KR20180008319A - 해파리 독소를 유효성분으로 함유하는 섬유증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 해파리 독소를 유효성분으로 함유하는 섬유증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 해파리 독소는 섬유증 유발시 주요하게 발현되는 것으로 알려진 α-SMA(α-smooth muscle actin), 콜라겐-Ⅰ(collagen-Ⅰ) 또는 비멘틴(vimentin)의 발현과 TGF-β1/Smad 신호전달을 억제하고, 콜라겐 분해효소인 MMP-1(matrix metalloproteinase-1) 또는 MMP-13(matrix metalloproteinase-13)의 발현을 증가시킬 뿐만 아니라, TGF-β1 처리에 의해 섬유증이 유발된 세포의 세포자살(apoptosis) 및 세포주기 중지(Cell cycle arrest)를 유도시켜 항섬유증 효과를 나타낸다.

Description

해파리 독소를 유효성분으로 함유하는 섬유증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Composition for preventing, improving or treating of fibrosis comprising jellyfish venom as effective component}

본 발명은 해파리 독소를 유효성분으로 함유하는 섬유증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

섬유증(fibrosis)은 세포외 기질(ECM, extracellular matrix)의 과잉 축적으로 인해 기관이나 조직에 과도한 섬유성 결합조직이 형성되는 것으로, 복잡한 세포, 세포외 기질, 사이토카인 및 성장 인자의 상호 작용을 통해 발달한다. 다른 세포 유형은 간엽세포(섬유아 세포 및 근육섬유 아세포) 및 상피와 내피세포 유래의 ECM 생산 세포(상피- 및 내피-간엽 전환으로 불리는 과정을 통해), 국부 또는 골수 유래 줄기세포(섬유세포) 등을 포함한다. 근육섬유 아세포는 정상적인 상처 치유에 관여하는 주요 세포 유형이며, 섬유 형성에서 중요한 이펙터 세포(effector cell)로 간주되고 있다. 그들은 콜라겐 및 다른 ECM 성분에 매우 합성적이며, 또한, α-SMA(α-smooth muscle actin)의 드 노보(de novo) 발현을 특징으로 한다. 섬유증의 예로 폐부종(폐), 간경변(간), 심내막심근섬유증(심장), 종격동섬유증(종격의 연조직), 골수섬유증(골수), 후복막섬유증(복막후강의 연조직), 괴상섬유화(폐), 신원성전신섬유증(피부), 크론병(장), 흉터종(피부), 심근경색(심장), 전신성경피증(피부, 폐)이 있다. 종래의 치료 연구는 코르티코스테로이드 및 면역억제 약물을 사용하여, 대체로 섬유증의 염증 과정을 표적으로 삼아왔다. 그러나 이런 제제는 불행하게도 임상 실험에서 거의 효과가 없어서 섬유증을 치료하기 위한 새로운 약물이 필요한 실정이다.

한편, 해양식물, 해양동물 및 해양미생물로부터 생리활성물질을 분리하거나 그들의 시스템 공정과 기능을 이용하고자 하는 학문 또는 산업을 마린 바이오프로스펙팅(marine bioprospecting)이라고 한다. 자포동물문(Cnidaria)은 해파리, 산호, 말미잘 등이 포함되어 있는 동물군으로 11,000여 종 이상으로 구성되어 있으며 이들로부터 분리한 생리활성물질이 현재까지 3,000여 종 이상이다. 그 중 해파리는 지구 온난화 등으로 인해 전 세계적으로 출현빈도가 잦으며, 이들의 대량출현으로 어업(어망손상 및 어획량 감소), 발전소, 사람(해파리 독소)에게 많은 피해를 주고 있다. 따라서 해파리를 해로운 동물이 아닌 마린 프로스펙팅의 자원으로 이용하고자 한다.

노무라입깃해파리(Nemopilema nomurai)는 어망해파리 중에서 가장 대형종으로, 큰 것은 갓의 직경이 1m에 달하고, 몸 전체의 길이는 5m 이상인 것도 있으며, 몸의 90% 이상인 수분을 포함한 노무라입깃해파리 한 마리의 최대 무게는 200kg에 달한다. 상기 노무라입깃해파리는 식용으로 활용할 수 없으며, 독성을 가지고 있으므로 대부분 폐기처리된다. 지금까지 해파리 독소의 약리 독성학적 작용은 별로 알려진 바가 없었으며, 최근에 그 작용기작의 일부가 보고되고 있을 뿐이다. 일반적으로 독소를 가지는 동물에 대한 연구는 뱀, 전갈, 거미, 벌 등의 육상동물에 치우쳐져 있었다. 이에 반해, 해파리 독소에 대한 연구는 심순환기에 초점이 맞추어져 있고, 실제로 해파리 독소는 심장 및 순환기에 강한 억제작용을 나타내고 있다. 해파리의 종류와 독소의 종류에 따라 각기 다른 양상의 약리학적 작용을 나타내고 있지만 아직 구체적으로 밝혀진 바는 없다.

한편, 한국공개특허 제2009-0114999호에는 봉독을 포함하는 간경변 치료용 약학조성물에 대해 개시하고 있으며, 한국등록특허 제1536215호에는 해파리 콜라겐 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염, 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물에 대해 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 해파리 독소를 유효성분으로 함유하는 섬유증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대해 아직까지 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 HSC-T6세포에 해파리 독소를 처리하였을 때, 섬유증 유발시 주요하게 발현되는 α-SMA(α-smooth muscle actin), 콜라겐-Ⅰ(collagen-Ⅰ) 및 비멘틴(vimentin)의 발현과 TGF-β1/Smad 신호전달을 억제하며, 콜라겐 분해효소인 MMP-1(matrix metalloproteinase-1) 또는 MMP-13(matrix metalloproteinase-13)의 발현을 증가시킬 뿐만 아니라, TGF-β1 처리에 의해 섬유증이 유발된 세포의 세포자살(apoptosis) 및 세포주기 중지(Cell cycle arrest)를 유도시켜 항섬유증 효과를 나타내는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 해파리 독소를 유효성분으로 함유하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 해파리 독소를 유효성분으로 함유하는 섬유증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 해파리 독소는 섬유증 유발시 주요하게 발현되는 것으로 알려진 α-SMA(α-smooth muscle actin), 콜라겐-Ⅰ(collagen-Ⅰ) 또는 비멘틴(vimentin)의 발현과 TGF-β1/Smad 신호전달을 억제하고, 콜라겐 분해효소인 MMP-1(matrix metalloproteinase-1) 또는 MMP-13(matrix metalloproteinase-13)의 발현을 증가시킬 뿐만 아니라, TGF-β1 처리에 의해 섬유증이 유발된 세포의 세포자살(apoptosis) 및 세포주기 중지(Cell cycle arrest)를 유도시켜 항섬유증 효과를 나타낸다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 TGF-β1 및 노무라입깃해파리 독소(NnV; Nemopilema nomurai venom)를 HSC-T6 세포에 함께 처리하였을 때, 간섬유증이 유발된 HSC-T6 세포의 세포생존율(cell viability)을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 TGF-β1과 유령해파리(Cyanea nozakii), 커튼원양해파리(Dactylometra quinquecirrha), 숲뿌리해파리(Rhopilema esculenta) 및 작은상자해파리(Carybdea brevipedalia) 독소 각각을 HSC-T6 세포에 함께 처리하였을 때, 간섬유증이 유발된 HSC-T6 세포의 세포생존율(cell viability)을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 TGF-β1 처리 후 노무라입깃해파리 독소(NnV; Nemopilema nomurai venom)를 HSC-T6 세포에 농도별로 처리하였을 때, 간섬유증 유발시 주요하게 발현되는 것으로 알려진 a-SMA(α-smooth muscle actin), 콜라겐-Ⅰ(collagen-Ⅰ), 비멘틴(vimentin), MMP-1(matrix metalloproteinase-1) 및 MMP-13(matrix metalloproteinase-13)의 발현양상을 나타낸 웨스턴 블롯 결과이며, (A)는 웨스턴 블롯의 밴드 사진이고, (B)는 이를 정량화한 그래프이다. (A)에서 β-actin은 로딩 컨트롤(loading control)이며, (B)에서 #은 아무것도 처리하지 않은 대조군에 대비하여 TGF-β1를 단독처리하였을 때, a-SMA, 콜라겐-Ⅰ 및 비멘틴의 발현 증가와 MMP-1 및 MMP-13의 발현 감소 효과가 통계적으로 유의하다는 것을 의미하고 p값이 0.05 미만인 것을 의미하며, a-SMA, 콜라겐-Ⅰ 및 비멘틴에서 *은 TGF-β1를 단독처리한 대조군에 대비하여 TGF-β1와 0.5, 1 및 2㎍/㎖의 NnV를 함께 처리하였을 때, a-SMA, 콜라겐-Ⅰ 및 비멘틴의 발현 감소 효과가 통계적으로 유의하다는 것을 의미하고 p값이 0.05 미만인 것을 의미하며, MMP-1 및 MMP-13에서 *은 TGF-β1를 단독처리한 대조군에 대비하여 TGF-β1와 0.5, 1 및 2㎍/㎖의 NnV를 함께 처리하였을 때, MMP-1 및 MMP-13의 발현 증가 효과가 통계적으로 유의하다는 것을 의미하고 p값이 0.05 미만인 것을 의미한다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 TGF-β1 처리 후 숲뿌리해파리(Rhopilema esculenta) 독소(A) 및 커튼원양해파리(Dactylometra quinquecirrha) 독소(B)를 HSC-T6 세포에 농도별로 각각 처리하였을 때, 간섬유증 유발시 주요하게 발현되는 것으로 알려진 a-SMA(α-smooth muscle actin), 콜라겐-Ⅰ(collagen-Ⅰ) 및 TGF-β1의 발현양상을 나타낸 웨스턴 블롯 결과이다. GAPDH는 로딩 컨트롤(loading control)이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 TGF-β1 처리 후 유령해파리(Cyanea nozakii) 독소(A) 및 작은상자해파리(Carybdea brevipedalia) 독소(B)를 HSC-T6 세포에 농도별로 각각 처리하였을 때, 간섬유증 유발시 주요하게 발현되는 것으로 알려진 a-SMA(α-smooth muscle actin), 콜라겐-Ⅰ(collagen-Ⅰ) 및 TGF-β1의 발현양상을 나타낸 웨스턴 블롯 결과이다. GAPDH는 로딩 컨트롤(loading control)이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 TGF-β1 처리 후 NnV(Nemopilema nomurai venom)를 HSC-T6 세포에 농도별로 처리하였을 때, 이동(migration) 및 침윤(invasion)된 세포의 현미경 사진(A)이며, 이를 흡광도로 측정하여 정량화한 그래프(B)이다. (B)에서 #은 아무것도 처리하지 않은 대조군에 대비하여 TGF-β1를 단독처리하였을 때, 이동 및 침윤 증가 효과가 통계적으로 유의하다는 것을 의미하고 p값이 0.05 미만인 것을 의미하며, *은 TGF-β1를 단독처리한 대조군에 대비하여 TGF-β1와 0.5, 1 및 2㎍/㎖의 NnV를 함께 처리하였을 때, 이동 및 침윤 감소 효과가 통계적으로 유의하다는 것을 의미하고 p값이 0.05 미만인 것을 의미한다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 HSC-T6 세포에 TGF-β1를 단독처리하였을 때, 간섬유증 유발시 주요하게 발현되는 것으로 알려진 Smad 신호전달 관련 단백질인 p-Smad2, Smad2 및 Smad4의 발현양상을 나타낸 웨스턴 블롯 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 TGF-β1 처리 후 NnV(Nemopilema nomurai venom)를 HSC-T6 세포에 농도별로 처리하였을 때, 간섬유증 유발시 주요하게 발현되는 것으로 알려진 Smad 신호전달 관련 단백질인 TGF-β 수용체 I(TGF-β receptor I), p-Smad2, Smad2, Smad4 및 Snail의 발현양상을 나타낸 웨스턴 블롯 결과(A)이며, 이를 정량화한 그래프(B)이다. (B)에서 #은 아무것도 처리하지 않은 대조군에 대비하여 TGF-β1를 단독처리하였을 때, TGF-β 수용체 I, p-Smad2, Smad2, Smad4 및 Snail의 발현 증가 효과가 통계적으로 유의하다는 것을 의미하고 p값이 0.05 미만인 것을 의미하며, TGF-β 수용체 I에서 *은 TGF-β1를 단독처리한 대조군에 대비하여, TGF-β1와 1 및 2㎍/㎖의 NnV를 함께 처리하였을 때, TGF-β 수용체 I의 발현 감소 효과가 통계적으로 유의하다는 것을 의미하고 p값이 0.05 미만인 것을 의미하며, p-Smad2, Smad4 및 Snail에서 *은 TGF-β1를 단독처리한 대조군에 대비하여, TGF-β1와 0.5, 1 및 2㎍/㎖의 NnV를 함께 처리하였을 때, p-Smad2, Smad4 및 Snail의 발현 감소 효과가 통계적으로 유의하다는 것을 의미하고 p값이 0.05 미만인 것을 의미한다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 TGF-β1 처리 후 NnV(Nemopilema nomurai venom)를 HSC-T6 세포에 농도별로 처리하였을 때, 섬유증 유발시 주요하게 발현되는 것으로 알려진 p-p65, p-Akt, p-ERK1/2(p-Extracellular signal-regulated kinase 1/2) 및 p-p38의 발현 양상을 나타낸 웨스턴 블롯 결과(A)이며, 이를 정량화한 그래프(B)이다. (B)에서 #은 아무것도 처리하지 않은 대조군에 대비하여 TGF-β1를 단독처리하였을 때, p-p65 및 p-Akt의 발현 증가 효과가 통계적으로 유의하다는 것을 의미하고 p값이 0.05 미만인 것을 의미하며, *은 TGF-β1를 단독처리한 대조군에 대비하여 TGF-β1와 1 및 2㎍/㎖의 NnV를 함께 처리하였을 때, p-p65 및 p-Akt의 발현 감소 효과가 통계적으로 유의하다는 것을 의미하고 p값이 0.05 미만인 것을 의미한다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 TGF-β1 처리 후 NnV(Nemopilema nomurai venom)를 HSC-T6 세포에 농도별로 처리하였을 때, 세포자살(apoptosis) 유도 효과를 나타낸 형광현미경 사진이다. ↘는 NnV 처리로 인하여 응축되고 깨진 세포핵을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 TGF-β1 처리 후 NnV(Nemopilema nomurai venom)를 HSC-T6 세포에 농도별로 처리하였을 때, 세포주기 중지(cell cycle arrest) 유도 효과를 확인한 유세포 분석 결과(A)이며, 이를 정량화한 그래프(B)이다. (B)에서 *은 NnV를 처리하지 않은 대조군에 대비하여 TGF-β1와 4 및 6㎍/㎖의 NnV를 함께 처리하였을 때, 세포주기 중지로 인해 sub G1기 세포군 증가가 통계적으로 유의하다는 것을 의미하며, p값이 0.05 미만인 것을 의미한다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 TGF-β1 처리 후 NnV(Nemopilema nomurai venom)를 HSC-T6 세포에 농도별로 처리하였을 때, 세포자살(pro-apoptosis) 관련 단백질인 Mcl-1, Bcl-xl, Bcl-2, Bax, caspase-3, caspase-7, caspase-9, cleaved caspase-3, cleaved caspase-7 및 cleaved caspase-9의 발현 양상을 나타낸 웨스턴 블롯 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 해파리 독소를 유효성분으로 함유하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 섬유증의 예방 또는 치료용 약학조성물에서, 상기 노무라입깃해파리(Nemopilema nomurai), 커튼원양해파리(Dactylometra quinquecirrha), 숲뿌리해파리(Rhopilema esculenta), 작은상자해파리(Carybdea brevipedalia) 및 유령해파리(Cyanea nozakii) 중에서 선택된 어느 하나 이상의 해파리로부터 유래한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 섬유증은 간섬유증, 지방 섬유증, 신장 섬유증, 폐 섬유증, 피부 섬유증, 심장 섬유증, 관절 섬유증, 신경 섬유증, 근 섬유증 및 복막 섬유증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있으며, 바람직하게는 간섬유증일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 해파리 독소는 α-SMA(α-smooth muscle actin), 콜라겐-Ⅰ(collagen-Ⅰ) 또는 비멘틴(vimentin)의 발현을 억제시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 해파리 독소는 MMP-1(matrix metalloproteinase-1) 또는 MMP-13(matrix metalloproteinase-13)의 발현을 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 해파리 독소는 TGF-β1/Smad 신호전달을 억제하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 약학적 투여 형태는 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 해파리 독소를 포함하는 약학조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 해파리 독소에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이 외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 해파리 독소는 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 해파리 독소를 유효성분으로 함유하는 섬유증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.

상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

실시예 1. 본 발명의 해파리 독소 처리에 따른 세포생존율(cell viability) 분석

HSC-T6 세포를 24-웰 플레이트에 접종하여 24시간 배양한 후 무혈청 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지로 교체하고, TGF-β1와 노무라입깃해파리 독소(NnV; Nemopilema nomurai venom)를 농도별로 함께 처리하여 48시간 후에 MTT 시약을 각 웰에 50㎕씩 처리하였으며, 3시간 동안 반응시킨 후에 배지를 제거하고 500㎕의 DMSO를 첨가하여 보라색 포마진을 용해시키고 마이크로플레이트 리더를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 각 처리에 하여 5회 반복실험한 평균값이다. 또한, 상기 노무라입깃해파리 독소 이외에 커튼원양해파리(Dactylometra quinquecirrha), 숲뿌리해파리(Rhopilema esculenta), 작은상자해파리(Carybdea brevipedalia) 및 유령해파리(Cyanea nozakii) 독소를 대상으로 상기 동일한 방법으로 세포생존율을 측정하였다.

그 결과, 도 1에 개시한 바와 같이 TGF-β1와 1 및 2㎍/㎖의 노무라입깃해파리 독소(NnV)를 함께 처리하였을 때 세포생존율은 크게 변화가 없었으며, 4 및 8㎍/㎖의 NnV 처리시 세포생존율이 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 노무라입깃해파리 독소(NnV)의 항-섬유증(anti-fibrosis) 효과를 확인하기 위해, 하기 실시예에서 간섬유증 유발시 발현되는 주요 단백질들의 조절 효과 및 HSC-T6의 세포사멸 유도 효과를 구분하여 확인하였고, 이를 위해 NnV의 농도를 달리 설정하여 실험을 진행하였다. 간섬유증 유발시 발현되는 주요 단백질들의 조절 효과 확인시험에서는 세포독성이 없는 0.5, 1 및 2μg/㎖의 NnV를 이용하였고, 세포사멸 유도 효과 확인시험은 세포독성을 유발하는 4 및 6㎍/㎖의 NnV를 이용하여 하기 실시예에 사용하였다.

또한, 도 2에 개시한 바와 같이 TGF-β1와 커튼원양해파리(Dactylometra quinquecirrha), 숲뿌리해파리(Rhopilema esculenta), 작은상자해파리(Carybdea brevipedalia) 및 유령해파리(Cyanea nozakii) 독소 각각을 함께 처리하였을 때, 0.25, 0.5 및 1㎍/㎖의 해파리 독소 처리시 세포생존율은 크게 변화가 없었으며, 2㎍/㎖의 해파리 독소 처리시 세포생존율이 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2. 본 발명의 해파리 독소 처리에 따른 간섬유증 유발시 주요하게 발현되는 것으로 알려진 마커의 발현양상 분석

본 실시예 2에서는 웨스턴 블롯을 통해 간섬유증 유발시 주요하게 발현되는 것으로 알려진 단백질의 발현양상을 확인하였다. 무혈청 배지를 함유한 6-웰 플레이트에 HSC-T6 세포를 24시간 동안 배양한 후 간섬유증 유도물질인 2ng/㎖의 TGF-β1을 처리한 다음, 0.5, 1 및 2㎍/㎖의 노무라입깃해파리 독소(NnV)를 24시간 동안 처리하였다. 배지를 제거한 후, RIPA 용해버퍼를 첨가하여 4℃에서 세포를 용해시켰고 원심분리하였다. 표준물질로 소혈청 알부민을 사용하여 단백질을 정량한 후, 동일한 단백질양으로 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔을 이용하여 전기영동을 하였다. 분리된 단백질을 나이트로셀룰로즈 막으로 이동시킨 다음, 5% 스킴 밀크(skim milk) 용액으로 블로킹(blocking)한 후, 1차 항체인 a-SMA(α-smooth muscle actin), 콜라겐-Ⅰ(collagen-Ⅰ), 비멘틴(vimentin), MMP-1(matrix metalloproteinase-1) 및 MMP-13(matrix metalloproteinase-13)을 4℃에서 하루 동안 배양하였다. 배양한 후 TBST 용액으로 세척을 한 다음, 2차 항체를 1시간 붙인 뒤 화학발광성 ECL 분석 키트를 사용하여 단백질을 검출하였으며, BIORAD-CHEMIDOC을 이용하여 웨스턴 블롯 밴드를 시각화하고 정량화하였다. 또한, 상기 노무라입깃해파리 독소 이외에 커튼원양해파리(Dactylometra quinquecirrha), 숲뿌리해파리(Rhopilema esculenta), 작은상자해파리(Carybdea brevipedalia) 및 유령해파리(Cyanea nozakii) 독소를 대상으로 상기 동일한 방법으로 a-SMA(α-smooth muscle actin), 콜라겐-Ⅰ(collagen-Ⅰ)의 발현양상을 확인하였다.

그 결과, 도 3에 개시한 바와 같이 TGF-β1 처리시 간섬유증의 주요 발현 마커인 a-SMA, 콜라겐-Ⅰ 및 비멘틴의 발현이 증가하였으나, 본 발명의 노무라입깃해파리 독소(NnV)를 처리하였을 때에는 이의 발현이 감소된 것을 확인할 수 있었다. 간섬유증은 세포외 기질의 침착이 일어나 문제가 되는 병리학적 현상이며, 세포외 기질의 침착이 분해되지 않고 합성이 증가하여 발생한다. 따라서 침착된 세포외 기질을 분해할 수 있는 단백분해효소의 증가와 이를 억제하는 단백질 발현의 조절이 아주 중요하다. MMP-1(matrix metalloproteinase-1) 및 MMP-13(matrix metalloproteinase-13)은 콜라겐-Ⅰ을 분해하는 주요 단백분해효소로 알려져 있는데, 이들은 간섬유증 발생시 감소된다. 본 실시예 2에서도 마찬가지로 TGF-β1 처리로 인해 감소된 MMP-1 및 MMP-13의 발현이 본 발명의 NnV 처리로 인해 다시 증가한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 4 및 도 5에 개시한 바와 같이 TGF-β1 처리시 간섬유증의 주요 발현 마커인 a-SMA, 콜라겐-Ⅰ(collagen-Ⅰ) 및 TGF-β1의 발현이 증가하였으나, 커튼원양해파리(Dactylometra quinquecirrha), 숲뿌리해파리(Rhopilema esculenta), 작은상자해파리(Carybdea brevipedalia) 및 유령해파리(Cyanea nozakii) 독소를 함께 처리하였을 때에는 a-SMA, 콜라겐-Ⅰ(collagen-Ⅰ) 및 TGF-β1의 발현이 감소된 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 본 발명의 해파리 독소( NnV ) 처리에 따른 성상세포의 이동 및 침윤에 대한 억제 효과

섬유증 유발시 성상세포(stellate cell)가 TGF-β1에 의해 활성화되면 증식성, 섬유원성 및 수축성 근섬유모세포로 형질전환이 되며, 활성화된 성상세포는 형질전화에 의해 이동(migration) 및 침윤(invasion)이 증가하게 된다. 따라서, 본 실시예 3에서는 본 발명의 노무라입깃해파리 독소(NnV; Nemopilema nomurai venom) 처리에 따른 성상세포의 이동(migration) 및 침윤(invasion) 정도를 측정하였다. 이동(migration) 및 침윤(invasion)에 사용할 인서트(insert)를 수화(hydration)시키기 위해 24-웰 플레이트에 따뜻한 compltete DMEM을 넣고 인서트를 담군 후 1시간 동안 배양하였다. 인서트를 새로운 배지가 들어있는 웰 플레이트로 옮기고 인서트에 무혈청 배지를 함유한 HSC-T6 세포를 넣어주었다. 이때, 무혈청 배지에 간섬유증 유도물질인 TGF-β1를 단독으로 처리하거나 TGF-β1 및 NnV를 함께 처리하여 넣어주고, 24시간 후에 인서트 바닥에 있는 이동(migration) 및 침윤(invasion)된 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 현미경으로 관찰하였으며, 이를 10% 아세트산에 녹여서 마이크로플레이트 리더를 이용하여 560nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 6에 개시한 바와 같이 TGF-β1 처리에 의해 성상세포의 이동(migration) 및 침윤(invasion)이 증가하였으며, 특히 침윤이 약 2배 이상 증가하였다. 반면에, TGF-β1 및 본 발명의 NnV를 함께 처리한 경우, 농도의존적으로 세포의 이동(migration) 및 침윤(invasion) 모두 감소하였으며, 특히 가장 높은 농도인 2㎍/㎖의 NnV 처리시 50% 이상의 억제 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 본 발명의 해파리 독소( NnV ) 처리에 따른 간섬유증 유발시 주요하게 발현되는 것으로 알려진 Smad 신호전달 관련 단백질의 발현양상 분석

본 실시예 4에서는 웨스턴 블롯을 통해 간섬유증 유발시 Smad 신호전달 관련 단백질의 발현양상을 확인하였다. 무혈청 배지를 함유한 6-웰 플레이트에 HSC-T6 세포를 24시간 동안 배양한 후 간섬유증 유도물질인 2ng/㎖의 TGF-β1을 처리한 다음, 0.5, 1 및 2㎍/㎖의 노무라입깃해파리 독소(NnV; Nemopilema nomurai venom)를 24시간 동안 처리하였다. 배지를 제거한 후, RIPA 용해버퍼를 첨가하여 4℃에서 세포를 용해시켰고 원심분리하였다. 표준물질로 소혈청 알부민을 사용하여 단백질을 정량한 후, 동일한 단백질양으로 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔을 이용하여 전기영동을 하였다. 분리된 단백질을 나이트로셀룰로즈 막으로 이동시킨 다음, 5% 스킴 밀크(skim milk) 용액으로 블로킹(blocking)한 후, 1차 항체인 p-Smad2, Smad4, Snail 및 TGF-β 수용체 I(TGF-β receptor I)을 4℃에서 하루 동안 배양하였다. TBST 용액으로 세척을 한 다음, 2차 항체를 1시간 붙인 뒤 화학발광성 ECL 분석 키트를 사용하여 단백질을 검출하였으며, BIORAD-CHEMIDOC을 이용하여 웨스턴 블롯 밴드를 시각화하고 정량화하였다.

세포외 기질인 교원질 침착과 관련된 대표적인 기전으로는 Smad 신호전달경로가 알려져 있다. TGF-β1 처리로 인해 Smad2의 인산화가 증가되고, Smad2와 Smad4의 복합체를 구성하여 핵 내로 이동한다. 이동한 Smad2와 Smad4의 복합체는 Snail과 같은 전사인자에 결합하여 이와 관련된 단백질의 발현을 촉진시킨다. 본 발명의 NnV 처리에 따른 Smad 신호전달 관련 단백질의 발현양상을 확인한 결과, 도 7 및 8에 개시한 바와 같이 TGF-β1만을 처리한 시간이 증가할수록 p-Smad2, Smad2 및 Smad4의 발현이 증가하였으나, TGF-β1 및 본 발명의 NnV를 함께 처리한 24시간 후에, 농도의존적으로 p-Smad2, Smad2 및 Smad4의 발현이 모두 감소된 것을 확인할 수 있었다. 또한, TGF-β1은 TGF-β 수용체 I(TGF-β receptor I)에 결합하여 Smad 신호전달의 활성을 촉진시키는데, 본 발명의 NnV 처리로 인해 TGF-B receptor I의 발현도 감소된 것을 확인하였으며, TGF-β1 처리에 의해 증가된 Smad 신호전달은 Snail의 발현을 증가시켰으나, 본 발명의 NnV 처리에 의해 Snail 역시 감소된 것을 확인할 수 있었다.

또한, Smad 신호전달 이외에 섬유증 유발 기전으로 알려진 ERK1/2(Extracellular signal-regulated kinase 1/2), p38, Akt 및 p65의 발현에 대한 본 발명의 NnV 억제 효과를 확인하였다. 그 결과, 도 9에 개시한 바와 같이 NF-κB의 대표적 마커인 p-p65의 발현이 TGF-β1 처리에 의해 증가하였으나, TGF-β1 및 NnV를 함께 처리하였을 때, p-p65의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 마찬가지로 p-Akt의 발현량이 TGF-β1 처리에 의해 증가하였으나, TGF-β1 및 NnV를 함께 처리한 경우, 농도의존적으로 p-Akt 발현량도 감소하였다. 반면에, p-ERK1/2 및 p-p38의 발현량은 전혀 변화가 없었다. 이러한 결과를 통해, 해파리 독소인 NnV의 항섬유증 효과는 Smad, NF-κB 및 Akt 신호전달경로 억제를 통해 일어난다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5. TGF - β1 처리에 의해 섬유증이 유도된 HSC -T6 세포에서 NnV 처리에 의한 세포자살(apoptosis) 및 세포주기 중지(Cell cycle arrest) 유도 효과

본 발명의 노무라입깃해파리 독소(NnV; Nemopilema nomurai venom)의 항섬유증 효과를 위해, 과증식된 성상세포(stellate cell)인 HSC-T6 세포의 세포자살(apoptosis) 유도 역시 중요한 기전 중 하나이다. 따라서, 상기 실시예 1의 결과를 바탕으로 HSC-T6 세포에 TGF-β1와 세포독성을 보인 4 및 6㎍/㎖의 NnV를 함께 처리하여 세포독성과 세포자살(apoptosis)이 관련이 있는지를 확인하였으며, DAPI 염색을 통해 핵 염색을 실시하였다. 그 결과, 도 10에 개시한 바와 같이 아무것도 처리하지 않은 세포와 TGF-β1만을 처리한 세포에서는 핵 모양의 변화가 없었으나, TGF-β1(2ng/㎖) 및 NnV(4 및 6㎍/㎖)를 함께 처리한 세포에서는 핵이 깨어지고 응축되었으며, 핵 크기 역시 크게 감소한 것을 확인할 수 있었다. 또한, NnV를 처리한 경우 섬유증이 유도된 HSC-T6 세포의 세포주기(cell cycle)에 어떤 영향을 주는지를 확인하고자 유세포 분석기(flow cytometry)를 이용하여 확인하였다. 그 결과, 도 11에 개시한 바와 같이 세포주기 중 NnV를 처리함에 따라 농도의존적으로 세포자살이 일어남을 의미하는 sub G1기의 비율이 유의적으로 증가되었으며, 이를 통해 해파리 독소인 NnV가 섬유증이 유도된 HSC-T6 세포의 세포주기 중지 유도 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

또한, TGF-β1 처리에 의해 활성화된 HSC-T6 세포에 NnV를 처리하였을 때, 세포자살 유도 효과를 확인하기 위해, 웨스턴 블롯(Western blot) 분석을 통해 세포자살 관련 단백질들의 발현 양상을 확인하였다. 그 결과, 도 12에 개시한 바와 같이 전-세포자살(proapoptosis) 단백질인 Bcl-xl, Bcl-2 및 Mcl-1의 발현량은 NnV 처리시 농도의존적으로 감소하였으며, 항-세포자살(anti-apoptosis) 관련 단백질인 Bax의 발현량은 증가하였을 뿐만 아니라, Bax/Bcl-2 비율를 계산한 결과, NnV의 고농도인 6㎍/㎖에서 아무것도 처리하지 않은 세포에 비해 약 13배 증가한 것을 확인할 수 있었다. 전형적인 세포자살 표현형으로, 카스파아제-3(caspase-3), 카스파아제-7 및 카스파아제-9의 활성 형태인 쪼개진 카스파아제-3(cleaved caspase-3), 쪼개진 카스파아제-7 및 쪼개진 카스파아제-9의 발현량은 NnV 처리시 증가하였으며, PARP(poly(ADP-ribose)polymerase)의 발현량은 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (9)

1. 해파리 독소를 유효성분으로 함유하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 해파리 독소는 노무라입깃해파리(Nemopilema nomurai), 커튼원양해파리(Dactylometra quinquecirrha), 숲뿌리해파리(Rhopilema esculenta), 작은상자해파리(Carybdea brevipedalia) 및 유령해파리(Cyanea nozakii) 중에서 선택된 어느 하나 이상의 해파리로부터 유래한 것을 특징으로 하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 섬유증은 간섬유증, 지방 섬유증, 신장 섬유증, 폐 섬유증, 피부 섬유증, 심장 섬유증, 관절 섬유증, 신경 섬유증, 근 섬유증 및 복막 섬유증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 해파리 독소는 α-SMA(α-smooth muscle actin), 콜라겐-Ⅰ(collagen-Ⅰ) 또는 비멘틴(vimentin)의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 해파리 독소는 MMP-1(matrix metalloproteinase-1) 또는 MMP-13(matrix metalloproteinase-13)의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 해파리 독소는 TGF-β1/Smad 신호전달을 억제하는 것을 특징으로 하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 상기 해파리 독소 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학조성물.
8. 해파리 독소를 유효성분으로 함유하는 섬유증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
9. 제8항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 섬유증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.

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