CN108093637A - 新型双环脂羊毛硫肽、制备及作为抗微生物剂的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种代表一类新的羊毛硫肽的新型双环脂羊毛硫肽及其盐，它们从树状微杆菌(Microbacterium arborescens)的培养物的制备，以及它们作为抗微生物剂在预防和治疗人、动物或植物的感染中的用途。

Description

新型双环脂羊毛硫肽、制备及作为抗微生物剂的用途
背景技术
抗微生物耐药性使微生物有能力找到旨在规避用于治疗由这种微生物引起的感染的药物的作用的方法，所述抗微生物耐药性被认为是当前的公共卫生问题，这不仅是因为耐药细菌的增长趋势，而且也由于缺乏新的抗生素。
因此，抗生素的需求不断增长，这不仅是由于耐药性问题，而且也由于人口预期寿命的延长。
例如，耐多药的革兰氏阳性菌(MDRGP)仍然继续对科学界提出挑战，其中涉及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，所述金黄色葡萄球菌的第一个青霉素耐药菌株出现在五十多年前。而且，耐多药的革兰氏阴性菌(MDRGN)也已成为一个值得担心的问题，尤其是大肠杆菌(E.coli)耐药菌株。
因此，寻找具有抗微生物性质并且其结构不同于常规抗生素中发现的结构的新化学实体被认为是开发抑制这些耐药性感染的新方法的迫切需求。申请人已经发现，微杆菌属(Microbacterium)对产生具有抗菌活性的新化合物特别有用。目前为止文献中描述的所有微杆菌属菌株均从环境来源分离。临床微生物学诊断实验室接收几乎任何临床样本，包括拭子、粪便、尿液、血液、痰液、脑脊髓液、滑液、以及可能的感染组织。然而，近二十年来，已经从临床样本中分离出了微杆菌属菌株。最初，这些黄色或橙色的发酵性革兰氏阳性杆菌(GPR)被鉴定为CDC棒状杆菌型A-4和A-5细菌，但进一步的研究揭示它们属于微杆菌属(临床样本中遇到的微杆菌属某些种最初鉴定为CDC棒状杆菌型A-4和A-5细菌(PrimaryIdentification of Microbacterium spp.Encountered in Clinical Specimens as CDCCoryneform Group A-4 and A-5 Bacteria)，Guido FUNKE，临床微生物学杂志(JOURNALOF CLINICAL MICROBIOLOGY)，1995年1月，第188-192页)。
发明内容
我们已经表明，微杆菌属的基因组编码产生生物活性次级代谢产物的酶途径。本发明提供了从微杆菌属微生物中分离的具有抗菌活性的新型化合物，更具体地说，所述微杆菌属微生物是树状微杆菌(Microbacterium arborescens)菌株CIP 55.81T(巴斯德研究所菌种保藏中心(Collection Institut Pasteur))。
附图说明
图1显示化合物MH+＝979.57340的1H NMR谱(600MHz，DMSO-d6，300K)的全谱。
图2显示化合物MH+＝979.57340的1H NMR谱(600MHz，CD3CN/D2O，300K)的全谱。
图3显示化合物MH+＝979.57340的1H-1H COSY NMR谱(600MHz，CD3CN/D2O，300K)。
图4显示化合物MH+＝979.57340的C编辑的HSQC谱(从0.0至5.5ppm)(600MHz，CD3CN/D2O，300K)。
图5显示含有氨基乙烯基硫基的化合物MH+＝979.57340的C-编辑的HSQC谱(从5.5至10ppm)(600MHz，CD3CN/D2O，300K)。
图6显示化合物MH+＝979.57340的TOCSY谱(600MHz，CD3CN/D2O，300K)。
图7显示化合物MH+＝979.57340的HMBC NMR谱(600MHz，CD3CN/D2O，300K)。
图8显示化合物MH+＝979.57340的1H NMR谱(700MHz，CD3CN/D2O：3/2，含有0.2％CD3COOD，305K)。
图9显示化合物MH+＝979.57340的残基内NMR分派。
图10显示化合物MH+＝979.57340中构造块的顺序排列的一致性画面。
图11总结了明确定义化合物979.57340中双环羊毛硫肽系统的残基内相关性。
图12显示化合物MH+＝1007.60472的1H NMR谱(600MHz，DMSO-d6，300K)。
图13显示化合物MH+＝1007.60472的1H-1H COSY NMR谱(600MHz，DMSO-d6，300K)。
图14显示化合物MH+＝1007.60472的ROSY NMR谱(600MHz，DMSO-d6，300K)。
图15显示含有氨基乙烯基硫基的化合物1007.60472的C编辑的HSQC谱(从5.0至10ppm)(600MHz，DMSO-d6，300K)。
图16显示化合物MH+＝979.57340(A)、MH+＝1005.58912(B)、MH+＝1007.60472(C)的HPLC-HRMS。
图17显示化合物MH+＝1007.60472的ESI-LIT-Orbitrap。
图18显示化合物MH+＝1005.58917的乙烯基质子的1H NMR谱。
具体实施方式
羊毛硫肽(lantipepetide)是核糖体合成的翻译后修饰的天然产物，分为4类(NatProd Rep.2013年1月，30(1),108-160DOI：10.1039/c2np20085f)，它们中的一些但不是全部显示出抗微生物活性。
本发明涉及代表一类新的羊毛硫肽的双环化合物以及它们的酸式盐，所述双环化合物至少包括(i)下列氨基酸：Gly，以及各自为L构型的Ala、Gln、Leu和Ser；(ii)氨基乙烯基硫基；和(iii)由直链脂肪酸链、特别是C15或C17组成的取代基，所述脂肪酸链可以含有碳-碳双键，所述脂肪链的末端碳带有任选被一个或两个(C1-C6)烷基取代的胍基。所述新型化合物可以根据生物合成途径被分类为羊毛硫肽，尽管它们具有小得多的分子量，而且脂肪酸取代基的存在是羊毛硫肽中的独特特征，因此已经将它们称作脂羊毛硫肽(lipolantipeptide)。
本发明具体涉及如上所述的双环脂羊毛硫肽，其中所述胍基被由两个末端氮原子携带的两个甲基取代。
根据本发明的脂羊毛硫肽可以采取如上限定的几种化合物，尤其是三种化合物(下面指定为A、B和C)的混合物的形式，所述三种化合物在脂肪链结构的水平上是不同的，即，它是饱和C15链或者饱和或不饱和的C17链，后者可以含有如下限定的一个不饱和度。化合物A、B和C本身各自构成本发明的目的。所讨论的化合物的分子量和分子式分别为978和C45H78N12O10S，1006和C47H82N12O10S，以及1004和C47H80N12O10S(下文分别为化合物A、C和B)。
根据本发明的脂羊毛硫肽的特征还在于：
i)HR MS/MS碎片化显示取代的胍的两个峰特征，质量损失为31.0427和70.0538，分别对应于CH3NH2和CH3N＝C＝NCH3基团的损失；
ii)氨基乙烯基硫基的两个乙烯基质子在CD3CN/H2O中的1H NMR化学位移是5.5和7.2ppm。
下文给出化合物A、B和C的表示。
()m和()n代表共7个CH2。
根据本发明的脂羊毛硫肽具有抗微生物特性，使得其可用作预防和治疗人、动物以及植物中由微生物病原体引起的感染的抗微生物剂，这构成了本发明的另一个目的。
根据本发明的脂羊毛硫肽特别可用作针对在有氧或厌氧条件下生长的革兰氏阳性菌的抗菌剂。这些药物可用于抵抗葡萄球菌属(Staphylococcus)的细菌，更具体地说是金黄色葡萄球菌(S.aureus)和凝固酶阴性葡萄球菌如表皮葡萄球菌(S.epidermidis)和腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)(包括多重耐药菌株如耐甲氧西林葡萄球菌，万古霉素中介金黄色葡萄球菌和耐万古霉素金黄色葡萄球菌)，肠球菌属(Enterococcus)(包括屎肠球菌(E.faecium)和包括耐万古霉素的分离株)，链球菌属(Streptococcus)(包括肺炎链球菌(S.pneumoniae)、耐青霉素的肺炎链球菌、无乳链球菌(S.agalactiae)、化脓性链球菌(S.pyogenes)和草绿色(viridans)型的链球菌)，艰难梭菌(Clostridium difficile)，痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)。
此外，它还显示出针对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的抗分枝杆菌活性，结核分枝杆菌是包括获得性免疫缺陷综合征患者在内的人中值得关注的一种重大感染。
除了上述用途之外，根据本发明的脂羊毛硫肽还能够用于保护农作物抵抗植物病原体。可以提到例如红辣椒中由疫霉属(Phytophtora)引起的疫霉枯萎病感染的控制。
本发明还涉及药物组合物，其包含作为活性成分的治疗有效量的至少一种根据本发明的脂羊毛硫肽。在本发明的组合物中，所述活性成分可以与药学上可接受的载体或赋形剂相组合。
根据本发明的药物组合物有利地被配制成通过口服，局部，经皮，舌下，直肠，肠胃外包括静脉内、肌肉内、腹膜内和皮下途径施用，其中个体剂量适合于待治疗的患者。优选的途径是经皮途径。
根据本发明的组合物可以是固体，液体包括溶液、乳液或悬浮液，或者为凝胶剂/乳膏剂的形式，并且以人类医学中常用的药物形式呈现，例如普通的或糖衣片剂，明胶胶囊，颗粒剂，栓剂，注射剂，软膏剂，乳膏剂，凝胶剂；他们是根据习惯的方法进行制备的。活性成分的并入可以利用这些药物组合物中通常使用的赋形剂，例如滑石粉，阿拉伯树胶，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，水性或非水性媒介物，动物或植物来源的脂肪物质，石蜡衍生物，二醇，各种润湿剂，分散剂或乳化剂，防腐剂。这些组合物尤其可以以粉末的形式呈现，所述粉末打算在临用前溶解或悬浮于合适媒介物例如无热原无菌水中。
所施用的根据本发明的脂羊毛硫肽的剂量根据待治疗的病症、所讨论的患者以及施用途径而变化，例如，对于成人，所述剂量可以在每天10μg至10g之间。
实验部分
下文中，通过实施例来具体描述本发明，但是本发明不仅限于这些实施例。
用于产生脂羊毛硫肽的培养基的制备
YPG培养基的组成如下：葡萄糖1g/L；蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)150mM
分开制备10％葡萄糖、2M MOPS和3M KOH溶液。
10％葡萄糖(100毫升)
·10克粉末，蒸馏水定量至100毫升
·在110℃下灭菌30分钟
3M KOH
·MM＝56.11g/mol
·纯度:85％
·56.11*0.85＝47.6g/mol
·称重143.08g粉末，用蒸馏水定量至1L
·在121℃下高压灭菌20分钟
2M MOPS(1L)
·MM＝209.26g/mol
·称重418.52g粉末，定量至920mL
·在无菌条件下在0.22微米上过滤
·加入80mL无菌3M KOH
YPGYPG培养基
·10g/L蛋白胨
·5g/L酵母提取物
在121℃下灭菌20分钟
·加入无菌10％葡萄糖：最终浓度0.1％(最终浓度1g/L)
·加入无菌MOPS(最终浓度150mM)
根据初始pH使用无菌KOH或无菌KCl将pH调节至7.2
树状微杆菌(Microbacterium arborescens)CIP 55.81T的培养
-预培养物(P1)
将含有最终体积为100ml的YPG培养基的500ml烧瓶用原代树状微杆菌菌株库的菌落接种，并在30℃下以160转/分钟(rpm)的速度搅拌温育24小时。然后分光光度计测定600nm处的光密度(OD)，直到树状微杆菌菌株处于其指数生长期的开始/中间处(1<600nm处的OD<3)
通过在YPG琼脂上接种来监测预培养物的纯度。将培养板在30℃下温育48小时。
-在锥形烧瓶中的培养物
将含有最终体积为1000ml YPG培养基的5000ml烧瓶用100ml预培养物(P1)接种，并在30℃下以160rpm搅拌温育96小时。600nm处的初始OD介于0.1和0.3之间。
在96小时结束时通过接种YPG琼脂来监测发酵的纯度。将培养板在30℃下温育48小时。
将培养物在25℃、10,000g下离心45分钟。
回收上清液并保持在4℃
脂羊毛硫肽的提取
从上清液中提取具有抗微生物活性的化合物通过与80:20比率的二氯甲烷/甲醇混合物接触进行液-液提取来执行。使用收集的上清液进行5次所述操作。在50℃、7毫巴、160rpm下在旋转蒸发器中将溶剂浓缩至最终体积20ml。形成沉淀物，取出上清液，将沉淀物(棕色)(PRE1)重新溶解在甲醇中，真空蒸发溶剂。
用二氯甲烷将PRE1洗涤几次，然后用二氯甲烷/甲醇(99/1)洗涤，得到沉淀物2(黄色)(PRE2)。
通过制备型HPLC进行纯化
PRE2通过取出150mg溶于DMSO、H2O、乙腈1/1/1(v/v/v)的混合物中来纯化。将样品手动加载(1.5mL)到由Waters制造的半制备型HPLC的注射系统中。所使用的柱是C18(5微米，150×21mm，Gemini，Phenomenex)。根据下表1中所示的梯度以15mL/min的流速进行洗脱：
表1：作为缓冲液A和B各自浓度的函数的洗脱
分别在15.1min、15.8min和16.3min收集对应于化合物A、B和C的三个峰。
通过MALDI-TOF质谱法和NMR分析所得化合物。所使用的条件在后面的附图中。
化学位移分派和所有观察到的残基内联系分别被总结在表4和图9中。对于氨基乙烯基硫基的乙烯基质子，观察到清楚地指示顺式异构体的7.3Hz的3JHα-Hβ耦合常数。
在图9中，给出了化合物MH+＝979.57340的残基内NMR分派。
对于化合物B，在1H NMR谱(图18)中，在5.18ppm处的多重峰对应于脂肪酸链的两个乙烯基质子。所述化学位移和信号的多重性表明这两个质子不与羰基官能团共轭。
在标准条件下通过Marfey's试剂完全水解和衍生后，通过与标准品进行LC/MS比较，氨基酸Ala、Leu、Gln、Ser被鉴定为具有L构型。
药物组合物的实施例
1/制备用于注射的药物组合物，其含有：
化合物A：500mg
无菌水性赋形剂适量至5cm3
2/制备用于注射的药物组合物，其含有：
化合物C：2g
无菌水性赋形剂适量至5cm3
化合物的抗菌活性
根据临床和实验室标准研究所(Clinical and Laboratory StandardsInstitute)(CLSI)-临床和实验室标准研究所(CLSI，旧称NCCLS)推荐的方案，对分子978(A)、1004(B)和1006(C)进行活性测量：
1.用于有氧生长细菌的稀释抗菌敏感性试验方法(Methods for DilutionAntibacterial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically)；认可标准(Approved Standard)-第十版(2015)。临床和实验室标准研究所文件(Clinical andLaboratory Standards Institute Document)M07-A10。
2.厌氧菌的抗微生物敏感性试验方法(Methods for AntimicrobialSusceptibility Testing of Anaerobic Bacteria)；认可标准(Approved Standard)-第八版(2012)。临床和实验室标准研究所文件(Clinical and Laboratory StandardsInstitute Document)M11-A8。
3.按Springer等人在Journal of Clinical Microbiology(2009,47：1773-1780)中所述测定抗分枝杆菌活性。用MGIT 960和EpiCenter仪器对结核分枝杆菌进行定量药物敏感性试验。
下文表2和表3示出了这些活性。
表2
表3
化合物1006(C)的扩展抗菌活性。
分析数据
化合物A 化合物B 化合物C
外观 灰白色粉末 灰白色粉末 灰白色粉末
分子式 C45H78N12010S C47H80N12010S C47H82N12O10S
分子量 978 1004 1006
HR-MS(M+H)+ 979.57340 1005.58917 1007.60472
表4：化合物MH+＝979.57340在CD3CN/D2O中的NMR数据(采用CD3CN的化学位移作为参照，1H:1.97ppm，13C:0.47ppm)
表5化合物MH+＝979.57340在含有0.2％CD3COOD的CD3CN/D2O中的NMR数据
Fa-双甲基胍基十五烷酸，DhySer-脱羟基丝氨酸，
dCys-脱羧的乙烯基半胱氨酸，*3JHH约7.3Hz
HNi和Hαi-1之间的残基内NOE接触得出化合物MH+＝979.57340中构造块的顺序排列的一致性画面(图10)。
图11总结了明确定义羊毛硫肽双环系统的残基内相关性。
表6：化合物1007.60472在DMSO-d6中的NMR数据(采用DMSO的化学位移作为参照，1H:2.50ppm，13C:39.52ppm)
HPLC柱
Phenomenex Gemini NX,5μ,C18,150X 2mm
UPLC/“Orbitrap Technology”,Exactive,Thermo Fisher Scientific
HESI探针
MS高分辨(准确质量+/-5ppm)
UPLC Accela AS方法
转向阀
开关1(废料) 0-2min
开关2(MS) 2-15min
开关1(废料) 15-18min
泵方法
表7化合物MH+979.57340(A)、MH+1005.58912(B)、MH+1007.60472(C)的HRMS
＝＝＝＝总体状态：＝＝＝＝:
状态： 仪器状态好
性能： 好
＝＝＝＝＝＝离子源：＝＝＝＝＝＝:
＝＝＝＝＝＝离子光学：＝＝＝＝＝＝:
＝＝＝＝＝＝真空：＝＝＝＝＝＝:
＝＝＝＝＝温度：＝＝＝＝＝:
＝＝＝＝诊断数据：＝＝＝＝
表8：化合物MH+979.57340(图1)、MH+1007.60472(图3)的ESI-LIT-Orbitrap的结果

Claims (17)

1.一种双环脂羊毛硫肽及其任何酸式盐，所述双环脂羊毛硫肽包含：(i)氨基酸Gly，以及各自为L构型的Ala、Gln、Leu和Ser；(ii)氨基乙烯基硫基；和(iii)由饱和或不饱和直链脂肪酸链组成的取代基，所述脂肪酸链的末端碳带有任选被一个或两个(C1-C6)烷基取代的胍基。
2.权利要求1的双环脂羊毛硫肽，其特征在于所述胍基被由两个末端氮原子携带的两个甲基取代。
3.权利要求1或2的双环脂羊毛硫肽，其中所述直链脂肪酸链是饱和的并且为C15或C17。
4.权利要求1或2的双环脂羊毛硫肽，其中所述直链脂肪酸链是不饱和的并且为C17。
5.权利要求3的双环脂羊毛硫肽，其分子量为978并且分子式为：C45H78N12O10S。
6.权利要求3或5的双环脂羊毛硫肽，其为式A的化合物：
7.权利要求3的双环脂羊毛硫肽，其分子量为1006并且分子式为：C47H82N12O10S。
8.权利要求3或7的双环脂羊毛硫肽，其为式C的化合物：
9.权利要求4的双环脂羊毛硫肽，其分子量为1004并且分子式为：C47H80N12O10S。
10.权利要求4或9的双环脂羊毛硫肽，其为式B的化合物：
()m和()n代表共7个CH2。
11.权利要求1至10任一项的双环脂羊毛硫肽，其从树状微杆菌的培养物中获得。
12.权利要求1至11任一项的双环脂羊毛硫肽，其特征在于：
i)HR MS/MS碎片化显示取代的胍的两个峰特征，质量损失为31.0427和70.0538，分别对应于CH3NH2和CH3N＝C＝NCH3基团的损失；
ii)氨基乙烯基硫基的两个乙烯基质子在CD3CN/H2O中的1H NMR化学位移是5.5和7.2ppm。
13.权利要求1至12任一项的双环脂羊毛硫肽，其用作抗微生物剂，特别是抗菌剂。
14.权利要求1至12任一项的双环脂羊毛硫肽，其用于预防和/或治疗人、动物或植物中的微生物感染，特别是革兰氏阳性微生物感染。
15.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至12任一项的双环脂羊毛硫肽或其药学上可接受的盐，以及如适用，药学上可接受的载体和/或赋形剂。
16.一种针对病原体对植物进行预防或治疗的方法，所述方法包括将所述植物暴露于有效量的权利要求1至12任一项的双环脂羊毛硫肽或其加成盐。
17.一种植物检疫组合物，所述组合物包含权利要求1至12任一项的双环脂羊毛硫肽或其可接受的盐，以及如适用，可接受的载体和/或赋形剂。
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