CN113248599A

CN113248599A - 新型凝血酶抑制剂

Info

Publication number: CN113248599A
Application number: CN202110367930.0A
Authority: CN
Inventors: J·K·耶尔; C·Y·柯; R·M·基尼; M·卡其米洛瓦; L·罗莱
Original assignee: Institute Of Zoology Slovak Academy Of Sciences; National University of Singapore
Current assignee: Institute Of Zoology Slovak Academy Of Sciences; National University of Singapore
Priority date: 2015-06-18
Filing date: 2016-06-17
Publication date: 2021-08-13
Also published as: AU2016280365B2; JP6813510B2; IL256347A; CA2990065A1; SG10201911414SA; US10906946B2; JP2018518962A; CN107949569A; EP3310807B1; KR20180040573A; RU2745847C2; HK1254691A1; PH12017502345A1; WO2016204696A1; US20190002511A1; MX2017016556A; RU2018101491A3; EP3310807A1; EP3310807A4; RU2018101491A

Abstract

本发明提供分离的肽、其变体和片段，其能够以高水平的特异性结合至凝血酶并抑制其的活性。也提供这样的肽和编码它们的核酸在诊断和治疗方法、包覆医疗器械中的用途。

Description

新型凝血酶抑制剂

本申请是申请日为2016年6月17日，申请号为201680048275.X，发明名称为新型凝血酶抑制剂的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及分离的肽、其变体和片段，其特异性结合引起人的凝血疾病的凝血酶。也提供这种肽在诊断和治疗血栓形成相关疾病的方法，和用于包覆医疗器械中的用途。

背景技术

止血是在血管损伤后最小化血液外渗的生理过程。血液凝固的过程的一部分包括通过以序贯方式进行的有限的蛋白水解来活化循环酶原，并以形成纤维蛋白凝块结束。凝血酶(FIIa)在止血中担当了关键性作用(Stubbs M.T.and Bode W.Throm Res 69,1-58(1993))。在其促止血作用中：(a)它将可溶性纤维蛋白原切割为纤维蛋白单体，纤维蛋白单体聚合化而形成新生凝块(Versteeg H.H.,等,Physiol Rev 93,327-358(2013))；(b)它激活谷氨酰胺转移酶(FXIII)，谷氨酰胺转移酶(FXIII)共价交联纤维蛋白单体来稳定凝块；(c)它激活自身扩增所需要的非酶性辅因子(FV和FVIII)；(d)它激活FXI，FXI又激活内源性通路(Versteeg H.H.,等,Physiol Rev 93,327-358(2013))；和(e)它通过切割蛋白酶-活化受体激活血小板，导致血小板的形状改变、脱粒和聚集(Monroe D.M.,等,ArteriosclerThromb Vasc Biol 22,1381-1389(2002))。相反地，凝血酶也通过下调血液凝固过程的发展和扩增而担当显著的抗凝剂作用：通过与血栓调节蛋白结合，它激活蛋白质C，蛋白质C依次灭活辅因子FVa和FVIIIa两者来减轻进一步的凝血酶产生(Di Cera E.Mol Aspects Med29(4),203-254(2008))。凝血酶的这些矛盾的促凝血和抗凝作用，在不受控制的流血的阻塞型血栓形成之间保持平衡，在需要时有足够的血栓形成。

心血管疾病是全世界最大的单一杀手，并且是非可传染疾病的负担的重大原因(Chaudhari K.,等,Nat.Rev.Drug.Discov 13,571-572(2014))。缺血性心脏病和中风两者都是血栓形成的病理表现，是心血管疾病最常见的例子，并占全世界死亡人数的四分之一(Raskob G.Thromb Haem 112(5),843-943(2014))。抗凝剂如直接凝血酶抑制剂(DTI)、直接因子Xa(FXa)抑制剂和维生素K拮抗剂(VKA)构成了作为抗血栓形成的药物的现有治疗性选择的显著部分。DTI用作治疗性选择的一些实例为比伐卢定，水蛭素的合成类似物，其为结合至凝血酶活性位点和外部位点-I的二价抑制剂；阿加曲班和阿加曲班，单独结合至活性位点的小分子单价DTI；和低分子量肝素(LMWH)，其以抗凝血酶依赖方式抑制凝血酶(Michiel Coppens,等,Circ Res112,920-931(2012))。尽管是抗凝治疗的普遍选择，但这些类别带有以下局限性：如治疗性窗口窄、个体剂量、高出血风险、低生物利用度和食品-药物相互作用高(Bauer K.A.Haem 464-470(2013))。因而，需寻求新型、更好的具有更大益处的抗凝剂。

吸血动物已经适应了血液采食饮食，并已发展出一套控制宿主止血以确保连续的血流的分子用于成功采食。在抗凝剂中，凝血酶抑制剂在这些血液吮吸寄生虫中占据中心地位(Koh C.Y.and Kini R.M.Expert Rev.Haematol 1(2),135-139(2008))。水蛭素、山蛭素、triabin、ornithodorin和rhodniin是来自吸血动物的凝血酶抑制剂的特定家族的一些最广泛研究的例子(Huntington J.A.Thromb Haemost 111,583-589(2014))。我们先前已经分离和表征了一种我们称之为variegin的新凝血酶抑制剂(PCT/IB2008/002109)，一个32残基长的肽，其是来自硬蜱科彩饰花蜱(Amblyomma variegatum)的唾液腺提取物的快速、紧密结合和竞争性的凝血酶抑制剂(Koh C.Y.,J Biol Chem 282(40),29101-29113(2007))。

需要提供更有效的肽作为用于心血管和脑血管疾病的治疗的治疗性药物。用途的实例包括治疗和预防引起心肌梗死、中风和栓塞的动脉和静脉血栓形成；用于在不稳定型心绞痛、冠状动脉成形术、经皮冠状动脉介入治疗和心脏手术期间的抗凝作用。而且，这些肽也能够作为试剂开发，如在血液收集管中的抗凝药物和作为医疗器械如支架、导管和医用管上的表面包覆材料。avathrin

发明内容

本发明试图解决或改善以上描述的问题，并提供新肽和其变体，其具有改善的凝血酶亲和力。虽然新鉴定的肽“avathrin”和“ultravariegin”显示了有与variegin有限的序列同一性，但它们以相似的迅速、紧密结合竞争性模式，分别以545pM和4.4pM的K_i选择性地抑制凝血酶。针对靶(凝血酶)，这些亲和力分别近似为临床使用的相似的基于肽的凝血酶抑制剂(Bivalirudin^TM)的5和650倍高，所述临床使用的凝血酶抑制剂缺乏明确的功效且需要连续的输注。我们已经利用高分辨率三维结构和这些凝血酶抑制剂的许多变体的结构-功能关系为辅助，鉴定了它们的重要功能位点。设计和合成了具有改善的凝血酶亲和力的这些肽的新变体。我们已经通过鼠类动脉血栓形成模型成功证明这些肽的活体内功效。也鉴定和研究了来自硬蜱(Ixodid ticks)的其它新肽。

本发明的第一方面，提供凝血酶抑制剂，其包含选自下组的氨基酸序列：SGGHQTAVPKISKQGLGGDFEEIPSDEIIE(SEQ ID NO:1)，其变体或片段，SDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEE(SEQ ID NO:2)，其变体或片段，SEQ ID NO:22，其变体或片段，SEQ ID NO:23，其变体或片段，SEQ ID NO:24，其变体或片段，和SEQ ID NO:25，其变体或片段。

在优选实施例中，氨基酸序列选自下组：

QTAVPKISKQGLGGDFEEIPSDEIIE(SEQ ID NO:3)；

ISKQGLGGDFEEIPSDEIIE(SEQ ID NO:4)；

SGGHQTAVPKIAKQGLGGDFEEIPSDEIIE(SEQ ID NO:5)；

SGGHQTAVPKIHKQGLGGDFEEIPSDEIIE(SEQ ID NO:6)；

SGGHQTAVPRISKQGLGGDFEEIPSDEIIE(SEQ ID NO:7)；

SGGHQTAVPXISKQGLGGDFEEIPSDEIIE(SEQ ID NO:8)，其中X为β-高精氨酸；

SDEAVRAIPXMYSTAPPGDFEEIPDDAIEE(SEQ ID NO:9)，其中X为β-高精氨酸；

SDQGDVAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEE(SEQ ID NO:10)；

SDEAVRAEPKMHKTAPPGDFEEIPDDAIEE(SEQ ID NO:11)；

SDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPEEYLDDES(SEQ ID NO:12)；

MYSTAPPGDFEEIPDDAIEE(SEQ ID NO:13)；

SDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDEIEE(SEQ ID NO:14)；

SDEAVRAIPKMYSQAPPGDFEEIPDDAIEE(SEQ ID NO:15)；

SDQGDVAEPKMYSTAPPFDFEAIPEEYLDDES(SEQ ID NO:16)；

SDQGDVAEPXMHSTAPPFDFEAIPEEYLDDES(SEQ ID NO:17)，SEQ ID NO:2的变体，其中X为β-高精氨酸；

CDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEE(SEQ ID NO:18)，SEQ ID NO:2的变体；

SDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEECA(SEQ ID NO:19)，SEQ ID NO:2的变体；

MYSTAPPGDFEEIPDDAIEEGCCC(SEQ ID NO:20)，SEQ ID NO:2的变体；

SDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEEGCCC(SEQ ID NO:21)，SEQ ID NO:2的变体；

SGEDHTAVPKMSRKGLGGDFEDIPPEAYERALEAR(SEQ ID NO:22)；

ELESGDEDSEGGDSQSSPTESAAPRLHQREGGGGDFENVEYDQDQK(SEQ ID NO:23)；

SDVAPADYESDEGDNDGGHDGSEVAKPKMPRGNGGGGDFEEIPEVE(SEQ ID NO:24)；和

TGSDDDDEYDMYESDGDSNEGNDNDEFETAVPRLPNPNSGRDSEHIPMPVN(SEQ ID NO:25)。

本发明的另一方面提供分离凝血酶抑制剂，其包含根据本发明的任一方面的氨基酸序列，其用于预防或治疗血栓相关疾病。

本发明的另一方面提供抑制凝血酶活性的方法，其中方法包括用至少一种根据本发明的任一方面的凝血酶抑制剂接触凝血酶。

根据本发明的另一方面，提供根据本发明的任一方面的凝血酶抑制剂制备用于预防和/或治疗血栓相关疾病的药物的用途。

根据本发明的另一方面，提供预防和/或治疗血栓相关的疾病的方法，包括对需要这种预防和/或治疗的受试者施用有效量的根据本发明的任一方面的凝血酶抑制剂。

根据本发明的另一方面，提供检测受试者中的凝血酶积累的方法，包括对受试者或从受试者分离的组织样品施用至少一种根据本发明的任一方面的抑制剂，并检测结合至凝血酶的所述至少一种凝血酶抑制剂的存在。

根据本发明的另一方面，提供药物组合物，其包含有效量的至少一种根据本发明的任一方面的凝血酶抑制剂。

根据本发明的另一方面，提供分离的核酸分子，其编码根据本发明的任一方面的凝血酶抑制剂。在优选实施例中，核酸序列编码SEQ ID NO:1并由以下代表：

TCGGGTGGCCATCAGACTGCTGTTCCGAAGATATCTAAGCAAGGCTTGGGTGGAGACTTTGAAGAAATTCCAAGTGATGAAATAATCGAG(SEQ ID NO:26)。

根据本发明的另一方面，提供试剂盒，其包含至少一种由本文定义的血栓抑制剂。

附图说明

图1显示编码variegin样前体蛋白质BAD29729的mRNA在硬蜱科彩饰花蜱的唾液腺中的定位。整体原位杂交揭示BAD29729在靠近主要唾液管的II型腺泡中表达，但不在其它类型的腺泡(III型腺泡通过星号表明)中表达。箭头表明表达的部位。A-C.喂食5天的雌性(A)和喂食12天的雄性(B)的唾液腺显示，在2-4个较大细胞(C)中BAD29729的强表达。D-H.在血液采食的过程期间，BAD29729在若虫中的表达。未喂食(D)、2天-喂食(E)和4天-喂食(F)的若虫显示，染色在II型腺泡的基部中。该染色在6天-喂食个体中不存在(G)，并在充分充盈的和脱离的(H)若虫中非常弱。I.2天-喂食若虫的II型腺泡的特写显示，染色在两个基础细胞中。条形100μm(A-B),50μm(D-H)和25μm(C,I)。J.variegin和avathrin(来自前体蛋白质的活性凝血酶抑制肽)的序列比对。

图2显示avathrin的合成和纯化。avathrin使用固相肽合成(solid phasepeptide synthesis)进行合成并使用反相色谱法纯化。A.avathrin的纯化，使用从10％洗脱液B至70％洗脱液B(洗脱液A：0％ACN，99.9％MilliQ水和0.1％TFA；洗脱液B：0％ACN，99.9％MilliQ水和0.1％TFA)乙腈梯度，在Jupiter Proteo(5μm，250mm X 10mm，

)反相柱上进行。B.avathrin和其的截短的变体IS20的远UV CD光谱(260-190nm)，溶解于10mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4)。两个光谱都是典型的无规卷曲。C.avathrin的纯度和质量通过ESI-MS确定。avathrin电离为三个不同的电荷态，并显示分别相应于+4、+3和+2电荷态的785.84amu、1047.55amu和1570.58amu的m/z值。D.avathrin的解卷积质谱显示，观察到avathrin的质量相应于3139.65±0.83Da的预期质量(表1)。

图3显示avathrin的凝血酶抑制活性。A.使用S2238(100μM)预温育(10min)或不预温育来测量各种浓度avathrin的对凝血酶的酰胺水解活性(0.81nM)的影响。avathrin显示以剂量依赖方式抑制凝血酶的酰胺水解活性。抑制的IC₅₀和Hill slope在0min分别为为6.95±0.42nM和0.92±0.01；以及在10min为4.86±0.36nM和0.94±0.02nM。每一数据点为至少三次试验的平均值±S.D。B.凝血酶(0.81nM)酰胺水解分析，在各种浓度avathrin的存在下使用S2238(100μM)进行，而且在存在avathrin下的凝血酶抑制实现了线性发展曲线-迅速结合抑制剂的特征。C.在不同浓度的S2238测量了在各种浓度avathrin的存在下的剩余的凝血酶酰胺水解活性K_i并确定了K_i’(表观K)。以添加凝血酶(0.81nM)开始反应。使用GraphPad Prizm软件将数据拟合至Morrison紧密结合方程。每一数据点为至少三次试验的平均值±S.D。D.K_i’对比S2238浓度的曲线线性地提高，表明avathrin为竞争性抑制剂。抑制常数K_i确定为545.3±3.1pM。

图4显示凝血酶溶解纤维蛋白原的活性的抑制，由此avathrin、IS20、GL16和ultravariegin以剂量依赖方式延长纤维蛋白原凝块时间。

图5显示avathrin的丝氨酸蛋白酶选择性。针对其对于13个丝氨酸蛋白酶的选择性而筛选了avathrin，所述13个丝氨酸蛋白酶包括促凝血、抗凝、纤维蛋白溶解性和经典丝氨酸蛋白酶(凝血酶、胰蛋白酶、fIXa、fXIa、fXa、糜蛋白酶、tPA、fVIIa、血纤维蛋白溶酶、APC、kallikrien、尿激酶和fXIIa)。除非另有说明，否则用于酰胺水解分析的蛋白酶和底物的最终浓度分别以nM和μM在括号中给出：α-凝血酶/S2238(0.81/100)、胰蛋白酶/S2222(0.87/100)、fIXa//

fIXa(333/0.4)、fXIa/S2366(0.125/1000)、fXa/S2765(0.24/650)、糜蛋白酶/S2586(1.2/0.67)、tPA/S2288(36.9/1000)、fVIIa/S2288(460/1200)、血纤维蛋白溶酶/S2251(3.61/1200)、APC/S2366(2.74/600)、激肽释放酶/S2302(0.93/1100)、尿激酶/S2444(32U/ml/650)、fXIIa/S2302(20/1000)。凝血酶的活性在更低浓度(1000nM、100nM和10nM)的avathrin下测试，而其它蛋白酶在高得多的浓度(100μM、10μM和1μM)的avathrin下测试。每一数据点为至少三次独立试验的平均值±S.D。

图6显示基于凝血酶的avathrin的切割。A.通过HPLC色谱图评估基于凝血酶的avathrin的切割。将avathrin(150μM)与凝血酶(5μM)温育不同时间，并使用RP-HPLC分开反应混合物；利用ESI-MS分析切割产物的质量。在0min(上图)，鉴定了与全长avathrin(质量3139Da)相应的单峰。在120min(中图)，除了avathrin峰以外，鉴定了与N末端切割产物(SGGHQTAVPK；质量982Da)和C-端切割产物(ISKQGLGGDFEEIPSDEIIE；质量2176Da)相应的两个新峰。在600min(低图)，观察到与N-和C-端切割产物相应的两个峰而未观察到avathrin峰，表明为完全切割。B.基于凝血酶的avathrin的时间依赖性切割。avathrin、其N-和C-端切割产物的相对百分率，通过计算曲线下的面积进行定量。每一数据点为至少三次独立试验的平均值±S.D。C.凝血酶切割对avathrin的抑制性质的影响。将avathrin与凝血酶(0.81nM)温育直到36h，并在不同时间点测定其对发色底物S2238的凝血酶酰胺水解活性的抑制能力。在25nM的avathrin下，抑制剂存在于～30倍过量的凝血酶(0.81nm)中，并且这些比率与在切割产物的HPLC分析中使用的相似。24h后，切割产物保留了>50％的原始抑制活性，虽然在10h左右全长avathrin已被完全切割。因此，切割产物，尤其是avathrin的C-端切割产物似乎保持了与凝血酶结合并继续抑制凝血酶。每一数据点为至少三次独立试验的平均值±S.D。

图7显示截短的avathrin的突变体对凝血酶酰胺水解活性的影响。A.测量了QT26和IS20对凝血酶的酰胺水解活性(0.81nM)的影响。两种肽以剂量依赖方式抑制凝血酶。QT26具有的IC₅₀和Hill slope分别为在0min为8.94±0.64nM和0.88±0.03；和在10min为13.54±0.81和0.92±0.03。IS20具有的IC₅₀和Hill slope分别为在0min为12.38±0.32nM和0.86±0.02；和在10min为22.70±0.94nM和0.87±0.01。每一数据点为至少三次独立试验的平均值±S.D。B.GL16(3、10、30、100和300μM)不能抑制凝血酶酰胺水解活性；反而在高浓度时，其轻微地增强了基于凝血酶的S2238的水解。每一数据点为至少三次独立试验的平均值±S.D。C和D.测量了在QT26和IS20存在下的剩余的凝血酶酰胺水解活性并确定了K_i’(表观K_i)。QT26和IS20两者均为紧密结合抑制剂。每一数据点为至少三次试验的平均值±S.D。E.K_i’针对S2238浓度的曲线线性地提高，指示QT26为竞争性抑制剂。抑制常数K_i确定为760.32±0.91pM。F.K_i’针对S2238浓度的曲线线性地降低，指示IS20为非竞争性抑制剂(具有α<1)。抑制常数K_i被确定为5760±230pM。

图8显示，与avathrin相比，avathrin的变体对凝血酶酰胺水解活性的影响。所有的变体均以剂量依赖方式抑制凝血酶活性。A.S12A具有的IC₅₀和Hill slope分别为101.20±1.32nM和0.62±0.01。S12A的IC₅₀低于avathrin20倍，确认了Ser12在avathrin对凝血酶抑制中的重要性。S12H具有的IC₅₀和Hill slope分别为18.51±0.32nM和0.88±0.02。每一数据点为至少三次试验的平均值±S.D。B.L16P、G17P具有的IC₅₀和Hill slope分别为181.32±3.76nM和0.54±0.02。G2D、Q5D具有的IC₅₀和Hill slope分别为12.98±1.23nM和0.71±0.03。每一数据点为至少三次独立试验的平均值±S.D。C.β-avathrin具有的IC₅₀和Hill slope为分别332.16±1.32nM和0.62±0.01。虽然β-avathrin直到72h才被切割，但其效力发生严重下降。每一数据点为至少三次独立试验的平均值±S.D。D.K10R具有的IC₅₀和Hill slope分别为1.15±0.45nM和1.10±0.01。与avathrin相比，K10R的活性有5倍增加，但被以avathrin(3h)相比快得多的速率切割。每一数据点为至少三次独立试验的平均值±S.D。E.β-variegin具有的IC₅₀和Hill slope分别为117.90±1.16nM和0.93±0.05。每一数据点为至少三次独立试验的平均值±S.D。

图9显示基于凝血酶的avathrin的变体K10R(A)和β-avathrin(B)的切割的HPLC色谱图。将肽与凝血酶温育不同时间，并使用RP-HPLC分开反应混合物，并使用ESI-MS分析了切割产物的质量。虽然K10R-avathrin在3h后被完全切割(以比avathrin快得多的速率)，β-avathrin甚至在72h后仍未被切割。

图10显示avathrin变体的抑制的动力学参数。在不同浓度的S2238测量了在A.S12H、B.G2D，Q5D和C.K10R的存在下的剩余的凝血酶酰胺水解活性，并确定了K_i’(表观K_i)。以添加凝血酶(0.81nM)开始反应。S12H、G2D，Q5D和K10R为紧密结合凝血酶抑制剂，分别具有1.23±0.04nM、0.93±0.01nM和0.17±0.00nM的K_i值。每一数据点为至少三次独立试验的平均值±S.D。

图11显示基于β-avathrin和S12A的抑制凝血酶的双倒数作图(Lineweaver-Burkeplots)。在不同浓度的S2238测量了在β-avathrin(300nM；A)和S12A(30nM；B)的存在下的剩余凝血酶酰胺水解活性(实线，无抑制剂；虚线，有抑制剂)。β-avathrin和S12A两者均不是凝血酶的紧密结合抑制剂，因为它们不能在等摩尔浓度抑制凝血酶。双倒数作图显示β-avathrin和S12A分别具有32.04±0.36nM和6.07±0.18nM的K_i值。每一数据点为至少三次独立试验的平均值±S.D。

图12显示avathrin的凝血酶复合体的晶体结构的模型。A.凝血酶-avathrin复合体的概述。以棒状模型(碳：黄色；氮：蓝色；氧：红色)显示avathrin，以及显示为蓝绿色的凝血酶表面的表示。在凝血酶活性位点附近和在外部位点-1深沟中鉴定了6个残基^A(⁵QTAVPK¹⁰)和10个残基^A(¹⁹DFEEIPSDEI²⁸)。B.以与(A)相似的视角，显示了计算avathrin的电子密度图。2Fo-Fc图(灰色，于1.0sigma水平进行等高)和Fo-FC图(阳性图为绿，于3.0sigma进行等高，阴性图为红，于3.0sigma进行等高)。C.显示了从avathrin的肽N末端至易切断键(scissile bond)(黄色棒)的

半径内的凝血酶残基(蓝绿色线)，来描述在它们之间的相互作用。D.显示了从结合至外部位点-1的avathrin的肽(黄色棒)的

半径内的凝血酶残基(蓝绿色线)，来描述在它们之间的相互作用。E.与以(C)相似的视角，显示了计算avathrin的电子密度图。2Fo-Fc图(灰色，于1.0sigma水平进行等高)和Fo-FC图(阳性图为绿，于3.0sigma进行等高，阴性图为红，于3.0sigma进行等高)。F.以与(D)相似的视角，显示了计算avathrin的电子密度图。2Fo-Fc图(灰色，于1.0sigma水平进行等高)和Fo-FC图(阳性图为绿，于3.0sigma进行等高，阴性图为红，于3.0sigma进行等高)。

图13显示基于avathrin的凝块结合凝血酶的抑制。使用S2238(100μM)测量了avathrin对凝块结合凝血酶(0.81nM)的酰胺水解活性的影响。avathrin以剂量依赖方式抑制凝块结合凝血酶，具有1.74±0.35μM的IC₅₀。

图14显示与Hirulog-1相比，avathrin在氯化铁诱发的颈动脉血栓形成鼠类模型中对至阻塞的时间的影响。将溶解于100μl盐水(0.9％)中的两个剂量(3mg/kg和10mg/kg)的avathrin或Hirulog-1，通过小鼠(n＝6)的尾静脉进行静脉注射。通过在颈动脉上放置用10％FeCl₃饱和的滤纸(2mm x 2mm)而诱导了血栓形成，并测量了在FeCl₃诱发的血栓形成后至堵塞的时间(TTO)。对照动物进行静脉或腹腔注射100μl盐水(n＝6)。在注射3mg/kg和10mg/kg avathrin的动物中，TTO从在对照动物中的7.24±1.46min分别提高至15.03±3.23min和22.51±4.19min。在注射3mg/kg和10mg/kg Hirulog-1的小鼠中，TTO分别为9.76±3.15min和15.23±3.39min。两组之间的显著差异使用t-检验(*P<0.001)计算。在该模型中，avathrin呈现出比Hirulog-1更好的功效。

图15显示通过variegin家族的肽来抑制凝血酶酰胺水解的分析。测试了在不同浓度(0.0003-3000nM)的所选的肽的抑制凝血酶的能力。从彩饰花蜱的唾液腺分泌物(sialome)鉴定的肽ultravariegin，是IC₅₀为0.26±0.008nM的最强力的肽。所有其它肽所具有的IC₅₀在14至130nM的范围内。

图16显示基于ultravariegin变体UV003和UV004的凝血酶抑制。A和C.测试了不同浓度(0.03nM至100nM)的抑制凝血酶酰胺水解活性的能力并与ultravariegin进行比较。UV003和UV004分别以0.60±0.20nM和0.46±0.08nM的IC₅₀值抑制凝血酶。B和D.在不同浓度的S2238测量了在UV003和UV004的存在下的剩余的凝血酶酰胺水解活性并确定了它们的K_i。UV003和UV004的K_i分别发现为4.21±0.96pM和4.55±0.37pM。

图17显示基于ultravariegin变体UV005和UV011的凝血酶抑制。A和C.测试了不同浓度(0.03nM至100nM)的抑制凝血酶酰胺水解活性的能力并与ultravariegin进行比较。UV005和UV011以0.91±0.47pM和1.66±0.77nM的IC₅₀值抑制凝血酶。B和D.在不同浓度的S2238测量了在UV005和UV011的存在下的剩余的凝血酶酰胺水解活性并确定了它们的K_i。UV005和UV011的K_i发现为16.0±3.05和1387±230pM。

图18显示通过ultravariegin变体UV012、UV013、variegin YS、UV007、UV008、UV014和UV015的凝血酶抑制。A、C和E.测试了不同浓度(0.003nM至3000nM)其抑制凝血酶的能力，并与ultravariegin比较了酰胺水解活性。ultravariegin不同变体的IC₅₀值列于表5中。B和D.通过将数据拟合入紧密-结合抑制剂方程，在UV012、UV013、variegin YS、UV007、UV008、UV014和UV015的存在下的剩余的凝血酶的酰胺水解活性,测定它们的K_i值。各自变体的K_i值列于表4中。

图19显示ultravariegin的抑制常数K_i。将variegin家族的最强力的成员ultravariegin的K_i作为代表显示。ultravariegin为凝血酶的紧密结合抑制剂。将不同浓度的ultravariegin与不同浓度的S2238(50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM和400μM混合，并确定了K_i'。以添加凝血酶(0.81nM)开始反应。使用GraphPad prizm软件将数据拟合至Morrison方程(n＝3，误差棒代表S.D.)。(B)K_i’针对底物浓度的曲线线性地提高，指示ultravariegin竞争性抑制了凝血酶的酰胺水解活性，并且抑制常数K_i被确定为4.4±0.35pM(误差棒代表S.D.)。

图20显示基于凝血酶的ultravariegin的切割。对与凝血酶温育的ultravariegin的时间过程分析表明，ultravariegin事实上被凝血酶切割。进行了温育了不同时间点的反应混合物的RP-HPLC分离来将切割产物分开和定量。通过峰积分和计算曲线下的面积进行ultravariegin的切割产物的定量。随着与凝血酶温育的时间增加，全长ultravariegin的量降低，并观察到切割产物的量与Lys10-Met11键的切割相应。在18h，ultravariegin被完全切割并可观察到与切割产物相应的唯一的峰。

图21显示ultravariegin的丝氨酸蛋白酶选择性。针对13个丝氨酸蛋白酶筛选了ultravariegin：纤维蛋白溶解性丝氨酸蛋白酶(血纤维蛋白溶酶和TPA)、抗凝的丝氨酸蛋白酶(尿激酶)、促凝血的丝氨酸蛋白酶(FXIIa、FXIa、FXa、FIXa、FVIIa、激肽释放酶和凝血酶)和经典丝氨酸蛋白酶(胰蛋白酶和糜蛋白酶)。针对三个浓度(100、10和1nM)的ultravariegin测试了凝血酶。对于其他蛋白酶，使用了高得多的浓度(100、10和1μm)的avathrin。

图22显示血红扇头蜱(Rhipicephalus sanguineus)肽的抑制常数K_i。血红扇头蜱肽的K_i'通过将不同浓度的肽与不同浓度的S2238(50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM和400μM)混合而确定。以添加凝血酶(0.81nM)开始反应。使用GraphPad prizm软件将数据拟合至Morrison方程(n＝3，误差棒代表S.D.).(B)K_i’针对底物浓度的曲线线性地提高，指示上述肽竞争性抑制了凝血酶的酰胺水解活性，并且抑制常数K_i被确定为8.79±0.65nM(误差棒代表S.D.)。

图23显示针对13个丝氨酸蛋白酶筛选了血红扇头蜱肽的丝氨酸蛋白酶选择性：纤维蛋白溶解性丝氨酸蛋白酶(血纤维蛋白溶酶和TPA)、抗凝的丝氨酸蛋白酶(尿激酶)、促凝血的丝氨酸蛋白酶(FXIIa、FXIa、FXa、FIXa、FVIIa、激肽释放酶和凝血酶)和经典丝氨酸蛋白酶(胰蛋白酶和糜蛋白酶)。针对三个浓度(1000、100和10nM)的肽测试了凝血酶。对于其他蛋白酶，使用了高得多的浓度(100、10和1μm)的肽。

图24显示美洲花蜱(Amblyomma americanum)和Hyalomma marginatum rufipes肽的抑制常数K_i。通过将不同浓度的肽与不同浓度的S2238(50μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm和400μm)混合而确定两种肽的K_i'。以添加凝血酶(0.81nM)开始反应。使用GraphPad prizm软件将数据拟合至Morrison方程(n＝3，误差棒代表S.D.)。(B)K_i’针对底物浓度的曲线线性地提高，指示两种肽竞争性抑制了凝血酶的酰胺水解活性(误差棒代表S.D.)。来自美洲花蜱和Hyalomma marginatum rufipes的肽的K_i分别被确定为1.63±0.61nM和6.135±0.39nM。

图25显示(A)美洲花蜱肽和(B)Hyalomma marginatum rufipes的丝氨酸蛋白酶选择性。针对纤维蛋白溶解性丝氨酸蛋白酶(血纤维蛋白溶酶和TPA)、抗凝的丝氨酸蛋白酶(尿激酶)、促凝血的丝氨酸蛋白酶(FXIIa、FXIa、FXa、FIXa、FVIIa、激肽释放酶和凝血酶)和经典丝氨酸蛋白酶(胰蛋白酶和糜蛋白酶)筛选了两种肽。针对三个浓度(1000、100和10nM)的肽测试了凝血酶。对于其他蛋白酶，使用了高得多的浓度(100、10和1μM)的肽。

图26显示在抽血后不同时间点测量的，用不同的凝血酶抑制剂水蛭素、ultravariegin、avathrin、variegin和柠檬酸盐来防止血液凝固而对ADP诱导的血小板聚集的反应。

图27显示avathrin和其它抑制剂与凝血酶外部位点的相互作用。凝血酶外部位点的表面表示显示为蓝绿色；凝血酶抑制剂以棒状模型显示。avathrin的C末端片段(黄色)、variegin(品红)和Hirulog-1(绿)发生叠加。

图28显示avathrin与variegin和从硬蜱科彩饰花蜱、美洲花蜱和Amblyommacajannense的唾液腺的转录组鉴定的相关肽的序列比对。每个转录物编码翻译后切割成三至五个成熟肽的前体蛋白质。仅显示了来自每一转录物的一个代表性肽序列。

在本说明书中提及的文后参考文献，为了方便起见，以参考文献的列表的形式列出，并附在实施例之后。这些文后参考文献以其整个内容被引用于参考文献。

具体实施方式

定义

为方便起见，将在说明书，实施例和所附权利要求中使用的某些术语集合于此。

术语“包含”在本文中定义为，在该处各种组分、成分或步骤在本发明的实践中可以结合地使用。相应地，术语"包含"涵盖更限制性的术语"“基本由"......组成”和"选自......"。

术语“分离”在本文中定义为生物成份(如核酸/肽或蛋白质)，其已基本上被从上述成份所天然出现的有机体的细胞中的其它生物成分(即，其它染色体和染色体外的DNA和RNA和蛋白质)分开、产生除去或纯化出来。已被分离的核酸、肽和蛋白质因此包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。上述术语也涵盖通过在宿主细胞中重组表达而制备的核酸、肽和蛋白质以及化学合成的核酸。

术语"变体"在本文定义为具有至少一个核苷酸序列的核苷酸序列，所述至少一个核苷酸序列经由取代、缺失或添加至少一个核酸而不同于参照序列，但编码保持识别、结合和抑制凝血酶的能力的氨基酸序列。术语‘变体’也适用于氨基酸序列，所述氨基酸序列经由取代、缺失或添加至少一个氨基酸而不同于至少一个参照序列，但保持识别、结合和抑制凝血酶的能力。特别地，变体可以为天然出现的或可以为重组或合成地产生的。更特别地，变体可以为与参照序列至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的序列同一性。例如，陈述在SEQ ID NO:7中的avathrinK10R氨基酸序列，是通过替代在陈述在SEQ ID NO:1中的avathrin氨基酸序列的氨基酸而产生，并可以考虑成SEQ ID NO:1的变体。术语"变体"可以包括具有"保守的"变化的凝血酶的肽抑制剂，其中所取代的氨基酸具有相似的结构或化学性质(例如，用异亮氨酸来替代亮氨酸)。更罕有地，变体可以具有"非保守的"变化(例如，用色氨酸来替代甘氨酸)。类似的微小变化也可以包括氨基酸缺失或插入，或缺失并插入。可以使用本领域熟知的计算机程序，例如，

软件(DNASTAR,Inc.Madison,Wisconsin,USA)找到确定哪些氨基酸残基可以取代、插入或缺失而不破坏生物学活性的指导。变体的另一形式包括用修饰的氨基酸(如在SEQ ID NO:9中陈述为“X”的在β-ultravariegin(SDEAVRAIPXMYSTAPPGDFEEIPDDAIEE)中的β-高精氨酸)取代氨基酸。出于列出序列的目的，将以“X”或“Xaa”代表β-高精氨酸。

本文所用的术语“片段”指氨基酸序列，其通过一种或多种氨基酸改变，但保持识别和结合与参照序列相同的凝血酶上的构象表位的能力。例如，陈述在SEQ ID NO:3中的QTAVPKISKQGLGGDFEEIPSDEIIE(QT26)氨基酸序列短于陈述在SEQ ID NO:1中的avathrin序列(SGGHQTAVPKISKQGLGGDFEEIPSDEIIE)，并可以考虑为SEQ ID NO:1的片段，因为其保持了识别、结合和抑制凝血酶的能力。同样，陈述在SEQ ID NO:4中的IS20(ISKQGLGGDFEEIPSDEIIE)氨基酸序列短于陈述在SEQ ID NO:1中的avathrin序列(SGGHQTAVPKISKQGLGGDFEEIPSDEIIE)，并可以考虑为SEQ ID NO:1的片段，因为其保持了识别、结合和抑制凝血酶的能力。

本文所用的术语"样品"以其最广泛的含义使用。怀疑含有凝血酶的生物样品可以包括体液或组织。

本发明内容使用的术语"治疗"指预防性、改善性、治疗性或治愈性治疗。

术语"受试者"在本文中定义为脊椎动物，尤其是哺乳动物，更具体地为人。出于研究目的，受试者可以尤其是至少一个动物模型，例如，小鼠、大鼠等。特别地，对于血栓的治疗和/或血栓相连的疾病，受试者可以为人。

本发明在一个方面中，提供分离的凝血酶抑制剂，其包含选自以下的氨基酸序列：SGGHQTAVPKISKQGLGGDFEEIPSDEIIE(SEQ ID NO:1)，其变体或片段，SDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEE(SEQ ID NO:2)，其变体或片段，SEQ ID NO:22，其变体或片段，SEQ ID NO:23，其变体或片段，SEQ ID NO:24，其变体或片段和SEQ ID NO:25，其变体或片段。应该理解，如本文所公开的，这些序列可以被改变而仍然保持抑制凝血酶活性的能力。

例如，发现SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的残基7(A)、9(P)、10(K)、19-21(DFE)、23(I)和24(P)对凝血酶抑制活性非常重要，因为他们对变化的耐受性最少。如果保留这些关键残基的大多数，我们已经生产了保持凝血酶抑制活性而具有低至30％的同一性的肽变体。

在优选的实施方案中，分离的凝血酶抑制剂，其包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25具有至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更优选至少95％的序列同一性的氨基酸序列。更优选，分离的凝血酶抑制剂包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更优选至少95％的序列同一性的氨基酸序列。

在优选的实施方案中，分离的凝血酶抑制剂氨基酸序列选自以下：

QTAVPKISKQGLGGDFEEIPSDEIIE(SEQ ID NO:3)，SEQ ID NO:1的片段；

ISKQGLGGDFEEIPSDEIIE(SEQ ID NO:4)SEQ ID NO:1的片段；

SGGHQTAVPKIAKQGLGGDFEEIPSDEIIE(SEQ ID NO:5)，SEQ IDNO：1的S12A变体；

SGGHQTAVPKIHKQGLGGDFEEIPSDEIIE(SEQ ID NO:6)，SEQ ID NO:1的S12H变体；

SGGHQTAVPRISKQGLGGDFEEIPSDEIIE(SEQ ID NO:7)，SEQ IDNO：1的K10R变体；

SGGHQTAVPXISKQGLGGDFEEIPSDEIIE(SEQ ID NO:8)，SEQ ID NO:1的β-高精氨酸变体；

SDEAVRAIPXMYSTAPPGDFEEIPDDAIEE(SEQ ID NO:9)SEQ ID NO:2的β-高精氨酸变体。

SDQGDVAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEE(SEQ ID NO:10)，SEQ ID NO:2的变体；

SDEAVRAEPKMHKTAPPGDFEEIPDDAIEE(SEQ ID NO:11)，SEQ ID NO:2的变体；

SDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPEEYLDDES(SEQ ID NO:12)，SEQ IDNO:2的变体；

MYSTAPPGDFEEIPDDAIEE(SEQ ID NO:13)，SEQ ID NO:2的变体；

SDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDEIEE(SEQ ID NO:14)，SEQ ID NO:2的变体；

SDEAVRAIPKMYSQAPPGDFEEIPDDAIEE(SEQ ID NO:15)，SEQ ID NO:2的变体；

SDQGDVAEPKMYSTAPPFDFEAIPEEYLDDES(SEQ ID NO:16)，SEQ ID NO:2的变体；

SDQGDVAEPXMHSTAPPFDFEAIPEEYLDDES(SEQ ID NO:17)，SEQ IDNO:2的变体；

CDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEE(SEQ ID NO:18)，SEQ ID NO:2的变体；

SDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEECA(SEQ ID NO:19)，SEQ ID NO:2的变体；

MYSTAPPGDFEEIPDDAIEEGCCC(SEQ ID NO:20)，SEQ ID NO:2的变体；

SDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEEGCCC(SEQ ID NO:21)，SEQ ID NO:2的变体；

SGEDHTAVPKMSRKGLGGDFEDIPPEAYERALEAR(SEQ ID NO:22)；

ELESGDEDSEGGDSQSSPTESAAPRLHQREGGGGDFENVEYDQDQK(SEQ ID NO:23)；

SDVAPADYESDEGDNDGGHDGSEVAKPKMPRGNGGGGDFEEIPEVE(SEQ ID NO:24)；和

TGSDDDDEYDMYESDGDSNEGNDNDEFETAVPRLPNPNSGRDSEHIPMPVN(SEQ ID NO:25)；

优选所述抑制剂具有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21。

在另一优选的实施方案中，所述凝血酶抑制剂抑制凝血酶溶解纤维蛋白原的活性和/或抑制凝血酶的酰胺水解活性。

在另一优选的实施方案中，在酰胺水解分析中评估时，凝血酶抑制剂具有的IC₅₀小于400nM，优选小于300nM、小于200nM、小于100nm、小于50nm、小于10nM，优选小于9nM、小于8nM、小于7nM、小于6nM、小于5nM、小于4nM、小于3nM、小于2nM或小于1nM。更优选IC₅₀小于2nM。意图在那些特异性列举的IC₅₀值之间的IC₅₀值在本发明的范围内。

在另一优选的实施方案中，当在酰胺水解分析中评估时凝血酶抑制剂具有的K_i小于6000nM，优选小于2000、小于500、小于400nM、小于300nM、小于200nM、小于100nM、小于50nM、小于10nM、优选小于9nM、小于8nM、小于7nM、小于6nM、小于5nM、小于4nM、小于3nM、小于2nM或小于1nM。更优选K_i小于2nM。意图在那些特异性列举的K_i值之间的K_i值在本发明的范围内。

本发明的另一方面，提供分离的凝血酶抑制剂，其包含根据本发明的任一方面的氨基酸序列，其用于预防或治疗凝血酶活性相关疾病。

本发明的另一方面，提供抑制凝血酶活性的方法，其包括用至少一个根据本发明的任一方面的凝血酶抑制剂接触凝血酶。在优选的实施方案中，至少一种凝血酶抑制剂作为在血液收集管中的抗凝剂存在，或作为医疗器械如支架、导管和其它医用管上的表面包覆材料存在。

根据本发明的另一方面，提供根据本发明的任一方面的凝血酶抑制剂的用途，用于制备用于预防和/或治疗血栓相关疾病的药物。在优选的实施方案中，血栓相关疾病选自：引起心肌梗死、中风和栓塞的动脉和静脉血栓形成；用于在不稳定型心绞痛、冠状动脉成形术、经皮冠状动脉介入治疗和心脏手术期间的抗凝作用。

用于施用根据本发明的方法的治疗性组合物的适合方法包括但不限于：全身施用、非胃肠施用(包括血管内、肌内、动脉内施用)、口服递送、局部施用、口腔递送、直肠递送、阴道递送、皮下施用、腹膜内施用、手术植入、局部注射和超高速注射/轰击。在适用的情况下，连续的输注能够增强药物在靶位点的积累(参见例如，美国专利No.6,180,082)。

不论施用的途径如何，本发明的肽通常以对获得希望的反应有效的量施用。本文中所使用的术语“有效量”和“治疗有效量”指足以产生可测量的生物反应(例如，血栓或血栓相关疾病的量的减少)的治疗性组合物(例如，组合物，其包含凝血酶抑制剂多肽，和药学媒介、载剂或赋形剂)的量。本发明的治疗性组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化，以便施用对达到对具体受试者和/或应用的希望的治疗性反应有效的量的活性多肽。当然，在任何具体情况中的有效量将取决于多种因素，包括治疗性组合物活性、制剂、施用的途径、与其它药物或治疗的结合，所治疗的情况的严重程度，和所治疗的受试者的身体情况和既往病史。优选施用最小剂量，并在不存在限制性毒性剂量的情况下不断提高剂量至最小有效量。治疗有效剂量的测定和调整，以及评估何时和如何进行这样的调整是本领域普通技术人员已知的。

对于关于制剂和剂量的附加指南，参见美国专利No.5,326,902和5,234,933；PCTInternational Publication No.WO 93/25521；Berkow,等,(1997)The Merck Manual ofMedical Information,Home ed.Merck Research Laboratories,Whitehouse Station,N.J.；Goodman,等,(2006)Goodman&Gilman's the Pharmacological Basis ofTherapeutics,11th ed.McGraw-Hill Health Professions Division,New York.

根据本发明的另一方面，提供预防和/或治疗凝血酶活性相关疾病的方法，包括对需要这种预防和/或治疗的受试者施用有效量的根据本发明的任一方面的凝血酶抑制剂。在优选的实施方案中，血栓相关疾病选自：引起心肌梗死、中风和栓塞的动脉和静脉血栓形成；用于在不稳定型心绞痛、冠状动脉成形术、经皮冠状动脉介入治疗和心脏手术期间的抗凝作用。

本发明的凝血酶抑制剂也可以局部使用，来治疗例如，带有或不带有血肿的擦伤。本发明的肽抑制剂可以以与先前处理水蛭素的相似的方案在霜体中施用，其中对单侧急性肌肉骨骼损伤(擦伤)实施280UI/100g，应用每天3-4次共5天[Stamenova PK.,et al,EurRev Med Pharmacol Sci.5(2):37-42(2001)]。也已将凝血酶抑制剂配制作为局部应用(r-水蛭素1120IU/40g；MINAPHARM Pharmaceuticals，Cairo，Egypt)至治疗AV分流术血栓形成、挫伤、扭转、肌肉撕裂、外伤性血肿、水肿、红斑、静脉曲张、外周静脉炎和肛门外周静脉炎伴随痔疮，特别是与血栓栓塞并发症相关的那些[参见在minapharm.com的

]。本发明的分子小于水蛭素的大小的一半，在局部应用时这应增加活性成分(例如，凝血酶抑制剂)的渗透穿过皮肤屏障。

根据本发明的另一方面，提供检测受试者中的凝血酶积累的方法，包含对受试者或从受试者分离的组织样品施用至少一个根据本发明的任一方面的抑制剂，并检测结合至凝血酶的所述至少一种凝血酶抑制剂的存在。

在优选的实施方案中，提供检测受试者中的凝血酶积累的方法，所述方法包含：

a.从患者获得组织样品；和

b.通过用至少一个根据本发明的任一方面的抑制剂接触样品，并检测在凝血酶和至少一种凝血酶抑制剂之间的结合来检测凝血酶是否已累积在样品中。

优选，凝血酶抑制剂包含选自以下的氨基酸序列：SGGHQTAVPKISKQGLGGDFEEIPSDEIIE(SEQ ID NO:1)，其变体或片段，和SDEAVRAIPKMYSTAPPGDFEEIPDDAIEE(SEQ ID NO:2)，其变体或片段。

在方法的另一优选的实施方案中，凝血酶抑制剂包含选自以下的氨基酸序列：SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25。

优选所述抑制剂具有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21。

根据本发明的另一方面，提供诊断血栓相关的疾病或病况的方法，包括对受试者或从所述受试者分离的组织样品施用至少一个根据本发明的任一方面的抑制剂，并检测结合至凝血酶的所述凝血酶抑制剂的存在，其中，与结合至正常凝血酶水平的抑制剂水平相比，检测的结合至凝血酶的所述抑制剂的水平升高，指示所述疾病或病况。

根据本发明的另一方面，提供药物组合物，其包含有效量的至少一个根据本发明的任一方面的凝血酶抑制剂。

在另一优选的实施方案中，分离核酸分子编码-凝血酶抑制剂包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，其变体或片段。

在优选的实施方案中，分离的核酸分子编码SEQ ID NO:2，其片段或变体，并可以通过修饰由以下表示的核酸序列获得：

TCAGACGAAGCTGTCAGGGCGATTCCCAAGATGTACTCGACTGCCCCACCGGGAGATTTCGAAACAAT CCCTGACGACGCTATTGAGGAG(SEQ ID NO:27)其片段或变体。优选SEQ ID NO:27的核苷酸序列通过用适合的密码子取代编码Thr22的密码子来编码Glu22而改变，来生产SEQ ID NO:2的肽。应当理解，天然核苷酸序列(SEQ ID NO:27)编码根据本发明的适合的凝血酶抑制剂。

在优选的实施方案中，核酸具有由SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27表示的序列，其变体或衍生物。

根据本发明的另一方面，提供包含如本文描述的根据本发明的核酸分子的载体。

根据本发明的另一方面，提供宿主细胞，其包含根据本发明的任一方面的核酸分子或载体。宿主细胞可以为原核或真核，但优选真核。

根据本发明的另一方面，提供防止或治疗血栓相关的疾病或病况的试剂盒，其包含至少一个血栓抑制剂或根据本发明的任一方面的药物。试剂盒可以包含医疗器械，如支架、导管或其它形式的管材，其包覆在本发明的血栓抑制剂中。

现在已经总体上描述了本发明，通过参考下列通过说明提供的实施例将更容易理解本发明，并且其并不意在限制本发明。方法、技术和化学品如在给出的参考文献或标准生物技术和分子生物学教科书中的方案中所述。

实施例

材料和方法

激肽释放酶、人纤维蛋白原和牛胰蛋白酶购自Merck.Chemicals Ltd.(Nottingham,UK)。牛糜蛋白酶、六水合氯化铁和牛血清白蛋白购自sigma-Aldrich((St.Louis,MO,USA))。所有的其它丝氨酸蛋白酶来自Hematologic Technologies,Inc.(Essex Junction,VT,USA)。重组凝血酶获赠自Chemo-Sero-Therapeutic ResearchInstitute(Kaketsuken,Japan)。显色底物购自Chromogenix和Spectrozyme FIXa购自American Diagnostica。所有使用的其它化学品和试剂均为分析级。

肽合成和纯化

所有的肽均在Intavis MultiPep RSi肽合成仪Intavis BioanalyticalInstruments,Cologne,Germany)上使用固相肽合成而合成，并如先前描述的从树脂切下[[Koh CY,等,J Biol Chem 282:29101-13(2007)]。使用反相HPLC在来自GE Healthcare(Uppsala，Sweden)的AKTA purifier上，用Jupiter Proteo(5μm，250mm X 10mm，90A)柱纯化粗肽。所有的肽的纯度和质量通过ESI-MS使用来自Thermo Fisher Scientific(Waltham，MA，USA)的LCQ Fleet Ion Trap MS确定。

CD光谱学

avathrin、QT26和IS20的远UV CD光谱(260-190nm)，使用Jasco^TM J-810spectropolarimeter(Easton，MD)溶解于10mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4)中测量。所有的测量在室温使用0.1-cm路径长度比色杯，使用扫描速度50nm/min，带宽2nm和分辨率0.2nm进行。

抑制凝血酶的酰胺水解和溶解纤维蛋白原的活性和蛋白酶活性

对于所有的肽的凝血酶的酰胺水解活性分析，均在96-孔微量滴定板中，在含有100mM NaCl和1mg/ml牛血清白蛋白的50mM Tris缓冲液(pH 7.4)中进行。通常，在将100μl的S2238添加到反应孔前，将100μl的肽和100μl的凝血酶预温育不同的持续时间。随后通过Tecan(

瑞士)的Tecan Infinite Pro M200 microplate reader在405nms测量吸光度10min，然后测量对硝基苯胺的形成速率。使用GraphPad Prizm软件(San Diego，CA，USA拟合剂量-反应曲线)来计算IC₅₀值和希尔系数。为了测量抑制常数，使用了不同浓度的S2238并使用Morrison’s紧密结合方程确定了剩余的速度。如先前描述的[Koh CY，等，JBiol Chem 282：29101-13(2007)]，使用来自Tecan(

瑞士)的Sunrisemicroplate reader测量在650nm的吸光度，来测试肽对凝血酶溶解纤维蛋白原的活性的抑制。检测了avathrin针对13个丝氨酸蛋白酶的选择性(图5)。使用各自的显色底物确定了avathrin对这些丝氨酸蛋白酶的酰胺水解活性的影响。基于凝血酶切割avathrin。将avathrin(150μM)与凝血酶(5μM)在含有150mM NaCl和1mg/ml BSA的50mM Tris缓冲液(pH7.4)中温育。在不同温育时间后，用1％TFA(pH 1.8)猝灭反应，并加载到附接至来自ThermoFisher Scientific(Waltham，MA，USA)的Dionex纳米HPLC系统的Jupiter Proteo柱(4μm，

100x1.0mm)，并使用具有0.05％TFA和99.95％MilliQ水的乙腈梯度作为洗脱液A和0.05％TFA、19.95％MilliQ水和80％ACN作为洗脱液B进行洗脱。测量所有峰的质量以鉴定切割产物，其随后通过对峰积分和计算曲线下的面积来定量。为了测量不同预温育时间对凝血酶抑制活性的影响，进行了对各种温育时间(直到36h)的酰胺水解分析。

X射线晶体学

重组α-凝血酶(在150mM NaCl中)使用3000MWCO自旋filters在20mM NH₄HCO₃中脱盐，并在结晶之前冻干。使用了所述结晶条件用于其它抑制剂复合物，凝血酶与variegin、hirugen和Hirulog，并进一步优化[Koh CY,等,PLoS One 2011；6.；Skrzypczak-Jankun E,等,J Mol Biol 221:1379-93(1991)]。将avathrin(81.7μm)溶解于含有375mM NaCl的50mMHEPES缓冲液(pH 7.4)中。将凝血酶溶解于avathrin溶液中，至终浓度为54.5μm。结晶使用悬滴蒸气扩散(hanging降低vapor diffusion)法实现。通常，1μl的含有avathrin和凝血酶的混合物与1μl的沉淀剂(100mM HEPES，pH 7.4，20至25％(w/v)PEG 8000)混合并放置于4℃。晶体在近似6周后出现。将晶体浸泡在含有母液(添加了25％(v/v)甘油)的冷冻保护剂溶液中，并在冷的氮气流(Oxford Cryosystem，Oxford，UK)中在100K快速冷却。使用安装在旋转阳极Rigaku X射线发生器上的CCD收集了180帧的数据集(180°振荡)。加工数据集并分别使用Mosflm[Battye TGG,等,Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr 67:271-81(2011)]和AIMLESS[Evans PR,and Murshudov GN.Acta Crystallogr Sect D BiolCrystallogr 69:1204-14(2013)]进行标度[Leslie AGW,and Powell HR.Evolvingmethods for macromolecular Crystallography.2007]。复合体的结构使用Phaser程序和凝血酶-variegin晶体结构(PDB：3B23)作为模板，通过分子置换而确定[McCoy AJ.ActaCrystallogr Sect D Biol Crystallogr International Union of Crystallography63:32-41(2006)]。模型构建和改进使用COOT进行[Emsley P,and Cowtan K.ActaCrystallogr Sect D Biol Crystallogr International Union of Crystallography60:2126-32(2004)]。

抑制凝块结合凝血酶

使用S2238测试凝块结合凝血酶活性。简而言之，纤维蛋白凝块通过将100μL的2mg/mL纤维蛋白原与100μl 30nM凝血酶温育(在50mM HEPES缓冲液，pH 7.5，150mM NaCl，10mg/mL CaCl₂中)而制备。于37℃2h后，用相同缓冲液充分洗涤凝块。在共24hr期间，在每个三小时后重复该洗涤。然后将不同浓度的avathrin添加到凝块中并温育60min。然后添加发色底物S2238(终浓度200μml)，并将反应混合物在37℃温育90min。取等分试样，使用Tecan

Pro microplate reader，通过在405nm的终点读数来预计底物水解。试验以一式四份进行，并绘制了百分比抑制。

氯化铁诱导的颈动脉血栓形成模型

所有的动物试验均在新加坡国立大学的动物管理和使用委员会(InstitutionalAnimal Care and Use Committee，National University of Singapore.)批准的方案041/12中进行。氯化铁诱导的颈动脉血栓形成模型，如先前描述的[Eckly A,等,J ThrombHaemost 9:779-89(2011)]进行，有较小的修改。典型地，用腹膜内注射氯胺酮(75mg/kg)和美托咪定(1mg/kg)麻醉C57BL/6雄性小鼠(9-11周龄，24.5-27.5g)。将100μl的不同剂量的avathrin经由尾静脉注射到小鼠内。使用钝性解剖法解剖右颈动脉，并用FeCl₃饱和的2mmX 2mm滤纸施加在颈动脉的顶部上，引起血管损伤。在3min后，移除滤纸并用无菌生理盐水洗涤血管。为了确定至阻塞的时间，将微型多普勒流量探头(miniature Doppler flowprobe)(Transonic Systems Inc.,Ithaca,NY,USA)放置在颈动脉周围，并使用来自ADInstruments(Dunedin,New Zealand)的

流量计记录血流。用于监测损伤后血流的最大时间为30min。在试验完成后并从麻醉恢复之前，小鼠立即通过颈椎脱臼处死。

将血液采集入有肽的采血管

将单独的肽溶解于磷酸缓冲盐水来制备10X肽溶液(即，肽的浓度为它们待测试的最终浓度的10倍高)。将0.3ml的10X肽溶液放置在没有任何添加剂的采血管中。使用注射器从健康志愿者抽取血液，并立即转移至50ml锥形离心管(Falcon管)中，而后移液2.7ml的血液至具有肽溶液的采血管中。肽的最终浓度如在表5和6中表示。

肽在采血管中的抗凝血效果

将具有不同浓度的各种肽采血管在室温放置，直到在指定的时间进行测试。在不同时间点，将管颠倒几次并目视检查不溶材料作为凝块形成的指示。

在添加有肽的采血管中的血小板功能的保存

将具有不同浓度的各种肽采血管在室温放置，直到在指定的时间进行测试。在不同时间点，将管颠倒几次并取出血液样品用于血小板聚集测试，测试根据制造商推荐的方案，用二磷酸腺苷(ADP)作为激动剂，使用

血小板凝集器进行。

结果

检测在硬蜱科彩饰花蜱的唾液腺中的variegin样转录物

基于variegin序列的简并引物，从9天喂食雌性硬蜱科彩饰花蜱的唾液腺cDNA，扩增了编码219-残基前体蛋白质(BAD29729)的转录物(AB183707)。该前体包含推断的分泌信号和五个相同的30-残基的重复序列，重复序列之间具有公认的切割部位，使得能将前体翻译后切割为五个活性肽。该前体蛋白质在唾液腺中的表达通过原位杂交证实。探针杂交于II型唾液腺腺泡的较大基础颗粒细胞的细胞质中。转录物在唾液腺的若虫和成年雌性和雄性蜱中的定位证明，在采食过程的期间的表达的差异以及在表达开始中的个体可变性。在2-4天喂食若虫、5天喂食雌性和12天喂食雄性中检测到最强表达，即在雌性充盈并开始脱离的时间(图1A-I)。我们认为在219个氨基酸序列内的一小段的序列对于活性已经足够，因此合成了SEQ ID NO:1avathrin(30个氨基酸)。编码SEQ ID NO:1的核苷酸序列陈述在SEQID NO:21中。

由该转录物编码的活性肽显示与variegin的～40％的序列同一性。与variegin相比，这些肽也显示了关键功能残基的数个差异：

(i)variegin具有酸性N末端，所述酸性N末端被假设为对迅速结合动力学较重要[Koh CY,等,J Biol Chem 282:29101-13(2007)]。相反，在这些variegin样肽中通常不存在酸性残基；

(ii)variegin通过其His12与凝血酶的Ser195可能的氢键形成而破坏活性位点的电荷中继系统的催化性三联体，由此抑制凝血酶[Koh CY,等,PLoS One 2011；6]。在这些variegin样肽中，该功能组胺酸被丝氨酸替代；

(iii)天然variegin中的Thr14被糖基化，并且其显示比合成variegin的14倍高的亲和力[Koh CY,等,J Biol Chem 282:29101-13(2007)]。在variegin样肽中，不能被糖基化的谷氨酰胺存在于该位置；

(iv)variegin中的Pro16和Pro17在骨架(backbone)中引入纽结(kink)，可能限制在活性位点和外部位点-I结合片段之间的连接的构象的柔性[Koh CY,等,J Biol Chem282:29101-13(2007)]。在variegin样肽中的相似的区域包含三个甘氨酸，赋予肽以更多的柔性。

所有的这些差异提供动力来评价这些variegin样肽的结构-功能关系。因此，我们开始从前体蛋白质(BAD29729)合成活性肽，来进一步表征其对人α-凝血酶的抑制效果。

avathrin是强力的和选择性的凝血酶抑制剂

命名为avathrin(硬蜱科彩饰花蜱凝血酶抑制剂)的活性肽，通过基于fmoc的固相肽合成而合成，并纯化至同质(图2)。avathrin以剂量依赖方式抑制凝血酶对小肽发色底物S2238的酰胺水解活性，具有的IC₅₀和Hill slope分别为6.95±0.42nM和0.92±0.01。对等摩尔浓度的凝血酶和avathrin(0.81nM凝血酶；1nM avathrin)观察到显著抑制(14.33±1.39％)，符合典型的紧密-结合抑制剂的描述[Copeland R a.Enzymes:A practicalIntroduction to Structure,mechanism,and data analysis.2000](图3A)。反应进程曲线显示，在混合时达到稳态平衡，表明了迅速结合模式(图3B)。在不同浓度的avathrin存在下确定了凝血酶的反应速度，以获得表观抑制常数K_i'。K_i′的曲线随着S2238的浓度增加线性地提高，表明相对于S2238，avathrin为凝血酶的竞争性抑制剂(K_i为545.3±3.1pM)(图3C、3D)。因此，avathrin为迅速、紧密结合的凝血酶的竞争性抑制剂。avathrin也以时间剂量依赖方式延长纤维蛋白原凝块时间，表明它也抑制了凝血酶的溶解纤维蛋白原的活性(图4)。

avathrin的选择性通过筛选其针对13个丝氨酸蛋白酶来检测。在10nM，avathrin抑制了65％的凝血酶活性。然而，即使在100μm，其它蛋白酶的抑制也<30％(图5)，表明avathrin是对于凝血酶的高度选择性抑制剂，以至少四个数量级的选择性偏好凝血酶。

avathrin呈现延长的凝血酶抑制

凝血酶肽底物S2238的竞争性抑制表明，与所有的其它大分子底物或抑制剂如variegin和bivalirudin相似，avathrin与活性位点结合，并因此其可以对基于凝血酶的蛋白水解切割敏感。我们研究了基于凝血酶的avathrin的切割：通过与酶(30:1比例)温育了增加的时间的量并通过反相色谱(RP-HPLC)和电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析了反应。通过温育，鉴定了与SGGHQTAVPK(981.3Da)和ISKQGLGGDFEEIPSDEIIE(2176.3Da)相应的两个新峰，指示在Lys10-Ile11易切断键的切割(图6A)。切割通过计算在色谱图中峰下方的面积而定量(图6B)。随着时间长度的增加，切割产物的量提高，而全长肽的量降低，avathrin在10h被完全切割。评价了切割对抑制活性的影响(图6C)。在用于切割试验的相同的avathrin：凝血酶比例(1：30)，在24h，>45％的凝血酶的酰胺水解活性被抑制，表明即使在avathrin被完全切割后，凝血酶的抑制也延长。variegin表现出相似的行为，在切割后其的切割肽C末端到易切断键继续抑制凝血酶。为了试验avathrin的切割产物是否相似地抑制凝血酶，相应的肽(IS20)被纯化并测试了抑制。IS20抑制凝血酶的酰胺水解活性，具有IC₅₀为12.38±0.32nM(图7A)。随着S2238浓度增加K_i′线性下降，表明相对于小肽底物IS20为非竞争性抑制剂，具有总体K_i为5.76±0.23nM(图7B和7C)。IS20也以剂量依赖方式抑制凝血酶的溶解纤维蛋白原的活性(图4)。因此，avathrin通过其的C末端肽显示延长抑制，C末端肽保持着对于凝血酶的强结合亲和力。

avathrin上的凝血酶结合片段

我们合成了avathrin的两个附加的截短的变体，称为QT26和GL16，来定位avathrin上的凝血酶结合片段。在QT26和GL16中，分别缺失了avathrin的四个和15个N末端残基。两种肽均测试了其抑制凝血酶酰胺水解和溶解纤维蛋白原的活性的能力。QT26抑制了凝血酶的酰胺水解活性(IC₅₀＝8.94±0.64nM和K_i＝760.32±0.91pM)(图7A，7D和7E)和溶解纤维蛋白原的活性(图4)。与全长avathrin相比，由于QT26中缺失4个N末端残基丢失的活性最小。相反，GL16即使在300μm也并不抑制酰胺水解活性，并反而显示轻微的活化(5-10％)(图7F)。然而，其抑制了溶解纤维蛋白原的活性(图4)。总之，这表明QT26包含活性位点和外部位点-I结合序列两者，但GL16仅包含外部位点-I结合序列。由于易切断键在Lys10-Ile11之间，因此avathrin的活性位点结合片段位于序列⁵QTAVPKISKQ¹⁴内。

凝血酶-avathrin相互作用的结构-功能关系

尽管在variegin和avathrin之间的总体序列同一性较低，并且，几个关键功能性残基中的变化如上所述，但功能性avathrin在其凝血酶抑制活性中显示与variegin的高程度相似。为了进一步考察在两个序列中的差异的显著性，我们评价了通过先前variegin的结构-功能研究得知的一系列的avathrin取代突变体[Koh CY,等,PLoS One 2011；6]：

(i)variegin最可能干扰凝血酶的催化性三联体的关键功能残基VHis12以avathrin中的ASer12代替。我们合成了用Ala(S12A)或His(S12H)替代ASer12的两个突变体。S12A显示了与在相似的variegin突变中观察到的相似的效力下降(>10倍)(图8A)，表明ASer12对于avathrin的抑制效果的重要性。S12H抑制了凝血酶，具有IC₅₀为18.51±0.32nM(图8A)，S12H比avathrin为低2倍有效，表明丝氨酸使得avathrin成为比在该位置具有组胺酸时更强的凝血酶抑制剂。

(ii)variegin在其N末端包含两个Glu残基，并且这两个酸性残基被怀疑为将variegin操纵向凝血酶外部位点-II并赋予迅速结合抑制模式[Koh CY,等,J Biol Chem282:29101-13(2007)]。虽然avathrin显示出迅速结合动力学而没有酸性N末端，但我们感兴趣的是研究酸性N末端在avathrin的凝血酶抑制活性上的作用。在一个双突变肽G2D，Q5D中，在avathrin N末端引入了酸性残基来模仿静电控制在赋予variegin以迅速结合动力学中的可能作用[Koh CY,等,J Biol Chem 282:29101-13(2007)]。该突变体显示了比avathrin和QT26的轻微稍弱的抑制(<2倍)(图8B)。因而，酸性N末端的存在不像如先前假设的对迅速结合动力学较重要[Koh CY,等,J Biol Chem 282:29101-13(2007)]。

(iii)为了试验在variegin中在活性位点和外部位点-I结合片段之间更刚性而富脯氨酸的接头(15APPF18)相比在avathrin中柔性的富甘氨酸接头(15GLGG18)更有益的假设，合成和测试了双突变肽L16P，G17P。相比avathrin，双突变肽L16P，G17P记录了活性的>25倍降低(IC₅₀，181.32±3.76nM)(图8B)，表明对于avathrin，接头中的柔性是需要的。

(iv)已知凝血酶偏好在P1的精氨酸残基[Berliner LJ.Journal of ChemicalInformation and Modeling.(1992)]]，并由Lys取代P1 Arg引起活性的10倍降低[Gallwitz M,等,PLoS One 2012；7]。variegin和avathrin两者均在P1具备赖氨酸，且将在variegin中的P1 Lys突变至Arg导致活性的少量增加(<3倍)[Gallwitz M,等,PLoS One2012；7]。因而我们用Arg取代了avathrin中的P1 Lys(K10R)，并观察到相似的活性的3至4倍增加(IC₅₀，1.15±0.45nM)(图8C)。然而，基于凝血酶的该肽切割也进行得更快，导致在3h内完全切割(图9A)。

(v)接下来，我们合成了命名为β-avathrin的变体，其中易切断肽键(VLys10-VIle11)被取代为蛋白水解稳定键(β-homoArg10-Ile11)。β-avathrin比avathrin低>100倍有效，并以IC₅₀为332±1.32nM抑制凝血酶(图8D)。虽然直到72h，β-avathrin未被凝血酶切割(图9B)，但肽骨架上附加的碳原子引起的移位似乎对活性极为不利。在Hirulog变体中也观察到活性的相似的降低，其中进行了易切断键的代替以建立肽切割耐受性[BourdonP.Biochem Biophys Res Commun 177:1049-55(1991)]。这些肽的K_i值显示在图10和11中。avathrin和avathrin变体肽的结果总结在表1和2中。

表1.avathrin和其变体的预期的和观察到的质量

表2.通过avathrin和其变体抑制凝血酶的动力学参数

^*N.I.,没有抑制；^**N.D.,没有确定

凝血酶-avathrin复合体的晶体结构

凝血酶-avathrin复合体在C2空间基团中结晶并细化至分辨率为

(表3)。除了轻链的末端的残基；和在重链中的自溶环和C-末端以外，大多数凝血酶残基的电子密度是明确定义的。不幸的是，在结合的avathrin中不是所有的残基都具有对于明确建立模型的足够清晰的密度。观察到前四个(¹SGGH⁴)和最后两个残基(²⁹IE³⁰)无密度。从C末端至在AIle11和AGly18之间的易切断键，avathrin的电子密度也是不连续的。因此，我们构建了两段肽，代表活性位点结合片段N末端至易切断键(⁵QTAVPK¹⁰)和外部位点-I结合片段(¹⁹DFEEIPSDEI²⁸)(图12A和B)。我们假设在结晶期间出现了avathrin的切割。在切割后，在与凝血酶的复合体中在^AIle11和^AGly18之间的残基不具有有序的结合结构。由于密度较差，侧链的^AGln5、^AGlu22和^ASer25也可不能构建。

表3.结晶学数据收集和细化统计学

^*括号中的值为最高分辨率壳

^#通过Molprobity server报告的Ramachandran Plot统计学

如从酰胺水解分析预期的，基于avathrin的凝血酶抑制似乎通过活性位点阻断，显示与小肽底物的竞争性抑制。模型显示活性位点在切割后的状态，其中凝血酶电荷中继系统似乎就位。^TSer195的Oγ距离^THis57的

远，且^THis57的Nδ又离^TAsp102的

远。由于切割已经出现，在

^ALys10的Cα(P1)似乎进一步转移而远离亲核体(^TSer195的Oγ)。^ALys10羰基氧仍然稳定在氧离子洞中，定位于距^TGly193的骨架氮

的距离。如预期的那样，P1 ^ALys10结合在S1亚位点中，其侧链胺与特异性口袋的底部的^TAsp189形成氢键。P2 ^APro9吡咯烷环似乎与^THis57和^TTyr60A的芳族侧链发生垂直相互作用，类似于典型边缘至-面的pi相互作用。P3 ^AVal8侧链为可溶解暴露，没有特定的相互作用。相反，P4 ^AAla7侧链的甲基完全埋在由^TAsn98、^TLeu99、^TIle174和^TTrp216形成的疏水性口袋中。P5 ^AThr6和P6 ^AGln5两者均作为接近外部位点-II的肽为可溶解暴露，但缺少该点以外的avathrin的电子密度，使得不可能确定肽是否向外部位点-II(图12C)延伸。

直到外部位点-I周围，直接位于C末端的残基至易切断键才显示良好的电子密度。总的来说，该部分avathrin如hirugen、Hirulog-1和variegin，结合在外部位点-I槽中[KohCY,等,PLoS One 2011；6；Skrzypczak-Jankun E,等,J Mol Biol 221:1379-93(1991)；QiuX,等,Biochemistry 31:11689-97(1992)]。静电和疏水相互作用两者似乎对该结合较为重要。观察到在avathrin C-末端和外部位点-I之间的三种静电相互作用(^AAsp19-^TArg73、^AGlu21-^TArg75和^AGlu27^-TArg77A)(图12D)。三种疏水性侧链(^APhe20、^AIle23和^AIle28)埋在avathrin-凝血酶接口中。^AIle23和^AIle28埋在由由^TPhe34、^TLeu65、^TArg67、^TTyr76和^TIle82的侧链形成的较大疏水性口袋内。此外，部分暴露的^APro24似乎与^TTyr76的苯酚环有一些有利的接触。残基^AGlu22和^ASer25为可溶解暴露，并缺少侧链密度，因此它们与凝血酶的相互作用不可解释。此外，观察到在^AIle28后有非常低的电子密度，不允许^AIle29和^AGlu30的放置。

抑制凝块结合凝血酶

止血纤维蛋白凝块限制活性凝血酶，限制其循环[Francischetti IMB,等,Biochemistry 38:16678-85(1999)]。该凝块结合凝血酶被肝素-抗凝血酶III复合体保护，并充当活性凝血酶的储库，其被认为有助于血栓再形成[Francischetti IMB,等,Biochemistry 38:16678-85(1999)；Bridge KI,et aal.,Thromb Haemost 112:1-8(2014)]。因此，凝块结合凝血酶的抑制可以防止血栓再形成。因而我们评价了avathrin的抑制凝块结合凝血酶的能力。avathrin以剂量依赖方式抑制了凝块结合凝血酶，具有IC₅₀为1.74±0.35μm(图13)，其在溶液中高于凝血酶。活性位点抑制剂如阿加曲班，以浓度依赖方式迅速和可逆地抑制凝块结合凝血酶，具有IC₅₀为2.7μm[Berry C,等,Thromb Haemost 72:381-6(1994)]。

FeCl₃ 诱导的颈动脉血栓形成模型

为了评价avathrin的体内抗血栓形成功效，我们使用了FeCl₃诱导的颈动脉血栓形成小鼠模型[Wan C,等,J Thromb Haemost 13:248-61(2015)；Eckly a,等,J ThrombHaemost 2011；9:779-89]。在小鼠中静脉注射avathrin，平均至阻塞的时间(TTO)以剂量依赖方式提高。在分别注射3和10mg/kg的动物中，TTO从在对照动物中的7.24±1.46min提高至15.03±3.23和22.51±4.19min。avathrin的功效与作为比较药物的Hirulog-1相比较。在注射3和10mg/kg的Hirulog-1的小鼠中的TTO，分别为9.70±3.15和15.22±3.39min。因此，avathrin显示了比Hirulog-1更好的抗血栓形成功效(图14)。

鉴定来自硬蜱(Ixodid tick)转录组的肽序列

通过对公开的彩饰花蜱、Rhipicephalus pulchellus、美洲花蜱、Amblyommacajenesse、Amblyomma maculatum和Hyalomma marginatum rufipes的转录组实施独立的BLAST分析，鉴定了与variegin和avathrin相似的肽序列。这些序列与variegin和avathrin手工比对，并选择来自每种蜱中的一个肽用于进一步分析。

其它肽的抑制酰胺水解活性和选择性

在NCBI数据库中可以找到几个与来自彩饰花蜱和其它硬蜱的avathrin转录物相似的蛋白质序列。合成了这些序列中的一些，并测试了它们的凝血酶抑制活性(图15和表4)。这些序列具有登录号DAA34688.1、DAA34160.1和DAA 34258.1。与avathrin转录物相似，它们包括数个可以通过后翻译修饰被加工成较短的variegin样成熟肽的重复序列。合成了代表性序列并测试了凝血酶抑制，并命名为ultravariegin。ultravariegin与variegin50％相同。

表4.variegin家族的成员的分子量、IC₅₀和K_i值

ultravariegin是由SEQ ID NO:2代表的30个残基肽，并基于源自数据库转录物的212氨基酸蛋白质序列的30个残基延伸。然而，我们取代了在从212个氨基酸蛋白质序列中发现的30个残基延伸序列ultravariegin中的一个氨基酸残基(Thr22Glu以到达SEQ IDNO:2)。发现SEQ ID NO:2的肽以K_i为4.4pM抑制凝血酶。ultravariegin比具有342pM的K_i的variegin更有效70倍。为了进一步理解ultravariegin在抑制凝血酶中的结构-功能关系的，如下合成了ultravariegin的更少的变体。UV003、UV004和UV005为ultravariegin-variegin杂合肽。基于ultravariegin序列，N末端的前7个残基被UV003中的variegin序列替换。在UV004中，随后的7个残基以相同方式被替换。在UV005中，ultravariegin中的最后6个残基被variegin的最后8个残基(variegin具有两个额外的残基)替换。发现UV003和UV004的K_i与ultravariegin的K_i相似，显示在N末端的前14个残基用ultravariegin序列替代variegin对其活性是很大程度上无关紧要的(图16)。然而，UV005显示对凝血酶的亲和力降低3.6倍左右。因而，variegin和ultravariegin之间的抑制活性的主要区别来自它们的C末端。在ultravariegin的C末端的序列使其成为比variegin更有效的抑制剂(图17A和C)。

为了确定ultravariegin C末端的作用，合成了基于凝血酶的ultravarieginC末端切割产物，并作为UV011测试(图17B和D)。该肽具有K_i为1.39nM，其比variegin的C末端切割产物好10倍左右(MH22，K_i＝14.1nM)并比avathrin的C末端切割产物好4倍左右(IS20，K_i＝5.76nM)。在UV012中，Ala27至Glu的突变也引起亲和力比ultravariegin降低5倍。Thr14至Gln的突变没有改变ultravariegin活性的活性(图18A和B)。variegin序列的从VHis12-VLys13至Tyr-Ser突变，由于ultravariegin在该位置具有UTyr12-USer13，因此没有显著改善variegin的活性(图18C和D)。所有的ultravariegin肽的结果总结在表5中。

合成在N-或C末端具有半胱氨酸残基的四个肽，并测试活性。具有半胱氨酸残基的肽变体提供了将肽共价固定在表面而用于包覆的手段。迄今为止，与不含半胱氨酸的类似序列相比，在末端添加半胱氨酸的肽通常引起轻微但可接受的活性降低。肽的IC₅₀和K_i值列于表5中。

表5.ultravariegin和其变体的序列、IC₅₀和K_i。

测试了以上报告的来自其它蜱的肽的凝血酶的酰胺水解活性的抑制和选择性。发现所有的肽均选择性地抑制凝血酶。这些肽的动力学和选择性详细显示于图19至25中。

凝血酶抑制剂在血液采集装置中作为稳定剂

我们在室温在三个浓度：75μm、150μm和300μm测试了variegin、ultravariegin和avathrin在采血管中的抗凝效果。variegin先前作为在采血管中的添加剂包括在专利申请(WO2012075407A2)中，但avathrin和ultravariegin没有。avathrin(K_i＝545pM)具有与variegin(K_i＝318pM)相似的亲和力K_i并显示与variegin可比较的抗凝效果(表6)。

表6.variegin和相关肽在血液中的抗凝效果

在相同浓度，avathrin和variegin两者观察到的凝块形成的时间相同(例如在150μm52-66 h)。如预期那样，ultravariegin胜过avathrin和variegin(表3)。这与相比ultravariegin后者两肽亲和力为>200倍强是一致的(K_i＝1.5pM)。甚至在测试的最低浓度，ultravariegin的抗凝效果的(在75μm91-101 h)持续时间长于测试的variegin/avathrin的最高浓度(在300μm52-66 h)。相比之下，另一变体(β-variegin)具有K_i>30nM(即比variegin弱>100倍)并且仅能防止凝块形成3-4h。数据显示，肽对凝血酶的亲和力与其在采血管中的抗凝效果密切相关。

延长血液的稳定性用于血小板功能试验

我们也使用

analyzer测试了用ultravariegin、avathrin和variegin在150μm和300μm的防止血液凝固的血小板聚集反应。我们使用了ADP(6.5μm)作为激动剂。我们使用了柠檬酸盐和水蛭素作为两个对照。获得的结果显示在表7和图26中。

表7.在含有各种稳定剂的采血管中的血液(ADP作为激动剂)的血小板聚集反应(以曲线下的面积，U)的制表。

*由于凝块形成而没有获得读数

^$水蛭素的浓度如hirudin Vacuette@tube产品信息中所定义

由于在文献中没有关于响应的下限可以被认为是可靠的读值，我们决定使用32U的临界值(图26，虚线)。在我们的试验中，通过含有柠檬酸盐的血液在4h给予反应，其为血小板功能标准Testing CLSI Guideline H58-P推荐的最大分析时间。

相比金标准柠檬酸盐，具有ultravariegin、avathrin和variegin的采血管全部显示在稳定窗口中的最少6倍增加。在前24h中，在水蛭素中的血液(图26，橙色)与ultravariegin(图26，灰色)、avathrin(图26，蓝色)和variegin(图26，黄色)相似地进行，这可能并不令人惊讶，因为水蛭素也是有效的直接凝血酶抑制剂[Warkentin TE.BestPract Res Clin Haematol 17:105-25(2004)]。相比其它两种肽，ultravariegin和水蛭素对凝血酶的相对较强的亲和力导致在48h和72h更高的聚集反应。然而，这些读数稍微低于我们设定的32U cut-off(图26)。

讨论

尽管avathrin和variegin之间的总体序列同一性低(40％)，并且有如上所述的关键功能残基中的变化，但avathrin似乎以与variegin相似的方式发挥功能。两者均作为靶向活性位点和外部位点-I的迅速、紧密-结合二价抑制剂抑制凝血酶，具有相似的抑制常数(variegin的K_i＝342pM，avathrin的K_i＝545pM)。variegin和avathrin两者均规范地结合至凝血酶，并因此在结合后被凝血酶切割。基于凝血酶的variegin的切割(至完成为4h)进行得快于avathrin(至完成为10h)。avathrin的较慢切割可归因于由AGly15、AGly17和AGly18授予的总体柔性。两种肽的切割产物均相对于小肽底物非竞争性抑制凝血酶，variegin切割产物(MH22)的亲和力低于avathrin切割产物(IS20)的～2倍[Koh CY,等,ChemBioChem10:2155-8(2009)]。avathrin的较慢切割速率可能归因于IS20的更高的亲和力，降低游离凝血酶在平衡时用于切割肽的可利用性。我们也已经显示，在位置12的丝氨酸似乎赋予比组胺酸稍好的亲和力，而在N末端的酸性残基不决定迅速结合动力学。在variegin和avathrin之间的序列的比较允许这些集中于结构-功能研究并帮助理解凝血酶-抑制剂相互作用。

与凝血酶-Hirulog-1复合体相比，凝血酶-avathrin复合体的结构是最好的(279残基的RMSD为

)，因为两者都是以切割肽结晶的肽二价凝血酶抑制剂[Skrzypczak-Jankun E,等,J Mol Biol 221:1379-93(1991)；Bourdon P,等,FEBS Lett 294:163-6(1991)]。与avathrin相比Hirulog-1为更短的肽，但两肽均在它们的凝血酶活性位点和外部位点-I结合序列中显示显著程度的同一性。在切割后，只有的片段N末端至易切断键和在外部位点-I中的片段可以建立它们各自的结构。两个晶体具有相似的单位晶胞尺寸(C2；

β≈100°)。相比之下，凝血酶-variegin复合体以不同的结晶形式(C2；

β＝99°)进行结晶，并似乎仅具有切割的C末端肽键。

avathrin和Hirulog-1两者均具有它们的P1残基结合至凝血酶上的相同的S1口袋。虽然Hirulog-1的P1 Lys通过水分子与在S1口袋底部的TAsp189结合[Bode W.BloodCells,Mol Dis 36:122-30(2006)]，但我们观察到在ALys10和TAsp189之间的直接相互作用。对Hirulog-1的相同研究显示当Arg被Lys替代，亲和力减少10倍，但我们看到ALys10突变至Arg有小小的改变(～3倍)，与在结构中观察到的直接相互作用一致。Hirulog-1和avathrin共享相同的P2氨基酸(Pro)，因此以相似的方式与S2亚位点相互作用。Hirulog-1P3为D-Phe，占据与avathrin P4 AAla7占据的相同疏水性口袋[Skrzypczak-Jankun E,等,J Mol Biol 221:1379-93(1991)]。在我们所有的酶分析中使用的发色底物S2238几乎与Hirulog-1在P3至P1相同(D-Phe-哌可酸-Arg)。考虑到avathrin和Hirulog-1在这些位置与凝血酶上的相同部位结合，抑制的竞争性机制与结构一致。

avathrin(DFEEIPSDEIIE)、Hirulog-1(DFEEIPEEYL)和variegin(DFEAIPEEYLDDES)的前6个残基的外部位点-I结合片段几乎相同(下划线)。这些残基在晶体结构中也很好地对齐(图27)。三种肽与凝血酶的相互作用在所有结构中基本上是保守的。在该片段内的单个非保守残基(^AGlu22对比^HGlu57对比^VAla22)在所有的三种结构中为可溶解暴露，没有特定的相互作用。variegin和Hirulog-1共享接下来的4个残基EEYL，其对应于avathrin中的序列SDEI。在avathrin和variegin-凝血酶复合物中观察到这些残基，但在Hirulog-1-凝血酶复合体中没有观察到。在avathrin的相应的4个残基(SDEI)间，^ASer25和^AAsp26为可溶解暴露。^AGlu27和^VGlu26在结构上是等同的，并与^TArg77A具有静电相互作用。随后的残基的分析受到缺乏清晰的密度的阻碍。

尽管使用variegin序列来设计引物用于扩增，我们没有设法扩增variegin基因，表明在不同的采食点由这些蜱中的多个基因产生的肽具有高度的变异性。更令人吃惊的是，avathrin和variegin两者似乎被合成为含有复杂重复序列的更大的前体蛋白质，并加工成具备凝血酶抑制活性的更短的活性肽。尽管一些关键功能残基的总体序列同一性和变化较低，两种肽对凝血酶均具有相似的抑制机理和效果。对数据库的搜索揭示了在硬蜱科彩饰花蜱(BM291228：3肽，不完全转录物；BM293052：五肽；BM289492：五肽)、美洲花蜱(ACG76173：5肽，不完全转录物)、和Amblyomma cajennense(ACAJ0085C_1：4肽)中更多与含重复的variegin样肽的这种前体蛋白质相似的序列[Nene V,等,Int J Parasitol 32:1447-56(2002)；Batista IFC,等,Toxicon 51:823-34(2008)](图28)。也有证据在其它硬蜱，如血红扇头蜱和Hyalomma marginatum rufipes的唾液腺中存在相似的肽。大多数前体可以被加工成三至五个肽，形成一个新的密切相关的肽基凝血酶抑制剂。我们将这个凝血酶抑制剂的家族命名为Ixothrins(Ixodidae凝血酶抑制剂)。Ixothrins为小凝血酶抑制剂，没有任何二硫键，并在Ixodidae(硬蜱)家族中发现。它们结合至凝血酶的外部位点1和活性位点。在一个前体中产生ixothrin的多个拷贝。每种前体都具有信号肽，并翻译后加工出现或在内质网或唾液中来成熟ixothrin。似乎这样的多重产物途径在硬蜱中在肽基凝血酶抑制剂的产生中相当普遍。在唾液组分中靶向单个宿主凝血分子的多重性并不少见[Francischetti IMB,等,J Proteomics 71:493-512(2008)；Fontaine A,等,ParasitVectors BioMed Central Ltd；4:187(2011))]，虽然我们相信这是第一个将多样性也构建成单一前体蛋白质的例子。

综上所述，通过使用大量的多样化的序列，同时保持大体相似的整体骨架和功能，我们已经证明了硬蜱使凝血酶(其为在凝血中的关键酶)无效。我们已经证明，尽管序列相似，在FeCl₃诱导的颈动脉血栓形成模型中，avathrin和其它几种肽比Hirulog-1更好地防止血栓形成。该分子的家族可产生抗凝剂，其对数种临床适应症和心血管步骤有用，如在侵入性操作期间预防动脉血栓形成和再闭塞，在整形外科手术后预防静脉血栓形成，和在详细评估安全性和有效性概况后管理心肌梗塞[Bauer K A.Hematology Am Soc HematologyEduc Program 2013:464-70(2013)]。

本申请涉及以下各项：

1.分离的凝血酶抑制剂，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1，其变体或片段，和SEQ ID NO:2，其变体或片段，SEQ ID NO:22，其变体或片段，SEQ ID NO:23，其变体或片段，SEQ ID NO:24，其变体或片段和SEQ ID NO:25，其变体或片段。

2.项1的分离的凝血酶抑制剂，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25。

3.项1或2的分离的凝血酶抑制剂,其中所述抑制剂具有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21。

4.项1至3中任一项的分离的凝血酶抑制剂，其中所述抑制剂抑制凝血酶溶解纤维蛋白原的活性和/或抑制凝血酶的酰胺水解活性。

5.项1至4中任一项的凝血酶抑制剂，其中，在酰胺水解分析中评估时，凝血酶抑制剂具有的IC₅₀小于400nM，优选小于300nM、小于200nM、小于100nm、小于50nm、小于10nM，优选小于9nM、小于8nM、小于7nM、小于6nM、小于5nM、小于4nM、小于3nM、小于2nM或小于1nM。

6.项1至5中任一项的凝血酶抑制剂，其中当在酰胺水解分析中评估时，凝血酶抑制剂具有的K_i小于6000nM，优选小于2000nM、小于500nM、小于400nM、小于300nM、小于200nM、小于100nM、小于50nm、小于10nM、优选小于9nM、小于8nM、小于7nM、小于6nM、小于5nM、小于4nM、小于3nM、小于2nM或小于1nM。

7.分离的凝血酶抑制剂，其包含根据项1至6任一项的氨基酸序列，用于预防或治疗血栓相关疾病。

8.抑制凝血酶活性的方法，其中所述方法包括用项1至6中任一项的至少一种凝血酶抑制剂接触凝血酶。

9.项8的方法，其中所述至少一种凝血酶抑制剂在血液收集管中作为抗凝剂存在。

10.项8的方法，其中至少一种凝血酶抑制剂作为在医疗器械如支架、导管和其它医用管上的表面包覆材料存在。

11.项1至6任一项的凝血酶抑制剂制备用于预防和/或治疗凝血酶活性相关的疾病的药物的用途。

12.项11的用途，其中所述相关疾病选自：引起心肌梗死、中风和栓塞的动脉和静脉血栓形成；用于在不稳定型心绞痛、冠状动脉成形术、经皮冠状动脉介入治疗和心脏手术、深静脉血栓形成期间的抗凝作用；血栓性静脉炎；肺栓塞；来源可能是心脏、动脉粥样硬化斑块、瓣膜或血管假体或未知来源的栓塞和微栓塞事件；弥散性血管内凝血。

13.项11的用途，其中所述药物用于局部用途，用于预防和/或治疗AV分流术血栓形成、挫伤、扭转、肌肉撕裂、外伤性血肿、水肿、红斑、静脉曲张、外周静脉炎和外周静脉炎伴随痔疮，特别是与血栓栓塞并发症相关的那些。

14.预防和/或治疗血栓相关疾病的方法，其包括对需要这种预防和/或治疗的受试者施用有效量的项1至6中任一项的凝血酶抑制剂。

15.项14的方法，其中所述相关疾病选自：引起心肌梗死、中风和栓塞的动脉和静脉血栓形成；用于在不稳定型心绞痛、冠状动脉成形术、经皮冠状动脉介入治疗和心脏手术、深静脉血栓形成期间的抗凝作用；血栓性静脉炎；肺栓塞；来源可能是心脏、动脉粥样硬化斑块、瓣膜或血管假体或未知来源的栓塞和微栓塞事件；弥散性血管内凝血。

16.诊断血栓相关疾病或病况的方法，其包括对受试者或从所述受试者分离的组织样品施用至少一种根据项1至6中任一项的抑制剂，并检测结合至凝血酶的所述凝血酶抑制剂的存在，其中，与结合至正常凝血酶水平的抑制剂水平相比，检测的结合至凝血酶的所述抑制剂的水平升高指示所述疾病或病况。

17.检测受试者中的凝血酶积累的方法，包含对受试者或从受试者分离的组织样品施用至少一种根据项1至6中任一项的抑制剂，并检测结合至凝血酶的所述至少一种凝血酶抑制剂的存在。

18.药物组合物，其包含有效量的至少一种项1至6中任一项的血栓抑制剂。

19.分离的核酸分子，其编码项1至3中任一项的抑制剂。

20.编码项19的抑制剂的分离核酸分子，其变体或其片段，其中所述分子选自由SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27代表的组。

21.包含根据项19或20的核酸分子的载体。

22.宿主细胞，其包含根据项19至21任一项的核酸分子或载体。

23.调节凝血酶活性的试剂盒，其包括至少一种在项1-6任一项中定义的血栓抑制剂。

参考文献

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序列表

<110> 新加坡国立大学

斯洛伐克研究院动物学研究所

<120> 新型凝血酶抑制剂

<130> FP8143

<150> US 62/230,923

<151> 2015-06-18

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> PRT

<213> 彩饰花蜱（Amblyomma variegatum）

<400> 1

Ser Gly Gly His Gln Thr Ala Val Pro Lys Ile Ser Lys Gln Gly Leu

1 5 10 15

Gly Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Ser Asp Glu Ile Ile Glu

20 25 30

<210> 2

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 天然彩饰花蜱序列的Thr22Glu取代

<400> 2

Ser Asp Glu Ala Val Arg Ala Ile Pro Lys Met Tyr Ser Thr Ala Pro

1 5 10 15

Pro Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Asp Ala Ile Glu Glu

20 25 30

<210> 3

<211> 26

<212> PRT

<213> 彩饰花蜱

<400> 3

Gln Thr Ala Val Pro Lys Ile Ser Lys Gln Gly Leu Gly Gly Asp Phe

1 5 10 15

Glu Glu Ile Pro Ser Asp Glu Ile Ile Glu

20 25

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> 彩饰花蜱

<400> 4

Ile Ser Lys Gln Gly Leu Gly Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Ser Asp

1 5 10 15

Glu Ile Ile Glu

20

<210> 5

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Ser12Ala取代

<400> 5

Ser Gly Gly His Gln Thr Ala Val Pro Lys Ile Ala Lys Gln Gly Leu

1 5 10 15

Gly Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Ser Asp Glu Ile Ile Glu

20 25 30

<210> 6

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Ser12His取代

<400> 6

Ser Gly Gly His Gln Thr Ala Val Pro Lys Ile His Lys Gln Gly Leu

1 5 10 15

Gly Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Ser Asp Glu Ile Ile Glu

20 25 30

<210> 7

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lys10Arg取代

<400> 7

Ser Gly Gly His Gln Thr Ala Val Pro Arg Ile Ser Lys Gln Gly Leu

1 5 10 15

Gly Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Ser Asp Glu Ile Ile Glu

20 25 30

<210> 8

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lys10β 高精氨酸取代

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223> β-高精氨酸取代

<400> 8

Ser Gly Gly His Gln Thr Ala Val Pro Xaa Ile Ser Lys Gln Gly Leu

1 5 10 15

Gly Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Ser Asp Glu Ile Ile Glu

20 25 30

<210> 9

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lys10β 高精氨酸取代

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223> β-高精氨酸

<400> 9

Ser Asp Glu Ala Val Arg Ala Ile Pro Xaa Met Tyr Ser Thr Ala Pro

1 5 10 15

Pro Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Asp Ala Ile Glu Glu

20 25 30

<210> 10

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ultravariegin-variegin杂交

<400> 10

Ser Asp Gln Gly Asp Val Ala Ile Pro Lys Met Tyr Ser Thr Ala Pro

1 5 10 15

Pro Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Asp Ala Ile Glu Glu

20 25 30

<210> 11

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ultravariegin-variegin杂交

<400> 11

Ser Asp Glu Ala Val Arg Ala Glu Pro Lys Met His Lys Thr Ala Pro

1 5 10 15

Pro Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Asp Ala Ile Glu Glu

20 25 30

<210> 12

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ultravariegin-variegin杂交

<400> 12

Ser Asp Glu Ala Val Arg Ala Ile Pro Lys Met Tyr Ser Thr Ala Pro

1 5 10 15

Pro Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Asp Asp Glu Ser

20 25 30

<210> 13

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ultravarieginC末端凝血酶切割产物

<400> 13

Met Tyr Ser Thr Ala Pro Pro Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Asp

1 5 10 15

Ala Ile Glu Glu

20

<210> 14

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ultravariegin Ala27Glu取代

<400> 14

Ser Asp Glu Ala Val Arg Ala Ile Pro Lys Met Tyr Ser Thr Ala Pro

1 5 10 15

Pro Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Asp Glu Ile Glu Glu

20 25 30

<210> 15

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ultravariegin Thr14Gln取代

<400> 15

Ser Asp Glu Ala Val Arg Ala Ile Pro Lys Met Tyr Ser Gln Ala Pro

1 5 10 15

Pro Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Asp Ala Ile Glu Glu

20 25 30

<210> 16

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> variegin变体

<400> 16

Ser Asp Gln Gly Asp Val Ala Glu Pro Lys Met Tyr Ser Thr Ala Pro

1 5 10 15

Pro Phe Asp Phe Glu Ala Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Asp Asp Glu Ser

20 25 30

<210> 17

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> β高精氨酸variegin变体

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223> β高精氨酸

<400> 17

Ser Asp Gln Gly Asp Val Ala Glu Pro Xaa Met His Ser Thr Ala Pro

1 5 10 15

Pro Phe Asp Phe Glu Ala Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Asp Asp Glu Ser

20 25 30

<210> 18

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ultravariegin N-末端Cys

<400> 18

Cys Asp Glu Ala Val Arg Ala Ile Pro Lys Met Tyr Ser Thr Ala Pro

1 5 10 15

Pro Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Asp Ala Ile Glu Glu

20 25 30

<210> 19

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ultravariegin C-末端Cys

<400> 19

Ser Asp Glu Ala Val Arg Ala Ile Pro Lys Met Tyr Ser Thr Ala Pro

1 5 10 15

Pro Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Asp Ala Ile Glu Glu Cys Ala

20 25 30

<210> 20

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ultravariegin 片段c-末端Cys CysCys

<400> 20

Met Tyr Ser Thr Ala Pro Pro Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Asp

1 5 10 15

Ala Ile Glu Glu Gly Cys Cys Cys

20

<210> 21

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ultravariegin C-末端 CysCysCys

<400> 21

Ser Asp Glu Ala Val Arg Ala Ile Pro Lys Met Tyr Ser Thr Ala Pro

1 5 10 15

Pro Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Asp Ala Ile Glu Glu Gly Cys

20 25 30

Cys Cys

<210> 22

<211> 35

<212> PRT

<213> 美洲花蜱(Amblyomma americanum)

<400> 22

Ser Gly Glu Asp His Thr Ala Val Pro Lys Met Ser Arg Lys Gly Leu

1 5 10 15

Gly Gly Asp Phe Glu Asp Ile Pro Pro Glu Ala Tyr Glu Arg Ala Leu

20 25 30

Glu Ala Arg

35

<210> 23

<211> 46

<212> PRT

<213> Amblyomma maculatum

<400> 23

Glu Leu Glu Ser Gly Asp Glu Asp Ser Glu Gly Gly Asp Ser Gln Ser

1 5 10 15

Ser Pro Thr Glu Ser Ala Ala Pro Arg Leu His Gln Arg Glu Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Asp Phe Glu Asn Val Glu Tyr Asp Gln Asp Gln Lys

35 40 45

<210> 24

<211> 46

<212> PRT

<213> 血红扇头蜱（Rhipicephalus sanguineus）

<400> 24

Ser Asp Val Ala Pro Ala Asp Tyr Glu Ser Asp Glu Gly Asp Asn Asp

1 5 10 15

Gly Gly His Asp Gly Ser Glu Val Ala Lys Pro Lys Met Pro Arg Gly

20 25 30

Asn Gly Gly Gly Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Val Glu

35 40 45

<210> 25

<211> 51

<212> PRT

<213> Hyalomma marginatum

<400> 25

Thr Gly Ser Asp Asp Asp Asp Glu Tyr Asp Met Tyr Glu Ser Asp Gly

1 5 10 15

Asp Ser Asn Glu Gly Asn Asp Asn Asp Glu Phe Glu Thr Ala Val Pro

20 25 30

Arg Leu Pro Asn Pro Asn Ser Gly Arg Asp Ser Glu His Ile Pro Met

35 40 45

Pro Val Asn

50

<210> 26

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Avathrin

<400> 26

tcgggtggcc atcagactgc tgttccgaag atatctaagc aaggcttggg tggagacttt 60

gaagaaattc caagtgatga aataatcgag 90

<210> 27

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ultravariegin天然的

<400> 27

tcagacgaag ctgtcagggc gattcccaag atgtactcga ctgccccacc gggagatttc 60

gaaacaatcc ctgacgacgc tattgaggag 90

Claims

1.分离的凝血酶抑制剂，其由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25。

2.权利要求1的分离的凝血酶抑制剂，其中所述抑制剂抑制凝血酶溶解纤维蛋白原的活性和/或抑制凝血酶的酰胺水解活性。

3.分离的凝血酶抑制剂，其由根据权利要求1或2的氨基酸序列组成，用于预防或治疗血栓相关疾病。

4.抑制凝血酶活性的方法，其中所述方法包括用至少一种权利要求1或2的凝血酶抑制剂接触凝血酶，其中所述至少一种凝血酶抑制剂在血液收集管中作为抗凝剂存在，或其中所述至少一种凝血酶抑制剂作为在医疗器械如支架、导管和其它医用管上的表面包覆材料存在。

5.权利要求1的凝血酶抑制剂制备用于预防和/或治疗凝血酶活性相关的疾病的药物的用途。

6.权利要求5的用途，其中所述相关疾病选自：引起心肌梗死、中风和栓塞的动脉和静脉血栓形成；用于在不稳定型心绞痛、冠状动脉成形术、经皮冠状动脉介入治疗和心脏手术、深静脉血栓形成期间的抗凝作用；血栓性静脉炎；肺栓塞；来源可能是心脏、动脉粥样硬化斑块、瓣膜或血管假体或未知来源的栓塞和微栓塞事件；弥散性血管内凝血。

7.权利要求5的用途，其中所述药物用于局部用途，用于预防和/或治疗AV分流术血栓形成、挫伤、扭转、肌肉撕裂、外伤性血肿、水肿、红斑、静脉曲张、外周静脉炎和外周静脉炎伴随痔疮，特别是与血栓栓塞并发症相关的那些。

8.诊断血栓相关疾病或病况的方法，其包括对从受试者分离的组织样品施用至少一种根据权利要求1的抑制剂，并检测结合至凝血酶的所述凝血酶抑制剂的存在，其中，与结合至正常凝血酶水平的抑制剂水平相比，检测的结合至凝血酶的所述抑制剂的水平升高指示所述疾病或病况。

9.药物组合物，其包含有效量的至少一种权利要求1的血栓抑制剂。

10.分离的核酸分子，其编码权利要求1的抑制剂。

11.权利要求10的分离的核酸分子，其中所述核酸分子由于遗传密码冗余而与SEQ IDNO:27所示的核酸分子序列具有至少90％序列同一性。

12.包含根据权利要求10或11的核酸分子的载体。

13.宿主细胞，其包含根据权利要求10至12任一项的核酸分子或载体。

14.调节凝血酶活性的试剂盒，其包括至少一种在权利要求1中定义的血栓抑制剂。