KR20170132935A

KR20170132935A - 가야보리수 추출물을 포함하는 항염증 또는 피부 미백용 조성물

Info

Publication number: KR20170132935A
Application number: KR1020160063409A
Authority: KR
Inventors: 양선아; 박세호; 김민주; 노태길; 이연대
Original assignee: 계명대학교 산학협력단
Priority date: 2016-05-24
Filing date: 2016-05-24
Publication date: 2017-12-05

Abstract

본 발명은 가야보리수 잎의 열수 추출물과 에탄올 추출물 또는 잎 추출물과 열매 추출물을 혼합한 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 개선용 건강기능식품, 피부 염증 예방 또는 개선용 화장료 조성물, 피부 미백용 화장료 조성물 또는 피부 미백용 건강기능식품에 관한 것으로, 가야보리수 잎의 열수 추출물과 에탄올 추출물 또는 잎 추출물과 열매 추출물을 혼합한 혼합 추출물은 뛰어난 항염증 효과와 멜라닌 생성 억제능을 보였고, 고농도에서도 세포 독성을 거의 보이지 않았다.

Description

가야보리수 추출물을 포함하는 항염증 또는 피부 미백용 조성물{Composition for anti-inflammation or skin whitening comprising extract of Pinkpap Borisu}

본 발명은 가야보리수 잎, 열매 또는 이들의 혼합 추출물을 포함하는 항염증 또는 피부 미백용 조성물에 대한 것이다.

국내 합천군 가야면에서 널리 분포하고 있는 핑크팝 보리수(Pinkpop borisu)는 보리수나무과(Elaeagnaceae) 보리수나무속(Elaeagnus)에 속하는 낙엽활엽 관목인 보리수나무(Elaeagnus umbellata Thunb., Autumn olive)이고, 가야보리수라고 불린다. 민간에서는 보리똥나무 또는 뻘똥으로도 알려져 있다.

이는 거제, 고성 등의 지역에서 재배되어 6∼7월 수확되는 뜰보리수(Elaeagnus multiflora Thunb.) 및 7∼8월에 화천, 춘천 등의 지역에서 재배되며 주황색 원형모양의 둥근 열매를 갖는 갈매보리수나무(일명 비타민나무, Hippophae rhamnoides L.)와는 달리 10∼11월에 열매가 포도송이처럼 열려 붉은색으로 익는다. 열매는 길이 1cm의 구형으로 다소 떫은맛과 단맛을 가지며, 잎은 어긋나고 타원형으로 윗부분은 짙은 녹색을 띈다. 보리수나무의 열매, 잎과 뿌리를 중국에서 우내자 또는 호퇴자라고 하며, 이질, 지혈, 지사제로 사용되고 있다. 한편 우리나라에서는 보리수나무의 열매를 한방에서는 목반하(木半夏)라고 하며 효능으로는 설사, 출혈, 소화불량 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 민간에서는 열매뿐만 아니라 잎, 뿌리 및 가지를 기침의 치료에 많이 사용하고 있다.

현재 합천군 일대에서 무농약 유기농으로 재배되고 있으며, 잎과 열매는 식용으로 허가되었으나 체계적인 연구가 전무한 상태이다.

1. 한국등록특허 10-0829831호.

따라서 본 발명은 가야보리수 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 가야보리수 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

또한, 본 발명은 가야보리수 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 염증 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

또한, 본 발명은 가야보리수 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

또한, 본 발명은 가야보리수 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 건강기능식품을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 가야보리수 잎을 물, C1 내지 C4 알콜 및 이들의 혼합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용매로 추출한 가야보리수 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 가야보리수 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 가야보리수 잎을 물, C1 내지 C4 알콜 및 이의 혼합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용매로 추출한 가야보리수 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 가야보리수 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

상기 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 가야보리수 잎을 물, C1 내지 C4 알콜 및 이의 혼합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용매로 추출한 가야보리수 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 염증 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 가야보리수 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 염증 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 가야보리수 잎을 물, C1 내지 C4 알콜 및 이의 혼합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용매로 추출한 가야보리수 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 가야보리수 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 가야보리수 잎을 물, C1 내지 C4 알콜 및 이의 혼합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용매로 추출한 가야보리수 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 건강기능식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 가야보리수 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 건강기능식품을 제공한다.

상기 혼합추출물은 가야보리수 잎 추출물 및 열매 추출물을 30 내지 70 부피%로 혼합하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 가야보리수 잎의 열수 추출물과 에탄올 추출물 또는 잎 추출물과 열매 추출물을 혼합한 혼합 추출물은 뛰어난 항염증 효과와 멜라닌 생성 억제능을 보였고, 고농도에서도 세포 독성을 거의 보이지 않았다. 따라서 본 발명의 가야보리수 잎의 열수 추출물과 에탄올 추출물 또는 잎 추출물과 열매 추출물을 혼합한 혼합 추출물은 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 개선용 건강기능식품, 피부 염증 예방 또는 개선용 화장료 조성물, 피부 미백용 화장료 조성물 또는 피부 미백용 건강기능식품으로 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 가야보리수 추출물을 대식세포에 처리한 후, 항염증 효과를 확인한 결과이고,
도 2는 본 발명에 따른 가야보리수 추출물을 대식세포에 처리한 후, 세포독성을 확인한 결과이고,
도 3은 본 발명에 따른 가야보리수 추출물을 멜라닌(melanin) 세포에 처리한 후, 멜라닌 생성 억제능을 확인한 결과이고,
도 4는 본 발명에 따른 가야보리수 추출물을 멜라닌 세포에 처리한 후, 세포독성을 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 가야보리수 잎을 물, C1 내지 C4 알콜 및 이들의 혼합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용매로 추출한 가야보리수 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 추출물은 물 또는 에탄올(ethanol, EtOH) 추출물인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

추출 방법은 상기 용매를 사용하여 냉침, 온침, 가열 등 통상의 추출방법으로 가능하며, 이때, 증류수 추출은 고온에서 열탕추출과정을 거치는 것이 바람직하며 알코올 및 에틸 아세테이트 추출은 상온에서 추출작업을 거치는 것이 바람직하고, 추출액을 진공회전증발기를 이용하여 감압농축하고 동결건조하여 분말상태의 식물 추출물을 제조할 수 있다.

더불어 본 발명은 가야보리수 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 혼합추출물은 가야보리수 잎 추출물 및 열매 추출물이 30 내지 70 부피%로 혼합되며, 보다 바람직하게는 3:7 또는 7:3의 부피%로 혼합되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 추출물은 가야보리수 잎 또는 열매를 물, C1 내지 C4 알콜 및 이들의 혼합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용매로 추출할 수 있으며, 물 또는 에탄올 추출물인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 염증성 질환은 부종, 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 간직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 급성 염증 질환 및 만성 염증 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 가야보리수 잎을 물, C1 내지 C4 알콜 및 이의 혼합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용매로 추출한 가야보리수 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

더불어 본 발명은 가야보리수 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 가야보리수 잎을 물, C1 내지 C4 알콜 및 이의 혼합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용매로 추출한 가야보리수 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 염증 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

더불어 본 발명은 가야보리수 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 염증 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 가야보리수 잎을 물, C1 내지 C4 알콜 및 이의 혼합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용매로 추출한 가야보리수 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

더불어 본 발명은 가야보리수 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 가야보리수 잎을 물, C1 내지 C4 알콜 및 이의 혼합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용매로 추출한 가야보리수 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 건강기능식품을 제공한다.

더불어 본 발명은 가야보리수 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다.

또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 유효성분인 가야보리수 추출물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중, 질환에 따라 달라질 수 있으나, 0.001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 10 mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.　

또한, 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.　따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 기관지내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

더불어 본 발명에 따른 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강기능식품은 유효성분인 가야보리수 추출물에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강기능식품에 포함된 가야보리수 추출물은 상기 약학 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 유효성분인 가야보리수 추출물 외에 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 썬 크림, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

상기 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

상기 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

상기 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해 화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

상기 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 가야보리수 추출물 제조

경남 합천 지역에서 얻은 건조 상태의 가야보리수 잎 또는 열매를 분쇄기로 분쇄하고 70% 에탄올(Duksan, Ansan, Korea)로 3회 반복 추출하여 추출하였다. 추출한 시료는 여과지(Advantec, No. 5A, Tokyo, Japan)로 여과한 후 감압농축기를 이용하여 농축하였다.

이를 통해 가야보리수 잎 EtOH; 24.92g, 가야보리수 열매 EtOH; 213.78g, 가야보리수 잎 열수; 9.58g, 가야보리수 열매 열수; 39.02g, 가야보리수 혼합 추출물(잎3:열매7 열수); 32.59g, 가야보리수 혼합추출물(잎7:열매3 열수); 26.79g을 각각 수득하였다. 이를 동결건조하여 실험에 사용하였다.

< 실시예 2> 항염증 효과 확인

염증을 유도한 대식세포에 상기 실시예 1에서 제조한 가야보리수 추출물을 처리한 후 산화질소(Nitric oxide, NO)의 생성을 분석하여 항염증 효과를 확인하였다.

대식 세포주인 RAW264.7 세포는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양받았으며, 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS, Gibco BRL, Rockville, MD, USA)과 항생제(antibiotics)인 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)을 1% 첨가한 RPMI 1640 배지(RPMI 1640, Welgene, Gyeongsan, Korea)를 이용하여 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 2 내지 3회 계대 배양한 후 사용하였다.

RAW264.7 세포를 96웰 플레이트에 1×10⁵ cells/well이 되게 분주하여 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 24시간 동안 예비 배양한 후 각 추출물을 농도별로 처리하고 24시간 배양하였다. 그 후 각 웰에 1 mg/mL 농도의 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS, Sigma-Aldrich, USA)를 10μL 처리하여 염증을 유도하였다.

그 후, 상등액 100 μL를 96웰 플레이트 옮겨 2.5% 인산(phosphoric acid), 1% 술파닐아미드(sulfanilamide), 0.1% N-(1-나프틸)에틸렌디아민(N-(1-Naphtyl)ethylenediamine)이 포함된 그리스 시약(griess reagent) 100 μL를 각 웰 넣어 반응시켰다. 그 후 540 nm 파장에서 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 리더기로 광학 밀도(optical density, OD)를 측정하였다. 측정한 OD는 LPS만 가한 세포의 OD 값과 비교하여 백분율(%)로 표시하였다. 양성 대조군(Positive control)은 LPS를 가하지 않은 RAW264.7 세포의 OD이며, 음성 대조군(negative control)은 NO 억제제(inhibitor)로 작용하는 Lω-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르(Lω-Nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME, Sigma-Aldrich, USA)를 가한 세포의 OD이다.

그 결과 도 1과 같이, 가야보리수 잎 추출물을 처리한 경우 농도의존적인 항염증 효과를 보이는 것을 확인하였다. 특히, 가야보리수 잎 추출물과 열매 추출물를 혼합한 경우, 잎 추출물의 함량이 증가함에 따라 항염증 효과가 증가함을 나타냈다. 이를 통해 가야보리수 잎의 성분이 LPS에 의한 염증 유발을 억제함을 유추할 수 있었다. 하지만, 가야보리수 열매 추출물에서의 항염증 효과는 고농도(1,000 μg/mL)에서도 약 32.13% NO 억제능을 보임으로써 가야보리수 잎에서의 효능과 비교 시 현저히 낮음을 확인할 수 있었다. 더불어 가야보리수 잎 에탄올 추출물과 가야보리수 잎 열수 추출물을 비교한 결과, 동일한 농도(1,000 μg/mL)에서의 항염증 반응이 열수 추출물(4.73 μM)보단 에탄올 추출물(2.76 μM)에서 뛰어남을 확인하였다. 대조군(LPS 처리하지 않음)에서의 NO 생성은 1.01 μM이었고, 대조군(LPS 처리함)에서는 25.37 μM이었으므로 대식 세포주인 RAW264.7 세포의 활성에는 문제가 없음을 확인하였다.

< 실시예 3> 대식세포주에서의 세포 독성 확인

대식세포주에 상기 실시예 1에서 제조한 가야보리수 추출물을 처리한 후 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 시약을 이용하여 세포사멸 유도 효과를 확인하였다.

RAW264.7 세포를 96웰 플레이트에 1×10⁵ cells/well이 되게 분주하여 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 24시간 동안 예비 배양한 후 각 추출물을 농도별로 처리하고 24시간 배양하였다. 그 후 각 웰에 인산완충식염수(phosphate buffer saline, PBS)에 녹인 MTT(5 mg/mL) 용액 10 μL를 넣고 배양기에서 4시간 동안 반응시켰다. 배양 종료 후 상등액을 제거하고, 각 웰에 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO) 100 μL를 첨가하였다. 생성된 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)을 용해시키고 550 nm 파장에서 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 리더기(SPECTRA max 340PC, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 흡광도를 측정하였다. 측정한 포르마잔의 생성 정도는 추출물을 처리하지 않은 세포의 값과 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.

그 결과 도 2와 같이, 본 발명에 따른 가야보리수 추출물 모두 고농도로 처리했어도 약 80.3% 이상의 세포 생존을 보임으로써 세포에 대한 세포 독성이 없음을 증명하였다. 따라서 본 발명의 가야보리수 추출물의 항염증 효과는 세포의 사멸에 의한 염증 감소가 아닌 추출물의 효능임을 확인하였다.

< 실시예 4> 미백 효과 확인

멜라닌(melanin) 세포주에 상기 실시예 1에서 제조한 가야보리수 추출물을 처리한 후 미백 효과를 확인하였다.

쥐 유래 멜라닌 세포주인 B16-F0 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, USA)으로부터 분양받았으며, 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS, ATCC, USA)과 항생제인 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)을 1% 첨가한 DMEM 배지(DMEM, ATCC, USA)를 이용하여 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 2 내지 3회 계대 배양한 후 사용하였다.

B16-F0 세포를 6웰 플레이트에 5×10⁵ cells/well이 되게 분주하여 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 24시간 동안 예비 배양한 후 각 추출물을 농도별로 처리하고 48 시간 배양하였다. 추출물 처리와 함께 멜라닌 생성을 촉진시키기 위하여 1 μM α-멜라닌 세포 자극 호르몬(α-Melanocyte stimulating hormone, Sigma-Aldrich, USA)과 100 μM 3-이소뷰틸-1-메틸산틴(3-Isobutyl-1-methylxanthine, Sigma-Aldrich, USA)를 혼합시킨 DMEM(Eagle's minimal essential medium) 배지를 사용하였다. 그 후 상등액을 제거하고 따듯한 PBS 용액을 각 웰당 1,000 μL씩 첨가한 후 10분간 37℃에서 배양하였다. 파이펫팅(Pipetting)으로 6웰 플레이트 바닥에 붙어 있는 B16-F0 세포를 떼어내고 1.5 mL 튜브에 분주한 후 4℃로 유지된 원심분리기를 이용하여 13,000 rpm, 10 분간 원심분리하였다. 원심분리 후, 상등액을 조심스럽게 제거하고 1.0 N 수산화나트륨(sodium hydroxide, NaOH)과 DMSO를 9 : 1의 부피%로 혼합한 용해 용액(lysis solution) 150 μL를 넣어 멜라닌을 녹였다. 건조기(Oven)에서 60℃ 조건 하에 1시간 반응시킨 후, 96웰 플레이트에 각 웰당 100 μL씩 분주하여 ELISA 리더기로 405 nm에서 OD를 측정하였다. 양성대조군으로는 가야보리수 추출물을 처리하지 않은 멜라닌 세포의 OD 값을 사용하였다. 또한, 음성 대조군으로는 티로시나아제(tyrosinase) 생성 억제를 통한 멜라닌 억제능을 가지는 250 uM 알부틴(arbutin, Sigma-Aldrich, USA)을 처리한 멜라닌 세포의 OD 값을 사용하였다.

그 결과 도 3과 같이, 가야보리수 잎 추출물에 대하여 농도의존적으로 멜라닌 생성 억제능이 증가함을 나타냈다. 특히 가야보리수 잎 추출물을 고농도(1,000 μg/mL)로 처리하였을 때 알부틴보다 더 뛰어난 멜라닌 생성 억제능을 보였다.

< 실시예 5> 멜라닌 세포주에서의 세포 독성 확인

가야보리수 추출물의 B16-F0 세포에 대한 세포 독성을 측정하기 위해 MTT 분석을 실시하였다.

B16-F0 cell을 6웰 플레이트에 5×10⁵ cells/well이 되게 분주하여 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 24시간 동안 예비 배양한 후 각 추출물을 농도별로 처리하고 48 시간 배양하였다.

그 후 PBS에 녹인 MTT (5 mg/mL) 용액 100 μL를 각 웰에 넣고 배양기에서 4시간 동안 반응시켰다. 그 후 상등액을 제거하고, 각 웰에 500 μL의 DMSO를 첨가하여 생성된 포르마잔 크리스탈을 용해시켜 550 nm 파장에서 ELISA 리더기로 흡광도를 측정하였다. 측정한 포르마잔의 생성 정도는 정상적인 세포의 값과 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.

그 결과 도 4와 같이, 멜라닌 세포에 대한 보리수나무 추출물의 세포 독성을 측정한 결과, 고농도의 보리수나무 추출물에서도 70~80% 이상의 생존율을 나타냈다. 즉, 멜라닌 세포의 사멸에 의한 멜라닌 생성 억제 효과가 아님을 확인할 수 있었다. 더불어 멜라닌세포 자극 호르몬(α-melanocyte stimulating hormone, α-MSH), IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine)에 대한 멜라닌 세포의 독성은 나타나지 않았다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

가야보리수 잎을 물, C1 내지 C4 알콜 및 이들의 혼합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용매로 추출한 가야보리수 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
가야보리수 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 혼합추출물은 가야보리수 잎 추출물 및 열매 추출물을 30 내지 70 부피%로 혼합하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 염증성 질환은 부종, 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 간직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 급성 염증 질환 및 만성 염증 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
가야보리수 잎을 물, C1 내지 C4 알콜 및 이의 혼합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용매로 추출한 가야보리수 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
가야보리수 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제 6항에 있어서,
상기 혼합추출물은 가야보리수 잎 추출물 및 열매 추출물을 30 내지 70 부피%로 혼합하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제 5항 또는 제 6항에 있어서,
상기 염증성 질환은 부종, 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 간직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 급성 염증 질환 및 만성 염증 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
가야보리수 잎을 물, C1 내지 C4 알콜 및 이의 혼합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용매로 추출한 가야보리수 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 염증 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
가야보리수 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 염증 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
제 10항에 있어서,
상기 혼합추출물은 가야보리수 잎 추출물 및 열매 추출물을 30 내지 70 부피%로 혼합하는 것을 특징으로 하는 피부 염증 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
가야보리수 잎을 물, C1 내지 C4 알콜 및 이의 혼합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용매로 추출한 가야보리수 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
가야보리수 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제 13항에 있어서,
상기 혼합추출물은 가야보리수 잎 추출물 및 열매 추출물을 30 내지 70 부피%로 혼합하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
가야보리수 잎을 물, C1 내지 C4 알콜 및 이의 혼합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용매로 추출한 가야보리수 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 건강기능식품.
가야보리수 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 건강기능식품.
제 16항에 있어서,
상기 혼합추출물은 가야보리수 잎 추출물 및 열매 추출물을 30 내지 70 부피%로 혼합하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 건강기능식품.