旨及び範囲内並びに添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解されよう。本明細書において引用される全ての刊行物、配列アクセッション番号、特許、及び特許出願は、全ての目的のためにそれらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす。

実施例１０． 野生型ｓＢ１の特徴付け
この実験は、生理学的に関連するＲＯＳ及びＲＮＳのｓＢ１のエラスターゼ阻害活性に対する影響を解析するために実施された。野生型セルピンＢ１（ｒｈｓＢ１ ＷＴ（Ｃ３４４））を発現する酵母をＰＢＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）中で溶解させ、野生型（Ｃ３４４）セルピンＢ１を含有する可溶性の可溶化液を遠心分離により不溶性の細胞片から分離した。酵素（ＰＰＥ）をＰＰＥ活性が観察されなくなるまで可溶化液で滴定した。この実験の条件は、実施例１に記載されたのと同様であり、ｒｈｓＢ１は、酵母可溶化液中に存在する内因性の抗酸化剤により安定化された未酸化状態の遊離単量体ｒｈｓＢ１ Ｃ３４４－ＳＨとして存在した。

別個の可溶化液の試料を、異なる濃度の各ＲＯＳ／ＲＮＳで異なる時間処理し、反応を過剰のチオ硫酸ナトリウムを停止させた。次いで、図１の凡例に記載した方法を使用して処理に関連する容量変化に対して調整した後に、酸化された可溶化液試料をＰＰＥと反応させて、阻害活性を再評価した。図１２のパネルＡは、異なる濃度の過酸化亜硝酸（ＲＯＳ及びＲＮＳの両方）、Ｎ－クロロスクシンイミド（ＲＯＳ）、過酸化水素（ＲＯＳ）、及び次亜塩素酸ナトリウム（ＲＯＳ）の各試料中に存在するエラスターゼ阻害活性に対する影響を示す。図１２のパネルＢは、１ｍＭの濃度の過酸化亜硝酸が、野生型セルピンＢ１のエラスターゼ阻害活性を急速に不活性化することができ、測定された最も早い時点（５分）で８０％のＰＰＥ活性が復元されたことを示す。これらの結果は、野生型セルピンＢ１（Ｃ３４４）が、強力な酸化剤（例えば、過酸化亜硝酸）である活性酸素種及び活性窒素種（ＲＯＳ／ＲＮＳ）によりエラスターゼインヒビターとして急速に不活性化されるが、同様にＲＯＳであるが、より弱い酸化剤である過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）により不活性化されないことを示す。この差は、ｒｈｓＢ１のＣ３４４－ＳＨ基がタンパク質内の周囲のアミノ酸により安定化されていることに起因する可能性が高く、Ｃ３４４－ＳＨ基は、強力な酸化剤によってのみ酸化され得る。

次に、本発明者らは、酸化された野生型ｓＢ１の他のプロテアーゼを阻害する能力を試験するための実験を実行した。過酸化亜硝酸で処理され、不活性化された野生型セルピンＢ１（Ｃ３４４）を含有する酵母可溶化液を使用して、ウシα－キモトリプシンを阻害する能力を評価した（図１３、パネルＡ）。最大阻害のベースライン条件を確立するための酵素に対する酸化されていない可溶化液の最初の滴定を、キモトリプシンの発色基質であるＳｕｃｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡを使用することを除き、ＰＰＥについて記載したように実施した。結果は、野生型セルピンＢ１（Ｃ３４４）の酸化が、ウシα－キモトリプシンを阻害する能力を減少させることを示す。

次いで、本発明者らは、過酸化亜硝酸により不活化された野生型セルピンＢ１を精製し、好中球プロテイナーゼ３を阻害する能力を試験した（ＰＲ３；図１３、パネルＢ）。この実験では、１０μＬの３．３μＭのＰＲ３を、２倍モル過剰の各精製されたインヒビターとマイクロタイタープレート内で１９５μＬ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）の最終容量に混合した。試料を５分インキュベートし、次いで、５μＬの発色基質であるメトキシＳｕｃｃ－ＡＡＰＶ－ｐＮＡ（約１ｍＭの最終濃度）を添加し、残存する酵素活性をΔ４０５ｎｍで２０分間モニタリングした。結果は、野生型ｒｈｓＢ１（ｒｈｓＢ１－ＷＴ）が、プロテイナーゼ３（ＰＲ３）の発色基質切断活性を完全に阻害することができるが、過酸化亜硝酸により酸化されたｒｈｓＢ１（ｒｈｓＢ１Ｍ＊Ｐ）がその阻害活性の約４０％を失っていることを示す（図１３パネルＢ）。対照的に、酸化耐性Ｃ３４４Ａバリアント（ｒｈｓＢ１ Ａ３４４）は、阻害活性を少しも失っていなかった。最後に、エラスターゼにより切断された形態のｒｈｓＢ１（ｒｈｓＢ１－ＣＬ）は、全ての阻害活性を失い、実際にはＰＲ３活性を約５０％刺激した。このことは、反応部位ループ内での切断が全てのプロテアーゼ阻害活性を完全に破壊することを確証する。

実施例１１． ｓＢ１バリアントのエラスターゼ阻害活性の評価
野生型アミノ酸（Ｃ３４４）のＤＮＡコード配列を部位特異的変異誘発により変化させることにより、セルピンＢ１反応部位バリアントを構築した。配列をＤＮＡ配列決定により確認し、酵母発現ベクターにクローニングし、酵母（サッカロミセス・セレビシエ）に形質転換した。バリアントタンパク質を発現させ、前述したように精製した。

ヒトα１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）が基準対照として含まれた。セルピンＢ１の約４２５００ダルトンに対して、ＡＡＴの分子量は約５４０００ダルトンである。

酵素アッセイ：マイクロタイタープレート内の２００μＬの最終容量で、発色基質であるＳｕｃｃ－ＡＡＡ－ｐＮＡを用いて４０５ｎｍで約４００ｍＡＵ／分のＶｍａｘを生じたブタ膵臓エラスターゼ（ＰＰＥ）の濃度を使用した。これは通常１６０ｎＭであった。マイクロタイタープレートウェルへの試薬の添加順序は、以下の通りであった：１． 酵素（８μＬ～１０μＬの０．１ｍｇ／ｍＬ作業用原液のＰＰＥ）；２． 緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、＋４０ｍＭの２－メルカプトエタノール）；３． インヒビター。溶液を混合し、２５℃で５分間インキュベートし、次いで、５μＬの発色基質を１ｍＭの最終濃度に添加し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０ ＰＣマイクロタイタープレートリーダー（Molecular Devices社）で酵素活性を２分間記録した。各アッセイを三重反復で２回実行した。結果は、４つ全てのバリアントがエラスターゼ阻害活性を示すが、それらが非常に異なる効率でエラスターゼを阻害することを示した（図１４）。Ｃ３４４Ａ（Ａ３４４）バリアントのみが、野生型ｒｈｓＢ１（Ｃ３４４（野生型））のように、ＰＰＥを完全に阻害するために同量の精製されたタンパク質（１μｇ）を必要とし、精製されたヒトＡＡＴと同等であった。Ｃ３４４Ｖ（Ｖ３４４）バリアントは次善であり、１．５μｇの精製されたタンパク質を必要とした一方で、Ｃ３４４Ｇバリアントは同じ阻害レベルを達成するために３．５μｇのタンパク質を必要とした。Ｃ３４４Ｓバリアントは、完全な阻害を達成するために１３μｇの精製されたタンパク質を必要とする、ＰＰＥの弱いインヒビターであった。理想的には、Ｃ３４４Ａバリアントが、酸化耐性型のタンパク質として最良の置換であり、それにＣ３３４Ｖ及びＣ３４４Ｇ、その次にＣ３４４Ｓが続く。明らかに、セルピンＢ１のＣ３４４の保存的のように思われる置換をすることにより、ＰＰＥを阻害する能力が非常に異なるタンパク質がもたらされる。

Ｃ３４４Ｓは、エラスターゼの弱いインヒビターである
この実験では、一定量の野生型ｒｈｓＢ１（Ｃ３４４）又はＣ３４４Ｓバリアント（Ｓ３４４）を、異なる量のＰＰＥと共に示されるモル比でインキュベートした。反応容量を２０μＬに固定した。ＰＰＥを最初に添加し、続いて、緩衝液及びインヒビターを添加した。試料を２５℃で５分間インキュベートし、次いで、合成プロテアーゼインヒビターミックス（Sigma、カタログ番号Ｐ８２１５）を添加して、活性酵素をクエンチし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ローディング緩衝液を添加し、試料を５分間加熱した。反応産物を４％～２０％のＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離し、クマシーブルーＲ２５０による染色により可視化した（図１５）。Ｉはインヒビター（セルピンＢ１タンパク質）を表し、Ｅはブタ膵臓エラスターゼ（ＰＰＥ）を表し、ＭはＳＤＳ－ＰＡＧＥ用分子量マーカー（１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、８０ｋＤａ、及び１２０ｋＤａ）を表す。結果は、通常、野生型（Ｃ３４４）セルピンＢ１とＳＤＳ及び熱安定性の複合体を形成する酵素：インヒビター比で、Ｃ３４４ＳセルピンＢ１バリアントがＰＰＥにより急速に切断され、不活性化されることを示す。プロテアーゼインヒビターの生物学の当業者にとって、この種の相互作用は、「阻害の化学量論」（ＳＩ）と称され、ここで、セルピンは、標的酵素の非常に「効率的な」インヒビターであり、酵素が不活性である等モルのインヒビター：酵素比で、若しくはその付近で安定な複合体を形成することができるか、又はセルピンは、非常に弱いインヒビターであり、その大部分が触媒的に切断される基質経路に分配し、決して安定した複合体を形成しない。効率的なインヒビターと比較して、標的酵素を阻害するために非常に多量の弱いインヒビターが必要とされるため、これは生理学的に非常に重要である。

Ｃ３４４Ａ ｒｈｓＢ１バリアントは、酸化に対する耐性を示す
この実験では、野生型セルピンＢ１（Ｃ３４４）又はＣ３４４Ａバリアントを含有する酵母可溶化液を、上記で記載されたように酸化剤である過酸化亜硝酸で処理した。次いで、図３及び図４に記載されているように試料を、エラスターゼ及びキモトリプシンを阻害するそれらの能力について試験した。結果（図１６に示す）は、セルピンＢ１ Ｃ３４４Ａバリアントが、過酸化亜硝酸の存在下でエラスターゼ及びキモトリプシン阻害活性を保持するが、野生型セルピンＢ１（ｒｈｓＢ１ Ｃ３４４）が漸増する量の過酸化亜硝酸により急速に不活性化されることを示す。

この実験では、セルピンＢ１野生型タンパク質（ｒｈｓＢ１ ＷＴ）又はＣ３４４Ａバリアント（ｒｈｓＢ１ Ａ３４４）のいずれかを発現する酵母をＰＢＳ（ｐＨ７．５）中で溶解させた。酵素（ＰＰＥ）をＰＰＥ活性が観察されなくなるまで可溶化液（複数の場合もある）で滴定した。次いで、可溶化液（複数の場合もある）を、１Ｕ又は５Ｕの精製されたヒト好中球ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）＋２５ｍＭの塩化ナトリウム及び８０μＭのＨ_２Ｏ_２と共に異なる時間、インキュベートし、反応を過剰のチオ硫酸ナトリウムで停止させた。酸化された可溶化液試料をＰＰＥと反応させて、前述したように阻害活性を再評価した。精製されたヒトＡＡＴ（ｈＡＡＴ）を、ＭＰＯにより生成されたフリーラジカルにより不活性化されることが以前に示されたため、対照として使用した。結果（図１７に示す）は、野生型セルピンＢ１（ｒｈｓＢ１ ＷＴ）及びｈＡＡＴが、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）により生成されたフリーラジカルにより用量依存的様式で急速に不活性化されたが、Ｃ３４４Ａバリアント（ｒｈｓＢ１ Ａ３４４）は不活性化されなかったことを示す。

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本明細書において引用された全ての刊行物及び特許文献は、各刊行物及び文献が引用することにより本明細書の一部をなすことが具体的に、かつ個々に示されているかのように引用することにより本明細書の一部をなす。本発明は、主に特定の実施形態を参照して記載されているが、本開示を読むことにより他の実施形態が当業者に明らかとなることも想定され、かかる実施形態は本発明の方法の範囲内に包含されることが意図される。

例示的配列の表
配列番号１：ヒトＭＮＥＩ（セルピンＢ１）野生型（Ｃ３４４）のタンパク質配列（下線付きは残基Ｃ３４４である）

配列番号２：ヒトＭＮＥＩ Ｃ３４４Ｇバリアントのタンパク質配列（下線付きは残基Ｃ３４４での置換を示す）

配列番号３：ヒトＭＮＥＩ Ｃ３４４Ａバリアントのタンパク質配列（下線付きは残基Ｃ３４４での置換を示す）

配列番号４：ヒトＭＮＥＩ Ｃ３４４Ｖバリアントのタンパク質配列（下線付きは残基Ｃ３４４での置換を示す）

配列番号５：ヒトＭＮＥＩ Ｃ３４４Ｓバリアントのタンパク質配列（下線付きは残基Ｃ３４４での置換を示す）

配列番号６：酵母ＡＤＨ２プロモーターのＤＮＡ配列（アクセッション番号：Ｊ０１３１４ Ｍ１３４７５ Ｖ０１２９３）

Claims (25)

1. セルピンＢ１バリアントポリペプチドであって、配列番号１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含み、好中球又は膵臓エラスターゼ阻害活性を有し、前記好中球又は膵臓エラスターゼ阻害活性が、フリーラジカルによる酸化に対する耐性を示す、セルピンＢ１バリアントポリペプチド。
2. 前記フリーラジカルが、活性酸素種、活性窒素種、又は両方である、請求項１に記載のセルピンＢ１バリアントポリペプチド。
3. 前記セルピンバリアントポリペプチドが、配列番号１の配列と比較して、Ｃ３４４Ａ、Ｃ３４４Ｖ、及びＣ３４４Ｇからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のセルピンＢ１バリアントポリペプチド。
4. 前記セルピンＢ１バリアントポリペプチドが、ＩｇＧのＦｃ部分、抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に融合されている、請求項１～３のいずれか１項に記載のセルピンＢ１バリアントポリペプチド。
5. 前記セルピンＢ１バリアントポリペプチドがペグ化されている、請求項１～４のいずれか１項に記載のセルピンＢ１バリアントポリペプチド。
6. 請求項１に記載のセルピンＢ１バリアントポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
7. 請求項１～５のいずれか１項に記載のセルピンバリアントポリペプチドと薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
8. 医薬組成物であって、配列番号１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むセルピンＢ１ポリペプチドと、システイン３４４の酸化を防止する還元剤とを含み、ここで、前記ポリペプチドは、好中球又は膵臓エラスターゼを阻害することができる、医薬組成物。
9. 前記還元剤がＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）である、請求項７～９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
10. 正常な個体と比較したフリーラジカル生成の増加又は環境におけるフリーラジカルへの曝露の増加に関連する疾患を有する患者を処置する方法であって、
    セルピンＢ１バリアントポリペプチドを投与することを含み、前記セルピンＢ１バリアントポリペプチドが配列番号１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含み、前記セルピンバリアントポリペプチドが、配列番号１の天然タンパク質配列と比較して残基３４４でのアミノ酸置換を含み、
    前記セルピンＢ１バリアントポリペプチドが、好中球又は膵臓エラスターゼのセリンプロテアーゼ活性を阻害することができ、
    前記セルピンＢ１バリアントポリペプチドがフリーラジカルによる酸化に対する耐性を示す、方法。
11. 前記フリーラジカルが、活性酸素種、活性窒素種、又は両方である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記セルピンバリアントポリペプチドが、配列番号２～４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
13. 正常な個体と比較したフリーラジカル生成の増加又は環境源におけるフリーラジカルへの曝露の増加に関連する疾患又は遺伝子疾患を有する患者を処置する方法であって、請求項７～９のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
14. 正常な個体と比較したフリーラジカル生成の増加又は環境におけるフリーラジカルへの曝露の増加に関連する疾患を有する患者を処置する方法であって、
    有効量のセルピンＢ１ポリペプチド及び還元剤を投与することを含み、前記セルピンＢ１ポリペプチドが、配列番号１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含み、前記セルピンＢ１ポリペプチドが、好中球又は膵臓エラスターゼのセリンプロテアーゼ活性を阻害することができ、
    前記還元剤が、前記セルピンＢ１ポリペプチドのＣ３４４の酸化を防止するのに十分な量で存在する、方法。
15. 前記疾患又は遺伝子疾患が、タバコの煙中に存在するフリーラジカルへの曝露、又は正常な個体と比較した自然免疫細胞、粘膜細胞、若しくは腺細胞に存在する酵素によるフリーラジカル生成の増加に関連する、請求項１０に記載の方法。
16. 前記疾患が、感染性疾患、自己免疫疾患、呼吸器疾患、代謝疾患、心血管疾患、神経変性疾患、及び腫瘍疾患からなる群から選択される、請求項１０～１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記酸化耐性セリンプロテアーゼインヒビターが、吸入により、気管内に、局所的に、又は注射により皮下に、静脈内に、若しくは腹腔内に投与される、請求項１０に記載の方法。
18. 前記セルピンＢ１バリアントポリペプチドが、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１７に記載の方法。
19. 天然のセルピンＢ１又はそのバリアントポリペプチドを産生させる方法であって、
    サッカロミセス・セレビシエにおいて天然のセルピンＢ１又はセルピンＢ１バリアントポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させることを含み、
    前記セルピンＢ１バリアントポリペプチドが配列番号１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含み、前記セルピンバリアントポリペプチドが、配列番号１の天然タンパク質配列と比較して残基３４４でのアミノ酸置換を含み、
    前記セルピンＢ１バリアントポリペプチドが、好中球又は膵臓エラスターゼのセリンプロテアーゼ活性を阻害することができ、
    前記セルピンＢ１バリアントポリペプチドがフリーラジカルによる酸化に対する耐性を示す、方法。
20. 前記サッカロミセス・セレビシエがプロテアーゼを欠損している、請求項１９に記載の方法。
21. 前記ポリヌクレオチドを発現させる方法が、酵母エピソーム発現プラスミド（ＹＥｐ）をサッカロミセス・セレビシエに導入することによるものである、請求項１９に記載の方法。
22. 前記ポリヌクレオチドが酵母プロモーターに連結されている、請求項１９に記載の方法。
23. 前記酵母プロモーターがＡＤＨ２プロモーターである、請求項２２に記載の方法。
24. 前記ポリヌクレオチドが酵母にて発現されるようにコドン最適化されている、請求項１９に記載の方法。
25. 前記セルピンＢ１バリアントポリペプチドが、ＩｇＧのＦｃ部分、抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に融合されているか、又は前記セルピンＢ１バリアントポリペプチドがペグ化されている、請求項１９～２４のいずれか１項に記載の方法。

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