KR20170123693A - 그렐린 o-아실 트랜스퍼라제 억제제 - Google Patents

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KR20170123693A
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크리스토퍼 스탠리 갈카
에릭 제임스 헴브레
니콜라스 앨런 호니그슈미트
마리아 앵겔스 마르티네츠-그라우
게마 루아노 프라자
알무데나 루비오
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일라이 릴리 앤드 캄파니
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Abstract

본 발명은 신규 GOAT 억제제 및 그의 염 및 그의 제약 조성물을 제공한다.

Description

그렐린 O-아실 트랜스퍼라제 억제제
본 발명은 그렐린 O-아실 트랜스퍼라제 (GOAT)를 억제하는데 유용한 화합물, 제약 조성물 및 GOAT 활성과 관련된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
GOAT는 효소의 막-결합 O-아실 트랜스퍼라제 (MBOAT) 패밀리에 속한다. 이는 지방산을 데스아실그렐린 펩티드의 Ser3 잔기에 전달함으로써, 데스아실-그렐린 (비아실화 그렐린 또는 UAG로서 또한 공지됨)을 생물학상 활성 형태인 아실-그렐린 (AG)으로 전환시킨다. 아실-그렐린은 인간 및 설치류에서 음식물 섭취를 증가시키고 지방축적을 증가시키는 것으로 제시된 바 있다. 인간에서 AG의 주입은 또한 글루코스-유발 인슐린 분비를 억제하는 것으로 제시된 바 있다. 그렐린 유전자의 제거는 인슐린 방출을 증진시켜 고지방 식이가 제공된 ob/ob 마우스에서 글루코스 불내성을 예방 또는 호전시키는 것으로 제시된 바 있다.
소분자 GOAT 억제제는 문헌에 보고된 바 있다. WO 2013/125732를 참조한다.
그러나, 비만 및 당뇨병을 위한 현행 치료에 대한 가변적인 유효성 및 반응과 결부된 비만 및 당뇨병의 유병률은 더 많은 치료의 선택을 환자가 이용할 수 있을 것을 필요로 한다. 본 발명은 GOAT 억제제인 특정 신규 화합물을 제공한다. 이러한 신규 화합물은 비만의 강력한, 유효 치료에 대한 필요를 해결할 수 있다. 추가로 GOAT 억제제는 또한, 식이 및/또는 운동, 체중 증가를 감소시키거나 비만을 치료하도록 설계된 다른 치료 의약 작용제 또는 절차의 보조물로서 체중 증가 또는 체중의 재증가를 감소시키는데 유용할 수 있는 것으로 여겨진다. 유사하게, GOAT 억제제는 단독으로 또는 제2형 당뇨병에 대한 다른 치료와 조합하여, 제2형 당뇨병을 치료하는데 있어서 유용할 수 있다.
본 발명은 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.
Figure pct00001
여기서 R은 -OH로 임의로 치환된 -C1-C3 알킬; -OC1-C4 알킬; 피라졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴 또는 티아디아졸릴 (여기서 피라졸릴, 옥사졸릴 또는 티아졸릴 각각은 -CH3으로 1 내지 2회 임의로 치환될 수 있음); 피리디닐, 피리다지닐 또는 피라지닐 (여기서 각각은 -Cl로 임의로 치환될 수 있음); 및 -OCH3으로 임의로 치환된 페닐로부터 선택된다.
본 발명은 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염과 함께 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 추가 실시양태에서, 조성물은 1종 이상의 다른 치료제와 조합되어 사용된다.
본 발명의 추가 측면은 체중 증가 또는 체중의 재증가의 감소 또는 제2형 당뇨병 또는 비만의 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 체중 증가 또는 체중의 재증가를 감소시키거나 제2형 당뇨병 또는 비만을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 요법에 사용하기 위한, 특히 체중 증가 또는 체중의 재증가를 감소시키거나 제2형 당뇨병 또는 비만을 치료하기 위한, 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 심지어 추가로, 본 발명은 체중 증가 또는 체중의 재증가를 감소시키거나 제2형 당뇨병 또는 비만을 치료하는데 사용하기 위한, 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 게다가, 본 발명은 체중 증가 또는 체중의 재증가를 감소시키거나 제2형 당뇨병 또는 비만을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다.
본 발명은 추가로 허혈성 사건의 후유증의 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 허혈성 사건의 후유증을 치료하는 방법을 제공한다. 추가 실시양태에서, 허혈성 사건은 심근 허혈 또는 심장 허혈 또는 뇌 허혈이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 요법에 사용하기 위한, 특히 허혈성 사건의 후유증을 치료하기 위한 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 심지어 추가로, 본 발명은 허혈성 사건의 후유증을 치료하는데 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 게다가, 본 발명은 허혈성 사건의 후유증을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다. 추가 실시양태에서, 허혈성 사건은 심근 허혈 또는 심장 허혈 또는 뇌 허혈이다.
본 발명은 추가로 중독 장애의 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 중독 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 추가 실시양태에서, 중독 장애는 완료 행동, 예컨대 알콜, 흡연, 과식 또는 불법 약물의 사용을 수반한다.
본 발명은 중독 행동을 촉진하는 스트레스의 결과의 호전을 필요로 하는 환자에게 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 중독 행동을 촉진하는 스트레스의 결과를 호전시키는 방법을 제공한다. 추가 실시양태에서, 중독 행동은 완료 행동, 예컨대 알콜, 흡연, 과식 또는 불법 약물의 사용을 수반한다.
본 발명은 또한, 요법에 사용하기 위한, 특히 중독 장애를 치료하기 위한 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 심지어 추가로, 본 발명은 중독 장애를 치료하는데 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 게다가, 본 발명은 중독 장애를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다. 추가 실시양태에서, 중독 장애는 완료 행동, 예컨대 알콜, 흡연, 과식 또는 불법 약물의 사용을 수반한다.
본 발명은 또한, 요법에 사용하기 위한, 특히 중독 행동을 촉진하는 스트레스의 결과를 호전시키기 위한 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 추가 실시양태에서, 중독 장애는 완료 행동, 예컨대 알콜, 흡연, 과식 또는 불법 약물의 사용을 수반한다. 심지어 추가로, 본 발명은 중독 행동을 촉진하는 스트레스의 결과를 호전시키는데 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 게다가, 본 발명은 중독 행동을 촉진하는 스트레스의 결과를 호전시키기 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다. 추가 실시양태에서, 중동 행동은 완료 행동, 예컨대 알콜, 흡연, 과식 또는 불법 약물의 사용을 수반한다.
본 발명은 또한 본 발명의 화합물의 합성에 유용한 중간체 및 방법을 포괄한다.
본원에 사용된 용어 "치료하는" (또는 "치료하다" 또는 "치료")은 기존 증상, 상태, 또는 장애의 진행 또는 중증도를 저지, 둔화, 정지, 또는 역전시키는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "체중 증가를 감소시키는"은 환자의 체중에서의 증가를 감소시키는 것을 지칭한다. 용어 "체중의 재증가를 감소시키는"은 체중 감량 후 체중에서 리바운드를 경험하는 환자의 체중에서의 증가를 감소시키는 것을 지칭한다. 체중의 재증가는 식이요법, 운동, 행동 수정, 또는 승인된 요법을 통해 달성된 체중 감량의 중단 후에 리바운드 효과로 인한 것일 수 있다. 의심을 피하기 위해 본원에 사용된 바와 같은 체중 증가 또는 체중의 재증가는 식품 섭취 또는 식습관에 의해 유도된 체중 증가 또는 체중의 재증가를 지칭하고 비식품 관련 체중 증가, 예컨대 수분 보유, 근육량, 또는 염증으로 인한 체중, 유체의 축적을 지칭하지 않는다.
본원에 사용된 "허혈성 사건"은 기관 또는 신체 부분으로의 혈액의 불충분한 공급을 지칭한다. 혈류에서의 감소는 이환 기관 또는 신체 부분으로의 산소의 공급을 감소시킨다. 허혈성 사건은 또한 허혈로서 공지될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 허혈이 상이한 기관 또는 신체의 부분에 영향을 미칠 수 있으며, 예를 들어 심장에 대해, 예컨대 심근 허혈 또는 심장 허혈, 또는 뇌에 대해, 예컨대 뇌 허혈임을 인지할 것이다.
본원에 사용된 "중독 장애"는 개체가 부정적인 결과에도 불구하고 제어 불능을 나타내는 것인 과도한 부적응 행동을 나타낸다. 특히 본 발명과 관련하여서는 완료 행동 예컨대 알콜 섭취, 흡연, 과식 및 불법 약물의 사용을 수반하는 중독 장애이다. 본 발명은 이상 유인을 정상화하고, 중독 장애를 갖는 개체에서 이상조절된 신경 기질을 보상한다. 스트레스는 종종 병인 및 중독 장애의 유지에 있어서 촉발 작용제이고; 본 발명은 중독 행동을 촉진하는 스트레스의 결과를 호전시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 화합물은 반응하여 제약상 허용되는 염을 형성할 수 있다. 제약상 허용되는 염 및 그를 제조하기 위한 통상의 방법론은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [P. Stahl, et al. Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, 2nd Revised Edition (Wiley-VCH, 2011); S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, January 1977]을 참조한다.
통상의 기술자는, 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이 하기 I에서 *에 의해 나타내어지는 적어도 1개의 키랄 중심을 함유하는 코어로 구성됨을 인지할 것이다.
<화학식 I>
Figure pct00002
본 발명의 바람직한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 II에 의해 나타내어진다.
<화학식 II>
Figure pct00003
통상의 기술자는, 추가의 키랄 중심이 특정 가변기의 선택에 의해 본 발명의 화합물에서 생성될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 본 발명은 상기 화합물의 모든 개별 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체 뿐만 아니라 라세미체를 비롯한 거울상이성질체 및 부분입체이성질체의 혼합물을 고려한다.
통상의 기술자는, 또한 모든 키랄 중심에 대한 칸-인골드-프렐로그 (R) 또는 (S) 지정이 특정한 화합물의 치환 패턴에 따라 달라질 것임을 인지할 것이다. 단일 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체는 키랄 시약으로 시작하거나, 또는 입체선택적 또는 입체특이적 합성 기술에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 단일 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체는 본 발명의 화합물의 합성 중 임의의 편리한 시점에서 표준 키랄 크로마토그래피 또는 결정화 기술에 의해 혼합물로부터 단리될 수 있다. 본 발명의 화합물의 단일 거울상이성질체는 본 발명의 바람직한 실시양태이다.
본 발명의 화합물은 바람직하게는 다양한 경로, 예컨대 경구 투여에 의해 투여되는 제약 조성물로서 제제화된다. 이러한 제약 조성물 및 그의 제조 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro, et al., eds., 21st ed., Mack Publishing Co., 2005)]을 참조한다. 하기 화학식에 의해 나타내어지는 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물이 보다 특히 바람직하다.
Figure pct00004
여기서 R은 -OH로 임의로 치환된 -C1-C3 알킬; -OC1-C4 알킬; 피라졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴 또는 티아디아졸릴 (여기서 피라졸릴, 옥사졸릴 또는 티아졸릴 각각은 -CH3으로 1 내지 2회 임의로 치환될 수 있음); 피리디닐, 피리다지닐 또는 피라지닐 (여기서 각각은 -Cl로 임의로 치환될 수 있음); 및 -OCH3으로 임의로 치환된 페닐로부터 선택된다.
본 발명의 모든 예시된 화합물은 GOAT 억제제이지만, 특정 부류의 화합물이 바람직하다. 하기 단락은 이러한 바람직한 부류를 기재한다:
a) R은 -OH로 임의로 치환된 -C1-C3 알킬; -OC1-C4 알킬; 피라졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴 또는 티아디아졸릴 (여기서 피라졸릴, 옥사졸릴 또는 티아졸릴 각각은 -CH3으로 1 내지 2회 임의로 치환될 수 있음); 피리디닐, 피리다지닐 또는 피라지닐 (여기서 각각은 -Cl로 임의로 치환될 수 있음); 또는 -OCH3으로 임의로 치환된 페닐임;
b) R은 피라졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴 또는 티아디아졸릴 (여기서 피라졸릴, 옥사졸릴 또는 티아졸릴 각각은 -CH3으로 1 내지 2회 임의로 치환될 수 있음); 피리디닐 또는 피라지닐 (여기서 각각은 -Cl로 임의로 치환될 수 있음); 또는 -OCH3으로 임의로 치환된 페닐임;
c) R은 피라졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴 또는 티아디아졸릴 (여기서 피라졸릴, 옥사졸릴 또는 티아졸릴 각각은 -CH3으로 1 내지 2회 임의로 치환될 수 있음)임;
d) R은 피라졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴 또는 티아디아졸릴 (여기서 피라졸릴, 옥사졸릴 또는 티아졸릴 각각은 -CH3으로 1 내지 2회 임의로 치환될 수 있음)임;
e) R은 피리디닐, 피리다지닐 또는 피라지닐 (여기서 각각은 -Cl로 임의로 치환될 수 있음)임;
f) R은 -OCH3으로 임의로 치환된 페닐임;
g) R은 -OH로 임의로 치환된 -CH3이거나, -OCH3, 또는 -OC(CH3)3임;
h) R은 -OH로 임의로 치환된 -CH3임;
i) R은 -OCH3 또는 -OC(CH3)3임;
j) R은 피라졸릴임;
k) R은 -CH3으로 치환된 피라졸릴임;
l) 본 발명의 화합물은 유리 염기임;
m) -NC(O)R에 인접한 메틸 치환기는 본 발명의 화합물에서 S 배위임;
본 발명의 바람직한 실시양태는 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
Figure pct00005
여기서 R은 -OH로 임의로 치환된 -C1-C3 알킬; -OC1-C4 알킬; 피라졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴 또는 티아디아졸릴 (여기서 피라졸릴, 옥사졸릴 또는 티아졸릴 각각은 -CH3으로 1 내지 2회 임의로 치환될 수 있음); 피리디닐, 피리다지닐 또는 피라지닐 (여기서 각각은 -Cl로 임의로 치환될 수 있음); 및 -OCH3으로 임의로 치환된 페닐로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태는 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
Figure pct00006
여기서 R은 -OH로 임의로 치환된 -CH3; -OCH3 또는 -OC(CH3)3; 피라졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴 또는 티아디아졸릴 (여기서 피라졸릴, 옥사졸릴 또는 티아졸릴 각각은 -CH3으로 1 내지 2회 임의로 치환될 수 있음); 피리디닐, 피리다지닐 또는 피라지닐 (여기서 각각은 -Cl로 임의로 치환될 수 있음); 및 -OCH3으로 임의로 치환된 페닐로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태는 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
Figure pct00007
여기서 R은 피라졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴 또는 티아디아졸릴 (여기서 피라졸릴, 옥사졸릴 또는 티아졸릴 각각은 -CH3으로 1 내지 2회 임의로 치환될 수 있음); 피리디닐, 피리다지닐 또는 피라지닐 (여기서 각각은 -Cl로 임의로 치환될 수 있음); 및 -OCH3으로 임의로 치환된 페닐로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태는 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
Figure pct00008
여기서 R은 피라졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴 또는 티아디아졸릴 (여기서 피라졸릴, 옥사졸릴 또는 티아졸릴 각각은 -CH3으로 1 내지 2회 임의로 치환될 수 있음); 피리디닐 또는 피라지닐 (여기서 각각은 -Cl로 임의로 치환될 수 있음); 및 -OCH3으로 임의로 치환된 페닐로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태는 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
Figure pct00009
여기서 R은 피라졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴 및 티아디아졸릴 (여기서 피라졸릴, 옥사졸릴 또는 티아졸릴 각각은 -CH3으로 1 내지 2회 임의로 치환될 수 있음)로부터 선택된다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태는 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
Figure pct00010
여기서 R은 피리디닐, 피리다지닐, 및 피라지닐 (여기서 각각은 -Cl로 임의로 치환될 수 있음)로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태는 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
Figure pct00011
여기서 R은 -OCH3으로 임의로 치환된 페닐이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태는 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
Figure pct00012
여기서 R은 -OH로 임의로 치환된 -CH3, -OCH3 및 -OC(CH3)3으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태는 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
Figure pct00013
여기서 R은 -OH로 임의로 치환된 -CH3이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태는 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
Figure pct00014
여기서 R은 -OCH3 및 -OC(CH3)3으로부터 선택된다.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태는 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
Figure pct00015
본 발명의 또 다른 특히 바람직한 실시양태는 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
Figure pct00016
본 발명의 추가로 특히 바람직한 실시양태는 하기 화학식의 화합물에 관한 것이다.
Figure pct00017
본 발명의 화합물은 일반적으로 넓은 투여량 범위에 걸쳐 효과적이다. 예를 들어, 하루 투여량은 약 0.03 내지 약 30 mg/체중 Kg의 범위 내이다. 일부 경우에, 상기 범위의 하한치 미만의 투여량 수준이 매우 적합할 수 있는 한편, 다른 경우에도 보다 더 큰 용량이 유리한 이익/위험 프로파일을 유지하면서 사용될 수 있고, 따라서 상기 투여량 범위는 어떠한 방식으로든지 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 실제로 투여되는 화합물의 양은 치료될 상태, 선택된 투여 경로, 투여되는 실제 화합물 또는 화합물들, 개별 환자의 연령, 체중 및 반응, 및 환자 증상의 중증도를 포함한 관련 상황에 비추어 의사에 의해 결정될 것으로 이해될 것이다.
당뇨병 및/또는 비만의 치료를 위한 작용제가 당뇨병 및/또는 비만의 치료를 위한 다른 작용제와 조합될 수 있다는 점은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은, 당뇨병 또는 비만을 위한 다른 효과적인 치료(들)와 함께, 동시에 또는 순차적으로 공동 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은, 단독으로 또는 다른 효과적인 치료 (들)와 조합하여, 승인된 의료 절차, 예컨대 비만치료 수술, 예를 들어, 위장 우회로 수술 또는 위 조절 밴드술 절차 후에, 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 그의 염은 관련 기술분야에 공지된 다양한 절차에 의해 제조될 수 있으며, 이들 중 일부가 하기 반응식, 제조예 및 실시예에 예시되어 있다. 기재된 각각의 경로에 대한 구체적인 합성 단계는 본 발명의 화합물 또는 염을 제조하기 위해 상이한 방식으로 또는 상이한 반응식으로부터의 단계와 함께 조합될 수 있다. 하기 반응식에서의 각각의 단계의 생성물은 추출, 증발, 침전, 크로마토그래피, 여과, 연화처리 및 결정화를 포함한 관련 기술분야에 널리 공지된 통상적인 방법에 의해 회수될 수 있다. 하기 반응식에서, 모든 치환기는 달리 나타내지 않는 한, 상기 정의된 바와 같다. 시약 및 출발 물질은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 입수가능하다.
추가적으로, 하기 반응식에 기재된 특정 중간체는 1개 이상의 질소 보호기를 함유할 수 있다. 가변 보호기는 각 경우에, 수행될 특정한 반응 조건 및 특정한 변환에 따라 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 보호 및 탈보호 조건은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 ["Greene's Protective Groups in Organic Synthesis", Fourth Edition, by Peter G.M. Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007] 참조).
명확성을 위해 하기 반응식에서 특정 입체화학적 중심은 명시되지 않았고, 특정 치환기는 제거되었으며, 이는 어떠한 방식으로도 반응식의 교시를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 단일 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체는 키랄 시약으로 시작하거나 입체선택적 또는 입체특이적 합성 기술에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 단일 거울상이성질체 또는 라세미체는 선택적 결정화 기술 또는 키랄 크로마토그래피와 같은 방법에 의해 본 발명의 화합물의 합성 중 임의의 편리한 시점에서 표준 키랄 크로마토그래피 또는 결정화 기술에 의해 혼합물로부터 단리될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [J. Jacques, et al., "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981, and E.L. Eliel and S.H. Wilen," Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994] 참조).
본 발명의 일부 중간체 또는 화합물은 1개 이상의 키랄 중심을 가질 수 있다. 본 발명은 상기 화합물의 모든 개별 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체 뿐만 아니라 라세미체를 비롯한 거울상이성질체 및 부분입체이성질체의 혼합물을 고려한다. 적어도 1개의 키랄 중심을 함유하는 본 발명의 화합물이 단일 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체로서 존재하는 것이 바람직하다. 단일 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체는 키랄 시약으로 시작하여 또는 입체선택적 또는 입체특이적 합성 기술에 제조될 수 있다. 대안으로, 단일 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체는 표준 키랄 크로마토그래피 또는 결정화 기술에 의해 혼합물로부터 단리될 수 있다. 통상의 기술자는, 일부 상황에서 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체의 용리 순서가 상이한 크로마토그래피 칼럼 및 이동상으로 인해 상이할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
특정한 약어는 하기와 같이 정의된다: "ACN"은 아세토니트릴을 나타내고; "BSA"는 소 혈청 알부민을 나타내고; "DCC"는 1,3-디시클로헥실카르보디이미드를 나타내고; "DCM"은 디클로로메탄을 나타내고; "DIC"는 디이소프로필카르보디이미드를 나타내고; "DIPEA"는 디이소프로필에틸아민 또는 N-에틸-N-이소프로필-프로판-2-아민을 나타내고; "DMAP"는 디메틸아미노피리딘을 나타내고; "DMF"는 디메틸포름아미드를 나타내고; "DMSO"는 디메틸술폭시드를 나타내고; "EDCI"는 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드를 나타내고; "EDTA"는 에틸렌디아민테트라아세트산을 나타내고; "ee"는 거울상이성질체 과잉률을 나타내고; "ELISA"는 효소-연결된 면역 검정을 나타내고; "EtOAc"는 에틸 아세테이트를 나타내고; "EtOH"는 에탄올 또는 에틸 알콜을 나타내고; "Ex"는 실시예를 나타내고; "FBS"는 태아 소 혈청을 나타내고; "HATU"는 (디메틸아미노)-N,N-디메틸(3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-일옥시)메탄이미늄 헥사플루오로포스페이트를 나타내고; "HOAt"는 1-히드록시-7-아조벤조트리아졸을 나타내고; "HOBt"는 1-히드록실벤조트리아졸 수화물을 나타내고; "HBTU"는 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트를 나타내고; "HPLC"는 고성능 액체 크로마토그래피를 나타내고; "HRP"는 양고추냉이 퍼옥시다제를 나타내고; "IC50"은 작용제에 대해 가능한 최대 억제 반응의 50%를 생성하는 상기 작용제의 농도를 나타내고; " LC-ES/MS"는 액체 크로마토그래피 전기분무 질량 분광측정법을 나타내고; "min"은 분을 나타내고; "MeOH"는 메탄올 또는 메틸 알콜을 나타내고; "MS"는 질량 분광측정법을 나타내고; "OAc"는 아세테이트를 나타내고; "PBS"는 포스페이트 완충 염수를 나타내고, "PG"는 보호기를 나타내고; "Prep"는 제조를 나타내고; "PYBOP®"는 벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트를 나타내고; "PYBROP®"는 브로모-트리스-피롤리디노 포스포늄헥사플루오로 포스페이트를 나타내고; "RT"는 실온을 나타내고; "SCX"는 강한 양이온 교환을 나타내고; "SFC"는 초임계 유체 크로마토그래피를 나타내고; "SPE"는 고체 상 추출을 나타내고; "TFA"는 트리플루오로아세트산을 나타내고, "TMB"는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘을 나타내고; "TR"은 체류 시간을 나타낸다.
하기 반응식에서, 달리 나타내지 않는 한, 모든 치환기는 상기 정의된 바와 같다. 시약 및 출발 물질은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 이용가능하다. 다른 것들은 공지된 구조적으로-유사한 화합물의 합성과 유사한 유기 및 헤테로시클릭 화학의 표준 기술, 및 임의의 신규 절차를 포함한 하기 제조예 및 실시예에 기재된 절차에 의해 제조될 수 있다.
반응식 1
Figure pct00018
반응식 1에서, Rx는 적절한 아민 보호기이다. 아민 보호기는 관련 기술분야에 널리 공지 및 인지되어 있으며, 카르바메이트 및 아미드를 포함할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 대안적 시약 및 절차를 인지하여 상기 보호기를 첨가 및 제거할 것이다.
화합물 (2)는 화합물 (1)을 할로겐화제, 예컨대 일염화아이오딘, I2 또는 N-아이오도숙신이미드로 처리함으로써 제조될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 헤테로방향족 할로겐화의 다수의 방법이 존재한다는 것을 인지할 것이다. 추가의 단계에서, 화합물 (4)는 촉매, 예컨대 CuI 및 염기, 예컨대 Et3N, DIPEA, K2CO3, 또는 Cs2CO3의 존재 하에, 팔라듐 유도된 유기금속 시약, 예컨대 Pd(PPh3)2Cl2, Pd(OAc)2 , 또는 Pd2(dba)3을 이용하여, 표준 커플링 조건 하에, 화합물 (2)를 알킨 (3)과 커플링시킴으로써 제조될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 금속 예컨대 Cu 또는 Zn으로부터 유도된 대안적 유기금속 시약이 존재한다는 것을 인지할 것이다. 대안적으로, 화합물 (3)의 상응하는 유리 아민은 구입될 수 있고, 적절한 아민 보호기에 의해 보호될 수 있다. 화합물 (4)는 전이 금속 촉매 예컨대 산화백금의 존재 하에 촉매 수소화에 의해 환원된다. 다른 수소화 촉매가 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고; 예를 들어 탄소 상 팔라듐 또는 로듐 유도체는 알킨을 환원시키는 것으로 공지되어 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 에탄올 중 소듐 또는 산 중 아연으로의 처리를 포함한, 알킨 환원에 대한 다른 방법이 존재한다는 것을 인지할 것이다. 이어서, 보호기는 관련 기술분야에 널리 공지된 조건 하에, 예컨대 산성 또는 염기성 조건 하에 제거되어 화합물 (5)를 제공할 수 있다.
반응식 2
Figure pct00019
화합물 (7)은 표준 커플링 조건 하에 화합물 (5)를 화합물 (6)과 반응시킴으로써 합성될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 카르복실산 및 아민의 반응으로부터 생성되는 아미드 형성에 대한 다수의 방법 및 시약이 존재한다는 것을 인지할 것이다. 화합물 (5)와 화합물 (6)의 커플링은 적합한 커플링 시약 및 적합한 아민 염기, 예컨대 DIPEA 또는 트리메틸아민의 존재 하에 실시될 수 있다. 커플링 시약은 카르보디이미드, 예컨대 DCC, DIC, EDCI 및 다른 커플링 시약, 예컨대 HOBt 및 HOAt를 포함한다. 추가적으로, 비-친핵성 음이온의 우로늄 또는 포스포늄 염, 예컨대 HATU, HBTU, PYBOP® 및 PYBROP®는 보다 전통적인 커플링 시약 대신 사용될 수 있다. 첨가제 예컨대 DMAP는 반응을 증진시키는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 화합물 (5)는 염기, 예컨대 트리에틸아민 또는 피리딘의 존재 하에 화합물 (6)의 치환된 아실 클로라이드를 사용하여 아실화될 수 있다.
중간체 (7)에서, 보호기, Rx는 관련 기술분야에 널리 공지된 조건, 예컨대 산성 또는 염기성 조건 하에 제거될 수 있다. 생성된 아민 중간체는 화합물 (7)의 제조에서 이전에 기재된 것들을 포함한 표준 커플링 조건 하에 화합물 (8)과 반응하여, 화학식 I의 화합물을 제공할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 유기 염기 예컨대 트리에틸아민의 존재 하에 산 클로라이드와 반응시키거나 또는 촉매 예컨대 DMAP의 존재 하에 무수물과 반응시키는 것을 포함하여, 탈보호된 화합물 (7)로부터 화학식 I의 화합물을 제조하는 대안적 방법이 존재한다는 것을 인지할 것이다.
임의적인 단계에서, 화학식 I의 화합물의 제약상 허용되는 염은 적합한 용매 중에서 표준 조건하에 화학식 I의 적절한 유리 염기를 적절한 제약상 허용되는 산과 반응시킴으로써 형성될 수 있다. 추가적으로, 이러한 염의 형성은 질소 보호기의 탈보호 시에 동시에 일어날 수 있다. 이러한 염의 형성은 관련 기술분야에 널리 공지되고 인지되어 있다.
제조예 및 실시예
하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 추가로 예시하며 본 발명의 화합물의 전형적인 합성을 나타낸다. 시약 및 출발 물질은 용이하게 입수가능하거나 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 합성될 수 있다. 제조예 및 실시예는 제한이 아니라 예시로서 제시되고 다양한 변형이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이루어질 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 화합물의 R 또는 S 배위는 표준 기술 예컨대 X선 분석 및 키랄-HPLC 체류 시간과의 상관관계에 의해 결정될 수 있다. 하기 제조예 및 실시예의 명명화는 일반적으로 MDL 엑셀리스 (MDL ACCELRYS)® 드로우 버전 4.1에서 IUPAC 명명화 특색을 사용하여 수행된다.
LC-ES/MS는 애질런트(AGILENT)® HP1100 액체 크로마토그래피 시스템 상에서 수행된다. 전기분무 질량 분광측정법 측정 (양성 모드에서 얻어짐)은 HP1100 HPLC에 인터페이싱된 질량 선택성 검출기 사중극자 질량 분광계 상에서 수행된다. LC-MS 조건 (낮은 pH): 칼럼: 페노메넥스(PHENOMENEX)® 제미니(GEMINI)® NX C18 2.1 x 50 mm 3.0 m; 구배: 3분 내 5-100% B, 이어서 0.75분 동안 100% B, 칼럼 온도: 50℃ +/-10℃; 유량: 1 mL/분; 용매 A: 탈이온수, 0.1% 포름산 함유; 용매 B: ACN, 0.1% 포름산 함유. 대안적 LC-MS 조건 (낮은 pH): 칼럼: 엑스테라(XTERRA)® MS C18 칼럼 2.1x50 mm, 3.5 um; 구배: 0.25분 동안 5%의 용매 A, 3분 내 5%에서 100%의 용매 B의 구배 및 0.5분 동안 100%의 용매 B 또는 3분 내 10%에서 100%의 용매 B 및 0.75분 동안 100%의 용매 B; 칼럼 온도: 50℃ +/-10℃; 유량: 1 mL/분; 용매 A: 10 mM 암모늄 히드로겐카르보네이트 pH 9; 용매 B: ACN ; 파장: 214 nm.
모든 정제용 역상 크로마토그래피는 질량 선택성 검출기 질량 분광계 및 리프(LEAP)® 오토샘플러/분획 수집기가 장착된 애질런트® 1200 LC/MS 상에서 수행된다. 높은 pH 방법은 75 X 30 mm 페노메넥스® 제미니®-NX, 5 μ 입자 크기 칼럼, 10 X 20 mm 가드 상에서 수행된다. 85 mL/분의 유량. 용리액은 아세토니트릴 중 10 mM 중탄산암모늄 (pH 10)이다.
워터스 ZQ 질량 분광계 및 29998 다이오드 어레이 검출기는 초임계 유체 크로마토그래피 (SFC) 동안 질량 및 UV 데이터를 얻기 위해 사용된다. 정확한 질량 (전기분무 이온화) 및 UV 흡광도를 나타내는 물질이 수집된다.
제조예 1
5-아이오도-6-메틸-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-4-아민
Figure pct00020
DCM (20.1 mL) 중 일염화아이오딘 (4.14 g, 23.37 mmol)의 용액을 MeOH (1.4 mL) 중 6-메틸-2-트리플루오로메틸-피리미딘-4-아민 (4.14 g, 23.37 mmol)을 함유하는 플라스크에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 반응 완결 시, 10% 수성 아황산나트륨 용액 (200 mL)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 EtOAc (4 x 100 mL)로 추출하고, 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켜 조 표제 화합물을 담황색 고체 (7.0 g, 99%)로서 수득하였다. 물질을 추가 정제 없이 사용하였다. LC-ES/MS m/z 303.8 (M+H).
제조예 2
tert-부틸 4-[2-[4-아미노-6-메틸-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에티닐]피페리딘-1-카르복실레이트
Figure pct00021
20 mL 마이크로웨이브 바이알에서 10 mL DMF 중 5-아이오도-6-메틸-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-4-아민 (2.05 g, 6.75 mmol), 4-에티닐-피페리딘-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르 (1.41 g, 6.75 mmol), 비스(트리페닐포스핀)염화팔라듐 (II) (239 mg, 0.34 mmol) 및 아이오딘화구리 (I) (130 mg, 0.68 mmol)를 슬러리화하고, 질소를 현탁액을 통해 5분 동안 버블링하였다. 트리에틸아민 (1.88 mL, 13.5 mmol)을 첨가하고, 질소를 혼합물을 통해 5분 더 계속 버블링하였다. 혼합물을 마이크로웨이브에서 100℃에서 60분 동안 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 포화 수성 NaCl (500 mL)에 부었다. DCM으로 추출하고, MgSO4 상에서 유기 층을 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 실리카 겔 상에서 크로마토그래피에 의해 정제하였다 (5-35% EtOAc:헥산, 45분에 걸침). 정제된 분획을 농축 건조시켜 표제 화합물 (1.25 g, 48%)을 담황색 고체로서 수득하였다. LC-ES/MS m/z 385.2 (M+H).
제조예 3
tert-부틸 4-[2-[4-아미노-6-메틸-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸]피페리딘-1-카르복실레이트
Figure pct00022
EtOH (110 mL) 중에서 tert-부틸 4-[2-[4-아미노-6-메틸-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에티닐]피페리딘-1-카르복실레이트 (6.28 g, 16.34 mmol) 및 산화백금 (IV) (744 mg, 3.27 mmol)을 합하였다. 대안적으로 플라스크를 배기시키고, 수소 풍선 하에 수소로 채우고, 시스템을 수소로 충전하고, 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 혼합물을 뜨거운 EtOH (30 mL)에 이어서 2M NH3/MeOH (20 mL)로 헹구면서 규조토를 통해 여과하였다. 용액을 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 (6.15 g, 97%)을 백색 고체로서 수득하였다. 추가 정제 없이 사용하였다. LC-ES/MS m/z 389.2 (M+H).
제조예 4
6-메틸-5-[2-(4-피페리딜)에틸]-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-4-아민
Figure pct00023
tert-부틸 4-[2-[4-아미노-6-메틸-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸]피페리딘-1-카르복실레이트 (6.07 g, 15.63 mmol)를 DCM (25 mL) 중에서 용해시키고, TFA (10 mL, 132.25 mmol)를 첨가하였다. 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압 하에 농축시키고, 생성된 잔류물을 DCM (15 mL) 중에 용해시키고, SCX 칼럼 (50 g)에 적용하고, DCM (100 mL), MeOH (100 mL)로 용리시키고, 목적 물질을 2M NH3/MeOH (100 mL)로 용리시켰다. 메탄올성 암모니아 분획을 증발 건조시켜 표제 화합물 (4.4 g, 97%)을 회백색 고체로서 수득하였다. 추가 정제 없이 사용하였다. LC-ES/MS m/z 289.2 (M+H).
제조예 5
6-메틸-5-[2-(4-피페리딜)에틸]-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-4-아민 디히드로클로라이드
Figure pct00024
이소프로판올의 50℃ 용액 (1.26 L)에 느린 정상 스트림으로 아세틸 클로라이드 (180.1 mL)를 첨가하고, 50℃에서 30분 동안 교반하였다. 제조예 3으로부터의 tert-부틸 4-[2-[4-아미노-6-메틸-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸]피페리딘-1-카르복실레이트 (180.1 g, 463.7 mmol)를 조금씩 첨가하고, 1.5시간 동안 가열을 계속하였다. 실온으로 냉각시키고, 디에틸 에테르 (3.6 L)를 첨가하였다. 고체를 여과에 의해 수집하고, 디에틸 에테르 (2 x 300 mL)로 세척하였다. 생성된 고체를 진공 오븐에서 50℃에서 밤새 건조시켜 표제 화합물 (174.0 g, 98%)을 백색 자유-유동 분말로서 수득하였다. 추가 정제 없이 사용하였다. LC-ES/MS m/z 289.2 (M+H).
실시예 1
tert-부틸 N-[(1S)-2-[4-[2-[4-아미노-6-메틸-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸]-1-피페리딜]-1-메틸-2-옥소-에틸]카르바메이트
Figure pct00025
6-메틸-5-[2-(4-피페리딜)에틸]-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-4-아민 (3.9 g, 13.53 mmol)을 DMF (20 mL) 중에서 용해시키고; (2S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)프로판산 (2.8 g, 14.88 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 (7.46 g, 54.11 mmol), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (2.63 g, 13.53 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (7.08 mL, 40.58 mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 수성 NaHCO3 (500 mL)에 붓고, DCM으로 추출하였다. 유기 상을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시키고, 실리카 겔 상에서 크로마토그래피 (10-75% EtOAc:헥산, 45분에 걸침)에 의해 정제하여, 용매 제거 후에, 표제 화합물 (4.66 g, 75%)을 백색 발포체로서 수득하였다. LC-ES/MS m/z 460.2 (M+H).
실시예 1에 대한 대안적 절차
tert-부틸 N-[(1S)-2-[4-[2-[4-아미노-6-메틸-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸]-1-피페리딜]-1-메틸-2-옥소-에틸]카르바메이트
Figure pct00026
디이소프로필에틸아민 (308.6 mL, 1770 mmol)을 DCM (1.6 L) 중 6-메틸-5-[2-(4-피페리딜)에틸]-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-4-아민 디히드로클로라이드 (170 g, 442.4 mmol), (2S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)프로판산 (92.1 g, 486.6 mmol)의 현탁액에 첨가하여 밝은 황색 현탁액을 수득하였다. 빙조에서 0℃로 냉각시키고, (디메틸아미노)-N,N-디메틸(3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-일옥시)메탄이미늄 헥사플루오로포스페이트 (167.3 g, 442.4 mmol)를 조금씩 첨가하였다. 0℃에서 밝은 황색 현탁액을 30분 동안 교반하고, 교반하면서 실온으로 2시간 동안 가온하였다. 약 1 L로 감압 하에 농축시키고, 반응 혼합물을 EtOAc (1 L)로 희석하고, 포화 수성 NH4Cl (약 500 mL)로 분배하고; 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc (2 x 500 mL)로 추가로 추출하였다. 유기 상을 합하고, 포화 수성 NH4Cl (4 x 400 mL), 포화 수성 NaHCO3 (400 mL), 물 (400 mL), 포화 수성 NaCl (400 mL)로 세척하였다. MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 이소-헥산 (750 ml)과 공비혼합하면서 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 (237 g, 99%)을 백색 발포체로서 수득하였으며, 이는 추가 정제 없이 사용하기에 적합하였다. LC-ES/MS m/z 460.3 (M+H). 키랄 분석 (SFC 미니그램(MiniGram)®, 15% MeOH/CO2/0.2% 이소-프로필아민, 5 mL/분, 100 bar, 35℃, 220 nm) >98% ee.
제조예 6
(2S)-2-아미노-1-[4-[2-[4-아미노-6-메틸-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸]-1-피페리딜]프로판-1-온
Figure pct00027
tert-부틸 N-[(1S)-2-[4-[2-[4-아미노-6-메틸-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸]-1-피페리딜]-1-메틸-2-옥소-에틸]카르바메이트 (4.66 g, 10.14 mmol)를 DCM (150 mL) 중에서 용해시키고, 트리플루오로아세트산 (7.67 mL, 101.4 mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 진공 하에 농축시키고, 잔류물을 DCM (20 mL) 중에서 재구성하고, SCX 칼럼 (50 g)을 적용하면서, 100 mL DCM, 100 mL MeOH로 용리시키고, 목적 물질을 2M NH3/MeOH (100 ml)로 용리시켰다. 메탄올성 암모니아 분획을 증발 건조시켜 표제 화합물 (3.58 g, 98%)을 백색 발포체로서 수득하였다. 추가 정제 없이 사용하였다. LC-ES/MS m/z 360.2 (M+H).
실시예 2
N-[(1S)-2-[4-[2-[4-아미노-6-메틸-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸]-1-피페리딜]-1-메틸-2-옥소-에틸]-2-메틸-피라졸-3-카르복스아미드
Figure pct00028
(2S)-2-아미노-1-[4-[2-[4-아미노-6-메틸-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸]-1-피페리딜]프로판-1-온 (560 mg, 1.56 mmol)을 DMF (3 mL)를 함유하는 DCM (20 mL) 중에서 용해시키고; 1-메틸-1H-피라졸-5-카르복실산 (216 mg, 1.71 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 (969 mg, 6.23 mmol), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (303 mg, 1.56 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (1.36 mL, 7.8 mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 수성 NaHCO3 (200 mL)에 붓고, DCM으로 추출하였다. 유기 상을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시키고, 크로마토그래피에 의해 실리카 겔 (0-10% MeOH:DCM, 30분에 걸침) 상에서 정제하여, 용매 제거 후에, 표제 화합물 (665 mg, 91%)을 백색 발포체로서 수득하였다. LC-ES/MS m/z 468.0 (M+H).
하기 표 1 내의 실시예를, 실시예 2에 기재된 절차를 본질적으로 따라, (2S)-2-아미노-1-[4-[2-[4-아미노-6-메틸-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸]-1-피페리딜]프로판-1-온 및 적절하게 치환된 카르복실산을 사용하여 제조하였다.
표 1
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
실시예 2에 대한 제조의 대안적 방법
N-[(1S)-2-[4-[2-[4-아미노-6-메틸-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸]-1-피페리딜]-1-메틸-2-옥소-에틸]-2-메틸-피라졸-3-카르복스아미드
Figure pct00033
빙조에서 DCM (1.5 L) 중에 현탁된 (2S)-2-아미노-1-[4-[2-[4-아미노-6-메틸-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸]-1-피페리딜]프로판-1-온 (168.0 g, 342.0 mmol), 1-메틸-1H-피라졸-5-카르복실산 (64.7 g, 513.0 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (244.5 mL, 1400 mmol)의 슬러리에 1-프로판포스폰산 시클릭 무수물 (410.6 mL, 683.9 mmol)을 느린, 정상 스트림으로 첨가하면서, 내부 온도를 5-10℃에서 유지하였다. 실온으로 가온하면서 2.5시간에 걸쳐 교반하였다. 감압 하에 약 500 mL로 농축시키고, 생성된 잔류물을 EtOAc (2 L) 및 물 (1 L)로 희석하고; 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc (2 x 400 mL)로 추출하고, 합한 유기 층을 포화 NH4Cl (500 mL), 포화 수성 NaHCO3 (1 L), 물 (500 mL), 포화 수성 NaCl (500 mL)로 세척하였다. 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 증발시켰다. 생성된 잔류물을 이소프로필 아세테이트 (180 mL) 중에서 용해시키고, 헵탄 (1 L)으로 처리하고, 70℃로 4시간 동안 가열하여 백색 분말을 수득하였다. 실온으로 냉각시키고, 고체를 여과에 의해 수집하고, 9:1 헵탄:이소프로필 아세테이트 (100 mL)에 이어서 헵탄 (2 x 100 mL)으로 세척하였다. 진공 오븐에서 45℃에서 밤새 건조시켜 표제 화합물을 백색 분말 (117 g, 73%)로서 수득하였다. LC-ES/MS m/z 468.0 (M+H).
실시예 19
N-[(1S)-2-[4-[2-[4-아미노-6-메틸-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸]-1-피페리딜]-1-메틸-2-옥소-에틸]아세트아미드
Figure pct00034
표제 화합물 (47.7 mg, 67%)을, 실시예 1에 기재된 절차를 본질적으로 따라, DCM (3.9 mL, 0.05 M) 중 (2S)-2-아미노-1-[4-[2-[4-아미노-6-클로로-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸]-1-피페리딜]프로판-1-온 (70 mg, 0.19 mmol), 아세트산 무수물 (184.1 μL, 1.95 mmol) 및 DMAP (1.2 mg, 0.01 mmol)를 사용하여 제조하였다. ES/LC-MS m/z 402.2 (M+1).
실시예 20
메틸 N-[(1S)-2-[4-[2-[4-아미노-6-메틸-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸]-1-피페리딜]-1-메틸-2-옥소-에틸]카르바메이트
Figure pct00035
(2S)-2-아미노-1-[4-[2-[4-아미노-6-메틸-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸]-1-피페리딜]프로판-1-온 (43.8 mg, 0.12 mmol)을 DCM (3 mL) 중에서 용해시키고, 디메틸 디카르보네이트 (22.0 μL, 182.8 umol) 및 피리딘 (30 μL, 365.6 μmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 포화 수성 NaCl (100 ml)을 붓고, DCM (3 x 30 mL)으로 추출하였다. 합한 유기 층을 0.1 N HCl (2 x 100 mL), 물 (100 mL), 포화 수성 NaCl (100 ml)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜 표제 화합물을 회백색 고체 (22 mg, 43%)로서 수득하였다. LC-ES/MS m/z 418.2 (M+H).
실시예 21
N-[(1S)-2-[4-[2-[4-아미노-6-메틸-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸]-1-피페리딜]-1-메틸-2-옥소-에틸]피리딘-2-카르복스아미드 히드로클로라이드
Figure pct00036
N-[(1S)-2-[4-[2-[4-아미노-6-메틸-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일]에틸]-1-피페리딜]-1-메틸-2-옥소-에틸]피리딘-2-카르복스아미드 (69 mg, 0.15 mmol)를 DCM (1 mL) 중에서 용해시키고, HCl (디옥산 중 1M, 500 mL)을 첨가하였다. 실온에서 10분 동안 교반한 다음, 진공 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 DCM (1 mL)에 이어서 Et2O (2 mL)로 연화처리하였다. 여과하고, 생성된 담황색 고체를 수집하여 표제 화합물 (74 mg, 98%)을 수득하였다. LC-ES/MS m/z 465.2 (M+H).
검정
GOAT는 UAG를 AG로 전환시키는 주요 효소이다. GOAT 및 그렐린의 역할의 검토를 위해 문헌 [Kristy M. Heppner et al., The ghrelin O-acyltransferase-ghrelin system: a novel regulator of glucose metabolism, Current Opinion in Endocrinology, Diabetes & Obesity 2011, 18:50-55; Phillip A. Cole et al., Glucose and Weight Control in Mice with a Designed Ghrelin OAcyltransferase Inhibitor, Science. 2010 December 17; 330(6011): 1689-1692. doi:10.1126/science.1196154, Matthias H. Tschoep et al., Gastric O-acyl transferase activates hunger signal to the brain, Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 April 29; 105(17): 6213-6214, 및 Jesus Gutierrez, et al., Ghrelin octanoylation mediated by an orphan lipid transferase, Proc Natl Acad Sci U S A., 2008 April 29, 105 (17): 6320-6325]을 참조한다.
GOAT의 역할은 GOAT 유전자가 없는 마우스에서 관찰된 표현형에 의해 지지된다. 따라서, GOAT의 억제는 순환 AG를 감소시키고 순환 UAG를 상승시키는 것으로 예상된다. 그 결과, 총 그렐린 (UAG + AG)에 대한 AG의 비가 GOAT 억제제 처리 후 감소된다.
시험관내 무세포 인간 GOAT 효소적 검정
인간 GOAT 유전자 (수탁 번호: NM_001100916)를 pAN51 바큘로바이러스 발현 벡터에 서브클로닝하였다. 바큘로바이러스 스톡을 판매회사인 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐에 의해 제공된 Bac-to-Bac 프로토콜에 따라 제조하였다. 5 밀리리터의 인간 GOAT 바큘로바이러스 스톡을 2 L 삼각 플라스크 중 밀리리터당 1 x 106개 세포의 밀도에서 HyQ SFX-인섹트(SFX-Insect)™ 배지 (하이클론 카탈로그 번호 SH30278.02) 중 500 mL Sf9 세포에 첨가하였다. 인간 GOAT 유전자 감염된 Sf9 세포를 갖는 플라스크를 48시간 동안 28℃에서 120 rpm에서 플레이트 진탕기 상에 놓았다. 48시간 인큐베이션 후, 세포를 4℃에서 10분 동안 1,000xg에서 원심분리하였다. 세포 펠릿을 수집하고, 추가 가공을 위해 제조될 때까지 냉동고에서 -80℃에서 보관하였다.
효소적 검정을 위한 GOAT 효소의 마이크로솜 막의 제조:
1 그램 세포 펠릿을 9 mL 냉장한 균질화 완충제 (50 mM 트리스-HCl, 250 mM 수크로스, pH 7.5로 조정되고, 0.2 μm 밀리포어 필터를 통해 멸균 여과됨) 중에서 현탁시켰다. 세포 현탁액을 다운스 유리 균질화기로 옮겼다. 세포 펠릿을 얼음 상에서 40 스트로크로 균질화하였다. 균질액을 10분 동안 4℃에서 베크만 스윙 버킷 로터에서 3,000 rpm에서 원심분리하여 비파손 세포를 제거하였다. 상청액을 수집하고, 4℃에서 1시간 동안 40,000 xg에서 원심분리하였다. 생성된 막 펠릿을 다운스 유리 균질화기를 사용하여 균질화 완충제 중에서 현탁시키고, 검정용으로 냉동고에서 -20℃에서 보관하였다. 인간 GOAT 효소 막 제제의 장기 보관을 위해, 현탁된 막을 -80℃ 냉동고에서 보관하였다.
인간 GOAT 효소적 검정 프로토콜:
DMSO 중에서 시험 화합물을 제조하여 0.2 mM 스톡 용액을 형성하였다. DMSO 중의 스톡 용액을 연속 희석하여 10-포인트 희석 곡선을 수득하였고, 여기서 최종 화합물 농도는 96-웰 둥근 바닥 플레이트에서 10 μM 내지 0.5 nM의 범위였다. 검정 완충제 (50 mM 트리스 중 0.02% 트윈(TWEEN)™-20, pH 7.5/250 mM 수크로스/1 mg/mL BSA/10 mM EDTA) 중 효소 및 기질 용액을 제조하였다. 희석 화합물 (1 μL)을 상응하는 저 단백질 결합 384 웰 플레이트의 A 내지 N 열의 각각의 웰에 첨가하였다. 인간 데스아실-그렐린-비오틴 (CPC 사이언티픽 인크., 6.0 μM 최종), 옥타노일-조효소 A (CoA) (시그마, 60 μM 최종) 및 AG 특이적 항체 (WO2006/091381) (1.0 μg/mL 최종)로 이루어진 인간 GOAT 기질 믹스 (10 μL)를 화합물에 첨가하였다. 검정 완충제 (9 μL)에서 제조된 GOAT-His/sf9 효소 제제를 기질 및 시험 화합물을 함유하는 플레이트 각각의 웰에 첨가하여 결과적으로 0.01 μg/mL의 최종 농도를 생성시켜 반응을 개시하였다. 혼합물을 완만하게 회전하는 진동자 상에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 4M 구아니딘 히드로클로라이드 (20 μL)를 모든 웰에 첨가하고, 혼합하고, 3시간 동안 인큐베이션하여 반응을 중단하였다.
3시간 동안 PBS (40 μL) (인비트로겐) 차단 완충제 중 2% 열-불활성화 FBS로 차단함으로써 ELISA 플레이트 (스트렙타비딘 스펙트라플레이트(STREPTAVIDIN SPECTRAPLATE)™ 384, 퍼킨 엘머)를 제조하였다. ELISA 플레이트로부터 차단 완충제를 흡입하고 차단 완충제 (23 μL)를 칼럼 1-24, A-N 열에 첨가하였다. 아실그렐린 표준 곡선을 위해 O 및 P 열을 보류하였다. 반응 믹스 (2 μL)를 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 2.5 pM에서 출발하여 0.2M 구아니딘 히드로클로라이드를 함유하는 차단 완충제 중 연속 2X 희석에 의해 10 포인트 표준 곡선 (비오틴-표지된 옥타노일-그렐린)을 제조하였다. ELISA 플레이트 중 반응 혼합물 또는 비오틴-표지된 AG 표준을 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 다음 날, 플레이트를 세척 완충제 (0.1% 트윈™-20/PBS, 각각의 세척 주기에서 웰당 100 μL)로 3x 세척하였다. AG 특이적 항체 (WO 2006/091381) (차단 완충제 중 0.5 μg/mL의 25 μL)를 각각의 웰에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이전 단계와 유사하게, 플레이트를 세척 완충제로 3x 세척하였다. 차단 완충제 중 3,000x로 희석된 단백질 G-HRP (25 μL) (서던 바이오테크)를 첨가하고, 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 이전 단계에서와 같이, 플레이트를 세척 완충제로 3x 세척하였다. TMB 시약 (25 μL) (커키가드 & 페리 래보러토리즈, 인크.)을 각각의 웰에 첨가하고, 20분 동안 방치하여 전개시키고, 1M 인산 (웰당 25 μL)으로 중단시켰다. 엔비전(ENVISION)® 멀티레이블 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 플레이트를 판독하였다. AG 수준을 피팅된 표준 곡선에 대하여 플로팅하고, 퍼센트 억제를 계산하였다. 10-포인트 억제 곡선을 플로팅하고, 4-파라미터 로지스틱 방정식으로 피팅하여 액티비티베이스(ACTIVITYBASE)® (ver. 7.3.2.1)를 사용하여 IC50 값을 수득하였다.
본질적으로 상기 기재된 바와 같은 프로토콜에 따라, 본원의 실시예의 화합물 모두를 시험하였고, 1 μM 미만의 시험관내 무세포 인간 GOAT 효소적 검정에 대한 IC50을 나타내었다. 하기 예시된 본 발명의 화합물을 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 시험하였고, 하기 표 2에 예시된 바와 같은 하기 활성을 나타내었다.
표 2
Figure pct00037
표 2의 데이터는, 표 2의 화합물이 정제된 GOAT 효소 시험관내 활성을 억제한다는 것을 입증한다.
화합물 처리군에서 총 그렐린에 대한 AG의 비에서의 변화와 비히클 처리군에서의 그의 변화를 비교하는 것은 GOAT 효소에 의한 AG로의 UAG의 동적 프로세싱에 기인하는, 생체내 GOAT 효소 억제의 정도를 반영한다. 본원에서의 생체내 약역학적 연구에서, 비히클 및 화합물 처리군에서 혈장 및 위에서의 AG 및 UAG의 수준을 구체적으로 이들 두 분석물에 대해 ELISA에 의해 측정하였다. 각각의 샘플의 총 그렐린 수준은 이들 ELISA 측정에 의해 AG 및 UAG의 합으로서 계산되었다. 총 그렐린에 대한 AG의 비는 각각의 샘플 중의 AG의 수준을 동일한 샘플에서 총 그렐린의 수준으로 나눔으로써 정의된다. 비히클 처리군에서의 총 그렐린에 대한 AG의 비, AG 및 UAG의 수준을 산출하고 이를 100%로서 설정하였다. 이어서, 화합물 처리군에서의 이들 파라미터의 상대적 변화를 산출하여 시험 화합물의 유효성을 결정하였다.
GOAT 억제제에 대한 생체내 용량 의존성 3일 BID 연구:E
동물 및 처리:
할란 (인디애나주 인디애나폴리스)으로부터 9주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 구매하였다. 12시간 명/암 주기 (2200시간 조명)로 온도-제어 (24℃) 설비에 마우스를 개별적으로 수용하고, 표준 설치류 급식 (식이 2014, 할란) 및 물을 자유롭게 이용하도록 하였다. 전형적으로, 마우스가 연구 시 10-13주령인 경우 이들을 사용하였다. 실험 제0일에, 마우스를 처리군 (N=7/군)으로 무작위화하여 각각의 군이 유사한 평균 체중을 가졌다. 제1일 및 제2일에, 동물을 오전 7시 및 오후 7시에 경구 위관영양에 의해 다양한 투여량으로 현탁액으로서 비히클에서 제조된 시험 화합물 또는 비히클 (1% 히드록시에틸셀룰로스, 0.25% 트윈™ 80, 0.05% 소포제)로 처리하였다. 제3일에, 동물을 금식시키고, 이들을 청결한 케이지로 옮기고, 경구 위관영양에 의해 오전 8시에 다시 시험 화합물 또는 비히클을 투여하였다. 오후 1시에 그와 동일한 날에, 단두에 의해 동물을 희생시켜 혈액을 수집하였다. 혈액 수집 및 혈장 처리의 세부 사항은 하기 혈액 수집 및 혈장으로부터의 그렐린의 추출 섹션을 참조한다.
혈액 수집:
대략 600 μL 혈액을 600 μL (V보존제로서 정의됨)의 새로-제조된 보존제 (4 mM 페파블록(PEFABLOC)® [4-(2-아미노에틸) 벤젠술포닐 플루오라이드 히드로클로라이드], 72 mM NaCl, 58 mM NaF, 0.032 N 염산, pH 3.0)를 함유하는 미리 칭량된 EDTA 관 내로 수집하고 즉시 혼합하였다. 관을 다시 칭량하고, 얼음 상에서 유지하였다. 이러한 혈액 수집 절차를 사용하여 각각의 샘플의 정확한 혈액 부피를 정확히 측정하기 위해, 각각의 마우스에 대한 혈액의 중량을 하기 방정식을 사용하여 산출하였다:
혈액의 중량 = (혈액 함유 관의 중량 + 보존제) - (보존제를 함유하는 관의 중량)
혈액 부피 (V혈액) = (혈액의 중량) / 1.06
설치류 혈액의 밀도는 1.06 g/mL로서 추정됨을 주목한다.
혈액 수집 후 15분 내에, 샘플을 8분 동안 4℃에서 5000 rpm에서 원심분리하였다. 혈장 (650 μL)을 1 N 염산 (65 μL)을 함유하는 5 mL 유리 관으로 제거하고, 혼합하고, 얼음 상에서 유지하였다.
SEP-PAK® 칼럼에 의한 그렐린 추출:
AG 및 UAG를 SEP-PAK®_C18 칼럼을 사용하여 혈장으로부터 추출하여 ELISA를 수행하기 전에 간섭을 제거하였다. SEP-PAK®_C18 칼럼에 의한 AG 및 UAG 펩티드의 고체상 추출은 진공 매니폴드 (워터스 코포레이션) 상에서 또는 연동 펌프를 사용하여 수행할 수 있었다. 샘플 SEP-PAK®_칼럼 추출 절차를 독립적으로 각각의 개별 마우스로부터 수득된 혈장 샘플에 적용하였다. 일반적 추출 프로토콜은 하기와 같이 기재된다.
SEP-PAK® 칼럼 추출의 전체 프로토콜에 사용된 모든 용액은 빙냉 조건에 있어야 한다. SEP-PAK®_칼럼 (WAT054960, 워터스 코포레이션, 매사추세츠주 밀포드)을 99.9% ACN/0.1% TFA (100 mL ACN/0.1 mL TFA의 1 mL 용액)로 습윤화하였다. 압력을 적용하여 유량을 약 1 mL/분으로 조정하여 칼럼 층으로부터 액체를 제거하나, 칼럼이 어떤 시점에서도 메마르게 하지 않도록 하였다. 일단 칼럼으로부터 액체가 제거되면, 압력을 중단하였다. 칼럼을 3% ACN/0.1% TFA (97 mL 물, 3 mL ACN, 0.1 mL TFA의 1 mL)로 평형화하였다. 압력을 적용하여 유량을 약 1 mL/분으로 조정하여 칼럼 층으로부터 액체를 제거하나, 칼럼이 어떤 시점에서도 메마르게 하지 않도록 하였다. 대략 650 μL 산성화 혈장 (V칼럼에 첨가된 혈장으로서 정의됨)을 1.4 mL 빙냉 0.1% TFA로 희석하였다. 이전 단계로부터의 모든 희석된 산성화 혈장을 칼럼 상에 로딩하였다. 압력을 적용하여 유량을 약 0.5 mL/분으로 조정하여 샘플이 칼럼을 통과하도록 하고, 그렐린 펩티드가 칼럼의 수지 상에 흡수되도록 하였다. 칼럼을 메마르게 하지 않도록 하였다. 3% ACN/0.1% TFA (97 mL 물, 3 mL ACN, 0.1 mL TFA의 0.9 mL)로 세척하였다. 압력을 적용하여 유량을 약 1 mL/분으로 조정하여 칼럼 층으로부터 액체를 제거하나 칼럼이 메마르게 하지 않도록 하였다. 세척을 2회 더 반복하였다. 60% ACN/0.1% TFA (40 mL 물, 60 mL ACN, 0.1 mL TFA의 1 mL)로 용리시켰다. 수집관을 각각의 칼럼 밑에 놓고, 압력을 적용하여 유량을 약 0.5 mL/분으로 조정하여 액체를 칼럼을 통해 통과시키고, 용리액을 수집관 내로 수집하였다. 샘플을 드라이아이스 상에서 즉시 동결시켰다. 샘플을 고속 진공기 (모델# SC110A, 사반트)에서 동결건조시키고, ELISA 검정이 수행될 때까지 -20℃에서 보관하였다.
그렐린에 대한 ELISA 검정:
코트 96-웰 멀티-어레이(MULTI-ARRAY)® MSD® 플레이트 (메소 스케일 디스커버리, 메릴랜드주 게이더스버그, 카탈로그 # L15XA-3)를 PBS (인비트로겐) 중 그렐린의 아실 및 비아실화 형태 둘 다의 중간-영역을 인식하는, 1 μg/mL의 항체 (WO2005/026211 및 WO2006/019577) 100 μL로 코팅하였다. 플레이트의 측면을 탭핑하여 웰이 반드시 피복되게 하고, 접착 플레이트 밀봉기로 밀봉하고, 실온에서 밤새 인큐베이션하였다. 내용물을 폐기하고, PBS (25 μL) 중 블록커(BLOCKER)™ 카세인 (써모 사이언티픽, 일리노이주 록퍼드, 카탈로그 #37528)을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 재밀봉하고, 1시간 동안 실온에서 플레이트 진탕기 상에 놓았다.
PBS (각각의 샘플에 대해 400 μL, 이 부피는 V재구성으로서 정의됨) 중 블록커™ 카세인 중 SEP-PAK® C18 칼럼 추출로부터의 동결건조된 보존된 혈장 샘플을 재구성하고, 볼텍스 혼합기에서 잘 혼합하고, 45-60분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 플레이트로부터 내용물을 폐기하고, 25 μL에서 재구성된 혈장 샘플을 각각의 웰에 첨가하였다. 8000 pg/mL로 시작하고 8개의 총 농도를 위해 1:4 연속 희석을 수행하여 아실그렐린 및 비아실화 그렐린 표준 곡선을 제조하였다. 이중으로 제조된 표준을 각각의 웰 중 25 μL로 차단된 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 2시간 동안 플레이트 진탕기 상에서 실온에서 인큐베이션하였다.
플레이트 내용물을 폐기하고, 0.1% 트윈™ 20 (150 μL) (PBS-T)을 포함한 PBS로 3회 세척하였다. MSD® 술포-태그(SULFO-TAG)™ (메소 스케일 디스커버리)로 표지된 아실그렐린 특이적 항체 (WO 2006/091381) 또는 비아실화 그렐린 특이적 항체 (WO 2006/055347)를 2차 항체 용액으로 명명된, 0.05% 트윈™ 20을 함유하는 0.2 x 블록커 카세인 중 0.05 μg/mL로 희석하였다. 최종 세척액을 제거하고, AG 또는 UAG를 특이적으로 인식하는 2차 항체 용액 (각각의 웰에 25 μL)을 첨가하였다. 플레이트를 재밀봉하고, 플레이트 진탕기 상에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 최종적으로 PBS-T (150 μL/웰)로 다시 3x 세척하였다.
최종 세척액을 폐기하고, 1x MSD® 리드(Read) 완충제 (150 μL/웰)로 대체하였다. MSD® 섹터(SECTOR)® 이미저 6000 분석기 (메소 스케일 디스커버리)를 사용하여 플레이트 상에 전극에 대해 결합된 MSD® 술포-태그™ 표지의 활성화에 의해 발생된 전기화학발광 신호를 판독하였다. MSD® 소프트웨어에 의해 발생된 각각의 표준 곡선을 기초로 아실그렐린 또는 비아실화 그렐린의 농도를 계산하였다. 측정된 아실그렐린 또는 비아실화 그렐린 수준에 희석 배율을 곱함으로써 각각의 샘플에 대한 실제 혈장 농도를 결정하였다. 각각의 혈장 샘플에 대한 희석 배율은 하기 방정식으로 산출하였다.
Figure pct00038
결과:
3일 동안 실시예 2의 화합물의 투여는 0.1, 0.3, 1, 3, 및 10 mg/kg에서 각각, 혈장 AG를 40%, 60%, 56%, 63%, 및 63% 감소시켰고, UAG를 2.10, 2.22, 3.57, 3.49 및 3.78배 증가시켰다 (이하에 표로 만든 결과). 0.1, 0.3, 1, 3, 및 10 mg/kg에서의 투여 결과 비히클-처리 대조군 동물과 비교 시 총 그렐린에 대한 AG 비가 각각 57, 62, 79, 82 및 82% 감소되었다.
표 3
Figure pct00039
결과는 실시예 2의 화합물이 생체내에서 GOAT 녹-아웃 마우스에서 제시된 바와 같이, 순환에서 AG 생성을 억제하고 UAG를 상승시킨다는 것을 입증하였다.

Claims (22)

  1. 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    Figure pct00040

    여기서 R은 -OH로 임의로 치환된 -C1-C3 알킬; -OC1-C4 알킬; 피라졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴 또는 티아디아졸릴 (여기서 피라졸릴, 옥사졸릴 또는 티아졸릴 각각은 -CH3으로 1 내지 2회 임의로 치환될 수 있음); 피리디닐, 피리다지닐 또는 피라지닐 (여기서 각각은 -Cl로 임의로 치환될 수 있음); 및 -OCH3으로 임의로 치환된 페닐로부터 선택된다.
  2. 제1항에 있어서, R은 -OH로 임의로 치환된 -CH3; -OCH3 또는 -OC(CH3)3; 피라졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴 또는 티아디아졸릴 (여기서 피라졸릴, 옥사졸릴 또는 티아졸릴 각각은 -CH3으로 1 내지 2회 임의로 치환될 수 있음); 피리디닐, 피리다지닐 또는 피라지닐 (여기서 각각은 -Cl로 임의로 치환될 수 있음); 및 -OCH3으로 임의로 치환된 페닐로부터 선택된 것인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, R은 피라졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴 또는 티아디아졸릴 (여기서 피라졸릴, 옥사졸릴 또는 티아졸릴 각각은 -CH3으로 1 내지 2회 임의로 치환될 수 있음); 피리디닐 또는 피라지닐 (여기서 각각은 -Cl로 임의로 치환될 수 있음); 및 -OCH3으로 임의로 치환된 페닐로부터 선택된 것인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 메틸 치환기를 갖는 탄소 원자의 배위가 (S)인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    Figure pct00041
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    Figure pct00042
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    Figure pct00043
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 화학식의 화합물.
    Figure pct00044
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염과 함께 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 1종 이상의 다른 치료제와 조합된 제약 조성물.
  10. 체중 증가의 감소를 필요로 하는 환자에게 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 체중 증가를 감소시키는 방법.
  11. 체중의 재증가의 감소를 필요로 하는 환자에게 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 체중의 재증가를 감소시키는 방법.
  12. 비만의 치료를 필요로 하는 환자에게 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 비만을 치료하는 방법.
  13. 제2형 당뇨병의 치료를 필요로 하는 환자에게 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 제2형 당뇨병을 치료하는 방법.
  14. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  15. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 체중 증가를 감소시키는데 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  16. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 체중의 재증가를 감소시키는데 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  17. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 비만을 치료하는데 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  18. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제2형 당뇨병을 치료하는데 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  19. 체중 증가를 감소시키기 위한 의약의 제조에서의 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도.
  20. 체중의 재증가를 감소시키기 위한 의약의 제조에서의 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도.
  21. 제2형 당뇨병을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도.
  22. 비만을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도.
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