KR20180034868A

KR20180034868A - 돼지 동결정액의 품질 판별용 ＰＬＣz 유전자의 ＳＮＰ 마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20180034868A
Application number: KR1020160124608A
Authority: KR
Inventors: 조은석; 우제석; 사수진; 조규호; 홍준기; 김용민
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2016-09-28
Filing date: 2016-09-28
Publication date: 2018-04-05
Also published as: KR102019985B1

Abstract

본 발명은 돼지 동결정액의 품질 판별용 조성물과 키트, 및 돼지 동결정액의 품질 판별 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 본 발명의 SNP 위치의 염기를 확인함으로써, 돼지 동결정자의 융해 후의 정자 운동성과 같은 정자 품질을 정확하게 판별(예측)할 수 있다.

Description

돼지 동결정액의 품질 판별용 ＰＬＣz 유전자의 ＳＮＰ 마커 및 이의 용도{SNP Markers in PLCz gene for Discriminating Quality of Pig Frozen Semen and Their Uses}

본 발명은 돼지 동결정액의 품질 판별용 단일염기다형성(SNP) 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 돼지 동결정액의 품질 판별용 조성물과 키트, 및 돼지 동결정액의 품질 판별 방법에 관한 것이다.

양돈산업에 있어 돼지 번식의 주요 수단으로 사용되는 인공수정은 전 세계적으로 그 보급률이 매년 증가해오고 있으며, 국내의 돼지 인공수정 보급율은 90%에 이르고 있다. 인공수정은 자연교배에 비해 질병의 위험을 최소화할 수 있을 뿐만 아니라, 유전능력이 우수한 씨수퇘지의 유전자를 효율적으로 전달할 수 있어 개량을 가속화할 수 있는 장점을 가진 매우 유용한 기술이다¹. 인공수정용 정액은 크게 두 가지 형태로 구분될 수 있는데, 수퇘지로부터 채정한 원정액을 정액희석제와 희석하여 냉장상태로 보관하였다가 사용하는 액상정액(Fresh liquid semen)과 정액을 동결하여 -196℃ 액체질소에 보관하였다가 해동하여 사용하는 동결정액(Frozen semen)이 있다.

그러나, 상업용 비육돼지 생산을 위해서는 약 95% 이상이 액상정액을 사용하고 있으며, 돼지 동결정액의 경우는 돈군 개량과 유전자원 보존 등의 목적으로 쓰이고 있으나, 그 사용이 제한적이다. 이러한 이유는 동결정액의 동결과 융해방법, 동결보존액, 정액의 주입시간, 주입횟수, 주입정자수, 동결정액의 보존형태, 동결정액 보존기간, 개체에 따른 동결성 및 품종간의 차이 등이 동결정액 실용화를 어렵게 하는 요인들로 작용하기 때문이다. 그럼에도 불구하고 액상정액에 비해 반영구적인 보존이 가능한 동결정액은 유전능력이 우수한 씨수퇘지 유전자원을 장기보존 할 수 있을 뿐만 아니라, 씨수퇘지의 활용도를 높여 개량속도를 높이고, 유전인자(정액) 도입 시 전염성 질병의 전파를 방지할 수 있다는 장점이 부각되면서 많은 관심을 받고 있다.

정액동결 기술은 전염성 질병의 컨트롤, 정액의 장거리 수송 및 유전자원의 장기보존을 가능하게 한 유용한 기술이다². 그러나, 정액을 동결보존하는 과정에서 발생하는 저온충격, 삼투압 스트레스 및 동결보호제의 독성 등에 의해 동결-융해 후 정자의 운동성은 40% 수준이며, 일반적으로 돼지 인공수정에 사용되고 있는 액상정액과 비교하면 정액의 품질이 매우 낮게 나타난다³. 특히, 돼지의 정자는 타축종에 비해 세포막에 불포화 지방산의 함량이 높아 저온 충격에 매우 민감하게 반응하며, 이로 인해 돼지 정자는 동결-융해 후 운동성이 큰 폭으로 감소하는 것으로 알려져 있다⁴.

최근 돼지 정액의 동결과 융해방법 등에 많은 발전이 있었음에도 불구하고, 정액 동결-융해 과정 중에 발생하는 정자 운동성의 저하와 미토콘드리아의 기능장애 등의 요인들은 돼지 동결정액 산업화를 가로막는 요인으로 작용하고 있다^2,5. 이러한 문제들을 해결하기 위하여, 최근에는 유전자 변이에 따른 정액의 내동성을 판별하고, 돼지 동결정액의 품질을 향상시키고자 하는 연구가 진행되고 있다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 돼지 동결정액의 품질과 관련성이 있는 유전적 다형성에 대한 연구를 실시하였다. 그 결과, PLCz 유전자의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이 돼지 동결정액의 운동성 및 운동학적 형질과 연관성이 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

Maes et al., 2008, Theriogenology 70(8):1337-1345 Johnson et al., 2000, Animal reproduction science 62(1):143-172 Johnson et al., 1981, Journal of animal science 52(5):1130-1136 Mazur, 1984, American Journal of Physiology-Cell Physiology 247(3):C125-C142 Fraser et al., 2005, Reproduction in domestic animals 40(6):530-536

본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 돼지 동결정액의 품질 판별용 조성물을 제공하기 위한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 돼지 동결정액의 품질 판별용 키트를 제공하기 위한 것이다.

또한, 본 발명은 돼지 동결정액의 품질 판별 방법을 제공하기 위한 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 PLCz(phospholipase C zeta) 유전자 유래 폴리뉴클레오티드 서열의 101번째 위치에 존재하는 단일염기다형성(SNP)을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 돼지 동결정액의 품질 판별용 조성물이다.

또한, 본 발명의 다른 실시형태는 상기 조성물을 포함하는 돼지 동결정액의 품질 판별용 키트이다.

나아가, 본 발명의 또 다른 실시형태는 돼지로부터 분리된 시료의 핵산으로부터 서열번호 1로 표시되는 PLCz(phospholipase C zeta) 유전자 유래 폴리뉴클레오티드 서열의 101번째 위치에 존재하는 단일염기다형성(SNP) 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는 돼지 동결정액의 품질 판별 방법이다.

기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.

본 발명은 돼지 동결정액의 품질 판별용 조성물과 키트, 및 돼지 동결정액의 품질 판별 방법을 제공한다.

본 발명에 의하면, 본 발명의 SNP 위치의 염기를 확인함으로써, 돼지 동결정자의 융해 후의 정자 운동성과 같은 정자 품질을 정확하게 판별(예측)할 수 있다.

도 1은 두록 수퇘지의 PLCz 유전자의 인트론 1 부위에서 발견된 염기서열 분석결과와 다형성 위치를 보여준다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 PLCz(phospholipase C zeta) 유전자 유래 폴리뉴클레오티드 서열에서, 101번째 염기가 T 또는 C이고, 상기 101번째 염기를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돼지 동결정액의 품질 판별용 단일염기다형성(SNP) 마커이다.

본 발명의 다른 실시형태는, 서열번호 1로 표시되는 PLCz 유전자 유래 폴리뉴클레오티드 서열의 101번째 위치에 존재하는 단일염기다형성(SNP)을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 돼지 동결정액의 품질 판별용 조성물이다.

상기 PLCz 유전자 내 단일염기다형성 부위는 PLCz 유전자(GenBank accession No. NC_010447)의 158번째 위치에 존재하는 염기(T 또는 C)에 해당하며, 상기 단일염기다형성 부위를 포함하고 있는 PLCz 유전자의 일부 염기서열을 서열번호 1로 나타내었다. 또한, 상기 단일염기다형성 부위는 PLCz 유전자의 인트론 1 부위에 위치한다. 본 명세서에서는 상기 다형성 부위를 "PLCz g.158 T>C"로 표시할 수도 있다.

본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열을 가진다. 다형성 서열이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 포함하는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 10개 이상일 수 있으며, 예를 들어 10 내지 100개, 10 내지 80개, 10개 내지 60개 또는 10개 내지 40개의 연속 염기로 구성될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)"이란 다형성(polymorphism; 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우) 부위 중에서 개체에 따라 단일 염기만이 다른 것을 의미한다. SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.

본 발명에 있어서, 본 발명의 조성물에 포함되는 상기 SNP를 검출할 수 있는 제제는, 서열번호 1로 표시되는 PLCz 유전자 유래 폴리뉴클레오티드 서열의 101번째 위치의 SNP를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 프라이머, 또는 상기 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화 하는 프로브일 수 있다.

상기 프라이머 또는 프로브는 대립형질 특이적(allele-specific)이다.

본 명세서에서 사용된 용어, "대립형질 특이적(allele-specific)"이란 각 대립형질에 특이적으로 혼성화 하는 것, 즉, 다형성 서열 중에 존재하는 다형성 부위의 염기를 특이적으로 구별할 수 있도록 혼성화 하는 것을 의미한다. 여기에서, 혼성화란 보통 엄격한 조건, 예를 들어 1 M 이하의 염 농도 및 25℃ 이상의 온도 하에서 수행될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 15 내지 30개의 염기로 구성된다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 DNA 서열에 혼성화하여 다형성 부위를 포함하는 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다. 본 발명의 프라이머는 대립형질을 검출하여 돼지 동결정액의 품질을 판별하기 위한 마이크로어레이 등의 키트나 예측 방법 등에 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 2의 정방향 프라이머 및 서열번호 3의 역방향 프라이머일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프로브는 혼성화 프로브를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 대립형질 특이적 프로브는 같은 종의 두 개체로부터 유래한 핵산 단편 중에서 다형성 부위가 존재하여, 한 개체로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 개체로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질 간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여 대립형질 중 하나에만 혼성화되도록 충분히 엄격해야 한다. 이러한 본 발명의 프로브는 중앙 부위가 다형성 서열의 다형성 부위와 정렬하는 것이 바람직하다. 이에 따라, 서로 다른 대립형질성 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 프로브는 대립형질을 검출하여 돼지 동결정액의 품질을 판별하기 위한 마이크로어레이 등의 키트나 예측 방법 등에 사용될 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명의 조성물은 돼지 동결정액의 품질을 판별하기 위한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 돼지 동결정액의 품질은 동결정액의 융해 후의 정자의 운동성이다. 돼지마다 정자의 내동성이 상이하고, 돼지 정액은 동결 후 융해 시 정자의 운동성이 변할 수 있는데, 본 발명의 조성물을 사용하여 본 발명의 SNP를 검출(예컨대, SNP의 염기서열 결정 또는 유전자형 결정)함으로써, 융해 후의 운동성이 보다 우수한 정자를 갖는 돼지를 선별할 수 있다. 이와 같이 선별된 돼지의 정액을 사용하여 보다 내동성이 우수한 동결정액을 제조할 수 있다.

상기 정자의 운동성은 정자의 곡선속도, 직선속도, 평균 이동속도 및 ALH(Amplitude of Lateral Head displacement)로 구성된 군으로부터 선택되는 운동학적 특징을 분석하여 판단할 수 있다.

본 발명에 있어서, 본 발명의 조성물은 두록 품종(Duroc pig)의 동결정액의 품질 판별에 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시 형태는, 본 발명의 조성물을 포함하는 돼지 동결정액의 품질 판별용 키트이다.

본 발명의 키트는 돼지 동결정액의 품질 판별용 마커인, PLCz 유전자의 g.158 T>C 단일염기다형성 부위를 확인함으로써 돼지 동결정액의 품질을 예측하는데 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 본 발명의 키트는 PCR 키트, DNA 분석용(예컨대, DNA 칩) 키트 또는 마이크로어레이 키트로 구현될 수 있다.

본 발명의 키트에는 PLCz g.158 T>C SNP를 확인하기 위한 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브뿐만 아니라, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. PCR 키트는 상기 SNP 에 특이적인 프라이머 또는 프로브 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 돼지 동결정액의 품질 판별용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 상기 SNP에 특이적인 프라이머 또는 프로브가 부착되어 있는 기판을 포함하고, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 핵산을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 상기 SNP에 특이적인 프로브를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어질 수 있다. 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고, 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시 형태는, 돼지로부터 분리된 시료의 핵산으로부터 서열번호 1로 표시되는 PLCz 유전자 유래 폴리뉴클레오티드 서열의 101번째 위치에 존재하는 단일염기다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는 돼지 동결정액의 품질 판별 방법이다.

상기 시료로는 털, 뇨, 혈액, 정액, 각종 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 시료 등이 될 수 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다.

상기 핵산으로부터 본 발명의 SNP 마커의 염기를 결정하는 방법은 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 예를 들어, 본 발명의 SNP의 유전자형 확인은 시퀀싱 분석, 자동 염기서열 분석기를 사용한 시퀀싱 분석, 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 마이크로어레이에 의한 혼성화, PCR-RELP법(restriction fragment length polymorphism), PCR-SSCP법(single strand conformation polymorphism), PCR-SSO법(specific sequence oligonucleotide), PCR-SSO법과 도트 하이브리드화법을 조합한 ASO(allele specific oligonucleotide) 하이브리드화법, TaqMan-PCR법, MALDI-TOF/MS법, RCA법(rolling circle amplification), HRM(high resolution melting)법, 프라이머 신장법, 서던 블롯 하이브리드화법, 도트 하이브리드화법 등의 공지의 방법에 의하여 수행될 수 있다

본 발명의 방법은, 상기 SNP 부위의 염기를 결정하는 단계 이후에, 결정된 염기 정보를 바탕으로 검체 대상인 돼지의 동결정액의 품질을 판별하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 SNP의 유전자형이 TT인 경우 돼지 동결정액의 품질이 TC 또는 CC 유전자형을 갖는 돼지보다 우수한 것으로 판단할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 SNP의 유전자형이 TC인 경우 돼지 동결정액의 품질이 CC 유전자형을 갖는 돼지보다 우수한 것으로 판단할 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실험재료 및 실험방법

정액 채취

수퇘지들을 농촌진흥청 국립축산과학원에서 균등한 먹이 및 취급 조건들에서 사육하였다. 본 연구에서 공시축은 2011년에서 2015년까지 1.5~2년생의 성숙한 수퇘지를 사용했으며, 정액의 채취는 의빈대를 이용한 수압법을 이용하였다. 본 연구에 사용된 샘플은 정자 운동성과 형태학적으로 정상인 정자의 비율이 80% 이상인 사출정액만을 이용했다. 정액필터를 통해 1차적으로 걸러진 정액을 37℃ BTS (Beltsville thawing solution)와 1:1의 비율로 희석하여 신속히 실험실로 운반하였다.

동결정액 제조

정액동결에 앞서 정액샘플들을 24시간 동안 17℃ 정액보관고에서 보관하였다. 동결을 위한 전처리과정으로, 액상정액 샘플을 17℃ 조건하에서 15분 동안 800 xg로 원심분리를 실시하였다. 원심분리 후, 진공펌프를 이용하여 상층액을 조심스럽게 제거하여 정자 펠렛만을 남겼다. 정자 펠렛들은 1차 동결희석제(LEY; lactose egg-yolk extender, 11% [v/v] β-lactose, 20% [v/v] hen egg yolk)로 재부유하여 최종정액농도 1.5 X 10⁹ 세포/ml로 만들었으며, 그 다음 1.5시간 동안 5℃에서 샘플을 냉각시켰다. 그 뒤, 동결용 정액샘플을 89.5 ml LEY에 9 ml 글리세롤 및 1.5 ml Orvus Es Paste(OEP, Nova Chemical Sales Inc., Scituate, MA. USA)가 함유되어 있는 2차 희석제를 조심스럽게 첨가하여 5℃에서 정자의 최종 농도를 1 X 10⁹ 세포/ml로 만들었다. 정액샘플들을 filling & sealing machine(IMV, L'Aigle, France)으로 0.5 ml 스트로우(IMV, L'Aigle, France)내에 포장하였으며, 글리세롤 평형을 위해 1시간 동안 5℃에 보관하였다. 정액 동결을 위해 샘플들은 정액 동결기(SY-LAB Gerate GmbH, Austria)를 사용하여 6분 동안 5℃에서 -5℃까지 냉각시키고, 얼음결정형성(seeding)을 유도하는 동안에 30초 동안 -5℃에 두었다. 그 다음 40분 동안 -5℃에서 -80℃까지 냉각시켰고, 60분 동안 -80℃에서 -150℃까지 냉각시켜 동결을 마무리하였다. 동결정액 스트로우는 분석을 수행할 때까지 -196℃ 액체질소 탱크에 보관하였다. 그 후에 동결정액 스트로우들은 20초 동안 38℃의 항온수조에 담가서 융해시켰고, 각 스트로우의 내용물들은 즉시 BTS에 1:4 (v/v) 비율로 부유시킨 후 정자의 운동성을 평가하기 위하여 30분 동안 38℃에 가온시켰다.

정자의 운동학적 특성 분석

정자 운동성(MOT, Motility)을 정자 자동분석기(CASA, Computer-assisted semen analysis system; SAIS SI-100, Medical Supply, Korea)를 사용하여 평가하였다. 정자샘플은 BTS로 희석하여 30 X 10⁶ 세포/ml농도로 준비하였다. 5 ㎕의 정자샘플을 38℃로 가온된 pre-wormed markler counting chamber(Sefi-Medical Instruments, Israel)에 올려놓고, 샘플 당 최소 100마리의 정자를 평가하였으며, 분석은 5회 이상 실시하였다. 각 정자 샘플의 전체 운동성(TMS, Total motile spermatozoa, %), 곡선속도(VCL, Curvilinear velocity, um/s), 직선속도(VSL, Straight-line velocity, um/s), 평균 이동속도(VAP, Average path velocity), 직진성(LIN, 예를 들어, VSL과 VCL 사이의 비율) 및 ALH(Amplitude of Lateral Head displacement)를 포함하는 운동학적 특성들을 측정했다. 두록 78두 동결정액에 대한 평가결과를 표 1에 나타내었다.

Genomic DNA 분리 및 유전자형 분석

Genomic DNA를 Wizard Genomic DNA 정제 키트(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 제조사의 방법을 약간 변형하여 분리하였다. 직접 염기서열분석(Direct sequencing)을 위하여, 두록 수퇘지 78두의 DNA를 이용하여 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행하였다. PCR은 10 pml의 프라이머, 0.25 mM dNTP, 10X PCR buffer, 1.25 u DNA polymerase(Genet Bio, Chungnam, Korea)와 100 ng의 DNA를 포함하여 20 ㎕의 부피에서 수행하였다. PCR 조건은 94℃에서 30초, 64℃에서 30초, 72℃에서 45초로 수행하였고, DNA Engine Tetrad 2 Thermal Cycler(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 총 35회 반복으로 PCR을 수행하였다. PCR 수행 후 염기서열 분석을 위하여, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit V3.0(Life Technologies Corp., Carlsbad, CA, USA)와 ABI PRISM 3730 Genetic Analyzer(Life Technologies Corp.)를 이용하여 염기서열을 분석하였고, SeqMan program(DNASTAR Inc., Madison, WI, USA)을 이용하여 SNP(Sngle nucleotide polymorphism)를 비교하여 유전자형을 결정하였다. 염기서열 분석에 이용된 프라이머는 5′- GGTGTTCAGACCGAAAGGAA -3′(서열목록 2) 및 5′- AACAGAAAGGACTTCTGATGTGA -3′(서열목록 3)이다.

통계 분석

연관성 분석은 SAS 9.13(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)의 GLM(generalized linear model)을 이용하였으며, 유전자형의 효과와 경제형질들에 대해 최소 유의차 검정으로 평균간 차이에 대한 유의성을 조사하였다. 통계분석에 이용한 모형은 다음과 같았다.

y _ijkl =μ+G _i +S _j +P _l +e _ijkl

상기 모형에서 y _ijkl 는 관측치, μ는 전체의 평균, G는 유전자형 효과, S _j 는 성별의 효과, P _l 는 정액채취기간, e _ijkl 는 임의오차를 나타내며, 유전자형 효과, 성별의 효과, 정액 채취기간은 고정효과로 사용되었다. 그리고, 유의적 차이는 P < 0.01 와 P < 0.05로 표시하였다.

실험결과

본 연구에서는 PLCz 유전자의 SNP를 확인하여 유전자형을 분석하고, 두록 78두 동결정액의 운동학적 특성과 연관성을 분석하고자 하였다. 정자의 운동학적 특성 분석 결과는 표 1과 같았다.

PLCz 유전자의 인트론 1 지역에서 염기서열 분석을 통하여 SNP를 확인한 결과, 도 1과 같이 158번째 염기에서 다형성을 확인할 수 있었다. 두록 78두의 대립유전자와 유전자형의 빈도를 확인한 결과, 표 2와 같이 TT, TC 및 CC 유전자형의 빈도는 각각 0.72, 0.22 그리고 0.06이었다. 그리고, T 대립유전자(0.83)가 C 대립유전자(0.17)보다 빈도가 훨씬 높은 것으로 나타났다.

본 연구에서 확인한 SNP와 두록 78두 돼지 동결정액의 운동학적 특성과 연관성을 비교한 결과, 표 3과 같이 높은 유의성을 보였다. MOT, VCL, VSL 및 VAP(p < 0.0001, p = 0.0002, p < 0.0001 및 p < 0.0001, 각각)에서 높은 유의성을 보였고, ALH(p = 0.0160)에서는 보다 낮은 유의성을 확인할 수 있었다.

본 연구에서는 PLCz 유전자의 SNP와 동결정액의 운동학적 특성과 연관성을 확인하려고 하였고, 그 결과 PLCz 유전자의 g.158 T>C SNP는 운동성 및 운동학적 특성들의 거의 대부분과 상당한 연관성이 있었고, TT 유전자형을 가진 돼지가 TC 및 CC 유전자형을 가진 돼지보다 대부분의 형질 값들이 더 높았다.

상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.

Claims

서열번호 1로 표시되는 PLCz(phospholipase C zeta) 유전자 유래 폴리뉴클레오티드 서열의 101번째 위치에 존재하는 단일염기다형성(SNP)을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 돼지 동결정액의 품질 판별용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 SNP를 검출할 수 있는 제제는, 서열번호 1로 표시되는 PLCz 유전자 유래 폴리뉴클레오티드 서열의 101번째 위치의 SNP를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 프라이머인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 2의 정방향 프라이머 및 서열번호 3의 역방향 프라이머인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 SNP를 검출할 수 있는 제제는, 서열번호 1로 표시되는 PLCz 유전자 유래 폴리뉴클레오티드 서열의 101번째 위치의 SNP를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화 하는 프로브인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 돼지 동결정액의 품질은 동결정액의 융해 후의 정자의 운동성인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 돼지는 두록 품종(Duroc pig)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 돼지 동결정액의 품질 판별용 키트.
돼지로부터 분리된 시료의 핵산으로부터 서열번호 1로 표시되는 PLCz(phospholipase C zeta) 유전자 유래 폴리뉴클레오티드 서열의 101번째 위치에 존재하는 단일염기다형성(SNP) 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는 돼지 동결정액의 품질 판별 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 SNP의 유전자형이 TT인 경우 돼지 동결정액의 품질이 TC 또는 CC 유전자형을 갖는 돼지보다 우수한 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 SNP의 유전자형이 TC인 경우 돼지 동결정액의 품질이 CC 유전자형을 갖는 돼지보다 우수한 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.