KR20160011572A - 어성초 추출물을 포함하는 항당뇨 및 항비만 효과 증진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 어성초 추출물을 포함하는 항당뇨 효과 및 항비만 효과 증진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 어성초 추출물과 대표적인 항당뇨병제인 Metformin의 병용투여를 통한 항당뇨 효과 증진 및 Metformin에 의해 유발되는 부작용의 감소를 확인하였고, 이와 함께 지방축적 억제를 통한 비만 치료 효과를 확인하였는바, 당뇨병의 효과적인 치료에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

어성초 추출물을 포함하는 항당뇨 및 항비만 효과 증진용 조성물 {A Pharmaceutical composition comprising extract of Houttuyniae cordata for enhancing the therapy of diabetes mellitus and obesity}

본 발명은 항당뇨 효과 및 항비만 효과 증진용 조성물로서, 보다 구체적으로는 항당뇨병제인 메트포민(Metformin)의 당뇨병 치료효과를 증진시킴과 동시에 비만도 치료할 수 있는 어성초(Houttuyniae cordata) 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

당뇨병은 인슐린의 절대적 또는 상대적 결핍 및 조직에서의 인슐린 작용성 저하에 기인하는 고혈당과 이에 수반되는 대사 장애를 특징으로 하는 질환이다. 인류문명의 발달에 따른 식이 형태와 생활양식의 변화로 인해 비만 인구와 함께 증가추세에 있는 제 2형 당뇨병(Type 2 Diabetes Mellitus)은 인슐린의 분비가 절대적으로 부족한 제 1형 당뇨병(Type 1 Diabetes Mellitus)과는 달리 인슐린 저항성이 주요한 병태 생리학적 특징이다. 인슐린 저항성은 유전적인 요인과 함께 말초조직에서 인슐린 감수성을 감소시키는 식이 형태나 비만, 운동부족, 스트레스 등의 생활습관과 밀접한 관련이 있다. 인슐린 민감성의 감소는 비만과 매우 높은 연관성을 가지며, 비만 상태에서의 염증 반응이 인슐린 민감성을 감소시킨다는 연구들이 많이 보고되고 있다.

현재 제 2형 당뇨병 치료제로서, 인슐린 분비능을 증가시키는 sulfonlurea 계통의 약물이 있고, 인슐린 작용력을 향상시키는 peroxisome proliferator activated receptor gamma(PPAR-γ) agonist인 pioglitazone과 rosiglitazone의 약물이 있다. 이 밖에도 간에서 당신생 합성을 감소시키는 Metformin 계통의 약물, 탄수화물의 소화흡수를 방해하여 식후 혈당의 상승을 방지하는 acarbose 계통의 약물이 있다.

이러한 약물 중에서도 Metformin은 다른 경구용 혈당강하제에 비해 저혈당 및 체중증가 등의 부작용이 적다는 장점이 있어 현재 제2형 당뇨병 환자의 1차적인 약물요법으로 사용되고 있다. 현재, Metformin은 이의 염산염으로서 글루코파지 (GLUCOPHAGE: 등록상표명, Bristol-Myers Squibb Company)의 정제 형태로 시판되고 있다. 시판되고 있는 글루코파지 정제는 500mg, 850mg, 또는 1000mg의 염산 Metformin을 함유하고 있으며, 그 투여는 효능 및 내성의 양 측면을 고려하여 하루에 2,550 mg의 최대 요구 용량을 초과하지 않는 범위 내에서 이루어지고 있다.

Metformin은 French lilac의 주요성분으로 1957년부터 유럽에서 사용되어 왔고, 미국에서는 1994년부터 사용이 허가되었으나 작용기전은 비교적 최근에 밝혀졌다. 이제까지 알려진 대표적인 작용기전은 세포의 에너지 조절에 관여하는 AMP-activated protein kinase(AMPK)의 활성화를 유도하여 간에서 당 신생작용을 억제하고 근육 및 간에서 지방산 산화를 촉진시키는 것으로 보고되었다. 최근 연구결과에 의하면 Metformin의 혈당저하작용에는 AMPK의 인산화 상위 kinase인 LKB1이 필요한 것으로 밝혀졌으며, LKB1에 의해 transcriptional co-activator인 TORC2의 인산화를 통한 당신생 억제작용을 나타내는 것으로 밝혀졌다.

다만, Metformin에 의해 유발되는 부작용으로서, 복용 환자의 20 내지 30 ％에서, 식욕 감퇴, 복부 팽만감, 구역, 설사 등이 보고된바 있다. 또한, 드물게 젖산증(lactic acidosis)을 유발하는 것으로 보고되었고, 이로 인해 신질환, 간질환, 저산소증, 심각한 감염, 알코올중독증 등이 동반된 경우에는 주의를 필요로 한다. 이러한 부작용은 최소 및/또는 지속 용량을 감소시키거나 투약 횟수를 줄이거나 다른 약제와 병용 투여하는 방법에 의해 부분적으로 해결될 수 있다.

따라서, 약제의 병용 또는 혼합을 통한 Metformin의 당뇨병 치료효과 상승 및 부작용 감소가 주요한 과제의 대상 되고 있고, 관련 연구가 이루어지고 있으나(한국 특허공개번호 10-2011-0123908), 아직 미비한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 항당뇨병제인 Metformin과 어성초 추출물의 병용에 의한 항당뇨 효과의 증진, 부작용 감소 및 지방축적 억제 효과를 확인하고, 이에, 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명의 목적은 항당뇨병제인 Metformin과 병용되는, 어성초 추출물을 포함하는 항당뇨 효과 증진용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항 당뇨병제인 Metformin과 병용되는, 어성초 추출물을 포함하는 항당뇨 효과 증진용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 조성물은 상기 항 당뇨병제인 Metformin과 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 조성물은 지방세포의 분화를 억제시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 어성초 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상 용매로 추출한 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 AMPK-α, PPAR-α 및 PPAR-γ로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 발현을 증가시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 XBP-1 유전자 발현을 감소시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료효과 증진 및 비만 치료방법을 제공한다.

본 발명은 어성초 추출물을 포함하는 조성물의 당뇨병 치료효과 증진 및 비만의 치료 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은 어성초 추출물을 유효성분으로 포함하며, 상기 어성초 추출물과 항당뇨병제인 Metformin을 병용함으로써, 당뇨병, 전당뇨 치료 효과 증진 및 부작용 감소를 확인하였는바, 당뇨병을 치료효과를 증진시키기 위한 약학 조성물로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 아울러, 상기 당뇨병 치료효과와 함께 지방축적 억제효과를 확인하였는바, 당뇨병 치료와 함께 비만의 예방 또는 치료 효과를 기대할 수 있다.

도 1은 3T3-L1 세포에서, 어성초 추출물(OSC; 수 추출물, OSC30; 30% 에탄올 추출물, OSC100; 100% 에탄올 추출물) 투여에 의한 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 2는 3T3-L1 세포에서, 어성초 추출물(OSC; 수 추출물, OSC30; 30% 에탄올 추출물, OSC100; 100% 에탄올 추출물) 및 Metformin 병용 투여에 의한 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 3은 3T3-L1 세포에서, 다양한 농도의 어성초 추출물(20, 50, 100, 200 ㎍/㎖) 투여에 의한 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 4는 HepG2 세포에서, 어성초 추출물(OSC; 수 추출물, OSC30; 30% 에탄올 추출물, OSC100; 100% 에탄올 추출물) 및 Metformin 병용 투여에 의한 세포 내 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 활성 변화를 확인한 결과이다.
도 5는 RAW 264.7 세포에서, 어성초 추출물(OSC; 수 추출물, OSC30; 30% 에탄올 추출물, OSC100; 100% 에탄올 추출물) 투여에 따른 일산화 질소 생성 억제능을 확인한 결과이다.
도 6은 RAW 264.7 세포에서, 어성초 추출물(OSC; 수 추출물, OSC30; 30% 에탄올 추출물, OSC100; 100% 에탄올 추출물) 및 Metformin 병용 투여에 의한 세포 내 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 활성 변화를 확인한 결과이다.
도 7은 3T3-L1 세포에서, 어성초 추출물(OSC; 수 추출물, OSC30; 30% 에탄올 추출물, OSC100; 100% 에탄올 추출물) 및 Metformin 병용 투여에 의한 지방세포 분화 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 8은 미분화된 L6 rat myoblast 세포에서, 어성초 추출물(OSC; 수 추출물, OSC30; 30% 에탄올 추출물, OSC100; 100% 에탄올 추출물)과 Metformin 병용 투여에 의한 포도당 섭취능 증진 효과를 확인한 결과이다.
도 9는 미분화된 L6 rat myoblast 세포에서, 어성초 100% 에탄올 추출물(OSC)과 Metformin의 병용 투여에 의한 포도당 섭취능 증진 효과를 확인한 결과이다.
도 10은 미분화된 L6 rat myoblast 세포에서, 다양한 농도의 어성초 추출물(50, 100, 200㎍/㎖)과 Metformin의 병용 투여에 의한 포도당 섭취능 증진 효과를 확인한 결과이다.
도 11은 RIN-m5F insulinoma 세포에서, 어성초 추출물(OSC; 수 추출물, OSC30; 30% 에탄올 추출물, OSC100; 100% 에탄올 추출물) 및 Metformin 병용 투여에 의한 인슐린 분비능을 확인한 결과이다.
도 12는 미분화된 L6 rat myoblast 세포에서, 어성초 추출물 및 Metformin 병용 투여 (OSC+met1)에 의한 인슐린 저항성 개선 여부를 확인한 결과이다.
도 13은 3T3-L1 세포에서, 어성초 100% 에탄올 추출물(OSC100)과 Metformin의 병용 투여에 의한 DPP-4(dipeptidyl peptidase-4)의 발현량 변화를 확인한 결과이다.
도 14는 3T3-L1 세포에서, 어성초 100% 에탄올 추출물(OSC100)과 Metformin의 병용 투여에 의한 PPAR-γ 단백질 발현량 변화를 확인한 결과이다.
도 15는 3T3-L1 세포에서, 다양한 농도의 어성초 추출물(50, 100, 200㎍/㎖) 과 Metformin의 병용 투여에 의한 PPAR-γ 단백질 발현량 변화를 확인한 결과이다.
도 16은 3T3-L1 세포에서, 다양한 농도의 어성초 추출물(50, 100, 200㎍)과 Metformin의 병용 투여에 의한 AMPK 단백질 발현량 변화를 확인한 결과이다.
도 17은 RAW 264.7 세포에서, Metformin(M), 어성초 30% 에탄올 추출물 및 Metformin 병용 투여(M+USE) 또는 어성초 수 추출물 및 Metformin 병용 투여 (M+USW)에 의한 AMPK-α 유전자 발현량 변화를 확인한 결과이다.
도 18은 RAW 264.7 세포에서, Metformin(M), 어성초 30% 에탄올 추출물 및 Metformin 병용 투여(M+USE) 또는 어성초 수 추출물 및 Metformin 병용 투여(M+USW)에 의한 PPAR-α 유전자 발현량 변화를 확인한 결과이다.
도 19는 RAW 264.7 세포에서, Metformin(M), 어성초 30% 에탄올 추출물 및 Metformin 병용 투여(M+USE) 또는 어성초 수 추출물 및 Metformin 병용 투여(M+USW)에 의한 PPAR-γ 유전자 발현량 변화를 확인한 결과이다.
도 20은 RAW 264.7 세포에서, Metformin(M), 어성초 30% 에탄올 추출물 및 Metformin 병용 투여(M+USE) 또는 어성초 수 추출물 및 Metformin 병용 투여(M+USW)에 의한 XBP-1 유전자 발현량 변화를 확인한 결과이다.
도 21은 4주령의 OLETF/LETO rat에서, (a) 어성초 추출물 및 Metformin 병용 투여(OSC+Met)에 의한 인슐린 저항성 변화, 및 (b) 시간의 경과에 따른 혈당 변화를 확인한 결과이다.
도 22는 어성초 추출물 및 Metformin 병용 투여후, 시간의 경과(120, 240, 360, 380, 600, 720 min)에 따른 (a) 1일째, 7일째, 또는 (b) 28일째 혈중 Metformin의 농도 변화를 확인한 결과이다.
도 23은 어성초 추출물 및 Metformin 병용 투여에 따른 Metformin의 uptake 변화를 확인한 결과이다.

본 발명에서, Metformin 및 어성초(Houttuyniae cordata) 추출물의 병용에 의한 항당뇨 및 지방축적 억제효과와 관련된 AMPK-α(AMP-activated protein kinase-alpha), PPAR-α(Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha), PPAR-γ(Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma) 유전자 발현의 증가를 확인하였다. 또한, Metformin의 부작용과 관련된 XBP-1(X-box binding protein 1) 유전자 발현의 감소를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 항 당뇨병제인 Metformin과 병용되는, 어성초 추출물을 포함하는 항당뇨 효과 증진용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 어성초 추출물은 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 추출할 수 있다. 예컨대, 본 발명에서 어성초 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상 용매를 사용하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는 에탄올을 사용할 수 있다. 또한, 어성초로부터 추출물을 추출하는 방법은 열수 추출, 냉침 추출, 환류 추출, 초음파 추출 등의 다양한 방법을 통하여 추출할 수 있지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.

상기 제조된 추출물은 이후 여과하거나 농축 또는 건조과정을 수행하여 용매를 제거할 수 있으며, 여과, 농축 및 건조를 모두 수행할 수 있다. 예컨대, 여과는 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 농축은 감압 농축기, 건조는 동결건조법 등을 수행할 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 용매로 추출한 추출물은 이후, 헥산, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 에틸아세테이트, 에틸 에테르, 클로로포름, 물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 분획과정을 더욱 실시할 수도 있다. 상기 분획 시 온도는 4℃ 내지 120℃일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 당뇨병에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 조성물에 의한 예방, 치료 대상 질병인 "당뇨병(diabetes Mellitus)"은 만성 대사성 질환으로 오랜 시간이 경과함에 따라 혈관장애와 신경, 신장 및 망막 등의 기능이상을 초래하고 이로 인해 생명까지 잃게 하는 질환이다. 당뇨병은 크게 발생하는 기전에 따라 인슐린 의존형 당뇨병(제1형 당뇨병)과 인슐린 비의존형 당뇨병(제2형 당뇨병)으로 구분되며, 본 발명에서는 바람직하게는 인슐린 비의존형 당뇨병을 의미한다. 상기 인슐린 비의존형 당뇨병은 일반적으로 인슐린에 대하여 저항성을 나타내며 인슐린의 작용부전으로 인하여 과혈당 상태가 지속되는 것이 보통이다. 만성적 고혈당은 췌장 베타 세포에 손상을 일으켜 세포 사멸을 야기하므로 제2형 당뇨병의 치료를 위해서는 효과적인 혈당 조절을 필요로 한다.

본 발명의 조성물과 병용되는 항당뇨병제로서, gliclazide, glibenclamide, repaglinide, nateglinide, mitiglinide, rosiglitazone, pioglitazone, acarbose, voglibose 등일 수 있으며, 바람직하게는 Metformin일 수 있으나, 이로써 제한되는 것은 아니다.

예컨대, 본 발명에서 사용되는 항당뇨병제인 "메트포민(Metformin)"은 바이구아나이드 (biguanide)계열 약물로서, 2형 당뇨병 환자의 1차적인 치료약물로 이용되고 있으나, 식욕 감퇴, 복부 팽만감, 구역, 설사, 피부 발진등의 부작용이 있는바, 이에 대한 각별한 주의가 요구되는 실정이다.

따라서, 본 발명에 따른 조성물은 항당뇨병제 투여에 의한 항당뇨 효과의 증진 및 부작용 경감을 위하여, 항당뇨병제와 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 항당뇨 치료 효과 증진과 동시에 비만을 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 조성물에 의한 예방, 치료 대상 질병인 "비만(obesity)"은 대사 장애로 인하여 체내에 지방세포가 증식 분화하고 이로 인하여 지방이 과잉으로 축적된 상태를 의미하며, 에너지 흡수량이 소비량에 비해 상대적으로 증가하는 경우, 지방세포의 수와 부피가 증가되는 과정을 거쳐 결과적으로 지방조직의 질량이 증가된다. 세포 수준에서의 비만은 지방세포의 증식 및 분화의 촉진으로 인한 지방세포의 수와 부피의 증가를 의미한다.

비만은 제2형 당뇨병의 주요한 병태생리학적 특징인 인슐린 저항성 증가와 밀접한 연관성을 가지고 있다. 인슐린 저항성은 다량의 인슐린 주사에 의해서도 혈당강하가 일어나지 않는 상태로써, 인슐린 민감도 감소를 의미한다. 이러한 인슐린 민감도 감소는 아디포카인들(adipokines)과 유리지방산 (free fatty acid)의 불규칙적인 분비로 인하여 지방산이 베타세포나 신장, 간, 심장 등 인슐린 민감성 조직내에 쌓여 지방 독성(lipotoxicity)을 나타내기 때문에 발생하는 것으로 알려져 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 AMPK-α, PPAR-α 및 PPAR-γ로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 발현을 증가시키는 것을 특징으로 한다.

상기 AMPK-α, PPAR-α 및 PPAR-γ은 항당뇨 효과 항당뇨 및 지방축적 억제효과와 관련성이 있는 유전자로서, AMPK (AMP-activated protein kinase)는 세포 내 에너지가 부족한 상황(ATP에 비해 AMP가 증가하는 상황)에서 활성화 되어 정상 에너지 균형을 회복시키기 위해 ATP를 소비하는 과정(지방산, 콜레스테롤 등의 합성을 억제하고 반대로ATP를 생산하는 과정), 즉 지방산 산화, 해당과정을 활성화하며, PPAR-α는 중성지방의 분해에 관여하는 당지질 대사를 조절하고, lipoprotein lipase(LPL)을 통해 triglyceride(TG)의 level을 낯추는 역할을 하며, PPAR-γ는 지방세포의 전사조절분자 중의 하나로서, 지방세포의 분화 및 지방합성과 저장에 관여하는 효소들의 발현을 조절하는 역할을 할 뿐만 아니라, 인슐린 민감도를 항진시키는데 있어서 중요한 기능을 가지고 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 XBP-1 유전자 발현을 감소시키는 것을 특징으로 한다.

상기 XBP-1 유전자는 의 부작용과 관련성이 있는 유전자로서, XBP-1 유전자는 소포체 스트레스에 관여하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 일시예에서는 어성초 추출물의 단독 투여, 또는 Metformin와의 병용 투여의 경우, 세포 독성을 나타내지 않음을 확인하였으며, 병용 투여에 의한 세포 내 활성산소종 감소, 자유 라디칼 제거, 일산화 질소 생성 억제, 및 지방 세포 분화 억제 효과를 실험적으로 확인하였다(실시예 1 내지 5 참조). 또한, 어성초 추출물의 병용 투여를 통한 포도당 섭취 증진, 인슐린 분비 증가, 및 인슐린 저항성 개선 효과를 확인하였으며, DPP-4 단백질 발현 억제, 및 PPAR-γ, AMPK 단백질 발현 증가를 확인하였다(실시예 6 내지 9 참조). 또한, AMPK-α, PPAR-α, PPAR-γ 유전자 발현의 증가를 통해 항당뇨 효과의 증진 및 지방축적 억제효과를 확인하였고, XBP-1 유전자 발현의 감소 통해 Metformin에 의하여 유발되는 부작용 감소를 확인하였으며, In vivo 동물실험을 통하여, 인슐린 저항성 감소, 및 어성초 추출물과 Metformin의 병용 투여에 의해 Metformin의 약동학적 성질에는 변화가 없음을 구체적으로 확인하였다(실시예 10 내지 12).

본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성셀룰로스, 폴리비닐피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 약제학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 내지 150mg, 바람직하게는 0.01 내지 100mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료 방법을 제공한다. 본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 세포 독성 실험

3T3-L1 세포를 96-well plate에 3×10³/well 세포로 100㎕씩 분주하여 CO₂ incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 다양한 농도의 샘플을 각 well에 첨가하고 24시간 동안 배양한 후, EZ-Cytox 10㎕를 각 well에 첨가하였다. 2시간 동안 incubator에서 반응 시킨 후, 흡광도를 측정하기 전 1분 동안 plate를 shaking하고 96-well plate reader를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 추출방법(물 (OSC), 30% 에탄올(OSC 30), 100% 에탄올 추출(OSC 100)), Metformin과의 병용 투여 여부, 및 어성초 추출물의 농도 변화(20, 50, 100, 200 ㎍/㎖)에 따른 세포 독성을 측정하였다.

그 결과, 도 1 내지 도 3에 나타낸 바와 같이, 단독 또는 Metformin과의 병용 투여여부 및 추출방법의 차이와 관계없이 모든 군에서 세포 독성을 나타내지 않았다. 또한, 어성초 추출물 투여 농도의 증가에도 불구하고, 역시 세포 독성은 관찰되지 않았다.

실시예 2. 세포 내 활성산소종 활성 측정

HepG2 세포를 6-well plate에 3×10⁵/well 세포로 2mL씩 분주하여 8시간 동안 CO₂ incubator에서 배양한 후, Metformin 단독 투여 또는 어성초 추출물과 Metformin을 병용 투여하였으며, 다시 6시간 동안 배양한 후, 세포를 회수하였다. 1200g 5분간 원심분리 후, 상층액을 버리고, 5ug/mL DHR123을 처리하여 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 다시 5분간 원심분리한 후, PBS로 2번 washing하고 여과시켰으며, FACS 형광 값으로 세포 내 활성산소종 활성을 측정하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 정상군(Normal)과 비교하여, Metformin 투여군(Metformin)에서 세포 내 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 활성이 감소하는 경향을 보였다. 또한, 어성초 추출물 및 Metformin 병용 투여군은, 세포 내 활성산소종의 활성을 더욱 감소시켰으며, 어성초 100% 에탄올 추출물(OSC 100%+Met)에서 가장 우수한 효과를 확인하였다.

실시예 3. DPPH 자유 라디칼 소거활성 측정

샘플 40ul를 300uM의 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 760ul에 혼합하고 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 96-well에 triplicate로 분주하였으며, microplate reader에서 515nm의 파장으로 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로 BHT를 사용하였으며, 본 실시예에서는 3가지 추출방법(물, 30% 에탄올, 100% 에탄올 추출)에 따른 어성초 추출물에서 DPPH 자유 라디칼(DPPH free radical) 제거능력을 측정하였고 IC₅₀를 계산하였다.

그 결과, 대조군인 BHT의 경우, 113.85 ㎍/㎖으로 측정되었다. 또한, 어성초 물, 30% 에탄올, 또는 100% 에탄올 추출물을 투여한 경우, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, IC₅₀은 각각 239.80㎍/㎖, 246.10㎍/㎖, 293.11㎍/㎖으로 우수한 자유 라디칼 제거능을 확인하였으며, 어성초 수 추출물(Water extract)에서, 가장 우수한 효과를 확인하였다.

실시예 4. 일산화 질소 생성 억제능 측정

항염증 기능을 비교하기 위해서 LPS로 유도된 일산화질소(NO) 형성 in vitro 모델을 이용하여 실험하였으며, NO 측정은 cell의 상층액에서 Griess reaction (Green et al., 1982)에 기초해 측정하였다. RAW 264.7 세포를 1.5×10⁵ cells/mL로 접종하고, 여러 농도로 희석한 시료로 전 처리한 후, 1시간 뒤에 lipopolysaccharide(LPS; Sigma, St Louis, MO, USA) 1 ㎍/mL을 처리하여 24시간 배양하였다. 96-well plate에 세포 배양 상층액 50 μL와 Griess 시약 1% (w/v) sulfanilamide 50 μL를 첨가한 다음 차광하여 10분 동안 실온에서 반응시킨 후, 2.5% (v/v) phosphoric acid에 녹인 0.1% (w/v) N-1-napthylethylenediamine을 50μL 혼합하여 10분 동안 차광하여 반응시켰다. 흡광도는 30분 이내에 microplate reader (Molecular Device, CA, USA)를 이용하여 540㎚에서 측정하였다. NO의 생성량 산출은 nitric oxide standard solution을 이용하여 계산하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 LPS 투여군 (LPS)과 비교하여, Metformin 단독 투여군(Met 0.5, Met 1, Met 2)에서 일산화 질소의 생성량이 감소하는 경향성을 보였으며, 어성초 추출물을 단독으로 투여한 경우에도 추출 방법과 관계없이 LPS 투여군(LPS)보다 일산화 질소 생성량이 감소하였다. 또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, Metformin 단독 투여군과 비교하여, Metformin 및 어성초 추출물 병용 투여군에서 일산화 질소 생성량이 더욱 감소되어 시너지 효과(synergic effect)를 확인할 수 있었다.

실시예 5. 지방세포 분화 억제 효과 확인

3T3-L1 세포를 6-well plate에서 5×10⁵ cells/well의 농도로 seeding 한 후, 세포가 full confluence가 될 때까지 배양하였다. 1uM Dexamethasone, 0.5mM IBMX, 10ug/ml insulin이 포함된 DMEM(Differentiation media)으로 바꾸어 48시간 동안 배양한 후, 10ug/ml의 insulin이 포함된 DMEM(maturation media)을 처리하여 분화를 유도하였다. 상기와 같이 분화가 유도된 지방 세포에 다양한 농도의 샘플 또는 양성대조군을 처리하였으며, Oil red O staining 염색법, TG, 및 TC assay를 통해서 지방세포 분화 억제 효과를 분석하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여, Metformin 단독 투여군(Met)에서, 전지방세포인 3T3-L1의 분화에 의한 지질 형성이 억제되는 경향성을 보였다. 또한, Metformin 및 어성초 추출물 병용 투여군에서 보다 우수한 억제효과를 나타냈으며, 어성초 30% 에탄올 추출물(OSC 30%+Met)에서 가장 우수한 효과를 확인하였다.

실시예 6. 포도당 섭취능 측정 (Glucose uptake assay)

미분화된 L6 rat myoblast 세포를 2% Horse serum등을 이용하여 myotube 세포로 분화 유도시키거나 HepG2 cell을 이용하여 96-well clear-bottom blackwell plate에서 incubation 한 이후, 12시간 동안 glucose free media로 배지를 바꾸어 glucose starvation 상태에서 incubation하였다. 이 후 다양한 샘플과 함께 형광시약인 2-NBDG를 100ug/ml의 농도로 포함한 glucose free media로 바꾸어 6~12시간 동안 incubation하였으며, DPBS를 이용하여 2회 washing 한 후, fluorescence microplate reader를 이용하여 Ex/Em = 485/535nm 파장에서 형광을 측정하였으며, 포도당 섭취를 억제시키는 Apigenin을 대조군으로 이용하였다.

그 결과, 도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여, Metformin 단독 투여군(Met)에서 포도당 섭취능력이 증가하였으며, Metformin 단독 투여군과 비교하여, 어성초 수 추출물 및 Metformin 병용 투여군(OSC), 어성초 100% 에탄올 추출물 및 Metformin 병용 투여군(OSC100)에서 포도당 섭취능력이 현저하게 증진됨을 확인하였다. 또한, 도 10에 나타낸 바와 같이, 병용 투여되는 어성초 추출물의 농도가 증가(50, 100, 200 ㎍/㎖)함에 따라, 포도당 섭취능력이 증진됨을 확인하였다.

실시예 7. 인슐린 분비능 측정 (Insulin uptake assay)

RIN-m5F insulinoma 세포를 10 % FBS, 0.6 % PS(Penicillin Streptomycin), 300 mg/L L-glutamine가 포함된 RPMI 1640 Medium(WELGENE Inc, Korea)배지를 처리한 후, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. RIN-m5F 세포를 12-well plate에 well 당 3×10⁵cell/well를 분주하여 3일 동안 배양한 후, Metformin 0.75 mM과 어성초 추출물(OSC)을 각각 병용 처리하였다. 2일 동안 배양한 후, 배지를 제거하고 modified Kreb's ringer bicarbonate 완충액(KRBB-HEPES, 134mmol/L NaCl, 4.8mmol/L KCl, 1mmol/L CaCl₂, 1.2mmol/L MgSO₄, 1.2mmol/L KH₂PO₄, 5mmol/L NaHCO₃, 10mmol/L HEPES, 1mg/mL BSA, pH7.4)으로 2회 세척하고, 20mM의 포도당을 함유한 KRBB-HEPES 완충액으로 바꾸어 1시간 배양하였다. 상층액을 취하여 4℃에서 10분간 원심분리하고 다시 상층액을 모아 -20℃에 보관하여 사용하였다. 분비된 인슐린의 양은 rat insulin ELISA kit(Mercodia, Sweden)로 측정하였으며, 각 well의 세포 단백질의 농도를 측정하여 단백질 각 단위 그램 당 인슐린 분비량을 계산하였다.

그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, Metformin 단독 투여군(MET1, MET2)의 경우 인슐린 분비량이 크게 증가하지 않은 반면, Metformin 및 어성초 추출물 병용 투여군에서는 인슐린 분비량이 현저하게 증가하였으며, 어성초 30% 에탄올 추출물에서, 가장 우수한 효과를 확인하였다.

실시예 8. 인슐린 저항성 측정 (Insulin resistance assay)

미분화된 L6 rat myoblast 세포를 96well clear-bottom blackwell plate에 분주하고 2% Horse serum을 이용하여 myotube로 분화 유도 시킨 후, 형광 결과를 측정하였다. 분화된 L6 세포의 배지를 2시간 동안 glucose free media로 바꾸어 glucose starvation 상태에서 다양한 농도의 샘플을 처리하였다. 이 후, 5mM 농도의 glucosamine을 포함한 glucose free media로 배지로 교환한 후, 6~12시간 동안 배양하여 insulin resistance를 유도하였다. 상층액을 모두 제거 후, 100ug/ml 농도의 2-NBDG가 포함된 glucose-free media를 처리하여 6시간 배양한 후, DPBS로 2회 washing 하고 fluorescence plate reader에서 Ex/Em = 485/535nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, insulin, 및 glucosamine을 투여하는 조건에서, Metformin 단독 투여 군과 비교하여 어성초 추출물 및 metfomrin 병용 투여군에서, 우수한 glucose uptake를 확인하였으며, 즉 synergic하게 인슐린 저항성을 개선하는 효과를 보였다.

실시예 9. 관련 단백질의 발현량 변화 확인

3T3-L1 전지방세포를 10% FBS, 1% PS(Penicillin Streptomycin)가 포함된DMEM(WELGENE Inc, Korea)에 처리하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 상기 세포를 세포 배양용 6-well plate에 8x10⁴/well로 분주하였고, 세포의 분화를 유도하기 위하여 세포의 confluency가 50~60%가 될 때, 0.5mM IBMX, 1 μΜ Dexamethasone, 10μg/ml insulin / 10% FBS가 포함된 DMEM 분화유도 배양액으로 바꾸어 3일간 배양하였다. 3일 후, 10 μg/mL insulin/10 % FBS가 포함된 DMEM 배지로 배양하며, 2일마다 배지를 교환하였으며, 분화 5일째 샘플을 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 6-well plate의 세포를 PBS로 두번 washing하고 RIPA buffer(50 mM Tris-HCl pH7.4, 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM PMSF, 1mM NaF, 1mM sodium, 1㎍/㎖ aprotinin, leupeptin, pepstatin)를 이용하여 용해하고, 12,000rpm에서 20분간 원심 분리하여 단백질을 포함하는 상층액을 얻어내었다. BCA(Thermo Scientific, USA) 방법에 따라 정량 후 10 %의 polyacrylamide gel상에서 전기영동을 하였다. 전기영동 후, gel상의 단백질을 PVDF membrane에 200 mA로 1.5 시간 동안 전이시켜 5% skim milk 또는 5% BSA로 비특이적인 단백질에 대한 blocking을 한 후, 일차 항체를 4℃에서 overnight 처리하고 TBS-T로 10분씩 세 번 세척하였다. 이후 이차 항체를 상온에서 1시간 처리하여 TBS-T로 10분씩 세 번 세척하고 ECL(NEURONEX, Korea) 용액을 처리하여 LAS-3000(FUJIFILM, Japan)으로 단백질 발현량을 관찰하였다.

그 결과, 도 13 내지 도 16에 나타낸 바와 같이, Metformin 단독 투여군(MET1, MET2)과 비교하여, Metformin 및 어성초 추출물 병용 투여군에서 DPP-4 (dipeptidyl peptidase-4)의 발현량이 억제된 반면, PPARγ 및 AMPK의 발현량은 유의적으로 증가하였다. 본 실시예에서, DPP-4는, 인크레틴 분해를 담당하는 DPP-4 효소와 관련된 단백질로, DPP-4의 발현이 억제될 경우, 인슐린의 합성/분비가 촉진 되고 glucagon 억제 및 간에서의 glucose 합성 억제를 통해 혈당을 조절할 수 있으며, PPARγ은 발현량이 증가함에 따라 인슐린의 감수성을 증가시키는 역할, AMPK는 생체내의 에너지 대사 및 항상성 조절의 중심적인 역할 것으로 알려져 있다. 따라서, 상기 결과는 Metformin 및 어성초 추출물 병용 투여를 통해 보다 항당뇨 효과를 보다 증진시킬 수 있음을 의미한다.

실시예 10. 관련 유전자의 발현량 변화 확인

10-1. 세포 및 어성초 추출물의 준비

Macrophage cell line인 RAW 264.7 세포는 한국 세포주 은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분주 받아 사용하였고, 세포배양은 DMEM에 10% FBS와 2 mML-glutamine, 100 U/ml penicillin, and 100 lg/ml streptomycin이 함유된 배지를 사용하였다. CO₂ incubator 37℃, 5% CO_2, 95% O₂ 조건하에서 배양하였다. 실험에 사용된 어성초 추출물(water 100%, ethanol 30%)은 동국대학교 약학대학에서 제공 받아 사용하였다. 각각의 세포를 정상군 (N), Metformin 투여군 (M), Metformin + 어성초 추출물(ethanol 30%) 투여군(M+USE), 어성초 추출물(수 추출물) 투여군 (M+USW)으로 총 4군에 대하여 실험을 진행하였다.

RAW 264.7 세포는 DMEM에 10% FBS와 2 mML-glutamine, 100 U/ml penicillin, and 100 lg/ml streptomycin이 함유된 배양액을 사용하여 37℃, 5% CO₂, 90% humidity의 조건하에서 배양되었다. 배양된 세포는 2~3일에 한 번씩 배양액을 바꾸어 주면서 배양하여 세포분화가 최대에 도달하였을 때 phosphate buffered saline(PBS)으로 세포를 세척한 후, trypsin-EDTA 용액으로 부착된 세포를 분리한 뒤 원심 분리하여 세포를 모은 다음, 세포와 배지를 잘 혼합하여 계대 배양하여 사용하였다.

10-2. 항당뇨 효과 관련 유전자 발현

Metformin과 어성초 추출물의 병용이 항당뇨 효과와 관련 유전자의 발현에 어떠한 영향을 주는지 확인하기 위하여 단독으로 Metformin을 투여(M)한 RAW 264.7 세포와 Metformin + 어성초 (ethanol 30% 또는 water 100%)을 투여한 RAW 264.7 세포간의 AMPK-α, PPAR-α, PPAR-γ 유전자 발현을 Real-time PCR을 통하여 비교하였다.

total RNA는 Trisure (Bioline, USA)를 사용하여 protocol에 따라 분리 정제하였다. 1㎍의 total RNA를 cDNA synthesis kit (Sprint TMRT Complete Oligo-(dT)18, Clontech, MountainView, CA, USA)를 이용하여 protocol에 따라 역전사 반응을 수행하여 first strand cDNA를 얻었다. RT-PCR 샘플은 Light Cycler-Fast Start DNA Master SYBR Green(Roche Applied Science, Indianapolis, ID, USA)을 이용하여 최종 반응 용량을 20μL로 하여 Light Cycler instrument(Roche Applied Science)에서 진행하였다.

상기 실시예에서 사용된 Primer의 DNA sequence는 다음과 같다.

PCR amplification은 C/EBPα에서 95℃에서 10분 동안 prior incubation 후, 45 cycle의 amplification (95℃에서 10초간 denaturation, 52℃에서 10초간 annealing, 72℃에서 15초간 extension) 하였고 beta-actin에서는 95℃에서 10분 동안 prior incubation 후, 35 cycle의 total RNA는 Trisure (Bioline, USA)를 사용하여 protocol에 따라 분리 정제하였다. 1㎍의 total RNA를 cDNA synthesis kit (Sprint TMRT Complete Oligo-(dT)18, Clontech, MountainView, CA, USA)를 이용하여 protocol에 따라 역전사 반응을 수행하여 first strand cDNA를 얻었다. RT-PCR 샘플은 Light Cycler-Fast Start DNA Master SYBR Green(Roche Applied Science, Indianapolis, ID, USA)을 이용하여 최종 반응 용량을 20μL로 하여 Light Cycler instrument(Roche Applied Science)에서 진행하였다.

그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, AMPK-α 유전자 발현은 정상군 (N)은 0.80, Metformin 처리군 (M)은 0.76으로 측정되었다. Metformin 및 어성초 추출물(ethanol 30%) 병용 투여군(M+USE), Metformin 및 어성초 추출물(water 100%) 병용 투여군(M+USW)에서 AMPK-α 유전자의 발현의 증가를 확인하였으며, 특히 M+USE군은 0.84로서, 유의적인 발현 증가를 확인하였다.

또한, 도 18에 나타난 바와 같이, PPAR-α 유전자 발현은 정상군 (N)은 1.01, Metformin 처리군 (M)은 0.68로 측정되었다. Metformin 및 어성초 추출물(ethanol 30%) 병용 투여군(M+USE)은 2.29, Metformin 및 어성초 추출물(water 100%) 병용 투여군(M+USW)은 1.59로 측정되었으며, PPAR-α 유전자의 발현의 증가를 확인하였다.

아울러, 도 19에 나타난 바와 같이, PPAR-γ 유전자 발현은 정상군 (N)은 1.03, Metformin 처리군 (M)은 0.83으로 측정되었다. Metformin 및 어성초 추출물(ethanol 30%) 병용 투여군(M+USE)은 0.94로 측정되었으며, PPAR-γ 유전자의 발현의 증가를 확인하였다.

10-3. Metformin의 부작용 관련 유전자 발현

Metformin과 어성초 추출물의 병용이 Metformin에 의해 유발되는 부작용과 관련 유전자의 발현에 어떠한 영향을 주는지 확인하기 위하여 단독으로 Metformin을 투여(M)한 RAW 264.7 세포와 Metformin + 어성초 (ethanol 30% 또는 water 100%)을 투여한 RAW 264.7 세포간의 XBP-1 유전자 발현을 Real-time PCR을 통하여 비교하였다. RAW 264.7 세포는 상기 실시예 9-2와 동일하게 수득하였으며, 각각의 세포를 정상군 (N), Metformin 투여군 (M), Metformin + 어성초 추출물(ethanol 30%) 투여군(M+USE), 어성초 추출물(수 추출물) 투여군 (M+USW)으로 총 4군에 대하여 실험을 진행하였다.

XBP-1 유전자 발현을 확인하기 위하여, Primer를 제외하고, 상기 실시예 10-1에 기재된 방법과 동일한 방법으로, Real-time PCR을 실시하였다.

상기 실시예에서 사용된 Primer의 DNA sequence는 다음과 같다.

그 결과, 도 20에 나타낸 바와 같이, XBP-1 유전자 발현은 정상군 (N)은 1.00, Metformin 처리군 (M)은 1.01로 측정되었다. Metformin 및 어성초 추출물(ethanol 30%) 병용 투여군(M+USE)은 0.32, Metformin 및 어성초 추출물(water 100%) 병용 투여군(M+USW)은 0.40으로 측정되었으며, XBP-1 유전자 발현의 감소를 확인하였다.

실시예 11. Intraperitoneal insulin tolerance test (IPITT)

당뇨병에 대한 메트포민과 어성초 추출물 병용 투여 효과를 확인하기 위해 4주령의 OLETF rat, LETO rat (Otsuka Pharmaceutical, Japan)을 분양받아 8주간의 적응기간 거쳐 100mg/kg의 Metformin 단독 투여 또는 200mg/kg의 어성초 추출물과 100mg/kg의 Metformin을 병용 투여 하였다. 매주 식이 섭취량과 무게, 상태 등을 체크하였고, 24주째에 꼬리정맥에서 채혈하여 IPITT를 수행하였다. 12주 후 동물을 zoletil/rumpun IP 투여로 마취하여 희생하였고, 지방과 각 장기 샘플과 혈청 샘플을 분리하였다. 실험 종료 1주전 OLETF/LETO를 15시간 동안 금식시키고, 1U/kg 농도의 인슐린을 IP로 주사한 후, 각 개체의 꼬리정맥에서 0min, 30min, 60min, 90min, 120min의 시간대에 소량의 출혈을 시켜 혈액에서 Accucheck 혈당 검사기 (Roche, USA)를 이용하여 혈당을 측정하였다. 결과는 AUC(area under curve)등을 이용하여 분석하였다.

그 결과, 도 21에 나타낸 바와 같이, LETO군보다 OLEFT군에서 인슐린 저항성이 높게 관찰되었으며, 상기 저항성은 Metformin 단독 처리를 통해 감소하는 경향을 보였다. 또한, Metformin 단독 투여군과 비교하여, Metformin 및 어성초 추출물 병용 투여군에서 인슐린 저항성이 유의적으로 감소됨을 확인하였다.

실시예 12. 병용 투여에 의한 Metformin의 약동학적 변화 측정

12-1. 병용 기간에 따른 Metformin의 약동학적 변화

Rat를 마취 후, 동맥에 cannula를 삽입하고 마취에서 깬 후 경구를 통해 Metformin 100 mg/mg 단독 투여군 또는 Metformin 100 mg/kg와 어성초 추출물 200 mg/kg을 병용 투여군으로 나누어 약물을 투여하였으며, 상기 약물은 실험조건에 따라 1회, 7일간, 또는 4주간 투여하였다. 투여 후 일정한 시간 간격으로 채혈을 하고 24시간 동안 소변을 수집하였으며, 24시간이 경과한 시점에 위장관에 남아있는 메트포르민 양을 측정하기 위해 개복하여 위장관 샘플을 채취하였다. 또한, LC/MSMS를 이용 정량하여 혈중 농도 프로파일, 뇨, 위장관에 남아있는 Metformin의 양을 계산하였다.

그 결과, 하기 표 4 및 도 22에 나타낸 바와 같이, Metformin 단독 처리군과 비교하여 Metformin 및 어성초 추출물 병용 투여군 (단회, 7일, 또는 4주)에서, Metformin의 축적 효과와 같은 유의적인 약동학적 파라미터의 변화는 관찰되지 않았다.

12-2. OCT 1 및 OCT 2 저해에 의한 Metformin의 uptake 변화

OCT transporter cells product에서 Metformin과 어성초 추출물의 병존에 따른 Metformin의 uptake 변화를 관찰하였다. OTC1와 OTC2의 저해제로 30 uM 과 300 uM verapamil을 사용하였으며, OCT1,2의 기질로는 10 uM Metformin을 사용하였다.

그 결과, 도 23에 나타낸 바와 같이, OCT1 및 OCT2의 저해제인 30 uM verapamil 또는 300uM verapmil 처리군에서는 유의적으로 Metformin의 uptake가 감소된 반면, Metformin 및 어성초 추출물을 병용 투여군에서는 Metformin의 uptake를 감소시키지 않음을 확인하였다.

상기 결과들을 종합해 볼 때, 어성초 추출물과 항당뇨병제인 Metformin을 병용하여 투여하여도 Metformin 약물 자체의 흡수 및 작용에는 아무런 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Dongguk University Gyeongju Campus Industry-Academy Cooperation Foundation <120> A Pharmaceutical composition comprising extract of Houttuyniae cordata for enhancing the therapy of diabetes Mellitus and obesity <130> MP15-044 <150> KR 10-2014-0092197 <151> 2014-07-21 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin primer_forward <400> 1 gcaagtgctt ctaggcggac 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin primer_reverse <400> 2 aagaaagggt gtaaaacgca gc 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMPK alpha1 primer_forward <400> 3 aagccgaccc aatgacatca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMPK alpha1 primer_reverse <400> 4 cttccttcgt acacgcaaat 20 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR-alpha primer_forward <400> 5 gcctgtctgt cgggatgt 18 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR-alpha primer_reverse <400> 6 ggcttcgtgg attctcttg 19 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR-gamma primer_forward <400> 7 gccctttggt gactttatgg a 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR-gamma primer_reverse <400> 8 gcagcaggtt gtcttggatg 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XBP-1 primer_forward <400> 9 tggccgggtc tgctgagtcc g 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XBP-1 primer_reverse <400> 10 gtccatggga agatgttctg g 21

Claims (6)

1. 항당뇨병제와 병용되는 항당뇨 효과 증진용 약학적 조성물로서,
   상기 조성물은 어성초(Houttuyniae Herba) 추출물을 포함하고, 상기 항 당뇨병제는 메트포민(Metformin)인, 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 조성물은 상기 항당뇨병제와 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
3. 제 1항에 있어서,
   상기 조성물은 지방세포의 분화를 억제시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
4. 제 1항에 있어서,
   상기 어성초 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상 용매로 추출한 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
5. 제 1항에 있어서,
   상기 조성물은 AMPK-α(AMP-activated protein kinase-alpha), PPAR-α(Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha) 및 PPAR-γ(Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
6. 제 1항에 있어서,
   상기 조성물은 XBP-1(X-box binding protein 1) 유전자 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.

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