JP2018518962A - 新規トロンビン阻害物質 - Google Patents
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Abstract
Description
QTAVPKISKQGLGGDFEEIPSDEIIE(配列番号3);
ISKQGLGGDFEEIPSDEIIE(配列番号4);
SGGHQTAVPKIAKQGLGGDFEEIPSDEIIE(配列番号5);
SGGHQTAVPKIHKQGLGGDFEEIPSDEIIE(配列番号6);
SGGHQTAVPRISKQGLGGDFEEIPSDEIIE(配列番号7);
SGGHQTAVPXISKQGLGGDFEEIPSDEIIE(配列番号8)(配列中、Xはβ−ホモアルギニンである);
SDEAVRAIPXMYSTAPPGDFEEIPDDAIEE(配列番号9)(配列中、Xはβ−ホモアルギニンである);
SDQGDVAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEE(配列番号10);
SDEAVRAEPKMHKTAPPGDFEEIPDDAIEE(配列番号11);
SDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPEEYLDDES(配列番号12);
MYSTAPPGDFEEIPDDAIEE(配列番号13);
SDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDEIEE(配列番号14);
SDEAVRAIPKMYSQAPPGDFEEIPDDAIEE(配列番号15);
SDQGDVAEPKMYSTAPPFDFEAIPEEYLDDES(配列番号16);
配列番号2のバリアントであるSDQGDVAEPXMHSTAPPFDFEAIPEEYLDDES(配列番号17)(配列中、Xはβ−ホモアルギニンである);
配列番号2のバリアントであるCDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEE(配列番号18);
配列番号2のバリアントであるSDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEECA(配列番号19);
配列番号2のバリアントであるMYSTAPPGDFEEIPDDAIEEGCCC(配列番号20);
配列番号2のバリアントであるSDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEEGCCC(配列番号21);
SGEDHTAVPKMSRKGLGGDFEDIPPEAYERALEAR(配列番号22);
ELESGDEDSEGGDSQSSPTESAAPRLHQREGGGGDFENVEYDQDQK(配列番号23);
SDVAPADYESDEGDNDGGHDGSEVAKPKMPRGNGGGGDFEEIPEVE(配列番号24);および
TGSDDDDEYDMYESDGDSNEGNDNDEFETAVPRLPNPNSGRDSEHIPMPVN(配列番号25)
を含む群から選択される。
便宜上、本明細書、実施例、および添付の請求項において使用される特定の用語を以下にまとめた。
配列番号1の断片であるQTAVPKISKQGLGGDFEEIPSDEIIE(配列番号3);
配列番号1の断片であるISKQGLGGDFEEIPSDEIIE(配列番号4);
配列番号1のS12AバリアントであるSGGHQTAVPKIAKQGLGGDFEEIPSDEIIE(配列番号5);
配列番号1のS12HバリアントであるSGGHQTAVPKIHKQGLGGDFEEIPSDEIIE(配列番号6);
配列番号1のK10RバリアントであるSGGHQTAVPRISKQGLGGDFEEIPSDEIIE(配列番号7);
配列番号1のβ−ホモアルギニンバリアントであるSGGHQTAVPXISKQGLGGDFEEIPSDEIIE(配列番号8);
配列番号2のβ−ホモアルギニンバリアントであるSDEAVRAIPXMYSTAPPGDFEEIPDDAIEE(配列番号9);
配列番号2のバリアントであるSDQGDVAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEE(配列番号10);
配列番号2のバリアントであるSDEAVRAEPKMHKTAPPGDFEEIPDDAIEE(配列番号11);
配列番号2のバリアントであるSDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPEEYLDDES(配列番号12);
配列番号2のバリアントであるMYSTAPPGDFEEIPDDAIEE(配列番号13);
配列番号2のバリアントであるSDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDEIEE(配列番号14);
配列番号2のバリアントであるSDEAVRAIPKMYSQAPPGDFEEIPDDAIEE(配列番号15);
配列番号2のバリアントであるSDQGDVAEPKMYSTAPPFDFEAIPEEYLDDES(配列番号16);
配列番号2のバリアントであるSDQGDVAEPXMHSTAPPFDFEAIPEEYLDDES(配列番号17);
配列番号2のバリアントであるCDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEE(配列番号18);
配列番号2のバリアントであるSDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEECA(配列番号19);
配列番号2のバリアントであるMYSTAPPGDFEEIPDDAIEEGCCC(配列番号20);
配列番号2のバリアントであるSDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEEGCCC(配列番号21);
SGEDHTAVPKMSRKGLGGDFEDIPPEAYERALEAR(配列番号22);
ELESGDEDSEGGDSQSSPTESAAPRLHQREGGGGDFENVEYDQDQK(配列番号23);
SDVAPADYESDEGDNDGGHDGSEVAKPKMPRGNGGGGDFEEIPEVE(配列番号24);および
TGSDDDDEYDMYESDGDSNEGNDNDEFETAVPRLPNPNSGRDSEHIPMPVN(配列番号25)
を含む群から選択される。
a.患者から組織試料を得ること;および
b.本発明の任意の一態様による少なくとも1つの阻害物質と前記試料とを接触させ、トロンビンと前記少なくとも1つのトロンビン阻害物質の結合を検出することによって、前記試料中でトロンビンが蓄積していたかどうかを検出すること
を含む方法が提供される。
カリクレイン、ヒトフィブリノゲンおよびウシトリプシンは、Merck Chemicals社(英国ノッティンガム)から購入した。ウシキモトリプシン、塩化鉄(III)六水和物およびウシ血清アルブミンは、シグマ アルドリッチ社(米国ミズーリ州セントルイス)から購入した。その他のセリンプロテアーゼはいずれもHematologic Technologies社(米国バーモント州エセックス・ジャンクション)から入手した。組換えトロンビンは、化学及血清療法研究所(化血研)(日本)より供与された。発色基質はChromogenix社から購入し、スペクトロザイムFIXaはAmerican Diagnostica社から入手した。使用した他の化学物質および試薬はいずれも分析グレードであった。
ペプチドはいずれも、過去の報告に従って、Intavis MultiPep RSiペプチドシンセサイザー(Intavis Bioanalytical Instruments(ドイツ、ケルン))を使用して固相ペプチド合成法により合成し、樹脂から切断した[Koh CY, et al., J Biol Chem 282: 29101-13 (2007)]。GEヘルスケア社(スウェーデン、ウプサラ)のAKTA purifierおよびJupiter Proteoカラム(5μm、250mm×10mm、90Å)を使用した逆相HPLCによって粗ペプチドを精製した。ペプチドの純度および質量はいずれも、サーモフィッシャーサイエンティフィック社(米国マサチューセッツ州ウォルサム)のLCQ Fleetイオントラップ質量分析計を使用してESI-MSによって測定した。
avathrin、QT26またはIS20を10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)に溶解し、JascoTM J-810分光偏光計(メリーランド州イーストン)を使用して遠紫外円偏光二色性(CD)スペクトル(260〜190nm)を測定した。測定はいずれも、光路長0.1cmのキュベットを使用し、走査速度50nm/分、バンド幅2nmおよび分解能0.2nmの条件で室温にて行った。
トロンビンのアミド分解活性アッセイは、いずれのペプチドに対しても、100mM NaClおよび1mg/mlウシ血清アルブミンを含む50mMトリス緩衝液(pH7.4)を入れた96ウェルマイクロタイタープレートにおいて行った。すなわち、インキュベーション時間を様々に変えてペプチド100μlとトロンビン100μlとをプレインキュベートし、S2238 100μlを反応ウェルに加えた。テカン社(スイス、メンネドルフ)のTecan Infinite Pro M200マイクロプレートリーダーを使用して405nmで10分間吸光度を測定することによって、p−ニトロアニリンの生成率を追跡した。GraphPad Prizmソフトウェア(米国カリフォルニア州サンディエゴ)を使用してカーブフィッティングを行って用量応答曲線を作製し、IC50値とHill係数を求めた。阻害定数を測定するため、様々な濃度のS2238を使用し、強く結合する阻害物質に適用可能なMorrisonの式から残存活性(反応速度)を求めた。トロンビンのフィブリノゲン分解活性に対するペプチドの阻害作用は、過去の報告に従って、テカン社(スイス、メンネドルフ)のサンライズマイクロプレートリーダーを使用して650nmで吸光度を測定することによって試験した[Koh CY, et al., J Biol Chem 282: 29101-13 (2007)]。avathrinの選択性は13種のセリンプロテアーゼに対して試験した(図5)。これらのセリンプロテアーゼのアミド分解活性に対するavathrinの効果は、各セリンプロテアーゼに対応する発色基質を使用して測定した。トロンビンによるavathrinの分解。150mM NaClおよび1mg/ml BSAを含む50mMトリス緩衝液(pH7.4)中で、avathrin(150μM)をトロンビン(5μM)とともにインキュベートした。インキュベーション時間を様々に変えて反応させた後、1%TFA(pH1.8)で反応を停止し、サーモフィッシャーサイエンティフィック社(米国マサチューセッツ州ウォルサム)のDionex nano-HPLCシステムに接続したJupiter Proteoカラム(4μm、90Å、100×1.0mm)に反応液を載せた。0.05%TFAおよび99.95%MilliQ水を溶離液Aとし、0.05%TFA、19.95%MilliQ水および80%ACNを溶離液Bとしたアセトニトリル勾配を用いて溶出を行った。すべてのピークの質量を測定して分解産物を同定し、次いで、ピークを積分し、曲線下面積を算出することによって定量した。プレインキュベーション時間を様々に変えたときのトロンビン阻害活性を測定するため、インキュベーション時間を様々に変えて(最大で36時間)アミド分解アッセイを行った。
20mM NH4HCO3を添加した分画分子量(MWCO)3000のスピンフィルターを使用して組換えα−トロンビン(150mM NaCl溶液中)を脱塩し、凍結乾燥し、結晶化した。トロンビンと阻害物質との複合体として、トロンビンとvarieginの複合体、トロンビンとhirugenの複合体およびトロンビンとhirulogの複合体も解析に供し、これらの結晶化ではさらに最適化した条件を使用した[Koh CY, et al., PLoS One 2011; 6.; Skrzypczak-Jankun E, et al., J Mol Biol 221: 1379-93 (1991)]。また、375mM NaClを含む50mM HEPES緩衝液(pH7.4)にavathrin(81.7μM)を溶解し、得られたavathrin溶液にトロンビンを最終濃度54.5μMで溶解した。結晶化はハンギングドロップ蒸気拡散法を使用して行った。すなわち、avathrinおよびトロンビンを含む混合物1μlと沈殿剤1μl(100mM HEPES、pH7.4、20〜25%(w/v)PEG 8000)とを混合し、4℃で静置した。約6週間後に結晶が析出した。母液を含む凍結保護溶液に25%(v/v)のグリセリンを添加し、この凍結保護溶液に結晶を浸し、100Kの冷窒素気流(Oxford Cryosystem(英国オックスフォード))でフラッシュ冷却した。回転アノードを備えたリガク社製X線発生装置上に設置したCCDを使用して、180フレームのデータセットを収集した(振動範囲180°)。得られたデータセットはMosflm[Battye TGG, et al., Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr 67: 271-81 (2011)]を使用してデータ処理し、AIMLESS[Evans PR, and Murshudov GN. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr 69: 1204-14 (2013)]を使用してスケーリングを行った[Leslie AGW, and Powell HR. Evolving methods for macromolecular Crystallography. 2007]。複合体の構造は、Phaserプログラムと、テンプレートとしてのトロンビン−variegin複合体の結晶構造(PDB:3B23)とを使用して、分子置換法によって決定した[McCoy AJ. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr International Union of Crystallography 63: 32-41 (2006)]。COOTを使用してモデル構築および構造精密化を行った[Emsley P, and Cowtan K. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr International Union of Crystallography 60: 2126-32 (2004)]。
凝塊結合トロンビンの活性はS2238を使用して試験した。すなわち、(50mM HEPES緩衝液、pH7.5、150mM NaCl、10mg/mL CaCl2中の)2mg/mLフィブリノゲン100μLを30nMトロンビン100μLとともにインキュベートすることによってフィブリン凝塊を作製した。37℃で2時間インキュベートして得られた凝塊を同じ緩衝液で丁寧に洗浄した。24時間にわたって3時間ごとに同じ方法で繰り返し洗浄を行った。様々な濃度のavathrinを凝塊に加え、60分間インキュベートした。発色基質S2238(最終濃度:200μM)を加え、反応混合物を37℃で90分間インキュベートした。反応混合物を小分けし、Tecan Infinite(登録商標)Proマイクロプレートリーダーを使用して、エンドポイント法により405nmでの吸光度から基質の加水分解を推定した。実験は4連で行い、阻害率(%)をプロットした。
動物実験はすべて、シンガポール国立大学の動物実験委員会によって認可されたプロトコル041/12に従って行った。過去に報告された方法[Eckly A, et al., J Thromb Haemost 9: 779-89 (2011)]を一部変更して、塩化鉄(III)の誘導により頸動脈血栓モデルを作製した。すなわち、雄性C57BL/6マウス(9〜11週齢、24.5〜27.5g)にケタミン(75mg/kg)およびメデトミジン(1mg/kg)を腹腔内注射することによって麻酔をかけた。様々な用量のavathrin100μLをマウスの尾静脈に注射した。鈍的剥離によって右頸動脈を切開し、FeCl3を染みこませた2mm×2mmの濾紙を頸動脈上に載せて血管損傷を誘導した。3分後、濾紙を除去し、滅菌生理食塩水で血管を洗浄した。閉塞が生じるまでの時間を測定するため、小型のドップラー血流計(トランソニックシステムズ社(米国ニューヨーク州イサカ))を頸動脈の周囲に配置し、ADInstruments社(ニュージーランド、ダニーデン)のトランソニック(登録商標)血流計を使用して血流を記録した。損傷作製後から最大で30分まで血流をモニターした。実験終了後直ちに、麻酔から回復する前に頸椎脱臼によってマウスを安楽死させた。
各ペプチドをリン酸緩衝生理食塩水に溶解し、10×ペプチド溶液を調製した(すなわち、試験における最終濃度の10倍の濃度のペプチド溶液を調製した)。添加剤を含んでいない採血管に10×ペプチド溶液0.3mlを入れた。注射器を使用して健常ボランティアから血液を採取し、直ちに50mlの遠心用コニカルチューブ(Falconチューブ)に移した後、ペプチド溶液を入れた採血管に血液2.7mlをピペットで移した。ペプチドの最終濃度は表5および表6に記載した通りである。
濃度を様々に変えた種々のペプチドを添加した採血管を、規定の試験時間に達するまで室温で静置した。様々な時間点において、採血管を数回転倒混和しながら、血栓形成の指標としての不溶性物質の有無を目視で確認した。
濃度を様々に変えた種々のペプチドを添加した採血管を、規定の試験時間に達するまで室温で静置した。様々な時間点において採血管を数回転倒混和し、血液試料を採取して、メーカーの推奨プロトコルに準じ、Multiplate(登録商標)血小板凝集計と血小板アゴニストとしてのアデノシン二リン酸(ADP)を使用して、血小板凝集能検査を行った。
Amblyomma variegatumの唾液腺におけるvariegin様転写産物の検出
血液を与えて9日間飼育した雌のAmblyomma variegatumの唾液腺からcDNAを得た後、varieginの配列に基づいた縮重プライマーを使用して、219残基の前駆体タンパク質(BAD29729)をコードする転写産物(AB183707)を該cDNAから増幅した。この前駆体タンパク質は、推定上の分泌シグナル配列と、30残基の同じ反復配列を5つ含んでいるが、これらの反復配列の間に推定上の切断部位があることから、前駆体タンパク質が翻訳後に切断されることによって5つの活性ペプチドが得られる。唾液腺におけるこの前駆体タンパク質の発現をin situハイブリダイゼーションによって確認した。唾液腺のII型腺房の基底膜に見られる大型顆粒細胞の細胞質においてプローブをハイブリダイズさせた。若虫および雌雄の成虫ダニの唾液腺において転写産物の局在を同定したところ、飼育期間によって発現に差があること、および発現の開始に個体差があることが示された。血液を与えて2〜4日飼育した若虫、5日間飼育した雌成虫および12日間飼育した雄成虫、すなわち、雌ダニが満腹まで吸血して宿主から脱落し始める頃に最も強い発現が検出された(図1A〜I)。219残基のアミノ酸配列中の短い配列だけで十分な活性が得られると考え、配列番号1で示されるavathrin(30残基のアミノ酸)を合成した。配列番号1をコードするヌクレオチド配列を配列番号21に示す。
(i)varieginは酸性残基からなるN末端を有し、これが速い結合速度の達成に重要な役割を果たしていると推定される[Koh CY, et al., J Biol Chem 282: 29101-13 (2007)]。これに対して、上記のvariegin様ペプチドでは酸性残基は通常存在しない。
(ii)varieginは、恐らく自体のHis12をトロンビンのSer195に水素結合させることによって、活性部位の触媒三残基の電荷リレー系を破壊し、それによってトロンビンを阻害する[Koh CY, et al., PLoS One 2011; 6]。上記のvariegin様ペプチドでは、この機能性ヒスチジンはセリンと置換されている。
(iii)天然varieginのThr14はグリコシル化されており、合成varieginの14倍の親和性を示した[Koh CY, et al., J Biol Chem 282: 29101-13 (2007)]。variegin様ペプチドでは、この残基に相当する位置にグルタミンが存在し、グルタミンはグリコシル化することができない。
(iv)varieginでは、Pro16およびPro17によって主鎖に折れ曲がりが生じ、活性部位とエキソサイトI結合セグメントとの間の結合において立体構造の柔軟性が恐らく制限されている[Koh CY, et al., PLoS One 2011; 6]。variegin様ペプチド中の類似領域には3つのグリシン残基が含まれており、これによってペプチドの柔軟性が非常に高くなっている。
avathrin(Amblyomma variegatum thrombin inhibitor)と命名した活性ペプチドをFmocベースの固相ペプチド合成法によって合成し、精製して均質なペプチドを得た(図2)。ペプチド小分子からなる発色基質S2238に対するトロンビンのアミド分解活性は、avathrinによって用量依存的に阻害され、そのIC50は6.95±0.42nMであり、Hill slopeは0.92±0.01であった。等モル濃度のトロンビンとavathrin(0.81nMのトロンビンと1nMのavathrin)を反応させたところ、有意な阻害作用(14.33±1.39%)が観察され、強く結合する阻害物質に典型的な曲線が示された[Copeland R a. Enzymes: A practical Introduction to Structure, mechanism, and data analysis. 2000](図3A)。avathrinとトロンビンを混合して得られた反応進行曲線では、安定な平衡状態が示されたことから、avathrinが速く結合する阻害物質であることが示された(図3B)。様々な濃度のavathrinの存在下においてトロンビンの反応速度を測定することによって、見かけの阻害定数(Ki’)を求めた。Ki’のプロットは、S2238の濃度が高くなるにつれて直線的に増加し、avathrinがS2238と競合するトロンビン競合阻害物質であることが示された(Ki=545.3±3.1pM)(図3C、図3D)。したがって、avathrinは速く強く結合するトロンビン競合阻害物質であることが示された。さらに、avathrinは用量依存的にフィブリノゲン凝固時間を延長し、トロンビンのフィブリノゲン分解活性も阻害することが示された(図4)。
avathrinはトロンビンのペプチド性基質S2238と競合する競合阻害物質であることから、avathrinがトロンビンの活性部位に結合することが示された。このことから、varieginやビバリルジンなどの他の巨大分子基質や阻害物質と同様に、avathrinはトロンビンによる加水分解切断を受けると考えられる。インキュベーション時間を延長してavathrinとトロンビンとを(30:1の比率で)反応させ、逆相クロマトグラフィー(RP-HPLC)およびエレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)で分析することによって、トロンビンによるavathrinの分解を調査した。インキュベーション後、SGGHQTAVPK(981.3Da)およびISKQGLGGDFEEIPSDEIIE(2176.3Da)に相当する2つのピークが新たに同定され、Lys10とIle11の間の被切断結合で切断されたことが示された(図6A)。得られたクロマトグラムのピーク下面積を算出することによって分解を定量した(図6B)。インキュベーション時間が長くなるにつれて、分解産物の量が徐々に増加するとともに、完全長ペプチドの量が減少し、約10時間後にはavathrinが完全に分解された。この分解が阻害活性に及ぼす影響を評価した(図6C)。分解実験に使用したのと同じavathrinとトロンビンの比率(1:30)で実験を行ったところ、24時間後にトロンビンのアミド分解活性の45%超が阻害され、avathrinが完全に分解された後でも、長時間にわたってトロンビンに対する阻害作用が示された。varieginでも同じような挙動が示され、varieginが分解された後でも、C末端から被切断結合までを含む切断ペプチドによってトロンビンに対する阻害作用が発揮され続けた。avathrinの分解産物が完全長avathrinと同様にトロンビンを阻害するかどうかを検討するため、avathrinの分解産物に相当するペプチド(IS20)を精製し、その阻害作用を試験した。IS20によってトロンビンのアミド分解活性が阻害され、そのIC50値は12.38±0.32nMであった(図7A)。S2238の濃度が増加するにつれて、Ki’が曲線を描いて徐々に減少したことから、IS20はこのペプチド性小分子基質に対して非競合阻害物質として機能することが示され、Ki値は総じて5.76±0.23nMとなった(図7Bおよび図7C)。さらに、IS20はトロンビンのフィブリノゲン分解活性を用量依存的に阻害した(図4)。したがって、avathrinは、そのC末端ペプチドを介して長時間にわたって阻害作用を示し、avathrinのC末端ペプチドはトロンビンに対して強力な結合親和性を保持していることが示された。
avathrinのトロンビン結合セグメントの位置を特定するため、avathrinの2種の末端切断バリアント(QT26およびGL16)をさらに合成した。QT26は、avathrinのN末端から4残基を欠失させたものであり、GL16はavathrinのN末端から15残基を欠失させたものである。いずれのペプチドについても、トロンビンのアミド分解活性およびフィブリノゲン分解活性を阻害する能力を試験した。QT26は、トロンビンのアミド分解活性を阻害し(IC50=8.94±0.64nMおよびKi=760.32±0.91pM)(図7A、図7Dおよび図7E)、さらにトロンビンのフィブリノゲン分解活性も阻害した(図4)。N末端の4残基が欠失していることによるQT26の活性の低下は、完全長avathrinと比較してごくわずかであった。これに対して、GL16は、300μMの濃度であってもアミド分解活性を阻害することができず、逆にわずかな活性化(5〜10%)を示した(図7F)。しかし、GL16はフィブリノゲン分解活性を阻害した(図4)。以上の結果から、QT26は活性部位結合配列とエキソサイトI結合配列の両方を含んでいるが、GL16はエキソサイトI結合配列のみを含んでいることが示された。被切断結合はLys10とIle11の間に存在することから、avathrinの活性部位結合セグメントは5QTAVPKISKQ14配列中に存在する。
上述したように、varieginとavathrinの間での全体的な配列同一性が低く、かつ重要な機能性残基のいくつかが変化しているにも関わらず、avathrinは、そのトロンビン阻害活性においてvarieginと機能的に非常に類似している。この2つの配列の違いの重要性をさらに詳しく調査するため、varieginを用いた過去の構造機能研究[Koh CY, et al., PLoS One 2011; 6]から得た情報を元に、一連のavathrin置換変異体の評価を行った。
結晶化したトロンビン−avathrin複合体をC2空間群で解析し、2.09Åの分解能で構造を精密化した(表3)。トロンビンは、軽鎖の末端、自己消化ループおよび重鎖のC末端を除いた大部分において残基の電子密度が十分に定義されている。しかし、残念ながら、トロンビンに結合したavathrinでは、残基の電子密度のすべてが十分に定義されているわけではなく、トロンビン−avathrin複合体の明確な結晶構造モデルは構築されていない。最初の4残基の配列(1SGGH4)と最後の2残基の配列(29IE30)では、電子密度は観察されない。さらに、avathrinのC末端から、AIle11とAGly18の間の被切断結合までの領域では、電子密度は不連続である。これを踏まえ、avathrinペプチドの2つのセグメントとして、N末端から被切断結合までの活性部位結合セグメント(5QTAVPK10)と、エキソサイトI結合セグメント(19DFEEIPSDEI28)とを構築した(図12Aおよび図12B)。本実験では、結晶化中にavathrinが切断されると仮定する。切断後、トロンビンと複合体化したavathrinにおいて、AIle11とAGly18の間の残基は秩序立った結合構造を有していなかった。電子密度が低かったことから、側鎖中のAGln5、AGlu22およびASer25は構築することができなかった。
止血作用を発揮するフィブリン凝塊は、活性化トロンビンを捕捉し、その循環を制限する[Francischetti IMB, et al., Biochemistry 38: 16678-85 (1999)]。この凝塊結合トロンビンは、ヘパリン−アンチトロンビンIII複合体による阻害から保護されており、活性化トロンビンの供給源として機能し、血栓再形成の一助となっていると考えられている[Francischetti IMB, et al., Biochemistry 38: 16678-85 (1999);Bridge KI, et al.,Thromb Haemost 112: 1-8 (2014)]。したがって、凝塊結合トロンビンを阻害することによって血栓再形成を予防することができると考えられる。これを踏まえ、凝塊結合トロンビンを阻害する能力についてavathrinを評価した。avathrinは、凝塊結合トロンビンを用量依存的に阻害し、そのIC50値は1.74±0.35μMであり(図13)、その阻害作用はトロンビン溶液に対して発揮された阻害作用よりも高かった。アルガトロバンなどの活性部位阻害物質は、濃度依存的に速くかつ可逆的に凝塊結合トロンビンを阻害し、そのIC50値は2.7μMである[Berry C, et al., Thromb Haemost 72: 381-6 (1994)]。
インビボにおけるavathrinの抗血栓作用を評価するため、FeCl3で誘導した頸動脈血栓マウスモデルを使用した[Wan C, et al., J Thromb Haemost 13: 248-61 (2015); Eckly a, et al., J Thromb Haemost 2011; 9: 779-89]。avathrinを静脈注射したマウスにおいて、閉塞が生じるまでの平均時間(TTO)が用量依存的に延長した。対照マウスでのTTOは7.24±1.46分であったのに対し、3mg/kgのavathrinを注射したマウスのTTOは15.03±3.23分まで延長し、10mg/kgのavathrinを注射したマウスのTTOは22.51±4.19分まで延長した。avathrinの有効性は、比較対照薬物としてのhirulog-1と比較することによって評価した。3mg/kgのhirulog-1を注射したマウスのTTOは9.70±3.15分であり、10mg/kgのhirulog-1を注射したマウスのTTOは15.22±3.39分であった。したがって、avathrinはhirulog-1よりも良好な抗血栓作用を示した(図14)。
Amblyomma variegatum、Rhipicephalus pulchellus、Amblyomma americanum、Amblyomma cajenesse、Amblyomma maculatumおよびHyalomma marginatum rufipesの公開されているトランスクリプトーム情報を利用したstandalone BLAST解析を行うことによって、varieginやavathrinに類似したペプチド配列を同定した。varieginおよびavathrinに対してこれらの配列を手動でアライメントし、各ダニ類から1種類ずつペプチドを選択し、さらに詳しく分析した。
avathrin転写産物に類似したタンパク質配列として、A. variagatumやその他のマダニ類に由来するタンパク質配列をNCBIデータベースからさらにいくつか見出すことができる。これらの配列のいくつかを合成し、そのトロンビン阻害活性を試験した(図15および表4)。これらの配列のアクセッション番号は、DAA34688.1、DAA34160.1およびDAA34258.1であった。avathrin転写産物と同様に、これらの配列はいくつかの反復配列を含んでおり、翻訳後修飾によりvariegin様の短い成熟ペプチドにプロセシングされると見られる。代表的な1つの配列を合成し、トロンビン阻害作用について試験し、ultravarieginと命名した。ultravarieginはvarieginと50%の同一性を有する。
室温での採血管における抗凝固作用について、3種の濃度(75μM、150μMおよび300μM)のvariegin、ultravarieginおよびavathrinを試験した。過去の特許出願(WO2012075407A2)において、varieginは採血管の添加剤として使用されているが、avathrinやultravarieginのこのような用途は報告されていない。avathrin(Ki=545pM)は、variegin(Ki=318pM)と同等の親和性を持ち、varieginと同等の抗凝固作用を示した(表6)。
さらに、Multiplate(登録商標)アナライザーを使用して、150μMまたは300μMのultravariegin、avathrinまたはvarieginで血液凝固を阻止した血液における血小板凝集反応を試験した。血小板アゴニストとしてADP(6.5μM)を使用した。2種のコントロールとしてクエン酸塩およびヒルジンを使用した。得られた結果を表7および図26に示す。
上述したように、avathrinとvarieginは配列全体の同一性が低く(40%)、また、重要な機能性残基において様々なバリエーションが見られたにもかかわらず、avathrinは、varieginと同じように機能すると考えられる。avathrinとvarieginはいずれも、トロンビンの活性部位とエキソサイトIを標的として速く強く結合する二価阻害物質として機能し、同等の阻害定数でトロンビンを阻害する(varieginのKi=342pM、avathrinのKi=545pM)。varieginとavathrinはいずれも、標準的な結合様式でトロンビンに結合するため、結合した後、トロンビンによって分解される。トロンビンによるvarieginの分解(4時間で完了)は、avathrinの分解(10時間で完了)よりも速く進行する。avathrinの分解がvarieginよりも遅延する理由は、AGly15、AGly17およびAGly18によって付与されるペプチド全体の柔軟性にあると考えられる。avathrinの分解産物およびvarieginの分解産物は、ペプチド性小分子基質に対して非競合的にトロンビンを阻害し、varieginの分解産物(MH22)の親和性は、avathrinの分解産物(IS20)の親和性の約2分の1未満であった[Koh CY, et al., ChemBioChem 10: 2155-8 (2009)]。avathrinの分解速度がvarieginよりも遅いことは、恐らく、IS20の親和性がvarieginの分解産物よりも高いことに起因し、平衡状態において、avathrinの分解に働く遊離トロンビンが減少することによると考えられる。さらに、12番目にセリンがあることによって、同じ位置にヒスチジンがある場合よりもわずかに良好な親和性が得られると見られるが、N末端の酸性残基は速い結合動態に寄与しないことも示された。varieginとavathrinの配列を比較することによって、上述の点に注目した構造機能解析を実施し、トロンビンと阻害物質の相互作用についての理解を深めることができた。
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Claims (23)
- 単離されたトロンビン阻害物質であって、
配列番号1またはそのバリアントもしくは断片、配列番号2またはそのバリアントもしくは断片、配列番号22またはそのバリアントもしくは断片、配列番号23またはそのバリアントもしくは断片、配列番号24またはそのバリアントもしくはその断片、および配列番号25またはそのバリアントもしくは断片を含む群から選択されるアミノ酸配列を含むトロンビン阻害物質。 - 前記アミノ酸配列が、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24および配列番号25を含む群から選択される、請求項1に記載の単離されたトロンビン阻害物質。
- 配列番号2、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20および配列番号21からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1または2に記載の単離されたトロンビン阻害物質。
- トロンビンのフィブリノゲン分解活性および/またはトロンビンのアミド分解活性を阻害する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の単離されたトロンビン阻害物質。
- アミド分解アッセイで評価したIC50が、400nM未満、好ましくは300nM未満、200nM未満、100nM未満、50nM未満、10nM未満、好ましくは9nM未満、8nM未満、7nM未満、6nM未満、5nM未満、4nM未満、3nM未満、2nM未満または1nM未満である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のトロンビン阻害物質。
- アミド分解アッセイで評価したKiが、6000nM未満、好ましくは2000nM未満、500nM未満、400nM未満、300nM未満、200nM未満、100nM未満、50nM未満、10nM未満、好ましくは9nM未満、8nM未満、7nM未満、6nM未満、5nM未満、4nM未満、3nM未満、2nM未満または1nM未満である、請求項1〜5のいずれか1項に記載のトロンビン阻害物質。
- 血栓に関連する疾患の予防または治療のための、請求項1〜6のいずれか1項に記載のアミノ酸配列を含む、単離されたトロンビン阻害物質。
- トロンビンの活性を阻害する方法であって、請求項1〜6のいずれか1項に記載の少なくとも1つのトロンビン阻害物質とトロンビンとを接触させることを含む方法。
- 前記少なくとも1つのトロンビン阻害物質が採血管の抗凝固剤として使用されている、請求項8に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのトロンビン阻害物質がステント、カテーテル、その他の医療用チューブなどの医療機器の表面コーティング剤として使用されている、請求項8に記載の方法。
- トロンビンの活性に関連する疾患の予防および/または治療のための医薬品を製造するための、請求項1〜6のいずれか1項に記載のトロンビン阻害物質の使用。
- トロンビンの活性に関連する前記疾患が、心臓発作、脳卒中および塞栓症を引き起こす動脈血栓症および静脈血栓症;不安定狭心症、冠動脈形成術、経皮的冠動脈インターベンションおよび心臓手術における血液凝固阻止用;深部静脈血栓症;血栓性静脈炎;肺塞栓症;心臓のアテローム性動脈硬化プラーク、人工弁もしくは人工血管を原因とするか、または原因不明の塞栓エピソードおよび微小塞栓エピソード;ならびに播種性血管内凝固症候群から選択される、請求項11に記載の使用。
- 前記医薬品が、動静脈シャント血栓症、挫傷、捻挫、筋肉裂傷、外傷性血腫、浮腫、紅斑、静脈瘤、静脈周囲炎、および痔核を伴う肛門の静脈周囲炎、特に血栓塞栓性合併症を伴うこれらの疾患の予防および/または治療のための局所使用のための医薬品である、請求項11に記載の使用。
- 血栓に関連する疾患を予防および/または治療する方法であって、
血栓に関連する疾患の予防および/または治療を必要とする対象に、請求項1〜6のいずれか1項に記載のトロンビン阻害物質の有効量を投与することを含む方法。 - 血栓に関連する前記疾患が、心臓発作、脳卒中および塞栓症を引き起こす動脈血栓症および静脈血栓症;不安定狭心症、冠動脈形成術、経皮的冠動脈インターベンションおよび心臓手術における血液凝固阻止用;深部静脈血栓症;血栓性静脈炎;肺塞栓症;心臓のアテローム性動脈硬化プラーク、人工弁もしくは人工血管を原因とするか、または原因不明の塞栓エピソードおよび微小塞栓エピソード;ならびに播種性血管内凝固症候群から選択される、請求項14に記載の方法。
- 血栓に関連する疾患または状態を診断する方法であって、
対象または該対象から単離された組織試料に、請求項1〜6のいずれか1項に記載の少なくとも1つの阻害物質を投与すること、および
トロンビンに結合した前記トロンビン阻害物質を検出すること
を含み、
トロンビンに結合した前記阻害物質の検出量が、正常レベルのトロンビンに結合した前記阻害物質の量よりも多い場合に、血栓に関連する疾患または状態があることが示される方法。 - 対象におけるトロンビンの蓄積を検出する方法であって、
対象または該対象から単離された組織試料に、請求項1〜6のいずれか1項に記載の少なくとも1つの阻害物質を投与すること、および
トロンビンに結合した前記少なくとも1つのトロンビン阻害物質を検出すること
を含む方法。 - 請求項1〜6のいずれか1項に記載の少なくとも1つの血栓阻害物質の有効量を含む医薬組成物。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の阻害物質をコードする単離された核酸分子。
- 配列番号26および配列番号27ならびにそれらのバリアントまたは断片として示される群から選択される、請求項19に記載の、阻害物質をコードする単離された核酸分子。
- 請求項19または20に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項19〜21のいずれか1項に記載の核酸分子またはベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の少なくとも1つの血栓阻害物質を含む、トロンビンの活性を調節するためのキット。
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