KR20180018458A - 아모디아퀸 및 항당뇨 약물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

아모디아퀸 및 항당뇨 약물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a) 아모디아퀸(amodiaquine) 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염; 및 (b) 항당뇨 약물을 유효성분으로 함유하는 PPAR-γ(Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma) 활성화에 따른 부작용을 억제하면서, 당뇨병을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로, 상기 조성물은 PPAR-γ(Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma) 활성화에 반응하는 제2형 당뇨병 및 PPAR-α(Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha) 활성화에 반응하는 비만, 이상지질혈증, 심혈관계질환 및 지방간으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 동시에 예방 또는 치료하기 위한 것이다.

Description

아모디아퀸 및 항당뇨 약물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING DIABETES MELLITUS CONTAINING AMODIAQUINE AND ANTIDIABETIC DRUG}
본 발명은 PPAR-γ 및 PPAR-α를 모두 활성화시키는 아모디아퀸 및 항당뇨 약물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
당뇨병이란 췌장의 베타 세포에서 분비되는 당(glucose) 조절 호르몬인 인슐린이 체내에서 요구하는 양을 생성해내지 못하거나 인슐린이 세포에 제대로 작용하지 못하여 혈액 속의 포도당이 에너지로 이용되지 않고 혈액 속에 쌓여 고혈당을 유발하며 요 중에 당이 검출되는 증상을 말한다. 일반적으로 당뇨병은 치료를 위하여 인슐린이 필수적으로 요구되느냐의 여부에 따라 인슐린 의존형 당뇨병(제1형 당뇨병)과 인슐린 비의존형 당뇨병(제2형 당뇨병)으로 구분된다. 제2형 당뇨병은 인슐린 비의존성 당뇨로써, 인슐린 저항성으로 인해 인슐린 작용이 충분하지 못하거나 인슐린이 상대적으로 부족하여 발병하게 되는데, 전체 당뇨병 환자의 90%가 제2형 당뇨에 속하며, 주로 30대 이후에 발병하므로 성인형 당뇨병이라고도 한다.
당뇨가 오래 지속되면 체내 포도당의 흡수가 정상적으로 일어나지 않기 때문에 당질대사 및 지질대사 그리고 단백질 대사의 이상을 초래하여 고인슐린혈증, 신경 합병증, 당뇨성 망막증(비증식성 망막증, 증식성 망막증, 당뇨성 백내장), 신부전증, 성기능 장애, 피부질환(알레르기), 고혈압, 동맥 경화증, 뇌졸증(중풍), 심장병(심근경색증, 협심증, 심장마비), 괴저와 같은 여러 당뇨 합병증이 발병하게 된다. 따라서, 제2형 당뇨병의 다양한 원인과 병인을 이해하고 개선방안을 마련하기 위해 국내외적으로 포도당의 이송 및 대사과정, 인슐린 신호전달 체계 등에 관한 연구가 활발히 이루어지고 있으나, 아직까지 근원적으로 치료할 수 있는 약물을 개발하지 못하고 있는 실정이다.
현재 알려진 제2형 당뇨병 치료제는 크게 4가지로 분류할 수 있는데, 인슐린의 분비를 유도하는 설포닐우레아(sulfonylureas)계 약물, 근육세포로 당을 이동시키고 간에서 당의 합성을 억제하는 효과를 나타내는 비구아니드(biguanides)계, 소장에서 포도당을 만드는 효소를 억제시키는 알파-글루코시다제(α-glucosidase) 저해제, 지방세포 분화에 관계되는 PPAR(Peroxisome proliferator-activated receptors)-γ를 활성화시키는 티아졸리디온(TZD, thiazolidinedione)계 약물 등이 있다. 그러나 이러한 경구용 혈당 강하제 약물은 저혈당증 유발(설포닐우레아계 약물), 신장독성(비구아니드계 약물), 유산증(비구아니드계 약물), 설사와 배탈(알파-글루코시다제 저해제) 등 많은 부작용을 수반한다.
한편, 페록시좀(Peroxisome)은 이러한 대상 기능 이상의 원인이 되는 세포 내 소기관 중 하나로서, 산소, 포도당, 지질, 및 호르몬의 대사에 있어 중요한 역할을 하며, 세포 증식 및 분화의 조절, 염증 매개체들의 조절에도 폭 넓게 영향을 미친다. 또한 페록시좀은 지질대사와 포도당 대사를 통하여 인슐린 감수성뿐만 아니라 세포막과 비만세포의 형성에 영향을 주고, 산화적 스트레스에 영향을 주어 노화 및 종양 발생에 있어서 중요한 역할을 한다. 페록시좀 증식체 활성화 수용체(Peroxisome proliferator-activated receptors : PPAR)는 리간드(Lignad) 결합에 의해 유전자 발현을 조절하는 핵 수용체중 하나로써, 여러 가지 지방산이 내인성 리간드로 작용한다. 현재 밝혀진 PPAR은 페록시좀 증식체 활성화 수용체 알파(PPAR-α), 페록시좀 증식체 활성화 수용체 베타/델타(PPAR-β/δ), 및 페록시좀 증식체 활성화 수용체 감마(PPAR-γ)가 있다.
PPAR-γ는 지방 조직에서 가장 많이 발견되고, 그 밖에 혈관 내피, 대식세포, 및 췌장의 β세포에서 발견되며, 지방세포의 분화를 조절하고 전신 지질 항상성에 결정적인 역할을 한다. PPAR-γ의 전체적 또는 부분적 활성화 화합물은 제2형 당뇨병의 치료에 특히 효과적이다. 다만, PPAR-γ 활성화시 부작용으로 발생하는 비만, 이상지질혈증, 심혈관계질환, 지방간 등이 문제된다.
PPAR-α는 주로 혈관벽, 간, 심장, 근육, 신장, 및 갈색 지방조직 등에서 발견되며, 작용제인 피브레이트(fibrate)류와 함께 동맥경화증을 예방하거나 발병을 지연시키고, 지방 산화 촉진을 통한 항비만 작용을 한다.
따라서, PPAR의 작용에 의해 조절되는 각종 질환들의 예방, 개선, 또는 치료를 위하여 PPAR의 활성을 보다 효과적으로 조절할 수 있는 새로운 화합물 발굴에 대한 필요성이 제기되고 있다.
이에 본 발명자들은 우수한 항당뇨 활성을 가지며 안전하게 적용될 수 있는 화합물에 대하여 연구하던 중, 아모디아퀸(amodiaquine)에 주목하게 되었다.
아모디아퀸(amodiaquine)은 항말라리아성 화합물로 말라리아에 관한 치료제 연구가 여러 편 보고되어 있다. 또한, 종래 아모디아퀸에 대한 특허 등록된 기술을 살펴보면, 경구투여용 항말라리아 배합 제제 및 그의 제조방법(대한민국 특허등록 제10-0623322호), 항말라리아 제제로서 피페라진 유도체(대한민국 특허등록 제10-1423785호)등이 있다.
하지만, PPAR의 작용에 의해 조절되는 질환으로서, PPAR-γ 활성화시 부작용으로 발생하는 비만, 이상지질혈증, 심혈관계질환, 지방간 등을 억제하면서, 동시에, 당뇨병의 예방 또는 치료를 위한 아모디아퀸 및 항당뇨 약물의 복합제제에 대한 연구 및 기술은 전무한 실정이다.
본 발명은 (a) 아모디아퀸 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염; 및 (b) 항당뇨 약물을 유효성분으로 함유하는 조성물의 새로운 용도, 즉, PPAR-γ 활성화에 따른 부작용을 억제하면서, 당뇨병을 예방 또는 치료용으로서의 신규 용도를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 (a) 하기 화학식 1로 표시되는 아모디아퀸(amodiaquine) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염; 및
(b) 메트포민(metformin), 부포르민(buformin) 및 펜포르민(phenformin)로 이루어진 군으로부터 선택된 비구아니드 약물(Biguanide);
트로글리타존(troglitazone), 시글리타존(ciglitazone), 로지글리타존(rosiglitazone), 피오글리타존(pioglitazone) 및 엔글리타존(englitazone)로 이루어진 군으로부터 선택된 인슐린 감작제(insulin sensitizer);
시타글립틴(Sitagliptin), 리나글립틴(Linagliptin), 빌다글립틴(Vildagliptin), 제미글립틴(Gemigliptin), 삭사글립틴(Saxagliptin), 알로글립틴 (Alogliptin), 테네리글립틴(Teneligliptin), 아나글립틴 (Anagliptin) 및 에보글립틴(Evogliptin)로 이루어진 군으로부터 선택된 디피피포 억제제 (Dipeptidyl peptidase 4 (DPP-4) inhibitor);
다파글리플로진(Dapagliflozin), 카나글리플로진(Canagliflozin), 엠파글리플로진(Empagliflozin), 이프라글리플로진(Ipragliflozin), 토포글리플로진(Tofogliflozin), 루세오글리플로진(Luseogliflozin), 레모글리플로진 (Remogliflozin), 레모글리플로진 에타보네이트(Remogliflozin etabonate) 및 에르투글리플로진(Ertugliflozin)로 이루어진 군으로부터 선택된 나트륨 포도당 공동수송체 억제제(Sodium-glucose co-transporter 2 (SGLT2) inhibitor);
엑세나타이드(Exenatide), 릭시세나타이드(Lixisenatide), 리라글루타이드(Liraglutide), 알비글루타이드 (Albiglutide) 및 둘라글루타이드 (Dulaglutide)로 이루어진 군으로부터 선택된 글루카곤양 펩티드-1 작용제(Glucagon-like peptide 1 (GLP1) agonist); 및
글리벤클라미드(glybenclamide, glyburide), 글리피지드(glipizide), 글리클라지드(gliclazide), 글리메피리드(glimepiride), 톨라자미드(tolazamide), 톨부타미드(tolbutamide), 아세토헥사미드(acetohexamide), 카르부타미드(carbutamide), 클로르프로파미드(chlorpropamide), 글리보르누리드(glibornuride), 글리퀴돈 (gliquidone), 글리센티드(glisentide), 글리소아미드(glisolamide), 글리속세피드 (glisoxepide), 글리클로피아미드(glyclopyamide), 글리실아미드(glycylamide), 글리펜티드(glipentide), 레파글리니드(repaglinide) 및 나테글리니드(nateglinide)로 이루어진 군으로부터 선택된 인슐린 분비 촉진제(insulin secretagogue);
아카보스(acarbose), 보글리보스(voglibose), 에미글리테이드(emiglitate) 및 미글리톨(miglitol)로 이루어진 군으로부터 선택된 알파-글루코시다제 억제제 (α-glucosidase inhibitor);
리모나반트(Rimonabant), 오테나반트(Otenabant), 이비나반트(Ibinabant) 및 수리나반트(Surinabant)로 이루어진 군으로부터 선택된 카나비노이드 수용체-1 길항제(cannabinoid receptor 1 antagonist);
시클로-히스프로, 또는 아연염 및 시클로-히스프로 함유 조성물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항당뇨 약물을 유효성분으로 함유하는 PPAR-γ(Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma) 활성화에 따른 부작용을 억제하면서, 당뇨병을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00001
.
상기 조성물은 PPAR-γ(Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma) 활성화에 반응하는 제2형 당뇨병 및 PPAR-α(Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha) 활성화에 반응하는 비만, 이상지질혈증, 심혈관계질환 및 지방간으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 동시에 예방 또는 치료하기 위한 것일 수 있다.
상기 이상지질혈증은 고지혈증(hyperlipidemia), 고중성지방혈증(Hypertriglyceridemia), 및 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 아모디아퀸 및 상기 항당뇨 약물의 중량비는 1:0.01 내지 1:500일 수 있다.
상기 조성물의 일일 투여량은 8㎎/㎏ 내지 20㎎/㎏일 수 있다.
본 발명에 따른 PPAR-γ 활성화에 따른 부작용을 억제하면서, 당뇨병을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물은 (a) 아모디아퀸 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염; 및 (b) 항당뇨 약물을 유효성분으로 함유하는 것으로, 아모디아퀸은 PPAR-α와 PPAR-γ의 활성을 촉진할 수 있다.
따라서, 이러한 아모디아퀸 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 메트포민 등 비구아니드 약물과 같은 항당뇨 약물을 혼합한 복합제제의 경우, 단독제제의 경우에 비해 당신생 작용 억제 및 지질대사 관련 중성지방과 인지질의 생합성 억제 등에 큰 상승 효과를 보이는바, 본 발명의 조성물은 PPAR-γ 활성화에 반응하는 제2형 당뇨병 및 PPAR-α 활성화에 반응하는 비만, 이상지질혈증, 심혈관계질환 및 지방간으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 동시에 예방 또는 치료하는데 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1(a) 및 도 1(b)는 아모디아퀸의 PPAR-γ 활성화 효과를 측정한 그래프이고, 도 1(c) 및 도 1(d)는 PPAR-α 활성화 효과를 측정한 그래프이다.
도 2는 아모디아퀸을 쥐 유래 근육세포인 C2C12 myotube 세포주에 24시간 처리하였을 때, 포도당 유사체의 흡수치를 측정한 그래프이다.
도 3(a)는 아모디아퀸 섭취가 마우스의 공복 혈당 농도에 미치는 영향을 확인한 그래프이고, 도 3(b)는 아모디아퀸 섭취가 마우스에게 포도당 투여 후 시간 경과에 따른 혈당의 변화에 미치는 영향을 확인한 당내성 검사(IPGTT) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 아모디아퀸 섭취가 마우스의 당화혈색소 값에 미치는 영향을 확인한 그래프이다.
도 5(a)는 고지방 식이로 유도하는 비만 마우스(High fat diet-induced obesity mice)를 대상으로 고지방 섭취와 동시에 아모디아퀸 투여를 하였을 때 마우스의 비만억제현상을 보여주는 그래프이고, 도 5(b)는 마우스의 하루 평균 사료 섭취량을 나타난 그래프이다. 도 5(c)는 고지방 식이로 장기(20주) 유도한 비만 마우스(High fat diet-induced obesity mice)에 아모디아퀸 투여에 의한 비만 치료현상을 나타낸 그래프이며, 도 5(d)는 각 마우스의 하루 평균 사료 섭취량을 확인한 그래프이다.
도 6는 아모디아퀸의 섭취에 의한 저온도에 노출 시 고지방 유도 비만 마우스의 열생산을 나타낸 그래프이다.
도 7(a)는 고지방 식이와 동시에 아모디아퀸을 투여를 함께 진행한 마우스를 대상으로 포도당 투여 후 시간 경과에 따른 혈당의 변화에 미치는 영향을 확인한 당내성 검사(OGTT) 결과를 나타낸 그래프이다. 도 7(b)는 고지방 식이와 동시에 아모디아퀸을 투여를 함께 진행한 마우스를 대상으로 인슐린 주사 후 시간 경과에 따른 혈당 농도 변화를 확인한 인슐린 수용성 검사(IPITT)를 나타낸 그래프이다. 도 7(c)는 고지방 식이로 장기(20주) 유도한 마우스를 대상으로 아모디아퀸을 투여한 후 인슐린을 주사하여 시간 경과에 따른 혈당 농도 변화를 확인한 인슐린 수용성 검사(IPITT)를 나타낸 그래프이다.
도 8(a)는 아모디아퀸이 고지방식이로 14주 동안 사육한 실험동물에서 간을, 도 8(b)는 아모디아퀸이 고지방식이로 22주 동안 사육한 실험동물에서 간을Hematoxylin-Eosin으로 각각 염색하여 지방 축적으로 인한 간 세포의 조직학적 변화를 확인한 그래프이다.
도 9(a)는 아모디아퀸을 섭취한 고지방 유도 비만 마우스의 간 조직에서, 도 9(b)는 근육조직에서, 도 9(c)는 지방조직에서 지방산 산화와 관련된 유전자들의 발현을 측정한 결과를 각각 나타낸 그래프이다.
도 10는 아모디아퀸을 섭취한 고지방 유도 비만 마우스의 지방조직에서 항염증과 관련된 유전자들의 발현을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 아모디아퀸 및 메트포민의 복합제제를 사람 유래 간세포인 HepG2 세포주에 24시간 처리하였을 때, 당신생 작용에 관련된 유전자 PEPCK의 발현을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 아모디아퀸 및 메트포민의 복합제제를 사람 유래 간세포인 HepG2 세포주에 24시간 처리하였을 때, 지질대사 관련 중성지방과 인지질의 생합성에 관련된 유전자 SREBP-1의 발현을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 인슐린 저항성 유도를 위한 팔미트산과 함께, 아모디아퀸 및 메트포민의 복합제제를 분화된 쥐 유래 근육세포인 C2C12 세포에 16시간 처리하였을 때, 인슐린 반응성에 관련된 유전자 GLUT4의 발현을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14(a)는 아모디아퀸 및 메트포민을 1:50의 중량비로 투여한 마우스, 도 14(b)는 아모디아퀸 및 메트포민을 1:150의 중량비로 투여한 마우스, 도 14(c)는 아모디아퀸 및 메트포민을 1:300의 중량비로 투여한 마우스, 도 14(d)는 아모디아퀸 및 메트포민을 1:500의 중량비로 투여한 마우스를 대상으로 포도당 투여 후 시간 경과에 따른 혈당의 변화에 미치는 영향을 확인한 당내성 검사(OGTT) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 15(a)는 아모디아퀸 및 시타글립틴을 1:1의 중량비로 투여한 마우스, 도 15(b)는 아모디아퀸 및 시타글립틴을 1:2의 중량비로 투여한 마우스, 도 15(c)는 아모디아퀸 및 시타글립틴을 1:10의 중량비로 투여한 마우스, 도 15(d)는 아모디아퀸 및 시타글립틴을 1:20의 중량비로 투여한 마우스를 대상으로 공복혈당의 변화에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 그래프이며, 도 15(e)는 아모디아퀸 및 시타글립틴을 1:1의 중량비로 투여한 마우스, 도 15(f)는 아모디아퀸 및 시타글립틴을 1:2의 중량비로 투여한 마우스, 도 15(g)는 아모디아퀸 및 시타글립틴을 1:10의 중량비로 투여한 마우스, 도 15(h)는 아모디아퀸 및 시타글립틴을 1:20의 중량비로 투여한 마우스를 대상으로 포도당 투여 후 시간 경과에 따른 혈당의 변화에 미치는 영향을 확인한 당내성 검사(OGTT) 결과를 나타낸 그래프이며, 도 15(i)는 아모디아퀸 및 시타글립틴을 1:1의 중량비로 투여한 마우스, 도 15(j)는 아모디아퀸 및 시타글립틴을 1:2의 중량비로 투여한 마우스, 도 15(k)는 아모디아퀸 및 시타글립틴을 1:10의 중량비로 투여한 마우스, 도 15(l)은 아모디아퀸 및 시타글립틴을 1:20의 중량비로 투여한 마우스를 대상으로 당화혈색소 값에 미치는 영향을 확인한 그래프이다.
도 16(a)는 아모디아퀸 및 다파글리플로진을 1:0.02의 중량비로 투여한 마우스, 도 16(b)는 아모디아퀸 및 다파글리플로진을 1:0.2의 중량비로 투여한 마우스, 도 16(c)는 아모디아퀸 및 다파글리플로진을 1:2의 중량비로 투여한 마우스를 대상으로 공복혈당의 변화에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 그래프이며, 도 16(d)는 아모디아퀸 및 다파글리플로진을 1:0.02의 중량비로 투여한 마우스, 도 16(e)는 아모디아퀸 및 다파글리플로진을 1:0.2의 중량비로 투여한 마우스, 도 16(f)는 아모디아퀸 및 다파글리플로진을 1:2의 중량비로 투여한 마우스를 대상으로 포도당 투여 후 시간 경과에 따른 혈당의 변화에 미치는 영향을 확인한 당내성 검사(OGTT) 결과를 나타낸 그래프이며, 도 16(g)는 아모디아퀸 및 다파글리플로진을 1:0.02의 중량비로 투여한 마우스, 도 16(h)는 아모디아퀸 및 다파글리플로진을 1:0.2의 중량비로 투여한 마우스, 도 16(i)는 아모디아퀸 및 다파글리플로진을 1:2의 중량비로 투여한 마우스를 대상으로 당화혈색소 값에 미치는 영향을 확인한 그래프이다.
도 17(a)는 아모디아퀸 및 엑세네타이드를 1:0.001의 중량비로 투여한 마우스, 도 17(b)는 아모디아퀸 및 엑세네타이드를 1:0.005의 중량비로 투여한 마우스를 대상으로 포도당 투여 후 시간 경과에 따른 혈당의 변화에 미치는 영향을 확인한 당내성 검사(OGTT) 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명자들은 PPAR-α와 PPAR-γ를 모두 활성화시킬 수 있는 아모디아퀸 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 항당뇨 약물을 혼합한 복합제제의 경우, 단독제제의 경우에 비해 혈당 조절 및 지방축적 억제(특히, 간조직의 중성지방축적 억제)에 큰 상승 효과를 보이는바, PPAR-γ 활성화에 따른 부작용을 억제하면서, 당뇨병을 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 아모디아퀸이 PPAR-γ와 PPAR-α의 이중 리간드로 작용하는지 알아보기 위하여 벡터를 사용하여 PPAR-γ와 PPAR-α의 활성을 측정하였고(실시예 1 참조), 아모디아퀸의 포도당 흡수능이 증가하여 혈당 저해 효과가 있는지 여부를 확인하기 위하여 마우스의 근육세포주로 포도당 흡수능 평가 실험을 진행하였다(실시예 2 참조). 또한, 아모디아퀸에 의한 혈당 강하 및 혈당 조절 효과, 당화혈색소(HbA1C) 감소 효과, 몸무게 감소 효과, 열생산 효과 및 지방간 예방 효과를 마우스에서 알아보았다(실시예 3 내지 8 참조). 또한, 아모디아퀸 투여가 간, 근육, 지방조직 내 PPAR-α 활성화에 따른 타겟 유전자들(ACOX, CPT-1 및 mCAD)의 발현을 조절하여 지방산 분해를 촉진시킬 수 있음을 확인하였고(실시예 9 참조), 아모디아퀸 투여가 지방조직 내 항염증 반응에 따른 타겟 유전자들(TNFα, MCP-1 및 iNOS)의 발현을 억제시킬 수 있음을 확인하였다(실시예 10 참조).
그 결과, 아모디아퀸 처리에 의한 PPAR-γ와 PPAR-α 활성화와 그에 따른 일련의 반응들이 혈당 조절 및 지방축적 억제에 효과적임을 확인하였다.
한편, 본 발명의 다른 실시예에서는 아모디아퀸 및 메트포민의 복합제제의 처리에 따른 당신생 작용 억제에 대한 상승 효과를 측정하였고(실시예 11 참조), 지질대사 관련 중성지방과 인지질의 생합성 억제에 대한 상승 효과를 측정하였으며(실시예 12 참조), 팔미트산에 의해 유도된 인슐린 저항성 상태에서 근육세포 내 GLUT4 유전자의 발현을 증가시킬 수 있음을 확인하였다(실시예 13 참조).
또한, 본 발명의 또 다른 실시예에서는 아모디아퀸 및 메트포민의 복합제제의 투여에 의한 마우스의 혈당 조절 효과에 미치는 영향을 확인하였고(실시예 14 참조), 본 발명의 또 다른 실시예에서는 아모디아퀸 및 시타글립틴의 복합제제 투여에 의한 마우스의 혈당 강하, 혈당조절 효과 및 당화혈색소 함량에 미치는 영향을 확인하였고(실시예 15), 본 발명의 또 다른 실시예에서는 아모디아퀸 및 다파글리플리진의 복합제제 투여에 의한 마우스의 혈당 강하, 혈당조절 효과 및 당화혈색소 함량에 미치는 영향을 확인하였으며(실시예 16), 본 발명의 또 다른 실시예에서는 아모디아퀸 및 엑세네타이드의 복합제제 투여에 의한 마우스의 혈당조절 효과에 미치는 영향을 확인하였다(실시예 17).
그 결과, 아모디아퀸 및 항당뇨 약물의 복합제제를 처리한 경우, 단독제제를 처리한 경우에 비해 혈당 조절 및 지방축적 억제(특히, 간조직의 중성지방축적 억제)에 큰 상승 효과를 가짐을 확인하였다.
따라서, 본 발명은
(a) 하기 화학식 1로 표시되는 아모디아퀸(amodiaquine) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염; 및
(b) 메트포민(metformin), 부포르민(buformin) 및 펜포르민(phenformin)로 이루어진 군으로부터 선택된 비구아니드 약물(Biguanide);
트로글리타존(troglitazone), 시글리타존(ciglitazone), 로지글리타존(rosiglitazone), 피오글리타존(pioglitazone) 및 엔글리타존(englitazone)로 이루어진 군으로부터 선택된 인슐린 감작제(insulin sensitizer);
시타글립틴(Sitagliptin), 리나글립틴(Linagliptin), 빌다글립틴(Vildagliptin), 제미글립틴(Gemigliptin), 삭사글립틴(Saxagliptin), 알로글립틴 (Alogliptin), 테네리글립틴(Teneligliptin), 아나글립틴 (Anagliptin) 및 에보글립틴(Evogliptin)로 이루어진 군으로부터 선택된 디피피포 억제제 (Dipeptidyl peptidase 4 (DPP-4) inhibitor);
다파글리플로진(Dapagliflozin), 카나글리플로진(Canagliflozin), 엠파글리플로진(Empagliflozin), 이프라글리플로진(Ipragliflozin), 토포글리플로진(Tofogliflozin), 루세오글리플로진(Luseogliflozin), 레모글리플로진 (Remogliflozin), 레모글리플로진 에타보네이트(Remogliflozin etabonate) 및 에르투글리플로진(Ertugliflozin)로 이루어진 군으로부터 선택된 나트륨 포도당 공동수송체 억제제(Sodium-glucose co-transporter 2 (SGLT2) inhibitor);
엑세나타이드(Exenatide), 릭시세나타이드(Lixisenatide), 리라글루타이드(Liraglutide), 알비글루타이드 (Albiglutide) 및 둘라글루타이드 (Dulaglutide)로 이루어진 군으로부터 선택된 글루카곤양 펩티드-1 작용제(Glucagon-like peptide 1 (GLP1) agonist); 및
글리벤클라미드(glybenclamide, glyburide), 글리피지드(glipizide), 글리클라지드(gliclazide), 글리메피리드(glimepiride), 톨라자미드(tolazamide), 톨부타미드(tolbutamide), 아세토헥사미드(acetohexamide), 카르부타미드(carbutamide), 클로르프로파미드(chlorpropamide), 글리보르누리드(glibornuride), 글리퀴돈 (gliquidone), 글리센티드(glisentide), 글리소아미드(glisolamide), 글리속세피드 (glisoxepide), 글리클로피아미드(glyclopyamide), 글리실아미드(glycylamide), 글리펜티드(glipentide), 레파글리니드(repaglinide) 및 나테글리니드(nateglinide)로 이루어진 군으로부터 선택된 인슐린 분비 촉진제(insulin secretagogue);
아카보스(acarbose), 보글리보스(voglibose), 에미글리테이드(emiglitate) 및 미글리톨(miglitol)로 이루어진 군으로부터 선택된 알파-글루코시다제 억제제 (α-glucosidase inhibitor);
리모나반트(Rimonabant), 오테나반트(Otenabant), 이비나반트(Ibinabant) 및 수리나반트(Surinabant)로 이루어진 군으로부터 선택된 카나비노이드 수용체-1 길항제(cannabinoid receptor 1 antagonist);
시클로-히스프로, 또는 아연염 및 시클로-히스프로 함유 조성물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항당뇨 약물을 유효성분으로 함유하는
PPAR-γ(Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma) 활성화에 따른 부작용을 억제하면서, 당뇨병을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00002
.
상기 항당뇨 약물은 현재 임상 등 개발 중이거나 제품화되어 있는 약물로서, 구체적으로, 비구아니드 약물(Biguanide), 인슐린 감작제(insulin sensitizer), 디피피포 억제제(DPP-4 inhibitor), 나트륨 포도당 공동수송체 억제제(Sodium-glucose co-transporter 2 (SGLT2) inhibitor), 글루카곤양 펩티드-1 작용제 (Glucagon-like peptide 1(GLP1) agonist), 인슐린 분비 촉진제(insulin secretagogue), 알파-글루코시다제 억제제(α-glucosidase inhibitor), 카나비노이드 수용체-1 길항제(cannabinoid receptor 1 antagonist), 및 시클로-히스프로 또는 아연염 및 시클로-히스프로 함유 조성물일 수 있고, 비구아니드 약물(Biguanide), 디피피포 억제제(DPP-4 inhibitor), 나트륨 포도당 공동수송체 억제제(Sodium-glucose co-transporter 2 (SGLT2) inhibitor) 및 글루카곤양 펩티드-1 작용제 (Glucagon-like peptide 1(GLP1) agonist)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
보다 구체적으로, 상기 비구아니드 약물(Biguanide)은 메트포민(metformin), 부포르민(buformin) 및 펜포르민(phenformin)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고; 상기 인슐린 감작제(insulin sensitizer)는 트로글리타존(troglitazone), 시글리타존(ciglitazone), 로지글리타존(rosiglitazone), 피오글리타존(pioglitazone) 및 엔글리타존(englitazone)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고; 상기 디피피포 억제제 (Dipeptidyl peptidase 4 (DPP-4) inhibitor)는 시타글립틴(Sitagliptin), 리나글립틴(Linagliptin), 빌다글립틴(Vildagliptin), 제미글립틴 (Gemigliptin), 삭사글립틴 (Saxagliptin), 알로글립틴 (Alogliptin), 테네리글립틴 (Teneligliptin), 아나글립틴 (Anagliptin) 및 에보글립틴(Evogliptin)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고; 상기 나트륨 포도당 공동수송체 억제제(Sodium-glucose co-transporter 2 (SGLT2) inhibitor)는 아카나글리플로진(Canagliflozin), 다파글리플로진(Dapagliflozin), 엠파글리플로진(Empagliflozin), 이프라글리플로진 (Ipragliflozin), 토포글리플로진(Tofogliflozin), 루세오글리플로진(Luseogliflozin), 레모글리플로진 (Remogliflozin), 레모글리플로진 에타보네이트 (Remogliflozin) 및 에르투글리플로진 (Ertugliflozin)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고; 상기 글루카곤양 펩티드-1 작용제(Glucagon-like peptide 1 (GLP1) agonist)는 엑세나타이드(Exenatide), 릭시세나타이드(Lixisenatide), 리라글루타이드(Liraglutide), 알비글루타이드 (Albiglutide) 및 둘라글루타이드 (Dulaglutide)로 이루어진 군으로 선택될 수 있고; 상기 인슐린 분비 촉진제(insulin secretagogue)는 글리벤클라미드(glybenclamide, glyburide), 글리피지드(glipizide), 글리클라지드(gliclazide), 글리메피리드(glimepiride), 톨라자미드(tolazamide), 톨부타미드(tolbutamide), 아세토헥사미드(acetohexamide), 카르부타미드(carbutamide), 클로르프로파미드(chlorpropamide), 글리보르누리드(glibornuride), 글리퀴돈 (gliquidone), 글리센티드(glisentide), 글리소아미드(glisolamide), 글리속세피드 (glisoxepide), 글리클로피아미드(glyclopyamide), 글리실아미드(glycylamide), 글리펜티드(glipentide), 레파글리니드(repaglinide) 및 나테글리니드(nateglinide)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 상기 알파-글루코시다제 억제제(α-glucosidase inhibitor)는 아카보스(acarbose), 보글리보스(voglibose), 에미글리테이드(emiglitate) 및 미글리톨(miglitol)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고; 상기 카나비노이드 수용체-1 길항제(cannabinoid receptor 1 antagonist)는 리모나반트(Rimonabant), 오테나반트(Otenabant), 이비나반트(Ibinabant) 및 수리나반트(Surinabant)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
한편, 시클로-히스프로(Cyclo-his-pro) 또는 아연염 및 시클로-히스프로 함유 조성물에서, 시클로-히스프로는 아연과 아연 대사를 촉진하는 효소로서 정제된 시클로-히스프로를 사용할 수 있고, 아연염은 아연 양이온 및 염화물, 황산염 등 음이온을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 인슐린분해효소(IDE) 합성을 촉진시키고 활성도를 증가시켜 인슐린 저항성을 개선시킬 수 있다.
즉, 아모디아퀸 또는 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 단독제제로 사용하거나, 메트포민 등 비구아니드 약물과 같은 항당뇨 약물을 단독제제로 사용하는 경우에도 혈당을 조절하고, 지방축적을 억제하는 등 어느 정도 효과를 보이나, 이는 미미한 수준에 불과하다. 그러나, 이들에 대한 복합제제의 경우에는 혈당 조절 및 지방축적 억제(특히, 간조직의 중성지방축적 억제) 등에 큰 상승 효과를 가질 수 있다.
이들에 대한 복합제제를 포함하는 조성물은 PPAR-γ 활성화에 반응하는 제2형 당뇨병 및 PPAR-α 활성화에 반응하는 비만, 이상지질혈증, 심혈관계질환 및 지방간으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 동시에 예방 또는 치료하기 위한 것일 수 있다. 상기 비만, 이상지질혈증, 심혈관계질환 및 지방간으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상은 PPAR-γ 활성화에 따른 부작용으로 볼 수 있다. 이때, 상기 이상지질혈증은 고지혈증(hyperlipidemia), 고중성지방혈증(Hypertriglyceridemia), 및 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 아모디아퀸 및 상기 항당뇨 약물의 중량비는 1:0.01 내지 1:500일 수 있다. 구체적으로, 상기 항당뇨 약물이 비구아니드 약물(Biguanide)인 경우, 상기 아모디아퀸 및 상기 항당뇨 약물의 중량비는 1:50 내지 1:500인 것이 바람직하고, 1:300 내지 1:500인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 항당뇨 약물이 디피피포 억제제(DPP-4 inhibitor)인 경우, 상기 아모디아퀸 및 상기 항당뇨 약물의 중량비는 1:1 내지 1:20인 것이 바람직하고, 1:10 내지 1:20인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 항당뇨 약물이 나트륨 포도당 공동수송체 억제제(Sodium-glucose co-transporter 2 (SGLT2) inhibitor)인 경우, 상기 아모디아퀸 및 상기 항당뇨 약물의 중량비는 1:0.02 내지 1:2인 것이 바람직하고, 1:1 내지 1:2인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 항당뇨 약물이 글루카곤양 펩티드-1 작용제 (Glucagon-like peptide 1(GLP1) agonist)인 경우, 상기 아모디아퀸 및 상기 항당뇨 약물의 중량비는 1:0.01 내지 1:0.05인 것이 바람직하고, 1:0.02 내지 1:0.05인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
이때, 아모디아퀸의 중량비가 너무 커지게 되면, 세포 독성에 따른 문제점이 있고, 항당뇨 약물의 중량비가 너무 커지게 되면, 상대적인 아모디아퀸의 중량비가 작아지게 되어 PPAR-γ 및 PPAR-α를 충분히 활성화시키지 못하는 문제점이 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 당뇨병에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
이에, 약학적 조성물로 제조하기 위하여 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제, 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소, 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 치료효과를 증진시키기 위하여, 바람직하게는 병용되는 약물과 동시에(simultaneous), 별도로(separate), 또는 순차적(sequential)으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 투여, 비강 내 투여, 경기관지 투여, 동맥 주사, 정맥 주사, 피하 주사, 근육 주사, 또는 복강 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 일일 투여량은 약 0.0001㎎/㎏ 내지 100mg/kg이고, 바람직하게는 8㎎/㎏ 내지 20㎎/㎏이며, 하루 일회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물의 일일 투여량이 8㎎/㎏ 내지 20㎎/㎏를 유지하는 경우, PPAR-γ 및 PPAR-α를 모두 활성화시킬 수 있으면서도, 세포 독성으로 인한 문제점을 최소화할 수 있는 이점을 가진다.
본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 PPAR-γ 활성화에 따른 부작용을 억제하면서, 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
나아가, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 포함하는 PPAR-γ 활성화에 따른 부작용을 억제하면서, 당뇨병을 예방 또는 치료하기 위한 용도를 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[준비예]
하기 실시예에서 사용한 아모디아퀸(Amodiaquine), 메트포민(metformin)은 씨그마알드리치(주)에서 구입하여 사용하였고, 시타글립틴(Sitagliptin)은 Cayman Chemical에서 구입하여 사용하였으며 다파글리플로진(Dapagliflozin), 엑세나타이드(Exenatide)는 (주)성우바이오팜에서 구입하였다.
[실시예]
실시예 1. 아모디아퀸에 의한 PPAR-γ 또는 PPAR-α의 활성화 측정
아모디아퀸이 PPAR-γ 또는 PPAR-α의 리간드로 작용하는지 알아보기 위하여, 3가지 벡터를 사용하였다. pZeo 벡터의 SV40 프로모터에 효모의 전사인자인 GAL4-DBD(DNA binding domain)와 사람 PPAR-γ-LBD(ligand binding domain) 또는 PPAR-α-LBD(ligand binding domain)를 발현하는 벡터와 GAL4 유전자가 결합할 수 있는 염기서열(5'-CTCGGAGGACAGTACTCCG-3')이 8번 반복된 유전자를 리포터 유전자인 루시퍼라제(luciferase)에 결합시킨 벡터 및 트랜스팩션 대조군으로 베타 갈락토시다제(β-galactosidase)를 발현하는 벡터를 사용하여 공지의 방법(Cell, 68: 879-887, 1992)에 따라 수행하였다.
루시퍼라아제 발현의 활성화는 BE(2)C 세포를 GAL4-PPAR-γ-LBD 플라스미드 또는 GAL4-PPAR-α-LBD 플라스미드와 GAL4-루시퍼라제 벡터, β-galactosidase 벡터로 형질변형시킨 6시간 후, 아모디아퀸을 20시간 처리한 세포를 5% CO2 인큐베이터에서 키운 다음 측정하였다. 이 때, 아모디아퀸을 농도별(0.01~50 μM)로 함께 처리한 실험군, DMSO(Dimethyl Sulfoxide) 0.3%를 처리한 대조군, PPAR-γ 리간드로서 공지된 화합물인 로지글리타존(Sigma, USA)을 농도별(0.001~50 μM)로 함께 처리한 양성 대조군, PPAR-α 리간드로서 공지된 화합물인 WY-14,643(Sigma, USA)을 농도별(0.01~50 μM)로 함께 처리한 양성 대조군 및 아모디아퀸의 유사체로서 공지된 화합물인 클로로퀸(Chloroquine)(7-chloro-4-(4-diethylamino-1-methylbutylamino)quinoline)(Sigma, USA)을 농도별(0.001~50 μM)로 함께 처리한 양성 대조군을 비교하였다. 상기 실험 결과는 실험군과 대조군의 t검증을 실시하여 그 유의성을 검증하였으며, 통계학적으로 유의한 차이를 보였다.
그 결과, 도 1(a) 및 도 1(b)에 나타낸 바와 같이, PPAR-γ 리간드로서 공지된 화합물인 로지글리타존을 처리한 양성대조군에 비하여 아모디아퀸을 처리한 군이 농도 의존적으로 더 높은 PPAR-γ 활성을 나타냄을 알 수 반면, PPAR-α 리간드로서 공지된 화합물인 WY-14,643을 처리한 양성대조군 및 아모디아퀸의 유사체로서 공지된 화합물인 클로로퀸에서는 PPAR-γ 활성이 나타나지 않았다. 또한, 도 1(c) 및 도 1(d)에 나타낸 바와 같이, PPAR-α 리간드로서 공지된 화합물인 WY-14,643을 처리한 양성대조군과 비슷하게 아모디아퀸을 처리한 군에서 농도 의존적으로 높은 PPAR-α 활성을 나타내었으나, PPAR-γ 리간드로서 공지된 화합물인 로지글리타존을 처리한 양성대조군 및 아모디아퀸의 유사체로서 공지된 화합물인 클로로퀸에서는 PPAR-α 활성이 없음을 알 수 있었다.
따라서, 아모디아퀸 처리가 PPAR-γ 및 PPAR-α 활성을 모두 촉진하는 효능이 있음을 확인하였고, 상기 아모디아퀸을 PPAR-γ와 관련된 질병인 제2 당뇨병 등에 대한 예방 또는 치료용으로 이용할 수 있음을 알 수 있었고 PPAR-α 신호에 의해 조절되는 비만, 이상지질혈증, 심혈관계질환, 지방간 등에 대한 예방 또는 치료용으로 이용할 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 도 1(b) 및 도 1(d)의 결과로부터, 아모디아퀸은 벤젠 고리와 하이드록실기가 치환되어 있는 구조적 특징으로 인해 PPAR-γ 및 PPAR-α 활성을 모두 촉진하는 것이지, 아모디아퀸의 유사체라 할지라도 동일한 활성을 촉진하지 못함을 알 수 있었다.
실시예 2. 아모디아퀸에 의한 C2C12 myotube 세포의 포도당 흡수치(uptake) 효과 측정
근육, 지방, 간세포 등에서는 인슐린에 의한 신호전달에 의하여 인슐린 수용체의 인산화가 일어나고, 이에 따라 하위에 위치해 있는 여러 단백질들이 인산화 되면, 포도당 흡수능이 증가하게 되어 결과적으로 혈당을 저하시킨다. 따라서, 아모디아퀸이 당뇨병에 효과가 있는지 여부를 확인하기 위하여 포도당 흡수능 평가 실험을 진행하였다. 근육세포인 C2C12 myoblast 세포를 10% BSA(bovine serum albumin)가 들어있는 DMEM에서 배양하였다. 세포밀도가 약 80~90%가 되었을 때 2% horse serum이 들어있는 DMEM 배양액으로 치환하여 C2C12 myoblast를 myotube로 세포분화를 유도하여 완전히 분화시킨 후 실험을 진행하였다. 완전히 분화된 C2C12 myotube 세포에 0.5% BSA가 들어있는 DMEM 배지와 함께 각각 10 및 30 μM 농도의 아모디아퀸과, DMSO(Dimethyl Sulfoxide) 0.1% 및 포도당 흡수능의 양성 대조군으로 공지된 화합물인 로지글리타존(Sigma, USA) 50 μM을 잘 섞은 후 24시간동안 처리하였다. 24시간 동안 처리 후, 배지를 제거하였고, 37℃로 유지되는 플레이트 위에서 KRP(0.1% BSA + 5 mM 포도당) 버퍼 3 ㎖로 세척하여 잔여 시료를 제거하였다. 세척은 20분 간격으로 3회 반복하였다. 이어서 1 ㎖의 KRP 버퍼를 주입하고, 37℃에서 표지되지 않은 2-DOG와 [3H]2-DOG(Amersham Pharmacia)를 함께 KRP 버퍼에 녹인 용액(0.2mM, 0.2 μCi)을 가하여 정확히 10분간 처리하였다. 차가운 인산완충식염수 3 ㎖로 세척하여 포도당 흡수능 반응을 중지 시키고 인산완충식염수로 2회 더 세척한 다음, 세포를 1시간 정도 통풍 건조시킨 후, 0.1% SDS 1 ㎖을 가하여 파이펫으로 밀고 당기면서 용해시키고, 용해물 300 ㎕를 취하여 액체 scintillation counter(Perkin Elmer, USA)로 방사능을 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 아모디아퀸 처리군의 포도당 흡수치가 양성 대조군인 로지글리타존 처리군의 포도당 흡수치에 비하여 더 증가한 것을 확인하였다.
따라서, 상기 결과로부터 아모디아퀸이 세포 내에서 당뇨병 치료제의 대표적인 표적 단백질인 PPAR-γ의 활성을 증가시켜 근육세포 내부로 포도당 흡수를 촉진시키는 효과가 있음을 알 수 있었다.
실시예 3. 아모디아퀸에 의한 마우스의 혈당 강하 효과 및 혈당조절 효과 측정
3-1. 아모디아퀸 및 음성대조군 투여
㈜Clea Japan에서 구입한 5주령의 KKAy를 1주일간 예비사육한 후 5마리씩 2 그룹으로 나누었다.
1 그룹은 인산완충식염수를 투여하여 음성대조군으로 설정하였으며, 2 그룹은 아모디아퀸 18 ㎎/㎏의 농도로 6주 동안 매일 경구 투여하였다.
3-2. 마우스의 공복 혈당 강하 효과 및 혈당조절 효과 측정
6주 동안 공복 혈당은 12시간 절식 시킨 후 1, 2, 5, 6주에 꼬리정맥으로부터 전혈을 채취하여 측정하였다. 혈당 측정에는 혈당스트립(한국, 경기도, 녹십자)을 이용하였다. 상기 실험결과는 실험군과 대조군의 t검증을 실시하여 그 유의성을 검증하였으며, 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(*p<0.05, **p<0.005). 그리고 혈당 조절 효과를 확인하기 위하여, 16시간 절식시킨 후 대조 및 실험수행군 동물들의 복강에 2 g/kg의 포도당을 주입하고 혈중 포도당량을 30분 간격으로 2시간 동안 측정하였다. 혈중 포도당량 측정에는 당 내성 검사(IPGTT, intraperitoneal glucose tolerance test)를 이용하였다. 상기 실험결과는 실험군과 대조군의 집단별 t검증을 실시하여 그 유의성을 검증하였으며, 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(*p<0.05, **p<0.005).
그 결과, 도 3(a)에 나타낸 바와 같이, 공복 혈당은 대조군에 비하여 아모디아퀸을 섭취한 마우스에서 현저하게 감소한 것을 확인하였다. 그리고 도 3(b)에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비하여 아모디아퀸 투여군에서 포도당을 투여하고 2시간 후 혈중 포도당이 빠르게 감소한 것을 확인하였다. 구체적으로, 대조군의 공복혈당은 132.4 ㎎/㎗ 이었으나, 아모디아퀸 투여군의 공복혈당은 100.2 ㎎/㎗ 이었으며, 대조군의 당 부하 2 시간 후 혈당은 293.2 ㎎/㎗ 이었으나, 아모디아퀸의 혈당은 207 ㎎/㎗ 이었다.
따라서, 아모디아퀸이 혈중 포도당 농도를 감소시키는 우수한 효과를 나타내므로, 아모디아퀸을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물이 당뇨병 예방 또는 치료를 위하여 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있으며 공복 혈당을 감소시키는 작용이 있으므로, 인슐린 저항성 제 2형 당뇨병 예방제 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4. 아모디아퀸에 의한 당화혈색소(HbA1C) 함량에 미치는 영향
혈액 중에 분포하는 포도당의 일부가 적혈구와 단단히 결합을 하게 되는데 이를 당화혈색소(HbA1C)라 한다. 혈당 조절은 혈당치만이 아니라 반드시 당화혈색소 수치를 함께 조사하게 된다. 이는 당화혈색소 1% 감소에 당뇨로 인한 합병증 20% 이상 감소시키는 효과가 있기 때문이다. 본 실시예에서는 아모디아퀸 섭취에 의한 마우스의 당화혈색소 함량을 살펴보기로 하였다.
4-1. 아모디아퀸 및 음성대조군 투여
아모디아퀸에 의한 마우스의 당화혈색소를 측정하기 위하여 5주령의 KKAy를 ㈜Clea Japan에서 구입하여 1주일간 예비사육한 후 5마리씩 2그룹으로 나누었다. 상기 실시예 3에서와 마찬가지로 실험동물 1그룹은 인산완충식염수를 투여하여 대조 수행군으로 설정하였으며, 2그룹은 아모디아퀸을 18 ㎎/㎏의 농도로 6주 동안 매일 1 ㎖ 주사기를 통하여 경구 투여하였다.
4-2. 마우스의 당화혈색소 측정
아모디아퀸의 당화혈색소 저하효과를 측정하기 위하여, 대조 및 실험수행군 동물들의 꼬리정맥으로부터 전혈을 채취하여 easy A1c cartridge에 주입한 후 easy A1c analyzer(한국, 서울, 아산제약)를 이용하여 측정하였다. 상기 실험결과는 실험군과 대조군의 집단별 t검증을 실시하여 그 유의성을 검증하였으며, 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(**p<0.005).
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 대조군 마우스에 비하여 아모디아퀸의 섭취 마우스에서 당화혈색소의 생성이 69% 가까이 억제되었음을 확인하였다.
따라서, 아모디아퀸이 당화혈색소를 감소시키는 효과가 있음을 알 수 있었다.
실시예 5. 아모디아퀸에 의한 몸무게 감소 측정
5-1. 실험동물의 설계 및 실험 식이 조성
아모디아퀸에 의한 마우스의 몸무게 감소를 측정하기 위하여 7주령의 C57BL/6 수컷 마우스(Charles River Laboratories, Tokyo, Japan)를 구입하여 일정한 조건(온도:22±2℃, 상대습도:55±10%, 일주기:12시간)에서 사육하였다. 7 마리를 한 군으로 하여 케이지에서 물과 먹이를 자유 공급하였으며, 실험 전 1주일간 순화를 거쳐 실험에 사용하였다.
순응기간이 끝난 후, 7개의 군으로 나누어 하기 표 1와 같은 기간동안 식이와 아모디아퀸 및 양성대조군(WY-14,643, 로지글리타존) 투여를 진행하였다.
군 식이종류 아모디아퀸
(mg/kg)		 WY-14,643
(mg/kg)		 로지글리타존
(mg/kg)		 기간
정상대조군 LFD - - - 14주간 물질 투여
고지방대조군 HFD - - -
양성대조군
(예방용)		 HFD - 50 -
아모디아퀸군 HFD 20 - -
고지방대조군 HFD - - - 15주간 HFD로 유도 후
7주간 물질투여
양성대조군
(치료용)		 HFD - - 50
아모디아퀸군 HFD 20 - -
LFD (10% kcal as fat; D12450B, Research Diets Inc.)
HFD (60% kcal as fat; D12492, Research Diets Inc.)
5-2. 마우스의 몸무게 변화 측정
몸무게 변화조사는 정상사료를 급여한 마우스와 고지방을 급여한 고지방 유도 비만 마우스와 고지방에 아모디아퀸 및 양성대조군 (WY-14,643 및 로지글리타존)을 투여한 고지방 유도 비만 마우스를 1주 1회 오전 10시를 기준으로 21주 동안 전자저울(Dragon 204/S, Mettler Toledo, USA)을 사용하여 몸무게를 측정하였다. 몸무게 평균은 그룹당 7마리의 마우스의 몸무게를 합산하여 마우스로 나누어 각각의 평균몸무게로 하였다. 상기 실험결과는 고지방 유도 비만 대조군과 아모디아퀸, 양성대조군(WY-14,643 및 로지글리타존)간의 집단별 t검정을 실시하여 그 유의성을 검증하였으며, 통계학적으로 크게 유의한 차이를 보였다(*P<0.05, **P<0.005, ***P<0.0005).
실험 결과, 도 5(a)에 나타낸 바와 같이, 아모디아퀸 투여군 고지방 유도 비만마우스의 몸무게는 고지방 유도비만 마우스의 몸무게보다 현저하게 감소함을 관찰할 수 있었으며 양성대조군(WY-14,643)과 비슷함을 관찰할 수 있었다. 고지방으로 비만을 유도한 후 아모디아퀸을 투여한 도 5(c)의 경우에도 고지방 유도비만 마우스의 몸무게보다 현저하게 감소함을 관찰할 수 있었다. 반면, PPAR-γ의 작용제인 양성대조군(로지글리타존)의 경우 고지방 유도비만 마우스와 비슷하거나 그보다 더 몸무게가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
5-3. 고지방 유도 비만 마우스의 먹이 섭취량 측정
먹이 섭취량 조사는 정상사료를 먹고 자란 마우스와 고지방을 섭취한 고지방 유도 비만 마우스 그리고 고지방에 아모디아퀸 및 양성대조군 (WY-14,643 및 로지글리타존)을 투여한 고지방 유도 비만 마우스를 매일 오전 11시를 기준으로 하여 먹이 섭취량을 측정하였다. 먹이 섭취량 평균은 그룹 당 7마리임으로 7로 나누어 각각의 평균먹이 섭취량으로 하였다. 매일 먹은 섭취량은 kcal로 환산하여 나타내었다. 실험 결과, 도 5(b) 및 도 5(d)에 나타낸 바와 같이, 아모디아퀸 및 양성대조군 (WY-14,643 및 로지글리타존)을 투여한 고지방 유도 비만 마우스의 먹이 섭취량과 고지방 유도 비만 마우스의 먹이 섭취량간의 차이가 없음을 관찰할 수 있었다.
상기 결과는 아모디아퀸이 먹이 섭취량의 관계없이 마우스의 몸무게를 감소시키는 효과가 있으며, 따라서, 상기 아모디아퀸이 항비만 의약품으로 이용할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 6. 아모디아퀸에 의한 열생산 효과 측정
지방 세포는 지방 축적에 작용하는 백색 지방 세포와, 아주 적은 양이지만 열생산에 작용하는 갈색 지방 세포로 구분된다. 갈색 지방 세포는 식사 후에 몸이 따뜻하게 되는 식사 유도성 열생산 작용이 있으며, 기온이 낮아지면 활동이 증가되고 열을 생산해 체온은 유지하는 기능을 한다. 비만의 실험 모델인 유전성 비만 동물인 ob/ob 마우스는 갈색 지방 세포의 기능이 안 좋기 때문에 4℃의 저온에 노출시키면 체온이 점차 내려가고 4시간 정도 후에는 죽고 만다. 갈색 지방 세포의 기능이 제대로 안되면 일상 온도에서 열로 손실되는 에너지가 적기 때문에 과잉 에너지가 축적돼 비만이 발생될 가능성이 높다. 따라서 본 실시예에서는 아모디아퀸 투여에 의한 고지방 유도 비만 마우스의 열생산 능력을 살펴보기로 하였다.
6-1. 고지방 유도 비만 마우스의 열생산 능력 측정
실시예 5 에서 설계한 실험동물 중 14주간의 고지방 식이를 한 마우스들을 대상으로 열 생산 능력을 측정하기 위해 4℃ cold test를 실시하였다(Spiegelman B.M. et al,. Cell 92: 829-839, 1998). 이하 상기 측정방법을 자세히 설명한다. 고지방 유도 비만 마우스 그룹들의 마우스들을 4℃에 노출시키기 전 체온을 측정하여 실험 시작 측정온도로 기록하고 4℃ 방에 6시간 까지 노출하여 매시마다 체온을 측정하였다. 체온은 마우스용 직장 온도계(testo 925, Germany)를 이용하여 측정하였다. 열생산 측정값은 매시마다 측정한 온도를 나타내었다. 상기 실험 결과는 실험군과 대조군의 집단별 t검정을 실시하여 그 유의성을 검증하였으며, 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(*p<0.05, ***p<0.0005).
실험 결과, 도 5에 나타낸바와 같이, 아모디아퀸 투여군 고지방 비만 유도 마우스가 고지방 비만 유도 마우스에 비해 체온의 감소가 적음을 확인되어, 열 생산 효과가 뛰어난 것으로 나타났다.
따라서 상기 결과로부터 본 발명에 따른 아모디아퀸이 고지방 유도 비만 마우스의 열생산 활성을 높여 열로 생산되는 에너지가 많기 때문에 비만이 될 가능성을 낮추는 효과가 있음을 알 수 있었다.
실시예 7. 아모디아퀸에 의한 마우스의 혈당 조절 효과 측정
본 실시예에서는 실시예 5 에서 설계한 실험동물을 대상으로 혈당조절 효과를 측정하기 위해서 당내성검사와 인슐린내성시험을 실시하였다.
7-1. 마우스의 경구 당부하 검사 측정
16시간 절식시킨 후 대조 및 실험수행군 동물들을 대상으로 2 g/kg의 포도당을 경구로 투여하고 혈중 포도당량을 30분 간격으로 2시간 동안 측정하였다. 혈중 포도당량 측정에는 당 내성 검사(OGTT, oral glucose tolerance test)를 이용하였다. 상기 실험결과는 고지방 유도 비만 마우스 대조군과 아모디아퀸, 양성대조군(WY-14,643) 및 정상사료 섭취 마우스간의 집단별 t검정을 실시하여 그 유의성을 검증하였으며, 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(*p<0.05, **p<0.005, ***p<0.0005).
그 결과, 도 7(a)에 나타낸 바와 같이, 고지방 유도 비만 마우스 대조군에 비하여 아모디아퀸 투여군에서 포도당을 투여하고 2시간 후 혈중 포도당이 빠르게 감소한 것을 확인하였다. 구체적으로, 고지방 유도 비만 마우스 대조군의 당 부하 2 시간 후 혈당은 180.5 ㎎/㎗ 이었으나, 아모디아퀸의 혈당은 139.1 ㎎/㎗ 이었다.
따라서, 아모디아퀸이 혈중 포도당 농도를 감소시키는 우수한 효과를 나타내므로, 아모디아퀸을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물이 인슐린 저항성 제 2형 당뇨병 예방제 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
7-2. 마우스의 인슐린 내성 시험 측정
16시간 절식시킨 후 대조 및 실험 수행군 동물들을 대상으로 0.5 U/kg의 인슐린을 복강으로 투여하고 혈중 포도당량을 30분 간격으로 2시간 동안 측정하였다. 혈중 포도당량 측정에는 인슐린 내성 시험(IPITT, intraperitoneal insulin tolerance test)를 이용하였다. 상기 실험결과는 고지방 유도 비만 마우스 대조군과 아모디아퀸, 양성대조군(WY-14,643 및 로지글리타존) 및 정상사료 섭취 마우스간의 집단별 t검정을 실시하여 그 유의성을 검증하였으며, 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(*p<0.05, **p<0.005, ***p<0.0005).
그 결과, 도 7(b)에 나타낸 바와 같이, 고지방 유도 비만 마우스 대조군 및 실험군에서 인슐린을 투여하여 인슐린 저항성을 측정한 결과 모든 군에서 30분에서 혈당이 가장 최저치를 보였고, 그 이후 서서히 증가되었다. 고지방 유도 비만 마우스 대조군은 120분에 혈당이 공복 혈당까지 올라 갔으며 정상사료 섭취군, 양성대조군(WY-14,643), 아모디아퀸 투여군에서는 2시간 후 혈중 포도당이 공복혈당보다 낮은 수준으로 혈당이 유지 되었다. 그리고 도 7(c)의 고지방 유도를 통한 인슐린 저항성이 걸린 비만 마우스 대조군과 실험군에 인슐린을 투여하여 초기 혈당의 %로 나타냈다. 인슐린 저항성을 측정한 결과 고지방 유도 비만 마우스와 아모디아퀸 투여군에서는 30분에서 가장 최저치를 보였고, 그 이후 서서히 증가되었다. 양성대조군(로지글리타존) 및 정상사료 섭취군에서는 60분에서 혈당이 가장 최저치를 보였고, 그 이후 서서히 증가 되었다. 고지방 유도 비만 마우스 대조군은 120분에 혈당이 초기 혈당의 70% 가까이 올라 갔으며 정상사료 섭취군, 양성대조군(로지글리타존), 아모디아퀸 투여군에서는 2시간 후 혈중 포도당이 초기 혈당의 40~45% 정도로 혈당이 유지되었다.
따라서, 아모디아퀸의 섭취가 인슐린 감수성을 증가시키는 작용이 있으므로, 인슐린 저항성 제 2형 당뇨병 예방제 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 8. 아모디아퀸에 의한 지방간 예방 효과 측정
지방간의 원인은 알코올의 과다한 섭취로 인하여 발생되는 알코올성 지방간을 제외하면 고열량과 고지방 식이, 단순당의 섭취와 관련된 영양 불균형을 들 수 있다. 특히 고열량 또는 고지방식이의 지속적인 섭취는 간에서의 지방합성과 분해 사이의 지질대사 장애를 초래하여 지방간을 유발한다.
이에 본 실시예에서는 아모디아퀸의 처리에 의한 지방간 유발에 미치는 영향을 검토하고자 하였다.
8-1. 고지방 유도 비만 마우스그룹의 조직 채취
실시예 5 에서 설계한 실험동물 중 14주간 고지방과 함께 약물을 급여한 고지방 유도 비만 마우스그룹과 15주간 고지방으로 유도 후 7주간 고지방과 함께 약물을 급여한 고지방 유도 비만 마우스들을 경추 탈골법으로 희생시킨 후 해부용 고정틀에 고정하고, 수술용 메스로 복부를 절개하여 간을 적출 하였다. 적출된 간조직은 축화된 변형을 방지하기위해 10% 포르말린 용액에 고정하였다. 고정된 조직은 24시간 후 흐르는 물에 수세한 다음 일반적인 조직의 탈수, 투명 및 침투과정을 자동조직 처리장치(6460B, Sakura, Japan) 기기를 사용하여 14시간 동안 처리하였으며, 파라핀 블록의 제작과 냉각은 자동 포매장치(Tissue-Tex, Japan)를 사용하였다. 제작된 파라핀 블록을 회전식 미세박절기(Rotary Microtome 2040, Japan)를 사용하여 조직을 수직 방향으로 4-5 ㎛ 두께로 연속 절편하여, 부유온수조와 신전기 과정을 거쳐 슬라이드에 부착시켰다.
8-2. 아모디아퀸에 의한 지방간 예방 효과 관찰
박절한 조직절편을 헤마토실린으로 염색한 다음 과염색된 부분은 흐르는 수돗물에 수세한 다음 1% HCL, 70% A/C 용액에 3-5회 침지함으로써 핵을 청화하였다. 그 다음 수세를 5-10분 정도 충분히 수세하여 핵이 청명한 색이 되도록 세포질 대조염색으로 염색한 다음 15초간 과도한 에오진용액을 흐르는 물로 세척하고 탈수 및 투명과정을 거쳤다. 광학 현미경(BX50, Olympus, Japan)을 사용하여 각각의 간조직을 관찰하였으며, 현미경에 장착된 CCD 카메라(PM-C35DX, Olympus, Japan)로 각 군의 조직들을 촬영하였다.
실험 결과, 도 8(a)와 8(b)에 나타낸 바와 같이, 고지방 유도 비만 마우스의 간은 지방으로 꽉 차 있는 반면, 아모디아퀸 투여군 고지방 유도 비만 마우스의 간의 경우 거의 정상마우스의 간과 같은 모양을 확인할 수 있었다.
따라서 상기 결과로부터 본 발명에 따른 아모디아퀸이 지방간 억제 효과가 뛰어남을 알 수 있었다.
실시예 9. 아모디아퀸 투여에 따른 간, 근육, 지방조직 내 PPAR -α 활성화에 따른 타겟 유전자의 발현 확인
PPAR-α는 지방산 산화 대사 경로에 관여하는 효소의 유전자인 ACOX(acyl-CoA oxidase), CPT-1(carnitine palmitoyl transferase-1), 및 mCAD(medium chain acyl-CoA dehyrogenase)의 발현을 유도하여 지방산(fatty acid) 합성을 감소시킨다고 알려져 있다. 따라서, 상기 ACOX, CPT-1 및 mCAD 유전자의 발현량을 측정하면, 지방산 산화효능을 파악할 수 있다. 이에 본 실시예에서는 간, 근육, 지방조직에 아모디아퀸 투여가 ACOX, CPT-1 및 mCAD 유전자의 발현량에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
각 조직은 실시예 5 에서 설계한 실험동물 중 14주간 고지방을 급여한 고지방 유도 비만 마우스그룹들의 마우스를 경추 탈골법으로 희생시킨 후 해부용 고정틀에 고정하고, 수술용 메스로 절개하여 간, 근육, 지방조직을 적출 하여 사용하였으며, β-actin, ACOX, CPT-1 및 mCAD의 프라이머 염기서열은 각각 다음과 같다.
β-actin forward : 5'-GGG AAG GTG ACA GCA TTG-3'
reverse : 5'-ATG AAG TAT TAA GGC GGA AGA TT-3'
ACOX forward : 5'-ACA CTA ACA TAT CAA CAA GAG GAG-3'
reverse : 5'-CAT TGC CAG GAA GAC CAG-3'
CPT-1 forward : 5'-CCA CCT CTT CTG CCT CTA T-3'
reverse : 5'-TTC TCA AAG TCA AAC AGT TCC A-3
mCAD forward : 5'-CCG AAG AGT TGG CGT ATG-3'
reverse : 5'-AGC AAG AAT CAC AGG CAT T-3'
각 조직을 분쇄기를 이용하여 갈은 후 Trizol을 이용하여 RNA를 추출하였고, 역전사 중합효소 연쇄반응(RT PCR, Reverse transcription polymerase chain reaction)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 대조군으로는 β-actin을 사용하였으며, PPAR-α 활성화에 따른 타겟 유전자 및 지방산 분해에 관여하는 ACOX, CPT-1 및 mCAD 유전자의 발현량을 알아보기 위해 각각의 프라이머를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응(RT PCR, Real-time polymerase chain reaction)을 하였다(95℃ 3분, <95℃ 10초, 60℃ 10초, 72℃ 30초> 39회, 95℃ 10초, 65℃ 5초). ACOX, CPT-1 및 mCAD을 β-actin으로 보정하여 결과 값을 내었다. 상기 실험결과는 고지방 유도 비만 마우스 대조군과 아모디아퀸 및 양성대조군(WY-14,643) 마우스간의 집단별 t검정을 실시하여 그 유의성을 검증하였으며, 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(*p<0.05, **p<0.005, ***p<0.0005).
그 결과, 도 9(a), 도 9(b), 도 9(c)에 나타낸 바와 같이, 아모디아퀸을 투여한 실험군에서 대조군에 비하여 거의 215배 이상 유전자 발현량이 증가한 것을 확인하였다.
따라서, 아모디아퀸의 처리가 PPAR-α 활성화에 따른 타겟 유전자이며 지방산 분해에 관여하는 ACOX, CPT-1 및 mCAD 유전자의 발현을 각 조직에서 증가시키는 것으로 보아, 아모디아퀸이 PPAR-α를 활성화시켜 PPAR-α의 타겟 유전자들의 발현을 조절할 수 있음을 의미하며, 지방산 산화를 촉진시켜 지방축적을 억제시킬 수 있을 것으로 판단되었다.
실시예 10. 아모디아퀸 투여에 따른 지방조직 내 항염증 반응에 따른 타겟 유전자의 발현 확인
지방세포는 간엽세포(mesenchymal stem cell) 및 전구지방세포(preadipocyte)로부터 분화되며, 지질대사기능, 당대사기능, 나아가 아디포사이토카인 분비에 변화를 가져온다. 비만 환자에게서 증가하는 TNFα, MCP-1 및 iNOS 등은 지방세포의 염증 발현으로 지방분화를 촉진하고 기타 성인병 이환율을 증가 시킨다. TNF-α는 염증반응에서 중요한 작용을 하는 세포분비물질이며, MCP-1은 염증성 케모카인으로서, 지방세포에서 분비되어 비만, 인슐린저항성, 동맥경화증에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 또한 iNOS는 염증성 전구물질로 염증반응을 촉진시키는 것으로 알려져 있다.
따라서, 상기 TNFα, MCP-1 및 iNOS 유전자의 발현량을 측정하면, 항염증 효능을 파악할 수 있다. 이에 본 실시예에서는 지방조직에서 아모디아퀸 투여가 TNFα, MCP-1 및 iNOS 유전자의 발현량에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
각 조직은 실시예 5 에서 설계한 실험동물 중 14주간 고지방을 급여한 고지방 유도 비만 마우스그룹들의 마우스를 경추 탈골법으로 희생시킨 후 해부용 고정틀에 고정하고, 수술용 메스로 절개하여 지방조직을 적출 하여 사용하였으며, β-actin, TNFα, MCP-1 및 iNOS의 프라이머 염기서열은 각각 다음과 같다.
β-actin forward : 5'-GGG AAG GTG ACA GCA TTG-3'
reverse : 5'-ATG AAG TAT TAA GGC GGA AGA TT-3'
TNFα forward : 5'-ATG AGA AGT TCC CAA ATG GC-3'
reverse : 5'-TTT GAG AAG ATG ATC TGA GTG TGA G-3'
MCP-1 forward : 5'-AAT GAG TAG GCT GGA GAG-3'
reverse : 5'-TCT CTT GAG CTT GGT GAC-3
iNOS forward : 5'-GCT TCT GGC ACT GAG TAA-3'
reverse : 5'-GGA GGA GAG GAG AGA GAT-3
지방조직을 분쇄기를 이용하여 갈은 후 Trizol을 이용하여 RNA를 추출하였고, 역전사 중합효소 연쇄반응(RT PCR, Reverse transcription polymerase chain reaction)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 대조군으로는 β-actin을 사용하였으며, 염증반응에 관여하는 TNFα, MCP-1 및 iNOS 유전자의 발현량을 알아보기 위해 각각의 프라이머를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응(RT PCR, Real-time polymerase chain reaction)을 하였다(95℃ 3분, <95℃ 10초, 60℃ 10초, 72℃ 30초> 39회, 95℃ 10초, 65℃ 5초). TNFα, MCP-1 및 iNOS을 β-actin으로 보정하여 결과 값을 내었다. 상기 실험결과는 고지방 유도 비만 마우스 대조군과 아모디아퀸 및 양성대조군(WY-14,643) 마우스간의 집단별 t검정을 실시하여 그 유의성을 검증하였으며, 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(*p<0.05, **p<0.005).
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 아모디아퀸을 투여한 실험군에서 대조군에 비하여 거의 540% 가까이 유전자 발현량이 감소한 것을 확인하였다.
따라서, 아모디아퀸의 처리가 항염증 반응에 관여하는 TNFα, MCP-1 및 iNOS 유전자의 발현을 각 조직에서 억제시키는 것으로 보아, 아모디아퀸이 염증반응에 중요한 작용을 하는 인자들을 억제함으로 비만, 인슐린 저항성, 동맥경화증에 영향을 미칠 것으로 판단되었다.
실시예 11. 아모디아퀸 및 메트포민의 복합제제 투여에 따른 간세포 내 당신생 작용 억제에 대한 상승 효과 측정
혈당조절 호르몬인 인슐린과 글루카곤은 간조직의 당대사 효소인 PEPCK 활성도를 조절하는 것으로 알려져 있다. 인슐린은 당신생 효소인 PEPCK 활성도를 낮춤으로써 당신생 작용을 억제하여 간조직의 당생성 과정을 줄인다. 반면, 글루카곤은 glucokinase의 유전자 발현을 억제하고 간조직의 G6Pase 활성도 및 mRNA 발현과 PEPCK 전사과정을 촉진하므로 소량의 글루카곤 농도 증가가 당신생 작용을 증가시킨다. PEPCK는 당신생 과정의 율속효소로서 oxaloacetate 가 phosphoenolpyruvate로 전환되는 반응을 촉매 한다고 알려져 있다. 따라서, 상기 PEPCK 유전자의 발현량을 측정하면, 당신생 작용을 파악할 수 있다. 이에 본 실시예에서는 간세포에 아모디아퀸 및 메트포민의 복합제제의 처리가 PEPCK 유전자의 발현량에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
세포는 한국 세포주 은행에서 구입한 사람 간세포를 사용하였으며, β-actin 및 PEPCK의 프라이머 염기서열은 각각 다음과 같다.
β-actin forward : 5'-GGG AAG GTG ACA GCA TTG-3'
reverse : 5'-ATG AAG TAT TAA GGC GGA AGA TT-3'
PEPCK forward : 5'-CAG TTG AGT AGC ACA GAG AA-3'
reverse : 5'-GAT TCC TGA GTG ACC TTG AA-3'
세포는 5% CO2, 37℃ 배양기에서 HepG2 간세포를 DMEM(10% FBS, 페니실린-스트렙토마이신)에 배양한 후, 혈청이 들어있지 않은 DMEM과 함께 아모디아퀸 및 메트포민의 복합제제를 처리하고 24시간 배양한 후, Trizol을 이용하여 RNA를 추출하였고, 역전사 중합효소 연쇄반응(RT PCR, Reverse transcription polymerase chain reaction)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 대조군으로는 β-actin을 사용하였으며, PEPCK 유전자의 발현량을 알아보기 위해 프라이머를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응(RT PCR, Real-time polymerase chain reaction)을 하였다(95℃ 3분, <95℃ 10초, 60℃ 10초, 72℃ 30초> 39회, 95℃ 10초, 65℃ 5초). PEPCK를 β-actin으로 보정하여 결과 값을 내었다. 상기 실험결과는 실험군과 대조군의 t 검정(t-test)로 비교 검증을 실시하여 그 유의성을 검증하였으며, 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(**p<0.005, ***p<0.0005).
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 아모디아퀸 10μM 및 메트포민 2mM의 복합제제의 처리가 아모디아퀸 10μM 단독 또는 메트포민 2mM 단독 처리의 경우보다 큰 상승 작용이 확인되었다. 따라서, 아모디아퀸 10μM 및 메트포민 2mM의 복합제제의 처리가 간에서 당신생 과정의 주요 효소인 PEPCK 유전자 발현을 억제함으로 공복시 혈당을 낮추어 줄 수 있을 것으로 사료되어 관련된 질병인 당뇨병에 대한 치료용으로 이용할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 12. 아모디아퀸 및 메트포민의 복합제제 투여에 따른 간세포 내 지질대사 관련 중성지방과 인지질의 생합성 억제에 대한 상승 효과 측정
SREBP-1은 지질대사 관련 중성지방과 인지질의 생합성에 관련된 유전자의 조절에 관여하여 지방 생성과 체지방 축적을 억제한다고 알려져 있으며, 한 연구에서는 고도비만과 인슐린저항성이 특징인 ob/ob mice에서 발생한 지방간병변에서 SREBP-1 gene을 비활성화시키게 되면 간조직의 중성지방 축적이 감소한다고 보고되었다. 따라서, 상기 SREBP-1 유전자의 발현량을 측정하면, 간조직의 중성지방 축적이 감소효능을 파악할 수 있다. 이에 본 실시예에서는 간세포에 아모디아퀸 및 메트포민의 복합제제의 처리가 SREBP-1 유전자의 발현량에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
세포는 한국 세포주 은행에서 구입한 마우스 간세포를 사용하였으며, β-actin, 및 SREBP-1의 프라이머 염기서열은 각각 다음과 같다.
β-actin forward : 5'-GGG AAG GTG ACA GCA TTG-3'
reverse : 5'-ATG AAG TAT TAA GGC GGA AGA TT-3'
SREBP-1 forward : 5'-CGA CTA CAT CCG CTT CTT G-3'
reverse : 5'-GGT CCT TCA GTG ATT TGC TT-3'
세포는 5% CO2, 37℃ 배양기에서 HepG2 간세포를 DMEM(10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신)에 배양한 후, 혈청이 들어있지 않은 DMEM과 함께 아모디아퀸(amodiaquine) 및 메트포민의 복합제제를 처리하고 24시간 배양한 후, QIAGEN RNA extraction kit (QIAGEN, Hilden, Germany)을 이용하여 RNA를 분리한 후, 역전사 중합효소 연쇄반응(RT PCR, Reverse transcription polymerase chain reaction)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 대조군으로는 β-actin을 사용하였으며, SREBP-1 유전자의 발현량을 알아보기 위해 프라이머를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응(RT PCR, Real-time polymerase chain reaction)을 하였다(95℃ 3분, <95℃ 10초, 60℃ 10초, 72℃ 30초> 39회, 95℃ 10초, 65℃ 5초). SREBP-1을 β-actin으로 보정하여 결과 값을 내었다. 상기 실험결과는 실험군과 대조군의 t 검정(t-test)로 비교 검증을 실시하여 그 유의성을 검증하였으며, 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(*p<0.05, **p<0.005).
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 아모디아퀸 10μM 및 메트포민 2mM의 복합제제의 처리가 아모디아퀸 10μM 단독 또는 메트포민 2mM 단독 처리의 경우보다 큰 상승 작용이 확인되었다. 따라서, 아모디아퀸 10μM 및 메트포민 2mM의 복합제제의 처리가 간 조직에서 지방산과 중성지방의 합성에 관여하는 주요 단백질인 SREBP-1 유전자 발현을 억제함으로 지방간병변에서 간조직의 중성지방 축적이 감소시켜 줄 수 있을 것으로 사료되어 관련된 지방간에 대한 치료용으로 이용할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 13. 아모디아퀸 및 메트포민의 복합제제의 투여에 따른 팔미트산에 의해 유도된 인슐린 저항성 상태에서 근육세포 내 GLUT4 유전자의 발현 확인
Glucose transporter type 4(GLUT4)의 발현은 골격근 내 다양한 전사인자에 의해 증가되며 GLUT4 발현의 양적인 증가가 이루어지면 인슐린반응성도 증가시킨다고 잘 알려져 있다(J M Ren et al., J. Clin. Invest., 95:429-432, 1995). 따라서 골격근 내 GLUT4 수준은 우리 몸의 혈당 조절을 위해 중요하므로 상기 GLUT4 유전자의 발현량을 측정하면, 인슐린 반응성을 파악할 수 있다. 이에 본 실시예에서는 팔미트산에 의해 유도된 인슐린 저항성 상태에서 아모디아퀸 및 메트포민의 복합제제의 처리에 따른 근육세포에 GLUT4 유전자의 발현량에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
세포는 한국 세포주 은행에서 구입한 마우스 근아세포를 사용하였으며, β-actin, 및 GLUT4의 프라이머 염기서열은 각각 다음과 같다.
β-actin forward : 5'-GGG AAG GTG ACA GCA TTG-3'
reverse : 5'-ATG AAG TAT TAA GGC GGA AGA TT-3'
GLUT4 forward : 5'-AAA TCT AGC CCT GCC TCC-3'
reverse : 5'-GCT CTA ACC GTC CTT GCC-3'
1 X 107의 C2C12(마우스 근아세포)를 2% 말혈청으로 분화 시켜 근관세포로 만든 후 인슐린 저항성 조건에서 실험하기 위해 400μM 팔미트산과 아모디아퀸 및 메트포민의 복합제제를 16시간 동안 처리한 후 QIAGEN RNeasy Mini kit(Qiagen, 미국)로 RNA를 추출하였다. 분리된 RNA는 Bioanalyzer 2100 (Agilent, 미국)을 이용하여 완전성을 확인하였으며, 역전사 효소 중합효소 연쇄반응(RT PCR, Reverse transcription polymerase chain reaction)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 대조군으로는 β-actin을 사용하였으며, GLUT4 유전자의 발현량을 알아보기 위해 프라이머를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응(RT PCR, Real-time polymerase chain reaction)을 하였다(95℃ 3분, <95℃ 10초, 60℃ 10초, 72℃ 30초> 39회, 95℃ 10초, 65℃ 5초). GLUT4를 β-actin으로 보정하여 결과 값을 내었다. 상기 실험결과는 실험군과 대조군의 t 검정(t-test)로 비교 검증을 실시하여 그 유의성을 검증하였으며, 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(*p<0.05, ***p<0.0005).
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 인슐린 저항성 상태를 유도하기 위해 분화된 C2C12 골격근 세포에 400uM의 팔미트산을 16시간 처리하였을 때 인슐린에 의해 GLUT4의 발현이 크게 증가하지 않는 반면, 아모디아퀸 10μM 및 메트포민 2mM의 복합제제의 처리가 아모디아퀸 10μM 단독 또는 메트포민 2mM 단독 처리의 경우보다 큰 상승 작용이 확인되었다. 따라서, 아모디아퀸 10μM 및 메트포민 2mM의 복합제제의 처리가 인슐린 저항성 상태의 근육 세포 내 GLUT4 유전자 발현 증가를 통해 혈당 조절 및 당 대사 개선에 긍정적인 영향을 미치고 있음을 확인하여 관련 질병인 당뇨병에 대한 치료용으로 이용할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 14. 아모디아퀸 및 메트포민의 복합제제의 투여에 의한 마우스의 혈당조절 효과 측정
14-1. 아모디아퀸 및 메트포민의 단독 및 복합제제 투여
아모디아퀸 및 메트포민의 복합제제에 의한 혈당조절 효과를 측정하기 위해 6주령의 KKAy를 ㈜Clea Japan에서 구입하여 일정한 조건(온도:22±2℃, 상대습도:55±10%, 일주기:12시간)에서 사육하였다. 7 마리를 한 군으로 하여 케이지에서 물과 먹이를 자유 공급하였으며, 실험 전 1주일간 순화를 거쳐 실험에 사용하였다.
순응기간이 끝난 후, 10개의 군으로 나누어 6주 동안 아모디아퀸 및 메트포민 단독 및 복합제제를 하기 표 2의 중량비로 매일 경구 투여를 진행하였다.
군 아모디아퀸 메트포민
정상대조군 - -
단독 투여군 1 -
- 50
- 150
- 300
- 500
아모디아퀸:메트포민
복합조성물 투여군		 1 50
1 150
1 300
1 500
14-2. 마우스의 혈당조절 효과 측정
혈당 조절 효과를 확인하기 위하여, 16시간 절식시킨 후 대조 및 실험 수행군 동물들의 복강에 2 g/kg의 포도당을 주입하고 혈중 포도당량을 30분 간격으로 2시간 동안 측정하였다. 혈중 포도당량 측정에는 당 내성 검사(OGTT, oral glucose tolerance test)를 이용하였다. 상기 실험결과는 실험군과 대조군의 집단별 t검증을 실시하여 그 유의성을 검증하였으며, 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(*p<0.05, **p<0.005, ***p<0.0005).
그 결과, 도 14(a)-(d)에 나타낸 바와 같이, 아모디아퀸:메트포민 중량비가 1:50 및 1:150 보다 1:300 및 1:500의 중량비로 투여한 복합제제 투여군에서 단독투여군보다 포도당을 투여하고 2시간 후 혈중 포도당이 빠르게 감소한 것을 확인하였다.
따라서, 아모디아퀸 단독 또는 메트포민 단독 투여군의 경우보다 복합제제 투여군에서 혈중 포도당 농도를 감소시키는 우수한 상승 작용이 확인되었음으로, 아모디아퀸:메트포민 1:300 또는 1:500의 중량비로 투여한 복합제가 당뇨병 예방 또는 치료를 위하여 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있고 인슐린 저항성 제 2형 당뇨병 예방제 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 15. 아모디아퀸 및 시타글립틴의 복합제제의 투여에 의한 마우스의 혈당 강하, 혈당조절 효과 및 당화혈색소 함량에 미치는 영향
15-1. 아모디아퀸 및 시타글립틴의 단독 및 복합제제 투여
아모디아퀸 및 시타글립틴의 복합제제에 의한 혈당조절 효과를 측정하기 위해 6주령의 KKAy를 ㈜Clea Japan에서 구입하여 일정한 조건(온도:22±2℃, 상대습도:55±10%, 일주기:12시간)에서 사육하였다. 7 마리를 한 군으로 하여 케이지에서 물과 먹이를 자유 공급하였으며, 실험 전 1주일간 순화를 거쳐 실험에 사용하였다.
순응기간이 끝난 후, 10개의 군으로 나누어 8주 동안 아모디아퀸 및 시타글립틴 단독 및 복합제제를 하기 표 3의 중량비로 매일 경구 투여를 진행하였다.
군 아모디아퀸 시타글립틴
정상대조군 - -
단독 투여군 1 -
- 1
- 2
- 10
- 20
아모디아퀸:시타글립틴
복합조성물 투여군		 1 1
1 2
1 10
1 20
15-2. 마우스의 공복 혈당 강하 효과 측정
공복 혈당은 16시간 절식 시킨 후 약물 처리 8주에 꼬리정맥으로부터 전혈을 채취하여 측정하였다. 혈당 측정에는 혈당스트립(한국, 경기도, 녹십자)을 이용하였다. 상기 실험결과는 실험군과 대조군의 t검증을 실시하여 그 유의성을 검증하였으며, 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(*p<0.05). 그 결과, 도 15a-d에 나타낸 바와 같이, 아모디아퀸:시타글립틴 중량비가 1:1 보다 1:2, 1:10 및 1:20의 중량비로 투여한 복합제제 투여군에서 단독투여군보다 공복 혈당이 현저하게 감소하는 상승효과를 확인하였다.
15-3. 마우스의 혈당조절 효과 측정
혈당 조절 효과를 확인하기 위하여, 16시간 절식시킨 후 대조 및 실험 수행군 동물들의 복강에 2 g/kg의 포도당을 주입하고 혈중 포도당량을 30분 간격으로 2시간 동안 측정하였다. 혈중 포도당량 측정에는 당 내성 검사(OGTT, oral glucose tolerance test)를 이용하였다. 상기 실험결과는 실험군과 대조군의 집단별 t검증을 실시하여 그 유의성을 검증하였으며, 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(*p<0.05, **p<0.005, ***p<0.0005).
그 결과, 도 15(e)-(h)에 나타낸 바와 같이, 아모디아퀸:시타글립틴 중량비가 1:1 및 1:2 보다 1:10 및 1:20의 중량비로 투여한 복합제제 투여군에서 단독투여군보다 포도당을 투여하고 2시간 후 혈중 포도당이 빠르게 감소한 것을 확인하였다.
따라서, 아모디아퀸 단독 또는 시타글립틴 단독 투여군의 경우보다 복합제제 투여군에서 혈중 포도당 농도를 감소시키는 우수한 상승 작용이 확인되었음으로, 아모디아퀸:시타글립틴 1:10 또는 1:20의 중량비로 투여한 복합제가 당뇨병 예방 또는 치료를 위하여 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있고 인슐린 저항성 제 2형 당뇨병 예방제 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
15-4. 마우스의 당화혈색소 측정
혈당 조절은 혈당치만이 아니라 반드시 당화혈색소 수치를 함께 조사하게 된다. 이는 당화혈색소 1% 감소에 당뇨로 인한 합병증 20% 이상 감소시키는 효과가 있기 때문이다. 본 실시예 에서는 아모디아퀸 및 시타글립틴의 복합제제 섭취에 의한 마우스의 당화혈색소 함량을 살펴보기로 하였다. 아모디아퀸 및 시타글립틴의 복합제제의 당화혈색소 저하효과를 측정하기 위하여, 대조 및 실험수행군 동물들의 꼬리정맥으로부터 전혈을 채취하여 Hemoglobin A1c reagent kit에 주입한 후 DCA vantage analyzer(미국, 뉴욕, 지멘스)를 이용하여 측정하였다. 상기 실험결과는 실험군과 대조군의 집단별 t검증을 실시하여 그 유의성을 검증하였으며, 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(*p<0.05).
그 결과, 도 15(i)-(l)에 나타낸 바와 같이, 아모디아퀸:시타글립틴 중량비가 1:1 또는 1:2, 또는 1:10 또는 1:20의 중량비로 투여한 복합제제 투여군에서 단독투여군보다 당화혈색소 생성 억제효과과 상승되는 것을 확인하였다.
따라서, 아모디아퀸 및 시타글립틴의 복합제제가 당화혈색소를 감소시키는 효과가 있음으로 인슐린 저항성 제 2형 당뇨병 예방제 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 16. 아모디아퀸 및 다파글리플리진의 복합제제의 투여에 의한 마우스의 혈당 강하, 혈당조절 효과 및 당화혈색소 함량에 미치는 영향
16-1. 아모디아퀸 및 다파글리플로진의 단독 및 복합제제 투여
아모디아퀸 및 다파글리플로진의 복합제제에 의한 혈당조절 효과를 측정하기 위해 6주령의 KKAy를 ㈜Clea Japan에서 구입하여 일정한 조건(온도:22±2℃, 상대습도:55±10%, 일주기:12시간)에서 사육하였다. 7 마리를 한 군으로 하여 케이지에서 물과 먹이를 자유 공급하였으며, 실험 전 4주일간 순화를 거쳐 실험에 사용하였다.
순응기간이 끝난 후, 8개의 군으로 나누어 8주 동안 아모디아퀸 및 다파글리플로진 단독 및 복합제제를 하기 표 4의 중량비로 매일 경구 투여를 진행하였다.
군 아모디아퀸 다파글리플로진
정상대조군 - -
단독 투여군 1 -
- 0.02
- 0.2
- 2
아모디아퀸:다파글리플로진
복합조성물 투여군		 1 0.02
1 0.2
1 2
16-2. 마우스의 공복 혈당 강하 효과 측정
공복 혈당은 16시간 절식 시킨 후 약물 처리 8주에 꼬리정맥으로부터 전혈을 채취하여 측정하였다. 혈당 측정에는 혈당스트립(한국, 경기도, 녹십자)을 이용하였다. 상기 실험결과는 실험군과 대조군의 t검증을 실시하여 그 유의성을 검증하였으며, 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(*p<0.05, *p<0.005). 그 결과, 도 16(a)-(c)에 나타낸 바와 같이, 아모디아퀸:다파글리플로진 중량비가 1:0.02 및 1:0.2 보다 1:2의 중량비로 투여한 복합제제 투여군에서 단독투여군보다 공복 혈당이 현저하게 감소하는 상승효과를 확인하였다.
16-3. 마우스의 혈당조절 효과 측정
혈당 조절 효과를 확인하기 위하여, 16시간 절식시킨 후 대조 및 실험 수행군 동물들의 복강에 2 g/kg의 포도당을 주입하고 혈중 포도당량을 30분 간격으로 2시간 동안 측정하였다. 혈중 포도당량 측정에는 당 내성 검사(OGTT, oral glucose tolerance test)를 이용하였다. 상기 실험결과는 실험군과 대조군의 집단별 t검증을 실시하여 그 유의성을 검증하였으며, 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(*p<0.05, **p<0.005).
그 결과, 도 16(d)-(f)에 나타낸 바와 같이, 아모디아퀸:다파글리플로진 중량비가 1:0.02 및 1:0.2 보다 1:2의 중량비로 투여한 복합제제 투여군에서 단독투여군보다 포도당을 투여하고 2시간 후 혈중 포도당이 빠르게 감소한 것을 확인하였다.
따라서, 아모디아퀸 단독 또는 다파글리플로진 단독 투여군의 경우보다 복합제제 투여군에서 혈중 포도당 농도를 감소시키는 우수한 상승 작용이 확인되었음으로, 아모디아퀸:다파글리플로진 1:2의 중량비로 투여한 복합제가 당뇨병 예방 또는 치료를 위하여 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있고 인슐린 저항성 제 2형 당뇨병 예방제 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
16-4. 마우스의 당화혈색소 측정
당뇨병을 진단하는 방법은 혈중 포도당 측정등 여러 가지가 있지만, 혈중 포도당 측정은 식사, 운동 등 여러 요인의 영향을 받아 부정확하므로 당뇨병을 관리하고 치료하기 위해서는 혈액 중 당화혈색소를 측정하는 것이 효과적인 방법 중의 하나이다. 1986년 미국 당뇨협회에서 모든 형태의 당뇨병을 관리하기 위해 연간 2회씩의 당화혈색소 측정을 제안함으로써 비교적 안정한 지표인 당화혈색소의 양을 당뇨병 관리지표로 사용하기 시작하였다(대한민국 공개특허 10-2009-0006999, 2009.01.16. 공개). 본 실시예 에서는 아모디아퀸 및 시타글립틴의 복합제제 섭취에 의한 마우스의 당화혈색소 함량을 살펴보기로 하였다. 아모디아퀸 및 시타글립틴의 복합제제의 당화혈색소 저하효과를 측정하기 위하여, 대조 및 실험수행군 동물들의 꼬리정맥으로부터 전혈을 채취하여 Hemoglobin A1c reagent kit에 주입한 후 DCA vantage analyzer(미국, 뉴욕, 지멘스)를 이용하여 측정하였다. 상기 실험결과는 실험군과 대조군의 집단별 t검증을 실시하여 그 유의성을 검증하였으며, 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(*p<0.05, **p<0.005).
그 결과, 도 16(g)-(i)에 나타낸 바와 같이, 아모디아퀸:다파글리플로진중량비가 1:0.02 보다 1:0.2 또는 1:2의 중량비로 투여한 복합제제 투여군에서 단독투여군보다 당화혈색소 생성 억제효과과 상승되는 것을 확인하였다.
따라서, 아모디아퀸 및 다파글리플로진 복합제제가 당화혈색소를 감소시키는 효과가 있음으로 인슐린 저항성 제 2형 당뇨병 예방제 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 17. 아모디아퀸 및 엑세네타이드의 복합제제의 투여에 의한 마우스의 혈당조절 효과에 미치는 영향
17-1. 아모디아퀸 및 엑세네타이드의 단독 및 복합제제 투여
아모디아퀸 및 엑세네타이드의 복합제제에 의한 혈당조절 효과를 측정하기 위해 6주령의 ob/ob를 Jackson laboratory에서 구입하여 일정한 조건(온도:22±2℃, 상대습도:55±10%, 일주기:12시간)에서 사육하였다. 7 마리를 한 군으로 하여 케이지에서 물과 먹이를 자유 공급하였으며, 실험 전 1주일간 순화를 거쳐 실험에 사용하였다.
순응기간이 끝난 후, 6개의 군으로 나누어 8주 동안 아모디아퀸 및 엑세네타이드 단독 및 복합제제를 하기 표 5의 중량비로 격일로 피하주사로 격일 투여를 진행하였다.
군 아모디아퀸 엑세네타이드
정상대조군 - -
단독 투여군 1 -
- 0.001
- 0.005
아모디아퀸:엑세네타이드
복합조성물 투여군		 1 0.001
1 0.005
17-2. 마우스의 혈당조절 효과 측정
혈당 조절 효과를 확인하기 위하여, 16시간 절식시킨 후 대조 및 실험 수행군 동물들의 복강에 2 g/kg의 포도당을 주입하고 혈중 포도당량을 30분 간격으로 2시간 동안 측정하였다. 혈중 포도당량 측정에는 당 내성 검사(OGTT, oral glucose tolerance test)를 이용하였다. 상기 실험결과는 실험군과 대조군의 집단별 t검증을 실시하여 그 유의성을 검증하였으며, 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(*p<0.05, **p<0.005, ***p<0.0005).
그 결과, 도 17(a)-(b)에 나타낸 바와 같이, 아모디아퀸:엑세네타이드 중량비가 1:0.001 보다 1:0.005의 중량비로 투여한 복합제제 투여군에서 단독투여군보다 포도당을 투여하고 2시간 후 혈중 포도당이 빠르게 감소한 것을 확인하였다.
따라서, 아모디아퀸 단독 또는 엑세네타이드 단독 투여군의 경우보다 복합제제 투여군에서 혈중 포도당 농도를 감소시키는 우수한 상승 작용이 확인되었음으로, 아모디아퀸:엑세네타이드 1:0.005의 중량비로 투여한 복합제가 당뇨병 예방 또는 치료를 위하여 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있고 인슐린 저항성 제 2형 당뇨병 예방제 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

Claims (5)

  1. (a) 하기 화학식 1로 표시되는 아모디아퀸(amodiaquine) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염; 및
    (b) 메트포민(metformin), 부포르민(buformin) 및 펜포르민(phenformin)로 이루어진 군으로부터 선택된 비구아니드 약물(Biguanide);
    트로글리타존(troglitazone), 시글리타존(ciglitazone), 로지글리타존(rosiglitazone), 피오글리타존(pioglitazone) 및 엔글리타존(englitazone)로 이루어진 군으로부터 선택된 인슐린 감작제(insulin sensitizer);
    시타글립틴(Sitagliptin), 리나글립틴(Linagliptin), 빌다글립틴(Vildagliptin), 제미글립틴(Gemigliptin), 삭사글립틴(Saxagliptin), 알로글립틴 (Alogliptin), 테네리글립틴(Teneligliptin), 아나글립틴 (Anagliptin) 및 에보글립틴(Evogliptin)로 이루어진 군으로부터 선택된 디피피포 억제제 (Dipeptidyl peptidase 4 (DPP-4) inhibitor);
    다파글리플로진(Dapagliflozin), 카나글리플로진(Canagliflozin), 엠파글리플로진(Empagliflozin), 이프라글리플로진(Ipragliflozin), 토포글리플로진(Tofogliflozin), 루세오글리플로진(Luseogliflozin), 레모글리플로진 (Remogliflozin), 레모글리플로진 에타보네이트(Remogliflozin etabonate) 및 에르투글리플로진(Ertugliflozin)로 이루어진 군으로부터 선택된 나트륨 포도당 공동수송체 억제제(Sodium-glucose co-transporter 2 (SGLT2) inhibitor);
    엑세나타이드(Exenatide), 릭시세나타이드(Lixisenatide), 리라글루타이드(Liraglutide), 알비글루타이드 (Albiglutide) 및 둘라글루타이드 (Dulaglutide)로 이루어진 군으로부터 선택된 글루카곤양 펩티드-1 작용제(Glucagon-like peptide 1 (GLP1) agonist); 및
    글리벤클라미드(glybenclamide, glyburide), 글리피지드(glipizide), 글리클라지드(gliclazide), 글리메피리드(glimepiride), 톨라자미드(tolazamide), 톨부타미드(tolbutamide), 아세토헥사미드(acetohexamide), 카르부타미드(carbutamide), 클로르프로파미드(chlorpropamide), 글리보르누리드(glibornuride), 글리퀴돈 (gliquidone), 글리센티드(glisentide), 글리소아미드(glisolamide), 글리속세피드 (glisoxepide), 글리클로피아미드(glyclopyamide), 글리실아미드(glycylamide), 글리펜티드(glipentide), 레파글리니드(repaglinide) 및 나테글리니드(nateglinide)로 이루어진 군으로부터 선택된 인슐린 분비 촉진제(insulin secretagogue);
    아카보스(acarbose), 보글리보스(voglibose), 에미글리테이드(emiglitate) 및 미글리톨(miglitol)로 이루어진 군으로부터 선택된 알파-글루코시다제 억제제 (α-glucosidase inhibitor);
    리모나반트(Rimonabant), 오테나반트(Otenabant), 이비나반트(Ibinabant) 및 수리나반트(Surinabant)로 이루어진 군으로부터 선택된 카나비노이드 수용체-1 길항제(cannabinoid receptor 1 antagonist);
    시클로-히스프로, 또는 아연염 및 시클로-히스프로 함유 조성물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항당뇨 약물을 유효성분으로 함유하는
    PPAR-γ(Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma) 활성화에 따른 부작용을 억제하면서, 당뇨병을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00003
    .
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 PPAR-γ(Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma) 활성화에 반응하는 제2형 당뇨병 및 PPAR-α(Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha) 활성화에 반응하는 비만, 이상지질혈증, 심혈관계질환 및 지방간으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 동시에 예방 또는 치료하기 위한 것인, 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 이상지질혈증은 고지혈증(hyperlipidemia), 고중성지방혈증(Hypertriglyceridemia), 및 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 아모디아퀸 및 상기 항당뇨 약물의 중량비는 1:0.01 내지 1:500인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물의 일일 투여량은 8㎎/㎏ 내지 20㎎/㎏인, 조성물.
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