KR20170104643A - 추간판의 치료 및/또는 재구성 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 STRO-1+ 다능성 세포의 투여를 수반하는 대상의 추간판을 치료 및 재구성하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 추간판이 퇴화된 척추증상의 치료에 유용하다.

Description

추간판의 치료 및/또는 재구성{Repair and/or Reconstitution of Invertebral Discs}
본 발명은 환자의 추간판을 치료 및 재구성하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 추간판이 퇴화된 척추증상의 치료에 유용하다.
추간판(invertebral disc, IVD)은 인간의 신체에서 가장 주된 비혈관성, 비신경성 및 비림프성의 구조이다. 상기 추간판은 축의 압축 및 굴신중에 유연성과 기계적인 안정성을 부여하기 때문에, 척주의 일반적인 기능에 중요하다. 상기 IVD는 몇가지 특화된 결합조직으로 구성된다: (i) 추간판의 상하에 위치한 척추골의 표면을 덮는 연골성 말단판(CEPs)의 유리질 연골; (ii) 속질핵(NP)을 감싸는 섬유연골륜의 섬유테(AF); 및, (iii) 비록 연골유사세포를 포함하지만 유리질 연골이 아닌 중심 젤라틴성 속질핵(NP). 또한, 이행부위(TZ)는 그의 명칭이 의미하는 대로, 상기 AF와 NP의 사이에 위치한 것으로 확인되었다. 상기 섬유연골륜의 AF는 척추의 골테에 연결된 중심부의 콜라겐층(라멜라)으로 구성된다.
프로테오글리칸(PGs)과 제I, II, III, V, VI, IX, X, XI형 콜라겐은 모든 이들 판 조직의 주된 기질 구성요소이지만, 그들의 상대적인 풍부함과 분포는 그들의 해부학적 위치에 의존한다. 물분자에 대해 높은 친화도를 가지는 PGs는 "건강한 판(healthy discs)"의 NP에서 가장 풍부하다. 상기 PGs에 흡수된 물은 감싸는 섬유연골륜의 AF를 팽창시키는 NP 내에서 수압을 발생시킨다. 그들 각각의 생리화학적 특성을 가지는 이들 특화된 결합조직의 조합은 척주의 정상적인 생기계적 기능에 필수적인 IVD의 유체역학적 및 점탄성적 특성을 부여한다.
상기 IVD는 노화 및 퇴화중에 심각한 기질의 변화를 경험한다. 인간의 시신 시료 및 척추수술시에 얻어진 추간판 시료의 연구는 연로한 그룹에 속한 개개인의 추간판이 일반적으로 넓은 범위의 병소를 갖는다는 점을 보여준다(참고문헌 1 및 2).
추간판 병변의 주된 3가지 유형이 이들 시료로부터 확인되었다: (i) 추체골의 가장자리에 AF의 부착부에 인접한 가로 결함인 테 병변; (ii) 환형 라멜라가 각각으로부터 분리되는 동심상의(둘레층의) 열상(tear); 및, (iii) NP내에서 시작되는 틈새의 전파로부터의 결과인 방사열상(radiating tear)(참고문헌 1, 2, 3). 기계적으로 매개될 수도 있는 척추 가장자리의 골에서 그들의 삽입부에 인접한 AF의 내측영역내에서 청소년기 및 이른 성년기에 더욱 일반적으로 나타나기 때문에, 테 병변은 특히 관심을 끈다. 그들의 존재는 AF의 초기 상실을 제공하고, 추간판 퇴화의 기본적인 원인이 되지만, 시신 시료의 연구는 다른 병리학적 특징(동심상의 열상, 낭성환형퇴화증, NP의 탈수증, 추골 가장자리의 신데스모파이트(syndesmophyte) 및 후방추간관절의 골관절염)도 약간은 예외 없이 존재함을 지적한다(참고문헌 1, 2).
비록, 이들 각각의 추간판 병변의 일시적인 병력은 여전히 논란거리로 남아있으나, NP에서 PGs의 손실과 그와 연결된 물이 추간판 퇴화의 초기 병인학적 결정인자라는 점에 대해서는 대체로 동의한다(참고문헌 4).
앞서 논의된 바와 같이, 유연한 수탄성 융기로서의 추간판의 기능은 NP내의 물분자의 흡수에 의하여 크게 매개되었다. 수분의 감소 및 이에 따른 NP의 팽압의 감소는 국부적인 상실의 결과로서 상위-생리적인 기계적 스트레스의 부담을 가져온다.
추간판 퇴화로부터 발생되는 등 및 목의 통증과 연관된 의학적 문제는 인구의 90%가 살아가면서 경험한다(참고문헌 5, 6). 사람에서, 의학적인 중재를 요구할 정도로 심각한 등 또는 목의 통증은 인생에서 삼십대 및 사십대에 발생하여, 오십대에서 최고에 달하며, 그 이후에는 감소한다(참고문헌 5).
미국에서, 등의 통증은 다른 어떤 근골격장애보다고 더 많은 입원의 원인이 되는 등과 목의 통증과 관련된 의사와 의료기관으로의 방문의 두 번째로 가장 일반적인 이유이다. 등의 통증은 작업시간을 손실하는 기본적인 원인이다. 예를 들어, 영국에서는 이러한 불편으로 인하여 매년 천백만 일 이상의 근로일을 손실하기에 이르렀다. 더욱이, 상기 인원이 향후 몇십 년에 걸쳐 증가하기 때문에, 등과 목의 통증문제는 이에 따라 증가할 것으로 예측된다.
현대사회에서 등과 목의 통증의 높은 발생율과 경제적인 부담에도 불구하고, 그 원인에 대하여는 여전히 거의 이해되고 있지 않다. 그러나, 상기 IVD가 고통의 기본적인 원인이라면, 추간판 수탄성 기능의 손실에 의하여 기계적으로 타협하게 된 외측 AF에 존재하는 신경 또는 인근의 척추구조로부터 퇴화 및/또는 손상이라는 점에 대하여 일반적으로 동의하고 있다(참고문헌 7, 8, 9, 10). 추간판 질환은 허리의 통증의 모든 경우의 23-40%에 달한다(참고문헌 11, 12). 외측의 AF가 자극되고, 신경섬유가 그의 내측 세 번째 층만큼 깊이 신장될 수도 있으며, 이에 따라 외측 AF의 모든 병리학적 변화가 고통을 유발시키게 된다(참고문헌 13, 14, 15).
원반형태의 원천의 등 또는 목의 통증을 치료하기 위한 현존하는 패러다임은 생활태도의 변화를 추구하거나 또는 종합적인 증상을 최소화하는 항-염증/진통성 의약 또는 퇴화된 조직의 절제 또는 움직임을 제한하기 위한 척추 관절고정(spinal arthrodesis)을 필요로 할 수도 있는 수술적인 중재를 사용하는 것과 같은 경험에 의거한 것이다. 목 또는 허리 통증을 경감시키기 위한 척추융합술(spinal fusion)의 광범위한 실시에도 불구하고, 추간판을 가로지르는 경화분절의 삽입에 의하여 주변의 추간판에 부가되는 기계적인 스트레스가 이후에 증상이 나타날 수도 있는 주변의 추간판의 퇴화변화를 촉진하기 때문에, 온건한 과정이 아니라고 알려져 있다(참고문헌 16). 치료하기 위한 완전히 변화된 방법을 필요로 하였다.
오스테오제닉 프로테인-1(OP-1)(뼈형성 단백질-7)과 같은 단백질의 추간판 내의 도입은 이후에 실험적으로 생성된 퇴화를 치료하는 추간판 기질을 자극하는 것으로 보고되었다. 추간판 퇴화는, 화학핵소체 용해술이라고 알려진 과정인 추간판 NP내에 탈중합 효소인 콘드로이티나아제 ABC의 사전 주입에 의하여 토끼에서 생성되었다(참고문헌 17). NP와 AF세포 모두 화학핵소체 용해술 후에 기능적인 기질의 재형성에 더욱 효과적인 것과는 멀게 된 것이 발견되었다. 정상적인 밀집된 세포외기질에 포집된 추간판 세포는 PG 합성상 OP-1의 자극효과에 대부분 반응하지 않는 것이 발견되었다(참고문헌 17).
자가 연골세포를 이용하여 개와 사람의 퇴화된 IVD를 치료하기 위한 잠재적인 세포치료법을 평가하기 위한 연구가 보고되었다(참고문헌 18, 19). 사용된 상기 세포는 동일 종의 건강한 NP로부터 수득한 연골세포이고, 이후에 손상된 추간판에 재이식되었다. 이러한 접근법의 단점은 상기 세포가 인접한 건강한 추간판 또는 동일종의 다른 공여자로부터 수득되어야만 한다는 것이다. AF의 침해는 이러한 세포를 수득하기 위해 필요하고, AF 구조를 손상시킬 뿐만 아니라 NP로부터 생존할 수 있는 세포를 제거하는 과정은 이러한 조직에서 퇴화성 변화를 가속화시킨다. 이러한 방법은 인간에 적용되는 것이 명백하게 제한되었다.
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간단 요약
본 발명은 처음으로 생체내 조건에서 퇴화된 추간판의 수핵 및 섬유테의 재형성을 촉진하기 위한 STRO-1+ 다능성 세포의 사용을 설명한다. STRO-1+ 다능성 세포는 동종이형의 원천으로부터 유래되고 본 연구에서 사용된 동물모델에서 잘 견딘다. 이는 공여자로부터의 STRO-1+ 다능성 세포가 퇴화된 추간판의 치료를 위한 "규격품"처럼 많은 수로 성장하고 발달될 수 있다는 점을 제공한다.
따라서, 본 발명은 대상에서 추간판을 재구성 및/또는 치료하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 추간판의 중간엽 전구세포(STRO-1+ 다능성 세포) 및/또는 그의 자손세포를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 STRO-1+ 다능성 세포 및/또는 그의 자손세포는 추간판의 속질핵내로 투여된다.
바람직하게는, STRO-1+ 다능성 세포는 또한 TNAP+, VCAM-1+, THY-1+, STR0-2+, CD45+, CD146+, 3G5+ 또는 그들의 조합이다.
STRO-1+ 다능성 세포 및/또는 그의 자손세포는 자가원천, 동종이형의 원천 또는 이종의 원천으로부터 유래될 수도 있다. 일 양태에서, 상기 세포는 동종이형의 원천으로부터 유래된다.
또한, 본 발명의 방법은 추간판에 예를 들어, 히알루론산(hyaluronic acid, hyaluronan, HA), 콘드로이탄 황산염(chondroitan sulfate), 더마탄 황산염(dermatan sulfate), 케라탄 황산염(keratan sulfate), 헤파린(heparin), 헤파린 황산염(heparin sulfate)과 같은 글리코사미노글리칸(GAG)을 투여하는 단계를 포함한다. 상기 GAG는 STRO-1+ 다능성 세포 및/또는 그의 자손세포로서 동일하거나 또는 서로다른 조성물로 투여될 수 있다.
본 발명의 방법은 모든 척추동물에서 수행할 수 있는 것으로 인식될 것이다. 예를 들어, 환자는 인간, 개, 고양이, 말, 소 또는 양과 같은 포유동물일 수도 있다.
본 발명의 방법은 허리통증(low back pain), 추간판의 연령에 따른 변화 또는 척추분리증(spondylolysis)과 같은 추간판의 퇴화에 의한 척추증상의 치료 또는 예방에 사용될 수도 있다.
본 명세서 전반에서, 용어 "포함한다", 또는 "포함한" 또는 포함하는" 등의 변형 형태는 언급된 요소, 정수 또는 단계, 요소들, 정수들 또는 단계들의 그룹을 포함하는 것을 내포하며, 다른 요소, 정수, 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 그룹을 배제하는 것이 아닌 것으로 이해될 것이다.
이하, 본 발명은 하기 비제한적인 실시예들에 의거하여 및 첨부된 도면을 참조하여 설명된다.
상세한 설명
일반적인 기술 및 선택적 정의
달리 구체적으로 언급된 경우를 제외하고는, 본원에 사용된 모든 기술적 용어와 과학적 용어들은 당해 기술 분야(예들 들어, 세포 배양, 줄기 세포 생물학, 분자 유전학, 면역학, 면역조직화학, 단백질 화학, 및 생화학)의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 가지는 것으로 이해되어야 한다.
달리 언급되어 있지 않은 한, 본 발명에서 사용되는 재조합 단백질, 세포 배양 및 면역학적 기술들은 당업자들에게 잘 알려져 있는 표준적인 과정이다. 이러한 기술들은 J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), and J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons(현재까지 모든 업데이트 포함) 등의 문헌에 개시 및 예시되어 있다.
본 명세서에서, 용어 "치료하는", "치료한다" 또는 "치료"는 특정 상태의 한가지 이상의 증상을 감퇴 또는 없애는데 충분한 STRO-1+ 다능성 세포 및/또는 그의 자손세포의 치료학적 유효량의 투여를 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "예방하는", "예방한다" 또는 "예방"은 특정 상태의 한가지 이상의 증상의 진전을 중지 또는 방해하는데 충분한 STRO-1+ 다능성 세포 및/또는 그의 자손세포의 치료학적 유효량의 투여를 포함한다.
STRO-1 + 다능성 세포 또는 자손 세포
본 명세서에서 사용되는 문구 "STRO-1+ 다능성 세포"는 STRO-1+ 및/또는 다능성 세포 콜로니를 형성할 수 있는 TNAP+ 전구세포를 의미한다.
STRO-1+ 다능성 세포는 골수세포, 혈액, 치아속질 세포, 지방조직, 피부, 비장, 이자, 뇌, 신장, 간, 심장, 망막, 뇌, 모낭, 장, 폐, 림프절, 가슴샘, 뼈, 인대, 힘줄, 골격근, 진피 및 골막에서 발견되고; 및, 중배엽 및/또는 내배엽 및/또는 외배엽과 같은 생식선 내로 분화 가능하다. 따라서, STRO-1+ 다능성 세포는 이에 제한되지 않으나, 지방조직, 골조직, 연골조직, 탄성조직, 근육조직 및 섬유결합조직을 포함하는 무수한 세포형태로 분화할 수 있다. 특정한 혈통의 투입 및 이들 세포가 들어가는 분화경로는 기계적인 영향 및/또는, 성장인자, 사이토카인 및/또는 숙주조직에 의해 성립되는 국부적인 미세환경 조건과 같은 내재적인 생물학적 활성 인자로부터의 다양한 영향에 의존한다. 일 양태에서, STRO-1+ 다능성 세포는 줄기세포 또는 표현형 세포를 산출하도록 시간에 맞추어 비가역적으로 분화되는 전구세포인 딸세포를 산출하도록 분리된 비-조혈성 기원세포이다
다른 양태에서, STRO-1+ 다능성 세포는 대상 예를 들어 치료될 대상 또는 관련될 대상 또는 관련되지 않은 (동일종이거나 또는 이종인) 대상으로부터 수득한 시료로부터 농화된다. 용어 '농화된다', '농화' 또는 이의 변형어는 본원에서 무처리한 집단과 비교하여 한가지 특정 세포 유형의 비율이나 다수의 특정 세포유형들의 비율이 증가된, 세포 집단을 지칭한다.
다른 양태에서, 본 발명에 사용된 세포는 TNAP+, VCAM-1+, THY-1+, STR0-2+, CD45+, CD146+, 3G5+ 또는 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 개별적으로 또는 종합적으로 발현시킨다.
"개별적으로"는 본 발명이 마커 또는 마커의 그룹을 각기 별도로 포함하는 것과 상기 각각의 마커 또는 마커의 그룹이 개별적으로 본 명세서에 기재되었음에도 불구하고, 청구항은 서로 개별적이고 분리적으로 그러한 마커 또는 마커의 그룹을 정의할 수도 있다는 점을 의미한다.
"종합적으로"는 본 발명이 마커 또는 펩타이드의 그룹의 몇개 또는 조합을 포함한다는 것과, 상기 마커 또는 마커의 그룹의 몇개 또는 조합이 본 명세서에 특정되어 기재되지 않았다 하여도, 청구항은 상기 마커 또는 마커의 그룹의 모든 다른 조합으로부터 개별적이고 분리적으로 그러한 조합 또는 서브-조합을 정의할 수도 있다는 점을 의미한다.
바람직하게는, STRO-1+ 다능성 세포는 STRO-lbright(syn. STRO-lbri)이다. 바람직하게는, STRO-1bright세포는 부가적으로 TNAP+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+ 및/또는 CD146+ 중 한가지 이상이다.
일 양태에서, STRO-1+ 다능성 세포는 WO 2004/85630에 기재된 바와 같이 혈관주위 간엽 전구 세포(perivascular mesenchymal precursor cell)이다.
소정의 마커에 대해 "양성"이라고 할 수 있는 세포는 세포 표면에 존재하는 마커의 정도에 따라 상기 마커의 낮은(lo 또는 dim) 또는 높은(bright, bri) 수준으로 발현할 수도 있고, 상기 용어는 세포의 분류 과정에 사용되는 형광이나 그외 마커의 세기와 관련 있다. Io(또는 dim 또는 dull) 및 bri의 구별은 특정 세포 집단을 분류할 때 사용되는 마커 측면에서 이해될 것이다. 해당 마커에 대해 "음성"이라고 할 수 있는 세포는 상기 세포로부터 필연적으로 완전히 없다는 것은 아니다. 상기 용어는 상기 마커가 세포에서 비교적 매우 낮은 수준으로 발현된다는 것과, 검출가능하게 표지하거나 또는 상술한 배경값 수준이 검출 불가능할 때, 매우 낮은 시그널을 형성한다는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는, "bright"는 검출 가능하게 표지하였을 때 비교적 강한 신호를 형성하는 세포 표면상의 마커를 의미한다. 이론에 한정되지 않지만, "bright" 세포는 샘플에서 다른 세포보다 표적 마커 단백질(예, STRO-1에 의해 인식된 항원)을 더 많이 발현하는 것으로 제시된다. 예컨대, STRO-1bri 세포는 FACS 분석으로 결정된 바에 따라, FITC-접합된 STRO-1 항체로 표지하였을 때, 비-bright 세포(STRO-ldull/dim) 보다 형광 신호를 더 강하게 형성한다. 바람직하게는, "bright" 세포는 출발 샘플에 함유된 가장 밝게 표지된 골수 단핵구 세포를 약 0.1% 이상으로 포함한다. 다른 예에서, "bright" 세포는 출발 샘플에 함유된 가장 밝게 표지된 골수 단핵구 세포를 약 0.1%, 약 0.5% 이상, 약 1% 이상, 약 1.5% 이상 또는 약 2% 이상으로 포함한다. 바람직한 예에서, STRO-1bright 세포는 STRO-I- 라고 명명된 세포인 "배경값"에 비하여 STRO-1 표면 발현의 2 로그 배수 높은 발현을 나타낸다. 그에 비해, STRO-1dim 및/또는 STRO-1intermediate 세포는 2 로그배수 이하, 전형적으로 "배경값" 보다 약 1 로그배수 이하의 STRO-1 표면 발현을 보인다.
본원에서 사용되는 용어 "TNAP"는 조직 비-특이적 알칼리 포스파타제의 모든 이소형(isoform)을 포함하는 것으로 의도된다. 예컨대, 상기 용어는 간 이소형(LAP), 골 이소형(BAP) 및 신장 이소형(KAP)을 포함한다. 바람직한 양태에서, TNAP는 BAP이다. 특히 바람직하게는, 본원에 사용되는 TNAP는 부다페스트 조약 규정하에 2005년 12월 19일자로 ATCC에 기탁번호 PTA-7282로 기탁된 하이브리도마 세포주에서 생산되는 STRO-3 항체에 결합할 수 있는 분자를 일컫는다.
일 양태에서, 상기 STRO-1+ 다능성 세포는 클론원성(clonogenic) CFU-F로 생장할 수 있다.
바람직하기로는, STRO-1+ 다능성 세포의 상당 비율은 적어도 2종 이상의 상이한 생식세포로 분화할 수 있다. 다능성 세포가 예정될 수 있는 계통에 대한 비제한적인 실시예에서는, 골 전구세포; 담관 상피 세포 및 간 세포로 될 수 있는 다능성 간 세포 선조체; 희소돌기아교 세포(oligodendrocyte) 및 성상 세포(astrocyte)로 진행되는 아교세포 전구 세포를 만들 수 있는 신경 한정 세포; 신경으로 진행되는 신경 전구세포; 심장 근육 및 심근 세포에 대한 전구세포, 글루코스-반응성 인슐린 분비성 췌장 β 세포주가 있다. 그외 계통으로는, 상아질모세포(odontoblast), 상아질-생산 세포 및 연골세포, 및 하기 세포의 전구 세포를 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다: 망막색소 상피 세포, 섬유모세포, 각질 세포와 같은 피부 세포, 수지상 세포(dendritic cell), 모낭세포, 신관(renal duct) 상피 세포, 평활근 및 골격근 세포, 고환 선조체, 혈관내피 세포, 힘줄, 인대, 연골, 지방 세포, 섬유모세포, 골수 기질(marrow stroma), 심장 근육, 평활근, 골격근, 혈관주위 세포(pericyte), 혈관, 상피, 아교, 신경, 성상 세포 및 희소돌기아교 세포.
다른 양태에서, 상기 STRO-1+ 다능성 세포는 배양시 조혈 세포가 될 수 없다
일 양태에서, 상기 세포는 치료할 대상으로부터 수득하고, 표준방법으로 시험관내 환경에서 배양되며, 자가 또는 동종이형의 조성물로서 대상에게 투여되기 위하여 상층액 또는 수용성 인자 또는 증식된 세포를 수득하는데 사용된다. 선택적인 양태에서, 작제된 인간의 세포주의 하나 이상의 세포가 사용된다. 본 발명의 다른 유용한 양태에서, 비-인간 동물(또는 환자가 인간이 아닌 다른 종이라면)의 세포가 사용된다.
또한, 본 발명은 STRO-1+ 다능성 세포 및/또는 시험관내 배양을 통해 생성되는 이들의 자손 세포(후자는 또한 증폭된 세포(expanded cell)라고도 함)로부터 유래되어 수득한 상층액 또는 가용성 인자의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 증폭된 세포는 배양 조건(배양 배지내 자극성 인자의 수 및/또는 타입을 포함함), 계대 횟수 등에 따라 매우 다양한 표현형을 가질 수 있다. 특정 양태에서, 자손 세포는 모 개체군으로부터 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 또는 약 10번 계대 배양한 후 수득된다. 그러나, 자손 세포는 모 개체군으로부터 임의 횟수의 계배 배양한 후 수득할 수도 있다.
자손 세포는 임의의 적정 배지에서 배양함으로써 수득할 수 있다. 본원에서 세포 배양에 대해 사용되는 용어 "배지"는 세포를 둘러싼 환경 구성 성분들을 포함한다. 배지는 고체, 액체, 가스 또는 상의 혼합물 및 물질일 수 있다. 배지는 액체 생장 배지뿐만 아니라 세포 생장을 지지하지 않는 액체 배지도 포함한다. 또한, 배지는 아가, 아가로스, 젤라틴 및 콜라겐 기질 등의 젤라틴성 배지를 포함한다. 기체 배지의 구현예에서는 페트리 접시(petri dish) 또는 다른 고체 또는 반고체 지지(support) 상에서 생장하는 세포가 노출되는 기체 상을 포함된다. 또한 용어 "배지"는 세포와 접촉되지 않더라도, 세포 배양에 사용되도록 의도된 물질도 지칭한다. 즉, 박테리아 배양용으로 제조된 영양분이 풍부한 액체(nutrient rich liquid)도 배지이다. 물이나 다른 액체와 혼합하였을 때 세포 배양에 적합하게 되는 가루 혼합물은 "분말 배지"로 지칭할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 자손 세포는 STRO-3 항체로 표지된 자기(magnetic) 비드를 이용하여 골수에서 TNAP+ STRO-1+ 다능성 세포를 분리하여 수득한 다음, 분리된 세포를 배양하여 증폭시켰다(적절한 배양 조건의 구현예에서는 Gronthos et al. Blood 85: 929-940, 1995 참조).
일 양태에서, 그러한 증폭된 (자손) 세포(바람직하게는, 최소 5회 계대 배양한)는 TNAP-, CC9+, HLA 클래스 I+, HLA 클래스 II-, CD14-, CD19-, CD3-, CD11a-c-, CD31-, CD86-, CD34- 및/또는 CD80-일 수 있다. 그러나, 전술한 조건과 다른 배양조건에서는 여러 가지 마커의 발현은 바뀔 수 있다. 또한, 이러한 표현형의 세포는 증폭된 세포 집단에서 우위를 점할 수 있지만, 이러한 것이 이러한 표현형(들)을 가지지 않는 세포의 비율이 소수라는 것을 의미하진 않는다(예로, 증폭된 세포에서 적은 비율은 CC9-일 수 있음). 바람직한 일 구현예에서, 증폭된 세포는 여전히 여러 가지 세포 타입으로 분화할 수 있는 능력을 가진다.
일 양태에서, 상층물 또는 가용성 인자, 또는 세포 자체를 수득하기 위하여 사용되는 증폭된 세포 집단은, 세포의 25% 이상, 더욱 바람직하기로는 50% 이상이 CC9+인 세포를 포함한다.
다른 양태에서, 상층물 또는 가용성 인자 또는 세포 자체를 수득하기 위하여 사용되는 증폭된 세포 집단은, 세포의 40% 이상, 더욱 바람직하기로는 45% 이상이 STRO-1+인 세포를 포함한다.
추가적인 양태에서, 자손 세포는 LFA-3, THY-1, VCAM-1, ICAM-1, PECAM-1, P-셀렉틴, L-셀렉틴, 3G5, CD49a/CD49b/CD29, CD49c/CD29, CD49d/CD29, CD90, CD29, CD18, CD61, 인테그린 β, 6-19, 트롬보모듈린(thrombomodulin), CD10, CD13, SCF, PDGF-R, EGF-R, IGF1-R, NGF-R, FGF-R, 렙틴-R, (STRO-2 = Leptin-R), RANKL, STRO-1bright 및 CD146으로 이루어진 군으로부터 종합적으로 또는 개별적으로 선택되는 하나 이상의 마커 또는 이들 마커의 조합을 발현할 수 있다.
일 양태에서, 자손 세포는 국제특허공개 WO 2006/032092에서 정의된/정의되거나 설명된 다능성 증폭된 STRO-1+ 다능성 세포 자손(MEMPs)이다. 자손이 유래될 수 있는 STRO-1+ 다능성 세포의 농화된 집단을 제조하는 방법은 국제특허공개 WO 01/04268 및 WO 2004/085630에 기재되어 있다. 시험관 내에서, STRO-1+ 다능성 세포는 절대적으로 순수한 조제물로서 존재하기는 어려우며, 일반적으로 조직 특이적으로 예정된 세포(tissue specific committed cell, TSCC)인 다른 세포와 같이 존재할 것이다. 국제특허공개 WO 01/04268에는, 골수 유래 세포를 약0.1% 내지 90%의 순도로 수득하는 방법이 기재되어 있다. 자손이 유래되는 MPC를 포함하는 집단은 직접 조직 원천으로부터 수확되거나, 또는 생체 외(ex vivo)에서 이미 증폭된 집단일 수도 있다.
예를 들어, 자손은 이들이 존재하는 집단의 총 세포 중 약 0.1, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 95% 이상을 차지하는, 수확된, 미증폭의 실질적으로 정제된 STRO-1+ 다능성 세포로부터 수득할 수 있다. 이러한 수준은 예컨대 TNAP, STRO-1bright, 3G5+, VCAM-1, THY-1, CD146 및 STRO-2로 이루어진 군으로부터 개별적으로 또는 종합적으로 선택되는 한가지 이상의 마커에 양성인 세포를 선별함으로써, 달성할 수 있다.
MEMP는 마커 STRO-1bri에 대해 양성이고 마커 알카리 포스파타제(ALP)에 대해 음성이라는 점에서 막 회수한 STRO-1+ 다능성 세포와 구별할 수 있다. 반면, 막 분리한 STRO-1+ 다능성 세포는 STRO-1bri와 ALP에 모두 양성이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 투여되는 세포 중 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상은 표현형 STRO-1bri, ALP-를 가진다. 더 바람직한 구현예에서, MEMP는 마커 Ki67, CD44 및/또는 CD49c/CD29, VLA-3, α3β1 중 1종 이상에 대해 양성이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, MEMP는 TERT 활성을 나타내지 않으며/않거나, 마커 CD18에 음성이다.
STRO-1+ 다능성 세포 출발 집단은 WO 01/04268 또는 WO 2004/085630에 기재된 임의의 하나 이상의 조직 타입, 즉 골수, 치수세포(dental pulp), 지방 조직 및 피부, 또는 보다 광의적으로는 지방 조직, 치아, 치수, 피부, 간, 신장, 심장, 망막, 뇌, 모낭, 장, 폐, 비장, 림프절, 흉선, 췌장, 뼈, 인대, 골수, 힘줄 및 골격근으로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 실시에 있어서, 임의의 소정의 세포 표면 마커를 보유하고 있는 세포는 여러 가지 많은 방법으로 분리할 수 있지만, 바람직한 방법은 관심 마커에 대한 결합제(예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 단편)의 결합에 의존적이며, 높은 수준의 결합, 낮은 수준의 결합을 보이거나 또는 결합성이 없는 것을 분리된다. 가장 편리한 결합제는 항체 또는 항체 기반의 분자이며, 바람직하게는 이러한 후자 물질의 특이성 때문에 단일클론 항체이거나 또는 단일클론 항체를 기본으로 한다. 항체는 두 가지 단계에 이용할 수 있지만, 다른 물질 또한 사용할 수 있으므로, 이러한 마커에 대한 리간드 역시 채택하여 이들을 보유하거나 보유하지 않는 세포를 농화시킬 수 있다
항체 또는 리간드를 조 분리(crude separation)가 가능하도록 고형 지지체에 부착시킬 수 있다. 분리 기법은, 바람직하기로는, 수집된 분획의 생장성 유지를 최대화하는 방법이다. 여러 가지 효능의 다양한 기법을 채택하여 적절하게 조 분리물을 수득할 수 있다. 적용되는 특정 기법은 분리 효율, 관련된 세포독성, 수행 용이성 및 속도, 및 정교한 장치 및/또는 기술 능력의 필요성에 따라 결정될 것이다. 분리 과정은, 항체-코팅된 자기 비드를 이용하는 자기 분리, 친화성 크로마토그래피 및 고상 매트릭스에 부착된 항체를 이용한 "패닝(panning)"을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다. 정확한 분리를 제공하는 기법은 FACS가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. FACS를 수행하는 방법은 당업자에게 자명할 것이다.
본 명세서에 기술된 각 마커에 대한 항체는 상업적으로 입수가능하고, ATCC 또는 다른 기탁기관으로부터 입수 가능하며 및/또는 공지된 기술을 사용하여 생산될 수 있다.
STRO-1+ 다능성 세포 분리 방법은, 예컨대 STRO-1의 고수준 발현을 인식하는 MACS를 활용하는 제1 단계의 고상 분류 단계를 포함하는 것이 바람직하다. 이후 제2 단계가 수반될 수 있으며, 특허 WO 01/14268에 개시된 바와 같이, 전구세포의 발현 수준을 더 높이는 것이 바람직하다. 이러한 제2의 분류 단계는 2종 이상의 마커를 사용하는 단계를 포함할 수 있다.
STRO-1+ 다능성 세포 수득 방법은 제1 농화 단계 전에 공지된 기법으로 세포의 공급원을 수확하는 단계를 포함할 수도 있다. 따라서, 조직은 수술로 적출될 것이다. 공급원 조직을 포함하는 세포는, 이후 이른바 단일 세포 현탁물로 분리될 것이다. 이러한 분리는 물리적 및/또는 효소적인 방식으로 달성될 수 있다.
적합한 STRO-1+ 다능성 세포 집단이 수득되고 나면, MEMP를 수득하기 위한 임의의 적합한 방식으로 배양 또는 증폭시킬 수 있다.
일 구현예에서, 세포는 치료받을 대상으로부터 채취되고, 표준 기법으로 시험관 내에서 배양한 후, 이를 이용하여 상기 대상에게 자기(autologous) 또는 동종 조성물(allogeneic composition)으로서 투여하기 위한 상층물 또는 가용성 인자 또는 증폭된 세포를 수득한다. 다른 구현예에서, 상층물 또는 가용성 인자를 얻기 위하여 1종 이상의 확립된 인간 세포주의 세포들이 이용된다. 본 발명의 다른 유용한 구현예에서, 상층물 또는 가용성 인자를 얻기 위하여, 인간을 제외한 동물(또는 환자가 인간이 아니고 다른 종인 경우)의 세포가 이용된다.
본 발명은 인간을 제외한 영장류의 세포, 유제류(ungulate), 개과 동물(canine), 고양이과 동물(feline), 토끼목(lagomorph), 설치류, 조류 및 어류의 세포 등의, 인간을 제외한 모든 동물 종 유래의 세포를 이용하여 실시할 수 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 영장류 세포로는, 침팬지, 비비, 시노몰구스 원숭이 및 임의의 그외 신세계 또는 구세계 원숭이의 세포가 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 사용할 수 있는 유제류 세포로는 소, 돼지, 양, 염소, 말, 버팔로 및 비손(bison)의 세포가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 사용할 수 있는 설치류 세포로는 마우스, 랫, 기니아 피그, 햄스터 및 저빌쥐(gerbil)가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 사용할 수 있는 토끼목 동물의 구현예로는 토끼, 잭 토끼(jack rabbit), 산토끼(hare), 흰꼬리 토끼(cottontails), 눈신 토끼(snowshoe rabbit) 및 새앙토끼(pika)가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 닭(Gallus gallus)은 본 발명에서 사용할 수 있는 조류의 일 예이다.
본 발명의 방법에 사용가능한 세포는 사용 전에 또는 상층물 또는 가용성 인자를 얻기 전에 보관될 수 있다. 진핵 세포, 특히 포유류 세포의 보존 및 저장 방법과 프로토콜은 당업계에 잘 알려져 있다(비교, 예를 들어, Pollard, J. W. and Walker, J. M. (1997) Basic Cell Culture Protocols, Second Edition, Humana Press, Totowa, N.J.; Freshney, R. I. (2000) Culture of Animal Cells, Fourth Edition, Wiley-Liss, Hoboken, N.J.). 간엽 줄기/선조 세포 등의 분리된 줄기세포 또는 이의 자손의 생물학적 활성을 유지시키는 임의 방법들을 본 발명에 적용할 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 세포는 동결-보존을 이용하여 유지 및 저장된다.
투여 및 조성물
투여되는 STRO-1+ 다능성 세포 또는 그의 자손의 투약은 개체의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중과 같은 인자들에 따라 변경할 수 있다. 투약 요법은 최적의 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 1회 볼루스(bolus) 투여하거나, 시간을 초과하여 다수의 분할된 용량으로 투여하거나, 또는 용량을 치료 상태의 위급성에 따라 비례적으로 감소 또는 증가시킬 수 있다. 투여 용이성 및 투약 균일성을 위해 투약 단위 형태로 비경구 조성물을 제형화하는 것이 유리할 수 있다. "투약 단위 형태"는 본원에서 처리할 개체에게 단일 투약으로서 조절된 물리적으로 분리된 단위를 의미하며; 각 단위는 필요한 약학 담체와 조합하여 원하는 치료 효과를 형성하도록 계산된 활성 화합물의 미리 결정된 양을 포함한다.
일 양태에서, 투여된 STRO-1+ 다능성 세포의 투약은 0.1 내지 4.0×106 세포수의 범위에서 수행한다. 상기 투약은 예를 들어, 0.5×106 세포수일 수도 있다.
STRO-1+ 다능성 세포 및/또는 그의 자손은 추간판 강에 추가되기 전에, 다양한 형태(예를 들어, 용액, 현탁액, 고체, 다공체, 직물체, 부직포, 미립자, 겔, 페이스트 등)로 가공되는 것이 적합하다.
손상된 추간판에 정상의 기계적 및/또는 생리학적 특성을 회복시키기 위하여, 수 많은 생물학적 및 합성된 물질이 STRO-1+ 다능성 세포 및/또는 그의 자손과 동시투여되기 위하여 고려된다. 예를 들어, 하나 이상의 천연 또는 합성 글리코사미노글리칸(GAGs) 또는, 예를 들어 이전의 변화 및 다른 것에서 보듯이, 그들의 생리학적 염을 포함하는 히알루론산(hyaluronic acid, HA), 콘드로이탄 황산염(chondroitan sulfate), 더마탄 황산염(dermatan sulfate), 케라탄 황산염(keratan sulfate), 헤파린(heparin), 헤파린 황산염(heparin sulfate), 갈락토사미노글리쿠론글리칸 황산염(galactosaminoglycuronglycan sulfate, GGGS)와 같은 뮤코폴리사카라이드는 수핵내로 직접적으로 주사될 수도 있다. HA는 윤활세포에 의한 내인성 HA 합성과 연골세포에 의한 프로테오글리칸 합성을 자극하는 역할을 수행하고, 연골퇴화 효소의 분비를 억제하며; 또한, 연골퇴화의 일정부분을 수행하는 것으로 알려진 산소 자유라디칼의 제거제로서 활동하는 것이 제시되었다. 주사 가능한 콘드로이틴 황산염과 글루코사민은 관절 연골퇴화의 과정을 유사하게 저해하는 것으로 나타났다. 거의 틀림없이, 다른 GAG는 퇴화성 추간판 질병을 앓고 있는 추간판으로 주사하기 위한 이상적인 환경을 그들에게 만들어주는 치료적 가치를 가지는 유사한 예방성 또는 회복성 특징을 제공할 수도 있다. GAG의 또 다른 가치있는 특성은 물을 끌어 모아 유지하는 그들의 강력한 능력이다. 따라서, 이후에 속질핵의 흡인으로부터 생성되는 공간안으로 주사되거나 또는 선택적으로 보충물로서 현존하는 속질핵에 추가할 수도 있는 점성의 겔을 형성하도록 GAG를 물 또는 다른 수용성 물질과 혼합하는 것이 적절할 수도 있다. 천연 "히드로겔"은 삼차원 구조의 공간을 충진하고, 구겨짐에 저항하고, 추간판이 움직임과 관련된 충격을 적절하게 흡수하도록 하는 충진물질로서 작용할 수 있도록 형성될 수 있다.
예를 들어, Euflexxa®(Ferring Pharmaceuticals) 또는 Restylane®(Q-Med Aktiebolag Co., 스웨덴)과 같은 합성된 히알루론 겔은 본 발명에 사용하기에 적합하다.
의료등급의 실리콘을 포함하는 보조 투여제로서 사용될 수 있는 다른 주사가능한 합성 물질예 예는 Bioplastique®(폴리비닐피롤리돈 담체에 현탁된 고체 실리곤 입자; Uroplasty BV, Netherlands), Arteplast®(젤라틴 담체에 현탁된 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA)의 미소구체; Artcs Medical, USA), Artecoll®(송아지 연골 담체에 현탁된 민무늬 PMMA 구체; Artepharma Pharmazeu Tische, GMBH Co., Germany)이다. 추가로, 합성 히드로겔 조성물은 추간판에 정상형태를 회복하게 하고, 이에 의하여 정상적인 생-기계적 기능을 회복하게 하는 충진 물질로서 사용될 수도 있다.
공지된 연골보호능을 가지는 항산화제 역시 속질핵 내로 주사하기 위한 후보물질이다. 이들의 예시는 토코페롤(비타민 E), 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(SOD), 아스코르브산염(비타민 C), 카탈라제 및 다른 것을 포함한다. 추가로, 알진산 나트륨 및 그의 유사체 또한 주사용으로서 본 명세서에서 고려된다. 추가적으로, 재조합 뼈형성 단백질-1(OP-1)은 속질핵과 섬유테 세포에 의해 프로테오글리칸 풍부 기질의 형성을 촉진하는 그의 능력으로 인하여, 주사용으로서 좋은 후보물질이다.
합성 주사제의 사용 또한 고려된다. 이들은 기본적인 목적이 추간판에 생-기계적 기능을 회복하려는 것인 경우에 특별히 적용될 수 있다. 히알루론산 단독으로 또는 다른 글리코사미노글리칸과 조합하여 생물학적으로 활성인 물질을 배달하는 담체로서 사용될 수도 있다. 바람직한 양태에서, 히알루론산 및/또는 다른 GAG는 STRO-1+ 다능성 세포 또는 그의 자손세포를 위한 담체로서 이용된다. 히알루론산/GAG 조성물의 농도와 점도는 주어진 목적에 적합하도록 정례적으로 조절된다.
또 다른 실시예에서, STRO-1+ 다능성 세포 또는 그의 자손세포는 피브린 글루와의 혼합물로서 전달될 수도 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "피브린 글루"는 칼슘이온의 존재하에서 피브린 중합체의 가교에 의하여 형성되는 불용성 기질을 의미한다. 상기 피브린 글루는 피브리노겐, 그의 유도체 또는 그의 대사체, 피브린(가용성 단량체 또는 중합체) 및/또는 피브린 기질을 형성하는 생물학적 조직 또는 용액으로부터 유도된 그의 복합체로부터 형성될 수 있다. 선택적으로, 상기 피브린 글루는 피브리노겐, 그의 유도체 또는 그의 대사체 또는 재조합 DNA 기술에 의해 생산된 피브린으로부터 형성될 수도 있다.
또한, 피브린 글루는 피브리노겐과 피브린 글루 형성 촉매(예, 트롬빈 및/또는 팩터 XIII)와의 상호작용에 의해 만들어질 수 있다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 피브리노겐은 촉매(예, 트롬빈)의 존재시 단백질이 절단됨으로써 피브린 단량체로 변환된다. 피브린 단량체는 이후 가교되어 피브린 글루 매트릭스를 형성할 수 있는 폴리머를 형성할 수 있다. 피브린 폴리머의 가교는 팩터 XIII과 같은 촉매의 존재에 의해 증진될 수 있다. 피브린 글루 형성의 촉매는 혈장, 동결침전물(cryoprecipitate) 또는 피브리노겐이나 트롬빈을 포함하고 있는 그외 혈장 분획으로부터 유래될 수 있다. 또는, 촉매는 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다.
응괴 형성율(clot formation rate)은 피브리노겐과 혼합된 트롬빈의 농도에 의존한다. 효소 의존적인 반응으로, 온도가 높을수록(최대 37℃), 응괴 형성율은 빨라진다. 응괴의 인장 강도는 사용되는 피브리노겐의 농도에 의존적이다.
히알루로난의 존재하에서 피브린 응괴가 생성될 때, 가교 기질과 반응하고 서로 맞물리게 된다. 이러한 기질은 조직 재생에 주된 역할을 수행하고, 조직 복구에서 세포 조절기능을 수행하는 것으로 알려져 있다(참조: Weigel PH, Fuller GM, LeBoeuf RD., (1986) A model for the role of hyaluronic acid and fibrin in the early events during the inflammatory response and wound healing. J Theor Biol. 119: 219-34). 히알루로난의 용해속도 역시 이러한 GAG의 치료효과를 연장시키는데 유리한 Ha-피브린 기질에서 연장된다(참조: Wadstrom J and Tengblad A (1993) Fibrin glue reduces the dissolution rate of sodium hyaluronate. Upsala J Med Sci. 98: 159-167).
몇 가지 공개문헌들에 치료제의 전달을 위한 피브린 글루의 사용이 개시되어 있다. 실례를 들면, 미국 특허 4,983,393에는 아가로스, 아가, 염수 용액, 글리코사미노글리칸, 콜라겐, 피브린 및 효소를 포함하는 질내 삽입물로서 이용하기 위한 조성물이 개시되어 있다. 또한, 미국 특허 3,089,815에는 피브리노겐 및 트롬빈으로 구성된 주사용 약리학적 조제물이 개시되어 있으며, 미국 특허 6,468,527에는 체내 특정 부위에 다양한 생물학제 및 비-생물학제의 전달을 용이하게 하는 피브린 글루가 개시되어 있다. 그러나, 피브린 + 히알루로난 + STRO-1+ 동종이형세포의 연골분화의 촉진의 사용은 종래에 기술되지 않았다.
STRO-1+ 다능성 세포 및/또는 그의 자손세포를 포함하는 상기 조성물은 추간판 강에 "외과적으로 추가"된다. 이는, 상기 물질이, 신체의 자연적인 성장 또는 재생과정에 의하여 "추가"되는 것과는 구별되는, 의료종사자의 간섭에 의하여 추가되는 것이다. 비록 추간판 내부로 콜라겐-기반 물질을 도입하는 다른 외과적 방법이 사용될 수도 있으나, 상기 외과적 과정은 바람직하게는 피하주사바늘을 통해 주입하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 확장된 환형 개구부를 통한 압출, 카테터를 통한 주입, 외상 또는 외과적 절개로 형성된 개구부를 통한 삽입, 또는, 추간판 강내로 상기 물질의 침습 또는 최소한의 침습성 침착의 다른 수단에 의하여, 상기 물질은 추간판내로 도입될 수도 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 세포 조성물을 이용한 치료를 개시하기 전에, 환자의 면역을 억제하는 것이 필수가 아니거나 또는 바람직하지 않을 수 있다. 실제로, 본 명세서에 나타난 결과는, 면역억제제가 없더라도 양에서 동종이형의 STRO-1+ 다능성 세포의 이식을 잘 견딜수 있다는 것을 보여준다.
그러나, 다른 경우에, 세포 치료를 개시하기 전에 환자의 면역을 약물학적으로 억제하는 것이 바람직하거나 적절할 수도 있다. 이는 전신성 또는 국소 면역억제제를 이용하여 달성할 수 있으며, 또는 캡슐화된 장치를 통해 세포를 전달함으로써 수행할 수 있다. 세포는, 세포가 필요로 하는 영양분과 산소, 그리고 치료학적 인자는 투과 가능하지만, 면역 체액성 인자와 세포는 비투과성인, 캡슐에 캡슐화될 수 있다. 바람직하게는, 캡슐화제는 저자극성이며, 표적 조직에 용이하고 안정적으로 위치시킬 수 있으며, 이식된 구조물에 추가적인 보호를 제공한다. 이식된 세포에 대한 면역반응을 감소 또는 없애기 위한 이러한 및 다른 방법들은 당업계에 공지되어 있다. 대안적인 예로, 세포를 유전자 변형하여 이의 면역원성을 낮출 수 있다.
STRO-1+ 다능성 세포 또는 그의 자손세포는 다른 유리한 의약 또는 생물학적 분자(성장인자, 영양인자)와 함께 도입되는 것이 적절할 것이다. 다른 제제와 함께 도입될 때, 그들은 단일 약제학적 조성물 또는 분리된 약제학적 조성물의 형태로, 다른 제제와 동시에 또는 순차적으로(다른 제제의 도입 이전 또는 이후에) 함께 도입될 수도 있다. 함께 도입될 수도 있는 생물학적 활성인자는 항-세포자멸 제제(예를 들어, EPO, EPO 미메티바디, TPO, IGF-I 및 IGF-II, HGF, 카스파제 억제제); 항염제(예를 들어, p38 MAPK 억제제, TGF-베타 억제제, 스타틴류, IL-6 및 IL-I 억제제, 페미로라스트, 트래니라스트, 레미케이드, 시롤리무스, 및 NSAIDs(비스테로이드성 항염제; 예를 들어, 테폭살린, 톨메틴, 수프로펜); 면역억제/면역조절제(예를 들어, 사이클로스포린, 타크롤리무스와 같은 칼시뉴린 억제제); mTOR 억제제(예를 들어, 시롤리무스, 이베롤리무스); 항-증식제(예를 들어, 아자티오프린, 마이코페놀레이트 모페틸); 코르티코스테로이드(예를 들어, 프레드니솔론, 히드로코르티존); 단클론 항-IL-2R알파 수용체 항체(예를 들어, 바실릭시맵, 다클리주맵), 다클론 항-T-세포 항체(예를 들어, 항-티모사이트 글로불린(ATG))과 같은 항체; 항-림파구 글로불린(ALG); 단클론 항-T 세포 항체(0KT3); 항-혈전제(예를 들어, 헤파린, 헤파린 유도체, 유로키나제, PPack(덱스트로페닐알라닌 프롤린 아르기닌 클로로메틸케톤), 항트롬빈 화합물, 혈소판 수용체 길항제, 항-트롬빈 항체, 항혈소판 수용체 항체, 아스피린, 다이피리다몰, 프로타민, 히루딘, 프로스타글란딘 억제제 및 혈소판 억제제); 및 항산화제(예를 들어, 프로부콜, 비타민 A, 아스코르빈산, 토코페롤, 코엔자임 Q-IO, 글루타치온, L-시스테인, N-아세틸시스테인)에 더하여 국소 마취제를 포함한다.
유전적으로 변형된 세포
일 양태에서, STRO-1+ 다능성 세포 및/또는 그의 자손세포는, 예를 들어, 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 트립시노겐, 키모트립시노겐, 엘라스타제, 카르복시펩티다아제, 췌장 리파제 또는 아밀라제, 또는 향상된 혈관신생과 관련되거나 또는 이의 원인이 되는 폴리펩티드, 또는 췌장세포 또는 혈관세포내의 세포분화에 관련된 폴리펩티드와 같은 치료적 및/또는 예방적인 장점을 제공하는 관심있는 단백질을 발현 및/또는 분비하도록, 유전적으로 변형된다.
세포를 유전적으로 변형시키는 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 세포에서 발현되는 핵산은 세포에서 발현을 유도하는 프로모터와 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 상기 핵산은 예를 들어 CMV 프로모터(예를 들어, CMV-IE 프로모터) 또는 SV-40 프로모터와 같은 바이러스 프로모터와 같은, 환자의 다양한 세포에서 작동가능한 프로모터에 연결된다. 추가적인 적절한 프로모터는 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 양태에 준용해서(mutatis mutandis) 적용할 수 있을 것이다.
바람직하게는, 상기 핵산은 발현 작제물의 형태로 제공된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "발현 작제물"은 세포내에서, 작동가능하게 연결된 핵산(예를 들어, 리포터 유전자 및/또는 계수 선별가능한 리포터 유전자)을 발현하게 하는 능력을 가지는 핵산을 의미한다. 본 발명의 범주 내에서, 발현 작제물은 플라스미드, 박테리오파아지, 파제미드, 코스미드, 바이러스 보조 유전체 또는 유전제 단편, 또는 발현가능한 형태로 이종 DNA를 유지 및/또는 복제할 수 있는 다른 핵산을 포함할 수도 있는 것으로 이해된다.
본 발명을 수행하기 위한 적절한 발현 작제물을 작제하는 방법은 당업자에게 자명할 것이고, 예를 들어, Ausubel et al(In: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987) 또는 Sambrook et al (In: Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001)에 서술되어 있다. 예를 들어, 발현 작제물의 각 구성요소는 예를 들어 PCR을 사용하여 적절한 주형 핵산으로부터 증폭되고, 이어 예를 들어 플라스미드 또는 파제미드와 같은 적절한 발현 작제물로서 클로닝된다.
이러한 발현 작제물에 적절한 벡터는 당업계에 공지 및/또는 본 명세서에 기재되어 있다. 예를 들어, 포유동물 세포에서 본 발명의 방법에 적합한 발현 벡터는 예를 들어 인비트로젠에서 제공하는 pcDNA 벡터 세트의 벡터, pCI 벡터 세트의 벡터(Promega), pCMV 벡터 세트의 벡터(Clontech), pM 벡터(Clontech), pSI 벡터(Promega), VP 16 벡터(Clontech) 또는 pcDNA 벡터 세트의 벡터(Invitrogen)이다.
당업자는 추가적인 벡터 및 예를 들어 인비트로젠 코포레이션, 클론텍 또는 프로메가와 같은 이들 벡터의 판매처를 인식하고 있을 것이다.
단리된 핵산분자 또는 발현을 위해 세포내로 동일한 것을 포함하는 유전자 작제물을 도입하는 수단은 당업자에게 공지되어 있다. 주어진 생물체에 사용된 기술은 공지된 성공적인 기술에 의존한다. 제조합 DNA를 세포내에 도입하는 수단은 미세주입술, DEAE-덱스트란 매개 형질전환, 리포펙타민(Gibco, MD, USA) 및/또는 셀펙틴(Gibco, MD, USA)과 같은 리포좀 매개 형질전환, PEG-매개 DNA 도입술, 전기천공법 및 다른 것들 사이에서도 DNA-코팅된 텅스텐 또는 금입자를 사용하는 것과 같은 미립자 충돌법을 포함한다.
선택적으로, 본 발명의 발현 작제물은 바이러스 벡터이다. 적절한 바이러스 벡터는 당업계에 공지되어 있고, 상업적으로 입수 가능하다. 숙주 세포 게놈으로의 핵산의 전달 및 핵산의 도입을 위한 상업적인 바이러스-기반 시스템은 예를 들어 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 아데노-연관 바이러스 벡터를 포함한다. 선택적으로, 아데노바이러스 벡터는 숙주세포 내에 염색체 부체를 남기는 핵산을 도입하는데 유용하다. 바이러스 벡터는 표적 세포 및 조직에 유전자를 전달하기 위한 유효하고 다재다능한 방법이다. 추가적으로, 높은 신호전달 효율이 많은 서로다른 세포형 및 표적 조직에서 관찰되었다.
예를 들어, 일반적으로 레트로바이러스 벡터는 외부 서열의 6-10kb까지 패키징할 능력을 갖는 시스-액팅 긴 말단반복서열(long terminal repeats, LTRs)을 포함한다. 최소의 시스-액팅 LTRs은 벡터의 복제와 패키징하기에는 충분하고, 그런 다음 장기간 동안 발현시키도록 표적 세포로 발현 작제물을 도입하는데 사용된다. 광범위하게 사용되는 레트로바이러스 벡터는 MuLV(murine leukemia virus), GaLV(gibbon ape leukemia virus), SrV(simian immunodeficiency virus), HIV(human immunodeficiency virus) 및 이들의 조합에 기초한 것들을 포함한다(참조: 예를 들어, Buchscher et al, J Virol. 56: 2731-2739 (1992); Johann et al, J. Virol. 55: 1635-1640 (1992); Sommerfelt et al, Virol. 76: 58-59 (1990); Wilson et al, J. Virol. 63: 274-2318 (1989); Miller et al, J. Virol. 65: 2220-2224 (1991); PCT/US94/05700; Miller and Rosman BioTechniques 7: 980-990, 1989; Miller, A. D. Human Gene Therapy 7:5-14, 1990; Scarpa et al Virology 75: 849-852, 1991; Burns et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 8033-8037, 1993).
다양한 AAV(adeno-associated virus) 벡터 시스템 또한 핵산 전달용으로 개발되었다. AAV 벡터는 당업계에 이미 공지된 기술을 사용하여 작제될 수 있다. 예를 들어, 미국특허등록 제5,173,414호 및 5,139,941호; 국제특허공개 WO 92/01070 및 WO 93/03769; Lebkowski et al. Molec. Cell. Biol. 5: 3988-3996, 1988; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter Current Opinion in Biotechnology 5: 533-539, 1992; Muzyczka. Current Topics in Microbiol, and Immunol. 158: 97-129, 1992; Kotin, Human Gene Therapy 5: 793-801, 1994; Shelling and Smith Gene Therapy 7: 165-169, 1994; 및 Zhou et al. J Exp. Med. 779: 1867-1875, 1994를 참조하라.
본 발명의 발현 작제물을 전달하기 위해 유용한 추가적인 바이러스 벡터는 예를 들어, 백시니아 바이러스 및 아비앙 폭스바이러스 또는 알파바이러스와 같은 바이러스의 폭스 패밀리로부터 유도된 것을 포함하거나, 또는 (예를 들어, Fisher-Hoch et al, Proc. Natl Acad. ScL USA 5(5): 317-321, 1989)에 기재된)바이러스 벡터를 활용한다.
본 발명은 STRO-1+ 다능성 세포의 투여를 수반하는 대상의 추간판을 치료 및 재구성하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 추간판이 퇴화된 척추증상의 치료에 유용하다.
도 1. 모든 양 그룹에서 STRO-1 세포로 치료된 허리 척추층의 개략도.
도 2. 방사선학적으로 결정된 추간판 높이 색인(Disc Height Index, DHI).
적은 용량(A) 및 많은 용량(B)의 STRO-I 세포가 수용된 양의 그룹에 대하여, 기저선 및 퇴화가 유도된 콘드로이티나제 ABC 주사후 3개월(3mth pre-STRO-I 세포)에서 X-선 결정된 평균±SEM 추간판 높이 색인(DHI).
도 3: 콘드로이티나제 ABC가 주사된 추간판을 위한 MRI로 결정된 응집체의 추간판 퇴화점수.
콘드로이티나제 ABC 주사 이후, 3개월(A) 또는 6개월(B)동안 적은 용량의 STRO- 1 + HA 또는 HA 단독으로 치료하기 이전, MRI로 결정된 응집체의 추간판 퇴화 점수의 평균±SEM.
도 4: 콘드로이티나제 ABC 주사된 추간판용 MRI로 결정된 응집체의 추간판 퇴화 점수.
콘드로이티나제 ABC 주사 이후, 3개월(A) 또는 6개월(B)동안 적은 용량의 STRO- 1 + HA 또는 HA 단독으로 치료하기 이전, MRI로 결정된 응집체의 추간판 퇴화 점수의 평균±SEM.
도 5: 응집체의 조직병리학적 추간판 퇴화점수.
적은 용량의 STRO-I 세포용의, 3개월(A) 및 6개월(B)된 응집체의 조직병리학적 추간판 퇴화점수의 평균.
# = 대조군으로부터의 유의한 차이 p < 0.001. Ω = STRO-1+ 세포로부터의 유의한 차이 p< 0.01
도 6: 응집체의 조직병리학적 추간판 퇴화점수.
많은 용량의 STRO-I 세포용의, 3개월(A) 및 6개월(B)된 응집체의 조직병리학적 추간판 퇴화점수의 평균.
# = 대조군으로부터의 유의한 차이 p < 0.001. Ω = STRO-1+ 세포로부터의 유의한 차이 p< 0.01
도 7: 응집체 MRI 추간판 퇴화점수.
3개월(A) 및 6개월(B)된 적은 용량의 STRO-I 세포용의 응집체 MRI 추간판 퇴화점수.
# = 대조군으로부터의 유의한 차이 p < 0.05. Ω = STRO-1+ 세포로부터의 유의한 차이 p< 0.05
도 8: 응집체 MRI 추간판 퇴화점수.
3개월(A) 및 6개월(B)된 많은 용량의 STRO-I 세포용의 응집체 MRI 추간판 퇴화점수.
# = 대조군으로부터의 유의한 차이 p < 0.05. Ω = STRO-1+ 세포로부터의 유의한 차이 p< 0.05
도 9: 속질핵(NP)의 조직병리학적 퇴화 점수.
3개월(A) 및 6개월(B)된 적은 용량의 STRO-I 세포용의 NP의 조직병리학적 퇴화 점수의 평균.
도 10: 속질핵(NP)의 조직병리학적 퇴화 점수.
3개월(A) 및 6개월(B)된 많은 용량의 STRO-I 세포용의 NP의 조직병리학적 퇴화 점수의 평균.
도 11. 속질핵을 위한 생화학적으로 결정된 글리코사미노글리칸(GAG) 함량.
3개월(A) 및 6개월(B)된 적은 용량 또는 많은 용량의 STRO-I 세포로 주사된 추간판의 속질핵을 위한 생화학적으로 결정된 글리코사미노글리칸(GAG) 함량의 평균 ± 표준편차.
# = 대조군으로부터의 유의한 차이(p < 0.05).
도 12. 방사선학적으로 결정된 추간판 높이 색인(DHI).
A: HA 또는 HA + 적은 용량의 STRO-I 세포가 주사된 후 3개월 및 6개월된, 콘드로이티나제 ABC로 유도된 퇴화 추간판을 위한 X-선으로 결정된 평균 ± SEM 추간판 높이 색인(DHI).
B: HA 또는 HA + 많은 용량의 STRO-I 세포가 주사된 후 3개월 및 6개월된, 콘드로이티나제 ABC로 유도된 퇴화 추간판을 위한 X-선으로 결정된 평균 ± SEM 추간판 높이 색인(DHI).
실시예
실시예 1: 실험설계
진행성 추간판 퇴화를 시작하도록 24마리의 양의 3개의 인접한 허리 추간판(정상적인 L3-L4, L4-L5 및 L5-L6)으로 1.0 IU의 콘트로이티나제 ABC(cABC)(Seikagaku Corporation, Japan)를 주사하였다. 나머지 허리 추간판(정상적인 L1-L2 및 L2-L3)은 cABC가 주사되지 않았고, 일반 대조군으로 간주되었다. cABC를 주사하고 15주(±3주)가 경과한 후에, 많고 적은 용량(각각 4×106 또는 0.5×106세포수)으로 STRO-1+ 다능성 세포의 주사, 또는 동일부피의 Euflexxa® 히알루론산(Ferring Pharmaceuticals)과 혼합된 ProFreeze™ NOA 동결배지(Lonza Walkersville Md.)를 추간판의 속질핵에 직접적으로 투여하였다(표 1). 동물들은 주사후 3개월 또는 6개월에 희생되었다. 도 1은 연구에 사용된 척추층 및 치료용 프로토콜을 나타내는 모식도이다.
연구계획 요약
그룹 N 추간판
(명칭)		 15±3주
기저선 이전		 기저선
0일		 Tx 희생시 분석
1 n=6 L1-L2 주사안함 주사안함 3개월 조직학/생화학
적은 용량 L2-L3 주사안함 주사안함 3개월 조직학/생화학
3개월 L3-L4 콘드로이티나제 STRO-1+ 세포수 0.5x106 3개월 조직학/생화학
L4-L5 콘드로이티나제 주사안함 3개월 조직학/생화학
L5-L6 콘드로이티나제 HA 및 NAO 3개월 조직학/생화학
2 n=6 L1-L2 주사안함 주사안함 3개월 조직학/생화학
많은 용량 L2-L3 주사안함 주사안함 3개월 조직학/생화학
3개월 L3-L4 콘드로이티나제 STRO-1+ 세포수 4x106 3개월 조직학/생화학
L4-L5 콘드로이티나제 주사안함 3개월 조직학/생화학
L5-L6 콘드로이티나제 HA 및 NAO 3개월 조직학/생화학
3 n=6 L1-L2 주사안함 주사안함 6개월 조직학/생화학
적은 용량 2-L3 주사안함 주사안함 6개월 조직학/생화학
6개월 3-L4 콘드로이티나제 STRO-1+ 세포수 0.5x106 6개월 조직학/생화학
4-L5 콘드로이티나제 주사안함 6개월 조직학/생화학
5-L6 콘드로이티나제 HA 및 NAO 6개월 조직학/생화학
4 n=6 L1-L2 주사안함 주사안함 6개월 조직학/생화학
많은 용량 2-L3 주사안함 주사안함 6개월 조직학/생화학
6개월 3-L4 콘드로이티나제 STRO-1+ 세포수 4x106 6개월 조직학/생화학
4-L5 콘드로이티나제 주사안함 6개월 조직학/생화학
5-L6 콘드로이티나제 HA 및 NAO 6개월 조직학/생화학
실시예 2: 면역적으로 선별된 STRO -1 + 다능성 세포의 증식
본 실험에 사용된 STRO-1+ 다능성 세포는 프렌치 쉽(French Sheep)으로부터 유래되었고, Lonza(USA)에서 입수하였다. 골수(BM) 흡인물은 양으로부터 수득하였고, BM 단핵세포(BMMNC)는 본질적으로 종래의 기술에 따라 제조하였다(US 2005-0158289).
이어서, STRO-1+ 다능성 세포는 앞서 기술된 바와 같은 자성 세포분류법에 따라 STRO-3 항체를 이용하여 단리되었다(WO2006/108229).
실시예 3: 방사선학
동물은 다음의 시간에서 유도마취의 조건하에서 허리척추에서 얻어진 방사선 사진술이 계획되었다: 0일(cABC의 주사), 시험 물품 투여일(허리 추간판 퇴화의 유도 이후 15±3주) 및 시험 물품의 이식 이후 3개월 및 6개월. 방사선 사진술의 평가는 앞서 기술된 바와 같이, IVD의 내측, 중앙 및 외측부로부터의 측정값의 평균화 및 인접한 추간체 높이의 평균값으로 이를 나눈 값에 의하여 산출된 추간판 높이 색인(DHI)를 사용하여 중립적인 관찰자에 의해 실시되었다(참고문헌 24).
실시예 4: 자기공명이미지(MRI)
MRIs는, 콘드로이티나제 ABC의 주사에 의한 추간판 퇴화의 유도 이후 약 15주 및 HA 또는 적은 용량의 HA + STRO-1+(Tx)의 층판내 주사로 치료하기 전에, 마취상태에서 모든 양의 허리척추에서 수행되었다. 치료 후 3개월 및 6개월과, 부검(Nx)이전에, 척추 MRI는 모든 양에서 다시 수행되었다.
영상화는 두 개의 MRI 스캐너 중의 하나를 이용하여 수행되었다. MRIs는 Numaris 33G 소프트웨어를 이용한 1.5 T Siemens VISION MRI 스캐너를 사용하여, STRO-1+의 도입 이전에 수행되었다. MRIs는 syngo Bl 3 소프트웨어를 이용한 1.5 Tesla Siemens AVANTRO MRI 스캐너를 사용하여 STRO-1+ 세포의 도입 이후에 수행되었다. 국소화 스캔(localizing scan)은 Tl, Tl 그래디언트 에코(Gradient echo, Tl Flash), T2 및 STIR 강조하에서, 허리 및 천골 척추의 화살표 이미지 부분에서 수행되고, 6개의 추간판 수준(L6/S1 L5/L6, L4/L5, L3/L4, L2/L3, L1/L2)의 T2 강조된 축방향 영상화에 의해 수행되었다. 이미지 서열은 일련의 12개의 화살표 이미지와 같이 각 스캔 결과가 나열된 CD로 제공되었다. 12개의 화살표 MRI 획득 섹션을 위해 수득한 디지털화된 이미지는 표 2에 요약된 추간판 퇴화 점수화 시스템(참고문헌 25)을 위한 페르만 등(Pferrmann et al)의 분류기준을 사용하여 두 명의 중립적이고 자격이 있는 관찰자에 의해 검토되었다. 최종 점수는 두 명의 중립적인 평가자로부터의 점수의 평균에 상응하였다.
페르만 등급 시스템을 이용한 양의 추간판 퇴화 점수화 시스템의 MRI 분류(참고문헌 25)
조
불균일함, 회색 내지 검은색 불균일함,검은색
4 5
유 분
불명확함 손실됨
2 3
호 기
극 한뇌수에동하 한중간 미약한
2 3
상정상 내지 약간 감소됨 정상 내지 중간정도로 감소됨 붕괴된 추간판 강
2 3 4
실시예 5: 조직병리학적 분석
조직학적 및 생화학적 분석용으로 가공된 추간판 유닛은 골거(bone saw)를 갖는 성장판에 근처에서, 인접한 두개의(cranial) 척추체 및 꼬리(caudal)의 척추체를 통한 절단에 의해 각각 분리되었다. 이들 척추분절은 56시간 동안 Histochoice®내로 일괄적으로 고정되고, Faxitron HP43855A X-레이 캐비닛(Hewlett Packard, McMinnville, USA)을 사용하여 완전한 칼슘제거가 확인될 때까지 일정하게 교반하면서 2주 동안 5% 중성 완충 포르말린에 10% 포름산을 여러번 교환하면서 칼슘을 제거하였다.
칼슘이 제거된 시료는 파라핀 포매 및 절단을 위한 표준적인 조직학적 방법으로 가공되었다. 4미크론 두께의 파라핀 박편은 수퍼프로스트 플러스 글래스 마이크로스코프 슬라이드(Superfrost Plus glass microscope slid)(Menzel-Glaser)에 올려졌고, 85℃에서 30분 이후, 55℃에서 하룻밤 동안 건조되었다. 상기 박편은 자일론에서(4회×2분) 파라핀이 제거되고, 물을 가한 다단계 에탄올 세척(100 내지 70%, v/v)을 통해 재수화되었다. 시상절편(sagittal slices)으로부터 제조된 모든 블록으로부터 하나의 단편은 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색되었다. 상기 H&E 염색된 조직학적 단편은 암호화되고 퇴화의 정도를 평가하도록, 이미 발표된 4점 세미-정량등급 시스템(참조: 표 3)을 사용하는 독립적이고 중립적인 조직병리학자에 의하여 재검토되었다(참고문헌 26). Neutral Red로 염색된 Alcian Blue counter를 포함하는 추가적인 착색염색 또한 추간판 단편에서 기질 구성요소의 분포 및 조립을 확인하는데 사용되었다.
하부 허리 추간판(BEP 골종판, CEP 연골종판)에서 조직학적 변화의 등급 시스템
등급 섬유테 속질핵 연골종판 여백/연골하골

1		 정상 라멜라
좁은 라멜라간 기질
정상 테 부착
외측 1/3에만 혈관		 동질성
균열없음		 균일한 두께
뼈에 정상부착
깊이의 <1/5의 균일한 석회화
균일한 세포분포		 BEP의 동일한 두께
라멜라 뼈에 단독
CEP를 갖는 분명한 틈
미약한 CEP로의 혈관침습

2
소수의 라멜라 분열 및 해체
소수의 기질확장
수복반응 없는 부착 테병변(Rim lesion)의 소수의 해체		 소수의 균열
소수의 세포괴사
테의 소수의 후방이동
소수의 콘드론(chondrone) 형성		 소수의 연골감소
작은 가로지르는 틈새
석회화된 영역의 불균일한 비후
미약한 침입하는 혈관채널
적은 콘드론		 약하게 동일하지 않은 BEP
슈몰결절
BEP의 최소의 리모델링
작은 가장자리 골증식체(osteophyte)

3		 중간수준의 기질확장
부착부의 중간의 틈새형성
외측 1/3 최소의 연골모양 화생을 수반하지 않는 누액의 방출
소수의 수복병변을 가지는 외측 및 중앙 1/3 테병변에서의 낭변성 혈관		 중간수준의 균열
중간수주의 세포괴사
낭변성
테안으로의 후방이동
콜라겐의 구심성 확장
중간수준의 콘드론형성		 명확한 연골감소
석회화된 영역의 명확한 비후
많은 가로지르는 틈새
많은 혈관채널
많은 콘드론		 중간수준의 동일하지 않은 BEP
혈관 슈몰결절
중간수준의 잔기둥 비후
뼈 라멜라의 결손
골수강에서 최소한의 섬유화 조직
중간크기의 골증식체

4
광범위한 라멜라 해체
외측 1/3내로 확장되는 누액의 방출
광범위한 연골모양 화생
모든 영역에서의 혈관
주목할만한 수복병변을 가지는 테병변		 핵의 완전한 손실
유리체(loose body) 형성
명확한 콘드론형성		 연골의 전체손실
잔여 연골의 석회화
광범위한 틈새형성		 현저한 동일하지 않은 BEP
골화된 슈몰결절
큰 골증식체
현저한 잔기둥 비후
골수강에서 현저한 섬유화
연골형성
실시예 6: 고정된 추간판 조직의 생화학적 분석
중앙의 시상절편(sagittal slices)이 조직학적 연구를 위해 제거된 후, 섬유테(AF) 및 속질핵(NP)은 나머지 가공된 칼슘이 제거된 추간판 조직으로부터 주의깊게 절제되었다. 이러한 가공은 NP와 AF 사이의 경계선이 손실된 극도로 퇴화된 추간판에서는 더욱 어렵다. 미세하게 절단된 NP 및 AF 조직의 부분표본은 동일 중량으로 동결건조되었고, 건조된 조직의 3개 영역(1-2 mg)은 16시간 동안 110℃에서 6M HCl에서 가수분해되었다. 중화된 분해물의 부분표본은 종래의 방법과 같이 조직 콜라겐 함량의 측정을 위해 히드록시프롤린으로 분석되었다(참고문헌 4). 동결건조된 조직의 3개 영역(대략 2 mg)은 또한 파파인으로 분해되었고, 부분표본은 종래의 방법과 같이 메타염색질성 색소(metachromatic dye)인 1,9-디메틸메틸렌 블루를 사용하여 황화된 글리코사미노글리칸을 위해 분석되었다(참고문헌 27).
실시예 7: 자료의 통계적 분석
3개월 및 6개월 치료그룹 전체를 위한 DHI 및 생화학적 자료의 통계적 비교는 p<0.05의 유의수준으로 스튜던트 언페어 티검정법(Student's unpaired t-test)을 사용하여 착수되었다. 조직학적 및 MRI 응집체 퇴화 및 NP 점수를 측정하기 위해, 다양한 추간판 치료간의 비교는 듄 멀티플 컴패리즌 포스트 혹 테스트(Dunn's multiple comparison post hoc test)와 함께 크러스칼-왈리스 또는 프리드먼 테스트(Kruskal-Wallis or Friedman Tests, nonparametric repeated measures ANOVA)를 사용하여 착수되었다. 그룹간의 통계적 유의성은 p<0.05이었다.
실시예 8: 면역적으로 선별된 STRO -1 + 다능성 세포를 이용한 양의 추간판 재생연구의 결과
많은 용량(4.0×106 STRO-1+ 세포수)(그룹 2 및 4)과 적은 용량(0.5×106 STRO-1+ 세포수)(그룹 1 및 3)으로 주사된 그룹의 모든 동물은 정상적인 체중을 유지하였고, 실험기간이 경과한 후에 부정적인 부작용이 관찰되지 않았다.
도 2에 도시된 바와 같이, 표적 추간판의 NP 내로의 화학핵소체 용해제(chemonucleolytic agent)인 콘드로이티나아제 ABC의 주사는 3개월 경과시 추간판 높이 색인(DHI)에서 거의 50%로 감소하게 된다: 추간판 세포외 기질로부터 PGs와 물의 유의한 손실을 확인하였다. 상기 DHI 치료 전 데이터는 MRI 응집체 추간판 퇴화 점수에 의해 뒷받침되었다. 도 3 및 4에서 보듯이, 모든 그룹에서, 콘트로이티나제 ABC를 주사하지 않은 대조군 추간판은, 모델의 유효성을 확정하는 콘트로이티나제 ABC를 주사한 추간판 점수의 대부분 50%인 MRI 퇴화 점수를 제공하였다.
적은 용량으로 STRO-1+ 세포 주사 후 3개월에 희생된 동물의 추간판에서 결정된 평균 조직병리학적 등급 점수의 응집체는 cABC 또는 cABC+HA의 어느 것도 주사되지 않은 대조군 추간판과 유의하게 상이하지 않은 점수로 감소됨을 보여주었다. 그러나, 나중의 2개 점수는 대조군 추간판 점수보다도 유의하게(p<0.001) 높았다(도 5A). 치료 후 6개월에 희생된 적은 용량 STRO-1+ 세포 그룹에서는, 추간판 점수가 cABC 및 cABC+HA 주사된 추간판보다도 유의하게(p<0.01) 낮았으나, 아무것도 주사되지 않은 추간판 점수와는 동등하였다(도 5B). 이러한 양상은 3개월된 많은 용량으로 STRO-1+ 세포를 주사한 경우에는 유지되었으나(p<0.05)(도 6A), 주사 후 6개월된 경우에는 유지되지 않았다(도 6B).
아무것도 주사되지 않은 대조군, cABC, cABC+HA 및 cABC+ STRO-1+ 세포가 각각 주사된, 3개월된 적은 용량의 양 및 6개월된 적은 용량의 양의 조직학적 단편의 현미경사진을 그들 각각의 조직병리학적 점수와 함께 분석하였다. 이러한 분석은 cABC 도입 후 다양한 추간판 내로의 치료로부터 야기된 뚜렷한 조직적 및 세포적 변화를 강조하였다. 또한, 추간판 구조적 완전성의 표준화 및 세포의 적은 용량 도입에 이은 6개월의 새로운 세포외 기질의 축적에 의해 보여진 것처럼, STRO-1+ 세포에 의해 매개된 장점을 도시하였다. 비록, 이들 조직학적 단편은 그들의 다양한 조직병리학적 점수에 기초하여 선별되었으나, 그들은 도 5에 요약된 모든 3개월 및 6개월 적은 용량 그룹에서 얻어진 전체적인 평균 응집체 점수와 일치하였다.
추간판 조직병리학적 점수는 MRI 평가 추간판 퇴화 점수에 상보적이었다. 더욱이, 모든 그룹의 MRI 점수는, 사용된 용량과는 상관없이 cABC + STRO-1+ 세포의 추간판 및 대조군의 추간판의 점수보다도, cABC 단독 및 cABC+HA 주사된 추간판의 높은 점수를 나타내는 것과 동일한 유형을 나타내었다. 그러나, MRI 퇴화 점수와 관련하여, cABC+HA에 비하여 3개월 및 6개월 적은 용량 STRO-1+ 세포 주사된 추간판 점수 둘 다에서 유의한 차이(p<0.05)가 관찰되었다(도 7A 및 7B). 많은 용량으로 주사된 STRO-1+ 세포에 대한 MRI 점수는 3개월된 대조군, cABC 단독 또는 cABC+HA 값과는 유의한 차이를 나타내지 않았으나, 6개월이 경과된 cABC 단독 값에는 미치지 못하였다(도 8A 및 8B).
이들 실험에서 사용된 추간판 퇴화의 실험모델이 NP 내로의 PG 중합체 분해효소인 콘드로이티나제-ABC의 직접적인 주사로 인하여 유도되었기 때문에, 이들 영역에 대한 조직병리학적 점수는 별도로 보여진다. 추가로, NP 조직의 다양한 치료에 반응하여 발생되는 생화학적 변화가 또한 제공된다. 도 9 및 10에서 명백한 것처럼, cABC + STRO-1+ 세포가 주사된 추간판에 대한 평균 NP 조직병리학적 점수는, cABC 및 cABC+HA 주사된 추간판의 전체적인 추간판 조직병리학적 점수가 더 높은 퇴화점수를 나타내는 것과 동일한 양상을 나타내었다. 그러나, 사용된 소규모 그룹크기(N=6)내의 동물 시료간의 변이 때문에, 차이점은 통계적으로 유의적이지 않았다.
방사선학적으로 결정된 DHI는 추간판 퇴화의 색인으로 승인되었다(참고문헌 24). 이미 논의된 바와 같이, DHI는 PG 중합체 분해효소인 cABC의 추간판 내로의 주사 이후 3개월동안 약 50%까지 감소되었다.
추간판 NP 조직의 글리코사미노글리칸(GAG) 함량(PGs의 마커로서)의 생화학적 결정은 아무것도 주사되지 않은 대조군의 추간판에 비하여, 모든 치료된 추간판에서 이들 구성요소의 상당한 손실을 보여주었다(도 11). 모든 그룹에서 대조군의 NP 조직에 비하여, cABC 및 cABC+HA 조직에서 GAG 수준이 유의한 차이(p<0.05)를 나타내는 반면, 3개월된 많은 용량의 STRO-1+ 세포가 주사된 추간판과 6개월된 적은 용량의 STRO-1+ 세포가 주사된 추간판은 대조군에 대하여 통계적으로 차이가 없었다(도 11).
도 12에서 알 수 있는 바와 같이, 모든 주사된 추간판은 그들의 치료와는 상관없이 치료된 후 3개월 경과시에 그들의 DHI가 일부 회복됨을 보여주었다. 그러나, DHI에 있어서 가장 큰 개선은 상기 개선 정도가 통계적으로 유의함(p<0.02)을 보여주었던 적은 용량의 STRO-1+ 세포를 주사한 추간판에 있었다. 더욱이, 6개월된 적은 용량의 STRO-1+ 세포가 주사된 추간판의 DHI는 아무것도 주사되지 않은 대조군 추간판 DHI 평균값과 유의하게 다르지 않았다(도 12A).
논의
본 발명의 실험결과는 퇴화된 추간판 내로 적은 용량의 STRO-1+ 세포 및 HA의 추간판 내 투여가 HA가 주사된 추간판보다도 더욱 크게 구조적 회복을 증진시켰음을 보여준다. 이러한 결론은 추간판 통합의 3개의 독립적인 평가에 의한 실험 데이터, 및 정상적인 추간판 높이 인덱스의 50%에 상응하는 퇴화상태 기준선으로부터의 기질 회복에 의하여 뒷받침되었다.
6개월 이상 추간판에 주사된 적은 용량 STRO-1+ 세포에서 관찰되는 DHI의 증가는 재구성된 세포외기질의 퇴화된 추간판 내부의 축적에 의하여 설명할 수 있다. 건강한 척추에서 추간판의 높이(DHI)는 PGs 및 이와 결합된 물분자가 고농도로 속질핵 및 내측-섬유 내에 존재함으로 인해 유지된다(참고문헌 2, 4). 이러한 내용물은 추간판에, 추간판의 높이를 유지할 뿐만 아니라, 축방향의 압축 후에 추간판이 변형으로부터 회복되게 하는 높은 수화 압력을 부여한다(참고문헌 2, 4). 실제로, 이러한 동물 모델에서 추간판 퇴화를 유도하는 콘드로티나제-ABC의 사용은 선택적으로 퇴화시키고, NP의 세포외 기질 및 내측 AF로부터 PGs의 대부분을 제거하는 상기 효소의 능력에 의존한다(참고문헌 28). 음성 전하를 띠는 PGs에 결합하는 알시안 블루 염색약을 사용한 조직학적 연구는 이들 조직에서 PGs의 고농도의 존재를 확인하는, cABC+HA가 주사된 추간판 분절의 cABC 단독보다도 더욱 진한 염색을 나타내는 적은 용량의 STRO-1+ 세포가 주사된 추간판으로부터 수득된 분절을 보여주었다. 백색 및 형광 현미경에 의한 이들 염색된 분절의 평가 역시 AF 콜라겐 피브릴 조립체의 라멜라 구조뿐만 아니라 히알린 연골종판(CEP) 형상의 정상화를 확정한다. 상기 CEP는 비혈관성 NP 내로 영양 확산의 주된 경로이고, 그의 구조의 물리적 파괴는 정주세포의 생존을 감소시킨다.
GAG 함량으로부터 생화학적으로 결정된 NP에서 PGs의 농도는 조직병리학적 발견을 부분적으로만 지지하였다. 3 및 6개월에 높고 적은 용량의 STRO-1+ 세포가 주사된 NP의 GAG 함량은 다른 치료된 추간판과는 달리, 대조군 NP와 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 그러나, cABC+ STRO-1+ 세포가 주사된 추간판에서의 GAG 수준과 cABC 또는 cABC+HA 추간판의 NP의 것 사이의 통계적 차이는 이들 그룹의 조직 내로 GAG의 비교 가능한 수준으로 제시함을 나타내었다. 생화학적 분석을 위해 사용된 추간판 조직은 생화학적 분석을 수행하기 전에 몇 개월 동안 완충된 포르말린으로 미리 고정되었기 때문에, PGs의 변화되는 양이 지금 시점에서 기질의 외부로 침출되는 것이 가능하다. 추가로, 포르말린 고정과정 동안 형성된 콜라겐과 단백질의 공유결합적인 가교가 서로 추간판의 NP 및 AF 영역의 적절한 거시적인 차이 및 정밀분석을 손상시켰을 수도 있다. 상기 정밀분석은 NP와 AF 사이의 경계가 손상된 퇴화된 추간판에서 특히 어려웠다. 추간판 AF는 NP보다도 현저히 적은 GAG 함량을 가지고, 이로 인한 시료채취의 오류는 분석 자료상에 현저한 영향을 주었다(참고문헌 1-4).
실험적으로 생성된 퇴화된 IVD의 속질핵 내로의 고분자 히알루론산(HA)과 같은 적절한 담체와 함께 양의 STRO-1+ 다능성 세포의 투여는 추간판 높이의 회복에 의한 방사선 사진술 적으로 평가함으로써, 추간판 세포외 기질의 재생을 촉진시킴을 본 실험에서 보여주었다. 이는, 가득한 척추에서 추간판의 높이는 이들 구조에 높은 수화 압력을 부여하는 고농도의 기질 프로테오글리칸 및 그들이 결합하는 물분자와 함께 NP 및 내측-섬유에 존재함으로 인하여 유지된다는 추정에 근거하여 해석된다. 실제로, 이들 실험의 시작시에 추간판의 퇴화를 유도하는 콘트로이티나아제-ABC의 용도는 NP 세포외 기질로부터 대부분의 프로테오글리칸을 분해 및 제거할 수 있는 상기 효소의 능력에 의존한다.
본 발명의 결과는, cABC의 초기 주사에 의해 유도된 퇴화상태로부터의 추간판의 회복이 STRO-1+ 세포를 많은 용량(4.0×106) 보다는 적은 용량(0.5×106)으로 처리할 경우에 더욱 지속된다는 점을 보여주었다. 이러한 관찰에 대한 가능한 해석은, O2/CO2의 교환 및 CEP의 아래측 혈관 사이의 대사체에 의존적인 추간판의 NP에 대한 제한된 영양 공급과 관련될 수 있다(참고문헌 1, 2). 앞서 설명하였듯이, 추간판 퇴화시에 일어나는 것처럼 보이는 NP와 CEP 사이의 접점의 어떠한 조그만 분열 및 척추골의 연골밑 혈액공급의 어떠한 조그만 붕괴라도 NP에 대한 영양 공급을 손상시킬 수 있다. 이러한 영양결핍은 그들의 생존성을 상실하게 하는 이러한 산소-결핍 환경에서 생존하게 하여 결과적으로 치료효과를 나타내게 하는 주사된 STRO-1+의 수의 상한선을 제공할 수 있다.
적은 용량의 STRO-1+ 다능성 세포의 투여에 이은 이들 모델 동물에서 추간판 완전성을 위한 원인적인 치료 기작은 아직 해결되기 않았다. 그러나, 퇴화된 추간판 강내의 STRO-1+ 다능성 세포에 의해 방출된 항-염증성 사이토카인과 성장인자는 생화학적 및 생-기계적 손상에 응하여 상주하는 추간판 세포에 의해 방출된 사이토카인 및 다른 유해성 인자에 의해 매개되는 이전 이화작용 및 동화작용 억제 효과를 조절하게 되는 것이 가능하다. 추간판으로 주사된 몇몇 비-STRO-1+ 세포에서 가끔 보여지는 것처럼, 이들 STRO-1+ 다능성 세포로부터 유래된 주변분비 인자 또한 그들의 세포외 환경으로부터 PGs의 고갈에 대한 상주하는 추간판 세포의 정상 생리학적 동화반응을 지지한다. 반면, 몇몇 STRO-1+ 다능성 세포는 퇴화 기질 내로 주입할 수도 있고, NP 연골세포 또는 다른 추간판 세포로 분화되는 것도 가능하다.
당업자라면, 광범위하게 기재된 본 발명의 사상 및 범위를 이탈하지 않고 구체적인 구현예로 나타낸 본 발명에 대해 다양한 변형 및/또는 개량이 이루어질 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 본 발명의 구현예는 모든 측면에서 예시적으로 간주되며, 제한적인 것은 아니다.
본 명세서에서 논의되고 및/또는 인용되는 모든 문헌은 그 전체가 본 발명에 포함된다.
본 발명의 명세서에 포함된 문헌, 수행, 재료, 기구, 물품 등의 모든 논의는 본 발명의 정황을 제공하기 위한 목적일 뿐이다. 임의의 또는 모든 이러한 것들이, 본 출원의 각 청구항의 우선일 전에 존재하기에, 본 발명과 관련된 분야의 종래 기술 기반의 일부를 형성하거나 또는 공통된 일반적인 지식임을 용인하는 것은 아니다.

Claims (8)

  1. 추간판에 STRO-1+ 다능성 세포 및/또는 그의 자손세포를 투여하는 단계를 포함하는, 대상의 추간판을 재구성하거나 및/또는 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 STRO-1+ 다능성 세포 및/또는 그의 자손세포는 추간판의 속질핵내로 투여하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 STRO-1+ 다능성 세포는 또한 TNAP+(STRO-3), VCAM- 1+, THY-1+, STR0-2+, D45+, CDl 46+, 3G5+ 또는 그들의 조합에 양성인 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 STRO-1+ 다능성 세포는 동종이형체로부터 유래된 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG)을 추간판에 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 GAG는 히알루론산(hyaluronic acid, HA), 콘드로이탄 황산염(chondroitan sulfate), 더마탄 황산염(dermatan sulfate), 케라탄 황산염(keratan sulfate), 헤파린(heparin), 헤파린 황산염(heparin sulfate) 및 갈락토사미노글리쿠론글리칸 황산염(galactosaminoglycuronglycan sulfate, GGGS)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 대상이 추간판이 퇴화된 척추증상을 가지는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 척추증상은 허리통증(low back pain), 추간판의 연령에 따른 변화 또는 척추분리증(spondylolysis)인 것인 방법.
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