KR20170136539A - 이상성 세라믹 골 대체물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 재흡수성 황산칼슘 페이스트 및 안정한 인산칼슘 상을 포함하고, 골 이식편으로 작용하며 골 활성 단백질(예를 들어, BMP)과 항-이화 작용제(예를 들어, 비스포스포네이트)의 조합에 대한 우수한 담체로 작용하여 향상된 골 재생을 제공하는 이상성 세라믹 골 대체물을 제시한다.

Description

이상성 세라믹 골 대체물
본 발명은 합성 골 이식편 및 골 재생에서의 이들의 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 이상성 세라믹 골 대체물이 골 성장을 유도 및/또는 자극할 수 있는 골 활성 단백질, 예를 들어, 골 형성 단백질(bone morphogenic protein, BMP), 및 항-이화 작용 약물(anti-catabolic drug), 예를 들어, 비스포스포네이트(bisphosphonate)와 같은, 모두의 담체(carrier)로서 어떻게 작용하여 개선된 활성 골 재생을 유도하고 유용한지를 보여준다.
골절 치료와 골 리모델링(bone remodeling)은 조직 재생의 한 형태로 볼 수 있으며, 생 뼈는 4 내지 20 년마다 성인에서 골 질량(bone mass)이 완전히 변하는 일정한 리모델링을 받게 된다. 골 리모델링은 활성화, 재흡수, 반전 및 형성의 4 단계를 포함하는 사이클이다. 활성화는 골절 또는 골 악성 종양 주변의 파골세포(osteoclast)의 사멸 또는 개질에 의해 시작되어 새로운 파골세포를 모집하고 유도하여 죽은 뼈의 재흡수를 시작한다. 얼마 후, 재흡수가 느려지고 조골세포(osteoblast)가 반전 단계에서 모집되고 활성화된다. 활성화된 조골세포는 죽은 뼈의 재흡수 이후 표면에 달라붙어 새로운 골 기질(bone matrix)-유골 조직(osteoid tissue)을 생성하기 시작하고, 기질의 광화(mineralization)가 이어진다. 서로 다른 골 세포 유형 및 이들의 활성제 및 억제제의 작용은 민감한 방식으로 균형을 이루고, 일반적으로 시간이 지남에 따라 죽거나 골절된 뼈의 교체로 이어진다.
외상, 감염의 제거, 종양 병변의 절제, 불유합 수술 및 전치환술(primary arthroplasty) 또는 재치환술(revision arthroplasty)에서의 골 치료에 의한 골 손실과 같은 심각한 골 결함의 회복은 종종 새로운 골 형성, 예를 들어 골 이식편의 사용에 의해 지지되고 촉진되는 외과적 개입에 의해 지원된다.
이식편 내의 살아있는 세포 및 단백질은 골 형성(osteogenesis), 즉, 뼈의 신생 합성(de novo synthesis)을 유도할 수 있기 때문에, 자가 골 이식편은 이상적인 선택이다. 그러나, 신선한 뼈를 채취한 후 제한된 공급과 공여 부위 이환율(donor site morbidity)의 위험으로 인하여 골 동종이식편(allograft)(예를 들어 전치환술에서 절제된 대퇴골두(femoral head)의 뼈)을 대신 사용하였다. 골 동종이식편, 즉 골전도 지지체(osteoconductive scaffold)로서 기능하는 동일한 종의 대상으로부터의 죽은 뼈는 공급이 제한적이고 또한 혈액 매개 질병을 유발할 수 있는 잠재 위험이 있으며, 심지어 일부 민족 집단에서는 금지되어 있다.
해면골 이식편을 이용한 여러 동물 연구에서 골 형성 단백질(bone morphogenic protein, BMP)에 의해 리모델링의 속도 및 리모델링된 이식편/대체물의 양이 증가하는 것으로 나타났으나, BMP에 의한 골유도(osteoinduction)에 의해 형성된 대부분의 신생 골이 형성되자마자 신속하게 재흡수되었다. 신생 골의 재흡수는 조기의 이화작용(catabolism)으로 이어지는 파골세포의 강화된 모집으로 인한 랭크 리간드 시스템(Rank ligand system)의 BMP 활성화가 원인인 것으로 보인다. 임상 연구에서, 조기 이화작용은 골절에서의 고정 손실, 조기 동종이식편 재흡수 및 실패, 그리고 고관절 재치환술에서의 느슨해짐을 유발하였다(Nicole Y.C. Yu, Aron Schindler, Magnus Tagil, Andrew J. Ruys, David G. Little. Frontiers in Bioscience E4, 2647-2653, June 1, 2012).
비스포스포네이트는 골 재흡수를 억제하는 항-이화 작용 약물의 그룹이며, 골다공증 및 골 전이(bone metastasis)의 예방 및 치료에 임상적으로 사용된다. 정맥내 또는 경구로 투여된 비스포스포네이트는 골 무기질을 표적으로 하고 이에 결합하며, 따라서 전신 적용된 비스포스포네이트는 주로 활성 골 리모델링 영역에 축적된다. 파골세포의 재흡수 동안, 골 무기질에 결합된 비스포스포네이트가 방출되어 파골세포에서 내재화되고 이어서 이들 세포의 세포사멸이 일어난다. 동물 연구에서, 정맥내 또는 국소적으로 투여된 비스포스포네이트는 자가이식편(autograft) 또는 동종이식편과 BMP의 조합에 의해 유도된 신생 골의 재흡수를 억제할 수 있음이 밝혀졌다(Yu et al. ibis). Toshihiko Nishisho 등은 뼈의 거대 세포 종양의 치료에서 인공 뼈(수산화인회석(hydroxyapatite) 또는 β-트리칼슘(β-tricalcium))와 함께 졸레드론산(zoledronic acid)의 국소 투여를 개시하였다(Orthopedics Vol. 38, Issue 1: e25-e30 (2015).
지난 10 년 동안, 커다란 골 결함은 골전도성(osteoconductive) 골 대체물로 작용하는 생체 물질과 같은 인공 이식편으로 치료되었다(Oryan A, Alidadi S, Moshiri A, Maffulli N. Bone regenerative medicine: classic options, novel strategies, and future directions. Journal of orthopaedic surgery and research. 2014; 9:18). 이들 물질은 고분자, 세라믹 또는 합성물이다(Habibovic P, de Groot K. Osteoinductive biomaterials-properties and relevance in bone repair. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 2007; 1:25-32).
골 조직 공학에 대한 다른 연구는 다공성 고분자, 당-기반 고점도 담체 또는 콜라겐 내에 골 형성 단백질(BMP)과 같은 골 활성 단백질 및 비스포스포네이트와 같은 항-이화 작용 약물의 혼입을 포함한다. WO 2012/094708은 생분해성 또는 생체적합성 고분자 내에 BMP 단독 또는 졸레드론산(ZA)과의 조합으로서의 혼입을 개시하고 있다. 수산화인회석은 ZA로 도핑될 수 있으며, 형성될 때 고분자에 혼입될 수 있다. WO 2014/032099는 당-기반 고점도 담체, BMP, 비스포스포네이트 및 선택적으로 수산화인회석을 포함하는 조성물을 개시하고 있다. Murphy CM, Schindeler A, Gleeson JP, Yu NYC, Cantrill LC, Mikulec K 등은 Acta Biomaterialia. 2014; 10: 2250-8에서 재조합 BMP 및 비스포스포네이트의 결합 및 동시 전달을 가능하게 하는 콜라겐-수산화인회석 지지체를 개시하고 있다. BMP와 비스포스포네이트를 동종이식편 또는 다공성 고분자와 같은 담체와 결합시킨 연구는 BMP와 비스포스포네이트 간에 다소간의 상승적인 결과를 보였다. 고분자는 환자에게 삽입되기 전에 제조된 사전 제작된 표준 제품이므로, 빈 공간을 남기지 않고 효과적인 골 재생을 위해 각각의 골 공극을 충전하는데 효과적으로 사용될 수 없고 이는 감염의 위험을 증가시킨다. 고분자는 그 자체가 골전도성(osteoconductive)도 골유도성(osteoinductive)도 아니므로 골 재생에 적극적으로 참여하지 못한다.
재흡수성 황산칼슘 반수화물 성분 및 예를 들어 수산화인회석과 같은 안정한 인산칼슘 성분을 포함하는, 체내에서 경화되어 합성 이식편으로 작용하는 능력을 갖는 주입 가능한 이상성 세라믹 골 대체물이 지난 수년 동안, 예를 들어, 스웨덴 회사인 Bone Support AB사에 의해 개발되었다(EP 1301219, EP 1465678, EP 1601387, EP 1829565, WO 2011/098438, WO 2014/128217 참조). 이들 공개물은 골 대체물이 생물학적 활성제의 긴 목록에서 선택되는 첨가제를 포함할 수 있는 것을 제안한다. 목록은 그 중에서도 항생제, 골 형성 단백질(BMP)과 같은 골 활성 단백질 및 비스포스포네이트를 포함한다. 그러나, 지금까지 상용 골 대체물에 항생제만 포함되었다. Bone Support AB사는 CERAMENT™lBONE VOID FILLER, CERAMENT™lSPINE SUPPORT 및 CERAMENT™lG(겐타마이신 함유CERAMENT™)의 세 가지 이상성 세라믹 제품을 출시하였고, 네 번째 제품인 CERAMENT™lV(반코마이신 함유 CERAMENT™) CERAMENT™)이 CE 승인을 받고 출시할 준비를 마쳤다.
약간의 골전도성 골 대체물을 사용하는 많은 유망한 결과에도 불구하고, 골 재생을 가속화할 수 있는 골유도성 골 대체물이 매우 바람직할 수 있다.
본 발명에서, 초기 미세다공성(microporosity) 및 기계적 안정성을 제공하고, 체내에서 재흡수되는 동화 작용제(anabolic agent)를 함유하는 적어도 하나의 상(phase) 및 체내에서 안정하고 천천히 리모델링되며 바람직하게는 항-이화 작용제에 대해 높은 친화성을 갖는 적어도 하나의 다른 상으로 구성된 골전도성 담체(osteoconductive carrier)에 의해 골 활성 단백질(들) 및 항-이화 작용제(들)이 개선된 골 대체물과 함께 골 결손에 전달된다.
담체 물질 그 자체는 주로 골 전도성이지만, 미세다공성이고 신속한 재흡수성의 상은 다양한 첨가된 치료제의 제어된 전달을 제공하고, 골 성장 인자에 의해 유도된 새로운 골 세포의 신속한 내성장(ingrowth)을 가능하게 하는 물질의 거대 다공성을 증가시키는 반면, 밀접하게 결합된 항-이화 작용제를 갖는 안정한 상은 다공성 물질을 통해 침입하는 새로운 골 세포에 의해 매우 천천히 리모델링됨으로써, 항-이화 작용제가 시간이 지남에 따라 천천히 방출되고, 따라서 더욱 조밀하고 강한 새로운 뼈의 형성을 위해 신속한 골 성장 및 새로운 뼈의 재흡수의 지속적인 국지적 평형을 제공한다.
본 발명의 일 실시형태에 따른 이상성 세라믹 골 대체물, 즉, 경화 상태의 세라믹 물질은 a) 황산칼슘 상; b) 인산칼슘 상; c) 적어도 하나의 골 활성 단백질; 및 d) 적어도 하나의 항-이화 작용제를 포함한다. 상기 적어도 하나의 골 활성 단백질은 바람직하게는 신속한 재흡수성의 황산칼슘 상에 존재하고, 상기 적어도 하나의 항-이화 작용제는 바람직하게는 안정한 인산칼슘 상에 존재한다. 항-이화 작용제는 바람직하게는 골 재흡수를 억제하고 인산칼슘에 대해 친화성을 갖는 제제이다.
황산칼슘 상은 바람직하게는 본질적으로 석고(Gypsum)로 알려진 황산칼슘 이수화물(calcium sulphate dihydrate, CSD)로 구성된다. 바늘 모양의 황산칼슘 이수화물 입자(calcium sulphate dihydrate particles)는 파리 석고(plaster of Paris)로도 알려진 황산칼슘 반수화물(calcium sulphate hemihydrate, CSH)이 물과 반응할 때 형성되며, 그에 따라 생성된 CSD 바늘이 결합하여 대략 20 내지 40%의 미세다공성을 갖는 고체 CSD 기질을 생성한다. CSD는 물과 체액에서 비교적 용해성이기 때문에 신체 내에서 비교적 신속하게 용해되고 완전히 재흡수된다(6 내지 12 주 내). 용해될 때까지, 황산칼슘 상은 골 지지체에 바람직한 기계적 강도를 제공하는데, 이는 종종 환자에게 이식된 후 인공 이식편의 안정성을 위해 그리고 수산화인회석 입자가 이동하지 않도록 하기 위해 중요하다. CSD가 용해되고 재흡수되는 과정에서, 골 대체물에서 미세기공(micropore)이 점차 확대되어, 줄기 세포(예를 들어, 중간엽 전구 세포), 활성화된 조골세포, 세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 단백질 및 그 밖의 골 세포가 뼈, 골수 및 골 대체물 사이의 내벽(lining)으로부터 새로운 골 형성 및 리모델링이 발생할 수 있는 골 대체물로 더욱 깊숙이 이동할 수 있게 하는 기질을 형성한다. 황산칼슘 상의 특성은 따라서 신생 골이 기계적 안정성을 확보할 때까지 기계적 안정성을 유지하면서 세라믹 골 대체물 내에서 골 세포의 점진적인 내성장을 가능하게 한다.
본 발명의 실시형태에서, 고체 CSD는 황산칼슘 반수화물 분말이 물과 혼합되는 경화 공정에서 형성된다. 공정이 원하는 제어 가능한 시간 내에 발생하도록 촉진제를 추가해야 하는 경우가 종종 있다. 대체물이 액체 형태(예를 들어, 페이스트)로, 예를 들어, 체내 치료에서 주사되거나 달리 적용되는 경우, 알맞은 경화 시간은 10 내지 30 분이다. 촉진제로 황산칼슘 이수화물 또는 식염수(NaCl 용액)를 사용할 수 있다.
골 활성 단백질 및 그 밖의 생리 활성제(예를 들어, 항생제)가 존재하는 경우, 바람직하게는 체액과 접촉시 황산칼슘 상의 미세기공을 통해 황산칼슘 상 내에 배치되고 따라서 이로부터 방출된다. 환자에게 이식한 이후 활성제의 신속한 방출은 골 활성 단백질 및 선택적으로 골 대체물 기질 및 이식 직후 인근의 그 밖의 골 활성 인자의 초기의 높은 국부적 집중을 유발하고, 골 세포 활성화 및 성장의 강력한 초기 자극을 야기한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 골 활성 단백질 및 선택적으로 임의의 다른 생리 활성제는 인산칼슘과 액체의 혼합 이전에 CSH 분말과 미리 혼합된다. 또 다른 실시형태에서, 골 활성 단백질 및 선택적으로 임의의 다른 생리 활성제는 황산칼슘 및 인산칼슘과 혼합되기 전에 액체와 미리 혼합된다. 또 다른 실시형태에서, 골 활성 단백질 및 선택적으로 임의의 다른 생리 활성제는 황산칼슘과 액체의 혼합 이전에 인산칼슘과 미리 혼합된다. 또 다른 실시형태에서, 골 활성 단백질 및 선택적으로 임의의 다른 생리 활성제는 "지연 혼합(delayed mixing)"으로 알려진 공정으로 황산칼슘 분말과 인산칼슘 분말을 액체와 혼합한 직후에 페이스트와 혼합된다(WO 2011/098438 참조). 후자는 골 활성 단백질 및 선택적으로 임의의 다른 생리 활성제가 예를 들어 환자의 수술에 사용하기에 경화 시간이 너무 길어지는 경우와 같이 경화 또는 경화 시간을 방해하는 경우에 관련될 수 있다. 임의의 혼합에서, 골 활성 단백질 및 임의의 다른 생리 활성제는 바람직하게 본 발명의 이상성 세라믹 골 대체물에서 황산칼슘 상 내에 존재할 것이다.
본 발명의 이상성 세라믹 골 대체물의 황산칼슘 상은 골 활성 단백질에 대한 고유한 담체 및 전달 기질을 제공함으로써, 골 활성 단백질의 제어된 그러나 비교적 신속한 방출을 가능하게 하고 동시에 초기 기계적 안정성과 함께 신속한 골 세포 내성장을 위해 유리한 다공성을 생성한다.
인산칼슘 상은 바람직하게는 필수적으로 α-제3인산칼슘, 수산화인회석, 제4인산칼슘 및 β-제3인산칼슘으로 이루어진 군에서 선택되는 인산칼슘 세라믹으로 구성된다(본원에 참조로서 포함되는 EP 1 301 219 참조). 필요한 경우 다양한 인산칼슘 세라믹의 혼합물이 적용될 수 있다.
인산칼슘 상은 비정질 및/또는 결정질 인산칼슘 입자로 구성된다. 입자 크기는 바람직하게는 100 μm 미만, 50 μm 미만, 35 μm 미만, 20 μm 미만 또는 10 μm 미만과 같이 200 μm 미만이다(바람직하게는 0.1 내지 50 μm). 일 실시형태에서, 인산칼슘은 경화를 위해 황산칼슘 분말 및 물과 혼합되는 인산칼슘 입자(예를 들어, 소결된 수산화인회석 입자)로서 제공되며, 따라서 인산칼슘 입자는 경화 후 황산칼슘 상 내에 포매된다. 또 다른 실시형태에서, 인산칼슘은 물과 혼합시 인산칼슘 시멘트를 형성하기 위해 경화 반응 동안 제조되는 경화성 인산칼슘 분말로서 제공된다(본원에 참조로서 포함되는 EP 1 301 219 참조). 인산칼슘의 경화 반응은 미립자 인산칼슘 또는 인산염, 예를 들어 인산수소이나트륨(Na2HPO4)에 의해 촉진될 수 있다.
본 발명의 특정 일 실시형태에서, 인산칼슘 상은 필수적으로 수산화인회석 입자로 구성된다. 수산화인회석 입자는 비정질 또는 결정질 상태일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 인산칼슘 상은 필수적으로 소결된 결정질 수산화인회석 입자로 구성된다. 일 실시형태에서, 소결된 결정질 수산화인회석 입자는 WO 2014/128217(본원에 참조로서 포함됨)에 개시된 방법에 따라 제조되며, 여기서 소결된 결정질 수산화인회석 입자는 가열에 의해 비활성화되고, 이는 결정질 수산화인회석 및 황산칼슘을 포함하는 이상성 세라믹 조성물 내에서 황산칼슘의 개선된 경화 특성으로 이어진다. 이는 조성물이 항생제와 같은 추가의 제제를 포함할 때 바람직하다.
본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명의 이상성 세라믹 골 대체물에 유용한 골 활성 단백질은 골 형성에 활성인 동화 작용 인자, 즉 바람직하게는 골 형성 단백질(BMP), 인슐린 유사 성장 인자(insulin-like growth factor, IGF), 형질전환 성장 인자-β(transforming growth factor-β, TGFβ), 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH), 스클레로스틴(sclerostine) 등으로 이루어진 군에서 선택되는 골 성장 단백질이다. 골 활성 단백질은 또한 세포 공장 유래 골 활성 단백질 및 세포외 기질(ECM) 단백질을 포함하는 조성물의 형태로 제공될 수 있다(WO 2008/041909). 대안적으로, 골 성장 인자인 스트론튬(strontium)이 골 활성 단백질에 추가해서 또는 대체물로서 사용될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 골 활성 단백질은 BMP의 긴 목록에서 선택되는 골 성장 단백질일 수 있지만, 가장 바람직하게는 BMP-2 또는 BMP-7 또는 이들의 조합이다. BMP는 (예를 들어, 골 세포 공장으로부터의) 공여 세포에서 분리되거나 또는 재조합으로 제조될 수 있다. 인간 환자의 경우, rhBMP-2 또는 rhBMP-7과 같은 재조합 인간 BMP가 바람직하게 사용된다. rhBMP는 상업적으로 입수 가능하거나 공지된 기술로 제조될 수 있다.
골 활성 단백질은 그 자체로 제공될 수 있고, 분말, 수성 액체 또는 페이스트 중 임의의 것에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 골 활성 단백질은 사용 전에 수용성 및/또는 생분해성 합성 고분자 마이크로캡슐, 소 콜라겐 입자, 전분 입자, 이수화물 입자(dihydrate nidation particles) 등으로 캡슐화될 수 있다. 캡슐화된 활성 첨가제는 사용 전에 미리 제조될 수 있을 뿐만 아니라 저장 및 혼합 중에 보호된다는 장점이 있다. 캡슐화된 활성 첨가제는 페이스트 이전에 또는 페이스트 내에서 또는 황산칼슘 상의 용해 및 재흡수 중에 방출될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 이상성 세라믹 골 대체물에 유용한 항-이화 작용제는 골 재흡수를 억제하는 제제이다. 골 재흡수 특성을 갖는 억제제의 예는 비스포스포네이트, 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(selective estrogen receptor modulator, SERM)(예를 들어, 랄록시펜(raloxifene), 타목시펜(tamoxifen), 라소폭시펜(lasofoxifene) 및 바제독시펜(bazedoxifene)); 데노수맙(denosumab, Amgen사에 의해 개발된 RANKL에 대한 단일 클론 항체) 및 스타틴(statin)이다. 수산화인회석에 대한 활성 결합이 발생하지 않는 경우, 제제를 캡슐화한 서방성 전달 시스템이 바람직하다.
바람직한 실시형태에서, 항-이화 작용제는 비스포스포네이트이다. 비스포스포네이트는 골 무기질, 즉 수산화인회석과 같은 인산칼슘에 대해 강한 친화성을 가지며, 단순 비스포스포네이트(예를 들어, 에티드로네이트(etidronate)) 및 질소 함유 비스포스포네이트(예를 들어, 알렌드로네이트(alendronate) 및 졸레드로네이트(zoledronate))로 분류될 수 있다. 본 발명에 따른 이상성 세라믹 골 대체물에 사용하기 위한 비스포스포네이트를 선택할 때 다양한 비스포스포네이트의 효능을 고려해야 한다. 알렌드로네이트는 에티드로네이트보다 10 내지 100 배 더 강력하고 졸레드로네이트는 에티드로네이트보다 최대 10,000 배 더 강력하다.
비스포스포네이트는 이들의 분자 구조와 칼슘 이온을 킬레이트화할 수 있는 능력으로 인해 골 무기질을 표적으로 하고 이에 결합한다. 뼈에 있는 무기물에 대한 이들의 강한 친화성으로 인해, 이들은 활성 리모델링 영역에 축적되고 다른 세포 유형에는 최소한으로 축적되며 골 재흡수 동안 방출되어 파골세포에서 내재화될 때까지 실질적으로 결합 상태를 유지한다. 그러나, 비스포스포네이트는 파골세포에 독성이기 때문에, 이들은 골 재흡수가 억제되거나 유지되는 세포사멸로 진행한다.
본 발명의 이상성 세라믹 골 대체물의 인산칼슘 상은 항-이화 작용제, 바람직하게는 비스포스포네이트에 대한 고유한 담체 및 전달 기질을 제공함으로써, BMP 활성화의 결과로서 신생 골 세포가 생성되고 파골세포로 분화되는 동일한 속도로 제제의 제어되고 느린 방출을 가능하게 하고 동시에 황산칼슘이 재흡수된 이후 매우 천천히 신생 골에 재흡수되거나(4-12 개월) 이에 혼입되는 안정한 기질을 형성한다. 공지된 고분자 담체의 일부와 비교할 때, 인산칼슘 상은 시간이 지남에 따라 천연 무기질로서 재흡수되거나 혼입될 것이며, 환자 내에 인공 고분자를 남기지 않을 것이다. 본 발명에 따른 이상성 세라믹 골 대체물에 존재하는 항-이화 작용제(예를 들어, 비스포스포네이트)는 새로운 뼈의 내성장 이후 이상성 골 대체물 내의 이에 결합된 파골세포에 의해 신생 골의 조기 재흡수를 억제하는데, 이는 기질 내의 인산칼슘 입자에 결합된 항-이화 작용제가 황산칼슘 상의 용해 및 재흡수의 결과로서 노출되기 때문이다. 신생 골 세포는 따라서 신생 골이 완전히 광화될 때까지 그리고 그 이후에도 골 결함에 삽입된 이식편으로부터 기질로 확장될 때 항-이화 작용제를 만나게 된다. 조기 재흡수 억제는 동물 근육 모델에서 볼 수 있는 바와 같이 새로운 뼈의 더욱 조밀한 형성 및 광화를 유도하며 이전보다 더욱 양호하고 신속하게 골 결함 환자를 치료할 수 있다. 인산칼슘의 전부 또는 일부는 비스포스포네이트로 전처리될 수 있으므로, 즉각적인 시작부터 12 내지 24 개월의 장기간에 걸친 최적의 균형 및 골 내성장을 위해 결합될 수 있다.
공지된 고분자 담체는 소량의 수산화인회석(WO 2012/094708에서 2 %(w/v) 및 WO 2014/032099에서 1 내지 5 %(w/v))만을 포함하는 반면, 본 발명의 이상성 세라믹 담체는 대략 최대 95 %(w/w)의 인산칼슘(예를 들어, 수산화인회석)(시판되는 Cerament™ 제품에서 대략 40 %의 수산화인회석)을 포함할 수 있고, 따라서 본 발명의 담체에서 비스포스포네이트는 훨씬 높은 밀도로 분산될 수 있다. 높은 밀도는 파골세포의 침투에 의해 골 세포 재흡수의 더욱 효과적인 국지적 억제를 보장하고, 조골세포만 남아있게 된다. 또한, 일부 고분자만이 기계적 지지를 제공하고, 그 어떠한 고분자도 골전도성이 아니기 때문에 골 이식편으로서 이상적이지는 않지만, 본 발명에서 사용되는 이상성 세라믹 골 대체물(예를 들어, Cerament™ 제품)은 미세다공성, 기계적 지지성, 골전도성 및 골유도성이다. 기계적 지지를 제공하는 다공성 고분자, 예를 들어. 폴리((락틱-코-글리콜)산)(WO 2012/094708 참조)은 용매 및/또는 온도를 필요로 하거나 체내 중합 및 주사에 의한 삽입에 적합하지 않은 발열 중합 공정을 갖는다. 주입 가능한 고분자, 예를 들어, 당-기반 고점도 고분자(WO 2014/032099 참조)는 낮은 다공성을 제공하고 기계적 지지를 제공하지 않는다.
항-이화 작용제는 분말 또는 용액으로서 제공될 수 있고 및/또는 수용성 및/또는 생분해성 합성 고분자 마이크로캡슐, 소 콜라겐 입자, 전분 입자, 이수화물 입자 등으로 캡슐화될 수 있다. 캡슐화된 활성 첨가제는 사용 전에 미리 제조되고 저장될 수 있을 뿐만 아니라 저장 및 혼합 중에 보호된다는 장점이 있다. 캡슐화된 성분으로서 첨가될 때, 비스포스포네이트는, 예를 들어 페이스트를 제조하거나 체액이 체내에서 캡슐화에 접하게 될 때와 같이, 예를 들어 캡슐화가 물과 접촉될 때, 이들의 캡슐화로부터 방출되고 인접한 인산칼슘 입자에 결합된다. 항-이화 작용제 및 골 활성 단백질은 동일하거나 상이한 캡슐화로 제공될 수 있다.
본 발명의 실시형태에서, 이상성 세라믹 골 대체물은 항생제(항진균제 포함), 골 치유 촉진제(bone healing promoter), 화학요법제(chemotherapeutic), 정균제(cytostatic), 비타민, 호르몬, 골수 흡인액(bone marrow aspirate), 혈소판 풍부 혈장 및 탈회 골(demineralized bone)에서 선택되는 하나 이상의 추가 생리 활성제를 더 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 이상성 세라믹 골 대체물은 하나 이상의 항생제(예를 들어, 겐타마이신 및/또는 반코마이신)를 포함한다. 추가 생리 활성제(들)는 황산칼슘 분말, 인산칼슘 분말/입자 또는 액체와 혼합되거나, 상기한 지연 혼합 공정에서 황산칼슘 분말, 인산칼슘 분말/입자 및 액체를 포함하는 페이스트와 혼합될 수 있다. 또한, 추가 생리 활성제는 수용성 및/또는 생분해성 합성 고분자 마이크로캡슐, 소 콜라겐 입자, 전분 입자, 이수화물 입자 등으로 캡슐화될 수 있다. 추가 생리 활성제(들)는 선택적으로 항-이화 작용제 및/또는 골 활성 단백질과 함께 동일하거나 상이한 캡슐화로 제공될 수 있으며 페이스트 이전에 또는 페이스트 내에서 또는 체액과의 체내 접촉에 의해 방출될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 이상성 세라믹 골 대체물은 또한 수용성 비이온성 X-선 조영제(예를 들어, 이오헥솔(iohexol)) 및/또는 생분해성 X-선 조영제에서 선택되는 X-선 조영제를 포함한다. X-선 조영제는 황산칼슘 분말, 인산칼슘 분말, 그 밖의 첨가제 또는 액체와 혼합되거나, 상기한 지연 혼합 공정에서 황산칼슘 분말, 인산칼슘 분말/입자 및 액체를 포함하는 페이스트와 혼합될 수 있다. X-선 조영제는 또한 바람직한 경우 수용성 및/또는 생분해성 합성 고분자 마이크로캡슐, 소 콜라겐 입자, 전분 입자, 이수화물 입자 등으로 캡슐화될 수 있다. X-선 조영제(들)는 선택적으로 항-이화 작용제 및/또는 골 활성 단백질 및/또는 그 밖의 첨가제와 함께 동일하거나 상이한 캡슐화로 제공될 수 있고 페이스트 이전에 또는 페이스트 내에서 방출될 수 있다. 세라믹 분말과 혼합할 준비가 된 X-선 용량을 향상시키기 위한 요오드(이오헥솔(iohexol))를 포함하는 미리 혼합된 X-선 용액을 CERAMENT™lC-TRU라는 상품명으로 BONESUPPORT AB사로부터 입수할 수 있다.
본 발명의 특정 실시형태에서, CERAMENT™l BONE VOID FILLER, CERAMENT™l SPINE SUPPORT, CERAMENT™lG 및 CERAMENT™lV와 같은 BONESUPPORT AB사의 이상성 세라믹 물질은 골 형성 단백질(BMP)과 같은 골 활성제(들) 및 비스포스포네이트와 같은 항-이화 작용제(들)에 대한 담체로서 작용할 수 있다. 표 1은 상용 Cerament™ 제품의 함량을 보여준다. 본 발명에서는 Cerament™ 제품에 존재하는 수산화인회석이 줄기 세포에서 골유도 작용을 할 수 있고 낮은 면역원성을 갖는다는 것이 입증되었다.
Figure pct00001
(CERAMIC™ 제품의 조성물 사양)
본원에서 "Cerament™ 제품"은 CERAMENT™l BONE VOID FILLER, CERAMENT™l SPINE SUPPORT, CERAMENT™lG 및 CERAMENT™lV에 존재하는 하나 이상의 분말 조성물을 의미하며, 각각 CERAMENT™lBVF 또는 CERAMENT™BVF 또는 Cerament™BVF; CERAMENT™SS 또는 Cerament™SS; CERAMENT™G 또는 Cerament™G; 및 CERAMENT™V 또는 Cerament™V로 표시된다. 액체와의 혼합에 의해 이들 분말 조성물로부터 생성된 페이스트 및 경화된 고체 골 지지체는 본원 전체에서 동일한 이름으로 언급될 수 있다. "Cerament™ 제품"의 상태 및 함량은 문맥에서 분명해질 것이다.
Cerament™제품으로부터의 골 활성 단백질(예를 들어, BMP-2)의 높은 초기 방출 및 비스포스포네이트(예를 들어, ZA)의 지속 방출은 우수한 담체 플랫폼이 된다는 것이 밝혀졌다. 체외에서 볼 때 골 활성 단백질의 높은 초기 방출은 재흡수성 황산칼슘과 초기 미세다공성을 갖는 이상성 물질에 기인한다. 유도 가능한 세포에 대한 이러한 단백질의 증가된 높은 이용 가능성은 분화의 조기 개시를 유도하며, 이는 다시 촉진된 골 성장을 제공할 수 있다. 대조적으로, 체외에서 보인 담체 플랫폼으로부터의 비스포스포네이트의 지속되지만 낮은 방출은 비스포스포네이트가 인산칼슘(예를 들어, 수산화인회석) 입자의 표면에 강하게 결합함으로써 유발된다. 새로운 골 세포로의 비스포스포네이트의 지속적인 방출과 노출은 신생 골의 조기 재흡수를 억제하고 따라서 새로운 골 세포의 성숙과 광화는 강력하게 리모델링된 골의 신속한 형성을 유발한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 이상성 세라믹 골 대체물은 환자에게 이식되기 전에 주형(들)에서 비드로 제조되거나 및/또는 임의의 원하는 형태로 조각될 수 있다. 미리 설정된 비드 또는 조각된 제형에서 물질에 대한 경화 시간은 중요하지 않을 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 이상성 세라믹 골 대체물은 본 발명에 따른 이상성 세라믹 골 대체물 페이스트가 환자의 골 결손 부위에 주사되거나 또는 달리 배치되는 체내 경화 과정의 결과이다. 이러한 체내 경화 과정에서 경화 시간은 종종 중요하다. 최적의 일관되고 신뢰할 수 있는 골 대체물 경화를 위해서는 경화 성분, 첨가제 및 촉진제를 올바른 조합이 필수적이다. 페이스트는 건조 분말을, 수용성 첨가제의 일부 또는 전부를 포함할 수 있는 수성 액체와 혼합함으로써 사용 직전에 제조될 수 있다. 첨가제의 일부 또는 전부는 수성 액체와 혼합되기 전에 하나 또는 다른 건조 분말과 미리 혼합될 수 있다. 첨가제의 일부 또는 전부는 사용 전 및 경화 전에 페이스트에 첨가되어 혼합될 수 있다. 첨가제의 일부 또는 전부는 상기한 바와 같이 이후의 방출을 위해 캡슐화된 형태일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 분말 및 첨가제는 혼합할 준비가 된 키트로 제공될 수 있으며, 여기서 상이한 분말 및 첨가제는 개별적으로 제공되거나 또는 임의의 바람직한 방식으로 또는 다른 용기에서의 조합으로 미리 혼합될 수 있다. 키트는 또한 페이스트를 제조하기 위한 수성 액체를 포함할 수 있으며, 액체는 하나 이상의 첨가제를 함유할 수 있다.
추가로, 키트는 예를 들어 WO 2005/122971에 개시된 바와 같이, 주사기를 포함하여, 혼합 및 사용 및/또는 혼합 및 주입 장치에 대한 설명서를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 이상성 세라믹 골 대체물은, 외상, 감염된 부위의 제거, 병리학적 병변(예를 들어, 골암)의 절제, 불유합 수술 및 전치환술 또는 재치환술로 인한 골 손실과 같은 외과적 개입 및 공극의 충전이 필요하고 및/또는 이로울 수 있다. 치료하고자 하는 뼈는, 이에 제한되지는 않으나, 임의의 동물 또는 인간의 척수, 손, 손가락, 팔, 발, 발가락, 종아리 또는 허벅지, 무릎, 엉덩이, 발목, 팔꿈치, 손목, 어깨, 두개골, 턱 및 이빨의 뼈를 포함한다.
도 1: Cerament™의 시험관내 면역원성 분석. Ceram™BVF에 RAW 264.7 세포를 시딩하고 다양한 전염증성 사이토카인 IL-1β(패널 A), IL-2(패널 B), IL-6(패널 C) 및 TNF-α(패널 D)의 방출을 분석하고 면역원인 LPS와 비교하였다.
도 2: 전자 현미경을 통한 세포-물질 상호 작용. 패널 A 및 B는 각각 Cerament™BVF 및 Cerament™G를 나타낸다. 패널 C와 D는 두 가지 물질(BVF/G)의 표면 상의 C2C12 세포의 부착을 나타내는 반면, 패널 E와 F는 두 가지 물질(BVF/G)의 표면 전체에 걸친 세포의 균질한 분포를 보여주기 위한 C2C12 세포의 핵 염색(DAPI를 사용)을 나타낸다.
도 3: MTT 및 ALP 분석을 통한 C2C12 세포를 이용한 Cerament™BVF 물질에 대한 세포 배양 연구. 패널 A는 시딩 후 5 주 동안 Cerament™BVF 및 Cerament™G 생체 적합 물질에서의 C2C12 근육모세포의 증식 패턴을 나타낸다. 세포 증식은 증식 대조군으로서 2D-폴리스티렌 플레이트를 이용한 MTT 분석을 통해 평가하였다. 패널 B는 35일 동안 조직 배양 플레이트와 비교하여 Cerament™BVF 및 Cerament™G에 시딩된 C2C12 근육모세포의 ALP 활성 수준을 보여주는 알칼라인 포스파타아제 분석을 나타낸다.
도 4: Cerament™에 시딩된 C2C12 근육모세포의 면역 세포 화학 및 RT-PCR 분석. Cerament™BVF에 시딩한 C2C12 세포를 골 형성 분화를 시각화하기 위한 면역 세포 화학을 사용하여 분석하였다. 시딩 후 7 일 및 21 일의 후에 세포를 염색하였다. 염색된 세포는 시딩 21 일 후 각각 RunX-2(A-C)(7 일), Col I(D-F), OCN(G-I) 및 OPN(J-L)과 같은 골 형성 마커에 대해 양성이었다. 왼쪽 패널(A, D, G 및 J)의 이미지는 DAPI를 사용한 핵 염색을 나타내고, 중간 패널(B, E, H 및 K)의 이미지는 각각의 표적 단백질의 항체 기반 검출을 나타내는 반면 오른쪽 패널(C, F, I 및 L)은 각각의 병합된 이미지를 나타낸다.
도 5: 골 형성 분화의 조기 개시는 7 일 후 Cerament™BVF에 시딩한 C2C12 세포에서 RunX-2 유전자의 존재로 확인되었다(패널 M). 근육 세포의 조골세포 성숙(시딩 후 21 일)은 패널 N, 레인 5에서 대조군 사이즈 마커(ladder)와 함께 Col I(패널 N, 레인 1), OCN(패널 N, 레인 2), BSP(패널 N, 레인 3), 하우스키핑 유전자 GAPDH(패널 N, 레인 4)를 코딩하는 조골세포 유전자의 존재로 확인되었다.
도 6: 세포 공장 골 활성 단백질로 처리한 후 골격근 세포 L6의 형태학적 및 표현형 변화. 패널 A-D는 실험군에서 시딩 12 일 후 각각 Col I, OCN, OPN 및 BSP의 발현을 나타낸다. 염색된 세포는 가장 두드러진 조골세포 마커 COLI(패널 A), OCN(패널 B), OPN(패널 C) 및 BSP(패널 D)에 대해 양성이었다. 패널 E 및 F는 대조군에서 근관(myotube) 형성을 나타내는 반면, 세포 공장 처리군은 단핵 형태를 나타낸다(패널 G 및 H). 패널 I은 두 군에서 세포 증식을 나타내는 반면, 패널 J는 두 군에 대한 근관의 수(myotube number)를 나타낸다.
도 7: Cerament™ 디스크로부터의 BMP-2 시험관내 방출 프로파일
도 8: 시간 경과에 따른 Cerament™ 디스크로부터의 ZA의 시험관내 방출 프로필
도 9: A549 종양 세포에 대한 Cerament™ 디스크에서 방출된 ZA에 의해 유도된 세포독성.
도 10: 4 주 동안 복부 근육낭에 이식된 Cerament™BVF 디스크를 보여주는 방사선 사진. 패널 A는 Cerament™BVF를 나타내고, B는 Cerament™BVF + rhBMP-2를 나타내고, C는 Cerament™BVF + rhBMP-2 + ZA를 나타낸다.
도 11: 4 주 동안 복부 근육낭에 이식된 Cerament™BVF 디스크의 마이크로 CT 및 조직학. 패널 A-C는 Cerament™BVF, Cerament™BVF + rhBMP-2 및 Cerament™BVF + rhBMP-2 + ZA의 3D 마이크로 CT 재구성을 각각 나타낸다. 패널 D-F는 체내 이식 4 주 후 Cerament™BVF, Cerament™BVF + rhBMP-2 및 Cerament™BVF + rhBMP-2 + ZA의 조직학(H&E)을 각각 나타낸다.
도 12: 체내 이식 4 주 후 Cerament™BVF, Cerament™BVF + rhBMP-2 및 Cerament™BVF + rhBMP-2 + ZA의 광화된 조직 부피.
도 13: 4 주 동안 복부 근육낭에 이식된 Cerament™BVF 디스크의 마이크로 CT 및 조직학. 패널A-C(첫 번째 열)는 Cerament™BVF, Cerament™BVF + rhBMP-2 및 Cerament™BVF + rhBMP-2 + ZA의 3D 마이크로 CT 재구성을 각각 나타낸다. 조직학 및 EM에 대한 영역이 표시되어 있다. 두 번째 열은 골 세포가 없는 Cerament™BVF에 대한 EM(D); 주변부에만 뼈가 있는 Cerament™BVF + rhBMP-2(E)에 대한 EM(E); 및 중심부를 가로지르는 지주골(trabecular bone)이 있는 Cerament™BVF + rhBMP-2 + ZA에 대한 EM(F)을 보여준다. 세 번째 열(G-I)은 위의 두 번째 열과 동일한 것을 낮은 배율에서 보여준다.
본 발명은 골 결손, 특히 이식편이 필요한 심각한 골 결손의 재생의 재생과 같은 지지 조직의 장애의 치료에 사용하기 위한 새로운 이상성 세라믹 골 대체물에 관한 것이다. 세라믹 골 대체물의 두 가지 상은 상대적으로 신속한 재흡수성 황산칼슘 상 및 매우 천천히 재흡수 가능한 인산칼슘 상으로 구성된다. 이상성 세라믹 골 대체물은 새로운 골 재생을 위한 골유도 인자로서 작용하는 적어도 하나의 골 활성 단백질 및 골 재흡수를 억제하는 적어도 하나의 항-이화 작용제를 더 포함한다. 골 활성 단백질, 골 재흡수의 특정 억제제 및 미세다공성 및 비교적 신속한 재흡수성 상과 매우 느린 재흡수성 상을 포함하는 이상성 세라믹 골 대체물의 조합은 놀랍게도 유익한 것으로 입증되었다.
황산칼슘 상: 이상성 세라믹 골 대체물의 황산칼슘 상은 필수적으로 황산칼슘 반수화물이 물과 반응하여 시간이 지남에 따라 황산칼슘 이수화물 결정이 형성되고 서로 결합하여 미세다공성 기질을 형성하는 경화 과정에서 형성되는 황산칼슘 이수화물로 구성된다. 경화 반응은 0.2 내지 5 wt%와 같은 0.1 내지 10 wt%의 황산칼슘 이수화물 또는 예를 들어 식염수(NaCl 용액)와 같은 용액 형태의 적절한 염의 첨가에 의해 촉진될 수 있다. 경과 과정 동안, 인산칼슘 상(예를 들어, 수산화인회석 입자) 내의 인산칼슘 입자는 미세다공성 황산칼슘 이수화물 기질(황산칼슘 상)의 공극 내에 포매된다. 황산칼슘 상은 골 대체물에 대해 초기 기계적 고체 특성을 제공한다. 체내에서의 황산칼슘 상의 미세다공성 및 상대적으로 신속한 재흡수는 황산칼슘 상 내에 존재하는 첨가제를 초기 높은 속도로 유리시키고, 인공 물질은 황산칼슘의 재흡수와 함께 매우 다공성인 골격으로 변형되어 인산칼슘 상 내의 인산칼슘 입자에 대한 체액 및 세포의 접근을 증가시킨다. 이는 (신속한) 골 세포 내성장에 매우 유익한 것으로 나타났다. 시험관내 분석에서 BMP-2는 7 일 동안 일정한 속도로 고체 Cerament™ 골 지지체로부터 방출되고 BMP-2의 거의 90 %가 7 일 후에 방출되는 것으로 나타났다.
인산칼슘 상: 이상성 세라믹 골 대체물의 인산칼슘 상은 필수적으로 α-제3인산칼슘, 수산화인회석, 제4인산칼슘 및 β-제3인산칼슘으로 이루어진 군에서 선택되는 인산칼슘 입자로 구성된다. 인산칼슘 성분은 미리 설정된 입자로서 첨가되거나 물이 첨가될 때 이상성 물질 내의 경화 공정을 위한 경화성 전구체(분말)로서 첨가될 수 있다. 이러한 경화 공정의 촉진제, 예를 들어. 미립자 인산칼슘 입자 및 인산염은 본 기술 분야에 공지되어 있으며 공정 중에 첨가될 수 있다. 인산칼슘 입자는 구조가 비정질이거나 결정질일 수 있다. 바람직한 구조는, 예를 들어, 본 기술 분야에 공지된 열처리, 재결정화 및/또는 용해 공정에 의해 수득될 수 있다. EP 1 301 219, EP 1 465 678 및 EP 1 601 387은 인산칼슘, 이의 제조 및 세라믹 골 대체물에서 이들의 용도를 개시하고 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 인산칼슘 상은 필수적으로 수산화인회석, 특히 결정질 수산화인회석 입자로 구성된다. 비스포스포네이트와 같은 항-이화 작용제는 상업적으로 입수 가능한 Cerament™ 제품에서 인산칼슘 상을 구성하는 수산화인회석과 같은 인산칼슘에 대해 강한 친화성을 갖는다.
WO 2014/128217은 부동태화(passivated) 결정질 수산화인회석 입자 및 세라믹 골 대체물에서 이들의 용도를 개시하고 있다. 결정질 수산화인회석 분말은 소결되고 분쇄된 후 가열되어 결정화 수산화인회석 입자의 부동태화(비활성화)로 이어지며, 그렇지 않은 경우, 특히 골 대체물 분말이 항생제와 같은 첨가제를 포함할 때 황산칼슘 상의 경화 과정을 방해할 수 있다. 부동태화 결정질 수산화인회석 입자가 본 발명에서 바람직하게 사용될 수 있다.
골 활성 단백질
이상성 세라믹 골 대체물에 첨가제로 포함되는 골 활성 단백질은 바람직하게 골 형성 단백질(BMP), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 형질전환 성장 인자-β(TGFβ) , 부갑상선 호르몬(PTH), 스클레로스틴(sclerostine) 등으로 이루어진 군에서와 같은 골 성장 단백질에서 선택된다. 대안적으로, 하나 이상의 골 활성 단백질이 세포 공장 유래 골 활성 단백질 및/또는 세포외 기질 단백질(ECM)의 조성물로서 제공될 수 있다. 또한, 스트론튬이 골 활성 단백질에 추가해서 사용되거나 이를 대체할 수 있다. 일 실시형태에서, 골 활성 단백질은 황산염 반수화물과 인산칼슘 분말을 혼합하기 전에 황산칼슘 반수화물 분말과 혼합된다. 대안적으로, 골 활성 단백질은 혼합된 황산염 반수화물 및 인산칼슘 분말 또는 수성 액체와 혼합되거나 페이스트에 첨가된다. 골 활성 단백질은 수용성 및/또는 생분해성 고분자(들)로 캡슐화되어 제공될 수 있다.
일 실시형태에서, 골 활성 단백질은 골 성장 단백질, 바람직하게는 골 형성 단백질(BMP)이다. 바람직하게 BMP는 BMP-2 또는 BMP-7이다. 특정 실시형태에서, BMP는 재조합 BMP, 바람직하게는 rhBMP-2 또는 rhBMP-7과 같은 재조합 인간 BMP이다. BMP는 0.2 내지 500 μg/g 건조 분말, 더욱 바람직하게는 1.0 내지 250 또는 2 내지 200 또는 5 내지 1500 또는 10 내지 120 μg BMP/g 건조 분말의 농도로 사용된다. 그 밖의 골 활성 단백질은 유사한 농도 또는 대응하는 농도 또는 원하는 효과를 얻기 위해 필요한 농도로 사용될 수 있다.
골 활성 단백질은 골 대체물 또는 수성 액체에 첨가 및 혼합함으로써 골 대체물로 혼입된다. 대안적으로, 골 활성 단백질은 주조 전에 페이스트에 첨가될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 골 활성 단백질은 인산칼슘 분말과 혼합하기 전에 황산칼슘 분말과 미리 혼합된다.
골 활성 단백질은 그 자체로 제공될 수 있고, 분말, 수성 액체 또는 페이스트 중 임의의 것에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 골 활성 단백질은 사용 전에 수용성 및/또는 생분해성 합성 고분자 마이크로캡슐, 소 콜라겐 입자, 전분 입자, 이수화물 입자 등으로 캡슐화될 수 있다.
항-이화 작용제
본 발명의 이상성 세라믹 골 대체물에 포함하기 위한 하나 이상의 항-이화 작용제(들)는 바람직하게 비스포스포네이트; 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(SERM) (예를 들어, 랄록시펜(raloxifene), 타목시펜(tamoxifen), 라소폭시펜(lasofoxifene) 및 바제독시펜(bazedoxifene)), 데노수맙(denosumab, Amgen사에 의해 개발된 RANKL에 대한 단일 클론 항체); 또는 스타틴(statin) 또는 둘 이상의 이들 항-이화 작용제의 조합에서 선택된다. 바람직하게, 항-이화 작용제는 하나 이상의 비스포스포네이트이다.
비스포스포네이트는 비-질소(또는 단순) 비스포스포네이트 및 N-함유 비스포스포네이트로 분류된다. N-함유 비스포스포네이트는 단순 비스포스포네이트보다 강력하다.
단순 비스포스포네이트는 세포에서 ATP의 말단 피로인산염 잔기를 대체하는 화합물로 대사되어, 세포 에너지 대사에서 아데노신 삼인산(adenosine triphosphate, ATP)과 경쟁하는 비기능성 분자를 형성한다. 파골세포는 세포사멸을 시작하여 사멸되어 뼈의 파괴를 전반적으로 감소시킨다. 단순 비스포스포네이트의 예는 에티드로네이트(etidronate), 클로드로네이트(clodronate) 및 틸루드로네이트(tiludronate)이다. 클로드로네이트 및 틸루드로네이트는 에티드로네이트보다 10 배 더 강력하다.
질소 함유 비스포스포네이트는 HMG-CoA 환원 효소 경로(메발로네이트(mevalonate) 경로라고도 함)에서 효소인 파르네실 이인산 합성효소(farnesyl diphosphate synthase, FPPS)를 결합 및 차단함으로써 골 대사에 작용한다. N-함유 비스포스포네이트의 예는 (괄호 안의 숫자는 에티드로네이트에 대한 효능) 파미드로네이트(pamidronate, 100), 네리드로네이트(neridronate, 100), 올파드로네이트(olpadronate, 500), 알렌드로네이트(alendronate, 500), 이반드로네이트(ibandronate, 1000), 리세드로네이트(risedronate, 2000) 및 졸레드로네이트(zoledronate, 10000)이다.
비스포스포네이트는 황산칼슘 분말과 혼합되기 전에, 인산칼슘과 강하게 결합하는 인산칼슘 입자/분말(예를 들어, 수산화인회석)에 용액으로 첨가될 수 있다. 원하는 효과를 얻기 위해 필요한 비스포스포네이트의 양/농도는 선택된 비스포스포네이트의 효능에 따라 달라진다. "도핑된" 인산칼슘 입자 내의 비스포스포네이트의 농도는 용액 내의 비스포스포네이트 농도 및/또는 비스포스포네이트 용액에 입자가 배치되는 시간을 선택함으로써 조절될 수 있다. 대안적으로, 분말 및 페이스트 내의 비스포스포네이트의 양/농도는 공지된 (많은) 양/농도의 비스포스포네이트로 도핑된 인산칼슘 입자(예를 들어, 수산화인회석) 및 도핑되지 않은 인산칼슘 입자의 바람직한 비율의 혼합물을 사용하여 제어될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 선택된 비스포스포네이트는 졸레드로네이트/졸레드론산(ZA)이다.
ZA는 0.2 내지 500 μg/g 건조 분말, 더욱 바람직하게는 1 내지 300 μg/g, 또는 10 내지 200 μg/g 또는 10-120 μg/g의 농도로 사용된다. 그 밖의 비스포스포네이트는 유사한 농도 또는 대응하는 농도 또는 원하는 효과를 얻기 위해 필요한 농도로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 국소 적용에 사용되는 BMP의 투여량은 전신 주입에 필요한 것의 20 % 정도 또는 그보다 낮을 수 있다. 지나치게 많은 양의 비스포스포네이트(예를 들어, ZA)는 독성이 있으며, 단독으로 염증 반응을 일으키고 또한 파골세포를 죽일 뿐만 아니라 조골세포를 손상시킨다. 또한, 다량의 BMP만으로도 강력한 반응과 너무 지나친 골 형성을 유발할 수 있다.
골 활성 단백질은 분말 또는 용액으로서 제공될 수 있으며, 분말, 수성 액체 또는 페이스트 중 어느 하나에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 골 활성 단백질은 사용 전에 수용성 및/또는 생분해성 합성 고분자 마이크로캡슐, 소 콜라겐 입자, 전분 입자, 이수화물 입자 등으로 캡슐화될 수 있다.
체외 ZA 방출 분석에 사용하기 위한 디스크는 ZA를 세라믹 분말(Cerament™BVF) 및 액체와 혼합하여 제조되고 주형에서 주조하였다. 식염수를 디스크에 첨가하고, 다양한 시점에서 배지의 샘플을 수확하고 분석하였다. 각각의 Cerament™BVF 디스크로부터의 ZA의 방출은 ZA가 세포사멸을 유도하는 것으로 공지된 폐암 세포(세포주 A549)를 첨가함으로써 수확된 상등액에서 계산될 수 있다. 7 일 후, Cerament™BVF에서 방출된 ZA의 양은 로딩된 총 ZA의 대략 10 %이다.
선택적 에스트로겐 수용체 조절제(SERM), 예를 들어, 랄록시펜, 타목시펜, 라소폭시펜 및 바제독시펜은 폐경기 이후의 골다공증에 효과가 있는 것으로 밝혀졌으며, 따라서 본 발명에 사용하기 위한 항-이화 작용제로 선택될 수 있다.
데노수맙은 골 제거의 주된 신호의 역할을 하는 RANKL(RANK 리간드)을 억제하도록 설계된 완전 인간 단일 클론 항체이다. 많은 골 손실 조건에서, RANKL은 골 파괴에 대한 신체의 자연 방어를 압도한다. 데노수맙은 생명 공학 회사인 Amgen사에 의해 개발되었으며 골다공증, 치료로 유발된 골 손실, 골 전이, 다발성 골수종 및 골 거대 세포종의 치료에 사용된다.
스타틴은 HMG-CoA 환원 효소 경로를 억제하는 다른 종류의 약물이다. 비스포스포네이트와 달리, 스타틴은 높은 친화성을 갖고 뼈 표면에 결합하지 않으므로 뼈에 특이하지 않다. 그럼에도 불구하고, 일부 연구에서는 스타틴 사용자에서의 골절 비율의 감소(골다공증의 지표) 및/또는 골 무기질의 증가를 보고하였다.
추가 생리 활성제
본 발명에 따른 이상성 세라믹 골 대체물은 적어도 하나의 추가 생리 활성제를 또한 포함할 수 있다. 이러한 생리 활성제는 항생제(항진균제 포함), 골 치유 촉진제, 화학요법제, 정균제, 비타민, 호르몬, 골수 흡인액, 혈소판 풍부 혈장 및 탈회 골에서 선택된다.
항생제는 바람직하게 겐타마이신(gentamicin), 반코마이신(vancomycin), 토브라마이신(tobramycin), 세파졸린(cefazolin), 리팜피신(rifampicin), 클린다마이신(clindamycin)에서 선택되고, 항진균제는 바람직하게 나이스타틴(nystatin), 그리세오풀빈(griseofulvin), 암포테리신 B(amphotericin B), 케토코나졸(ketoconazole) 및 미코나졸(miconazole)로 이루어진 군에서 선택된다. 골 대체에서의 사용을 위해 시판되는 세라믹 분말 제품인 Cerament™lG는 겐타마이신을 포함한다. 골 대체에서의 사용을 위한 새로운 세라믹 분말 제품인 Cerament™lV는 반코마이신을 포함한다.
추가 생리 활성제의 농도는 제제 및 원하는 효과에 따라 달라진다. 항생제인 겐타마이신 및 반코마이신의 경우, 이들은 세라믹 분말의 0.5 내지 10 wt%, 바람직하게는 1 내지 6 wt%의 양으로 사용된다.
골 대체물에 생리 활성제를 더 포함하는 것이 바람직한 경우(골 활성 단백질 및 항-이화 작용제 이외에), 이들은 분말 또는 수성 액체에 첨가되고 이에 포함될 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 추가 생리 활성제가 경화 전에 페이스트에 첨가될 수 있다.
추가 생리 활성제는 그 자체로 제공될 수 있고, 분말, 수성 액체 또는 페이스트 중 임의의 것에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 생리 활성제는 사용 전에 수용성 및/또는 생분해성 합성 고분자 마이크로캡슐, 소 콜라겐 입자, 전분 입자, 이수화물 입자 등으로 캡슐화될 수 있다.
X-선 조영제
이식 상황에서, 외과 의사가 수술 중 및 수술 후 환자에서 이상성 세라믹 골 대체물의 위치를 추적할 수 있는 것이 종종 중요하다. 또한 수정될 필요가 있는 새로운 뼈의 내성장 또는 실패를 추적할 수 있는 것이 도움이 될 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 수용성 비이온성 X-선 조영제 및/또는 생분해성 X-선 조영제에서 선택되는X-선 조영제가 골 대체물에 혼입될 수 있다. EP 1 465 678 및 WO 2014/128217은 세라믹 골 지지체 내로의 x-선 조영제의 혼입을 개시하고 있다. X-선 조영제는 전체 분말 성분의 1 내지 25 wt%, 바람직하게는 10 내지 25 wt%를 구성하도록 첨가될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 수용성 비이온성 X-선 조영제는 이오헥솔(iohexol), 이오딕사놀(iodixanol), 이오베르솔(ioversol), 이오파미돌(iopamidol), 이오트롤레인(iotrolane), 메트리자미드(metrizamid), 이오데시몰(iodecimol), 이오글루콜(ioglucol), 이오글루카미드(ioglucamide), 이오글루나이드(ioglunide), 이오글루아미드(iogluamide), 이오메프롤(iomeprol), 이오펜톨(iopentol), 이오프로미드(iopromide), 이오사르콜(iosarcol), 이오시미드(iosimide), 이오투살(iotusal), 이옥실레인(ioxilane), 이오프로탈(iofrotal) 및 이오데콜(iodecol)에서 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 추가의 공극을 제공할 수 있는 생분해성 X-선 조영제가 사용될 수 있다.
X-선 조영제는 그 자체로 제공될 수 있고, 분말, 수성 액체 또는 페이스트 중 임의의 것에 첨가될 수 있다. 대안적으로, X-선 조영제는 사용 전에 수용성 및/또는 생분해성 합성 고분자 마이크로캡슐, 소 콜라겐 입자, 전분 입자, 이수화물 입자 등으로 캡슐화될 수 있다.
세라믹 골 대체물 분말
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 경화성 세라믹 골 대체물 분말에 관한 것으로서, 상기 경화성 세라믹 골 대체물 분말은,
a. 황산칼슘 반수화물 분말;
b. 인산칼슘 분말로서, 인산칼슘은 α-제3인산칼슘, 수산화인회석, 제4인산칼슘 및 β-제3인산칼슘으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 인산칼슘 분말;
c. 골 활성 단백질;
d. 항-이화 작용제;
e. 선택적으로, 바람직하게는 황산칼슘 이수화물 및 염(예를 들어, NaCl)에서 선택되는 황산칼슘의 경화 촉진제; 및
f. 선택적으로 인산칼슘, 바람직하게는 미립자 인산칼슘 및/또는 인산염(예를 들어, Na2HPO4)의 경화 촉진제를 포함한다.
"경화성 세라믹 골 대체물 분말"는 황산칼슘 반수화물 분말 및 선택적으로 인산칼슘 분말이 액체와 접촉한 후 고체 물질로 경화될 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 이상성 세라믹 골 대체물 분말(첨가제를 함유하거나 함유하지 않는 기본 분말)은 5:95 내지 95: 5, 10:90 내지 90:10 20:80 내지 80:20, 30:70 내지 70:30 또는 40:60 내지 60:40인 황산칼슘 반수화물 대 인산칼슘 비율(w/w)을 포함한다. 시판되는 Cerament™은 59.6 wt%의 황산칼슘 반수화물 및 40 wt%의 수산화인회석을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 인산칼슘 분말은 미리 설정된 수산화인회석 분말이며, 바람직하게는 비정질 및/또는 결정질 수산화인회석 입자로 구성된다.
미리 설정된 인산칼슘 분말로서 사용하기 위한 인산칼슘 입자(예를 들어, 결정질 수산화인회석)는 D(v,0.99) 200 μm 미만, 바람직하게는 100 μm 미만, 더욱 바람직하게는 50 μm 미만, 예를 들어 35 μm 미만의 입자 크기를 갖는다. 알려진 중량의 분말 샘플의 흡착된 가스(일반적으로 N2)의 부피를 측정하여 샘플 질량당 단위 면적(m2/g)으로 표시되는 분말의 총 표면적을 결정하는 방법인 BET(Brunauer, Emmett 및 Teller) 방법에 따라 측정할 때, 분말의 비표면적은 20 m2/g 미만인 것이 바람직하고, 10 m2/g 미만인 것이 더욱 바람직하다. 표면적을 측정하는 그 밖의 방법이 대안적으로 적용될 수 있다.
일 실시형태에서, 항-이화 작용제는 황산칼슘 분말과 혼합되기 전에 인산칼슘 입자와 미리 혼합(및 결합)되는 비스포스포네이트이다. 또 다른 실시형태에서, 인산칼슘 입자는 결정질 수산화인회석 입자이다. 대안적으로, 항-이화 작용제는 미리 혼합된 황산칼슘/인산칼슘 분말(기본 분말, 예를 들어, Cerament™ 제품)에 첨가하여 혼합한다.
또 다른 일 실시형태에서, 분말에 존재하는 골 활성 단백질은 골 형성 단백질(BMP), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 형질전환 성장 인자-β(TGFβ), 부갑상선 호르몬(PTH), 스트론튬, 스클레로스틴, 세포 공장 유래 단백질 및 ECM 단백질로 이루어진 군에서 선택된다. 골 활성 단백질은 인산칼슘 분말 또는 기본 분말과 함께 황산칼슘 반수화물 분말과 미리 혼합될 수 있다.
황산칼슘 분말, 인산칼슘 분말 또는 기본 분말은 또한 항생제(항진균제 포함), 골 치유 촉진제, 화학요법제, 세포 증식 억제제, 비타민, 호르몬, 골수 흡인액, 혈소판 풍부 혈장 및 탈회 골에서 선택되는 하나 이상의 생리 활성제를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 항생제는 겐타마이신, 반코마이신, 토브라마이신, 세파졸린, 리팜피신, 클린다마이신에서 선택될 수 있고, 항진균제는 나이스타틴, 그리세오풀빈, 암포테리신 B, 케토코나졸 및 미코나졸을 포함하는 군에서 선택된다.
황산칼슘 분말, 인산칼슘 분말 또는 기본 분말은 수용성 비이온성 X-선 조영제 및/또는 생분해성 X-선 조영제에서 선택되는 X-선 조영제를 더 포함할 수 있다. 수용성 비이온성 X-선 조영제는 이오헥솔(iohexol), 이오딕사놀(iodixanol), 이오베르솔(ioversol), 이오파미돌(iopamidol), 이오트롤레인(iotrolane), 메트리자미드(metrizamid), 이오데시몰(iodecimol), 이오글루콜(ioglucol), 이오글루카미드(ioglucamide), 이오글루나이드(ioglunide), 이오글루아미드(iogluamide), 이오메프롤(iomeprol), 이오펜톨(iopentol), 이오프로미드(iopromide), 이오사르콜(iosarcol), 이오시미드(iosimide), 이오투살(iotusal), 이옥실레인(ioxilane), 이오프로탈(iofrotal) 및 이오데콜(iodecol)에서 선택될 수 있다.
모든 추가 생리 활성제/X-선 조영제는 분말 또는 용액으로서 제공될 수 있으며, 선택적으로 임의의 분말에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 추가 생리 활성제/X-선 조영제는 임의의 분말과 혼합되기 전에 합성 고분자 마이크로캡슐, 소 콜라겐 입자, 전분 입자, 이수화물 입자 등으로 캡슐화될 수 있다.
경화성 세라믹 대체물 페이스트
본 발명은 또한 상기한 경화성 세라믹 골 대체물 분말 및 수성 액체를 포함하는 경화성 세라믹 골 대체물 페이스트에 관한 것이다. 수성 액체는 상기한 골 활성 단백질 및/또는 항-이화 작용제(예를 들어, 비스포스포네이트)를 비롯한 임의의 첨가제를 포함할 수 있다. X-선 조영제 및 항생제와 같은 생리 활성제는 세라믹 골 대체물 분말과 혼합하기 전에 수성 액체에 용해시키는 것이 바람직하다. 대안적으로, 골 활성 단백질 및/또는 항-이화 작용제(예를 들어, 비스포스포네이트)를 포함하는 첨가제가 상기한 바와 같이 지연 혼합에 의해 페이스트에 첨가되고 혼합될 수 있다. 하나 이상의 첨가제가 경화성 페이스트의 경화를 방해하는 경우, 이러한 첨가제는 지연 혼합에 의해 페이스트에 유리하게 첨가될 수 있다.
페이스트 제조에서의 액체 대 건조 분말 비율(L/P)은 0.3 내지 0.6 ml/g, 바람직하게는 0.4 내지 0.5 ml/g과 같이 0.2 내지 0.8 ml/g 범위이다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 경화 가능한 세라믹 골 대체물 페이스트는 분말(들), 첨가제 및 액체를 적절한 용기 또는 주사기(예를 들어, 스웨덴 BONESUPPORT AB사로부터 입수할 수 있는 특정 주입 장치)를 통해 주입할 준비가 되도록 제작된 특별히 설계된 혼합 장치(예를 들어, 스웨덴 BONESUPPORT AB사에서 입수할 수 있는 Mixing and Injection Device(Cerament™lCMI) 또는 미국 Biomet사로부터 입수할 수 있는, 진공과 함께 또는 진공 없이 사용되는 Optipac®과 같은 그 밖의 혼합 장치)에서 혼합하여 제조된다. 첨가제는 분말(들) 또는 액체의 일부이거나 또는 자체 함유되어 분말(들) 및 액체와 함께 첨가될 수 있다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 첨가제는 "지연된 혼합" 공정에서 분말(들)과 액체의 초기 혼합 이후에 페이스트에 첨가된다. 임의의 경화 반응이 시작되기 전에 첨가제(들)의 첨가 및 혼합이 수행되는 것이 중요하다. 바람직하게, 페이스트에 첨가제를 첨가하는 것은 초기 혼합 후 2 내지 4 분 이내에 수행된다.
키트
본 발명은 또한 본 발명에 따른 이상성 세라믹 골 대체물에 사용하기 위한 성분의 전부 또는 일부를 전달하기 위한 키트에 관한 것이다. 이러한 키트는,
i) 황산칼슘 반수화물 분말;
ii) 제 3 항 또는 제 4 항에 정의된 인산칼슘 분말;
iii) 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 정의된 골 활성 단백질;
iv) 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 정의된 골 재흡수를 억제하는 항-이화 작용제; 및
선택적으로 다음 중 하나 이상을 포함한다:
v) 위에서 정의된 적어도 하나의 추가 생리 활성제;
vi) 위에서 정의된 X-선 조영제;
vii) 황산칼슘, 바람직하게는 황산칼슘 이수화물 또는 NaCl과 같은 염의 경화 촉진제;
viii) 인산칼슘, 바람직하게는 미립자 인산칼슘 입자 및/또는 인산수소이나트륨(Na2HPO4)과 같은 인산염의 경화 촉진제;
ix) 선택적으로 수성 액체.
수성 액체는 선택적으로 염 및/또는 완충액을 포함하는 증류수일 수 있다.
일 실시형태에서, 키트는 인산칼슘 분말(ii)과 미리 혼합된 황산칼슘 반수화물 분말(i)을 포함하는 기본 분말(x)을 포함한다.
키트의 또 다른 실시형태에서, 항-이화 작용제(iv)는 인산칼슘 분말(ii)의 적어도 일부, 황산칼슘 반수화물 분말(i)의 적어도 일부, 기본 분말(x), 또는 수성 액체(ix)와 미리 혼합된다.
키트의 또 다른 실시형태에서, 골 활성 단백질(iii)은 황산칼슘 반수화물 분말(i)의 적어도 일부, 인산칼슘 분말(ii)의 적어도 일부, 기분 분말(x), 또는 수성 액체 (ix)와 미리 혼합된다.
키트의 또 다른 실시형태에서, 상기한 적어도 하나의 추가 생리 활성제(v)는 인산칼슘 분말(ii), 황산칼슘 반수화물 분말(i), 기본 분말(x), 또는 수성 액체(ix)와 미리 혼합된다.
키트의 또 다른 실시형태에서, 상기한 X-선 조영제(vi)는 인산칼슘 분말(ii), 황산칼슘 반수화물 분말(i), 기본 분말(x), 또는 수성 액체(ix)와 미리 혼합된다.
키트의 다른 실시형태에서, 상기한 황산칼슘의 경화 촉진제(vii)는 황산칼슘 반수화물 분말(i), 기본 분말(x), 또는 수성 액체(ix)와 미리 혼합된다.
키트의 또 다른 실시형태에서, 상기한 인산칼슘의 경화 촉진제(viii)는 인산칼슘 분말(ii), 황산칼슘 반수화물 분말(i), 기본 분말(x), 또는 수성 액체(ix)와 미리 혼합된다.
추가 생리 활성제/X-선 조영제는 그 자체로 또는 임의의 분말 또는 액체로 제공될 수 있다. 대안적으로, 추가 생리 활성제/X-선 조영제는 개별적으로 또는 수용성 및/또는 생분해성 합성 고분자 마이크로캡슐, 소 콜라겐 입자, 전분 입자 및/또는 이수화물 입자 등의 임의의 적합한 조합으로 캡슐화될 수 있으며, 선택적으로 임의의 분말 또는 액체와 혼합된다.
본 발명에 따르면, 키트는 선택적으로 주입용 주사기를 포함하는 혼합 및 주사 장치를 더 포함할 수 있다. 키트는 사용 설명서도 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 키트는, 예를 들어 생분해성 합성 막(biodegradable synthetic membrane) 또는 예를 들어 WO2013185173에 개시된 콜라겐 막(collagen membrane)과 같은, 인공 이식편을 둘러싸거나 또는 이식편을 외부에 폐쇄하기 위한 라이닝 막(lining membrane)을 더 포함한다. 합성 이식편은 또한 스프레이와 같이 도포될 수 있는 용액에서 단백질로 밀봉될 수 있고 따라서 표면 치유를 지원한다. 커버링 단백질은 표면 세균 부착 및 생물막 생성을 방지하는데 추가적인 이점을 추가할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 외상, 감염의 제거, 종양 병변의 절제, 지연 또는 불유합 및 전치환술 또는 재치환술로 인한 골 손실과 같은 골 결손 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 방법은 치료하고자 하는 골 병변 내로 본 발명에 따른 하나 이상의 이상성 세라믹 골 대체물(이식편)을 삽입하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 방법은 치료하고자 하는 골 병변에 본 발명에 따른 경화성 이상성 세라믹 골 대체물의 페이스트를 도포하는 단계를 포함한다. 치료하고자 하는 뼈는 척수, 손, 손가락, 팔, 발, 발가락, 종아리 또는 허벅지, 무릎, 엉덩이, 발목, 팔꿈치, 손목, 어깨, 두개골, 턱 및 이빨의 뼈를 포함하는 동물 또는 인간의 몸속의 모든 뼈이다. 경화성 페이스트의 형태인 이상성 세라믹 골 대체물의 삽입은 예를 들어 부러진 뼈, 골 종양, 또는 감염된 골 조직과 같은 골의 제거 이후 수행될 수 있다. 대체물이 이식편 주변의 조직에 포함되거나 또는 주변으로의 누출을 방지하거나 또는 개방된 상처를 덮을 필요가 있는 경우, 예를 들어 인공의 고분자 막을 적용하는 것이 유리하거나 필요할 수 있다. 이러한 막은 체액 및 세포가 다공성 이식편에 대해 유동할 수 있도록 및/또는 부분적으로 또는 전체적으로 외부로 밀봉되도록 다공성일 수 있다. 이상성 세라믹 골 대체물의 삽입이 경화된 후, 근육 조직과 피부를 인공 골 대체물 위에 재배치하거나 이식할 수 있다.
시험관내 시험
시험관내 면역원성
Cerament™ 제품 그 자체가 면역원성인지 여부를 확인하기 위해 면역원성 물질과 접촉할 때 다량의 사이토카인을 활성화하고 분비하는 것으로 알려진 RAW 264.7 대식세포를 포함하는 시험을 선택하였다. Cerament™ 제품으로 제조된 세라믹 디스크에 쥐 대식세포 RAW 264.7을 시딩하고 인터루킨(interleukin, IL)-1β, IL-2, IL-6과 같은 전염증성 사이토카인 및 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor, TNF)-α의 분비를 ELISA를 사용하여 7 일 동안 평가하였다. 모든 사이토카인(IL-1β, IL-2, IL-6 및 TNF-α)의 분비는 음성 대조군과 비교되며, 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 처리 양성 대조군보다 유의하게 낮다. 환자에서의 Cerament™의 적용은 따라서 면역학적 활성일 있는 경우 매우 낮은 것처럼 보인다.
시험관내 골유도 효과
일부 임상 사례에서, 수산화인회석/황산염 주입 가능한 혼합물인 Cerament™lBVF로 치료한 외과적으로 생성된 골 결손을 덮는 오버레이 근육에서 광범위한 뼈 형성이 관찰되었다.
근육과 골 대체물 사이의 계면에서의 골유도 가능성을 조사하기 위해 생체외 모델을 설계하였다. Cerament™BVF 및 Cerament™G로 제조된 디스크 상에 골격근 세포를 시딩하였다. SEM을 사용하여 생리화학적으로 Cerament™를 특성화하여 다공성 구조를 확인하였다(도 2A 및 도 2B). Cerament™ 지지체는 세포 부착에 충분한 표면적을 제공하고 또한 영양분, 가스 및 기타 신호 분자를 교환하기 위한 효율적인 환경을 제공한다. 세포는 SEM 및 DAPI 분석에서 관찰된 바와 같이 지지체의 표면에 걸쳐 균일하게 분포되었다(도 2C 내지 도 2F). 두 물질 모두에서 골격근 세포주 C2Cl2는 런트 관련(runt-related) 전사 인자-2(RUNX-2), 제1형 콜라겐(COLI), 오스테오칼신(osteocalcin, OCN), 오스테오폰틴(osteopontin, OPN) 및 골 시알프로테인(bone sialoprotein, BSP)과 같은 골 마커의 발현과 함께 조골세포 유사 세포로 분화되었다. 세포 증식은 겐타마이신을 포함하고 포함하지 않은 두 가지 지지체 모두에서 유사하였으며, 이는 모델에서 지지체에 겐타마이신을 첨가해도 세포에 부정적인 영향을 미치지 않음을 나타낸다(도 3A). 스캐폴드는 조직 배양 플레이트와 비교하였을 때 C2CI2 근육모세포의 점진적으로 억제된 증식을 나타냈다. 그러나, Cerament™ 및 2D 조직 배양 플레이트에서의 이러한 세포 증식 거동의 차이는 근육모세포 C2CI2 세포가 조골세포 계통으로 분화되었기 때문일 수 있다. ALP는 중요한 골 형성 마커이며 Cerament™에 시딩한 세포에서 ALP 활성이 8 배 증가하면(도 3B) 겐타마이신의 첨가 여부와 관계없이 물질의 골유도 거동이 분명히 나타난다. 이는 조골세포로 분화하여 성숙 단계에 들어가기 시작한 C2CI2 세포에 의한 것이다. ALP는 골 형성 세포 형성 예측 인자로서 작용할 수 있는 것으로 알려져 있다. RUNX2는 조골세포 특이적 전사 인자 및 조골세포 분화 조절 인자로 알려져 있다. COLI, OPN 및 OCN과 같은 성숙 조골세포의 그 밖의 마커의 존재가 세포 시딩 21 일째에 검출되었다.
인공 이식편에서 세포외 기질(ECM) 단백질과 성장 인자가 누출된 수술 조건을 모방하기 위해 ROS17/2.8 골 세포를 생물 반응기에서 배양하고 분비된 성장 인자와 ECM 단백질을 수확하였다. 수확된 세포 배양물에서 생성된 골 활성 단백질을 ELISA를 이용하여 측정하였고, 골 형성 단백질-2(BMP-2, 8.4 ± 0.8 ng/mg) 및 BMP-7(50.6 ± 2.2 ng/mg)을 발견하였다. 시험관내에서, 수확된 골 활성 단백질은 골 마커에 대해 양성으로 염색된 골 형성 계통으로 골격근 세포 L6의 분화를 유도하였다.
상기 결과를 기반으로, 골 형성은 이상성 세라믹 골 대체물로부터 그리고 이에 존재하는 조골세포 분화를 유도할 수 있는 성장 인자 및/또는 ECM 단백질의 방출에 의해 상승적으로 향상될 수 있음이 밝혀졌다.
시험관내 BMP -2 방출
Cerament™BVF-rhBMP-2 페이스트를 혼합하여 제조하고, 주사기에 옮긴 후 고체 디스크를 주형에서 제조하였다. 2 μg의 rhBMP-2 를 함유하는 각각의 디스크를 1 mL 생리 식염수에 담그고 37℃ 배양기에 넣었다. 7 일 동안의 다양한 시점에서, 상청액으로부터 생리 식염수 50 μl를 수집하고 분석하여 단백질 농도를 계산하였다. Cerament™BVF로부터의 BMP-2의 일정한 방출이 7 일 동안 관찰되었고, rhBMP-2의 거의 90 %가 7 일 후에 방출되었다.
시험관내 ZA 방출
이상성 세라믹 골 대체물로부터의 비스포스포네이트(졸레드론산(ZA)가 일례로 사용됨))의 방출을 겐타마이신을 포함하고 포함하지 않은 Cerament™에서 조사하였다. Cerament™BVF-ZA 페이스트 및 Cerament™G-ZA 페이스트는 각각의 Cerament™ 분말을 ZA 및 액체와 혼합하여 제조하였다. 주사기를 사용하여 페이스트를 주형에 옮겨 디스크를 제작하였고 생성된 고체 디스크가 경화하도록 놓아 두었다. 식염수를 디스크에 첨가하고 생리 조건에서 배양하였다. 7 일 동안 다양한 시점에서, 배지 샘플을 수집하고 분석하였다. 다양한 시점에서의 각각의 Cerament™+ZA 디스크로부터 ZA의 방출을 평가하기 위해, 수집된 상등액을 A549 세포에 첨가하고 MTT 분석을 사용하여 48 시간 배양한 후 세포 생존율을 계산하였다. ZA의 농도는 표준 곡선으로부터 계산하였다.
7 일 후, 고체 Cerament™ 디스크에서 방출된 ZA의 양은 로딩된 총 ZA의 거의 10 %이다. 겐타마이신을 포함하고 포함하거나 포함하지 않은 Cerament™ 간에 ZA 방출에 차이가 보이지 않았다. A549 세포에 대한 Cerament™BVF 및 Cerament™G 디스크에서 방출된 ZA의 세포독성 효과는 증가하는 시점에서 세포 생존율의 감소를 나타냈다.
시험관내 검사(이소성(근육) 골 모델)
디스크는 재조합 인간 (rh) BMP-2 단독 또는 rhBMP-2와 함께 ZA와 혼합된 Cerament™ 제품에서 제조되었으며 7 주령 래트에 이식되었다. 변형된 이소성 골 모델에서, 복근을 단 한번 무디게 절개하여 이식편을 복근에 삽입하였다. 변형된 이소성 골 모델은 스트레스를 받지 않는 복근을 사용한다는 점에서 독특하며, 초기 연구에 비해 파골세포에 의한 골 세포의 재흡수를 증가시키고, 이식편은 배면 상의 고관절에서 기존 뼈의 옆에 위치하고 따라서 국소 방출 및 아래에 있는 뼈로부터의 자극에 영향을 받을 가능성이 크고 이는 형성되는 뼈의 수준 및 비스포스포네이트와 같은 시험 중인 항-이화 작용제뿐만 아니라 성장 호르몬에 영향을 줄 것이다(WO 2012/094708). 하나의 군에서, 시험 동물들은 동물당 복부 정중선의 왼쪽에서 Cerament™BVF만의 두 개의 디스크를 이식받은 반면, 정중선의 오른쪽은 동물당 Cerament™BVF + rhBMP-2의 두 개의 디스크를 이식하는데 사용되었다. 또 다른 군에서, 동물들은 Cerament™BVF만의 두 개의 디스크 및 Cerament™BVF + rhBMP-2 + ZA의 두 개의 디스크를 유사한 방식으로 이식받았다. 시간이 지남에 따라 디스크에서 나타나는 지지체를 4 주 동안 동물에 방치하였다. 골 형성에 대한 분석은 X-선을 사용하여 수행되었으며 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(마이크로-CT) 및 전자 현미경을 사용하여 광화된 조직 부피의 3차원 분석을 이어졌다. 지지체 내의 세포 유형은 조직학(헤마톡실린 및 에오신(H&E))을 사용하여 분석하였다.
4 주 후에 희생시킨 동물을 조사한 결과, rhBMP-2 및 ZA가 로딩된 Cerament™BVF 디스크의 지지체는 rhBMP-2만 로딩된 Cerament™BVF 디스크의 지지체 및 Cerament™BVF 디스크의 지지체보다 조밀하였다. 마이크로 CT 결과는 rhBMP-2가 로딩된 군 및 Cerament™BVF 디스크 그에 비해 rhBMP-2 및 ZA의 조합이 로딩된 Cerament™BVF 디스크 군에서 광화된 조직 부피가 현저히 높은 것을 보여주었다. rhBMP-2및 ZA의 조합이 로딩된 군은 Cerament™BVF + rhBMP-2 군보다 상당히 높은 무기질 용량을 가졌다. 조직학적으로, rhBMP-2 + ZA가 로딩된 샘플은 지지체 내에서 이미 볼 수 있는 지주골의 섬을 갖는 지지체 주위에서 피질 쉘(cortical shell)로 진행된 반면, Cerament™BVF + rhBMP-2 군은 가시적인 지방 골수와 함께 파골세포 재흡수의 징후를 보였다. 이는 전자 현미경으로 분명하게 시각화된다.
실시예
실시예에 사용된 Cerament™조성물의 함량은 표 1에 제시되어 있다.
모든 실시예에서 "식염수"는 달리 명시되지 않는 한 9 mg NaCl/mL 물을 함유하는 NaCl 용액을 의미한다.
실시예 1
시험관내 면역원성
Cerament™BVF 페이스트를 제조사의 지시에 따라 제조하였고 디스크(직경 8 mm, 높이 2 mm)를 제조하는데 사용하였으며, 디스크는 20 분 전에 얹혔다. 디스크에 총 1×105 개의 쥐 대식세포 RAW 264.7을 시딩하였고, 인터루킨(interleukin, IL)-1β, IL-2, IL-6과 같은 전염증성 사이토카인 및 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor, TNF)-α의 분비를 ELISA를 사용하여 7 일 동안 평가하였다. 양성 대조군으로서, RAW 264.7 세포를 면역원성 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)로 처리하였다.
모든 사이토카인(IL-1β, IL-2, IL-6 및 TNF-α)의 분비는 음성 대조군(2D-TCP)과 비슷하였고, LPS 처리 양성 대조군(2D-TCP + LPS)보다 유의하게 낮았으며, p 값은 모든 경우에 0.0001 미만이었다(도 1A 내지 도 1D).
실시예 2
시험관내 골유도
시험관내 실험을 위한 물질 제조
Cerament™lBVF와 Cerament™lG의 두 가지 유형의 골 대체물 제품을 공급자 지침(Bone Support AB사, Lund, Sweden)에 따라 혼합하여 균질한 페이스트를 형성하였다. 페이스트를 직경 8 mm, 높이 2 mm의 디스크 형상 주형에 부은 후 30 분간 경화시켰다.
3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT), Sigmafast pNPP, 둘베코의 변형 이글 배지-하이 글루코스(Dulbecco's Modified Eagle's Medium-High glucose, DMEM-HG), 소태아 혈청(Fetal bovine serum, FBS), 항생제 칵테일(antibiotic cocktail), 실시간 중합효소 연쇄 반응(real time polymerase chain reaction, RT-PCR)을 위한 트리졸 시약 및 프라이머를 Sigma Aldrich(MA, USA)에서 구입하였다. 마우스 COLI, OCN, RUNX-2, OPN은 Santa Cruz Biotechnology, Inc.(CA, USA) 및 Sigma Chemical company(MA, USA)에서 구입하였다. 래트 COLI, OCN, OPN 및 골 시알프로테인(bone sialoprotein, BSP) 항체인 DRAQ5, alexa flour 488(AF-488)은 Abcam(Cambridge, UK)에서 입수하였다. RT-PCR 시약은 Thermo scientific(USA)에서 구입하였다. 래트 BMP-2 및 BMP-7 ELISA 키트는 Abnova Inc.(Taiwan) 및 대만 및 Qayee Bio(China)에서 각각 구입하였다. 그 밖의 모든 시약은 인정된 공급자로부터 구입한 고순도의 것이다.
세포 배양
마우스 근육모세포 C2Cl2 세포를 10 %(v/v) 소태아 혈청(FBS) 및 항생제가 보충된 둘베코의 변형 이글 배지(DMEM)에서 배양하였다. 세포를 95 % 공기 및 5 % CO2를 함유하는 배양기에서 보관하였다. 세포 증식 및 기능 실험을 위해 1×105 개의 세포를 Cerament™ 디스크에 시딩하였고, 면역형광 염색 및 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)을 위해 1×106 개의 세포를 Cerament™ 디스크에 시딩하였다. 래트 근육모세포 세포주 L6을 10 %(v/v) FBS 및 페니실린-스트렙토마이신으로 이루어진 1 %(v/v) 항생제 칵테일을 함유하는 하이 글루코스 DMEM에서 배양하였다. 세포를 80 % 컨플루언스(confluence)에서 계대 배양하고 회복 후 2 계대에서 사용하였다. 실험 전의 세포 생존율은 트립판 블루 염색 방법을 사용하여 평가하였다.
근육 조직에서 골 형성을 유도하는 체내 조건을 모방하기 위해, ROS17/2.8 조골세포의 확장된 세포 배양물부터 조골세포 세포 공장 유래 단백질을 수확하였다. 세포를 완전 배지 및 5 %(v/v) 혈청을 보충한 배양 플라스크에서 3 일 동안 증식시켰다. 배지 내의 분비된 골 활성 단백질을 수집하면서 세포를 다시 계대 배양하여 이 과정을 반복하였다.
근육 세포가 조골세포 유사 세로로 분화할 수 있도록, 래트 근육 세포주 L6을 사용하였다. 세포를 80 % 컨플루언트까지 성장시킨 후 저 혈청(5 % v/v) 완전 배지 또는 완전 배지(저 혈청) 및 수확된 조골세포 세포 공장 배지의 혼합물을 동일한 부피비로 공급하였다. 세포를 10 일 또는 12 일 동안 성장시키고 다양한 기술을 사용하여 분석하여 이들의 표현형의 변화를 확인하였다.
통계 분석
MTT 및 ALP 분석 데이터는 언페어드 t-검정을 사용하여 분석하였다. p < 0.05가 유의한 것으로 간주되었다. MTT 분석 데이터 및 세포 공장 실험에 대한 근관의 수는 비-모수적(non-parametric)인 다중 t-검정을 사용하여 분석하였으며 p <0.05가 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 데이터는 3회 반복에서의 평균 및 표준 편차와 함께 표시된다.
현미경 분석
Cerament™ 디스크의 표면상의 C2C12 세포의 물질의 형태와 부착을 주사 전자 현미경으로 분석하였다. 물질을 농도별 에탄올 처리로 건조시켰다. 또한, 샘플을 밤새 진공 건조시켰다. Cerament™ 표면에서의 세포 부착을 분석하기 위해, 세포를 겐타마이신을 포함하고 포함하지 않은 물질 모두에 시딩하였다. 세포를 3 일 동안 성장시켰다. 이후, 글루타르알데히드(glutaraldehyde, 2.5 %)를 사용하여 표면 상의 모든 세포를 고정시켰다. 고정 후 단계는 표면 형태 분석을 위한 샘플 제조에 사용된 것들과 동일하다. 또한, Cerament™ 디스크 상의 세포의 부착을 4', 6-디아미디노-2-페닐인돌(4', 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI) 염색을 사용하여 분석하였다.
겐타마이신을 포함하고 포함하지 않은 모든 Cerament™ 디스크의 표면 형태는 물질 표면에서 1 내지 10 μm 범위의 기공 크기를 갖는 함께 다공성 구조를 나타냈다(도 2A 및 도 2B). 시딩 3 일 후 Cerament™ 디스크의 표면에 세포가 존재하였다(도 2C 및 도 2D). 세포는 겐타마이신을 포함하고 포함하지 않은 두 디스크 모두에 부착되어 균질하게 분포되었다(도 2E 및 도 2F). 이는 시딩된 세포가 물질의 표면에 부착되고 고르게 분포되어 있는 유사한 유형의 분포 패턴을 나타내는 세포의 DAPI 염색에 의해 더 확인되었다.
세포 증식 분석
두 물질에서의 세포 증식은 MTT 분석을 이용하여 일정한 시간 간격으로 평가하였다. 간단히, 웰 내의 DMEM 배지를 제거하고, 세포가 시딩된 무기 디스크를 인산염 완충 식염수(PBS)를 사용하여 세척하였다. 이후, MTT(0.5 mg/ml)를 함유하고 FBS가 없는 DMEM 배지를 웰에 첨가하고 5 시간 배양하였다. 또한, 이 용액을 제거하고 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO)를 첨가하였다. 샘플을 37℃에서 20 분간 배양하였다. 형성된 착색된 용액을 수집하고 흡광도를 570 nm에서 분광 광도계로 측정하였다. L6 세포를 이용한 세포 공장 실험에서의 세포 증식 분석이 유사한 방식으로 수행되었으며 5×104 세포/웰의 세포 밀도가 사용되었다. 근관 증식은 현미경으로 분석하였고, 다핵 및 신장 세포를 근관으로 간주하였다.
겐타마이신을 포함하고 포함하지 않은 Cerament™ 물질 모두에서 유사한 결과가 나타났다(도 3A). 7 일째까지의 세포 집단의 초기 증가 후, 세포 증식은 억제되고, 이후의 시점에서는 세포 집단의 감소가 관찰되었다. 한편, 대조군으로 취한 2차원 폴리스티렌 조직 배양 플레이트의 경우, 14 일째까지 세포 증식의 증가가 관찰되었고, 이후 증식이 감소하기 시작하였다. 두 물질 모두에 시딩된 세포는 유사한 세포 증식 프로파일을 보였다. 세포 증식에 통계적으로 유의한 차이는 보고되지 않았다(p>0.05). 그러나, Cerament™ 디스크에 비해 폴리스티렌 조직 배양 플레이트에서 더욱 양호한 세포 증식이 보고되었다.
알칼라인 포스파타아제 분석
Sigmafast의 파라-니트로페닐포스페이트(para-Nitrophenylphosphate, pNPP) 정제를 사용하여 제조사가 제공한 프로토콜에 따라 pNPP 기질 용액을 제조하였다. 배지를 웰에서 제거하고 샘플을 PBS 완충액으로 세척하였다. 이후 샘플을 파라-니트로페닐포스페이트(pNPP) 기질 용액으로 37℃에서 2 시간 동안 배양하고 흡광도를 405 nm에서 측정하였다.
겐타마이신을 포함하고 포함하지 않은 물질 모두는 세포 시딩 14 일째까지 ALP 양의 증가를 보였다(도 3B). 이후, ALP의 값은 시간이 경과함에 따라 감소하기 시작한다. 14 일 동안, Cerament™ 물질 모두에 시딩된 세포는 폴리스티렌 대조군에 비해 ALP 수준이 8 배 증가한 것으로 나타났다(p<0.05). 두 물질 모두에서 ALP 수준에 통계적으로 유의한 차이는 없었다(p>0.05). 반면에, 폴리스티렌 플레이트에 시딩한 세포에 의한 ALP의 수준은 Cerament™ 물질에 시딩한 세포의 ALP 수준과 비교하여 작다.
골 형성 마커에 대한 면역형광 염색
물질의 분화 가능성을 면역형광 염색을 사용하여 관찰하였다. 세포를 염색하여 21 일 동안 runx2, 오스테오폰틴(osteopontin), 오스테오칼신(osteocalcin), 제1형 콜라겐(COLI)과 같은 그 밖의 마커의 존재를 검출하였다.
면역형광 염색은 Cerament™ 디스크에서 세포 시딩 7 일째까지 Runx2의 존재를 보여주었다(도 4A 내지 도 4C). COLI(도 4D 내지 도 4F), OCN(도 4G 내지 도 4I) 및 OPN(도 4J 내지 도 4L)과 같은 성숙 조골세포의 그 밖의 마커의 존재는 세포 시딩 21 일째에 검출되었다.
L6 근육 세포의 조골세포 유사 세포로의 전환분화(transdifferentiation)를 확인하기 위해, 제1형 콜라겐(COLI), 오스테오칼신(OCN), 오스테오폰틴(OPN) 및 골 시알프로테인(BSP)과 같은 다양한 조골세포 마커에 대해 두 개 군의 세포를 면역 염색하였다. 조골세포 채취 골 활성 단백질 또는 저 혈청을 포함하는 완전한 배지에서 세포를 배양 플라스크에서 10 일 동안 성장시켰다. 세포를 트립신 처리하고 4-웰 챔버 슬라이드에 시딩한 후 48 시간 동안 동일한 배지로 더 증식시켰다. 염색하는 날, 세포를 10 분 동안 4 % 포름알데히드를 사용하여 고정시키고, 이어서 0.1 %(v/v) 트리톤 X-100을 사용하여 5 분 동안 막 투과화를 실시하였다. 후기 세포를 5 % 염소 혈청을 사용하여 1 시간 동안 차단하고 각각의 1차 항체와 함께 실온에서 2 시간 동안 배양하였다. 슬라이드를 PBST로 5 회 세척한 후, 2차 항체(AF-488 표지)에서 1 시간 동안 배양하였다. 슬라이드를 DRAQ5를 사용하여 5 분 동안 대조 염색하고 각각 5 분씩 두 번 세척하였다. 분석하기 전에 슬라이드를 최종적으로 세척하고, 장착한 후 밤새 건조시켰다. 세포를 Zeiss 공초점 현미경으로 다양한 배율로 분석하였다.
도 6은 조골세포 유사 세포로 형질전환된 면역 양성 및 전환분화된 근육 세포를 도시하고 있다. 처리된 군의 세포는 12 일째에 COLI, OCN, OPN 및 BSP와 같은 골 형성 단백질을 발현하였다(도 6A 내지 도 6D). 대조군의 세포는 함께 융합되어 근관을 형성하고 골 형성 단백질을 발현하지 않았다.
RNA 추출 및 RT - PCR
겐타마이신을 포함하고 포함하지 않은 Cerament™의 디스크에 C2C12 세포를 1×106 세포/디스크의 농도로 시딩하였다. 7 일 및 21 일 동안 디스크에 시딩한 세포를 시험관내 배양한 후 트리졸 시약을 사용하여 RNA를 추출하였다. 세포가 시딩된 디스크를 트리졸 시약 1 ml를 첨가한 후 멀티웰 플레이트에서 마이크로튜브로 옮겼다. 이후, 제조사가 제공한 프로토콜에 따라 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA(20 μl)를 1 μl의 oligodT와 함께 5 분 동안 75℃에서 배양한 후 5 분 동안 얼음 위에서 배양하여 상보적 DNA(cDNA)를 합성하였다. 여기에 4 μl의 buff RT, 1 μl의 RTase, 0.5 μl의 RI(RNase 억제제) 및 2 μl의 dNTP mix를 함유하는 cDNA 혼합물을 첨가하였다. RUNX2, COLI, BSP 및 OCN과 같은 골 형성 계통의 다양한 유전자의 발현을 평가하기 위해 RT-PCR를 수행하였다. 유전자의 프라이머 서열은 이전의 연구로부터 수득하였고 표 2에 나타내었다. 내인성 대조군으로서, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)의 발현을 측정하였다. DNA 증폭을 위해 연속적인 열 사이클을 사용하였다. RT-PCR 산물을 에티디움 브로마이드를 사용하여 염색된 2.0 % 아가로스 겔에서 용해하였다.
프라이머 서열
1 RUNX2 F:TTTAGGGCGCATTCCTCATC
R:TGTCCTTGTGGATTAAAAGGACTTG
2 BSP F:CACCCCAAGCACAGACTTTT
R:GTTCCTTCTGCACCTGCTTC
3 COLI F:GAGGCATAAAGGGTCATCGTGG
R:CATTAGGCGCAGGAAGGTCAG
4 OCN F:GAACAGACTCCGGCGCTA
R:AGGGAGGATCAAGTCCCG
5 GAPDH F:TCCACTCACGGCAAATTCAACG
R:TAGACTCCACGACATACTCAGC
결과는 세포 시딩 7 일까지의 RUNX2의 존재(도 5M) 및 COLI, BSP 및 OCN과 같은 그 밖의 조골세포 표지의 존재를 보여주었다(도 5N).
광학 현미경 검사와 헤마톡실린 및 에오신 염색을 이용한 형태학적 변화
조골세포 채취 골 활성 단백질의 첨가에 의한 근육 세포의 전환분화를 수 일 동안 분석하였다. 광학 현미경 검사 및 H&E 염색을 사용하여 형태학적 분석을 수행하였다. 다양한 배율의 광학 현미경을 사용하여 배양 플라스크를 직접 모니터링하였다. H&E 염색을 수행하기 위해 세포를 4-웰 챔버 슬라이드에서 성장시키고 4 %(w/v) 포름알데히드로 10 분 동안 고정시켰다. 세포를 감소하는 에탄올 농로로 수화시키고 5 분 동안 헤마톡실린으로 염색하였다. 과도한 염색은 흐르는 물로 세척한 후 에오신으로 2 분간 대조 염색하였다. 이미지화하기 전에 슬라이드를 5 분 동안 크실렌에서 세척하고, 장착한 후 밤새 건조시켰다.
시간 경과에 따른 형태학적 차이를 골 활성 단백질로 처리된 세포 및 대조군에서 관찰하였다. 대조군의 세포는 처리군(미도시)의 세포와 비교하여 실험 1 일의 초기부터 실험의 종료까지 연장되는 것을 볼 수 있다(도 6E 및 도 6F). 헤마톡실린 및 에오신 염색은 성장 인자 처리가 있고 없는 세포 간의 구조적 차이를 명확하게 보여준다(도 6F 및 도 6H). 대조군의 경우, 근육 세포는 다수의 핵을 보유한 융합된 근관으로 분화하는 반면, 성장 인자로 처리된 군의 세포는 실험 내내 단일 핵으로 남아있게 된다(도 6F 및 도 6H). 또한 처리된 세포의 경우 세포의 크기가 훨씬 작고 조골세포와 같은 형태를 갖는다.
세포 생존율 및 근관의 수
세포의 증식 프로파일에서 유의한 차이는 관찰되지 않았다(도 6I). 그와는 반대로, 대조군의 세포는 융합되어 다중 핵을 갖는 근관을 형성한다. 7 일 동안 관찰될 수 있는 근관의 수 또한 분석하였다. 대조군의 근관의 수는 시간이 지남에 따라 계속 증가하였다(p<0.05). 그러나, 처리군에서 1 일째에는 근관이 거의 관찰되지 않았고 3 일 이후에는 그 수가 영(0)에 근접하였으며, 이는 근관 형성의 완전한 억제를 시사한다(도 6J).
조골세포 세포 공장 구성
ROS 17/2.8 세포 공장에서 다양한 프로-조골세포 단백질을 검출하기 위해, 수확한 세포 공장 단백질을 8 kDa 투석막(dialysis membrane)을 사용하여 48 시간 동안 초순수에 투석하였다. 투석 후, 48 시간 동안 단백질을 동결 건조하여 농축하였다. 이렇게 수득한 건조된 단백질 분획을 두 개의 중요한 골 활성 분자인 BMP-2 및 BMP-7의 검출 및 측정을 위해 ELISA를 사용하여 분석하였다.
다양한 중간엽 세포의 조골세포 계통으로의 골 형성 분화에 관여하는 두 개의 가장 일반적인 골유도 단백질인 BMP-2 및 BMP-7의 존재를 확인하였다. 골 형성 단백질의 검출은 ELISA를 사용하여 수행하였으며 세포 공장에서 BMP-2와 BMP-7의 각각의 농도는 수확한 단백질 분획의 8.4 ± 0.8 ng/mg 및 50.6 ± 2.2 ng/mg이었다.
실시예 3
시험관내 BMP -2 방출
1 g의 Cerament™BVF를 0.406 ml의 Cerament™lC-TRU와 혼합하였다. Cerament™BVF 페이스트를 30 초 동안 철저하게 혼합한 다음 30 초 동안 기다렸다가 2.5 분 동안 계속하였다. rhBMP-2 40 μg을 함유하는 rhBMP-2(Medtronic)의 저장액을 40 μL 식염수(9 mg NaCl/mL)에 용해시켜 제조하였다. 2.5 분에 24 μl의 상기 rhBMP/식염수 저장액을 미리 혼합된 Cerament™BVF 페이스트에 철저하게 혼합하였다. rhBMP-2 용액을 Cerament™BVF 페이스트에 완전히 혼합한 후, rhBMP/Cerament™BVF 페이스트를 주사기에 옮기고 12 개의 디스크를 제작하였다(직경: 5 ± 0.1 mm, 높이: 1.5 ± 0.05 mm). 모든 디스크는 20 분 전에 경화되었다. 디스크의 무게는 46 ± 3.2 mg이었고 각각의 디스크는 2 μg rhBMP-2를 함유하였다.
각각의 디스크를 1 mL의 식염수에 담그고 37℃의 배양기에 두었다. 각각의 시점(1 일, 3 일, 5 일 및 7 일)에서 상등액 50 μl를 분석을 위해 수집하고 50 μl의 신선한 식염수를 첨가하였다. 단백질 농도는 ELISA를 사용하여 7 일 동안 계산하였다. 도 7에서 고체 Cerament™BVF로부터 BMP-2의 일정한 방출이 7 일 동안 관찰되었고, rhBMP-2의 거의 90 %가 7 일 후에 방출된 것을 보여준다.
실시예 4
시험관내 ZA 방출
시험관내 졸레드론산(ZA) 방출 시험을 위해 총 12 개의 디스크를 제작하였다. 6 개의 디스크는 Cerament™BVF 분말로 제작하였으며 6 개의 디스크는 Cerament™G 분말로 제작하였다
500 mg의 Cerament™BVF를 148.64 μl의 Cerament™lC-TRU와 혼합하였다. 샘플을 30 초 동안 철저하게 혼합한 다음 30 초 동안 기다렸다가 2.5 분까지 계속하였다. 2.5 분에 67.5 μl의 졸레드론산 용액(54 μg ZA, Zometa(4 mg/5 ml), Novartis)을 Cerament™BVF 페이스트에 첨가하였다. Cerament™BVF + ZA 페이스트를 30 초 더 혼합하고 6 개의 디스크를 제작하였다(직경: 5 ± 0.1 mm, 높이: 1.5 ± 0.05 mm, 9 μg ZA). 모든 디스크는 20 분 전에 경화되었다.
500 mg의 Cerament™G 분말을 6.6 mg의 겐타마이신을 함유하는 148.64 μl의 식염수와 혼합하였다. 샘플을 30 초 동안 엄격하게 혼합한 다음 30 초 동안 기다렸다가 3.5 분까지 계속하였다. 3.5 분에 67.5 μl 졸레드론산 용액(54 μg ZA, Zometa, Novartis)을 Cerament™G 페이스트에 첨가하였다. Cerament™G + ZA 페이스트를 30 초 이상 혼합하고 6 개의 디스크를 제작하였다(직경: 5 ± 0.1 mm, 높이: 1.5 ± 0.05 mm, 9 μg ZA). 모든 디스크는 20 분 전에 경화되었다.
식염수를 디스크에 첨가하고 생리 조건에서 배양하였다. 각각의 시점에서, 배지의 샘플을 수집하여 추후 분석을 위해 저장하였다. 다양한 시점에서 각각의 Cerament™BVF/G + ZA 디스크로부터 ZA의 방출을 평가하기 위해, 수집된 상등액을 A549 세포에 첨가하고 48 시간 배양한 후 MTT 분석을 사용하여 세포 생존율을 계산하였다. 그 다음, 얻어진 표준 곡선으로부터 ZA의 농도를 계산하였다.
시험관내 통계 분석은 다중 t-검정(Prism 6)을 사용하여 수행하였고 데이터는 3회 반복에서의 평균 및 표준 편차와 함께 표시된다.
7 일 후, Cerament™BVF 및 Cerament™G 디스크에서 방출된 ZA의 양은 로딩된 총 ZA의 거의 10 %였다(도 8: BVF 및 G 군 모두는 Cerament™BVF와 Cerament™G 디스크 간에 차이가 나타나지 않았음). A549 세포에 대한 Cerament™ 디스크에서 방출된 ZA의 세포독성 효과는 증가하는 시점에서 세포 생존율의 감소를 나타낸다(도 9: BVF 및 G 군 모두는 Cerament™BVF와 Cerament™G 디스크 간에 차이가 없었음).
실시예 5
체내 근육낭 모델
이 연구는 실험실 동물 사용에 대한 지방 당국의 승인을 받았다(M 124-14 허가). Cerament™BVF, Cerament™BVF + rhBMP-2 및 Cerament™BVF + rhBMP-2 및 ZA의 디스크를 다음과 같이 제조하였다:
Cerament ™ BVF 디스크:
1 g의 Cerament™BVF를 162 μl 생리 식염수 및 268 μl Cerament™lC-TRU를 포함하는 0.43 mL의 이오헥솔 용액과 혼합하고 30 초 동안 철저하게 혼합한 다음 30 초 동안 기다렸다가 2.5 분까지 반복하였다. 사용된 총 액체는 1 g Cerament™ 분말에 대해 430 μl 였고, 이는 액체/분말 비율이 0.43 ml/g인 480 μl 페이스트를 제공한다. 페이스트를 사용하여 멸균 주형(40 μl 페이스트/실린더)에서 12 개의 원통형 디스크(직경 5 mm, 높이 2 mm, 중량 47.6 ± 3 mg)를 제조하였다. 각각의 디스크는 83.33 mg Cerament™BVF, 22.33 μl Cerament™lC-TRU 및 13.5 μl 식염수를 함유하였고 20 분 전에 얹혔다.
Cerament ™ BVF + BMP 디스크:
"Cerament™BVF + BMP" 군에서 BMP의 원액 솔루션은 162 μl의 식염수에 rhBMP-2(Medtronic) 120 μg을 녹여 초기에 준비하였다. 1 g의 Cerament™BVF를 268 μl의 Cerament™lC-TRU와 혼합하고 30 초 동안 엄격하게 혼합한 다음 30 초를 기다린 후 혼합을 반복하고 2.5 분이 될 때까지 정지하여 페이스트를 얻었다. 2.5 분에, 162 μl BMP/생리 식염수 용액(120 μg rhBMP-2 함유)을 페이스트에 첨가하고 30 초 동안 더 엄격하게 혼합하였다. 사용된 총 액체는 0.43 ml/g의 액체/분말 비를 제공하는 1 g Cerament™BVF 분말에 대해 430 μl이었다. rhBMP-2 120 μg을 함유하는 최종 부피 480 μl의 페이스트를 얻었고 각각 40 μl BMP/Cerament™BVF 페이스트를 넣은 동일한 크기의 12 개 디스크를 준비하는데 사용하였다. 각각의 디스크에는 83.33 mg Cerament™BVF, 22.33 μl Cerament™lC-TRU, 13.5 μl 식염수 및 10 μg rhBMP-2가 포함되어 있다. 디스크는 20 분 전에 얹혔다.
Cerament ™ BVF + BMP + ZA 디스크:
rhBMP-2의 용액은 120 μg rhBMP-2(Medtronic)를 12 μl의 생리 식염수에 녹여 제조하였다. 150 μl의 ZA 용액(120 μg ZA, Novartis)을 첨가하고 rhBMP-2 용액과 혼합하였다. 생리 식염수에 총 162 μl의 ZA(120 μg)와 rhBMP-2(120 μg)를 얻었다. 1 g의 Cerament™BVF를 268 μl의 Cerament™lC-TRU와 혼합하고, 페이스트를 30 초 동안 엄격하게 혼합한 후 30 초 동안 기다렸다가 혼합 및 정지를 2.5 분이 될 때까지 반복하여 페이스트를 제조하였다. 2.5 분에 162 μl의 ZA + rhBMP-2 용액을 페이스트에 첨가하고 30 초 동안 더 혼합하여 내용물을 균질화 시켰다. 480 μl의 최종 부피를 얻었고 각각 40 μl의 ZA/BMP/Cerament™ 페이스트가 담긴 12 개의 디스크를 만들었다. 각각의 디스크에는 83.33 mg Cerament™BVF, 22.33 μl Cerament™lC-TRU, 13.5 μl 식염수, 10 μg rhBMP-2 및 10 μg ZA가 포함되어 있다. 디스크는 20 분 전에 얹혔다.
상기한 바와 같이 제조된 Cerament™BVF, Cerament™BVF + rh-BMP-2 및 Cerament™BVF + rh-BMP-2 + ZA를 포함하는 디스크를 7 주령 Sprague Dawley 래트에 이식하였다. 복근을 단 한번 무디게 절개하여 이식편을 복근에 삽입하였다. 하나의 군에서, 다섯 마리의 동물이 동물당 복부 정중선의 왼쪽에 Cerament™BVF만을 함유하는 두 개의 디스크를 이식받은 반면, 정중선의 오른쪽은 동물당 Cerament™BVF + rhBMP-2을 함유하는 두 개의 디스크를 이식하는데 사용되었다. 두 번째 군에서, 다섯 마리의 동물이 Cerament™BVF를 함유하는 두 개의 디스크 및 Cerament™BVF + BMP-2 + ZA를 함유하는 두 개의 디스크를 유사한 방식으로 이식받았다. 시간이 지남에 따라 디스크에서 나타나는 지지체를 4 주 동안 동물에 방치하였다. 골 형성에 대한 분석은 X-선을 사용하여 수행되었으며 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(마이크로-CT)을 사용하여 광화된 조직 부피의 3차원 분석을 이어졌다. 지지체 내의 세포 유형은 조직학(H&E)을 사용하여 분석하였다.
생체내 통계 분석은 스튜던트 t-검정을 사용하여 수행하였고 n = 5(평균 및 SD)이었다. P 값 < 0.05가 유의한 것으로 간주되었다.
도 10에서 알 수 있듯이, 4 주 후에 동물을 방사선 투과 검사한 결과, rhBMP-2 및 ZA가 로딩된 Cerament™BVF 디스크의 지지체가 rhBMP-2만 로딩된 Cerament™BVF 디스크의 지지체보다 조밀한 것으로 나타났다. rhBMP-2가 로딩된 Cerament™BVF 디스크의 지지체는 Ceramentf™BVF 디스크의 지지체보다 조밀하다. 마이크로-CT 결과는 Cerament™BVF 디스크만의 군(p< 0.01)과 비교할 때 rhBMP-2와 ZA의 조합이 로딩된 Cerament™BVF 디스크 군 및 rhBMP-2가 로딩된 군에서 광화된 조직 부피가 유의하게 더 높았음을 보여준다(도 11 내지 도 13). rhBMP-2와 ZA의 조합이 로딩된 군은 Cerament™BVF + BMP-2 군(p <0.01)보다 유의하게 높은 무기질 용량을 보였다. 조직학적으로, rhBMP-2 + ZA가 로딩된 샘플은 지지체 내에서 이미 볼 수 있는 가로지르는 지주골의 섬을 갖는 지지체 주위에서 피질 쉘(cortical shell)로 진행된 반면, Cerament™BVF + rhBMP-2 군은 가시적인 지방 골수와 함께 파골세포 재흡수의 징후를 보였다(도 11).
본 발명의 특정 실시형태
1. 이상성 세라믹 골 대체물(biphasic ceramic bone substitute)로서,
a) 황산칼슘 상(calcium sulphate phase);
b) 인산칼슘 상(calcium phosphate phase);
c) 적어도 하나의 골 활성 단백질(bone active protein), 및
d) 적어도 하나의 항-이화 작용제(anti-catabolic agent)를 포함하는 이상성 세라믹 골 대체물.
2. 제 1 실시형태에 있어서,
황산칼슘은 황산칼슘 이수화물인 것을 특징으로 하는 이상성 세라믹 골 대체물.
3. 제 1 실시형태 또는 제 2 실시형태에 있어서,
인산칼슘은 α-제3인산칼슘(α-tricalcium phosphate), 수산화인회석(hydroxyapatite), 제4인산칼슘(tetracalcium phosphate) 및 β-제3인산칼슘(β-tricalcium phosphate)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이상성 세라믹 골 대체물.
4. 제 3 실시형태에 있어서,
인산칼슘 상은 수산화인회석, 바람직하게는 결정질 수산화인회석 입자로 구성되는 것을 특징으로 하는 이상성 세라믹 골 대체물.
5. 제 1 실시형태 내지 제 4 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서,
골 활성 단백질은 골 형성 단백질(bone morphogenic protein, BMP), 인슐린 유사 성장 인자(insulin-like growth factor, IGF), 형질전환 성장 인자-β(transforming growth factor-β, TGFβ), 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH), 스클레로스틴(sclerostine), 세포 공장 유래 골 활성 단백질 및 세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 단백질에서 선택되거나 스트론튬(strontium)인 것을 특징으로 하는 이상성 세라믹 골 대체물.
6. 제 5 실시형태에 있어서,
골 활성 단백질은 골 형성 단백질(bone morphogenic protein, BMP)인 것을 특징으로 하는 이상성 세라믹 골 대체물.
7. 제 6 실시형태에 있어서,
골 성장 단백질은 BMP-2, 바람직하게는 rhBMP-2, 및/또는 BMP-7, 바람직하게는 rhBMP-7인 것을 특징으로 하는 이상성 세라믹 골 대체물.
8. 제 1 실시형태 내지 제 7 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서,
항-이화 작용제는 골 재흡수를 억제하는 제제인 것을 특징으로 하는 이상성 세라믹 골 대체물.
9. 제 8 실시형태에 있어서,
항-이화 작용제는 비스포스포네이트(bisphosphonate), 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(selective estrogen receptor modulator, SERM), 데노수맙(denosumab) 또는 스타틴(statin)인 것을 특징으로 하는 이상성 세라믹 골 대체물.
10. 제 9 실시형태에 있어서,
항-이화 작용제는 에티드로네이트(etidronate), 클로드로네이트(clodronate) 및 틸루드로네이트(tiludronate)로 이루어진 군 또는 파미드로네이트(pamidronate), 네리드로네이트(neridronate), 올파드로네이트(olpadronate), 알렌드로네이트(alendronate), 이반드로네이트(ibandronate), 리세드로네이트(risedronate) 및 졸레드로네이트(zoledronate)로 이루어진 군에서 선택되는 비스포스포네이트인 것을 특징으로 하는 이상성 세라믹 골 대체물.
11. 제 10 실시형태에 있어서,
비스포스포네이트는 졸레드로네이트(졸레드론산(zoledronic acid))인 것을 특징으로 하는 이상성 세라믹 골 대체물.
12. 제 1 실시형태 내지 제 11 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서,
항생제(항진균제 포함), 골 치유 촉진제, 화학요법제, 정균제, 비타민, 호르몬, 골수 흡인액, 혈소판 풍부 혈장 및 탈회 골에서 선택되는 하나 이상의 추가 생리 활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 이상성 세라믹 골 대체물.
13. 제 12 실시형태에 있어서,
겐타마이신(gentamicin), 반코마이신(vancomycin), 토브라마이신(tobramycin), 세파졸린(cefazolin), 리팜피신(rifampicin), 클린다마이신(clindamycin)에서 선택되는 적어도 하나의 항생제를 포함하고, 항진균제는 나이스타틴(nystatin), 그리세오풀빈(griseofulvin), 암포테리신 B(amphotericin B), 케토코나졸(ketoconazole) 및 미코나졸(miconazole)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이상성 세라믹 골 대체물.
14. 제 1 실시형태 내지 제 13 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서,
수용성 비이온성 X-선 조영제 및/또는 생분해성 X-선 조영제에서 선택되는 X-선 조영제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 이상성 세라믹 골 대체물.
15. 제 14 실시형태에 있어서,
수용성 비이온성 X-선 조영제는 이오헥솔(iohexol), 이오딕사놀(iodixanol), 이오베르솔(ioversol), 이오파미돌(iopamidol), 이오트롤레인(iotrolane), 메트리자미드(metrizamid), 이오데시몰(iodecimol), 이오글루콜(ioglucol), 이오글루카미드(ioglucamide), 이오글루나이드(ioglunide), 이오글루아미드(iogluamide), 이오메프롤(iomeprol), 이오펜톨(iopentol), 이오프로미드(iopromide), 이오사르콜(iosarcol), 이오시미드(iosimide), 이오투살(iotusal), 이옥실레인(ioxilane), 이오프로탈(iofrotal) 및 이오데콜(iodecol)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이상성 세라믹 골 대체물.
16. 제 13 실시형태 내지 제 15 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서,
황산칼슘 대 인산칼슘 비율(w/w)은 5:95 내지 95: 5, 10:90 내지 90:10 20:80 내지 80:20, 30:70 내지 70:30 또는 40:60 내지 60:40인 것을 특징으로 하는 이상성 세라믹 골 대체물.
17. 경화성 세라믹 골 대체물 분말로서,
a. 황산칼슘 반수화물 분말;
b. 인산칼슘 분말로서, 인산칼슘은 α-제3인산칼슘, 수산화인회석, 제4인산칼슘 및 β-제3인산칼슘으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 인산칼슘 분말;
c. 선택적으로 골 활성 단백질;
d. 항-이화 작용제;
e. 선택적으로, 바람직하게는 황산칼슘 이수화물 및 염(예를 들어, NaCl)에서 선택되는 황산칼슘의 경화 촉진제; 및
f. 선택적으로 인산칼슘, 바람직하게는 미립자 인산칼슘 및/또는 인산염(예를 들어, Na2HPO4)의 경화 촉진제를 포함하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
18. 제 17 실시형태에 있어서,
인산칼슘은 수산화인회석 분말이고, 바람직하게는 비정질 및/또는 결정질 수산화인회석 입자로 구성되는 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
19. 제 17 실시형태 또는 제 18 실시형태에 있어서,
비정질 및/또는 결정질 인산칼슘(예를 들어, 수산화인회석) 입자는 200 μm 미만, 100 μm 미만, 50 μm 미만, 35 μm 미만, 또는 20 μm 미만의 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
20. 제 17 실시형태 내지 제 19 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서,
항-이화 작용제는 입자 중의 인산칼슘 분말과 미리 혼합(및 선택적으로 이에 결합)되는 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
21. 제 20 실시형태에 있어서,
인산칼슘 분말은 결정질 수산화인회석 입자인 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
22. 제 17 실시형태 내지 제 21 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서,
항-이화 작용제는 골 재흡수를 억제하는 제제인 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
23. 제 22 실시형태에 있어서,
항-이화 작용제는 비스포스포네이트(bisphosphonate), 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(selective estrogen receptor modulator, SERM), 데노수맙(denosumab) 또는 스타틴(statin)인 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
24. 제 23 실시형태에 있어서,
항-이화 작용제는 에티드로네이트(etidronate), 클로드로네이트(clodronate) 및 틸루드로네이트(tiludronate)로 이루어진 군 또는 파미드로네이트(pamidronate), 네리드로네이트(neridronate), 올파드로네이트(olpadronate), 알렌드로네이트(alendronate), 이반드로네이트(ibandronate), 리세드로네이트(risedronate) 및 졸레드로네이트(zoledronate)로 이루어진 군에서 선택되는 비스포스포네이트인 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
25. 제 24 실시형태에 있어서,
비스포스포네이트는 졸레드로네이트(졸레드론산(zoledronic acid))인 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
26. 제 17 실시형태 내지 제 25 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서,
골 활성 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
27. 제 26 실시형태에 있어서,
골 활성 단백질은 골 형성 단백질(bone morphogenic protein, BMP), 인슐린 유사 성장 인자(insulin-like growth factor, IGF), 형질전환 성장 인자-β(transforming growth factor-β, TGFβ), 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH), 스클레로스틴(sclerostine), 세포 공장 유래 단백질 및 세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 단백질에서 선택되는 골 성장 단백질이거나 스트론튬(strontium)인 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
28. 제 27 실시형태에 있어서,
골 활성 단백질은 BMP-2, BMP-7, rhBMP-2 및 rhBMP-7에서 선택되는 골 형성 단백질(bone morphogenic protein, BMP)인 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
29. 제 26 실시형태 내지 제 28 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서,
골 활성 단백질은 황산칼슘 반수화물 분말과 미리 혼합되는 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
30. 제 17 실시형태 내지 제 29 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서,
항생제(항진균제 포함), 골 치유 촉진제, 화학요법제, 정균제, 비타민, 호르몬, 골수 흡인액, 혈소판 풍부 혈장 및 탈회 골에서 선택되는 생리 활성제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
31. 제 30 실시형태에 있어서,
겐타마이신(gentamicin), 반코마이신(vancomycin), 토브라마이신(tobramycin), 세파졸린(cefazolin), 리팜피신(rifampicin), 클린다마이신(clindamycin)에서 선택되는 적어도 하나의 항생제를 포함하고, 항진균제는 나이스타틴(nystatin), 그리세오풀빈(griseofulvin), 암포테리신 B(amphotericin B), 케토코나졸(ketoconazole) 및 미코나졸(miconazole)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
32. 제 17 실시형태 내지 제 31 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서,
수용성 비이온성 X-선 조영제 및/또는 생분해성 X-선 조영제에서 선택되는 X-선 조영제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
33. 제 32 실시형태에 있어서,
수용성 비이온성 X-선 조영제는 이오헥솔(iohexol), 이오딕사놀(iodixanol), 이오베르솔(ioversol), 이오파미돌(iopamidol), 이오트롤레인(iotrolane), 메트리자미드(metrizamid), 이오데시몰(iodecimol), 이오글루콜(ioglucol), 이오글루카미드(ioglucamide), 이오글루나이드(ioglunide), 이오글루아미드(iogluamide), 이오메프롤(iomeprol), 이오펜톨(iopentol), 이오프로미드(iopromide), 이오사르콜(iosarcol), 이오시미드(iosimide), 이오투살(iotusal), 이옥실레인(ioxilane), 이오프로탈(iofrotal) 및 이오데콜(iodecol)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
34. 제 17 실시형태 내지 제 33 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서,
황산칼슘 대 인산칼슘 비율(w/w)은 5:95 내지 95: 5, 10:90 내지 90:10 20:80 내지 80:20, 30:70 내지 70:30 또는 40:60 내지 60:40인 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
35. 제 16 실시형태 내지 제 34 실시형태 중 어느 한 실시형태에 따른 경화성 세라믹 골 대체물 분말 및 수성 액체를 포함하는 경화성 세라믹 골 대체물 페이스트.
36. 제 35 실시형태에 있어서,
페이스트는 주입 가능한 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 페이스트.
37. 제 35 실시형태 또는 제 36 실시형태에 있어서,
손실된 골 조직을 생성함으로써 인간 또는 비인간 대상에서 지지 조직의 장애를 치료하는데 사용하기 위한 경화성 세라믹 골 대체물 페이스트.
38. 제 35 실시형태 내지 제 37 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서,
황산칼슘 대 인산칼슘 비율(w/w)은 5:95 내지 95: 5, 10:90 내지 90:10 20:80 내지 80:20, 30:70 내지 70:30 또는 40:60 내지 60:40인 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 페이스트.
39. 제 35 실시형태 내지 제 38 실시형태 중 어느 한 실시형태에 따른 경화성 세라믹 골 대체물 페이스트 또는 제 1 실시형태 내지 제 16 실시형태 중 어느 한 실시형태에 따른 이상성 세라믹 골 대체물을 제조하기 위한 키트로서,
i) 황산칼슘 반수화물 분말;
ii) 제 3 실시형태 또는 제 4 실시형태에 정의된 인산칼슘 분말;
iii) 제 5 실시형태 내지 제 7 실시형태 중 어느 한 실시형태에 정의된 골 활성 단백질;
iv) 제 9 실시형태 내지 제 11 실시형태 중 어느 한 실시형태에 정의된 골 재흡수를 억제하는 항-이화 작용제;
v) 선택적으로 제 12 실시형태 또는 제 13 실시형태에 정의된 적어도 하나의 추가 생리 활성제;
vi) 선택적으로 제 14 실시형태 또는 제 15 실시형태에 정의된 X-선 조영제;
vii) 선택적으로 황산칼슘, 바람직하게는 황산칼슘 이수화물 또는 NaCl과 같은 염의 경화 촉진제;
viii) 선택적으로 인산칼슘, 바람직하게는 미립자 인산칼슘 및/또는 인산칼슘염(예를 들어, Na2HPO4)의 경화 촉진제; 및
ix) 선택적으로 물과 같은 수성 액체를 포함하는 키트.
40. 제 39 실시형태에 있어서,
황산칼슘 반수화물 분말(i)은 인산칼슘 분말(ii)과 미리 혼합되어 기본 분말(x)을 형성하는 것을 특징으로 하는 키트.
41. 제 40 실시형태에 있어서,
항-이화 작용제(iv)는 인산칼슘 분말(ii)의 적어도 일부, 황산칼슘 반수화물 분말(i)의 적어도 일부, 기본 분말(x), 하나 이상의 활성 첨가제(iii 및 v 내지 viii), 또는 수성 액체(ix)와 미리 혼합되는 것을 특징으로 하는 키트.
42. 제 39 실시형태 내지 제 41 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서,
골 활성 단백질(iii)은 황산칼슘 반수화물 분말(i)의 적어도 일부, 인산칼슘 분말(ii)의 적어도 일부, 기분 분말(x), 하나 이상의 활성 첨가제(iv 내지 viii),
또는 수성 액체 (ix)와 미리 혼합되는 것을 특징으로 하는 키트.
43. 제 39 실시형태 내지 제 42 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서,
적어도 하나의 추가 생리 활성제(v)는 인산칼슘 분말(ii), 황산칼슘 반수화물 분말(i), 기본 분말(x), 하나 이상의 활성 첨가제(iv 및 vi 내지 viii), 또는 수성 액체(ix)와 미리 혼합되는 것을 특징으로 하는 키트.
44. 제 39 실시형태 내지 제 43 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서,
X-선 조영제(vi)는 인산칼슘 분말(ii), 황산칼슘 반수화물 분말(i), 기본 분말(x), 하나 이상의 활성 첨가제(iv, v, vii 및 viii), 또는 수성 액체(ix)와 미리 혼합되는 것을 특징으로 하는 키트.
45. 제 39 실시형태 내지 제 44 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서,
황산칼슘의 경화 촉진제(vi)는 황산칼슘 반수화물 분말(i), 기본 분말(x), 하나 이상의 활성 첨가제(iv 내지 vi 및 viii), 또는 수성 액체(ix)와 미리 혼합
것을 특징으로 하는 키트.
46. 제 39 실시형태 내지 제 45 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서,
인산칼슘의 경화 촉진제(viii)는 인산칼슘 분말(ii), 황산칼슘 반수화물 분말(i), 기본 분말(x), 하나 이상의 활성 첨가제(iv 내지 vii), 또는 수성 액체(ix)와 미리 혼합되는 것을 특징으로 하는 키트.
47. 제 39 실시형태 내지 제 46 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서,
a) 혼합 및/또는 주입 장치, 및/또는
b) 사용 설명서를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
48. 제 39 실시형태 내지 제 47 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서,
생분해성 합성 막(biodegradable synthetic membrane) 또는 콜라겐 막(collagen membrane)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
49. 제 39 실시형태 내지 제 48 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서,
손실된 골 조직을 생성함으로써 인간 또는 비인간 대상에서 지지 조직의 장애를 치료하는데 사용하기 위한 키트.
50. 제 1 실시형태 내지 제 16 실시형태 중 어느 한 실시형태에 따른 이상성 세라믹 골 대체물, 제 17 실시형태 내지 제 34 실시형태 중 어느 한 실시형태에 따른 이상성 세라믹 골 대체물 분말, 제 35 실시형태 내지 제 38 실시형태 중 어느 한 실시형태에 따른 이상성 세라믹 골 대체물 페이스트 및 제 39 실시형태 내지 제 49 실시형태 중 어느 한 실시형태에 따른 키트에 있어서, 하나 이상의 첨가제는 개별적으로 캡슐화되거나 수용성 및/또는 생분해성 합성 고분자 마이크로캡슐, 소 콜라겐 입자, 전분 입자, 이수화물 입자 등의 임의의 조합으로 캡슐화되어 제공되는 것을 특징으로 하는 이상성 세라믹 골 대체물, 이상성 세라믹 골 대체물 분말, 이상성 세라믹 골 대체물 페이스트 및 키트.
51. 외상, 감염의 제거, 종양 병변의 절제, 지연 또는 불유합 및 전치환술(primary arthroplasty) 또는 재치환술(revision arthroplasty)로 인한 골 손실과 같은 골 결손 환자를 치료하는 방법으로서, 제 1 실시형태 내지 제 16 실시형태 중 어느 한 실시형태에 따른 하나 이상의 이상성 세라믹 골 대체물(이식편) 또는 제 35 실시형태 내지 제 38 실시형태 중 어느 한 실시형태에 따른 경화성 이상성 세라믹 골 대체물 페이스트를 뼈가 제거된 곳에 삽입하는 단계를 포함하는 방법.
52. 제 51 실시형태에 있어서,
뼈는 척수, 손, 손가락, 팔, 발, 발가락, 종아리 또는 허벅지, 무릎, 엉덩이, 발목, 팔꿈치, 손목, 어깨, 두개골, 턱 및 이빨의 뼈를 포함하는 동물 또는 인간의 인체의 뼈에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
53. 제 51 실시형태 또는 제 52 실시형태에 있어서,
이상성 세라믹 골 대체물(예를 들어, 페이스트)을 삽입하는 단계는, 예를 들어 부러진 뼈, 골 종양, 또는 감염된 골 조직의 제거 이후 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
54. 제 51 실시형태 내지 제 53 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서,
이상성 세라믹 골 대체물 또는 페이스트(체내 경화됨)를 삽입하는 단계는 근육 및/또는 피부 조직의 재배치 또는 이식 이후 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
55. 제 51 실시형태 내지 제 54 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서,
이상성 세라믹 골 대체물(예를 들어, 페이스트)을 삽입하는 단계는 인공의 다공성 또는 반-다공성 고분자 막을 사용하여 개방된 상처에서 인접한 조직 및/또는 신체 외부의 주변으로 제한되는 것을 특징으로 하는 방법.
SEQUENCE LISTING <110> BONE SUPPORT AB <120> Biphasic Ceramic Bone Substitute <130> P1920PC00 <140> PCT/EP2016/056034 <141> 2016-03-18 <150> EP15160388 <151> 2015-03-23 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(5) <223> tedt <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> RUNX2 forward <400> 1 tttagggcgc attcctcatc 20 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(25) <223> RUNX2 revers <400> 2 tgtccttgtg gattaaaagg acttg 25 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> BSP forward <400> 3 caccccaagc acagactttt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> BSP revers <400> 4 gttccttctg cacctgcttc 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(22) <223> COLI forward <400> 5 gaggcataaa gggtcatcgt gg 22 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(21) <223> COLI revers <400> 6 cattaggcgc aggaaggtca g 21 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(18) <223> OCN forward <400> 7 gaacagactc cggcgcta 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(18) <223> OCN revers <400> 8 agggaggatc aagtcccg 18 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(22) <223> GAPDH forward <400> 9 tccactcacg gcaaattcaa cg 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(22) <223> GAPDH revers <400> 10 tagactccac gacatactca gc 22

Claims (39)

  1. 이상성 세라믹 골 대체물(biphasic ceramic bone substitute)로서,
    a. 황산칼슘 상(calcium sulphate phase);
    b. 인산칼슘 상(calcium phosphate phase);
    c. 적어도 하나의 골 활성 단백질(bone active protein), 및
    d. 적어도 하나의 항-이화 작용제(anti-catabolic agent)를 포함하는 이상성 세라믹 골 대체물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    황산칼슘은 황산칼슘 이수화물인 것을 특징으로 하는 이상성 세라믹 골 대체물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    인산칼슘은 α-제3인산칼슘(α-tricalcium phosphate), 수산화인회석(hydroxyapatite), 제4인산칼슘(tetracalcium phosphate) 및 β-제3인산칼슘(β-tricalcium phosphate)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이상성 세라믹 골 대체물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    인산칼슘 상은 수산화인회석, 바람직하게는 결정질 수산화인회석 입자로 구성되는 것을 특징으로 하는 이상성 세라믹 골 대체물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    골 활성 단백질은 골 형성 단백질(bone morphogenic protein, BMP), 인슐린 유사 성장 인자(insulin-like growth factor, IGF), 형질전환 성장 인자-β(transforming growth factor-β, TGFβ), 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH), 스클레로스틴(sclerostine), 세포 공장 유래 골 활성 단백질 및 세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 단백질에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이상성 세라믹 골 대체물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    골 활성 단백질은 BMP-2, 바람직하게는 rhBMP-2, 및/또는 BMP-7, 바람직하게는 rhBMP-7과 같은 골 형성 단백질(BMP)인 것을 특징으로 하는 이상성 세라믹 골 대체물.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항-이화 작용제는 골 재흡수를 억제하는 제제인 것을 특징으로 하는 이상성 세라믹 골 대체물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    항-이화 작용제는 비스포스포닉산(bisphosphonic acid), 비스포스포네이트(bisphosphonate), 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(selective estrogen receptor modulator, SERM), 데노수맙(denosumab) 또는 스타틴(statin)인 것을 특징으로 하는 이상성 세라믹 골 대체물.
  9. 제 8 항에 있어서,
    항-이화 작용제는 에티드로네이트(etidronate), 클로드로네이트(clodronate) 및 틸루드로네이트(tiludronate)로 이루어진 군 또는 파미드로네이트(pamidronate), 네리드로네이트(neridronate), 올파드로네이트(olpadronate), 알렌드로네이트(alendronate), 이반드로네이트(ibandronate), 리세드로네이트(risedronate) 및 졸레드로네이트(zoledronate)로 이루어진 군에서 선택되는 비스포스포네이트인 것을 특징으로 하는 이상성 세라믹 골 대체물.
  10. 제 1 항 내지 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항생제, 골 치유 촉진제, 화학요법제, 정균제, 비타민, 호르몬, 골수 흡인액, 혈소판 풍부 혈장 및 탈회 골에서 선택되는 하나 이상의 추가 생리 활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 이상성 세라믹 골 대체물.
  11. 제 10 항에 있어서,
    겐타마이신(gentamicin), 반코마이신(vancomycin), 토브라마이신(tobramycin), 세파졸린(cefazolin), 리팜피신(rifampicin), 클린다마이신(clindamycin)에서 선택되는 적어도 하나의 항생제를 포함하고, 항진균제는 나이스타틴(nystatin), 그리세오풀빈(griseofulvin), 암포테리신 B(amphotericin B), 케토코나졸(ketoconazole) 및 미코나졸(miconazole)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이상성 세라믹 골 대체물.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    수용성 비이온성 X-선 조영제 및/또는 생분해성 X-선 조영제에서 선택되는 X-선 조영제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 이상성 세라믹 골 대체물.
  13. 제 12 항에 있어서,
    수용성 비이온성 X-선 조영제는 이오헥솔(iohexol), 이오딕사놀(iodixanol), 이오베르솔(ioversol), 이오파미돌(iopamidol), 이오트롤레인(iotrolane), 메트리자미드(metrizamid), 이오데시몰(iodecimol), 이오글루콜(ioglucol), 이오글루카미드(ioglucamide), 이오글루나이드(ioglunide), 이오글루아미드(iogluamide), 이오메프롤(iomeprol), 이오펜톨(iopentol), 이오프로미드(iopromide), 이오사르콜(iosarcol), 이오시미드(iosimide), 이오투살(iotusal), 이옥실레인(ioxilane), 이오프로탈(iofrotal) 및 이오데콜(iodecol)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이상성 세라믹 골 대체물.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    황산칼슘 대 인산칼슘 비율(w/w)은 5:95 내지 95: 5, 10:90 내지 90:10 20:80 내지 80:20, 30:70 내지 70:30 또는 40:60 내지 60:40인 것을 특징으로 하는 이상성 세라믹 골 대체물.
  15. 경화성 세라믹 골 대체물 분말로서,
    a. 황산칼슘 반수화물 분말;
    b. 인산칼슘 분말로서, 인산칼슘은 α-제3인산칼슘, 수산화인회석, 제4인산칼슘 및 β-제3인산칼슘으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 인산칼슘 분말;
    c. 골 활성 제제;
    d. 항-이화 작용제;
    e. 선택적으로, 바람직하게는 황산칼슘 이수화물 및/또는 NaCl과 같은 무기 염에서 선택되는 수용액 중의 황산칼슘의 경화 촉진제; 및
    f. 선택적으로 수용액 중의 인산칼슘, 바람직하게는 미립자 인산칼슘 및/또는 Na2HPO4와 같은 인산염의 경화 촉진제를 포함하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
  16. 제 15 항에 있어서,
    인산칼슘은 수산화인회석 분말이고, 바람직하게는 비정질 및/또는 결정질 수산화인회석 입자로 구성되는 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
  17. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,
    비정질 및/또는 결정질 인산칼슘(예를 들어, 수산화인회석) 입자는 200 μm 미만, 100 μm 미만, 50 μm 미만, 35 μm 미만, 또는 20 μm 미만의 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
  18. 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항-이화 작용제는 입자 중의 인산칼슘 분말과 미리 혼합되고 이에 결합되는 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
  19. 제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인산칼슘 분말은 결정질 수산화인회석 입자인 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
  20. 제 15 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항-이화 작용제는 골 재흡수를 억제하는 제제이고 비스포스포닉산(bisphosphonic acid), 비스포스포네이트(bisphosphonate), 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(selective estrogen receptor modulator, SERM), 데노수맙(denosumab) 또는 스타틴(statin)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
  21. 제 20 항에 있어서,
    항-이화 작용제는 에티드로네이트(etidronate), 클로드로네이트(clodronate) 및 틸루드로네이트(tiludronate)로 이루어진 군 또는 파미드로네이트(pamidronate), 네리드로네이트(neridronate), 올파드로네이트(olpadronate), 알렌드로네이트(alendronate), 이반드로네이트(ibandronate), 리세드로네이트(risedronate) 및 졸레드로네이트(zoledronate)로 이루어진 군에서 선택되는 비스포스포네이트인 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
  22. 제 15 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항 항에 있어서,
    골 활성 제제는 골 형성 단백질(bone morphogenic protein, BMP), 인슐린 유사 성장 인자(insulin-like growth factor, IGF), 형질전환 성장 인자-β(transforming growth factor-β, TGFβ), 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH), 스클레로스틴(sclerostine), 세포 공장 유래 단백질 및 세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 단백질에서 선택되는 골 활성 단백질인 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
  23. 제 22 항에 있어서,
    골 활성 단백질은 BMP-2, BMP-7, rhBMP-2 및 rhBMP-7에서 선택되는 골 형성 단백질(bone morphogenic protein, BMP)인 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
  24. 제 15 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항생제, 골 치유 촉진제, 화학요법제, 정균제, 비타민, 호르몬, 골수 흡인액, 혈소판 풍부 혈장 및 탈회 골에서 선택되는 생리 활성제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
  25. 제 24 항에 있어서,
    겐타마이신(gentamicin), 반코마이신(vancomycin), 토브라마이신(tobramycin), 세파졸린(cefazolin), 리팜피신(rifampicin), 클린다마이신(clindamycin)에서 선택되는 적어도 하나의 항생제를 포함하고, 항진균제는 나이스타틴(nystatin), 그리세오풀빈(griseofulvin), 암포테리신 B(amphotericin B), 케토코나졸(ketoconazole) 및 미코나졸(miconazole)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
  26. 제 15 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    수용성 비이온성 X-선 조영제 및/또는 생분해성 X-선 조영제에서 선택되는 X-선 조영제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
  27. 제 26 항에 있어서,
    수용성 비이온성 X-선 조영제는 이오헥솔(iohexol), 이오딕사놀(iodixanol), 이오베르솔(ioversol), 이오파미돌(iopamidol), 이오트롤레인(iotrolane), 메트리자미드(metrizamid), 이오데시몰(iodecimol), 이오글루콜(ioglucol), 이오글루카미드(ioglucamide), 이오글루나이드(ioglunide), 이오글루아미드(iogluamide), 이오메프롤(iomeprol), 이오펜톨(iopentol), 이오프로미드(iopromide), 이오사르콜(iosarcol), 이오시미드(iosimide), 이오투살(iotusal), 이옥실레인(ioxilane), 이오프로탈(iofrotal) 및 이오데콜(iodecol)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
  28. 제 15 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    황산칼슘 대 인산칼슘 비율(w/w)은 5:95 내지 95: 5, 10:90 내지 90:10 20:80 내지 80:20, 30:70 내지 70:30 또는 40:60 내지 60:40인 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 분말.
  29. 제 15 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 따른 경화성 세라믹 골 대체물 분말 및 수성 액체를 포함하는 경화성 세라믹 골 대체물 페이스트.
  30. 제 29 항에 있어서,
    페이스트는 주입 가능한 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 페이스트.
  31. 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서,
    황산칼슘 대 인산칼슘 비율(w/w)은 5:95 내지 95: 5, 10:90 내지 90:10 20:80 내지 80:20, 30:70 내지 70:30 또는 40:60 내지 60:40이고, 액체 대 건조 분말의 비율은 0.2 내지 0.8, 바람직하게는 0.3 내지 0.6인 것을 특징으로 하는 경화성 세라믹 골 대체물 페이스트.
  32. 제 29 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 따른 경화성 세라믹 골 대체물 페이스트 또는 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 이상성 세라믹 골 대체물을 제조하기 위한 키트로서,
    i) 황산칼슘 반수화물 분말;
    ii) 제 3 항 또는 제 4 항에 정의된 인산칼슘 분말;
    iii) 제 5 항 또는 제 6 항에 정의된 골 활성 단백질;
    iv) 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 정의된 골 재흡수를 억제하는 항-이화 작용제;
    v) 선택적으로 제 10 항 또는 제 11 항에 정의된 적어도 하나의 추가 생리 활성제;
    vi) 선택적으로 제 12 항 또는 제 13 항에 정의된 X-선 조영제;
    vii) 선택적으로 황산칼슘, 바람직하게는 황산칼슘 이수화물 또는 NaCl과 같은 무기 염의 경화 촉진제;
    viii) 선택적으로 인산칼슘, 바람직하게는 미립자 인산칼슘 및/또는 Na2HPO4와 같은 인산칼슘염의 경화 촉진제; 및
    ix) 선택적으로 물과 같은 수성 액체를 포함하는 키트.
  33. 제 32 항에 있어서,
    성분들은 다양한 용기 내에 존재하는 것을 특징으로 하는 키트.
  34. 제 32 항에 있어서,
    둘 이상의 성분이 둘 이상의 용기 내에서 미리 혼합되는 것을 특징으로 하는 키트.
  35. 제 32 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 혼합 및/또는 주입 장치(들), 및/또는
    b) 사용 설명서를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  36. 제 32 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서,
    생분해성 합성 막(biodegradable synthetic membrane) 또는 콜라겐 막(collagen membrane)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  37. 제 32 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,
    손실된 골 조직을 생성함으로써 인간 또는 비인간 대상에서 지지 조직의 장애를 치료하는데 사용하기 위한 키트.
  38. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 이상성 세라믹 골 대체물, 제 15 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 따른 이상성 세라믹 골 대체물 분말, 제 29 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 따른 이상성 세라믹 골 대체물 페이스트 및 제 32 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 따른 키트에 있어서, 하나 이상의 첨가제는 개별적으로 캡슐화되거나 수용성 및/또는 생분해성 합성 고분자 마이크로캡슐, 소 콜라겐 입자, 전분 입자, 이수화물 입자 등의 임의의 조합으로 캡슐화되어 제공되는 것을 특징으로 하는 이상성 세라믹 골 대체물, 이상성 세라믹 골 대체물 분말, 이상성 세라믹 골 대체물 페이스트 및 키트.
  39. 외상, 감염의 제거, 종양 병변의 절제, 지연 또는 불유합 및 전치환술(primary arthroplasty) 또는 재치환술(revision arthroplasty)로 인한 골 손실과 같은 골 결손 환자를 치료하는 방법으로서, 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 이상성 세라믹 골 대체물(이식편) 또는 제 29 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 따른 경화성 이상성 세라믹 골 대체물 페이스트를 뼈가 제거된 곳에 삽입하는 단계를 포함하는 방법.
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