KR20180024002A - 신규한 바이사이클릭 리포란티펩티드, 제조 및 항균제로서의 용도 - Google Patents

신규한 바이사이클릭 리포란티펩티드, 제조 및 항균제로서의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20180024002A
KR20180024002A KR1020187003232A KR20187003232A KR20180024002A KR 20180024002 A KR20180024002 A KR 20180024002A KR 1020187003232 A KR1020187003232 A KR 1020187003232A KR 20187003232 A KR20187003232 A KR 20187003232A KR 20180024002 A KR20180024002 A KR 20180024002A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
bicyclic
peptide
lipotropic
formula
fatty acid
Prior art date
Application number
KR1020187003232A
Other languages
English (en)
Inventor
조제프 아스조디
드니스 꺄르니아또
도미니끄 르 벨레
귀욤 레까메
마리-엘렌 께르냉
Original Assignee
데이노비오?스
데이노비오?笭?
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 데이노비오?스, 데이노비오?笭? filed Critical 데이노비오?스
Publication of KR20180024002A publication Critical patent/KR20180024002A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/90—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having two or more relevant hetero rings, condensed among themselves or with a common carbocyclic ring system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N47/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid
    • A01N47/40—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid the carbon atom having a double or triple bond to nitrogen, e.g. cyanates, cyanamides
    • A01N47/42—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid the carbon atom having a double or triple bond to nitrogen, e.g. cyanates, cyanamides containing —N=CX2 groups, e.g. isothiourea
    • A01N47/44—Guanidine; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
    • C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring
    • C07K7/56—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring the cyclisation not occurring through 2,4-diamino-butanoic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

본 발명은 새로운 부류의 란티펩티드를 나타내는 신규 바이사이클릭 리포란티펩티드, 및 이의 염, 마이크로박테리움 아로보센스(Microbacterium arborescens)의 배양물로부터의 이들의 제조, 및 사람, 동물 또는 식물에서의 감염의 예방 및 치료에 있어서 항균제로서 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

신규한 바이사이클릭 리포란티펩티드, 제조 및 항균제로서의 용도
미생물(microorganism)에 의해 유발된 감염을 치유하는데 사용된 약물의 작용을 피하는데 목표를 둔 방법을 발견하는 미생물 능력을 수반한 항균제 내성(antimicrobial resistance)은, 내성 박테리아의 성장하는 경향 때문에, 그리고 새로운 항생제의 결여로 인하여, 현재의 공중 보건의 쟁점으로 유지되고 있다.
따라서, 내성 쟁점에 기인할 뿐 아니라, 집단의 연장된 기대 수명으로 기인한 항생제의 요구가 커지고 있다.
예를 들어, 최초의 페니실린-내성 균주가 50년 이상 전에 등장한 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 포함하는 다중-약물 내성 그람-양성 박테리아(multi-drug resistant Gram-positive bacteria: MDRGP)은 과학계에 여전히 도전 과제를 제기하고 있다. 또한, 다중-약물 내성 그람-음성 세균(MDRGN), 특히 이. 콜라이(E.coli)-내성 균주는 관심 쟁점으로 부상해 왔다.
따라서, 항균 특성을 가지고 및 통상의 항생제에서 발견된 것과는 상이한 구조를 지닌 새로운 화학적 실체(entities)에 대한 조사가 이러한 내성 감염을 억제하기 위한 새로운 방법을 개발하기 위한 시급한 요구사항으로서 고찰되고 있다. 본 출원인은 마이크로박테리움(Microbacterium)이 항박테리아 활성을 갖는 신규 화합물을 생산하는데 특히 유용함을 발견하였다. 지금까지 문헌에 기술된 모든 마이크로박테리움 균주는 환경 공급원으로부터 분리되었다. 임상 미생물 진단 연구소는 면봉, 대변, 소변, 혈액, 객담, 뇌척수액, 활액, 및 또한 가능한 감염된 조직을 포함하는 거의 모든 어떠한 임상 검체도 제공받는다. 그러나, 거의 20여년에 걸쳐 마이크로박테리움 균주는 임상 검체로부터 분리되었다. 초기에, 이들 황색- 또는 오렌지-색의, 발효성 그람-양성 막대균(GPR)은 CDC 코리네포름 그룹(coryneform group) A-4 및 A-5 박테리아로서 확인되었으나, 추가의 연구는 이들이 마이크로박테리움 속에 속한다는 것을 밝혀내었다(Primary Identification of Microbacteriumspp . encountered in Clinical Specimens as CDC Coryneform Group A-4 and A-5 Bacteria, Guido FUNKE, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Jan. 1995, p. 188-192).
발명의 간단한 요약
본 발명자들은 마이크로박테리움의 게놈이 생물학적으로 활성인 2차 대사산물을 생산하는 효소 경로를 암호화함을 입증하였다. 본 발명은 마이크로박테리움 속(genus Microbacterium), 보다 특히 균주 마이크로박테리움 아르보레센스(Microbacterium arborescens) CIP 55.81T(Collection Institut Pasteur)의 균(microorganism)으로부터 분리된 항박테리아 활성을 갖는 새로운 화합물을 제공한다.
발명의 요약
란티펩티드는 4개 부류로 나누어지는 리보소옴적으로 합성되어 해독후 변형된(post-translationally modified) 천연 생성물이고, (Nat Prod Rep. 2013 January, 30(1), 108-160 DOI: 10.1039/c2np20085f) 모두는 아니지만 이들 중 일부는 항균 활성을 나타낸다.
본 발명은 적어도 (i) 다음의 아미노산들: 각각이 L-구조인 Ala, Gln, Leu 및 Ser, 및 Gly, (ii) 아미노비닐티오 그룹, 및 (iii) 탄소-탄소 이중 결합을 함유할 수 있는 선형 지방산 쇄, 특히 C15 또는 C17로 이루어지고, 당해 지방 쇄의 말단 탄소는 1개 또는 2개의 (C1-C6) 알킬 그룹으로 임의 치환된 구아니딘 그룹을 수반하는(carrying) 치환체를 포함하는 새로운 부류의 란티펩티드, 및 이의 산 염을 나타내는 바이사이클릭 화합물에 관한 것이다. 당해 신규 화합물은 이들이 훨씬 더 작은 분자량을 가진다고 해도 생합성 경로를 기준으로 하여 란티펩티드로 분류될 수 있으며, 지방산 치환체의 존재는 란티펩티드에 있어서 독특한 특징이므로, 이들은 리포란티펩티드로 언급되어져 왔다.
본 발명은 특히 상기 기술된 바와 같은 바이사이클릭 리포란티펩티드에 관한 것이며, 여기서 구아니딘 그룹은 2개의 말단 질소 원자에 의해 수반된, 2개의 메틸 그룹으로 치환된다.
본 발명에 따른 리포란티펩티드는 상기 정의한 바와 같은 수개의 화합물, 특히 지방쇄 구조의 수준이 상이한, (즉, 포화된 C15 쇄 또는 포화되거나 불포화된 C17 쇄로, 후자는 이후 정의된 바와 같은 하나의 불포화도(unsaturation)를 함유할 수 있음) 3개의 화합물(이하, A, B 및 C로 지정됨)의 혼합물 형태를 취할 수 있다. 각각의 화합물 A, B 및 C는 그 자체로 본 발명의 목적을 구성한다. 논의되는 상기 화합물의 분자량 및 분자식은 각각 978 및 C45H78N12O10S, 1006 및 C47H82N12O10S, 및 1004 및 C47H80N12O10S(이하, 각각 화합물 A, C 및 B)이다.
본 발명에 따른 리포란티펩티드는 또한 하기에 의해 특징화된다:
i) HR MS/MS 단편화(fragmentation)는 치환된 구아니딘의 2개의 피크 특성을 나타내고, 각각 그룹 CH3NH2 및 CH3N=C=NCH3의 손실에 상응하는 31.0427 및 70.0538의 질량 손실을 나타낸다;
ii) 아미노비닐티오 그룹의 2개의 비닐성 양성자(vinylic prtons)의 CD3CN/H2O에 있어서 1H NMR 화학적 이동(chemical shift)은 5.5 및 7.2 ppm에 있음.
화합물 A, B 및 C는 이하 언급된다:
[식 A]
Figure pct00001
[식 B]
Figure pct00002
( ) m 및 ( ) n은 총 7개의 CH2를 나타냄.
[식 C]
Figure pct00003
본 발명에 따른 리포란티펩티드는 사람, 동물 및 식물에 있어서 미생물 병원체로 인한 감염의 예방 및 치료학적 처치(therapeutical treatment)를 위한 항균제로서 유용하도록 하는 항균 특성이 부여되어 있으며, 이는 본 발명의 추가의 목적을 구성한다.
본 발명에 따른 리포란티펩티드는 호기성 또는 혐기성 조건하에서 성장하는 그람-양성 박테리아에 대한 항박테리아제로서 특히 유용하다. 이러한 약물은 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 속, 보다 특히 에스. 아우레우스(S. aureus) 및 에스. 에피더미디스(S. epidermidis) 및 에스. 사프로피티쿠스(S. saprophyticus)(메티실린-내성 스타필로코쿠스, 반코마이신-중간체 및 반코마이신-내성 스타필로코쿠스 아우레우스와 같은 다중내성 균주를 포함함)와 같은 코아굴라제-음성 스타필로코쿠스, 엔테로코쿠스(이. 파에시움(E. faecium)을 포함하고 반코마이신-내성 분리체를 포함함), 스트렙토코쿠스(에스. 뉴모니아에(S. epidermidis), 페니실린-내성 에스 뉴모니아에, 에스. 아갈락티아에(S. agalactiae), 에스. 피오게네스(S. pyogenes) 및 비리단스 그룹의 스트렙토코쿠스를 포함함), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)의 박테리아에 대해 유용하다.
게다가, 이는 또한 후천성 면역결핍 증후군을 지닌 환자를 포함하는 사람에서 우려되는 주요 감염인, 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 대해 항마이코박테리아 활성을 입증한다.
상기 기술한 용도 외에도, 본 발명에 다른 리포란티펩티드는 또한 식물 병원체로부터 작물을 보호하는데 있어서 사용될 수 있다. 예를 들면, 고추에서 파이토프토라(Phytophthora)에 의해 유발된 파이토프토라 마름병 감염(blight infection)의 방제가 언급될 수 있다.
본 발명은 또한 활성 성분으로서, 치료학적 유효량의 적어도 하나의 본 발명에 따른 리포란티펩티드를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물에서, 활성 성분은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께 연합될 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 치료될 환자에게 적절한 개별 용량으로, 경구, 국소, 경피, 설하, 직장, 정맥내, 근육내, 복강내 및 피하 경로를 포함하는, 비경구 하에 투여되도록 유리하게 제형화된다. 바람직한 경로는 경피 경로이다.
본 발명에 따른 조성물은 고체, 액제(solution), 유제 또는 현탁제를 포함하는 액체, 또는 겔/크림제의 형태일 수 있으며 예를 들면, 플레인(plain) 또는 당-코팅된 정제, 젤라틴 캅셀, 과립, 좌제, 주사가능한 제제, 연고, 크림, 겔과 같은 사람 의약에서 일반적으로 사용된 약제학적 형태로 나타나며; 이들은 통상의 방법에 따라 제조된다. 활성 성분들은 활석, 검 아라빅(gum arabic), 락토즈, 전분, 스테아르산마그네슘, 수성 또는 비-수성 비히클, 동물 또는 식물 기원의 지방 물질, 파라핀 유도체, 글리콜, 다양한 습윤제, 분산제 또는 유화제, 방부제와 같은, 이들 약제학적 조성물 속에 통상적으로 사용되는 부형제를 사용하여 혼입시킬 수 있다. 이들 조성물은 특히 적절한 비히클, 예를 들면, 비-발열성 멸균수 속에 즉석으로 용해되거나 현탁되도록 의도된 분말의 형태로 존재할 수 있다.
투여된 본 발명에 따른 리포란티펩티드의 용량은 치료될 상태, 문제의 환자 및 투여 경로에 따라 변한다. 이는 예를 들면, 성인당 10μg 내지 10g으로 포함될 수 있다.
도 1은 화합물 MH+= 979.57340(600MHz, DMSO-d6, 300K)의 1H NMR 스펙트럼(완전한 스펙트럼(full spectrum))을 나타낸다.
도 2는 화합물 MH+= 979.57340(600MHz, CD3CN/D2O, 300K)의 1H NMR 스펙트럼(완전한 스펙트럼)을 나타낸다.
도 3은 화합물 MH+= 979.57340(600MHz, CD3CN/D2O, 300K)의 1H-1H COSY NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 4는 화합물 MH+= 979.57340(600MHz, CD3CN/D2O,300K)의 C-편집된(C-edited) HSQC 스펙트럼(0.0 내지 5.5 ppm)을 나타낸다.
도 5는 아미노비닐티오 그룹을 함유하는 화합물 MH+= 979.57340(600MHz, CD3CN/D2O, 300K)의 C-편집된 HSQC 스펙트럼(5.5 내지 10 ppm)을 나타낸다.
도 6은 화합물 MH+= 979.57340 (600MHz, CD3CN/D2O, 300K)의 TOCSY 스펙트럼을 나타낸다.
도 7은 화합물 MH+= 979.57340 (600MHz, CD3CN/D2O, 300K)의 HMBC NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 8은 화합물 MH+= 979.57340 (700 MHz, CD3CN/D2O: 0.2% CD3COOD를 갖는 3/2, 305K)의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 9는 화합물 MH+= 979.57340의 잔기-내 NMR 할당을 나타낸다.
도 10은 화합물 MH+=979.57340내 빌딩 블록(building block)의 순차적 배열의 일관된 사진을 나타낸다.
도 11은 화합물 979.57340 내 바이사이클릭 란티펩티드 시스템을 정확하게 정의하는 잔기-간 상관관계를 요약한다.
도 12는 화합물 MH+= 1007.60472 (600MHz, DMSO-d6, 300K)의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 13은 화합물 MH+= 1007.60472 (600MHz, DMSO-d6, 300K)의 1H -1H COSY NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 14는 화합물 MH+= 1007.60472 (600MHz, DMSO-d6, 300K)의 ROSY NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 15는 아미노비닐티오 그룹을 함유하는 화합물 1007.60472 (600MHz, DMSO-d6, 300K)의 C-편집된 HSQC 스펙트럼(5.0 내지 10 ppm)을 나타낸다.
도 16은 화합물 MH+= 979.57340 (A), MH+= 1005.58912 (B), MH+= 1007.60472 (C)의 HPLC-HRMS를 나타낸다.
도 17은 화합물 MH+= 1007.60472의 ESI-LIT-오르비트랩(Orbitrap)을 나타낸다.
도 18은 화합물 MH+=1005.58917의 비닐 양성자의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸다.
실시예 (EXPERIMENTAL PART)
다음에서, 본 발명은 실시예에 의해 구체적으로 기술되지만 본 발명이 이들에게만으로 한정되지는 않는다.
리포란티펩티드의 생산을 위한 배양 배지의 제조
YPG (펩톤, 글루코즈 , 효모 추출물) 배지
YPG 배지의 조성은 다음과 같다: 글루코즈, 1 g/L; 펩톤, 10 g/L; 효모 추출물, 5 g/L; MOPS (3-(N-모르폴리노)프로판설폰산) 150 mM
10% 글루코즈, 2M MOPS 및 3M KOH 용액을 별도로 제조한다.
10% 글루코즈 ( 100 ml )
Figure pct00004
10 g의 분말, 100 mL당 충분량(qsp)의 증류수
Figure pct00005
110℃에서 30분 동안 멸균
3M KOH
Figure pct00006
MM = 56.11 g/mol
Figure pct00007
순도: 85%
Figure pct00008
56.11 * 0.85 = 47.6 g/mol
Figure pct00009
증류수를 사용하여 1L당 충분량을 위해 분말 143.08 g을 칭량한다.
Figure pct00010
121℃에서 20분 동안 오토클레이빙(autoclaving)한다.
2M MOPS (1L)
Figure pct00011
MM = 209.26 g/mol
Figure pct00012
920mL당 적량을 위해 분말 418.52 g을 칭량한다.
Figure pct00013
멸균 조건하에 0.22 마이크론에서 여과한다.
Figure pct00014
80 mL의 멸균 3M KOH를 가한다.
YPGYPG 배지
Figure pct00015
10 g/L의 펩톤
Figure pct00016
5 g/L의 효모 추출물
121℃에서 20분 동안 멸균한다.
Figure pct00017
멸균된 10% 글루코즈의 첨가: 최종 농도 0.1%(최종 농도 1 g/L)
Figure pct00018
멸균 MOPS의 첨가(최종 농도 150 mM)
초기 pH에 따라 멸균 KOH 또는 멸균 KCl을 사용하여 pH를 7.2로 조절한다.
마이크로박테리움 아르보레센스 CIP 55.81T의 배양 .
- 예비-배양(P1)
최종 용적으로서 100 ml의 YPG 배지를 함유하는 500 ml들이 플라스크에 원시(primary) 마이크로박테리움 아르보레센스 균주 뱅크의 콜로니를 접종하고 30℃에서 24시간 동안 분당 160회 회전(rpm)으로 교반하면서 항온처리하였다. 이후에, 600nm에서의 광학 밀도(OD)를 마이크로박테리움 아르보레센스 균주가 이의 대수 성장기(1 < 600 nm에서의 OD <3)의 초기/중간에 존재할 때까지 분광광도계로 측정하였다.
예비-배양물의 순도를 YPG 아가 위에 씨딩(seeding)함으로써 모니터링하였다. 플레이트를 30℃에서 48시간 동안 항온처리하였다.
- 에를렌마이어 플라스크 속에서의 배양.
최종 용적으로서 1000 ml의 YPG 배지를 함유하는, 5000 ml 들이 플라스크에 100 ml의 예비-배양물(P1)을 접종하고 30℃에서 96시간 동안 160 rpm에서 교반하면서 항온처리하였다. 600nm에서의 초기 OD는 0.1 내지 0.3의 범위였다.
발효의 순도를 YPG 아가를 씨딩함으로써 96시간의 말기에 모니터링하였다. 플레이트를 30℃에서 48시간 동안 항온처리하였다.
배양물을 10,000 g로 45분 동안 25℃에서 원심분리하였다.
상층액을 회수하고 4℃에서 유지하였다.
리보란티펩티드의 추출
상층액으로부터 항균 활성을 가진 화합물의 추출은 80:20 비의 디클로로메탄/메탄올의 혼합물과 접촉시켜 액체-액체 추출로 수행하였다. 수집된 상층액을 사용하여 작동을 5회 수행한다. 용매를 회전 증발기 속에서 50℃, 7 mbar, 160 rpm에서 20ml의 최종 용적으로 농축시켰다. 침전물이 형성되면, 상층액을 제거하고 침전물(갈색)(PRE1)을 메탄올 속에 재용해시키고 용매를 감압하에 증발시켰다.
PRE1을 디클로로메탄에 이어서 디클로로메탄/메탄올(99/1)로 수회 세척하여 침전물 2(황색) (PRE2)을 수득하였다.
제조 HPLC에 의한 정제
PRE2를 DMSO, H2O, 아세토니트릴 1/1/1 (v/v/v)의 혼합물 속에서 150mg을 취함으로써 정제하였다. 샘플을 수동으로 Waters가 제조한 세미-제조 HPLC의 주입 시스템내로 로딩(1.5 mL)하였다. 사용된 컬럼은 C18(5 마이크론, 150 x 21 mm, Gemini, Phenomenex)이었다. 용출을 하기 표 1에 나타낸 구배에 따라서 15 mL/분의 유동 속도에서 수행하였다.
[표 1] 완충액 A 및 B의 각각의 농도의 함수로서의 용출(Elution)
Figure pct00019
화합물 A, B 및 C에 상응하는 3개의 피크를 각각 15.1분, 15.8분 및 16.3분에서 수집하였다.
수득된 화합물을 MALDI-TOF 질량 분광법 및 NMR로 분석하였다. 사용된 조건은 첨부된 도면에서 이후 나타낸다.
화학적 이동 할당(chemical shift assignment) 및 모든 관찰된 잔기-내(intra-residual) 연결성을 표 4 및 도 9 각각에 요약한다. 아미노비닐티오 그룹의 비닐성 양성자의 경우, 시스-이성체를 명확하게 나타내는 7.3 Hz의 3JHα - Hβ 커플링 상수가 관찰되었다.
도 9에서, 화합물의 잔기-내(intra-residual) NMR 할당 MH+= 979.57340이 제공된다.
화합물 B와 관련하여, 1H NMR 스펙트럼(도 18)에서, 5.18 ppm에서의 다중선(multiplet)은 지방산 쇄의 2개의 에틸렌성 양성자에 상응한다. 화학적 이동 및 시그날의 중복도는 2개의 양성자가 카보닐 작용으로 접합되어 있지 않음을 나타낸다.
표준 조건에서 완전한 가수분해 및 마페이 시약(Marfey's reagent)에 의한 유도체화 후, 아미노산 Ala, Leu, Gln, Ser은 표준물과 비교하여 LC/MS 비교에 의해 L 구조를 갖는 것으로 확인되었다.
약제학적 조성물의 예
1/ 다음을 함유하는 주사용 약제학적 조성물을 제조하였다:
화합물 A: 500 mg
멸균 수성 부형제 q.s.f. 5cm3
2/ 다음을 함유하는 주사용 약제학적 조성물을 제조하였다:
화합물 C: 2g
멸균 수성 부형제 q.s.f. 5cm3
화합물의 항박테리아 활성
활성의 척도는 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) - Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 이전에 NCCLS)에 의해 추천된 프로토콜에 따라, 분자 978 (A), 1004 (B) 및 1006 (C)에서 수행하였다:
1. Methods for Dilution Antibacterial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard - Tenth Edition (2015). Clinical and Laboratory Standards Institute Document M07-A10.
2. Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria; Approved Standard - Eighth Edition (2012). Clinical and Laboratory Standards Institute Document M11-A8.
3. 항마이코박테리아 활성은 Journal of Clinical Microbiology (2009, 47:1773-1780) by Springer et al. Quantitative drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis by use of MGIT 960 and EpiCenter Instrumentation에 기술된 바와 같이 측정하였다.
활성은 아래 표 2 및 3에 나타낸다.
[표 2]
Figure pct00020
[표 3] 화합물 1006(C)의 연장된 항박테리아 활성.
Figure pct00021
분석 데이타
Figure pct00022
[표 4] CD3CN/D2O에 있어서 화합물 MH+= 979.57340의 NMR 데이타, (CD3CN의 화학적 이동은 참고로 취한다, 1H: 1.97ppm, 13C: 0.47ppm)
Figure pct00023
[표 5] 0.2% CD3COOD를 가지는 CD3CN/D2O 내 화합물 MH+= 979.57340의 NMR 데이타
Figure pct00024
HNi와 Hαi-1 사이의 잔기-내 NOE 접촉은 화합물 MH+=979.57340에 있어서 블딩 블록의 순차적 배열의 일관된 사진을 생성하였다(도 10).
도 11은 란티펩티드 바이사이클릭 시스템을 모호하지 않게 정의하는 잔기=내 상관관계를 요약한다.
[표 6] DMSO-d6 내 화합물 1007.60472의 NMR 데이타, (DMSO의 화학적 이동은 참고로 취한다, 1H: 2.50ppm, 13C: 39.52ppm)
Figure pct00025
HPLC COLUMN
Phenomenex Gemini NX, 5μ, C18, 110 A, 150 X 2 mm
UPLC / “Orbitrap Technology”, Exactive , Thermo Fisher Scientific
HESI Probe
MS 고 해상도 (exact mass +/- 5ppm)
Figure pct00026
UPLC Accela AS Method
Figure pct00027
디버트 밸드 (Divert Valve)
Figure pct00028
펌프 방법 (Pump Method)
Figure pct00029
[표 7] 화합물 MH+ 979.57340 (A), MH+ 1005.58912 (B), MH+ 1007.60472 (C)의 HRMS
Figure pct00030
==== 전체 상태: ====:
상태: 장치 상태 양호
수행: 가능
====== 이온 공급원: ======:
분무 전압 (V) 3000.9
분무 전류 (μA) 0.91
모세관 온도 (℃) 249.91
Sheath 가스 유동 속도 5.51
Aux 가스 유동 속도 0.05
스윕 가스(Sweep gas) 유동 속도 0.10
Aux. 온도(℃) 40.28
====== 이온계(Ion Optics) ======:
모세관 전압 (V) -0.4
굽힘(Bent) FlatapoleDC (V) 6.1
주입 Flatapole DC (V) 8.1
Trans Multipole DC (V) 3.9
HCD Multipole DC (V) -73.7
RF0 및 RF1 Amp (V) 753.7
RF0 및 RF1 주파수(kHz) 3309.000
RF2 및 RF3 Amp (V) 596.4
RF2 및 RF3 주파수 (kHz) 2802.000
Inter FlatapoleDC (V) 6.97
Quad ExitDC (V) -28.18
C-트랩 도입 렌즈 DC (V) 6.10
C-트랩 RF Amp (V) 1010.0
C-트랩 RF 주파수 (kHz) 3.198
C-트랩 RF 전류 (A) 0.122
C-트랩 배출 렌즈 DC (V) -55.15
HCD 배출 렌즈DC (V) 34.73
====== 진공: ======:
전방 진공 센서 (mbar) 1.63
고 진공 센서 (mbar) 3.18e-09
UHV 센서 (mbar) 2.41e-10
공급원 TMP 속도 1000.0
UHV TMP 속도 1000.0
===== 온도: =====:
분석기 온도 (℃) 29.21
주위 온도 (℃) 24.6
주위 습도 (%) 0.0
공급원 TMP 모터 온도 57.0
공급원 TMP 바닥 온도 47.0
UHV TMP 모터 온도 (℃) 36.0
IOS 히트싱크(Heatsink) 온도(℃) 31.3
HVPS 펠티어(Peltier) 온도(℃) 34.92
Quad. Det. 온도 (℃) 38.25
==== 진단 데이타: ====
수행 확인번호 120.752
수행 me 1052.953
수행 cy: 1.975
CTCD mV -0.75
[표 8] 화합물 MH+ 979.57340 (pic 1), MH+ 1007.60472 (pic 3)의 ESI-LIT-Orbitrap 결과
Figure pct00031

Claims (17)

  1. (i) 각각이 L-구조인 아미노산 Ala, Gln, Leu 및 Ser, 및 Gly, (ii) 아미노비닐티오 그룹; 및 (iii) 포화되거나 불포화된 선형 지방산 쇄(chain)로 이루어지고, 당해 지방산 쇄의 말단 탄소가 1개 또는 2개의 (C1-C6) 알킬 그룹에 의해 임의로 치환되는 구아니딘 그룹을 수반하는 치환체를 포함하는 바이사이클릭 리포란티펩티드(bicyclic lipolantipeptide), 및 이의 임의의 산 염.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 구아니딘 그룹이 2개의 말단 질소 원자에 의해 수반된, 2개의 메틸 그룹으로 치환되는, 바이사이클릭 리포란티펩티드.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 선형 지방 산 쇄가 포화되어 있고 C15 또는 C17 내인, 바이사이클릭 리포란티펩티드.
  4. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 선형 지방산 쇄가 불포화되고 C17 내인, 바이사이클릭 리포란티펩티드.
  5. 청구항 3에 있어서,
    978의 분자량 및 다음의 분자식: C45H78N12O10S을 갖는, 바이사이클릭 리포란티펩티드.
  6. 청구항 3 또는 청구항 5에 있어서,
    하기 식 A인, 바이사이클릭 리포란티펩티드:
    [식 A]
    Figure pct00032
    .
  7. 청구항 3에 있어서,
    1006의 분자량 및 다음의 분자식: C47H82N12O10S를 갖는, 바이사이클릭 리포란티펩티드.
  8. 청구항 3 또는 청구항 7에 있어서,
    하기 식 C인, 바이사이클릭 리포란티펩티드:
    [식 C]
    Figure pct00033
    .
  9. 청구항 4에 있어서,
    1004의 분자량 및 다음의 분자식: C47H80N12O10S를 갖는, 바이사이클릭 리포란티펩티드.
  10. 청구항 4 또는 청구항 9에 있어서,
    하기 식 B인, 바이사이클릭 리포란티펩티드:
    [식 B]
    Figure pct00034

    식 중,
    ( ) m 및 ( ) n은 총 7개의 CH2를 나타냄.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    마이크로박테리움 아르보레센스(Microbacterium arborescens)의 배양물로부터 수득가능한, 바이사이클릭 리포란티펩티드.
  12. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    i) HR MS/MS 단편화(fragmentation)는 치환된 구아니딘의 2개의 피크 특성을 나타내고, 각각 그룹 CH3NH2 및 CH3N=C=NCH3의 손실에 상응하는 31.0427 및 70.0538의 질량 손실을 나타내고;
    ii) 아미노비닐티오 그룹의 2개의 비닐성 양성자(vinylic proton)의 CD3CN/H2O에 있어서 1H NMR 화학적 쉬프트(chemical shift)가 5.5 및 7.2ppm에 있음을 특징으로 하는, 바이사이클릭 리포란티펩티드.
  13. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    항균제(antimicrobial agent), 특히 항박테리아제(antibacterial agent)로서 사용하기 위한 바이사이클릭 리포란티펩티드.
  14. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    사람, 동물 또는 식물에 있어서 미생물 감염, 특히 그람-양성 미생물 감염의 예방 및/또는 치료학적 처치(treatment)에 사용하기 위한 바이사이클릭 리포란티펩티드.
  15. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 따른 바이사이클릭 리포란티펩티드, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및, 경우에 따라 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  16. 식물을 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 따른 바이사이클릭 리포란티펩티드 또는 이의 부가 염 유효량에 노출시키는 단계를 포함하는, 병원체(pathogens)로부터 상기 식물을 예방하거나 치료하기 위한 방법.
  17. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 따른 바이사이클릭 리포란티펩티드, 또는 이의 허용되는 염 및, 경우에 따라, 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는, 식물 위생 조성물(phytosanitary composition).
KR1020187003232A 2015-07-01 2016-07-01 신규한 바이사이클릭 리포란티펩티드, 제조 및 항균제로서의 용도 KR20180024002A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15306065.2 2015-07-01
EP15306065.2A EP3111949A1 (en) 2015-07-01 2015-07-01 New bicyclic lipopeptide, preparation and use as antimicrobial agent
EP15192409.9A EP3111948A1 (en) 2015-07-01 2015-10-30 New bicyclic lipopeptide, preparation and use as antimicrobial agent
EP15192409.9 2015-10-30
PCT/EP2016/065568 WO2017001678A1 (en) 2015-07-01 2016-07-01 New bicyclic lipolantipeptide, preparation and use as antimicrobial agent

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20180024002A true KR20180024002A (ko) 2018-03-07

Family

ID=53539624

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187003232A KR20180024002A (ko) 2015-07-01 2016-07-01 신규한 바이사이클릭 리포란티펩티드, 제조 및 항균제로서의 용도

Country Status (12)

Country Link
US (1) US10308683B2 (ko)
EP (3) EP3111949A1 (ko)
JP (1) JP2018523637A (ko)
KR (1) KR20180024002A (ko)
CN (1) CN108093637A (ko)
AU (1) AU2016287538A1 (ko)
BR (1) BR112017028590A2 (ko)
CA (1) CA2990748A1 (ko)
EA (1) EA201890188A1 (ko)
IL (1) IL256488A (ko)
MX (1) MX2018000092A (ko)
WO (1) WO2017001678A1 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018127494A1 (en) * 2017-01-03 2018-07-12 Deinobiotics Methods of producing lipolanthipeptides
US20190345199A1 (en) * 2017-01-03 2019-11-14 Deinove Lipolanthipeptides and their uses as antimicrobial agents
WO2019073011A1 (en) * 2017-10-12 2019-04-18 Deinove ENZYMATIC SYNTHESIS OF LIPOLANTHIPEPTIDES
CN110669113B (zh) * 2019-10-21 2022-05-17 河北省科学院生物研究所 一种羊毛硫肽前体肽amyA2及其制备方法和应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0401008D0 (en) * 2004-01-17 2004-02-18 Univ Manchester Drug delivery system
US7479481B2 (en) * 2004-05-06 2009-01-20 Molichem Medicines, Inc. Treatment of ocular diseases and disorders using lantibiotic compositions
EP1788074B1 (en) * 2004-08-09 2012-02-22 Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. Novel strains belonging to the genus paenibacillus and method of controlling plant disease by using these strains or culture thereof
GB0714030D0 (en) * 2007-07-18 2007-08-29 Novacta Biosystems Ltd The use of type-B lantibiotic-based compounds having antimicrobial activity
CN103483424A (zh) * 2007-08-09 2014-01-01 诺瓦提斯公司 硫肽前体蛋白质、编码该蛋白质的基因及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN108093637A (zh) 2018-05-29
US10308683B2 (en) 2019-06-04
EP3111949A1 (en) 2017-01-04
EA201890188A1 (ru) 2018-06-29
JP2018523637A (ja) 2018-08-23
CA2990748A1 (en) 2017-01-05
US20180201646A1 (en) 2018-07-19
BR112017028590A2 (pt) 2018-08-28
AU2016287538A1 (en) 2018-01-18
EP3316901A1 (en) 2018-05-09
EP3111948A1 (en) 2017-01-04
WO2017001678A1 (en) 2017-01-05
IL256488A (en) 2018-02-28
MX2018000092A (es) 2018-03-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5756227B2 (ja) ノノムラエ種からの環状ペプチド、その生産プロセス、およびそれを含むマイコバクテリア関連疾病の治療または予防のための薬学的組成物
KR20180024002A (ko) 신규한 바이사이클릭 리포란티펩티드, 제조 및 항균제로서의 용도
US20190112335A1 (en) Antimicrobial Compositions
CN104918951A (zh) 多粘菌素、组合物、制备方法和使用方法
EP1805212B1 (de) Desoxo-nonadepsipeptide
Gan-Jun et al. Anti-methicillin-resistant Staphylococcus aureus assay of azalomycin F5a and its derivatives
US10716797B2 (en) Steroid alkaloids and compositions and kits thereof
CN107235894B (zh) 具有抗耐药菌活性的季铵查尔酮衍生物、其制备方法及应用
CN102596218B (zh) 杆菌肽抗生素
DE102004053407A1 (de) Acylierte Nonadepsipeptide II
CN110938114A (zh) 一类万古霉素硫鎓衍生物、其制备方法、药物组合物和用途
WO2011106630A2 (en) Chrysophaentin antimicrobial compounds that inhibit ftsz protein
Okanya Isolation and structure elucidation of secondary metabolites from the gliding bacteria Ohtaekwangia kribbensis and Hyalangium minutum
RU2795449C1 (ru) Новые депсипептидные соединения, обладающие антибактериальной активностью
JP2018505871A (ja) ナイシンに基づく化合物および細菌感染の処置におけるそれらの使用
RU2572621C2 (ru) Экстракты kibdelos porangium в качестве антибактериальных средств
WO2021205372A2 (en) Antibacterial lipopeptides, pharmaceutical composition and cosmetic composition comprising them, and uses thereof
EP3833338A1 (en) Compounds for use in the treatment of bacterial infections
CN114671790A (zh) 二苯硫醚化合物、抗菌药物及制备方法与应用
Li Antibacterial secondary metabolites from four endophytic fungi, Eupenicillium sp., Diaporthe sp., Fusarium decemcellulare and Alternaria sp.
Sanchez Alternative Approaches to Antimicrobial Therapy: Intercepting Quorum Sensing in Pneumococci (Streptococcus pneumoniae)
Soler Maspons Synthesis of antibiotic cyclopeptides
KR19980017913A (ko) 신규한 바실러스 속 미생물 및 이로부터 마크로락틴 a를 제조하는 방법
US20160200769A1 (en) Compound, Transitmycin, Effective Against Bacterial and Viral Pathogens
Castillo et al. MunumbicinsE-4andE-5: novelbroad-spectrumantibioticsfrom Streptomyces NRRL 3052