KR20170068540A - 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 주형 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 변형시키기 위한 방법, 특히 나노 세공 서열 분석을 이용하여 그 특징을 규명하기 위한 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 주형으로부터 복수 개의 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성시킨다. 이어서, 이와 같이 변형된 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명할 수 있다.
Description
본 발명은 주형 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 변형시키기 위한 방법, 특히 나노 세공 서열 분석을 이용하여 그 특징을 규명하기 위한 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 주형으로부터 복수 개의 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성시킨다. 이어서, 이와 같이 변형된 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명할 수 있다.
핵산 라이브러리를 제조해야 하는 많은 상업적 상황이 있다. 이는 종종 트랜스포사제(transposase)를 사용하여 달성된다. 상기 라이브러리를 제조하기 위해 사용되는 트랜스포사제에 따라서, 라이브러리를, 예를 들어 서열 분석에 사용할 수 있기 전에 시험관 내에서 전위 현상을 복구시키는 것이 필요할 수 있다.
현재, 광범위한 응용 분야에 걸쳐 신속하고 저렴한 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 또는 RNA) 서열 분석 및 확인 기술이 필요하다. 기존 기술은 주로, 다량의 폴리뉴클레오티드를 생성하기 위해 증폭 기술에 의존하고 시그널 검출을 위한 다량의 전문 형광 화학물질을 필요로 하기 때문에 느리고 비용이 많이 든다.
막횡단 세공 (나노 세공)은 중합체 및 각종의 작은 분자에 대한 직접 전기 바이오센서(biosensor)로서 큰 잠재력을 가지고 있다. 특히, 최근에는 잠재적인 DNA 서열 분석 기술로서 나노 세공에 초점이 맞추어져 왔다.
전위가 나노 세공에 걸쳐 인가될 때, 분석물, 예컨대 뉴클레오티드가 특정 기간 동안 배럴에 일시적으로 존재할 때 전류 흐름 상의 변화가 있다. 뉴클레오티드의 나노 세공 검출은 공지된 시그너처(signature)의 전류 변화와 지속 기간을 제공한다. 가닥 서열 분석 방법에서는, 단일 폴리뉴클레오티드 가닥이 상기 세공을 관통하고 뉴클레오티드의 실체가 도출된다. 가닥 서열 분석은 세공을 통한 폴리 뉴클레오티드의 이동을 제어하기 위한 폴리뉴클레오티드 결합성 단백질의 사용을 포함할 수 있다.
본 발명자들은 놀랍게도, 복수 개의 더 짧은 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성하기 위하여 주형 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 것이 가능하다는 것을 입증하였다. 이와 같이 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 헤어핀 루프(hairpin loop) 또는 단일 가닥 리더 서열을 포함할 수 있다. 이들 변형은 상기 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 각각을, 예컨대 가닥 서열 분석에 의해 그 특징을 규명하는 것이, 원래의 주형 폴리뉴클레오티드보다 더 용이하도록 설계될 수 있다. 연속해서 상기 변형된 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명함으로써, 주형 폴리뉴클레오티드의 특질을 보다 용이하게 결정할 수 있게 된다.
본 발명의 변형 방법은 MuA 트랜스포사제, MuA 기질의 집단 및 폴리머라제를 이용하고, 이는 도 1에 요약되어 있다. MuA 기질은 반대 가닥에 오버행 및 헤어핀 루프를 포함한다. MuA 트랜스포사제는 주형 폴리뉴클레오티드를 단편화할 수 있고 양 말단에 오버행을 수반한 단편을 생성할 수 있다. MuA 트랜스포사제는 또한, 기질을 이중 가닥 단편의 한 말단 또는 양 말단에서의 오버행에 라이게이션할 수 있다. 오버행을 수반하지 않은 기질의 가닥은 전형적으로, 오버행을 수반한 단편의 가닥에 라이게이션된다. 이로써 생성되는 이중 가닥 구축물에는 단일 가닥 갭이 남게 된다. 이중 가닥 구축물은 또한, 이러한 갭으로부터의 반대 가닥에 헤어핀 루프를 갖는다.
폴리머라제는 주형으로서 헤어핀 루프를 포함하는 가닥을 사용할 수 있고 단일 가닥 갭을 함유하는 가닥을 옮겨놓을 수 있다. 이로써 생성되는 이중 가닥 구축물은 주형 폴리뉴클레오티드의 단편을 함유하는 두 상보적 가닥을 함유한다. 이러한 구축물 내의 두 가닥은 분리시킬 수 있고, 바람직하게는 이들 두 가닥을 동시에 주형으로서 사용하여, 주형 폴리뉴클레오티드의 단편을 포함하는 2개의 이중 가닥 구축물을 생성할 수 있는데, 상기 두 가닥은 헤어핀 루프에 의해 연결된다.
따라서, 본 발명은
(a) 주형 폴리뉴클레오티드를, 각각 (i) 적어도 하나의 오버행 및 (ii) 이러한 적어도 하나의 오버행을 포함하는 가닥으로부터 반대 가닥에 적어도 하나의 헤어핀 루프를 포함하는 이중 가닥 MuA 기질의 집단 및 MuA 트랜스포사제와 접촉시켜, 이러한 트랜스포사제가 주형 폴리뉴클레오티드를 단편화하고 기질을 이중 가닥 단편의 한 말단 또는 양 말단에 라이게이션함으로써, 복수 개의 단편/기질 구축물이 생성되도록 하는 단계;
(b) 상기 단편/기질 구축물을 폴리머라제와 접촉시켜, 이러한 폴리머라제가 오버행을 포함하는 가닥을 옮겨놓고 이들을, 헤어핀 루프를 포함하는 가닥을 보완하는 가닥으로 대체시킴으로써, 각각 주형 폴리뉴클레오티드의 이중 가닥 단편을 포함하는 복수 개의 이중 가닥 구축물을 생성시키도록 하는 단계; 및
(c) 이중 가닥 구축물의 두 가닥을 분리시키고 이러한 가닥을 주형으로 사용하여, 각각 적어도 하나의 헤어핀 루프에 의해 연결된 두 상보적 가닥을 포함하는 복수 개의 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 형성시키는 단계
를 포함하는, 주형 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 다음을 제공한다:
- 본 발명의 방법을 이용하여 생성된 복수 개의 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드;
- 주형 폴리뉴클레오티드를 변형시키기 위한 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 MuA 기질의 집단 (여기서, 기질은 상기 정의된 바와 같다);
- a) 변형된 폴리뉴클레오티드를 막횡단 세공과 접촉시켜, 이러한 폴리뉴클레오티드의 적어도 하나의 가닥이 상기 세공을 통하여 이동하도록 하는 단계; 및
b) 적어도 하나의 가닥이 세공에 대하여 이동함에 따라 하나 이상의 측정치를 취함으로써 (여기서, 이러한 측정치는 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 특징을 나타낸다), 변형된 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명하는 단계
를 포함하는, 본 발명의 방법을 이용하여 변형된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명하는 방법;
- a) 본 발명의 방법을 이용하여 주형 폴리뉴클레오티드를 변형시켜 복수 개의 변형된 폴리뉴클레오티드를 생성시키는 단계;
b) 각각의 변형된 폴리뉴클레오티드를 막횡단 세공과 접촉시켜, 각 폴리뉴클레오티드의 적어도 하나의 가닥이 세공을 통하여 이동하도록 하는 단계; 및
c) 각 폴리뉴클레오티드가 세공에 대하여 이동함에 따라 하나 이상의 측정치를 취함으로써 (여기서, 이러한 측정치는 각 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 특징을 나타낸다), 주형 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명하는 단계
를 포함하는, 주형 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명하는 방법; 및
- (a) 상기 정의된 바와 같은 MuA 기질의 집단, (b) MuA 트랜스포사제 및 (c) 폴리머라제를 포함하는, 주형 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 변형시키기 위한 키트.
도 1은 주형 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 (a로 표지됨)를 변형시키는 방법을 나타내는 만화를 도시한 것이다. 단계 1은 주형 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 MuA 트랜스포사제 (b로 표지됨) 및 이중 가닥 MuA 기질의 집단 (c로 표지됨; 이중 가닥 MuA 기질은 각각 5' 헤어핀 루프를 함유하였다)과 접촉시켜, MuA 트랜스포사제가 주형 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 단편화하고 단편화 지점의 각 측면에 MuA 기질을 삽입하도록 하는 것을 포함하였다. 단계 2는 주형 가닥을, dNTP 및 폴리머라제 (e로 표지됨)로 처리하여 d로 표지된 DNA 단편을 옮겨놓았고 DNA 5' 헤어핀 루프에 대한 상보적 가닥을 생성시킨 것을 포함하였다. 단계 3은 f로 표지된 이중 가닥 DNA 구축물을 열 처리함으로써 이들 가닥을 변성시켜 단일 가닥 DNA (g로 표지됨)가 되도록 하는 것을 포함하였다. 최종적으로, 단계 4는 상보적 가닥을 형성하는 DNA 폴리머라제를 포함하였다.
도 2는 실시예 1에 요약된 주형 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 (a로 표지됨)를 변형시키는 방법을 나타내는 만화를 도시한 것이다. 단계 1은 주형 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 MuA 트랜스포사제 (b로 표지됨) 및 이중 가닥 MuA 기질의 집단 (c로 표지됨; 이중 가닥 MuA 기질은 각각 5' 헤어핀 루프를 함유하였다)과 접촉시켜, MuA 트랜스포사제가 주형 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 단편화하고 단편화 지점의 각 측면에 MuA 기질을 삽입하도록 하는 것을 포함하였다. 단계 2는 주형 가닥을, dNTP 및 폴리머라제 (e로 표지됨)로 처리하여 d로 표지된 DNA 단편을 옮겨놓았고 DNA 5' 헤어핀 루프에 대한 상보적 가닥을 생성시킨 것을 포함하였다. 단계 3은 f로 표지된 이중 가닥 DNA 구축물을 열 처리함으로써 이들 가닥을 변성시켜 단일 가닥 DNA (g로 표지됨)가 되도록 하는 것을 포함하였다. 단계 4는 상보적 가닥을 형성하는 DNA 폴리머라제로 제2 처리하는 것을 포함하였다. 최종적으로, 단계 5는 단계 4에서 생성된 이중 가닥 DNA 구축물의 dA-테일링(tailing), 미리 결합된 효소 (h로 표지됨)를 이용한 어댑터의 라이게이션 및 콜레스테롤 테더(tether) (j로 표지됨)를 함유한 DNA 가닥 (i로 표지됨)의 혼성화를 포함하였다. 이로써, 실시예 1에 기재된 나노 세공 시스템에서 시험되었던 최종 DNA 구축물이 생성되었다.
도 3은 헬리카제 [T4 Dda - E94C/C109A/C136A/A360C (돌연변이 E94C/C109A/C136A/A360C를 수반한 서열식별번호 (SEQ ID NO): 24)]가 MspA 나노 세공을 통하여 DNA 샘플 6의 전위를 제어한 경우의 전류 추적 예 [y-축 표지 = 전류 (pA), x-축 표지 = 시간 (s)]를 도시한 것이다.
도 4는 애질런트(Agilent) 12,000 DNA 칩 추적을 도시한 것이다. 1로 표지된 라인은 처리되지 않은 MuA 단편화 DNA 입력 재료이고, 2로 표지된 라인은 68℃ 인큐베이션 단계 (실시예 1의 1.2에서 수행됨)를 진행하였고, 연속해서 실시예 1의 단계 1.3 모두를 진행하였던 분석물이며, 3으로 표지된 라인은 실시예 1의 단계 1.2에서 68℃ 인큐베이션을 진행하지 않았지만, 실시예 1의 단계 1.3 모두를 진행하였다. 영역 X는 이중 가닥 DNA 라이브러리에 상응하고, 영역 Y는 애질런트 12,000의 상부 마커에 상응하며 영역 Z는 애질런트 12,000 칩의 하부 마커에 상응하였다.
도 5는 주형 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 (a로 표지됨)를 변형시키는 바람직한 방법을 나타내는 만화를 도시한 것이다. 도 5는 각 기질이 스페이서 (xxx; h로 표지됨)에 의해 헤어핀 루프로부터 분리된 리더 서열 (i로 표지됨)을 포함하는 것을 제외하고는 도 1과 동일하다. 리더 서열이 주형으로서 사용되지 않았는데, 이는 폴리머라제 (e로 표지됨)가 스페이서를 통과하여 이동할 수 없었기 때문이다.
도 6은 헬리카제 (T4 Dda - E94C/C109A/C136A/A360C)가 MspA 나노 세공을 통하여 DNA 샘플 7의 전위를 제어한 경우의 전류 추적 예 [y-축 표지 = 전류 (pA), x-축 표지 = 시간 (s)]를 도시한 것이다.
도 7은 주형 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 (a로 표지됨)를 변형시키는 방법을 나타내는 만화를 도시한 것이다. 단계 1은 주형 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 MuA 트랜스포사제 (b로 표지됨) 및 이중 가닥 MuA 기질의 집단 [c로 표지됨; 이중 가닥 MuA 기질은 각각, G/C를 대체한 헤어핀 (h로 표지되고 흑색 원형으로서 도시됨) 내에 I/Z를 함유한 5' 헤어핀 루프를 함유하였다]과 접촉시켜, MuA 트랜스포사제가 주형 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 단편화하고 단편화 지점의 각 측면에 MuA 기질을 삽입하도록 하는 것을 포함하였다. 단계 2는 주형 가닥을, dNTP 및 폴리머라제 (e로 표지됨)로 처리하여 d로 표지된 DNA 단편을 옮겨놓았고 DNA 5' 헤어핀 루프에 대한 상보적 가닥을 생성시킨 (생성된 dsDNA는 f로 표지되었다) 것을 포함하였다. 폴리머라제에 의해 형성된 이중 가닥 영역 (1X로 표지됨)은 둘 다 헤어핀 루프를 형성할 수 있는 2개의 가닥으로 구성된다. 가닥 f2에 의해 형성된 헤어핀 루프는 이중 가닥 영역 1X의 Tm보다 더 높은 Tm을 가지는데, 이는 가닥 f2의 헤어핀 루프가 C/T/A/G로 구성되고 이중 가닥 영역 1X가 가닥 f1과 혼성화된 가닥 f2이기 때문이다 (여기서, 가닥 f1은 Z/T/A/I로 구성되는데, Z 및 I는 단지 2개의 수소 결합을 형성하는 반면, C/G는 3개의 수소 결합을 형성한다). 따라서, f2는 헤어핀 루프 (f2h로 표지됨)를 형성하고, f1은 헤어핀 루프 (f1h로 표지됨)를 형성하며, 가닥 f1에 의해 형성된 헤어핀 루프는 가닥 f2에 의해 형성된 헤어핀 루프보다 더 높은 Tm을 갖는다. 이어서, DNA 폴리머라제는 파선/점선으로서 도시된 상보적 가닥을 생성할 수 있다 (i1 및 i2로 표지된 전체 dsDNA 구축물). 따라서, 폴리머라제는 단계 2에서 생성된 (및 f2와 혼성화된 f1로 표지된) dsDNA를 가열할 필요 없이 상보적 가닥 (파선/점선으로서 도시됨)을 형성할 수 있었다.
도 8은 본 발명의 바람직한 방법을 나타내는 만화를 도시한 것이다. 단계 1 내지 4는 도 1에서와 동일하였다. 단계 5는 헤어핀 루프를 도 1에서 형성된 구축물에 부가하는 것을 포함하였다. 단계 6은 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 열 처리함으로써 이들 가닥을 변성시켜 단일 가닥 구축물이 되도록 하는 것을 포함하였다. 최종적으로, 단계 7은 상보적 가닥을 형성하는 DNA 폴리머라제를 포함하였다.
서열 목록에 관한 설명
서열식별번호: 1은 MS-B1 돌연변이체 MspA 단량체를 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다. 이러한 돌연변이체에는 시그널 서열이 결여되고 다음 돌연변이를 포함한다: D90N, D91N, D93N, D118R, D134R 및 E139K.
서열식별번호: 2는 MspA 단량체의 MS-B1 돌연변이체의 성숙한 형태의 아미노산 서열을 제시한다. 이러한 돌연변이체에는 시그널 서열이 결여되고 다음 돌연변이를 포함한다: D90N, D91N, D93N, D118R, D134R 및 E139K.
서열식별번호: 3은 α-헤모리신-E111N/K147N (α-HL-NN; 문헌 [Stoddart et al., PNAS, 2009; 106(19): 7702-7707])의 하나의 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다.
서열식별번호: 4는 α-HL-NN의 하나의 단량체의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 5 내지 7은 MspB, C 및 D의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 8은 Phi29 DNA 폴리머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다.
서열식별번호: 9는 Phi29 DNA 폴리머라제의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 10은 이. 콜라이 (E. coli)로부터의 sbcB 유전자로부터 유래된 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다. 이는 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 I 효소 (EcoExo I)를 코딩한다.
서열식별번호: 11은 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 I 효소 (EcoExo I)의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 12는 이. 콜라이로부터의 xthA 유전자로부터 유래된 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다. 이는 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 III 효소를 코딩한다.
서열식별번호: 13은 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 III 효소의 아미노산 서열을 제시한다. 이러한 효소는 3' - 5' 방향에서 이중 가닥 DNA (dsDNA)의 하나의 가닥으로부터의 5' 모노포스페이트 뉴클레오시드의 분배 소화를 수행한다. 한 가닥에서의 효소 개시에는, 대략 4개의 뉴클레오티드의 5' 오버행이 필요하다.
서열식별번호: 14는 티. 써모필루스 (T. thermophilus)로부터의 recJ 유전자로부터 유래된 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다. 이는 티. 써모필루스로부터의 RecJ 효소 (TthRecJ-cd)를 코딩한다.
서열식별번호: 15는 티. 써모필루스로부터의 RecJ 효소 (TthRecJ-cd)의 아미노산 서열을 제시한다. 이러한 효소는 5' - 3' 방향에서 ssDNA로부터의 5' 모노포스페이트 뉴클레오시드의 진행성 소화를 수행한다. 한 가닥에서의 효소 개시에는, 적어도 4개의 뉴클레오티드가 필요하다.
서열식별번호: 16은 박테리오파지(bacteriophage) 람다 exo (redX) 유전자로부터 유래된 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다. 이는 박테리오파지 람다 엑소뉴클레아제를 코딩한다.
서열식별번호: 17은 박테리오파지 람다 엑소뉴클레아제의 아미노산 서열을 제시한다. 이러한 서열은 삼량체로 어셈블리되는 3개의 동일한 서브유닛 중 하나이다. 상기 효소는 5'-3' 방향에서 dsDNA의 하나의 가닥으로부터의 뉴클레오티드의 고도의 진행성 소화를 수행한다 (http://www.neb.com/nebecomm/products/productM0262.asp). 한 가닥에서의 효소 개시에는, 5' 포스페이트를 수반한 대략 4개의 뉴클레오티드의 5' 오버행이 우선적으로 필요하다.
서열식별번호: 18은 Hel308 Mbu의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 19는 Hel308 Csy의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 20은 Hel308 Tga의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 21은 Hel308 Mhu의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 22는 TraI Eco의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 23은 XPD Mbu의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 24는 Dda 1993의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 25는 Trwc Cba의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 26 내지 28은 본 발명의 바람직한 MuA 기질의 서열을 제시한다.
서열식별번호: 29는 실시예 1에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다.
서열식별번호: 30은 실시예 1에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다. 이러한 서열은 그의 5' 말단에 부착된 다음 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는다: GATCU.
서열식별번호: 31은 실시예 1에서 사용된, 엔테로박테리아 파지 λ의 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다. 이러한 서열은 주형 가닥의 5' 말단에 부착된 부가의 12개 염기 오버행을 함유한다. 여기에 제시된 서열은 주형 가닥만의 것이다 (주형 보체는 제시되지 않음).
서열식별번호: 32는 실시예 1에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다.
서열식별번호: 33은 실시예 1에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다.
서열식별번호: 34는 실시예 1에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다.
서열식별번호: 35는 실시예 1에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다.
서열식별번호: 36은 실시예 2에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다.
서열식별번호: 37은 실시예 2에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다.
도 2는 실시예 1에 요약된 주형 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 (a로 표지됨)를 변형시키는 방법을 나타내는 만화를 도시한 것이다. 단계 1은 주형 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 MuA 트랜스포사제 (b로 표지됨) 및 이중 가닥 MuA 기질의 집단 (c로 표지됨; 이중 가닥 MuA 기질은 각각 5' 헤어핀 루프를 함유하였다)과 접촉시켜, MuA 트랜스포사제가 주형 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 단편화하고 단편화 지점의 각 측면에 MuA 기질을 삽입하도록 하는 것을 포함하였다. 단계 2는 주형 가닥을, dNTP 및 폴리머라제 (e로 표지됨)로 처리하여 d로 표지된 DNA 단편을 옮겨놓았고 DNA 5' 헤어핀 루프에 대한 상보적 가닥을 생성시킨 것을 포함하였다. 단계 3은 f로 표지된 이중 가닥 DNA 구축물을 열 처리함으로써 이들 가닥을 변성시켜 단일 가닥 DNA (g로 표지됨)가 되도록 하는 것을 포함하였다. 단계 4는 상보적 가닥을 형성하는 DNA 폴리머라제로 제2 처리하는 것을 포함하였다. 최종적으로, 단계 5는 단계 4에서 생성된 이중 가닥 DNA 구축물의 dA-테일링(tailing), 미리 결합된 효소 (h로 표지됨)를 이용한 어댑터의 라이게이션 및 콜레스테롤 테더(tether) (j로 표지됨)를 함유한 DNA 가닥 (i로 표지됨)의 혼성화를 포함하였다. 이로써, 실시예 1에 기재된 나노 세공 시스템에서 시험되었던 최종 DNA 구축물이 생성되었다.
도 3은 헬리카제 [T4 Dda - E94C/C109A/C136A/A360C (돌연변이 E94C/C109A/C136A/A360C를 수반한 서열식별번호 (SEQ ID NO): 24)]가 MspA 나노 세공을 통하여 DNA 샘플 6의 전위를 제어한 경우의 전류 추적 예 [y-축 표지 = 전류 (pA), x-축 표지 = 시간 (s)]를 도시한 것이다.
도 4는 애질런트(Agilent) 12,000 DNA 칩 추적을 도시한 것이다. 1로 표지된 라인은 처리되지 않은 MuA 단편화 DNA 입력 재료이고, 2로 표지된 라인은 68℃ 인큐베이션 단계 (실시예 1의 1.2에서 수행됨)를 진행하였고, 연속해서 실시예 1의 단계 1.3 모두를 진행하였던 분석물이며, 3으로 표지된 라인은 실시예 1의 단계 1.2에서 68℃ 인큐베이션을 진행하지 않았지만, 실시예 1의 단계 1.3 모두를 진행하였다. 영역 X는 이중 가닥 DNA 라이브러리에 상응하고, 영역 Y는 애질런트 12,000의 상부 마커에 상응하며 영역 Z는 애질런트 12,000 칩의 하부 마커에 상응하였다.
도 5는 주형 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 (a로 표지됨)를 변형시키는 바람직한 방법을 나타내는 만화를 도시한 것이다. 도 5는 각 기질이 스페이서 (xxx; h로 표지됨)에 의해 헤어핀 루프로부터 분리된 리더 서열 (i로 표지됨)을 포함하는 것을 제외하고는 도 1과 동일하다. 리더 서열이 주형으로서 사용되지 않았는데, 이는 폴리머라제 (e로 표지됨)가 스페이서를 통과하여 이동할 수 없었기 때문이다.
도 6은 헬리카제 (T4 Dda - E94C/C109A/C136A/A360C)가 MspA 나노 세공을 통하여 DNA 샘플 7의 전위를 제어한 경우의 전류 추적 예 [y-축 표지 = 전류 (pA), x-축 표지 = 시간 (s)]를 도시한 것이다.
도 7은 주형 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 (a로 표지됨)를 변형시키는 방법을 나타내는 만화를 도시한 것이다. 단계 1은 주형 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 MuA 트랜스포사제 (b로 표지됨) 및 이중 가닥 MuA 기질의 집단 [c로 표지됨; 이중 가닥 MuA 기질은 각각, G/C를 대체한 헤어핀 (h로 표지되고 흑색 원형으로서 도시됨) 내에 I/Z를 함유한 5' 헤어핀 루프를 함유하였다]과 접촉시켜, MuA 트랜스포사제가 주형 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 단편화하고 단편화 지점의 각 측면에 MuA 기질을 삽입하도록 하는 것을 포함하였다. 단계 2는 주형 가닥을, dNTP 및 폴리머라제 (e로 표지됨)로 처리하여 d로 표지된 DNA 단편을 옮겨놓았고 DNA 5' 헤어핀 루프에 대한 상보적 가닥을 생성시킨 (생성된 dsDNA는 f로 표지되었다) 것을 포함하였다. 폴리머라제에 의해 형성된 이중 가닥 영역 (1X로 표지됨)은 둘 다 헤어핀 루프를 형성할 수 있는 2개의 가닥으로 구성된다. 가닥 f2에 의해 형성된 헤어핀 루프는 이중 가닥 영역 1X의 Tm보다 더 높은 Tm을 가지는데, 이는 가닥 f2의 헤어핀 루프가 C/T/A/G로 구성되고 이중 가닥 영역 1X가 가닥 f1과 혼성화된 가닥 f2이기 때문이다 (여기서, 가닥 f1은 Z/T/A/I로 구성되는데, Z 및 I는 단지 2개의 수소 결합을 형성하는 반면, C/G는 3개의 수소 결합을 형성한다). 따라서, f2는 헤어핀 루프 (f2h로 표지됨)를 형성하고, f1은 헤어핀 루프 (f1h로 표지됨)를 형성하며, 가닥 f1에 의해 형성된 헤어핀 루프는 가닥 f2에 의해 형성된 헤어핀 루프보다 더 높은 Tm을 갖는다. 이어서, DNA 폴리머라제는 파선/점선으로서 도시된 상보적 가닥을 생성할 수 있다 (i1 및 i2로 표지된 전체 dsDNA 구축물). 따라서, 폴리머라제는 단계 2에서 생성된 (및 f2와 혼성화된 f1로 표지된) dsDNA를 가열할 필요 없이 상보적 가닥 (파선/점선으로서 도시됨)을 형성할 수 있었다.
도 8은 본 발명의 바람직한 방법을 나타내는 만화를 도시한 것이다. 단계 1 내지 4는 도 1에서와 동일하였다. 단계 5는 헤어핀 루프를 도 1에서 형성된 구축물에 부가하는 것을 포함하였다. 단계 6은 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 열 처리함으로써 이들 가닥을 변성시켜 단일 가닥 구축물이 되도록 하는 것을 포함하였다. 최종적으로, 단계 7은 상보적 가닥을 형성하는 DNA 폴리머라제를 포함하였다.
서열 목록에 관한 설명
서열식별번호: 1은 MS-B1 돌연변이체 MspA 단량체를 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다. 이러한 돌연변이체에는 시그널 서열이 결여되고 다음 돌연변이를 포함한다: D90N, D91N, D93N, D118R, D134R 및 E139K.
서열식별번호: 2는 MspA 단량체의 MS-B1 돌연변이체의 성숙한 형태의 아미노산 서열을 제시한다. 이러한 돌연변이체에는 시그널 서열이 결여되고 다음 돌연변이를 포함한다: D90N, D91N, D93N, D118R, D134R 및 E139K.
서열식별번호: 3은 α-헤모리신-E111N/K147N (α-HL-NN; 문헌 [Stoddart et al., PNAS, 2009; 106(19): 7702-7707])의 하나의 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다.
서열식별번호: 4는 α-HL-NN의 하나의 단량체의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 5 내지 7은 MspB, C 및 D의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 8은 Phi29 DNA 폴리머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다.
서열식별번호: 9는 Phi29 DNA 폴리머라제의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 10은 이. 콜라이 (E. coli)로부터의 sbcB 유전자로부터 유래된 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다. 이는 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 I 효소 (EcoExo I)를 코딩한다.
서열식별번호: 11은 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 I 효소 (EcoExo I)의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 12는 이. 콜라이로부터의 xthA 유전자로부터 유래된 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다. 이는 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 III 효소를 코딩한다.
서열식별번호: 13은 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 III 효소의 아미노산 서열을 제시한다. 이러한 효소는 3' - 5' 방향에서 이중 가닥 DNA (dsDNA)의 하나의 가닥으로부터의 5' 모노포스페이트 뉴클레오시드의 분배 소화를 수행한다. 한 가닥에서의 효소 개시에는, 대략 4개의 뉴클레오티드의 5' 오버행이 필요하다.
서열식별번호: 14는 티. 써모필루스 (T. thermophilus)로부터의 recJ 유전자로부터 유래된 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다. 이는 티. 써모필루스로부터의 RecJ 효소 (TthRecJ-cd)를 코딩한다.
서열식별번호: 15는 티. 써모필루스로부터의 RecJ 효소 (TthRecJ-cd)의 아미노산 서열을 제시한다. 이러한 효소는 5' - 3' 방향에서 ssDNA로부터의 5' 모노포스페이트 뉴클레오시드의 진행성 소화를 수행한다. 한 가닥에서의 효소 개시에는, 적어도 4개의 뉴클레오티드가 필요하다.
서열식별번호: 16은 박테리오파지(bacteriophage) 람다 exo (redX) 유전자로부터 유래된 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다. 이는 박테리오파지 람다 엑소뉴클레아제를 코딩한다.
서열식별번호: 17은 박테리오파지 람다 엑소뉴클레아제의 아미노산 서열을 제시한다. 이러한 서열은 삼량체로 어셈블리되는 3개의 동일한 서브유닛 중 하나이다. 상기 효소는 5'-3' 방향에서 dsDNA의 하나의 가닥으로부터의 뉴클레오티드의 고도의 진행성 소화를 수행한다 (http://www.neb.com/nebecomm/products/productM0262.asp). 한 가닥에서의 효소 개시에는, 5' 포스페이트를 수반한 대략 4개의 뉴클레오티드의 5' 오버행이 우선적으로 필요하다.
서열식별번호: 18은 Hel308 Mbu의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 19는 Hel308 Csy의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 20은 Hel308 Tga의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 21은 Hel308 Mhu의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 22는 TraI Eco의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 23은 XPD Mbu의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 24는 Dda 1993의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 25는 Trwc Cba의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 26 내지 28은 본 발명의 바람직한 MuA 기질의 서열을 제시한다.
서열식별번호: 29는 실시예 1에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다.
서열식별번호: 30은 실시예 1에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다. 이러한 서열은 그의 5' 말단에 부착된 다음 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는다: GATCU.
서열식별번호: 31은 실시예 1에서 사용된, 엔테로박테리아 파지 λ의 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다. 이러한 서열은 주형 가닥의 5' 말단에 부착된 부가의 12개 염기 오버행을 함유한다. 여기에 제시된 서열은 주형 가닥만의 것이다 (주형 보체는 제시되지 않음).
서열식별번호: 32는 실시예 1에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다.
서열식별번호: 33은 실시예 1에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다.
서열식별번호: 34는 실시예 1에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다.
서열식별번호: 35는 실시예 1에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다.
서열식별번호: 36은 실시예 2에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다.
서열식별번호: 37은 실시예 2에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다.
개시된 생성물 및 방법의 상이한 적용이 관련 기술분야의 특이적 요구에 맞춰질 수 있음을 이해해야 한다. 본원에서 사용된 용어는 단지 본 발명의 특별한 실시양태를 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것을 또한 이해해야 한다.
또한 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 그 내용이 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "폴리뉴클레오티드"에 대한 언급은 "폴리뉴클레오티드들"을 포함하고, "기질"에 대한 언급은 2개 이상의 상기 기질을 포함하며, "막횡단 단백질 세공"에 대한 언급은 2개 이상의 상기 세공을 포함한다.
본원에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 상기 또는 후속 여부에 관계없이 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 변형 방법
본 발명은 주형 폴리뉴클레오티드의 변형 방법을 제공한다. 주형은 임의의 목적을 위해 변형될 수 있다. 상기 방법은 바람직하게, 그 특징을 규명하기 위하여, 예컨대 가닥 서열 분석을 위하여 주형 폴리뉴클레오티드를 변형시킨다. 주형 폴리뉴클레오티드는 전형적으로, 본 발명에 따라서 궁극적으로 그 특징이 규명되거나 또는 서열 분석될 폴리뉴클레오티드이다. 이는 다음에 보다 상세히 논의된다.
본 방법은 복수 개의 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 형성을 포함한다. 이들 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는 전형적으로, 특히 가닥 서열 분석을 이용하여 주형 폴리뉴클레오티드보다 더 용이하게 그 특징이 규명된다. 복수 개의 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는 주형 폴리뉴클레오티드의 특징 규명을 촉진시키기 위해 그 자체가 특징 규명될 수 있다. 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드의 서열은 각각의 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 서열 분석함으로써 결정될 수 있다.
이러한 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는 전형적으로, 주형 폴리뉴클레오티드보다 더 짧으므로, 가닥 서열 분석을 이용하여 그의 특징을 규명하는 것이 더 간단하다. 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는 또한, 다음에 논의된 바와 같은 정보량의 2배를 포함한다.
변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는 MuA 기질 내에 표지를 포함시킴으로써 선택적으로 표지될 수 있다. 적합한 표지는 교정 서열, 커플링 모이어티(moiety) 및 어댑터 결합된 효소를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 가닥 서열 분석을 이용하여 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 특징 규명을 촉진시키는 변형을, 상기 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 내로 도입시켜 준다. 나노 세공을 함유하는 막에 폴리뉴클레오티드를 커플링시키면, 그의 특징 규명 또는 서열 분석을 허용하는 데 필요한 폴리뉴클레오티드의 양을 수십 배 정도 낮출 수 있는 것으로 널리 정립되어 있다. 이는 국제 출원 번호 PCT/GB2012/051191 (WO 2012/164270으로서 공개됨)에 논의된다. 본 발명의 방법은 폴리뉴클레오티드를 막에 커플링시키기 위한 수단을 각각 포함하는 복수 개의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 생성을 허용해 준다. 이는 다음에 보다 상세히 논의된다.
나노 세공을 사용하는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 특징 규명은 전형적으로, 나노 세공 내로 우선적으로 삽입되도록 설계된 리더 서열의 존재를 필요로 한다. 본 발명의 방법은 각각 단일 가닥 리더 서열을 포함하는 복수 개의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 생성을 허용한다. 이는 다음에 보다 상세히 논의된다.
헤어핀 루프와 같은 브릿징 모이어티에 의해 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 두 가닥을 연결함으로써 폴리뉴클레오티드의 양 가닥을 나노 세공에 의해 특징 규명하거나 또는 서열 분석할 수 있다는 것도 널리 정립되어 있다. 이는 단일 이중 가닥 폴리뉴클레오티드로부터 수득된 정보의 양을 2배로 하기 때문에 유리하다. 더욱이, 주형 보체 가닥 내의 서열은 주형 가닥의 서열과 반드시 직교하기 때문에, 두 가닥으로부터의 정보는 그 정보에 따라 조합될 수 있다. 따라서, 이러한 기전은 더 높은 신뢰도의 관찰을 제공하는 직교 교정 능력을 제공한다. 이는 국제 출원 번호 PCT/GB2012/051786 (WO 2013/014451로서 공개됨)에 논의된다. 본 발명의 방법은 헤어핀 루프를 사용하여 각 폴리뉴클레오티드의 두 가닥을 연결시킨, 복수 개의 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 생성을 허용한다.
주형 폴리뉴클레오티드
본 발명의 방법은 바람직하게 그 특징 규명을 위하여, 주형 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 변형시킨다. 주형 폴리뉴클레오티드는 전형적으로, 본 발명에 따라서 궁극적으로 특징 규명되거나 또는 서열 분석될 폴리뉴클레오티드이다. 이는 표적 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 또는 관심 이중 가닥 폴리뉴클레오티드로 지칭될 수도 있다.
폴리뉴클레오티드, 예컨대 핵산은 2개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 거대 분자이다. 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 임의의 뉴클레오티드의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 자연 발생적 또는 인공적일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 내의 하나 이상의 뉴클레오티드는 산화되거나 또는 메틸화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 내의 하나 이상의 뉴클레오티드는 손상될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 피리미딘 이량체를 포함할 수 있다. 이러한 이량체는 전형적으로, 자외선에 의한 손상과 연관되고, 피부 흑색종의 주요 원인이다. 폴리뉴클레오티드 내의 하나 이상의 뉴클레오티드는, 예를 들어 표지 또는 태그로 변형시킬 수 있다. 적합한 표지는 다음에 기재된다. 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 스페이서를 포함할 수 있다.
뉴클레오티드는 전형적으로, 핵염기, 당 및 적어도 하나의 포스페이트 기를 함유한다. 핵염기와 당은 뉴클레오시드를 형성한다.
핵염기는 전형적으로 헤테로사이클릭이다. 핵염기는 퓨린 및 피리미딘 및 보다 구체적으로 아데닌 (A), 구아닌 (G), 티민 (T), 우라실 (U) 및 시토신 (C)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
당은 전형적으로, 펜토스 당이다. 뉴클레오티드 당은 리보스 및 데옥시리보스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 당은 바람직하게, 데옥시리보스이다.
폴리뉴클레오티드는 바람직하게, 다음 뉴클레오시드를 포함한다: 데옥시아데노신 (dA), 데옥시우리딘 (dU) 및/또는 데옥시티미딘 (dT), 데옥시구아노신 (dG) 및 데옥시시티딘 (dC).
뉴클레오티드는 전형적으로 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드이다. 뉴클레오티드는 전형적으로 모노포스페이트, 디포스페이트 또는 트리포스페이트를 함유한다. 뉴클레오티드는 3개 초과의 포스페이트, 예컨대 4개 또는 5개의 포스페이트를 포함할 수 있다. 포스페이트는 뉴클레오티드의 5' 또는 3' 측면 상에 부착될 수 있다. 뉴클레오티드는 아데노신 모노포스페이트 (AMP), 구아노신 모노포스페이트 (GMP), 티미딘 모노포스페이트 (TMP), 우리딘 모노포스페이트 (UMP), 5-메틸시티딘 모노포스페이트, 5-히드록시메틸시티딘 모노포스페이트, 시티딘 모노포스페이트 (CMP), 사이클릭 아데노신 모노포스페이트 (cAMP), 사이클릭 구아노신 모노포스페이트 (cGMP), 데옥시아데노신 모노포스페이트 (dAMP), 데옥시구아노신 모노포스페이트 (dGMP), 데옥시티미딘 모노포스페이트 (dTMP), 데옥시우리딘 모노포스페이트 (dUMP), 데옥시시티딘 모노포스페이트 (dCMP) 및 데옥시메틸시티딘 모노포스페이트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 뉴클레오티드는 바람직하게, AMP, TMP, GMP, CMP, UMP, dAMP, dTMP, dGMP, dCMP 및 dUMP로부터 선택된다.
뉴클레오티드 탈염기성일 수 있다 (즉, 핵염기가 결여된다). 뉴클레오티드는 또한, 핵염기 및 당이 결여될 수 있다 (즉, 이는 C3 스페이서이다).
폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드는 임의의 방식으로 서로 부착될 수 있다. 뉴클레오티드는 전형적으로, 핵산에서와 같이 그의 당 및 포스페이트 기에 의해 부착된다. 뉴클레오티드는 피리미딘 이량체에서와 같이 그의 핵염기를 통해 연결될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 이중 가닥이다. 폴리뉴클레오티드의 적어도 특정 부분이 바람직하게 이중 가닥이다.
폴리뉴클레오티드는 핵산, 예컨대 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 DNA의 하나의 가닥과 혼성화된 RNA의 하나의 가닥을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 관련 기술분야에 공지된 임의의 합성 핵산, 예컨대 펩티드 핵산 (PNA), 글리세롤 핵산 (GNA), 트레오스 핵산 (TNA), 고정 핵산 (LNA) 또는 뉴클레오티드 측쇄를 수반한 다른 합성 중합체일 수 있다. PNA 주쇄는 펩티드 결합에 의해 연결된 반복되는 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위로 구성된다. GNA 주쇄는 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 반복되는 글리콜 단위로 구성된다. TNA 주쇄는 포스포디에스테르 결합에 의해 함께 연결된 반복되는 트레오스 당으로 구성된다. LNA는 리보스 모이어티 내의 2' 산소와 4' 탄소를 연결시키는 여분의 브릿지를 갖는, 상기 논의된 바와 같은 리보뉴클레오티드로부터 형성된다.
폴리뉴클레오티드는 가장 바람직하게 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA)이다.
폴리뉴클레오티드는 임의의 길이일 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 그 길이가 적어도 10개, 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 150개, 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 적어도 400개 또는 적어도 500개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 그 길이가 1000개 이상의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍, 5000개 이상의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍, 또는 100000개 이상의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍일 수 있다.
본 발명을 이용하여 임의의 수의 폴리뉴클레오티드를 조사할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 50, 100개 또는 그 초과의 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명하는 것에 관한 것일 수 있다. 2개 이상의 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명하는 경우, 이는 상이한 폴리뉴클레오티드일 수 있거나 또는 동일한 폴리뉴클레오티드의 2개의 사례일 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 자연 발생적 또는 인공적일 수 있다. 예를 들어, 상기 방법을 이용하여, 제작된 올리고뉴클레오티드의 서열을 검증할 수 있다. 상기 방법은 전형적으로, 시험관 내에서 수행된다.
주형 폴리뉴클레오티드는 전형적으로, 임의의 적합한 샘플에 존재한다. 본 발명은 전형적으로, 주형 폴리뉴클레오티드를 함유하는 것으로 공지되거나 또는 이를 함유하는 것으로 의심되는 샘플 상에서 수행된다. 또 다른 한편으론, 본 발명은 특정 샘플에서의 그의 존재가 공지되거나 또는 예상되는 하나 이상의 주형 폴리뉴클레오티드의 실체를 확증하기 위해 상기 샘플 상에서 수행될 수 있다.
샘플은 생물학적 샘플일 수 있다. 본 발명은 임의의 유기체 또는 미생물로부터 수득되거나 또는 추출된 샘플 상에서 시험관 내에서 수행될 수 있다. 이러한 유기체 또는 미생물은 전형적으로, 고세균, 원핵 생물 또는 진핵 생물이며 전형적으로, 다음 5개 계 중 하나에 속한다: 식물계, 동물계, 진균, 모네라계 및 원생 생물계. 본 발명은 임의의 바이러스로부터 수득되거나 또는 추출된 샘플 상에서 시험관 내에서 수행될 수 있다. 샘플은 바람직하게 유체 샘플이다. 샘플은 전형적으로, 환자의 체액을 포함한다. 샘플은 소변, 림프액, 타액, 점액 또는 양수이지만 혈액, 혈장 또는 혈청이 바람직하다. 전형적으로, 샘플은 그 기원이 인간이지만, 또 다른 한편으론 또 다른 포유류 동물, 예컨대 상업적으로 사육된 동물, 예컨대 말, 소, 양 또는 돼지로부터 유래될 수 있거나 또는 또 다른 한편으론, 애완 동물, 예컨대 고양이 또는 개로부터 유래될 수 있다. 또 다른 한편으론, 식물 기원의 샘플은 전형적으로, 상업 작물, 예컨대 곡물, 콩과 식물, 과일 또는 야채, 예를 들어 밀, 보리, 귀리, 카놀라, 옥수수, 콩, 쌀, 바나나, 사과, 토마토, 감자, 포도, 담배, 콩류, 렌틸, 사탕 수수, 코코아, 면화로부터 수득된다.
샘플은 비-생물학적 샘플일 수 있다. 비-생물학적 샘플은 바람직하게 유체 샘플이다. 비-생물학적 샘플의 예는 수술용 유체, 물, 예컨대 식수, 해수 또는 강물, 및 실험실 시험용 시약을 포함한다.
샘플은 전형적으로 본 발명에서 사용되기 전에, 예를 들어 원심 분리에 의해 또는 적혈구와 같은 원치 않는 분자 또는 세포를 걸러내는 막을 통과함으로써 처리된다. 샘플은 채취한 즉시 측정할 수 있다. 샘플은 또한 전형적으로 검정 이전에, 바람직하게는 -70℃ 아래에서 저장될 수 있다.
MuA
및 조건
주형 폴리뉴클레오티드는 MuA 트랜스포사제와 접촉시킨다. 이러한 접촉은 상기 트랜스포사제가 기능할 수 있게 해주는 조건, 즉 주형 폴리뉴클레오티드를 단편화할 수 있고 단편의 한 말단 또는 양 말단에 MuA 기질을 라이게이션할 수 있게 해주는 조건하에 일어난다. MuA 트랜스포사제는, 예를 들어 써모 사이언티픽 [Thermo Scientific; 카탈로그 번호 F-750C, 20 μL (1.1 μg/μL)]으로부터 시판되고 있다. MuA 트랜스포사제가 기능하게 될 조건은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 적합한 조건은 본 실시예에 기재되어 있다.
기질의 집단
주형 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥 MuA 기질의 집단과 접촉시킨다. 이러한 이중 가닥 기질은 폴리뉴클레오티드 기질이고, 상기 논의된 뉴클레오티드 또는 핵산 중 임의의 것으로부터 형성될 수 있다. 상기 기질은 전형적으로, 주형 폴리뉴클레오티드와 동일한 뉴클레오티드로부터 형성된다.
기질의 집단은 전형적으로 동질적이다 (즉, 전형적으로 복수 개의 동일한 기질을 함유한다). 기질의 집단을 이질적이다 (즉, 복수 개의 상이한 기질을 함유할 수 있다).
MuA 트랜스포사제에 적합한 기질은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (Saariaho and Savilahti, Nucleic Acids Research, 2006; 34(10): 3139-3149 and Lee and Harshey, J. Mol. Biol., 2001; 314: 433-444).
각 기질은 전형적으로, 그의 활성을 MuA 트랜스포사제에 대한 기질로서 제공하는 이중 가닥 부분을 포함한다. 이러한 이중 가닥 부분은 전형적으로 각 기질에서 동일하다. 기질의 집단은 상이한 이중 가닥 부분을 포함할 수 있다.
각 기질 내의 이중 가닥 부분은 전형적으로, 그 길이가 적어도 50개의 뉴클레오티드 쌍, 예컨대 그 길이가 적어도 55개, 적어도 60개 또는 적어도 65개의 뉴클레오티드 쌍이다. 각 기질 내의 이중 가닥 부분은 바람직하게, 각 가닥의 3' 말단에 데옥시시티딘 (dC) 및 데옥시아데노신 (dA)을 포함하는 디뉴클레오티드를 포함한다. dC 및 dA는 전형적으로, 상기 이중 가닥 부분의 두 가닥에서 상이한 배향으로 존재하는데, 즉 5'에서 3'로 판독될 때 한 가닥은 3' 말단에 dC/dA를 갖고 다른 가닥은 3' 말단에 dA/dC를 갖는다.
이중 가닥 부분의 한 가닥은 바람직하게, 서열식별번호: 26에 제시된 서열을 포함하고, 이중 가닥 부분의 다른 가닥은 바람직하게, 서열식별번호: 27에 제시된 서열을 포함한다.
5'-GTTTTCGCATTTATCGTGAAACGCTTTCGCGTTTTTCGTGCGCCGCTTCA-3' (서열식별번호: 26)
3'-CAAAAGCGTAAATAGCACTTTGCGAAAGCGCAAAAAGCACGCGGCGAAGT-5' (서열식별번호: 27).
각 기질은 적어도 하나의 오버행을 포함한다. 오버행은 전형적으로 뉴클레오티드 오버행이다. 각 기질의 한 말단 또는 양 말단에 오버행이 존재할 수 있다. 각 기질 내의 이중 가닥 부분이 서열식별번호: 27에 제시된 서열과 혼성화된 서열식별번호: 26에 제시된 서열을 포함하는 경우, 적어도 하나의 오버행은 바람직하게, 서열식별번호: 27에 제시된 서열의 5' 말단에 있다.
각 기질은 2개의 오버행을 포함할 수 있는데, 즉 각 기질의 양 말단에 하나씩 포함할 수 있다. 기질의 양 말단에 오버행이 존재하는 경우, 각 오버행은 전형적으로, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 부분의 상이한 가닥 상에 있다. 오버행은 바람직하게, 이중 가닥 부분의 한 가닥의 5' 말단에 위치한다.
각 기질은 바람직하게 단 하나의 오버행을 포함한다. 단 하나의 오버행은 바람직하게, 이중 가닥 부분의 한 가닥의 5' 말단에 있다.
오버행은 그 길이가 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개 또는 적어도 7개의 뉴클레오티드일 수 있다. 오버행은 바람직하게 그 길이가 5개의 뉴클레오티드이다.
바람직한 실시양태에서, 기질의 한 가닥은 서열식별번호: 26에 제시된 서열을 포함하고, 기질의 다른 가닥은 서열식별번호: 28에 제시된 서열을 포함한다 (하기 참조).
5'-GTTTTCGCATTTATCGTGAAACGCTTTCGCGTTTTTCGTGCGCCGCTTCA-3'
(서열식별번호: 26)
3'-CAAAAGCGTAAATAGCACTTTGCGAAAGCGCAAAAAGCACGCGGCGAAGTCTAG-5' (서열식별번호: 28).
집단 내의 기질은 국제 출원 번호 PCT/GB2014/052505에 개시된 구조 중 임의의 것을 가질 수 있다.
각 기질은 적어도 하나의 오버행을 포함하는 가닥으로부터 반대 가닥에 적어도 하나의 헤어핀 루프를 포함한다. 이러한 헤어핀 루프는 전형적으로, 기질의 두 가닥을 연결하지 않는다. 헤어핀 루프는 내부 헤어핀 루프일 수 있는데, 즉 적어도 하나의 오버행을 포함하는 가닥으로부터 반대 가닥의 말단에 있지 않는다. 내부 헤어핀 루프는 바람직하게, 본 발명의 방법에 사용된 임의의 폴리머라제가, 그를 통과하여 이동할 수 없는 스페이서에 인접해 있다. 스페이서는 헤어핀 루프의 어느 한 측면 상에 위치할 수 있다. 다음에 논의된 스페이서 중 임의의 것, 예컨대 하나 이상의 iSpC3 기 (즉, 당과 염기가 결여된 뉴클레오티드), 하나 이상의 스페이서 9 (iSp9) 기 또는 하나 이상의 스페이서 18 (iSp18) 기를 사용할 수 있다. 내부 헤어핀 루프는 바람직하게, 본 발명의 방법에 사용된 임의의 폴리머라제가, 그를 통과하여 이동할 수 없는 비-자연 뉴클레오티드, 예컨대 니트로인돌에 인접해 있다. 다음에 논의된 상이한 뉴클레오티드 종 중 임의의 것을 사용할 수 있다.
헤어핀 루프는 바람직하게, 적어도 하나의 오버행을 포함하는 가닥으로부터 반대 가닥의 말단에 또는 그 근처에 존재한다. 헤어핀 루프가 적어도 하나의 오버행을 포함하는 가닥으로부터 반대 가닥의 말단으로부터의 20개 이하의 뉴클레오티드, 15개 이하의 뉴클레오티드, 10개 이하의 뉴클레오티드 또는 5개 이하의 뉴클레오티드인 경우, 상기 헤어핀 루프는 적어도 하나의 오버행을 포함하는 가닥으로부터 반대 가닥의 말단 근처에 있다. 가닥의 말단의 줄기 부분 (혼성화된 부분)을 형성하는 마지막 뉴클레오티드 사이에 20개 이하의 뉴클레오티드가 존재하는 경우, 헤어핀 루프는 상기 가닥의 말단으로부터의 20개 이하의 뉴클레오티드이다. 헤어핀 루프는 바람직하게, 적어도 하나의 오버행을 포함하는 가닥으로부터 반대 가닥의 말단에 있다. 각 기질의 한 말단 또는 양 말단에 헤어핀 루프가 존재할 수 있다. 헤어핀 루프는 바람직하게, 적어도 하나의 오버행으로부터 기질의 반대 말단에 있다.
헤어핀 루프는 전형적으로 뉴클레오티드 헤어핀 루프이다. 각 기질 내의 이중 가닥 부분이 서열식별번호: 27에 제시된 서열과 혼성화된 서열식별번호: 26에 제시된 서열을 포함하는 경우, 적어도 하나의 헤어핀 루프는 바람직하게, 서열식별번호: 26에 제시된 서열의 5' 말단에 있다.
각 기질은 2개의 헤어핀 루프를 포함할 수 있는데, 즉 각 기질의 양 가닥 내에 하나씩 포함하거나 또는 각 기질의 양 말단에 하나씩 포함한다. 기질의 양 말단에 헤어핀 루프가 존재하는 경우, 각 헤어핀 루프는 전형적으로, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 부분의 상이한 가닥 위에 있다. 헤어핀 루프는 바람직하게, 이중 가닥 부분의 한 가닥의 5' 말단에 위치한다.
각 기질은 바람직하게, 단 하나의 헤어핀 루프를 포함한다. 단 하나의 헤어핀 루프는 바람직하게, 적어도 하나의 오버행을 포함하는 가닥으로부터 반대 가닥에 있다. 단 하나의 헤어핀 루프는 바람직하게, 적어도 하나의 오버행으로부터 기질의 반대 말단에 있고 적어도 하나의 오버행을 포함하는 가닥으로부터 반대 가닥 내에 있다. 단 하나의 헤어핀 루프는 바람직하게, 이중 가닥 부분의 한 가닥의 5' 말단에 있고 적어도 하나의 오버행을 포함하는 가닥으로부터 반대 가닥 내에 있다.
바람직한 실시양태에서, 각 기질은 이중 가닥 부분의 한 가닥의 5' 말단에 하나의 오버행을 포함하고 이중 가닥 부분의 다른 가닥의 5' 말단에 헤어핀 루프를 포함한다. 가장 바람직한 실시양태에서, 기질의 한 가닥은 서열식별번호: 26에 제시된 서열을 포함하고, 기질의 다른 가닥은 서열식별번호: 28에 제시된 서열을 포함하며 (상기 참조), 헤어핀 루프는 서열식별번호: 26에 제시된 서열의 5' 말단에 있다.
적합한 헤어핀 루프는 관련 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 설계할 수 있다. 헤어핀 루프는 임의의 길이일 수 있다. 헤어핀 루프는 그 길이가 전형적으로, 110개 이하의 뉴클레오티드, 예컨대 100개 이하의 뉴클레오티드, 90개 이하의 뉴클레오티드, 80개 이하의 뉴클레오티드, 70개 이하의 뉴클레오티드, 60개 이하의 뉴클레오티드, 50개 이하의 뉴클레오티드, 40개 이하의 뉴클레오티드, 30개 이하의 뉴클레오티드, 20개 이하의 뉴클레오티드 또는 10개 이하의 뉴클레오티드이다. 헤어핀 루프는 그 길이가 바람직하게, 약 1 내지 110개, 2 내지 100개, 5 내지 80개 또는 6 내지 50개의 뉴클레오티드이다.
헤어핀 루프는 상기 논의된 뉴클레오티드 중 임의의 것으로부터 형성될 수 있다. 헤어핀 루프는 이중 가닥 부분과 동일한 뉴클레오티드로부터 형성될 수 있다. 헤어핀 루프는 바람직하게, 이중 가닥 부분보다 더 낮은 융점 (Tm)을 갖는 헤어핀 루프를 초래하는 뉴클레오티드로부터 형성된다. 융점은 일상적인 기술을 이용하여 측정할 수 있다. 이중 가닥 부분이 RNA를 포함하는 경우, 헤어핀은 바람직하게, 아데노신 (A), 우리딘 (U), 이노신 (I) 및 제불라린 (Z)을 함유하는 뉴클레오티드로부터 형성된다. 이중 가닥 부분이 DNA를 포함하는 경우, 헤어핀은 바람직하게, 데옥시아데노신 (dA), 데옥시티미딘 (dT), 데옥시이노신 (dI) 및 데옥시제불라린 (dZ)을 함유하는 뉴클레오티드로부터 형성된다. 구아노신 (G)/데옥시구아노신 (dG)을 이노신 (I)/데옥시이노신 (dI)으로 대체하고 시티딘 (C)/데옥시시티딘 (dC)을 제불라린 (Z)/데옥시제불라린 (dZ)으로 대체하면, 이중 가닥 부분과 비교해서 헤어핀의 Tm이 저하된다. I/dI와 Z/dZ는 단지 2개의 수소 결합을 형성하는 반면, G/dG와 C/dC는 3개의 수소 결합을 형성한다. 본 발명의 방법에서, 폴리머라제는 오버행 가닥을, 헤어핀 루프를 포함하는 가닥을 보완하는 새로운 가닥으로 대체시킨다. 더 낮은 Tm을 갖는 헤어핀 루프를 이용하여, 더 높은 Tm을 갖는 상보적 헤어핀, 즉 더 높은 Tm을 갖는 뉴클레오티드로부터 형성된 헤어핀을 형성할 수 있다. 폴리머라제는 오버행 가닥을, 헤어핀 루프를 포함하는 가닥을 보완하는 새로운 가닥으로 대체시킬 수 있는데, 여기서 새로운 가닥은 주형 가닥 내의 헤어핀 루프보다 더 높은 Tm을 갖는 헤어핀 루프를 포함한다. 예를 들어, 아데노신 (A)/데옥시아데노신 (dA), 우리딘 (U)/데옥시티미딘 (dT), 이노신(I)/데옥시이노신 (dI) 및 제불라린 (Z)/데옥시제불라린 (dZ)을 함유하는 뉴클레오티드로부터 형성된 헤어핀 루프를 이용하여, 상보적 RNA 또는 DNA 헤어핀 루프를 형성할 수 있다. 두 헤어핀 간의 Tm 상의 차이는 이들이 함께 혼성화되는 것보다는 개개의 헤어핀으로서 더 안정적이라는 것을 의미한다. 이는 두 헤어핀 루프가 함께 혼성화되는 것보다는 오히려 그들 각각의 루프를 형성한다는 것을 의미한다. 이는 이중 가닥 구축물의 두 가닥을 분리하고 주형으로서 사용하여, 각각 적어도 하나의 헤어핀 루프에 의해 연결된 두 상보적 가닥을 포함하는 복수 개의 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 형성시키는, 상기 방법의 마지막 단계를 촉진시켜 준다. 예를 들어, 분리는 실온에서 수행될 수 있다.
각 기질은 선택 가능한 결합성 모이어티를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 선택 가능한 결합성 모이어티는 바람직하게, 헤어핀 루프 내에 있다. 선택 가능한 결합성 모이어티는 그의 결합 특성을 기준으로 하여 선택될 수 있는 모이어티이다. 따라서, 선택 가능한 결합성 모이어티는 바람직하게, 표면과 특이적으로 결합하는 모이어티이다. 선택 가능한 결합성 모이어티가 본 발명에서 사용된 임의의 다른 모이어티보다 훨씬 더 큰 정도로 표면과 결합하는 경우에, 상기 선택 가능한 결합성 모이어티는 그 표면과 특이적으로 결합한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 모이어티는 본 발명에서 사용된 다른 모이어티와 결합하지 않는 표면과 결합한다.
적합한 선택적 결합성 모이어티는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 바람직한 선택적 결합성 모이어티는 비오틴, 핵산 서열, 항체, 항체 단편, 예컨대 Fab 및 ScSv, 항원, 핵산 결합성 단백질, 폴리 히스티딘 테일 및 GST 태그를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 가장 바람직한 선택적 결합성 모이어티는 비오틴 및 선택 가능한 핵산 서열이다. 비오틴은 아비딘으로 코팅된 표면과 특이적으로 결합한다. 선택 가능한 핵산 서열은 상동 서열로 코팅된 표면과 특이적으로 결합한다 (즉, 혼성화한다). 또 다른 한편으론, 선택 가능한 핵산 서열은 핵산 결합성 단백질로 코팅된 표면과 특이적으로 결합한다.
각 기질은 리더 서열을 포함할 수 있다. 이러한 리더 서열은 전형적으로, 적어도 하나의 헤어핀 루프와 동일한 가닥 상에 있다. 리더 서열은 전형적으로, 헤어핀 루프와 동일한 기질의 말단에 있다. 리더 서열은 전형적으로, 적어도 하나의 헤어핀 루프를 포함하는 가닥의 말단에 위치한다 (즉, 헤어핀 루프는 단말 리더 서열과 나머지 기질 사이에 위치한다). 리더 서열은 전형적으로, 본 발명의 방법에서 사용된 임의의 폴리머라제가, 그를 통과하여 이동할 수 없는 스페이서에 의해 헤어핀 루프로부터 분리된다. 다음에 논의된 스페이서 중 임의의 것, 예컨대 하나 이상의 iSpC3 기 (즉, 당과 염기가 결여된 뉴클레오티드), 하나 이상의 스페이서 9 (iSp9) 기 또는 하나 이상의 스페이서 18 (iSp18) 기를 사용할 수 있다. 이러한 스페이서는 리더 서열이 단계 (b) 및 (c)에서 주형으로서 사용되지 않으므로, 상기 방법이 끝날 무렵 단일 가닥인 채로 있다는 것을 의미한다. 이로써, 리더 서열은 그의 기능을 수행할 수 있게 된다. 이의 한 예가 도 5에 도시된다.
리더 서열은 세공 내로 우선적으로 삽입된다. 리더 서열은 본 발명의 특징 규명 방법을 촉진시켜 준다. 리더 서열은 세공 내로 우선적으로 삽입됨으로써, 폴리뉴클레오티드가 세공을 통하여 이동하는 것을 촉진시키도록 설계된다. 리더 서열은 또한, 다음에 논의되는 바와 같은 하나 이상의 앵커(anchor)에 폴리뉴클레오티드를 연결시키기 위해 사용될 수 있다. 리더 서열은 전형적으로 중합체를 포함한다. 중합체는 바람직하게 음전하를 띤다. 중합체는 바람직하게 폴리뉴클레오티드, 예컨대 DNA 또는 RNA, 변형된 폴리뉴클레오티드 (예컨대 탈염기성 DNA), PNA, LNA, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 폴리펩티드이다. 리더는 바람직하게 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 보다 바람직하게 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 리더 서열은 상기 논의된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 단일 가닥 리더 서열은 가장 바람직하게, 단일 가닥의 DNA, 예컨대 폴리 dT 섹션을 포함한다. 리더 서열은 바람직하게 하나 이상의 스페이서를 포함한다.
리더 서열은 임의의 길이일 수 있지만, 전형적으로 그 길이가 10 내지 150개의 뉴클레오티드, 예컨대 그 길이가 20 내지 150개의 뉴클레오티드이다. 리더의 길이는 전형적으로, 상기 방법에 사용된 막횡단 세공에 좌우된다.
단편화
트랜스포사제는 주형 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 단편화하여 복수 개의 이중 가닥 단편을 형성시킨다. 트랜스포사제는 또한, 기질을 이중 가닥 단편의 한 말단 또는 양 말단에 라이게이션시킴으로써 복수 개의 단편/기질 구축물을 생성시킨다. 트랜스포사제는 바람직하게, 기질을 이중 가닥 단편의 양 말단에 라이게이션시킴으로써, 각각 양 말단에 헤어핀 루프를 갖는 복수 개의 단편/기질 구축물을 생성시킨다. 이의 예가 도 1에 도시될 수 있다.
폴리머라제
트랜스포사제에 의해 생성된 단편/기질 구축물은 폴리머라제와 접촉시킨다. 다음에 논의된 폴리머라제 중 임의의 것을 사용할 수 있다. 폴리머라제는 바람직하게 클레나우(Klenow) 또는 9°노스(North)이다. 폴리머라제는 보다 바람직하게, LongAmp? Taq DNA 폴리머라제 [이는 뉴 잉글랜드 바이오랩스 인크.(New England Biolabs? Inc.)로부터 시판되고 있다], 푸션(Phusion?) 고 성능 DNA 폴리머라제 (이는 뉴 잉글랜드 바이오랩스? 인크.로부터 시판되고 있다) 또는 KAPA 하이파이(HiFi) [이는 KAPA 바이오시스템즈(Biosystems)로부터 시판되고 있다]이다.
상기 구축물은, 폴리머라제가 오버행 가닥을 옮겨놓고 보체 폴리뉴클레오티드를 형성할 수 있는 조건하에 폴리머라제와 접촉시킨다. 이러한 조건은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 구축물은 전형적으로, 시판용 폴리머라제 완충제, 예컨대 뉴 잉글랜드 바이오랩스? 또는 KAPA 바이오시스템즈로부터의 완충제 중의 폴리머라제와 접촉시킨다. 온도는 클레나우의 경우에는 바람직하게 20 내지 37℃이거나 또는 9°노스, LongAmp? Taq DNA 폴리머라제, 푸션? 고성능 DNA 폴리머라제 또는 KAPA 하이파이의 경우에는 60 내지 75℃이다.
폴리머라제는 상기 단편/기질 구축물로부터 오버행을 포함하는 가닥을 옮겨놓는다. 폴리머라제는 이러한 오버행 가닥을, 헤어핀 루프를 포함하는 가닥을 보완하는 새로운 가닥으로 대체시킨다. 이로써, 각각 주형 폴리뉴클레오티드의 이중 가닥 단편을 포함하는 복수 개의 이중 가닥 구축물이 생성된다. 폴리머라제에 의해 형성된 새로운 가닥의 일부가 전형적으로, 헤어핀 루프에 상보적이다. 이는 헤어핀 루프가 전형적으로, 구축물 내의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 일부를 형성한다는 것을 의미한다. 이의 한 예가 도 1에 도시될 수 있다.
폴리머라제는 상기 및 하기에 논의된 뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는 새로운 가닥을 형성시킬 수 있다. 폴리머라제는 헤어핀 루프를 포함하는 가닥 내의 뉴클레오티드를 보완하는 유리 뉴클레오티드의 집단에 제공된다. 폴리머라제는 유리 뉴클레오티드를 이용하여 새로운 가닥을 형성시킬 수 있다.
분리/복제
이중 가닥 구축물의 두 가닥을 분리시키고, 이러한 가닥을 주형으로서 사용하여, 각각 적어도 하나의 헤어핀 루프에 의해 연결된 두 상보적 가닥을 포함하는 복수 개의 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 형성시킨다. 이의 한 예가 도 1에 도시된다.
상기 두 가닥은, 이들을 주형으로서 사용하기 전에 완전히 분리시킬 수 있다. 두 가닥은 동일한 시간에 (즉, 동시에) 분리시키고 주형으로서 사용될 수 있다. 다시 말해서, 두 가닥은 이들을 주형으로서 사용하기 전에 완전히 분리시킬 필요가 없거나 또는 부분적으로 분리시킬 수 있다.
두 가닥은 임의의 방식으로 분리시킬 수 있다. 그 방법은 바람직하게, pH, 온도 및 이온 강도 중 하나 이상을 증가시킴으로써 이중 가닥 구축물의 두 가닥을 분리시키는 것을 포함한다. 증가된 온도가 바람직하다. 상기 방법은 바람직하게, 온도를 95℃로 증가시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 바람직하게, 온도를 95℃로 증가시킨 다음, 온도를 55℃로 감소시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 바람직하게, 온도를 95℃로 증가시키고, 온도를 55℃로 감소시키며, 온도를 68℃로 증가시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 가장 바람직하게, 이중 가닥 구축물을 95℃에서 2분 동안, 55℃에서 30초 동안 및 68℃에서 30분 동안 인큐베이션하는 것을 포함한다. pH 상의 증가는 포름아미드 또는 수산화나트륨 (NaOH)을 이용하여 달성될 수 있다. 효소, 예컨대 헬리카제 또는 주형 가닥을 소화시키는 효소 (예를 들어, 그 가닥이 dT 대신 dU를 갖는 경우, USER)를 또한 이용하여 가닥을 분리시킬 수 있다. 다음에 논의되는 헬리카제 중 임의의 것을 사용할 수 있다.
다음에 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 두 가닥은 폴리머라제를 이용하여 분리시킬 수 있다. 폴리머라제는 상기 또는 하기에 논의된 것 중 임의의 것일 수 있다.
임의의 방법을 이용하여, 주형으로서 상기 분리된 가닥을 사용하여 새로운 폴리뉴클레오티드를 형성할 수 있다. 이러한 방법은 바람직하게, 상기 가닥을 폴리머라제와 접촉시켜, 이러한 폴리머라제가 주형으로서 상기 가닥을 사용하여 복수 개의 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 형성하도록 하는 것을 포함한다. 상기 또는 하기에 논의된 폴리머라제 중 임의의 것을 사용할 수 있다.
또 다른 한편으론, 본 방법은 (i) 복수 개의 가닥을, 뉴클레오티드 올리고머가 이러한 가닥과 혼성화할 수 있는 조건하에 상기 가닥 내의 모든 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드의 모든 가능한 조합을 포함하는 뉴클레오티드 올리고머의 집단과 접촉시키는 단계; 및 (ii) 상기 가닥과 혼성화하는 올리고머를 함께 라이게이션하여 복수 개의 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 형성시키는 단계를 포함할 수 있다. 혼성화를 허용하는 조건은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press; and Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York (1995)]). 혼성화는 저 수준의 엄격성 조건하에, 예를 들어 37℃ 하에 30 내지 35% 포름아미드, 1 M NaCl 및 1% SDS (소듐 도데실 술페이트)의 완충 용액의 존재하에, 이어서 50℃ 하에 1 X (0.1650 M Na+) 내지 2 X (0.33 M Na+) SSC (표준 소듐 시트레이트)에서 세척함으로써 수행될 수 있다. 혼성화는 중간 수준의 엄격성 조건 하에, 예를 들어 37℃ 하에 40 내지 45% 포름아미드, 1 M NaCl, 및 1% SDS의 완충제 용액의 존재하에, 이어서 55℃ 하에 0.5 X (0.0825 M Na+) 내지 1 X (0.1650 M Na+) SSC에서 세척함으로써 수행될 수 있다. 혼성화는 고 수준의 엄격성 조건하에, 예를 들어 37℃ 하에 50% 포름아미드, 1 M NaCl 및 1% SDS의 완충 용액의 존재하에, 이어서 60℃ 하에 0.1 X (0.0165 M Na+) SSC에서 세척함으로써 수행될 수 있다. 바람직한 조건은 바람직하게, 10 mM 트리스-HCl, 50 mM NaCl, pH 7 중의 10 uM 올리고머 및 98℃로의 가열 후, 분당 2℃로 18℃까지 냉각시킨다.
집단 내의 올리고머는 전형적으로 2 내지 16개의 뉴클레오티드를 갖는다. 집단 내의 모든 올리고머는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 집단 내의 올리고머는 상이한 길이를 가질 수 있다. 집단 내의 모든 올리고머는 바람직하게 동일한 길이를 가질 수 있다. 이러한 올리고머는 상기 논의된 뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 올리고머와 혼성화되는 가닥 내의 뉴클레오티드에 상보적이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 이들 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드를 확인하는 것은 간단한 일이다. 특정 뉴클레오티드가 염기쌍 형성, 바람직하게 왓슨 앤 크릭(Watson and Crick) 염기쌍 형성을 통하여 또 다른 뉴클레오티드와 혼성화되는 경우에, 이러한 뉴클레오티드는 또 다른 뉴클레오티드에 상보적이다. 상보적 뉴클레오티드는, 이와 상보적이지 않은 다른 뉴클레오티드와 혼성화될 수 있긴 하지만, 그와 상보적인 뉴클레오티드와 혼성화되는 것보다 더 적은 정도로 혼성화된다. N은 바람직하게, 핵염기 아데닌 (A), 우라실 (U), 구아닌 (G) 또는 시토신 (C)을 포함한다. 또 다른 한편으론, N은 바람직하게, 핵염기 A, 티민 (T), G 또는 C를 포함한다. A는 T 또는 U에 상보적이고 그 반대의 경우도 마찬가지이다. G는 C에 상보적이고 그 반대의 경우도 마찬가지이다.
상기 집단은 가닥 내의 모든 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드의 모든 가능한 조합을 포함한다. 이는 올리고머의 서열이 무엇이든지 간에, 올리고머가 전부는 아니지만 대부분의 가닥과 혼성화될 것이라는 것을 의미한다. 예를 들어, N이 핵염기 아데닌 (A), 우라실 (U), 구아닌 (G) 또는 시토신 (C)을 포함하는 경우, 상기 집단은 A, U, G 및 C의 모든 가능한 조합을 포함한다. 유사하게, N이 핵염기 A, 티민 (T), G 또는 C를 포함하는 경우, 상기 집단은 A, T, G 및 C의 모든 가능한 조합을 포함한다.
필요한 조합을 갖는 올리고머의 집단을 설계하고 수득하는 것은 간단하다. 예를 들어, 집단 내의 모든 올리고머가 NN을 포함하거나 또는 이로 이루어지고 N이 A, T, G 또는 C인 경우, 상기 집단은 AT, AG, AC, TA, TG, TC, GA, GT, GC, CA, CT 및 CG를 포함한다. 유사하게, 집단 내의 모든 올리고머가 NNN을 포함하거나 또는 이로 이루어지고 N이 A, T, G 또는 C인 경우, 상기 집단은 ATG, ATC, AGT, AGC, ACT, ACG, TAG, TAC, TGA, TGC, TCA, TCG, GAT, GAC, GTA, GTC, GCA, GCT, CAT, CAG, CTA, CTG, CGA 및 CGT를 포함한다. 일단 일반식, 예컨대 NN 또는 NNN이 설계되면, N의 가능한 조합 모두를 포함하는 집단이, 예를 들어 인티그레이티드 DNA 테크놀러지(Intergrated DNA Technologies; IDT), 시그마(Sigma) 및 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 시판되고 있다.
올리고머는 본 발명에 따라서 함께 라이게이션될 수 있다. 집단 내의 모든 올리고머는 바람직하게, 5' 말단에 포스페이트 기 또는 아데닐레이트 기를 갖는다.
혼성화된 올리고머는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 함께 라이게이션할 수 있다. 이러한 올리고머는 바람직하게, 리가제, 예컨대 T4 DNA 리가제, 이. 콜라이 DNA 리가제, Taq DNA 리가제, Tma DNA 리가제 및 9°N DNA 리가제를 이용하여 라이게이션한다.
올리고머는 또한, 반응성 기가 올리고머의 말단 상에 존재하는 경우에는, 화학적으로 라이게이션할 수 있다. 이러한 실시양태에서는, 올리고머가 용액 중에서 서로 라이게이션되지 못하도록 하는 단계를 수행할 필요가 있다. 라이게이션 반응은 전형적으로, 프라이머로서 특정 가닥 상의 헤어핀을 사용하여 개시된다.
바람직한 실시양태에서, 본 방법은 바람직하게, 복수 개의 이중 가닥 구축물을 폴리머라제와 접촉시켜, 이러한 폴리머라제가 이중 가닥 구축물의 두 가닥을 동시에 분리시키고 주형으로서 이들 가닥을 사용하여 복수 개의 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 형성시키도록 하는 것을 포함한다. 상기 또는 하기에 논의된 폴리머라제 중 임의의 것을 사용할 수 있다. 폴리머라제는 상기 또는 하기에 논의된 뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는 새로운 가닥을 형성할 수 있다. 폴리머라제는 주형 가닥 내의 뉴클레오티드를 보완하는 유리 뉴클레오티드의 집단에 제공된다. 폴리머라제는 유리 뉴클레오티드를 이용하여 새로운 가닥을 형성시킬 수 있다.
변형된 폴리뉴클레오티드
폴리머라제가 가닥을 주형으로서 사용하여 복수 개의 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 형성시키는 경우, 그 방법은 폴리머라제가 상기 가닥을 주형으로서 사용하여 복수 개의 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 형성시키는 조건하에, 가닥을 폴리머라제 및 유리 뉴클레오티드의 집단과 접촉시키는 것을 포함할 수 있는데, 여기서 폴리머라제는 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 형성시킬 때, 가닥 내의 뉴클레오티드 종 중 하나 이상을 상이한 뉴클레오티드 종으로 대체시킨다. 폴리머라제를 사용하여 상기 논의된 바와 같이 가닥을 동시에 분리시킬 수 있다. 이러한 유형의 변형은 UK 출원 번호 1403096.9에 기재되어 있다. 상기 또는 하기에 논의된 폴리머라제 중 임의의 것을 사용할 수 있다. 폴리머라제는 바람직하게 클레나우 또는 9°노스이다. 적합한 조건이 상기에 논의되어 있다.
막횡단 세공을 이용하여 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명하는 것, 예컨대 서열 분석하는 것은 전형적으로, k 뉴클레오티드 (여기서, k는 양의 정수이다) [즉, 'k-량체(k-mer)']로 구성된 중합체 단위를 분석하는 것을 포함한다. 이는 국제 출원 번호 PCT/GB2012/052343 (WO 2013/041878로서 공개됨)에 논의되어 있다. 상이한 k-량체에 대한 전류 측정치 간을 명확히 분리하는 것이 바람직하지만, 이러한 측정치 중 일부는 중복되는 것이 일반적이다. 특히 k-량체 내의 중합체 단위의 수가 많으면, 즉 k 값이 높으면, 상이한 k-량체에 의해 생성된 측정치를 결정하는 것이 어려워질 수 있어, 폴리뉴클레오티드에 관한 정보, 예를 들어 폴리뉴클레오티드의 기본 서열의 추정을 유도하는 데에 손상이 초래된다.
가닥 내의 하나 이상의 뉴클레오티드 종을, 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 새로운 가닥 (즉, 폴리머라제를 이용하여 생성된 가닥) 내의 상이한 뉴클레오티드 종으로 대체함으로써, 새로운 가닥은 주형 가닥 내의 것과 상이한 k-량체를 함유한다. 새로운 가닥 내의 상이한 k-량체는 주형 가닥 내의 k-량체와는 상이한 전류 측정치를 생성시킬 수 있으므로, 새로운 가닥은 주형 가닥과 상이한 정보를 제공한다. 새로운 가닥으로부터의 부가의 정보는 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명하므로, 주형 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명하는 것을 더 용이하게 만들 수 있다. 일부 경우에는, 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 자체의 특징을 규명하는 것이 더 용이할 수 있다. 예를 들어, 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는 그들의 전류 측정치 간의 증가된 분리 또는 명확한 분리를 수반하는 k-량체 또는 감소된 소음을 갖는 k-량체를 포함하도록 설계될 수 있다.
폴리머라제는 바람직하게, 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 형성시킬 때, 주형 가닥 내의 2개 이상의 뉴클레오티드 종을 상이한 뉴클레오티드 종으로 대체시킨다. 폴리머라제는 주형 가닥 내의 2개 이상의 뉴클레오티드 종 각각을 별개의 뉴클레오티드 종으로 대체시킬 수 있다. 폴리머라제는 주형 가닥 내의 2개 이상의 뉴클레오티드 종 각각을 동일한 뉴클레오티드 종으로 대체시킬 수 있다.
주형 가닥이 DNA인 경우, 상이한 뉴클레오티드 종은 전형적으로, 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신 또는 메틸시토신과 상이한 핵염기를 포함하고/하거나 데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 티미딘, 데옥시시티딘 또는 데옥시메틸시티딘과 상이한 뉴클레오시드를 포함한다. 주형 가닥이 RNA인 경우, 변형된 폴리뉴클레오티드 내의 상이한 뉴클레오티드 종은 전형적으로, 아데닌, 구아닌, 우라실, 시토신 또는 메틸시토신과 상이한 핵염기를 포함하고/하거나 아데노신, 구아노신, 우리딘, 시티딘 또는 메틸시티딘과 상이한 뉴클레오시드를 포함한다.
상이한 뉴클레오티드 종은 범용(universal) 뉴클레오티드일 수 있다. 범용 뉴클레오티드는 주형 가닥 내의 모든 뉴클레오티드와 어느 정도 혼성화되거나 또는 결합되는 것이다. 범용 뉴클레오티드는 바람직하게, 뉴클레오시드 아데노신 (A), 티민 (T), 우라실 (U), 구아닌 (G) 및 시토신 (C)을 포함하는 뉴클레오티드와 어느 정도 혼성화되거나 또는 결합되는 것이다. 범용 뉴클레오티드는 다른 뉴클레오티드 보다 일부 뉴클레오티드와 더 강력하게 혼성화되거나 또는 결합될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오시드인 2'-데옥시이노신을 포함하는 범용 뉴클레오티드 (I)는 I-C > I-A > I-G 대략 = I-T의 쌍형성의 우선 순위를 나타낼 것이다. 범용 뉴클레오티드가 집단 내의 뉴클레오티드 종을 대신하는 경우, 이러한 폴리머라제는 뉴클레오티드 종을 범용 뉴클레오티드로 대체시킬 것이다. 예를 들어, 유리 dAMP, dTMP, dCMP의 집단과 범용 뉴클레오티드를 접촉시키는 경우에는, 폴리머라제가 dGMP를 범용 뉴클레오티드로 대체시킬 것이다.
범용 뉴클레오티드는 바람직하게, 다음 핵염기 중 하나를 포함한다: 히포크산틴, 4-니트로인돌, 5-니트로인돌, 6-니트로인돌, 포르밀인돌, 3-니트로피롤, 니트로이미다졸, 4-니트로피라졸, 4-니트로벤즈이미다졸, 5-니트로인다졸, 4-아미노벤즈이미다졸 또는 페닐 (C6-방향족 환). 범용 뉴클레오티드는 보다 바람직하게, 다음 뉴클레오시드 중 하나를 포함한다: 2'-데옥시이노신, 이노신, 7-데아자-2'-데옥시이노신, 7-데아자-이노신, 2-아자-데옥시이노신, 2-아자-이노신, 2-O'-메틸이노신, 4-니트로인돌 2'-데옥시리보뉴클레오시드, 4-니트로인돌 리보뉴클레오시드, 5-니트로인돌 2' 데옥시리보뉴클레오시드, 5-니트로인돌 리보뉴클레오시드, 6-니트로인돌 2' 데옥시리보뉴클레오시드, 6-니트로인돌 리보뉴클레오시드, 3-니트로피롤 2' 데옥시리보뉴클레오시드, 3-니트로피롤 리보뉴클레오시드, 히포크산틴의 아사이클릭 당 유사체, 니트로이미다졸 2' 데옥시리보뉴클레오시드, 니트로이미다졸 리보뉴클레오시드, 4-니트로피라졸 2' 데옥시리보뉴클레오시드, 4-니트로피라졸 리보뉴클레오시드, 4-니트로벤즈이미다졸 2' 데옥시리보뉴클레오시드, 4-니트로벤즈이미다졸 리보뉴클레오시드, 5-니트로인다졸 2' 데옥시리보뉴클레오시드, 5-니트로인다졸 리보뉴클레오시드, 4-아미노벤즈이미다졸 2' 데옥시리보뉴클레오시드, 4-아미노벤즈이미다졸 리보뉴클레오시드, 페닐 C-리보뉴클레오시드, 페닐 C-2'-데옥시리보실 뉴클레오시드, 2'-데옥시네불라린, 2'-데옥시이소구아노신, K-2'-데옥시리보스, P-2'-데옥시리보스 및 피롤리딘. 범용 뉴클레오티드는 보다 바람직하게 2'-데옥시이노신을 포함한다. 범용 뉴클레오티드는 보다 바람직하게 IMP 또는 dIMP이다. 범용 뉴클레오티드는 가장 바람직하게 dPMP (2'-데옥시-P-뉴클레오시드 모노포스페이트) 또는 dKMP (N6-메톡시-2,6-디아미노퓨린 모노포스페이트)이다.
상이한 뉴클레오티드 종은 바람직하게, 그것이 대체하는 뉴클레오티드 종으로부터 부재하는 화학적 원자 또는 기를 포함한다. 이러한 화학적 기는 바람직하게, 프로피닐 기, 티오 기, 옥소 기, 메틸 기, 히드록시메틸 기, 포르밀 기, 카르복시 기, 카르보닐 기, 벤질 기, 프로파르길 기 또는 프로파르길아민 기이다. 화학적 기 또는 원자는 형광성 분자, 비오틴, 디곡시게닌, DNP (디니트로페놀), 광 불안정한 기, 알킨, DBCO, 아지드, 유리 아미노 기, 레독스 염료, 수은 원자 또는 셀레늄 원자일 수 있거나 또는 이를 포함할 수 있다.
자연 발생적 뉴클레오시드로부터 부재하는 화학적 기를 포함하는 시판용 뉴클레오시드는 6-티오-2'-데옥시구아노신, 7-데아자-2'-데옥시아데노신, 7-데아자-2'-데옥시구아노신, 7-데아자-2'-데옥시크산토신, 7-데아자-8-아자-2'-데옥시아데노신, 8-5'(5'S)-시클로-2'-데옥시아데노신, 8-아미노-2'-데옥시아데노신, 8-아미노-2'-데옥시구아노신, 8-중수소화-2'-데옥시구아노신, 8-옥소-2'-데옥시아데노신, 8-옥소-2'-데옥시구아노신, 에테노-2'-데옥시아데노신, N6-메틸-2'-데옥시아데노신, O6-메틸-2'-데옥시구아노신, O6-페닐-2'데옥시이노신, 2'-데옥시슈도우리딘, 2-티오티미딘, 4-티오-2'-데옥시우리딘, 4-티오티미딘, 5' 아미노티미딘, 5-(1-피레닐에티닐)-2'-데옥시우리딘, 5-(C2-EDTA)-2'-데옥시우리딘, 5-(카르복시)비닐-2'-데옥시우리딘, 5,6-디히드로-2'-데옥시우리딘, 5,6-디히드로티미딘, 5-브로모-2'-데옥시시티딘, 5-브로모-2'-데옥시우리딘, 5-카르복시-2'-데옥시시티딘, 5-플루오로-2'-데옥시우리딘, 5-포르밀-2'-데옥시시티딘, 5-히드록시-2'-데옥시시티딘, 5-히드록시-2'-데옥시우리딘, 5-히드록시메틸-2'-데옥시시티딘, 5-히드록시메틸-2'-데옥시우리딘, 5-아이오도-2'-데옥시시티딘, 5-아이오도-2'-데옥시우리딘, 5-메틸-2'-데옥시시티딘, 5-메틸-2'-데옥시이소시티딘, 5-프로피닐-2'-데옥시시티딘, 5-프로피닐-2'-데옥시우리딘, 6-O-(TMP)-5-F-2'-데옥시우리딘, C4-(1,2,4-트리아졸-1-일)-2'-데옥시우리딘, C8-알킨-티미딘, dT-페로센, N4-에틸-2'-데옥시시티딘, O4-메틸티미딘, 피롤로-2'-데옥시시티딘, 티미딘 글리콜, 4-티오우리딘, 5-메틸시티딘, 5-메틸우리딘, 피롤로시티딘, 3-데아자-5-아자-2'-O-메틸시티딘, 5-플루오로-2'-O-메틸우리딘, 5-플루오로-4-O-TMP-2'-O-메틸우리딘, 5-메틸-2'-O-메틸시티딘, 5-메틸-2'-O-메틸티미딘, 2',3'-디데옥시아데노신, 2',3'-디데옥시시티딘, 2',3'-디데옥시구아노신, 2',3'-디데옥시티미딘, 3'-데옥시아데노신, 3'-데옥시시티딘, 3'-데옥시구아노신, 3'-데옥시티미딘 및 5'-O-메틸티미딘을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 상이한 뉴클레오티드 종은 이들 뉴클레오시드 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
또 다른 한편으론, 상이한 뉴클레오티드 종은 바람직하게, 그것이 대체하는 뉴클레오티드 종에 존재하는 화학적 기 또는 원자가 결여된다.
상이한 뉴클레오티드 종은 바람직하게, 대체되는 하나 이상의 뉴클레오티드와 비교해서 변경된 전기 음성도를 갖는다. 변경된 전기 음성도를 갖는 상이한 뉴클레오티드 종은 바람직하게 할로겐 원자를 포함한다. 할로겐 원자는 상이한 뉴클레오티드 종 상의 임의의 위치, 예컨대 핵염기 및/또는 당에 부착될 수 있다. 할로겐 원자는 바람직하게 플루오린 (F), 염소 (Cl), 브로민 (Br) 또는 아이오딘 (I)이다. 할로겐 원자는 가장 바람직하게 F 또는 I이다.
할로겐을 포함하는 시판용 뉴클레오시드는 8-브로모-2'-데옥시아데노신, 8-브로모-2'-데옥시구아노신, 5-브로모우리딘, 5-아이오도우리딘, 5-브로모우리딘, 5-아이오도우리딘, 5'-아이오도티미딘 및 5-브로모-2'-O-메틸우리딘을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 상이한 뉴클레오티드 종은 이들 뉴클레오시드 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
방법은 바람직하게, 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 내의 하나 이상의 상이한 뉴클레오티드 종으로부터 핵염기를 선택적으로 제거하는 것을 추가로 포함한다. 이로써, 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 내에 탈염기성 뉴클레오티드가 초래된다. 탈염기성 뉴클레오티드는 핵염기가 결여된 뉴클레오티드이다. 탈염기성 뉴클레오티드는 전형적으로 당 및 적어도 하나의 포스페이트 기를 함유한다. 당은 전형적으로 펜토스 당, 예컨대 리보스 및 데옥시리보스이다. 탈염기성 뉴클레오티드는 전형적으로 탈염기성 리보뉴클레오티드 또는 탈염기성 데옥시리보뉴클레오티드이다. 탈염기성 뉴클레오티드는 전형적으로 모노포스페이트, 디포스페이트 또는 트리포스페이트를 함유한다. 포스페이트는 탈염기성 뉴클레오티드의 5' 또는 3' 측면 상에 부착될 수 있다.
핵염기는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 선택적으로 제거할 수 있다. 예를 들어, 특정의 DNA 복구 단백질, 예컨대 인간 알킬아데닌 DNA 글리코실라제 (hAAG)는 뉴클레오티드로부터 3-메틸 아데닌, 7-메틸 구아닌, 1, N6-에테노아데닌 및 히포크산틴을 선택적으로 제거할 수 있다. 또한, dUMP는 우라실 DNA 글리코실라제를 이용하여 선택적으로 제거할 수 있다.
부가의
폴리머라제
단계
또 다른 바람직한 실시양태에서, 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 내의 정보량은 주형 폴리뉴클레오티드의 특징 규명을 촉진시키기 위해 2배로 된다. 이의 한 예가 도 8에 도시된다. 그 방법은 바람직하게, (d) 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 두 가닥을 분리시키고; 이들 가닥을 주형으로서 사용하여, 각각 적어도 하나의 헤어핀 루프에 의해 연결된 두 상보적 가닥을 포함하는 복수 개의 개조된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계 (여기서, 각 상보적 가닥은 2개의 상보적 서열을 포함한다)를 포함한다. 각 상보적 가닥 내의 2개의 상보적 서열 중 하나는 주형 이중 가닥 폴리뉴클레오티드로부터 유래된다. 단계 (d)는 전형적으로, 분리시키기 전에, 상보적 가닥을 연결시키는 적어도 하나의 헤어핀 루프로부터 상기 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 다른 말단에서 상기 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에 헤어핀 루프를 부착시키는 것을 포함한다. 이러한 헤어핀 루프는 바람직하게, 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 가닥을 연결시키지 않는다. 헤어핀은 폴리머라제에 대한 핵형성 지점을 형성할 수 있다. 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 분리된 가닥이 주형으로서 사용될 때, 상기 부착된 헤어핀 루프가 또한 주형으로서 사용되고, 상기 개조된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 두 상보적 가닥을 연결시켜 주는데, 즉 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드로부터의 주형 가닥과 주형으로부터 형성된 새로운 가닥을 연결시켜 준다.
단계 (d)는 상기 논의된 방식 중 임의의 것으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 단계 (d)는 pH, 온도 및 이온 강도 중 하나 이상을 증가시킴으로써, 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 두 가닥을 분리시키는 것을 포함할 수 있다. 단계 (d)는 상기 분리된 가닥을 폴리머라제와 접촉시켜, 이러한 폴리머라제가 상기 가닥을 주형으로서 사용하여 복수 개의 개조된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 형성하도록 하는 것을 포함할 수 있다. 단계 (d)는 (i) 복수 개의 분리된 가닥을, 뉴클레오티드 올리고머가 이러한 가닥과 혼성화할 수 있는 조건하에 상기 가닥 내의 모든 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드의 모든 가능한 조합을 포함하는 뉴클레오티드 올리고머의 집단과 접촉시키는 단계; 및 (ii) 상기 가닥과 혼성화되는 올리고머를 함께 라이게이션하여 복수 개의 개조된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 형성시키는 단계를 포함할 수 있다. 단계 (d)는 복수 개의 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 폴리머라제와 접촉시켜, 이러한 폴리머라제가 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 두 가닥을 동시에 분리시키고 이들 가닥을 주형으로서 사용하여 복수 개의 개조된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 형성시키도록 하는 것을 포함할 수 있다. 상기 논의된 실시양태 중 임의의 것을 단계 (d)에 적용할 수 있다. 예를 들어, 단계 (d)는 주형 가닥 내의 하나 이상의 뉴클레오티드 종을 새로운 가닥 내의 상이한 뉴클레오티드 종으로 대체시키는 것을 포함할 수 있다.
Y 어댑터
각 기질이 리더 서열을 포함하지 않는 경우, 그 방법은 바람직하게는 복수 개의 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에, 헤어핀 루프와는 반대 말단에서 Y 어댑터를 부착시키는 것을 추가로 포함한다. Y 어댑터는 전형적으로 폴리뉴클레오티드 어댑터이다. 이들은 상기 논의된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것으로부터 형성될 수 있다. Y 어댑터는 전형적으로, (a) 이중 가닥 영역 및 (b) 단일 가닥 영역; 또는 다른 말단에서 상보적이지 않은 영역을 포함한다. Y 어댑터는 이것이 단일 가닥 영역을 포함하는 경우에 오버행을 갖는 것으로서 기재될 수 있다. Y 어댑터 내에 비-상보적 영역이 존재함으로써 어댑터에 Y자 모양이 제공되는데, 이는 두 가닥이 전형적으로 이중 가닥 부분과는 달리 서로 혼성화되지 않기 때문이다. Y 어댑터는 다음에 보다 상세히 논의되는 바와 같은 하나 이상의 앵커를 포함할 수 있다.
Y 어댑터는 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에 라이게이션될 수 있다. 라이게이션은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, Y 어댑터는 리가제, 예컨대 T4 DNA 리가제, 이. 콜라이 DNA 리가제, Taq DNA 리가제, Tma DNA 리가제 및 9°N DNA 리가제를 이용하여 라이게이션될 수 있다.
본 발명의 생성물
본 발명은 또한, 주형 폴리뉴클레오티드를 변형시키기 위한 이중 가닥 MuA 기질의 집단을 제공하는데, 여기서 각 기질은 범용 뉴클레오티드의 적어도 하나의 오버행을 포함한다. 본 발명은 또한, 주형 폴리뉴클레오티드를 변형시키기 위한 이중 가닥 MuA 기질의 집단을 제공하는데, 여기서 각 기질은 (i) 적어도 하나의 오버행 및 (ii) 이러한 적어도 하나의 오버행을 포함하는 가닥으로부터 반대 가닥 내의 적어도 하나의 헤어핀 루프를 포함한다. 기질은 상기 논의된 것들 중 임의의 것일 수 있다. 기질은 바람직하게, 상기 정의된 바와 같은 이중 가닥 부분을 포함한다. 이중 가닥 부분은 바람직하게, 상기 논의된 바와 같은 서열식별번호: 26 및 27을 포함한다. 이중 가닥 부분은 보다 바람직하게, 상기 논의된 바와 같은 서열식별번호: 26 및 28을 포함한다. 본 발명의 바람직한 집단은 각 기질이 한 말단에 오버행을 포함하고 다른 말단에 헤어핀 루프를 포함하는 것이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 방법을 이용하여 변형시킨 복수 개의 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 복수 개의 폴리뉴클레오티드는 상기 논의된 형태 중 임의의 것으로 존재할 수 있다. 상기 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는 헤어핀 루프에 의해 연결된 주형 폴리뉴클레오티드의 이중 가닥 단편을 포함하는 두 상보적 가닥을 포함한다.
집단 또는 복수 개는 분리하거나, 실질적으로 분리하거나, 정제하거나 또는 실질적으로 정제할 수 있다. 집단 또는 복수 개는 임의의 다른 성분, 예컨대 주형 폴리뉴클레오티드, 지질 또는 세공이 완전히 없는 경우에 단리되거나 또는 정제된다. 집단 또는 복수 개는 그의 사용 목적을 방해하지 않을 담체 또는 희석제와 혼합되는 경우에 실질적으로 단리된다. 예를 들어, 집단 또는 복수 개는 다른 성분, 예컨대 지질 또는 세공을 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만으로 포함하는 형태로 존재하는 경우에 실질적으로 단리되거나 또는 실질적으로 정제된다.
특징 규명 방법
본 발명은 또한, 본 발명의 방법을 이용하여 변형시킨 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명하는 방법을 제공한다. 이러한 변형된 폴리뉴클레오티드는 막횡단 세공과 접촉시켜, 폴리뉴클레오티드의 적어도 하나의 가닥이 세공을 통하여 이동하도록 한다. 적어도 하나의 가닥이 세공에 대하여 이동함에 따라 하나 이상의 측정치를 취한다. 이러한 측정치는 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 특징을 나타내고, 이로써 변형된 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명할 수 있다.
본 발명은 또한, 주형 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명하는 방법을 제공한다. 주형 폴리뉴클레오티드는 본 발명을 이용하여 변형시켜, 복수 개의 변형된 폴리뉴클레오티드를 생성시킨다. 각각의 변형된 폴리뉴클레오티드는 막횡단 세공과 접촉시켜, 각 폴리뉴클레오티드의 적어도 하나의 가닥이 세공을 통하여 이동하도록 한다. 각 폴리뉴클레오티드가 세공에 대하여 이동함에 따라 하나 이상의 측정치를 취한다. 이러한 측정치는 각 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 특징을 나타내고, 이로써 주형 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 상기 각각의 변형된 폴리뉴클레오티드의 양 가닥은 세공을 통하여 이동한다. 양 가닥이 세공을 통하여 이동하는 경우, 두 가닥은 전형적으로 분리된다. 이러한 두 가닥은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 분리시킬 수 있다. 예를 들어, 이들은 폴리뉴클레오티드 결합성 단백질에 의해 분리될 수 있거나 또는 탈혼성화를 선호하는 조건 (탈혼성화를 선호하는 조건의 예는 고온, 높은 pH, 및 수소 결합 또는 염기쌍 형성을 붕괴시킬 수 있는 작용제, 예컨대 포름아미드 및 우레아의 부가를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다)을 이용하여 분리될 수 있다.
막횡단
세공
막횡단 세공은 막을 어느 정도 가로지르는 구조이다. 이는 인가된 전위에 의해 구동되는 수화된 이온이 막을 가로 질러 또는 막 내에서 흐르도록 허용한다. 막횡단 세공은 전형적으로, 전체 막을 가로지르므로, 수화된 이온이 막의 한 측면에서 막의 다른 측면으로 흐를 수 있다. 그러나, 막횡단 세공은 막을 가로지를 필요가 없다. 한쪽 말단이 닫혀있을 수 있다. 예를 들어, 상기 세공은 그를 따라 또는 그 내부로 수화된 이온이 흐를 수 있는 막 내의 웰, 갭, 채널, 트렌치 또는 슬릿(slit)일 수 있다.
하나 이상의 선택적으로 증폭된 프로브 또는 하나 이상의 증폭 생성물은 바람직하게, (i) 상기 프로브 또는 증폭 생성물을 막횡단 세공과 접촉시켜, 이러한 프로브 또는 증폭 생성물이 상기 세공을 통하여 이동하도록 하는 단계 및 (ii) 상기 프로브 또는 증폭 생성물이 세공에 대하여 이동함에 따라 하나 이상의 측정치를 취함으로써 (여기서, 이러한 측정치는 프로브 또는 증폭 생성물의 하나 이상의 특징을 나타낸다), 프로브 또는 증폭 생성물의 특징을 규명하는 단계에 의해 그 특징이 규명된다.
임의의 막횡단 세공이 본 발명에 사용될 수 있다. 세공은 생물학적 또는 인공적일 수 있다. 적합한 세공은 단백질 세공, 폴리뉴클레오티드 세공 및 고체 상태 세공을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 세공은 DNA 오리가미(origami) 세공일 수 있다 (Langecker et al., Science, 2012; 338: 932-936).
막횡단 세공은 바람직하게 막횡단 단백질 세공이다.
본 발명에 따라서 사용하기 위한 막횡단 단백질 세공은 β-배럴 세공 또는 α-나선 번들 세공으로부터 유래될 수 있다. β-배럴 세공은 β-가닥으로부터 형성되는 배럴 또는 채널을 포함한다. 적합한 β-배럴 세공은 β 세공 형성성 독소, 예컨대 α-헤모리신, 탄저균 독소 및 류코시딘, 및 박테리아의 외막 단백질/포린, 예컨대 미코박테리움 스메그마티스 (Mycobacterium smegmatis) 포린 (Msp), 예를 들어 MspA, MspB, MspC 또는 MspD, 외막 포린 F (OmpF), 외막 포린 G (OmpG), 외막 포스포리파제 A 및 네이세리아 (Neisseria) 자동 수송체 지질단백질 (NalP), 및 다른 세공, 예컨대 리세닌(lysenin)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. α-나선 번들 세공은 α-나선으로부터 형성되는 배럴 또는 채널을 포함한다. 적합한 α-나선 번들 세공은 내막 단백질 및 α 외막 단백질, 예컨대 WZA 및 ClyA 독소를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 막횡단 세공은 리세닌으로부터 유래될 수 있다. 리세닌으로부터 유래된 적합한 세공은 국제 출원 번호 PCT/GB2013/050667 (WO 2013/153359로서 공개됨)에 개시된다. 막횡단 세공은 Msp, 예컨대 MspA로부터 유래되거나 또는 α-헤모리신 (α-HL)으로부터 유래될 수 있다. 야생형 α-HL 세공은 7개의 동일한 단량체 또는 서브유닛으로 형성된다 (즉, 이것은 7량체이다). α-헤모리신-NN의 하나의 단량체 또는 서브유닛의 서열이 서열식별번호: 4에 제시된다.
막횡단 단백질 세공은 바람직하게 Msp, 바람직하게 MspA로부터 유래된다. 이러한 세공은 올리고머성일 것이고, 전형적으로 Msp로부터 유래된 7, 8, 9 또는 10개의 단량체를 포함한다. 상기 세공은 동일한 단량체를 포함하는 Msp로부터 유래된 동종-올리고머성 세공일 수 있다. 또 다른 한편으론, 상기 세공은 다른 것과 상이한 적어도 하나의 단량체를 포함하는 Msp로부터 유래된 이종-올리고머성 세공일 수 있다. 바람직하게 상기 세공은 MspA 또는 그의 상동체 또는 파라로그(paralog)로부터 유래된다.
Msp로부터 유래된 단량체는 전형적으로, 서열식별번호: 2에 제시된 서열 또는 그의 변이체를 포함한다. 서열식별번호: 2는 MspA 단량체의 MS-(B1)8 돌연변이체이다. 이는 다음 돌연변이를 포함한다: D90N, D91N, D93N, D118R, D134R 및 E139K. 서열식별번호: 2의 변이체는 서열식별번호: 2의 서열에서 벗어나고 세공을 형성할 수 있는 그의 능력을 보유하고 있는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 적합한 변이체가 국제 출원 번호 PCT/GB2012/050301 (WO 2012/107778로서 공개됨) 및 UK 출원 번호 1407809.1 (ONT IP 057)에 개시된다. 서열식별번호: 2의 바람직한 변이체는 N93D를 포함한다. 세공을 형성할 수 있는 변이체의 능력은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 검정할 수 있다. 예를 들어, 상기 변이체는 다른 적절한 서브유닛과 함께 친양쪽성 층 내로 삽입할 수 있고, 세공을 형성하기 위해 올리고머화할 수 있는 그의 능력을 결정할 수 있다. 서브유닛을 막, 예컨대 친양쪽성 층 내로 삽입하기 위한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 서브유닛은 트리블록 공중합체 막을 함유하는 용액 중에 정제된 형태로 현탁시켜, 이것이 막으로 확산되고 막과의 결합과 기능적 상태로의 어셈블리에 의해 삽입되도록 한다. 또 다른 한편으론, 서브유닛은 문헌 [M.A. Holden, H. Bayley. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 6502-6503] 및 국제 출원 번호 PCT/GB2006/001057 (WO 2006/100484로서 공개됨)에 기재된 "선택 및 배치" 방법을 이용하여 막 내로 직접 삽입할 수 있다.
서열식별번호: 2의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐, 변이체는 바람직하게, 아미노산 동일성에 근거하여 상기 서열과 적어도 50% 상동일 것이다. 보다 바람직하게, 변이체는 전체 서열에 걸쳐 서열식별번호: 2의 아미노산 서열과의 아미노산 동일성에 근거하여 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 및 보다 바람직하게 적어도 95%, 97% 또는 99% 상동일 수 있다. 100개 이상, 예를 들어 125, 150, 175 또는 200개 또는 그 초과의 연속되는 아미노산의 연장물에 걸쳐 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 90% 또는 95%의 아미노산 동일성이 존재할 수 있다 ("하드 상동성").
본원에 기재된 단백질 중 임의의 것, 예컨대 막횡단 단백질 세공은 합성적으로 또는 재조합 수단에 의해 만들 수 있다. 예를 들어, 상기 세공은 시험관내 번역 및 전사 (IVTT)에 의해 합성될 수 있다. 이러한 세공의 아미노산 서열은 비-자연 발생적 아미노산을 포함하도록 변형되거나 또는 단백질의 안정성을 증가시키도록 변형될 수 있다. 단백질이 합성 수단에 의해 생성되는 경우, 이러한 아미노산은 생성 동안 도입될 수 있다. 세공은 또한, 합성 또는 재조합 생성 후에 변경될 수 있다.
특징 규명
본 방법은 변형된 또는 주형 폴리뉴클레오티드의 2개, 3개, 4개 또는 5개 또는 그 초과의 특징을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 하나 이상의 특징은 바람직하게, (i) 폴리뉴클레오티드의 길이, (ii) 폴리뉴클레오티드의 실체, (iii) 폴리뉴클레오티드의 서열, (iv) 폴리뉴클레오티드의 2차 구조 및 (v) 폴리뉴클레오티드가 변형되는 지의 여부로부터 선택된다. 본 발명에 따라서 (i) 내지 (v)의 임의의 조합, 예컨대 {i}, {ii}, {iii}, {iv}, {v}, {i,ii}, {i,iii}, {i,iv}, {i,v}, {ii,iii}, {ii,iv}, {ii,v}, {iii,iv}, {iii,v}, {iv,v}, {i,ii,iii}, {i,ii,iv}, {i,ii,v}, {i,iii,iv}, {i,iii,v}, {i,iv,v}, {ii,iii,iv}, {ii,iii,v}, {ii,iv,v}, {iii,iv,v}, {i,ii,iii,iv}, {i,ii,iii,v}, {i,ii,iv,v}, {i,iii,iv,v}, {ii,iii,iv,v} 또는 {i,ii,iii,iv,v}을 측정할 수 있다. 제2 폴리뉴클레오티드와 비교한 제1 폴리뉴클레오티드에 대한 (i) 내지 (v)의 상이한 조합 (상기 열거된 조합 중 임의의 것을 포함함)을 측정할 수 있다.
(i)의 경우, 폴리뉴클레오티드의 길이는, 예를 들어 폴리뉴클레오티드와 세공 간의 상호 작용의 수 또는 폴리뉴클레오티드와 세공 간의 상호 작용의 지속 기간을 결정함으로써 측정될 수 있다.
(ii)의 경우, 폴리뉴클레오티드의 실체는 수많은 방식으로 측정될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 실체는 폴리뉴클레오티드의 서열의 측정과 연계하거나 또는 폴리뉴클레오티드의 서열의 측정과 연계하지 않고서 측정될 수 있다. 전자가 간단한데; 폴리뉴클레오티드를 서열 분석함으로써 실체를 확인한다. 후자는 여러 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 내의 특별한 모티프의 존재를 측정할 수 있다 (폴리뉴클레오티드의 나머지 서열은 측정하지 않는다). 또 다른 한편으론, 상기 방법에서 특별한 전기적 및/또는 광학 시그널의 측정은 폴리뉴클레오티드를 특별한 공급원으로부터 유래한 것으로서 확인할 수 있다.
(iii)의 경우, 폴리뉴클레오티드의 서열은 이전에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다. 적합한 서열 분석 방법, 특히 전기적 측정을 이용하는 방법이 문헌 [Stoddart D et al., Proc Natl Acad Sci, 12;106(19):7702-7, Lieberman KR et al., J Am Chem Soc. 2010;132(50):17961-72] 및 국제 출원 WO 2000/28312에 기재되어 있다.
(iv)의 경우, 2차 구조는 각종 방식으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법이 전기적 측정을 포함하는 경우, 2차 구조는 세공을 통하여 흐르는 전류 상의 변화 또는 체류 시간 상의 변화를 이용하여 측정될 수 있다. 이로써, 단일 가닥 폴리뉴클레오티드의 영역과 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 영역이 구별될 수 있다.
(v)의 경우, 임의의 변형의 존재 또는 부재를 측정할 수 있다. 그 방법은 바람직하게, 폴리뉴클레오티드가 메틸화에 의해, 산화에 의해, 손상에 의해, 하나 이상의 단백질을 이용하거나 또는 하나 이상의 표지, 태그 또는 스페이서를 이용하여 변형되는 지의 여부를 결정하는 것을 포함한다. 특이적 변형은 다음에 기재되는 방법을 이용하여 측정될 수 있는 세공과의 특이적 상호 작용을 초래할 것이다. 예를 들어, 메틸시토신은 각 뉴클레오티드와의 상호 작용 동안 세공을 통하여 흐르는 전류를 근거로 하여 시토신과 구별될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 막횡단 세공과 접촉시킨다. 이러한 세공은 전형적으로, 막에 존재한다. 적합한 막은 다음에 논의된다. 그 방법은 세공이 막에 존재하는 막/세공 시스템을 조사하는 데 적합한 임의의 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 방법은 막횡단 세공 감지에 적합한 임의의 장치를 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 장치는 수성 용액을 포함하는 챔버; 및 이러한 챔버를 2개의 섹션으로 분리시켜 주는 장벽을 포함한다. 장벽은 전형적으로, 세공을 함유하는 막이 형성되는 구멍을 갖는다. 또 다른 한편으론, 장벽은 세공이 존재하는 막을 형성한다.
상기 방법은 국제 출원 번호 PCT/GB08/000562 (WO 2008/102120)에 기재된 장치를 이용하여 수행될 수 있다.
각종 상이한 유형의 측정이 이루어질 수 있다. 이는 전기적 측정 및 광학적 측정을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 가능한 전기적 측정은 전류 측정, 임피던스 측정, 터널링(tunnelling) 측정 (문헌 [Ivanov AP et al., Nano Lett. 2011 Jan 12; 11(1):279-85]), 및 FET 측정 (국제 출원 WO 2005/124888)을 포함한다. 광학적 측정은 전기적 측정과 조합될 수 있다 (Soni GV et al., Rev Sci Instrum. 2010 Jan; 81(1):014301). 측정은 막횡단 전류 측정, 예컨대 세공을 통하여 흐르는 이온성 전류의 측정일 수 있다.
전기적 측정은 문헌 [Stoddart D et al., Proc Natl Acad Sci, 12;106(19):7702-7, Lieberman KR et al., J Am Chem Soc. 2010;132(50):17961-72], 및 국제 출원 WO 2000/28312에 기재된 바와 같은 표준 단일 채널 녹음 장비를 이용하여 이루어질 수 있다. 또 다른 한편으론, 전기적 측정은, 예를 들어 국제 출원 WO 2009/077734 및 국제 출원 WO 2011/067559에 기재된 바와 같은 다채널 시스템을 이용하여 이루어질 수 있다.
본 방법은 바람직하게, 막에 걸쳐 인가된 전위를 이용하여 수행된다. 이와 같이 인가된 전위는 전압 전위일 수 있다. 또 다른 한편으론, 인가된 전위는 화학적 전위일 수 있다. 이의 한 예는 막, 예컨대 친양쪽성 층에 걸친 염 구배를 이용한다. 염 구배는 문헌 [Holden et al., J Am Chem Soc. 2007 Jul 11; 129(27):8650-5]에 개시된다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드가 세공에 대하여 이동함에 따라 세공을 관통하는 전류를 이용하여, 폴리뉴클레오티드의 서열을 추정하거나 또는 결정한다. 이것이 가닥 서열 분석이다.
본 방법은 폴리뉴클레오티드가 세공에 대하여 이동함에 따라 세공을 관통하는 전류를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 방법에 사용된 장치는 또한, 전위를 인가할 수 있고 막 및 세공에 걸쳐 전기적 시그널을 측정할 수 있는 전기 회로를 포함할 수 있다. 상기 방법은 패치 클램프 또는 전압 클램프를 이용하여 수행될 수 있다. 상기 방법은 바람직하게, 전압 클램프의 사용을 포함한다.
본 발명의 방법은 폴리뉴클레오티드가 세공에 대하여 이동함에 따라 세공을 관통하는 전류를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 막횡단 단백질 세공을 통하여 이온 전류를 측정하는 데 적합한 조건은 관련 기술분야에 공지되어 있고 본 실시예에 개시된다. 상기 방법은 전형적으로, 막 및 세공에 걸쳐 인가된 전압을 이용하여 수행된다. 사용된 전압은 전형적으로 +5 V 내지 -5 V, 예컨대 +4 V 내지 -4 V, +3 V 내지 -3 V 또는 +2 V 내지 -2 V이다. 사용된 전압은 전형적으로 -600 mV 내지 +600 mV 또는 -400 mV 내지 +400 mV이다. 사용된 전압은 바람직하게, -400 mV, -300 mV, -200 mV, -150 mV, -100 mV, -50 mV, -20 mV 및 0 mV로부터 선택된 하한치 및 +10 mV, +20 mV, +50 mV, +100 mV, +150 mV, +200 mV, +300 mV 및 +400 mV로부터 독립적으로 선택된 상한치를 갖는 범위 내에 있다. 사용된 전압은 보다 바람직하게, 100 mV 내지 240 mV의 범위 및 가장 바람직하게 120 mV 내지 220 mV의 범위 내에 있다. 증가된 인가된 전위를 이용함으로써 세공에 의해 상이한 뉴클레오티드들 간의 판별을 증가시킬 수 있다.
본 방법은 전형적으로, 임의의 전하 담체, 예컨대 금속 염, 예를 들어 알칼리 금속 염, 할라이드 염, 예를 들어 클로라이드 염, 예컨대 알칼리 금속 클로라이드 염의 존재하에 수행된다. 전하 담체는 이온성 액체 또는 유기 염, 예를 들어 테트라메틸 암모늄 클로라이드, 트리메틸페닐 암모늄 클로라이드, 페닐트리메틸 암모늄 클로라이드, 또는 1-에틸-3-메틸 이미다졸리움 클로라이드를 포함할 수 있다. 상기 논의된 예시적인 장치에서, 염은 챔버 내의 수성 용액에 존재한다. 염화칼륨 (KCl), 염화나트륨 (NaCl), 염화세슘 (CsCl) 또는 페로시안화칼륨과 페리시안화칼륨의 혼합물이 전형적으로 사용된다. KCl, NaCl 및 페로시안화칼륨과 페리시안화칼륨의 혼합물이 바람직하다. 전하 담체는 막에 걸쳐 비대칭적일 수 있다. 예를 들어, 전하 담체의 유형 및/또는 농도는 막의 각 측면에서 상이할 수 있다.
염 농도는 포화 상태일 수 있다. 염 농도는 3 M 이하일 수 있고, 전형적으로 0.1 내지 2.5 M, 0.3 내지 1.9 M, 0.5 내지 1.8 M, 0.7 내지 1.7 M, 0.9 내지 1.6 M 또는 1 M 내지 1.4 M이다. 염 농도는 바람직하게 150 mM 내지 1 M이다. 본 방법은 바람직하게, 적어도 0.3 M, 예컨대 적어도 0.4 M, 적어도 0.5 M, 적어도 0.6 M, 적어도 0.8 M, 적어도 1.0 M, 적어도 1.5 M, 적어도 2.0 M, 적어도 2.5 M 또는 적어도 3.0 M의 염 농도를 이용하여 수행된다. 높은 염 농도는 높은 시그널 대 소음 비를 제공하고, 정상적인 전류 변동의 배경에 대항하여 확인될 뉴클레오티드의 존재를 나타내는 전류를 허용한다.
본 방법은 전형적으로, 완충제의 존재하에 수행된다. 상기 논의된 예시적인 장치에서, 완충제는 챔버 내의 수성 용액에 존재한다. 임의의 완충제가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 전형적으로, 완충제는 인산염 완충제이다. 다른 적합한 완충제는 HEPES 및 트리스-HCl 완충제이다. 상기 방법은 전형적으로, 4.0 내지 12.0, 4.5 내지 10.0, 5.0 내지 9.0, 5.5 내지 8.8, 6.0 내지 8.7 또는 7.0 내지 8.8 또는 7.5 내지 8.5의 pH에서 수행된다. 사용된 pH는 바람직하게 약 7.5이다.
본 방법은 0℃ 내지 100℃, 15℃ 내지 95℃, 16℃ 내지 90℃, 17℃ 내지 85℃, 18℃ 내지 80℃, 19℃ 내지 70℃, 또는 20℃ 내지 60℃에서 수행될 수 있다. 상기 방법은 전형적으로 실온에서 수행된다. 상기 방법은 임의로, 효소 기능을 지지해 주는 온도, 예컨대 약 37℃에서 수행된다.
폴리뉴클레오티드 결합성 단백질
본 방법은 바람직하게, 상기/각 폴리뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드 결합성 단백질과 접촉시켜, 이러한 단백질이 세공을 통한 상기/각 폴리뉴클레오티드의 적어도 하나의 가닥의 이동을 제어하도록 하는 것을 포함한다.
보다 바람직하게, 본 방법은 (a) 상기/각 폴리뉴클레오티드를 세공 및 폴리뉴클레오티드 결합성 단백질과 접촉시켜, 이러한 단백질이 세공을 통한 상기/각 폴리뉴클레오티드의 적어도 하나의 가닥의 이동을 제어하도록 하는 단계 및 (b) 상기/각 폴리뉴클레오티드가 세공에 대하여 이동함에 따라 하나 이상의 측정치를 취함으로써 (여기서, 이러한 측정치는 상기/각 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 특징을 나타낸다), 변형된 또는 주형 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명하는 단계를 포함한다.
폴리뉴클레오티드 결합성 단백질은 폴리뉴클레오티드와 결합할 수 있고, 폴리뉴클레오티드가 세공을 통하여 이동하는 것을 제어할 수 있는 임의의 단백질일 수 있다. 특정 단백질이 폴리뉴클레오티드와 결합하는 지의 여부를 결정하는 것은 관련 기술분야에서 간단한 일이다. 이러한 단백질은 전형적으로, 폴리뉴클레오티드와 상호 작용하고 폴리뉴클레오티드의 적어도 하나의 특성을 변형시킨다. 상기 단백질은 폴리뉴클레오티드를 절단하여 개개의 뉴클레오티드 또는 더 짧은 쇄의 뉴클레오티드, 예컨대 디- 또는 트리뉴클레오티드를 형성시킴으로써, 이러한 폴리뉴클레오티드를 변형시킬 수 있다. 단백질은 폴리뉴클레오티드를 특이적 위치로 배향시키거나 또는 이동하게 함으로써, 즉 그의 이동을 제어함으로써 폴리뉴클레오티드를 변형시킬 수 있다.
폴리뉴클레오티드 결합성 단백질은 바람직하게, 폴리뉴클레오티드 핸들링 효소로부터 유래된다. 폴리뉴클레오티드 핸들링 효소는 폴리뉴클레오티드와 상호 작용할 수 있고 폴리뉴클레오티드의 적어도 하나의 특성을 변형시킬 수 있는 폴리펩티드이다. 이러한 효소는 폴리뉴클레오티드를 절단하여 개개의 뉴클레오티드 또는 더 짧은 쇄의 뉴클레오티드, 예컨대 디- 또는 트리뉴클레오티드를 형성시킴으로써, 이러한 폴리뉴클레오티드를 변형시킬 수 있다. 상기 효소는 폴리뉴클레오티드를 특이적 위치로 배향시키거나 또는 이동하게 함으로써 폴리뉴클레오티드를 변형시킬 수 있다. 폴리뉴클레오티드 핸들링 효소는 이것이 폴리뉴클레오티드와 결합할 수 있고 세공을 통한 그의 이동을 제어할 수 있는 한은 효소 활성을 나타내지 않아도 된다. 예를 들어, 상기 효소는 그의 효소 활성을 제거하도록 변형될 수 있거나 또는 효소로서 작용하지 못하게 하는 조건하에 사용될 수 있다. 이러한 조건은 다음에 보다 상세히 논의된다.
폴리뉴클레오티드 핸들링 효소는 바람직하게, 핵산분해 효소로부터 유래된다. 효소의 구축물에 사용된 폴리뉴클레오티드 핸들링 효소는 보다 바람직하게, 효소 분류 (EC) 군 3.1.11, 3.1.13, 3.1.14, 3.1.15, 3.1.16, 3.1.21, 3.1.22, 3.1.25, 3.1.26, 3.1.27, 3.1.30 및 3.1.31 중 임의의 것의 구성원으로부터 유래된다. 상기 효소는 국제 출원 번호 PCT/GB10/000133 (WO 2010/086603으로서 공개됨)에 개시된 것들 중 임의의 것일 수 있다.
바람직한 효소는 폴리머라제, 엑소뉴클레아제, 헬리카제 및 토포이소머라제, 예컨대 자이라제이다. 적합한 효소는 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 I (서열식별번호: 11), 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 III 효소 (서열식별번호: 13), 티. 써모필루스로부터의 RecJ (서열식별번호: 15) 및 박테리오파지 람다 엑소뉴클레아제 (서열식별번호: 17), TatD 엑소뉴클레아제 및 그의 변이체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 서열식별번호: 15에 제시된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 3개의 서브유닛은 상호 작용하여 삼량체 엑소뉴클레아제를 형성한다. 폴리머라제는 피로파지(PyroPhage?) 3173 DNA 폴리머라제 [이는 루시겐 코포레이션 (Lucigen? Corporation)으로부터 시판되고 있다], SD 폴리머라제 [바이오론(Bioron?)으로부터 시판되고 있다] 또는 그의 변이체일 수 있다. 상기 효소는 바람직하게, Phi29 DNA 폴리머라제 (서열식별번호: 9) 또는 그의 변이체이다. 토포이소머라제는 바람직하게, 모이어티 분류 (EC) 군 5.99.1.2 및 5.99.1.3 중 임의의 것의 구성원이다.
상기 효소는 가장 바람직하게, 헬리카제, 예컨대 Hel308 Mbu (서열식별번호: 18), Hel308 Csy (서열식별번호: 19), Hel308 Tga (서열식별번호: 20), Hel308 Mhu (서열식별번호: 21), TraI Eco (서열식별번호: 22), XPD Mbu (서열식별번호: 23) 또는 그의 변이체로부터 유래된다. 임의의 헬리카제가 본 발명에 사용될 수 있다. 헬리카제는 Hel308 헬리카제, RecD 헬리카제, 예컨대 TraI 헬리카제 또는 TrwC 헬리카제, XPD 헬리카제 또는 Dda 헬리카제일 수 있거나 또는 그로부터 유래될 수 있다. 헬리카제는 국제 출원 번호 PCT/GB2012/052579 (WO 2013/057495로서 공개됨); PCT/GB2012/053274 (WO 2013/098562로서 공개됨); PCT/GB2012/053273 (WO2013098561로서 공개됨); PCT/GB2013/051925 (WO 2014/013260으로서 공개됨); PCT/GB2013/051924 (WO 2014/013259로서 공개됨); PCT/GB2013/051928 (WO 2014/013262로서 공개됨) 및 PCT/GB2014/052736에 개시된 헬리카제, 변형된 헬리카제 또는 헬리카제 구축물 중 임의의 것일 수 있다.
헬리카제는 바람직하게, 서열식별번호: 25에 제시된 서열 (Trwc Cba) 또는 그의 변이체, 서열식별번호: 18에 제시된 서열 (Hel308 Mbu) 또는 그의 변이체 또는 서열식별번호: 24에 제시된 서열 (Dda) 또는 그의 변이체를 포함한다. 변이체는 막횡단 세공에 관하여 다음에 논의된 방식 중 임의의 것에서 천연 서열과 상이할 수 있다. 서열식별번호: 24의 바람직한 변이체는 (a) E94C 및 A360C 또는 (b) E94C, A360C, C109A 및 C136A를 포함한 다음, 임의로 (ΔM1)G1G2를 포함한다 (즉, M1을 결실시킨 다음, G1 및 G2를 부가한다).
가닥 서열 분석에서, 폴리뉴클레오티드는 인가된 전위와 함께 또는 그에 대항하여 세공을 통해 전위된다. 점진적으로 또는 순차적으로 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에서 작용하는 엑소뉴클레아제는 세공의 시스 측에 사용되어 잔여 단일 가닥을 인가된 전위하에 공급할 수 있거나 또는 트랜스 측에 사용되어 역전 전위하에 공급할 수 있다. 마찬가지로, 이중 가닥 DNA를 풀어주는 헬리카제가 또한, 유사한 방식으로 사용될 수 있다. 폴리머라제를 사용할 수도 있다. 인가된 전위에 대항한 가닥 전위가 필요한 서열 분석 적용을 위한 가능성도 있지만, DNA는 역전 전위하에 또는 전위가 전혀 없는 상황하에 효소에 의해 먼저 "포착"되어야만 한다. 이어서, 결합 후에는 전위가 다시 전환되어, 가닥이 세공을 통과하여 시스에서 트랜스로 되며, 전류 흐름에 의해 확장된 입체 형태로 유지될 것이다. 단일 가닥 DNA 엑소뉴클레아제 또는 단일 가닥 DNA 의존성 폴리머라제는 최근에 전위된 단일 가닥을 세공을 통해 제어된 계단식 방식으로, 인가된 전위에 대항하여 트랜스에서 시스로 다시 끌어당기는 분자 모터로서 작용할 수 있다.
임의의 헬리카제를 상기 방법에 사용할 수 있다. 헬리카제는 세공에 대하여 두 가지 모드로 작동할 수 있다. 첫째, 인가된 전압으로부터 비롯되는 장을 이용하여 세공을 통해 폴리뉴클레오티드를 이동시키도록 헬리카제를 사용하여 상기 방법을 수행하는 것이 바람직하다. 이러한 모드에서는, 폴리뉴클레오티드의 5' 말단을 먼저, 세공 내에 포획시키고; 헬리카제가 폴리뉴클레오티드를 세공 내로 이동시켜, 폴리뉴클레오티드가 막의 트랜스 측으로 최종적으로 전위될 때까지 상기 장을 이용하여 폴리뉴클레오티드가 세공을 관통하도록 한다. 또 다른 한편으론, 상기 방법은 인가된 전압으로부터 비롯되는 장에 대항하여 헬리카제가 세공을 통해 폴리뉴클레오티드를 이동시키도록 수행하는 것이 바람직하다. 이러한 모드에서는, 폴리뉴클레오티드의 3' 말단을 먼저, 세공 내에 포획시키고; 헬리카제가 폴리뉴클레오티드를 세공을 통해 이동시켜, 최종적으로 막의 시스 측으로 다시 방출될 때까지 인가된 장에 대항하여 세공으로부터 인출되도록 한다.
헬리카제
(들) 및 분자
브레이크
(들)
바람직한 실시양태에서, 본 방법은
(a) 상기/각 폴리뉴클레오티드에, 이러한 상기/각 폴리뉴클레오티드에 부착된 하나 이상의 헬리카제 및 하나 이상의 분자 브레이크를 제공하는 단계;
(b) 상기/각 폴리뉴클레오티드를 막횡단 세공과 접촉시키고 이러한 세공에 걸쳐 전위를 인가하여, 하나 이상의 헬리카제와 하나 이상의 분자 브레이크를 합치게 하고 둘 다가 세공을 통한 상기/각 폴리뉴클레오티드의 적어도 하나의 가닥의 이동을 제어하도록 하는 단계;
(c) 상기/각 폴리뉴클레오티드가 세공에 대하여 이동함에 따라 하나 이상의 측정치를 취함으로써 (여기서, 이러한 측정치는 상기 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 특징을 나타낸다), 변형된 또는 주형 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명하는 단계
를 포함한다.
이러한 유형의 방법은 국제 출원 PCT/GB2014/052737에 상세히 논의되어 있다.
스페이서
하나 이상의 헬리카제는 국제 출원 번호 PCT/GB2014/050175 (WO2014/135838로서 공개됨)에 논의된 바와 같이 하나 이상의 스페이서에서 지연될 수 있다. 상기 국제 출원에 개시된 하나 이상의 헬리카제 및 하나 이상의 스페이서의 임의의 입체 배치가 본 발명에 사용될 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 일부가 세공 내로 유입되고 인가된 전위로부터 발생한 장을 따라 세공을 통해 이동하는 경우, 폴리뉴클레오티드가 세공을 통해 이동함에 따라, 하나 이상의 헬리카제가 세공에 의해 스페이서를 지나 이동된다. 이는 폴리뉴클레오티드 (하나 이상의 스페이서를 포함함)가 세공을 통해 이동되고 하나 이상의 헬리카제가 세공의 상단에 남아있기 때문이다.
하나 이상의 스페이서는 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드의 일부이고, 예를 들어 폴리뉴클레오티드 서열을 방해한다. 하나 이상의 스페이서는 바람직하게, 폴리뉴클레오티드와 혼성화되는 하나 이상의 차단 분자, 예컨대 과속 방지턱의 일부가 아니다.
임의의 수의 스페이서, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 스페이서가 폴리뉴클레오티드에 존재할 수 있다. 바람직하게 2개, 4개 또는 6개의 스페이서가 폴리뉴클레오티드에 존재한다. 하나 이상의 스페이서가 바람직하게 Y 어댑터 또는 리더 서열 내에 있다. 폴리뉴클레오티드의 상이한 영역 내에 하나 이상의 스페이서가 존재할 수 있는데, 예컨대 Y 어댑터 및/또는 헤어핀 루프 어댑터 내에 하나 이상의 스페이서가 존재할 수 있다.
하나 이상의 스페이서는 각각 하나 이상의 헬리카제가 활성 모드에서도 극복할 수 없는 에너지 장벽을 제공한다. 하나 이상의 스페이서는 헬리카제의 견인을 저하시킴으로써 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드로부터 염기를 제거함으로써) 또는 하나 이상의 헬리카제의 이동을 물리적으로 차단시킴으로써 (예를 들어, 벌키 화학적 기를 이용함), 하나 이상의 헬리카제를 지연시킬 수 있다.
하나 이상의 스페이서는 하나 이상의 헬리카제를 지연시키는 임의의 분자 또는 분자의 조합물을 포함할 수 있다. 하나 이상의 스페이서는 하나 이상의 헬리카제가 폴리뉴클레오티드를 따라 이동하지 못하게 하는 임의의 분자 또는 분자의 조합물을 포함할 수 있다. 하나 이상의 헬리카제가 막횡단 세공 및 인가된 전위의 부재하에 하나 이상의 스페이서에서 지연되는 지의 여부를 결정하는 것은 간단한 일이다. 예를 들어, 헬리카제가 스페이서를 지나 이동할 수 있고 DNA의 상보적 가닥을 옮겨놓을 수 있는 능력은 PAGE에 의해 측정될 수 있다.
하나 이상의 스페이서는 전형적으로 선형 분자, 예컨대 중합체를 포함한다. 하나 이상의 스페이서는 전형적으로, 폴리뉴클레오티드와 상이한 구조를 갖는다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드가 DNA인 경우, 하나 이상의 스페이서는 전형적으로 DNA가 아니다. 특히, 폴리뉴클레오티드가 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)인 경우, 하나 이상의 스페이서는 바람직하게 펩티드 핵산 (PNA), 글리세롤 핵산 (GNA), 트레오스 핵산 (TNA), 고정 핵산 (LNA), 또는 뉴클레오티드 측쇄를 수반한 합성 중합체를 포함한다. 하나 이상의 스페이서는 폴리뉴클레오티드로부터 반대 방향으로 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드가 5'에서 3' 방향으로 있는 경우에는, 하나 이상의 스페이서가 하나 이상의 뉴클레오티드를 3'에서 5' 방향으로 포함할 수 있다. 이러한 뉴클레오티드는 상기 논의된 것들 중 임의의 것일 수 있다.
하나 이상의 헬리카제는 각 선형 분자 스페이서에 의해 (즉, 스페이서 앞에서) 또는 이러한 스페이서 상에서 지연될 수 있다. 선형 분자 스페이서가 사용되는 경우, 폴리뉴클레오티드에는 바람직하게, 하나 이상의 헬리카제가 그를 지나 이동되어야 하는 각 스페이서의 말단에 인접한 폴리뉴클레오티드의 이중 가닥 영역이 제공된다. 선형 분자 스페이서가 사용되는 경우, 폴리뉴클레오티드에는 바람직하게, 하나 이상의 헬리카제가 그를 지나 이동되어야 하는 말단과 반대의 각 스페이서의 말단에 차단성 분자가 제공된다. 이는 하나 이상의 헬리카제가 각 스페이서 상에 여전히 지연된 채로 있다는 것을 보장하는 데 도움을 줄 수 있다. 이는 또한, 하나 이상의 헬리카제가 용액 중에 확산되는 경우에, 이러한 하나 이상의 헬리카제가 폴리뉴클레오티드 상에 유지되는 것을 도와줄 수 있다. 차단성 분자는 하나 이상의 헬리카제를 물리적으로 지연시켜 주는, 다음에 논의된 화학적 기 중 임의의 것일 수 있다. 차단성 분자는 폴리뉴클레오티드의 이중 가닥 영역일 수 있다. 차단성 분자는 BNA일 수 있다.
본 방법은 2개 이상의 헬리카제가 스페이서를 지나 이동하는 것에 관한 것일 수 있다. 이러한 경우, 스페이서의 길이는 전형적으로 후행 헬리카제가, 세공 및 인가된 전위의 부재하에 선도 헬리카제가 스페이서를 지나치지 못하도록 증가시킨다. 상기 방법이 2개 이상의 헬리카제가 하나 이상의 스페이서를 지나 이동하는 것에 관한 것이라면, 상기 논의된 스페이서 길이는 적어도 1.5배, 예컨대 2배, 2.5배 또는 3배 증가될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법이 2개 이상의 헬리카제가 하나 이상의 스페이서를 지나 이동하는 것에 관한 것이라면, 스페이서 길이는 1.5배, 2배, 2.5배 또는 3배 증가될 수 있다.
막
본 발명에 사용된 세공은 막에 존재할 수 있다. 본 발명의 방법에서, 폴리뉴클레오티드는 전형적으로, 막 내의 세공과 접촉시킨다. 임의의 막이 본 발명에 따라서 사용될 수 있다. 적합한 막은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 막은 바람직하게 친양쪽성 층이다. 친양쪽성 층은 친수성 특성과 친지성 특성 둘 다를 갖는 친양쪽성 분자, 예컨대 인지질로부터 형성된 층이다. 친양쪽성 분자는 합성 또는 자연 발생적일 수 있다. 비-자연 발생적 친양쪽성체, 및 단층을 형성하는 친양쪽성체는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 블록 공중합체를 포함한다 (Gonzalez-Perez et al., Langmuir, 2009, 25, 10447-10450). 블록 공중합체는 2개 이상의 단량체 서브유닛을 함께 중합시켜 단일 중합체 쇄를 창출시키는 중합체성 물질이다. 블록 공중합체는 전형적으로, 각 단량체 서브유닛에 의해 기인되는 특성을 갖는다. 그러나, 블록 공중합체는 개개의 서브유닛으로부터 형성된 중합체가 보유하고 있지 않은 독특한 특성을 가질 수 있다. 블록 공중합체는 단량체 서브유닛 중 하나가 소수성 (즉, 친지성)인 반면, 다른 서브유닛(들)이 수성 매질 중에서 친수성이 되도록 조작될 수 있다. 이러한 경우, 블록 공중합체는 친양쪽성 특성을 보유할 수 있고, 생물학적 막을 모방하는 구조를 형성할 수 있다. 블록 공중합체는 디블록 (2개의 단량체 서브유닛으로 이루어짐)일 수 있지만, 2개 초과의 단량체 서브유닛으로부터 구축되어, 친양쪽성체로서 행동하는 보다 복잡한 배열을 형성할 수 있다. 상기 공중합체는 트리블록, 테트라블록 또는 펜타블록 공중합체일 수 있다. 막은 바람직하게 트리블록 공중합체 막이다.
막은 가장 바람직하게, 국제 출원 번호 PCT/GB2013/052766 또는 PCT/GB2013/052767에 개시된 막 중 하나이다.
친양쪽성 분자는 폴리뉴클레오티드의 커플링을 촉진시키기 위해 화학적으로 변형될 수 있거나 또는 기능화될 수 있다.
커플링
상기/각 변형된 폴리뉴클레오티드는 바람직하게, 세공을 포함하는 막과 커플링된다. 본 방법은 상기/각 폴리뉴클레오티드를, 세공을 포함하는 막과 커플링시키는 것을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 바람직하게, 하나 이상의 앵커를 이용하여 막과 커플링시킨다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 공지된 방법을 이용하여 막과 커플링시킬 수 있다.
각 앵커는 폴리뉴클레오티드과 커플링 (또는 결합)되는 기 및 막과 커플링 (또는 결합)되는 기를 포함한다. 각 앵커는 폴리뉴클레오티드 및/또는 막과 공유적으로 커플링 (또는 결합)될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 바람직하게, Y 어댑터 또는 리더 서열 및/또는 헤어핀 루프를 이용하여 막과 커플링시킨다.
폴리뉴클레오티드는 임의의 수의 앵커, 예컨대 2, 3, 4개 또는 그 초과의 앵커를 이용하여 막과 커플링시킬 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 2개의 앵커를 이용하여 막과 커플링시킬 수 있는데, 각 앵커는 폴리뉴클레오티드과 막 둘 다와 별도로 커플링 (또는 결합)된다.
하나 이상의 앵커는 하나 이상의 헬리카제 및/또는 하나 이상의 분자 브레이크를 포함할 수 있다.
막이 친양쪽성 층, 예컨대 공중합체 막 또는 지질 이중 층인 경우, 하나 이상의 앵커는 바람직하게, 막에 존재하는 폴리펩티드 앵커 및/또는 막에 존재하는 소수성 앵커를 포함한다. 소수성 앵커는 바람직하게 지질, 지방산, 스테롤, 탄소 나노튜브, 폴리펩티드, 단백질 또는 아미노산, 예를 들어 콜레스테롤, 팔미테이트 또는 토코페롤이다. 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 앵커는 세공이 아니다.
막의 성분, 예컨대 친양쪽성 분자, 공중합체 또는 지질은 하나 이상의 앵커를 형성하기 위해 화학적으로 변형될 수 있거나 또는 기능화될 수 있다. 막의 성분을 기능화하는 적합한 방식 및 적합한 화학적 변형의 예가 다음에 보다 상세히 논의된다. 막 성분의 임의의 분율, 예를 들어 적어도 0.01%, 적어도 0.1%, 적어도 1%, 적어도 10%, 적어도 25%, 적어도 50% 또는 100%를 기능화할 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 막과 직접적으로 커플링될 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 막과 커플링시키기 위해 사용된 하나 이상의 앵커는 바람직하게 링커를 포함한다. 하나 이상의 앵커는 하나 이상, 예컨대 2, 3, 4개 또는 그 초과의 링커를 포함할 수 있다. 하나의 링커를 사용하여 2개 이상, 예컨대 2, 3, 4개 또는 그 초과의 폴리뉴클레오티드를 막과 커플링시킬 수 있다.
바람직한 링커는 중합체, 예컨대 폴리뉴클레오티드, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리사카라이드 및 폴리펩티드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이들 링커는 선형, 분지 또는 환상일 수 있다. 예를 들어, 링커는 환상 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 환상 폴리뉴클레오티드 링커 상의 상보적 서열과 혼성화될 수 있다.
링커의 사용은 다음에 논의되는 서열 분석 실시양태에 바람직하다. 폴리뉴클레오티드가 세공과 상호 작용할 때 언커플링(uncouple)되지 않는다는 의미에서 막과 영구적으로 직접 커플링되면 (즉, 단계 (b) 또는 (e)에서 언커플링되지 않음), 서열 분석 실행이 막과 세공 간의 거리로 인해 폴리뉴클레오티드의 말단까지 지속될 수 없기 때문에 일부 서열 데이터가 상실될 것이다. 링커를 사용되면, 폴리뉴클레오티드에 대한 처리를 완료할 수 있다.
커플링은 영구적이거나 또는 안정적일 수 있다. 다시 말해서, 폴리뉴클레오티드가 세공과 상호 작용할 때 막과 커플링된 채로 있도록 커플링을 수행할 수 있다.
커플링은 일시적일 수 있다. 다시 말해서, 폴리뉴클레오티드가 세공과 상호 작용할 때 막으로부터 분리될 수 있도록 커플링을 수행할 수 있다.
커플링의 적합한 방법은 국제 출원 번호 PCT/GB12/051191 (WO 2012/164270으로서 공개됨) 및 UK 출원 번호 1406155.0에 개시된다.
언커플링
본 발명의 방법은 다수의 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명하고 적어도 제1 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 언커플링하는 것을 포함할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 2개 이상의 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명하는 것을 포함한다. 이러한 방법은
(a) 제1 샘플 중의 제1 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계;
(b) 제2 샘플 중의 제2 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계;
(c) 하나 이상의 앵커를 이용하여, 제1 샘플 중의 제1 폴리뉴클레오티드를 막과 커플링시키는 단계;
(d) 제1 폴리뉴클레오티드를 막횡단 세공과 접촉시켜, 제1 폴리뉴클레오티드의 적어도 하나의 가닥이 세공을 통하여 이동하도록 하는 단계;
(e) 제1 폴리뉴클레오티드가 세공에 대하여 이동함에 따라 하나 이상의 측정치를 취함으로써 (여기서, 이러한 측정치는 제1 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 특징을 나타낸다), 제1 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명하는 단계;
(f) 제1 폴리뉴클레오티드를 막으로부터 언커플링시키는 단계;
(g) 하나 이상의 앵커를 이용하여, 제2 샘플 중의 제2 폴리뉴클레오티드를 막과 커플링시키는 단계;
(h) 제2 폴리뉴클레오티드를 세공과 접촉시켜, 제2 폴리뉴클레오티드의 적어도 하나의 가닥이 세공을 통하여 이동하도록 하는 단계; 및
(i) 제2 폴리뉴클레오티드가 세공에 대하여 이동함에 따라 하나 이상의 측정치를 취함으로써 (여기서, 이러한 측정치는 제2 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 특징을 나타낸다), 제2 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명하는 단계
를 포함한다.
이러한 유형의 방법은 UK 출원 번호1406155.0에 상세히 논의되어 있다.
다른 특징 규명 방법
또 다른 실시양태에서, 상기/각 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는 폴리머라제가 뉴클레오티드를 상기 폴리뉴클레오티드 내로 혼입시킴에 따라 방출되는 표지된 종을 검출함으로써 그 특징이 규명된다. 폴리머라제는 상기 폴리뉴클레오티드를 주형으로서 사용한다. 각 표지된 종은 각 뉴클레오티드에 대해 특이적이다. 상기/각 폴리뉴클레오티드는 막횡단 세공, 폴리머라제 및 표지된 뉴클레오티드과 접촉시켜, 뉴클레오티드가 폴리뉴클레오티드(들)에 부가될 때 폴리머라제에 의해 포스페이트 표지된 종이 순차적으로 방출되도록 하는데, 여기서 포스페이트 종은 각 뉴클레오티드에 대해 특이적인 표지를 함유한다. 폴리머라제는 상기 논의된 것들 중 임의의 것일 수 있다. 포스페이트 표지된 종은 세공을 이용하여 검출되는데, 이로써 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명한다. 이러한 유형의 방법은 유럽 출원 번호 13187149.3 (EP 2682460으로서 공개됨)에 개시된다. 상기 논의된 실시양태 중 임의의 것이 본 방법에 동등하게 적용된다.
키트
본 발명은 또한, 주형 폴리뉴클레오티드를 변형시키기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 (a) 본 발명의 MuA 기질의 집단 및 (b) MuA 트랜스포사제 및 (c) 폴리머라제를 포함한다. 본 발명의 방법 및 생성물과 관련하여 상기 논의된 실시양태 중 임의의 것이 키트에 동등하게 적용된다.
키트는 막의 성분, 예컨대 친양쪽성 층 또는 지질 이중 층의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 막횡단 세공 또는 막횡단 세공의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 폴리뉴클레오티드 결합성 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 막, 세공 및 폴리뉴클레오티드 결합성 단백질은 상기 논의되어 있다.
본 발명의 키트는 상기 언급된 실시양태 중 임의의 것을 수행할 수 있게 해주는 하나 이상의 다른 시약 또는 기구를 부가적으로 포함할 수 있다. 이러한 시약 또는 기구는 다음 중 하나 이상을 포함한다: 적합한 완충제(들) (수성 용액), 대상체로부터 샘플을 수득하기 위한 수단 (예컨대, 용기, 또는 바늘을 포함하는 기구), 폴리뉴클레오티드를 증폭 및/또는 발현시키기 위한 수단, 상기 정의된 바와 같은 막, 또는 전압 또는 패치 클램프 장치. 시약은 키트 내에 건조 상태로 존재할 수 있으므로, 유체 샘플이 시약을 재현탁시키도록 한다. 키트는 또한 임의로, 이러한 키트가 본 발명의 방법에 사용될 수 있도록 해주는 설명서, 또는 본 발명의 방법이 사용될 수 있는 환자에 관한 세부 사항을 포함할 수 있다. 키트는 임의로, 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
다음 실시예가 본 발명을 예시한다.
실시예
1
본 실시예에는 주형 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 변형시키기 위한 방법, 특히 나노 세공 서열 분석을 이용하여 그 특징을 규명하기 위한 방법이 기재되어 있다. 본 실시예는 MuA 트랜스포사제가, 헤어핀 루프를 함유한 MuA 기질을 삽입시킬 수 있었다는 것을 보여준다. 이어서, 이러한 구축물 내의 갭은 폴리머라제를 이용하여 채운 다음, 이중 가닥 DNA를 용융시키기 위해 이중 가닥 구축물을 가열하였다. 이로써, 그로부터 폴리머라제가 보체를 생성시키는 헤어핀을 갖는 단일 가닥 DNA가 생성되었다. 이어서, 이러한 구축물을, 미리 결합된 효소를 이용하여 어댑터와 라이게이션하고, 최종적으로, 테더와 혼성화하였다. 이때, 이러한 DNA 구축물은 나노 세공을 통하여 헬리카제 제어된 DNA 이동을 나타내었다.
물질 및 방법
1.1 -
MuA
트랜스포사제를
이용한 DNA 주형의 단편화
본 실시예에 사용되었던 MuA 어댑터 X는 5' 21 bp 헤어핀을 갖고 있었다 (도 2에서 c로 표지된 어댑터; 서열 GATCU의 5' 말단에서 3' 말단으로 부착된 상부 가닥 = 서열식별번호: 29, 하부 가닥 = 서열식별번호: 30). 상기 어댑터의 상부 가닥 및 하부 가닥을, 10 mM 트리스 pH 7.5, 50 mM NaCl 중에서 2℃ min-1 하에 95℃로부터 10 uM에서 어닐링시켰다.
MuA 단편화 반응물 (10 μL)을 하기 표 1에 기재된 바와 같이 설정하고, 이를 30℃ 하에 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, MuA 효소를 75℃ 하에 15분 동안 가열함으로써 열 불활성화시켰다. 최종적으로, 이로써 생성된 DNA를 1.5x SPRI 정제하고, 뉴클레아제 무함유 물에서 용출시켰다 (42 μL, 샘플 1).
<표 1>
1.2 - DNA
주형을 DNA
폴리머라제와
함께
인큐베이션함
MuA 단편화 과정 후, 상기 정제된 DNA를 DNA 폴리머라제와 함께 인큐베이션하여 상부 가닥 헤어핀을 카피하였다.
DNA 폴리머라제 반응물 (50 uL)을 하기 표 2에 기재된 바와 같이 설정하고, 이를 68℃ 하에 10분 동안 인큐베이션하였다. 최종적으로, 이로써 생성된 DNA를 1.5x SPRI 정제하고, 뉴클레아제 무함유 물에서 용출시켰다 (42 μL, 샘플 2).
<표 2>
1.3 - 열 변성 및
폴리머라제
채우기(fill-in)
헤어핀 카피 단계 후, 샘플 2를 단일 변성 단계 및 폴리머라제 채우기로 처리하였다. 폴리머라제 채우기 반응을 위하여, 폴리머라제에 dCTP/dGTP/dATP를 제공하였지만, 표준 dTTP는 상이한 뉴클레오티드 종 5-프로피닐-dU로 대체시켰다. 반응물 (50 μL)을 하기 표 3에 기재된 바와 같이 설정하고, 이를 95℃ 하에 2분 동안, 55℃ 하에 30초 동안 및 68℃ 하에 30분 동안 인큐베이션하였다. 최종적으로, 이로써 생성된 DNA를 1.5x SPRI 정제하고, 뉴클레아제 무함유 물에서 용출시켰다 (45 μL, 샘플 3).
<표 3>
1.4 - dA
테일링
반응
그 다음, 샘플 3을 하기 표 4에 기재된 바와 같이 dA-테일링시키고, 이를 37℃ 하에 30분 동안 인큐베이션하였다. 이로써 생성된 DNA를 1.5x SPRI 정제하고, 뉴클레아제 무함유 물에서 용출시켰다 (20 μL, 샘플 4).
<표 4>
1.5 - 미리
부하된
효소를 이용하여 어댑터를
라이게이션함
이어서, 샘플 4를, 하기 표 5에 기재된 바와 같이 미리 부하된 효소 [T4 Dda - E94C/A360C/C109A/C136A (돌연변이 E94C/A360C/C114A/C171A/C421D를 수반한 다음 (ΔM1)G1G2를 수반한 서열식별번호: 24)]를 이용하여 Y-어댑터 1 (상부 가닥 = 3' 말단에서 서열식별번호: 33에 부착되었던 4개의 iSp18 스페이서에 3' 말단에서 부착되었던 서열식별번호: 32에 3' 말단에서 부착된 20개의 iSpC3 스페이서; 하부 가닥 = 5' 포스페이트가 부착된 서열식별번호: 34)에 라이게이션하고, 이를 실온 하에 20분 동안 인큐베이션하였다. 이로써 생성된 DNA를 0.4x SPRI 정제하고, 완충제 (200 μL의 750 mM NaCl, 10% PEG 8000, 50 mM 트리스.HCl pH 8)로 세척하며, 완충제 (20 μL의 40 mM CAPS pH 10, 40 mM KCl 샘플 5)에서 용출시켰다.
<표 5>
1.6 -
테더의
어닐링
이어서, 샘플 5에 존재하는 DNA 분석물을 테더와 어닐링시켰다. 샘플 5를 실온 하에 10분 동안 DNA 테더 (서열 AACAACCT는 그의 5' 말단에서 3개의 iSp18 스페이서, 2개의 티민 및 5' 콜레스테롤 TEG에 부착되었고; 서열 AACAACCT는 그의 3' 말단에서, 서열식별번호: 35에 3' 말단에서 부착되는 3개의 iSp18 스페이서에 부착되었다) (500 nM, 5 μL)와 함께 인큐베이션하였다. 이로써 생성된 샘플이 샘플 6으로서 공지되었다.
1.7 - 전기 생리학 시험
실험을 설정하기 전에, DNA 샘플 6 (샘플 6의 총 용적의 1/4)을 완충제 [25 mM 인산칼륨 완충제 (pH 7.5), 500 mM KCl], MgCl2 (1 mM) 및 ATP (2 mM)에 부가하여, 총 150 μL의 용적을 제공하였다.
완충제 [25 mM 인산칼륨 완충제, 150 mM 페로시안화칼륨 (II), 및 150 mM 페리시안화칼륨 (III), pH 8.0] 중의 블록 공중합체 내에 삽입된 단일 MspA 나노 세공으로부터 전기적 측정치를 획득하였다. 상기 블록 공중합체 내에 삽입된 단일 세공을 달성한 후, 완충제 [2 mL, 25 mM 인산칼륨 완충제, 150 mM 페로시안화칼륨 (II), 150 mM 페리시안화칼륨 (III), pH 8.0]를 시스템 내로 유동시켜 임의의 과도한 MspA 나노 세공을 제거하였다. 이어서, 효소 (T4 Dda - E94C/C109A/C136A/A360C, 10 nM 최종 농도), DNA 샘플 6 및 연료 (MgCl2 2 mM 최종 농도, ATP 2 mM 최종 농도) 예비 혼합물 (총 150 μL)을 단일 나노 세공 실험용 시스템 내로 유동시켰다. 실험을 120 mV 하에 실행하였고, 헬리카제-제어된 DNA 이동을 6시간 동안 모니터링하였다.
결과
샘플 제조 과정이 끝날 무렵에 생성된 DNA (샘플 6)의 헬리카제 제어된 DNA 이동이 관찰되었다. 도 3은 헬리카제 제어된 DNA 이동의 한 예를 도시한 것이다.
애질런트 12,000 DNA 칩 추적을 이용하여, 샘플 제조 과정을 또한 분석하였다. 단계 1.2 (여기서, 5' 헤어핀이 전사되었다) 이전에, 68℃ 하에 미리 인큐베이션하지 않는다면, 가닥 해리 (열 변성 단계 1.3) 후에는 어떠한 합성 보체도 만들어지지 않았는데 (도 2의 단계 4 후에 파선/점선으로서 도시됨), 이는 그로부터 폴리머라제가 개시되는 필수 3' 헤어핀이 가닥에 결여되었기 때문이다. 이는 도 4에 도시된 애질런트 12,000 DNA 칩 추적에서 관찰되었는데, 여기서 1로 표지된 라인은 처리되지 않은 MuA 단편화 DNA 입력 재료이고, 2로 표지된 라인은 68℃ 인큐베이션 단계 (상기 1.2에서 수행됨)를 진행하였고, 연속해서 단계 1.3 모두를 진행하였던 분석물이며, 3으로 표지된 라인은 단계 1.2에서 68℃ 인큐베이션을 진행하지 않았지만, 단계 1.3 모두를 진행하였다. 따라서, 라인 3의 경우에는 dsDNA가 만들어지지 않았으므로, 편평한 라인 (X로 표지된 영역)이 애질런트 추적에서 관찰되었는데, 이는 95℃ 하에서의 가닥 해리 이전에 카피된 헤어핀이 없었기 때문이다. 그러나, 라인 2의 경우에는 헤어핀이 전사되었으므로, 가닥 해리시 폴리머라제가 새로운 3' 헤어핀으로부터 채우기를 개시하였다. 이는 라인 2가 상기 카피된 헤어핀으로부터 만들어진 dsDNA 생성물에 상응하는 영역 X에서 피크를 나타냈다는 것을 의미한다.
상기 과정을 상기 언급된 바와 같이 반복하였지만, 단계 1.3에서는 DNA 샘플 7을 생성시킨 5-프로피닐-dU 보다는 오히려 표준 DNA dNTP's - dCTP/dATP/dGTP/dTTP를 폴리머라제에 제공하였다. 도 6은 DNA 샘플 7 (이는 단계 1.3에서 표준 DNA dNTP's를 이용하여 생성되었다)에 대한 헬리카제-제어된 DNA 이동의 예를 도시한 것이다. 샘플 제조 과정은 성공적이었고, 헬리카제 제어된 DNA 이동이 이러한 샘플에 대하여 관찰되었다.
실시예
2
본 실시예에는 주형 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 변형시키기 위한 방법, 특히 나노 세공 서열 분석을 이용하여 그 특징을 규명하기 위한 방법이 기재되어 있다. 도 7은 하기 단계 2.1 및 2.2에 기재된 샘플 제조 단계를 나타내는 만화를 도시한 것이다. 본 실시예는 MuA 트랜스포사제가, MuA 어댑터의 헤어핀 루프 내에 dG 및 dC의 유사체를 함유한 헤어핀 루프를 함유한 MuA 기질을 삽입할 수 있었다는 것을 보여준다 (dG는 데옥시이노신으로 대체시켰고, dC는 데옥시제불라린으로 대체시켰다). 이어서, 오버행 가닥을, 헤어핀 루프를 포함하는 가닥을 보완시킨 새로운 가닥으로 대체시킨 폴리머라제를 이용하여, 구축물 내의 갭을 채웠다. 헤어핀 루프를 포함하는 가닥을 보완시킨 새로운 가닥은 또한, 헤어핀 루프를 형성할 수 있었다. 이러한 새로운 가닥의 헤어핀 루프는 A/T/Z/I (도 7에서 1X로 표지됨)로 제조된 헤어핀 루프와 상보적 가닥 간에 형성된 이중 가닥 영역보다 더 높은 Tm을 갖고 있었다. 따라서, 새로운 가닥 내에 헤어핀이 형성되었고 (도 7에서 f2h로 표지됨), A/T/Z/I로 제조된 헤어핀 루프가 또한 형성되었다 (도 7에서 f1h로 표지됨). 이때, 폴리머라제는 헤어핀 루프를 프라이머로서 사용하여 상보적 가닥을 만들었다. 따라서, 도 7의 단계 2 후에 생성된 dsDNA 구축물을 분리시키기 위한 부가의 가열 단계가 필요하지 않았다.
2.1 -
MuA
트랜스포사제를
사용하는 DNA 주형의 단편화
본 실시예에서 사용된 MuA 어댑터는 5' 7 bp 헤어핀을 갖고 있는데, dG가 d이노신으로 대체되었고 dC가 d제불라린으로 대체되었다. 어댑터 P의 상부 가닥 [변형된 폴리뉴클레오티드 서열 IZITAZ (여기서, I는 데옥시이노신이고 Z는 데옥시제불라린이다)는 서열식별번호: 39의 5' 말단에 부착되는 변형된 폴리뉴클레오티드 서열 ITAZIZ (여기서, I는 데옥시이노신이고 Z는 데옥시제불라린이다)에 3' 말단에서 부착되는 비-변형된 폴리뉴클레오티드 서열 TTTTTA의 5' 말단에 부착된다] 및 하부 가닥 (서열식별번호: 38)을 10 mM 트리스 pH 7.5, 50 mM NaCl 중에서 2℃ min-1 하에 95℃로부터 10 uM에서 어닐링시켰다.
MuA 단편화 반응물 (10 μL)을, 어댑터 X 대신 어댑터 P를 이용하여 상기 표 1에 기재된 바와 같이 설정하고, 이를 30℃ 하에 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, MuA 효소를 75℃ 하에 15분 동안 가열함으로써 열 불활성화시켰다. 최종적으로, 이로써 생성된 DNA를 1.5x SPRI 정제하고, 뉴클레아제 무함유 물에서 용출시켰다 (42 μL).
2.2 - DNA 주형을 DNA 폴리머라제와 함께 인큐베이션함
MuA 단편화 과정 후, 상기 정제된 DNA를 DNA 폴리머라제와 함께 인큐베이션하여 상부 가닥 헤어핀을 카피하였다 (G/C를 I/Z로 대체시켰다).
이러한 단계 동안, 헤어핀 루프를 포함하는 가닥을 보완시킨 새로운 가닥이 헤어핀 루프를 형성하였다. 이는 새로운 가닥에 의해 형성된 헤어핀 루프가, dZ 및 dI의 유사체를 함유한 헤어핀 루프와 상보적 가닥 간에 형성된 이중 가닥 영역보다 더 높은 Tm을 갖고 있었다는 사실에 기인하였다. 따라서, 이중 가닥 DNA를 ssDNA로 분리시키기 위해서는 가열할 필요가 없었는데, 이는 더 높은 Tm을 갖는 헤어핀 루프가 우선적으로 형성되었고, 이때 폴리머라제는 이러한 헤어핀 루프를 프라이머로서 사용하여 상보적 가닥을 만들었기 때문이다.
DNA 폴리머라제 반응물 (50 uL)을 하기 표에 기재된 바와 같이 설정하고, 이를 37℃ 하에 30분 동안 인큐베이션하였다. 최종적으로, 이로써 생성된 DNA를 1.5x SPRI 정제하고, 뉴클레아제 무함유 물에서 용출시켰다 (42 μL).
<표 6>
이러한 가닥은 dA 테일링하고, 미리 부하된 효소를 이용하여 어댑터를 라이게이션하며, 테더를 혼성화함으로써 (실시예 1.4 내지 1.6에 기재된 바와 같음) 추가로 변형시켜, 나노 세공 시스템 (실시예 1.7에 기재된 바와 같음)을 이용하여 그 특징을 규명할 수 있었던 가닥을 생성할 수 있었다.
SEQUENCE LISTING
<110> Oxford Nanopore Technologies Limited
<120> Method
<130> N404112WO
<140> GB1418159.8
<141> 2014-10-14
<160> 37
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 558
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mycobacterium smegmatis porin A mutant
(D90N/D91N/D93N/D118R/D134R/E193K)
<400> 1
atgggtctgg ataatgaact gagcctggtg gacggtcaag atcgtaccct gacggtgcaa 60
caatgggata cctttctgaa tggcgttttt ccgctggatc gtaatcgcct gacccgtgaa 120
tggtttcatt ccggtcgcgc aaaatatatc gtcgcaggcc cgggtgctga cgaattcgaa 180
ggcacgctgg aactgggtta tcagattggc tttccgtggt cactgggcgt tggtatcaac 240
ttctcgtaca ccacgccgaa tattctgatc aacaatggta acattaccgc accgccgttt 300
ggcctgaaca gcgtgattac gccgaacctg tttccgggtg ttagcatctc tgcccgtctg 360
ggcaatggtc cgggcattca agaagtggca acctttagtg tgcgcgtttc cggcgctaaa 420
ggcggtgtcg cggtgtctaa cgcccacggt accgttacgg gcgcggccgg cggtgtcctg 480
ctgcgtccgt tcgcgcgcct gattgcctct accggcgaca gcgttacgac ctatggcgaa 540
ccgtggaata tgaactaa 558
<210> 2
<211> 184
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mycobacterium smegmatis porin A mutant
(D90N/D91N/D93N/D118R/D134R/E139K)
<400> 2
Gly Leu Asp Asn Glu Leu Ser Leu Val Asp Gly Gln Asp Arg Thr Leu
1 5 10 15
Thr Val Gln Gln Trp Asp Thr Phe Leu Asn Gly Val Phe Pro Leu Asp
20 25 30
Arg Asn Arg Leu Thr Arg Glu Trp Phe His Ser Gly Arg Ala Lys Tyr
35 40 45
Ile Val Ala Gly Pro Gly Ala Asp Glu Phe Glu Gly Thr Leu Glu Leu
50 55 60
Gly Tyr Gln Ile Gly Phe Pro Trp Ser Leu Gly Val Gly Ile Asn Phe
65 70 75 80
Ser Tyr Thr Thr Pro Asn Ile Leu Ile Asn Asn Gly Asn Ile Thr Ala
85 90 95
Pro Pro Phe Gly Leu Asn Ser Val Ile Thr Pro Asn Leu Phe Pro Gly
100 105 110
Val Ser Ile Ser Ala Arg Leu Gly Asn Gly Pro Gly Ile Gln Glu Val
115 120 125
Ala Thr Phe Ser Val Arg Val Ser Gly Ala Lys Gly Gly Val Ala Val
130 135 140
Ser Asn Ala His Gly Thr Val Thr Gly Ala Ala Gly Gly Val Leu Leu
145 150 155 160
Arg Pro Phe Ala Arg Leu Ile Ala Ser Thr Gly Asp Ser Val Thr Thr
165 170 175
Tyr Gly Glu Pro Trp Asn Met Asn
180
<210> 3
<211> 885
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> alpha-hemolysin mutant (E111N/K147N)
<400> 3
atggcagatt ctgatattaa tattaaaacc ggtactacag atattggaag caatactaca 60
gtaaaaacag gtgatttagt cacttatgat aaagaaaatg gcatgcacaa aaaagtattt 120
tatagtttta tcgatgataa aaatcacaat aaaaaactgc tagttattag aacaaaaggt 180
accattgctg gtcaatatag agtttatagc gaagaaggtg ctaacaaaag tggtttagcc 240
tggccttcag cctttaaggt acagttgcaa ctacctgata atgaagtagc tcaaatatct 300
gattactatc caagaaattc gattgataca aaaaactata tgagtacttt aacttatgga 360
ttcaacggta atgttactgg tgatgataca ggaaaaattg gcggccttat tggtgcaaat 420
gtttcgattg gtcatacact gaactatgtt caacctgatt tcaaaacaat tttagagagc 480
ccaactgata aaaaagtagg ctggaaagtg atatttaaca atatggtgaa tcaaaattgg 540
ggaccatacg atcgagattc ttggaacccg gtatatggca atcaactttt catgaaaact 600
agaaatggtt ctatgaaagc agcagataac ttccttgatc ctaacaaagc aagttctcta 660
ttatcttcag ggttttcacc agacttcgct acagttatta ctatggatag aaaagcatcc 720
aaacaacaaa caaatataga tgtaatatac gaacgagttc gtgatgatta ccaattgcat 780
tggacttcaa caaattggaa aggtaccaat actaaagata aatggacaga tcgttcttca 840
gaaagatata aaatcgattg ggaaaaagaa gaaatgacaa attaa 885
<210> 4
<211> 293
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> alpha-hemolysin mutant (E111N/K147N)
<400> 4
Ala Asp Ser Asp Ile Asn Ile Lys Thr Gly Thr Thr Asp Ile Gly Ser
1 5 10 15
Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu Asn
20 25 30
Gly Met His Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp Lys Asn His
35 40 45
Asn Lys Lys Leu Leu Val Ile Arg Thr Lys Gly Thr Ile Ala Gly Gln
50 55 60
Tyr Arg Val Tyr Ser Glu Glu Gly Ala Asn Lys Ser Gly Leu Ala Trp
65 70 75 80
Pro Ser Ala Phe Lys Val Gln Leu Gln Leu Pro Asp Asn Glu Val Ala
85 90 95
Gln Ile Ser Asp Tyr Tyr Pro Arg Asn Ser Ile Asp Thr Lys Asn Tyr
100 105 110
Met Ser Thr Leu Thr Tyr Gly Phe Asn Gly Asn Val Thr Gly Asp Asp
115 120 125
Thr Gly Lys Ile Gly Gly Leu Ile Gly Ala Asn Val Ser Ile Gly His
130 135 140
Thr Leu Asn Tyr Val Gln Pro Asp Phe Lys Thr Ile Leu Glu Ser Pro
145 150 155 160
Thr Asp Lys Lys Val Gly Trp Lys Val Ile Phe Asn Asn Met Val Asn
165 170 175
Gln Asn Trp Gly Pro Tyr Asp Arg Asp Ser Trp Asn Pro Val Tyr Gly
180 185 190
Asn Gln Leu Phe Met Lys Thr Arg Asn Gly Ser Met Lys Ala Ala Asp
195 200 205
Asn Phe Leu Asp Pro Asn Lys Ala Ser Ser Leu Leu Ser Ser Gly Phe
210 215 220
Ser Pro Asp Phe Ala Thr Val Ile Thr Met Asp Arg Lys Ala Ser Lys
225 230 235 240
Gln Gln Thr Asn Ile Asp Val Ile Tyr Glu Arg Val Arg Asp Asp Tyr
245 250 255
Gln Leu His Trp Thr Ser Thr Asn Trp Lys Gly Thr Asn Thr Lys Asp
260 265 270
Lys Trp Thr Asp Arg Ser Ser Glu Arg Tyr Lys Ile Asp Trp Glu Lys
275 280 285
Glu Glu Met Thr Asn
290
<210> 5
<211> 184
<212> PRT
<213> Mycobacterium smegmatis
<400> 5
Gly Leu Asp Asn Glu Leu Ser Leu Val Asp Gly Gln Asp Arg Thr Leu
1 5 10 15
Thr Val Gln Gln Trp Asp Thr Phe Leu Asn Gly Val Phe Pro Leu Asp
20 25 30
Arg Asn Arg Leu Thr Arg Glu Trp Phe His Ser Gly Arg Ala Lys Tyr
35 40 45
Ile Val Ala Gly Pro Gly Ala Asp Glu Phe Glu Gly Thr Leu Glu Leu
50 55 60
Gly Tyr Gln Ile Gly Phe Pro Trp Ser Leu Gly Val Gly Ile Asn Phe
65 70 75 80
Ser Tyr Thr Thr Pro Asn Ile Leu Ile Asp Asp Gly Asp Ile Thr Ala
85 90 95
Pro Pro Phe Gly Leu Asn Ser Val Ile Thr Pro Asn Leu Phe Pro Gly
100 105 110
Val Ser Ile Ser Ala Asp Leu Gly Asn Gly Pro Gly Ile Gln Glu Val
115 120 125
Ala Thr Phe Ser Val Asp Val Ser Gly Pro Ala Gly Gly Val Ala Val
130 135 140
Ser Asn Ala His Gly Thr Val Thr Gly Ala Ala Gly Gly Val Leu Leu
145 150 155 160
Arg Pro Phe Ala Arg Leu Ile Ala Ser Thr Gly Asp Ser Val Thr Thr
165 170 175
Tyr Gly Glu Pro Trp Asn Met Asn
180
<210> 6
<211> 184
<212> PRT
<213> Mycobacterium smegmatis
<400> 6
Gly Leu Asp Asn Glu Leu Ser Leu Val Asp Gly Gln Asp Arg Thr Leu
1 5 10 15
Thr Val Gln Gln Trp Asp Thr Phe Leu Asn Gly Val Phe Pro Leu Asp
20 25 30
Arg Asn Arg Leu Thr Arg Glu Trp Phe His Ser Gly Arg Ala Lys Tyr
35 40 45
Ile Val Ala Gly Pro Gly Ala Asp Glu Phe Glu Gly Thr Leu Glu Leu
50 55 60
Gly Tyr Gln Ile Gly Phe Pro Trp Ser Leu Gly Val Gly Ile Asn Phe
65 70 75 80
Ser Tyr Thr Thr Pro Asn Ile Leu Ile Asp Asp Gly Asp Ile Thr Gly
85 90 95
Pro Pro Phe Gly Leu Glu Ser Val Ile Thr Pro Asn Leu Phe Pro Gly
100 105 110
Val Ser Ile Ser Ala Asp Leu Gly Asn Gly Pro Gly Ile Gln Glu Val
115 120 125
Ala Thr Phe Ser Val Asp Val Ser Gly Pro Ala Gly Gly Val Ala Val
130 135 140
Ser Asn Ala His Gly Thr Val Thr Gly Ala Ala Gly Gly Val Leu Leu
145 150 155 160
Arg Pro Phe Ala Arg Leu Ile Ala Ser Thr Gly Asp Ser Val Thr Thr
165 170 175
Tyr Gly Glu Pro Trp Asn Met Asn
180
<210> 7
<211> 183
<212> PRT
<213> Mycobacterium smegmatis
<400> 7
Val Asp Asn Gln Leu Ser Val Val Asp Gly Gln Gly Arg Thr Leu Thr
1 5 10 15
Val Gln Gln Ala Glu Thr Phe Leu Asn Gly Val Phe Pro Leu Asp Arg
20 25 30
Asn Arg Leu Thr Arg Glu Trp Phe His Ser Gly Arg Ala Thr Tyr His
35 40 45
Val Ala Gly Pro Gly Ala Asp Glu Phe Glu Gly Thr Leu Glu Leu Gly
50 55 60
Tyr Gln Val Gly Phe Pro Trp Ser Leu Gly Val Gly Ile Asn Phe Ser
65 70 75 80
Tyr Thr Thr Pro Asn Ile Leu Ile Asp Gly Gly Asp Ile Thr Gln Pro
85 90 95
Pro Phe Gly Leu Asp Thr Ile Ile Thr Pro Asn Leu Phe Pro Gly Val
100 105 110
Ser Ile Ser Ala Asp Leu Gly Asn Gly Pro Gly Ile Gln Glu Val Ala
115 120 125
Thr Phe Ser Val Asp Val Lys Gly Ala Lys Gly Ala Val Ala Val Ser
130 135 140
Asn Ala His Gly Thr Val Thr Gly Ala Ala Gly Gly Val Leu Leu Arg
145 150 155 160
Pro Phe Ala Arg Leu Ile Ala Ser Thr Gly Asp Ser Val Thr Thr Tyr
165 170 175
Gly Glu Pro Trp Asn Met Asn
180
<210> 8
<211> 1830
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis phage phi29
<400> 8
atgaaacaca tgccgcgtaa aatgtatagc tgcgcgtttg aaaccacgac caaagtggaa 60
gattgtcgcg tttgggccta tggctacatg aacatcgaag atcattctga atacaaaatc 120
ggtaacagtc tggatgaatt tatggcatgg gtgctgaaag ttcaggcgga tctgtacttc 180
cacaacctga aatttgatgg cgcattcatt atcaactggc tggaacgtaa tggctttaaa 240
tggagcgcgg atggtctgcc gaacacgtat aataccatta tctctcgtat gggccagtgg 300
tatatgattg atatctgcct gggctacaaa ggtaaacgca aaattcatac cgtgatctat 360
gatagcctga aaaaactgcc gtttccggtg aagaaaattg cgaaagattt caaactgacg 420
gttctgaaag gcgatattga ttatcacaaa gaacgtccgg ttggttacaa aatcaccccg 480
gaagaatacg catacatcaa aaacgatatc cagatcatcg cagaagcgct gctgattcag 540
tttaaacagg gcctggatcg catgaccgcg ggcagtgata gcctgaaagg tttcaaagat 600
atcatcacga ccaaaaaatt caaaaaagtg ttcccgacgc tgagcctggg tctggataaa 660
gaagttcgtt atgcctaccg cggcggtttt acctggctga acgatcgttt caaagaaaaa 720
gaaattggcg agggtatggt gtttgatgtt aatagtctgt atccggcaca gatgtacagc 780
cgcctgctgc cgtatggcga accgatcgtg ttcgagggta aatatgtttg ggatgaagat 840
tacccgctgc atattcagca catccgttgt gaatttgaac tgaaagaagg ctatattccg 900
accattcaga tcaaacgtag tcgcttctat aagggtaacg aatacctgaa aagctctggc 960
ggtgaaatcg cggatctgtg gctgagtaac gtggatctgg aactgatgaa agaacactac 1020
gatctgtaca acgttgaata catcagcggc ctgaaattta aagccacgac cggtctgttc 1080
aaagatttca tcgataaatg gacctacatc aaaacgacct ctgaaggcgc gattaaacag 1140
ctggccaaac tgatgctgaa cagcctgtat ggcaaattcg cctctaatcc ggatgtgacc 1200
ggtaaagttc cgtacctgaa agaaaatggc gcactgggtt ttcgcctggg cgaagaagaa 1260
acgaaagatc cggtgtatac cccgatgggt gttttcatta cggcctgggc acgttacacg 1320
accatcaccg cggcccaggc atgctatgat cgcattatct actgtgatac cgattctatt 1380
catctgacgg gcaccgaaat cccggatgtg attaaagata tcgttgatcc gaaaaaactg 1440
ggttattggg cccacgaaag tacgtttaaa cgtgcaaaat acctgcgcca gaaaacctac 1500
atccaggata tctacatgaa agaagtggat ggcaaactgg ttgaaggttc tccggatgat 1560
tacaccgata tcaaattcag tgtgaaatgc gccggcatga cggataaaat caaaaaagaa 1620
gtgaccttcg aaaacttcaa agttggtttc agccgcaaaa tgaaaccgaa accggtgcag 1680
gttccgggcg gtgtggttct ggtggatgat acgtttacca ttaaatctgg cggtagtgcg 1740
tggagccatc cgcagttcga aaaaggcggt ggctctggtg gcggttctgg cggtagtgcc 1800
tggagccacc cgcagtttga aaaataataa 1830
<210> 9
<211> 608
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis phage phi29
<400> 9
Met Lys His Met Pro Arg Lys Met Tyr Ser Cys Ala Phe Glu Thr Thr
1 5 10 15
Thr Lys Val Glu Asp Cys Arg Val Trp Ala Tyr Gly Tyr Met Asn Ile
20 25 30
Glu Asp His Ser Glu Tyr Lys Ile Gly Asn Ser Leu Asp Glu Phe Met
35 40 45
Ala Trp Val Leu Lys Val Gln Ala Asp Leu Tyr Phe His Asn Leu Lys
50 55 60
Phe Asp Gly Ala Phe Ile Ile Asn Trp Leu Glu Arg Asn Gly Phe Lys
65 70 75 80
Trp Ser Ala Asp Gly Leu Pro Asn Thr Tyr Asn Thr Ile Ile Ser Arg
85 90 95
Met Gly Gln Trp Tyr Met Ile Asp Ile Cys Leu Gly Tyr Lys Gly Lys
100 105 110
Arg Lys Ile His Thr Val Ile Tyr Asp Ser Leu Lys Lys Leu Pro Phe
115 120 125
Pro Val Lys Lys Ile Ala Lys Asp Phe Lys Leu Thr Val Leu Lys Gly
130 135 140
Asp Ile Asp Tyr His Lys Glu Arg Pro Val Gly Tyr Lys Ile Thr Pro
145 150 155 160
Glu Glu Tyr Ala Tyr Ile Lys Asn Asp Ile Gln Ile Ile Ala Glu Ala
165 170 175
Leu Leu Ile Gln Phe Lys Gln Gly Leu Asp Arg Met Thr Ala Gly Ser
180 185 190
Asp Ser Leu Lys Gly Phe Lys Asp Ile Ile Thr Thr Lys Lys Phe Lys
195 200 205
Lys Val Phe Pro Thr Leu Ser Leu Gly Leu Asp Lys Glu Val Arg Tyr
210 215 220
Ala Tyr Arg Gly Gly Phe Thr Trp Leu Asn Asp Arg Phe Lys Glu Lys
225 230 235 240
Glu Ile Gly Glu Gly Met Val Phe Asp Val Asn Ser Leu Tyr Pro Ala
245 250 255
Gln Met Tyr Ser Arg Leu Leu Pro Tyr Gly Glu Pro Ile Val Phe Glu
260 265 270
Gly Lys Tyr Val Trp Asp Glu Asp Tyr Pro Leu His Ile Gln His Ile
275 280 285
Arg Cys Glu Phe Glu Leu Lys Glu Gly Tyr Ile Pro Thr Ile Gln Ile
290 295 300
Lys Arg Ser Arg Phe Tyr Lys Gly Asn Glu Tyr Leu Lys Ser Ser Gly
305 310 315 320
Gly Glu Ile Ala Asp Leu Trp Leu Ser Asn Val Asp Leu Glu Leu Met
325 330 335
Lys Glu His Tyr Asp Leu Tyr Asn Val Glu Tyr Ile Ser Gly Leu Lys
340 345 350
Phe Lys Ala Thr Thr Gly Leu Phe Lys Asp Phe Ile Asp Lys Trp Thr
355 360 365
Tyr Ile Lys Thr Thr Ser Glu Gly Ala Ile Lys Gln Leu Ala Lys Leu
370 375 380
Met Leu Asn Ser Leu Tyr Gly Lys Phe Ala Ser Asn Pro Asp Val Thr
385 390 395 400
Gly Lys Val Pro Tyr Leu Lys Glu Asn Gly Ala Leu Gly Phe Arg Leu
405 410 415
Gly Glu Glu Glu Thr Lys Asp Pro Val Tyr Thr Pro Met Gly Val Phe
420 425 430
Ile Thr Ala Trp Ala Arg Tyr Thr Thr Ile Thr Ala Ala Gln Ala Cys
435 440 445
Tyr Asp Arg Ile Ile Tyr Cys Asp Thr Asp Ser Ile His Leu Thr Gly
450 455 460
Thr Glu Ile Pro Asp Val Ile Lys Asp Ile Val Asp Pro Lys Lys Leu
465 470 475 480
Gly Tyr Trp Ala His Glu Ser Thr Phe Lys Arg Ala Lys Tyr Leu Arg
485 490 495
Gln Lys Thr Tyr Ile Gln Asp Ile Tyr Met Lys Glu Val Asp Gly Lys
500 505 510
Leu Val Glu Gly Ser Pro Asp Asp Tyr Thr Asp Ile Lys Phe Ser Val
515 520 525
Lys Cys Ala Gly Met Thr Asp Lys Ile Lys Lys Glu Val Thr Phe Glu
530 535 540
Asn Phe Lys Val Gly Phe Ser Arg Lys Met Lys Pro Lys Pro Val Gln
545 550 555 560
Val Pro Gly Gly Val Val Leu Val Asp Asp Thr Phe Thr Ile Lys Ser
565 570 575
Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser
580 585 590
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
595 600 605
<210> 10
<211> 1390
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 10
atgatgaacg atggcaaaca gcagagcacc ttcctgtttc atgattatga aaccttcggt 60
acccatccgg ccctggatcg tccggcgcag tttgcggcca ttcgcaccga tagcgaattc 120
aatgtgattg gcgaaccgga agtgttttat tgcaaaccgg ccgatgatta tctgccgcag 180
ccgggtgcgg tgctgattac cggtattacc ccgcaggaag cgcgcgcgaa aggtgaaaac 240
gaagcggcgt ttgccgcgcg cattcatagc ctgtttaccg tgccgaaaac ctgcattctg 300
ggctataaca atgtgcgctt cgatgatgaa gttacccgta atatctttta tcgtaacttt 360
tatgatccgt atgcgtggag ctggcagcat gataacagcc gttgggatct gctggatgtg 420
atgcgcgcgt gctatgcgct gcgcccggaa ggcattaatt ggccggaaaa cgatgatggc 480
ctgccgagct ttcgtctgga acatctgacc aaagccaacg gcattgaaca tagcaatgcc 540
catgatgcga tggccgatgt ttatgcgacc attgcgatgg cgaaactggt taaaacccgt 600
cagccgcgcc tgtttgatta tctgtttacc caccgtaaca aacacaaact gatggcgctg 660
attgatgttc cgcagatgaa accgctggtg catgtgagcg gcatgtttgg cgcctggcgc 720
ggcaacacca gctgggtggc cccgctggcc tggcacccgg aaaatcgtaa cgccgtgatt 780
atggttgatc tggccggtga tattagcccg ctgctggaac tggatagcga taccctgcgt 840
gaacgcctgt ataccgccaa aaccgatctg ggcgataatg ccgccgtgcc ggtgaaactg 900
gttcacatta acaaatgccc ggtgctggcc caggcgaaca ccctgcgccc ggaagatgcg 960
gatcgtctgg gtattaatcg ccagcattgt ctggataatc tgaaaatcct gcgtgaaaac 1020
ccgcaggtgc gtgaaaaagt ggtggcgatc ttcgcggaag cggaaccgtt caccccgagc 1080
gataacgtgg atgcgcagct gtataacggc ttctttagcg atgccgatcg cgcggcgatg 1140
aaaatcgttc tggaaaccga accgcgcaat ctgccggcgc tggatattac ctttgttgat 1200
aaacgtattg aaaaactgct gtttaattat cgtgcgcgca attttccggg taccctggat 1260
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gtggcgctgc 1390
<210> 11
<211> 485
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 11
Met Met Asn Asp Gly Lys Gln Gln Ser Thr Phe Leu Phe His Asp Tyr
1 5 10 15
Glu Thr Phe Gly Thr His Pro Ala Leu Asp Arg Pro Ala Gln Phe Ala
20 25 30
Ala Ile Arg Thr Asp Ser Glu Phe Asn Val Ile Gly Glu Pro Glu Val
35 40 45
Phe Tyr Cys Lys Pro Ala Asp Asp Tyr Leu Pro Gln Pro Gly Ala Val
50 55 60
Leu Ile Thr Gly Ile Thr Pro Gln Glu Ala Arg Ala Lys Gly Glu Asn
65 70 75 80
Glu Ala Ala Phe Ala Ala Arg Ile His Ser Leu Phe Thr Val Pro Lys
85 90 95
Thr Cys Ile Leu Gly Tyr Asn Asn Val Arg Phe Asp Asp Glu Val Thr
100 105 110
Arg Asn Ile Phe Tyr Arg Asn Phe Tyr Asp Pro Tyr Ala Trp Ser Trp
115 120 125
Gln His Asp Asn Ser Arg Trp Asp Leu Leu Asp Val Met Arg Ala Cys
130 135 140
Tyr Ala Leu Arg Pro Glu Gly Ile Asn Trp Pro Glu Asn Asp Asp Gly
145 150 155 160
Leu Pro Ser Phe Arg Leu Glu His Leu Thr Lys Ala Asn Gly Ile Glu
165 170 175
His Ser Asn Ala His Asp Ala Met Ala Asp Val Tyr Ala Thr Ile Ala
180 185 190
Met Ala Lys Leu Val Lys Thr Arg Gln Pro Arg Leu Phe Asp Tyr Leu
195 200 205
Phe Thr His Arg Asn Lys His Lys Leu Met Ala Leu Ile Asp Val Pro
210 215 220
Gln Met Lys Pro Leu Val His Val Ser Gly Met Phe Gly Ala Trp Arg
225 230 235 240
Gly Asn Thr Ser Trp Val Ala Pro Leu Ala Trp His Pro Glu Asn Arg
245 250 255
Asn Ala Val Ile Met Val Asp Leu Ala Gly Asp Ile Ser Pro Leu Leu
260 265 270
Glu Leu Asp Ser Asp Thr Leu Arg Glu Arg Leu Tyr Thr Ala Lys Thr
275 280 285
Asp Leu Gly Asp Asn Ala Ala Val Pro Val Lys Leu Val His Ile Asn
290 295 300
Lys Cys Pro Val Leu Ala Gln Ala Asn Thr Leu Arg Pro Glu Asp Ala
305 310 315 320
Asp Arg Leu Gly Ile Asn Arg Gln His Cys Leu Asp Asn Leu Lys Ile
325 330 335
Leu Arg Glu Asn Pro Gln Val Arg Glu Lys Val Val Ala Ile Phe Ala
340 345 350
Glu Ala Glu Pro Phe Thr Pro Ser Asp Asn Val Asp Ala Gln Leu Tyr
355 360 365
Asn Gly Phe Phe Ser Asp Ala Asp Arg Ala Ala Met Lys Ile Val Leu
370 375 380
Glu Thr Glu Pro Arg Asn Leu Pro Ala Leu Asp Ile Thr Phe Val Asp
385 390 395 400
Lys Arg Ile Glu Lys Leu Leu Phe Asn Tyr Arg Ala Arg Asn Phe Pro
405 410 415
Gly Thr Leu Asp Tyr Ala Glu Gln Gln Arg Trp Leu Glu His Arg Arg
420 425 430
Gln Val Phe Thr Pro Glu Phe Leu Gln Gly Tyr Ala Asp Glu Leu Gln
435 440 445
Met Leu Val Gln Gln Tyr Ala Asp Asp Lys Glu Lys Val Ala Leu Leu
450 455 460
Lys Ala Leu Trp Gln Tyr Ala Glu Glu Ile Val Ser Gly Ser Gly His
465 470 475 480
His His His His His
485
<210> 12
<211> 804
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 12
atgaaatttg tctcttttaa tatcaacggc ctgcgcgcca gacctcacca gcttgaagcc 60
atcgtcgaaa agcaccaacc ggatgtgatt ggcctgcagg agacaaaagt tcatgacgat 120
atgtttccgc tcgaagaggt ggcgaagctc ggctacaacg tgttttatca cgggcagaaa 180
ggccattatg gcgtggcgct gctgaccaaa gagacgccga ttgccgtgcg tcgcggcttt 240
cccggtgacg acgaagaggc gcagcggcgg attattatgg cggaaatccc ctcactgctg 300
ggtaatgtca ccgtgatcaa cggttacttc ccgcagggtg aaagccgcga ccatccgata 360
aaattcccgg caaaagcgca gttttatcag aatctgcaaa actacctgga aaccgaactc 420
aaacgtgata atccggtact gattatgggc gatatgaata tcagccctac agatctggat 480
atcggcattg gcgaagaaaa ccgtaagcgc tggctgcgta ccggtaaatg ctctttcctg 540
ccggaagagc gcgaatggat ggacaggctg atgagctggg ggttggtcga taccttccgc 600
catgcgaatc cgcaaacagc agatcgtttc tcatggtttg attaccgctc aaaaggtttt 660
gacgataacc gtggtctgcg catcgacctg ctgctcgcca gccaaccgct ggcagaatgt 720
tgcgtagaaa ccggcatcga ctatgaaatc cgcagcatgg aaaaaccgtc cgatcacgcc 780
cccgtctggg cgaccttccg ccgc 804
<210> 13
<211> 268
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 13
Met Lys Phe Val Ser Phe Asn Ile Asn Gly Leu Arg Ala Arg Pro His
1 5 10 15
Gln Leu Glu Ala Ile Val Glu Lys His Gln Pro Asp Val Ile Gly Leu
20 25 30
Gln Glu Thr Lys Val His Asp Asp Met Phe Pro Leu Glu Glu Val Ala
35 40 45
Lys Leu Gly Tyr Asn Val Phe Tyr His Gly Gln Lys Gly His Tyr Gly
50 55 60
Val Ala Leu Leu Thr Lys Glu Thr Pro Ile Ala Val Arg Arg Gly Phe
65 70 75 80
Pro Gly Asp Asp Glu Glu Ala Gln Arg Arg Ile Ile Met Ala Glu Ile
85 90 95
Pro Ser Leu Leu Gly Asn Val Thr Val Ile Asn Gly Tyr Phe Pro Gln
100 105 110
Gly Glu Ser Arg Asp His Pro Ile Lys Phe Pro Ala Lys Ala Gln Phe
115 120 125
Tyr Gln Asn Leu Gln Asn Tyr Leu Glu Thr Glu Leu Lys Arg Asp Asn
130 135 140
Pro Val Leu Ile Met Gly Asp Met Asn Ile Ser Pro Thr Asp Leu Asp
145 150 155 160
Ile Gly Ile Gly Glu Glu Asn Arg Lys Arg Trp Leu Arg Thr Gly Lys
165 170 175
Cys Ser Phe Leu Pro Glu Glu Arg Glu Trp Met Asp Arg Leu Met Ser
180 185 190
Trp Gly Leu Val Asp Thr Phe Arg His Ala Asn Pro Gln Thr Ala Asp
195 200 205
Arg Phe Ser Trp Phe Asp Tyr Arg Ser Lys Gly Phe Asp Asp Asn Arg
210 215 220
Gly Leu Arg Ile Asp Leu Leu Leu Ala Ser Gln Pro Leu Ala Glu Cys
225 230 235 240
Cys Val Glu Thr Gly Ile Asp Tyr Glu Ile Arg Ser Met Glu Lys Pro
245 250 255
Ser Asp His Ala Pro Val Trp Ala Thr Phe Arg Arg
260 265
<210> 14
<211> 1275
<212> DNA
<213> Thermus thermophilus
<400> 14
atgtttcgtc gtaaagaaga tctggatccg ccgctggcac tgctgccgct gaaaggcctg 60
cgcgaagccg ccgcactgct ggaagaagcg ctgcgtcaag gtaaacgcat tcgtgttcac 120
ggcgactatg atgcggatgg cctgaccggc accgcgatcc tggttcgtgg tctggccgcc 180
ctgggtgcgg atgttcatcc gtttatcccg caccgcctgg aagaaggcta tggtgtcctg 240
atggaacgcg tcccggaaca tctggaagcc tcggacctgt ttctgaccgt tgactgcggc 300
attaccaacc atgcggaact gcgcgaactg ctggaaaatg gcgtggaagt cattgttacc 360
gatcatcata cgccgggcaa aacgccgccg ccgggtctgg tcgtgcatcc ggcgctgacg 420
ccggatctga aagaaaaacc gaccggcgca ggcgtggcgt ttctgctgct gtgggcactg 480
catgaacgcc tgggcctgcc gccgccgctg gaatacgcgg acctggcagc cgttggcacc 540
attgccgacg ttgccccgct gtggggttgg aatcgtgcac tggtgaaaga aggtctggca 600
cgcatcccgg cttcatcttg ggtgggcctg cgtctgctgg ctgaagccgt gggctatacc 660
ggcaaagcgg tcgaagtcgc tttccgcatc gcgccgcgca tcaatgcggc ttcccgcctg 720
ggcgaagcgg aaaaagccct gcgcctgctg ctgacggatg atgcggcaga agctcaggcg 780
ctggtcggcg aactgcaccg tctgaacgcc cgtcgtcaga ccctggaaga agcgatgctg 840
cgcaaactgc tgccgcaggc cgacccggaa gcgaaagcca tcgttctgct ggacccggaa 900
ggccatccgg gtgttatggg tattgtggcc tctcgcatcc tggaagcgac cctgcgcccg 960
gtctttctgg tggcccaggg caaaggcacc gtgcgttcgc tggctccgat ttccgccgtc 1020
gaagcactgc gcagcgcgga agatctgctg ctgcgttatg gtggtcataa agaagcggcg 1080
ggtttcgcaa tggatgaagc gctgtttccg gcgttcaaag cacgcgttga agcgtatgcc 1140
gcacgtttcc cggatccggt tcgtgaagtg gcactgctgg atctgctgcc ggaaccgggc 1200
ctgctgccgc aggtgttccg tgaactggca ctgctggaac cgtatggtga aggtaacccg 1260
gaaccgctgt tcctg 1275
<210> 15
<211> 425
<212> PRT
<213> Thermus thermophilus
<400> 15
Met Phe Arg Arg Lys Glu Asp Leu Asp Pro Pro Leu Ala Leu Leu Pro
1 5 10 15
Leu Lys Gly Leu Arg Glu Ala Ala Ala Leu Leu Glu Glu Ala Leu Arg
20 25 30
Gln Gly Lys Arg Ile Arg Val His Gly Asp Tyr Asp Ala Asp Gly Leu
35 40 45
Thr Gly Thr Ala Ile Leu Val Arg Gly Leu Ala Ala Leu Gly Ala Asp
50 55 60
Val His Pro Phe Ile Pro His Arg Leu Glu Glu Gly Tyr Gly Val Leu
65 70 75 80
Met Glu Arg Val Pro Glu His Leu Glu Ala Ser Asp Leu Phe Leu Thr
85 90 95
Val Asp Cys Gly Ile Thr Asn His Ala Glu Leu Arg Glu Leu Leu Glu
100 105 110
Asn Gly Val Glu Val Ile Val Thr Asp His His Thr Pro Gly Lys Thr
115 120 125
Pro Pro Pro Gly Leu Val Val His Pro Ala Leu Thr Pro Asp Leu Lys
130 135 140
Glu Lys Pro Thr Gly Ala Gly Val Ala Phe Leu Leu Leu Trp Ala Leu
145 150 155 160
His Glu Arg Leu Gly Leu Pro Pro Pro Leu Glu Tyr Ala Asp Leu Ala
165 170 175
Ala Val Gly Thr Ile Ala Asp Val Ala Pro Leu Trp Gly Trp Asn Arg
180 185 190
Ala Leu Val Lys Glu Gly Leu Ala Arg Ile Pro Ala Ser Ser Trp Val
195 200 205
Gly Leu Arg Leu Leu Ala Glu Ala Val Gly Tyr Thr Gly Lys Ala Val
210 215 220
Glu Val Ala Phe Arg Ile Ala Pro Arg Ile Asn Ala Ala Ser Arg Leu
225 230 235 240
Gly Glu Ala Glu Lys Ala Leu Arg Leu Leu Leu Thr Asp Asp Ala Ala
245 250 255
Glu Ala Gln Ala Leu Val Gly Glu Leu His Arg Leu Asn Ala Arg Arg
260 265 270
Gln Thr Leu Glu Glu Ala Met Leu Arg Lys Leu Leu Pro Gln Ala Asp
275 280 285
Pro Glu Ala Lys Ala Ile Val Leu Leu Asp Pro Glu Gly His Pro Gly
290 295 300
Val Met Gly Ile Val Ala Ser Arg Ile Leu Glu Ala Thr Leu Arg Pro
305 310 315 320
Val Phe Leu Val Ala Gln Gly Lys Gly Thr Val Arg Ser Leu Ala Pro
325 330 335
Ile Ser Ala Val Glu Ala Leu Arg Ser Ala Glu Asp Leu Leu Leu Arg
340 345 350
Tyr Gly Gly His Lys Glu Ala Ala Gly Phe Ala Met Asp Glu Ala Leu
355 360 365
Phe Pro Ala Phe Lys Ala Arg Val Glu Ala Tyr Ala Ala Arg Phe Pro
370 375 380
Asp Pro Val Arg Glu Val Ala Leu Leu Asp Leu Leu Pro Glu Pro Gly
385 390 395 400
Leu Leu Pro Gln Val Phe Arg Glu Leu Ala Leu Leu Glu Pro Tyr Gly
405 410 415
Glu Gly Asn Pro Glu Pro Leu Phe Leu
420 425
<210> 16
<211> 738
<212> DNA
<213> Bacteriophage lambda
<400> 16
tccggaagcg gctctggtag tggttctggc atgacaccgg acattatcct gcagcgtacc 60
gggatcgatg tgagagctgt cgaacagggg gatgatgcgt ggcacaaatt acggctcggc 120
gtcatcaccg cttcagaagt tcacaacgtg atagcaaaac cccgctccgg aaagaagtgg 180
cctgacatga aaatgtccta cttccacacc ctgcttgctg aggtttgcac cggtgtggct 240
ccggaagtta acgctaaagc actggcctgg ggaaaacagt acgagaacga cgccagaacc 300
ctgtttgaat tcacttccgg cgtgaatgtt actgaatccc cgatcatcta tcgcgacgaa 360
agtatgcgta ccgcctgctc tcccgatggt ttatgcagtg acggcaacgg ccttgaactg 420
aaatgcccgt ttacctcccg ggatttcatg aagttccggc tcggtggttt cgaggccata 480
aagtcagctt acatggccca ggtgcagtac agcatgtggg tgacgcgaaa aaatgcctgg 540
tactttgcca actatgaccc gcgtatgaag cgtgaaggcc tgcattatgt cgtgattgag 600
cgggatgaaa agtacatggc gagttttgac gagatcgtgc cggagttcat cgaaaaaatg 660
gacgaggcac tggctgaaat tggttttgta tttggggagc aatggcgatc tggctctggt 720
tccggcagcg gttccgga 738
<210> 17
<211> 226
<212> PRT
<213> Bacteriophage lambda
<400> 17
Met Thr Pro Asp Ile Ile Leu Gln Arg Thr Gly Ile Asp Val Arg Ala
1 5 10 15
Val Glu Gln Gly Asp Asp Ala Trp His Lys Leu Arg Leu Gly Val Ile
20 25 30
Thr Ala Ser Glu Val His Asn Val Ile Ala Lys Pro Arg Ser Gly Lys
35 40 45
Lys Trp Pro Asp Met Lys Met Ser Tyr Phe His Thr Leu Leu Ala Glu
50 55 60
Val Cys Thr Gly Val Ala Pro Glu Val Asn Ala Lys Ala Leu Ala Trp
65 70 75 80
Gly Lys Gln Tyr Glu Asn Asp Ala Arg Thr Leu Phe Glu Phe Thr Ser
85 90 95
Gly Val Asn Val Thr Glu Ser Pro Ile Ile Tyr Arg Asp Glu Ser Met
100 105 110
Arg Thr Ala Cys Ser Pro Asp Gly Leu Cys Ser Asp Gly Asn Gly Leu
115 120 125
Glu Leu Lys Cys Pro Phe Thr Ser Arg Asp Phe Met Lys Phe Arg Leu
130 135 140
Gly Gly Phe Glu Ala Ile Lys Ser Ala Tyr Met Ala Gln Val Gln Tyr
145 150 155 160
Ser Met Trp Val Thr Arg Lys Asn Ala Trp Tyr Phe Ala Asn Tyr Asp
165 170 175
Pro Arg Met Lys Arg Glu Gly Leu His Tyr Val Val Ile Glu Arg Asp
180 185 190
Glu Lys Tyr Met Ala Ser Phe Asp Glu Ile Val Pro Glu Phe Ile Glu
195 200 205
Lys Met Asp Glu Ala Leu Ala Glu Ile Gly Phe Val Phe Gly Glu Gln
210 215 220
Trp Arg
225
<210> 18
<211> 760
<212> PRT
<213> Methanococcoides burtonii
<400> 18
Met Met Ile Arg Glu Leu Asp Ile Pro Arg Asp Ile Ile Gly Phe Tyr
1 5 10 15
Glu Asp Ser Gly Ile Lys Glu Leu Tyr Pro Pro Gln Ala Glu Ala Ile
20 25 30
Glu Met Gly Leu Leu Glu Lys Lys Asn Leu Leu Ala Ala Ile Pro Thr
35 40 45
Ala Ser Gly Lys Thr Leu Leu Ala Glu Leu Ala Met Ile Lys Ala Ile
50 55 60
Arg Glu Gly Gly Lys Ala Leu Tyr Ile Val Pro Leu Arg Ala Leu Ala
65 70 75 80
Ser Glu Lys Phe Glu Arg Phe Lys Glu Leu Ala Pro Phe Gly Ile Lys
85 90 95
Val Gly Ile Ser Thr Gly Asp Leu Asp Ser Arg Ala Asp Trp Leu Gly
100 105 110
Val Asn Asp Ile Ile Val Ala Thr Ser Glu Lys Thr Asp Ser Leu Leu
115 120 125
Arg Asn Gly Thr Ser Trp Met Asp Glu Ile Thr Thr Val Val Val Asp
130 135 140
Glu Ile His Leu Leu Asp Ser Lys Asn Arg Gly Pro Thr Leu Glu Val
145 150 155 160
Thr Ile Thr Lys Leu Met Arg Leu Asn Pro Asp Val Gln Val Val Ala
165 170 175
Leu Ser Ala Thr Val Gly Asn Ala Arg Glu Met Ala Asp Trp Leu Gly
180 185 190
Ala Ala Leu Val Leu Ser Glu Trp Arg Pro Thr Asp Leu His Glu Gly
195 200 205
Val Leu Phe Gly Asp Ala Ile Asn Phe Pro Gly Ser Gln Lys Lys Ile
210 215 220
Asp Arg Leu Glu Lys Asp Asp Ala Val Asn Leu Val Leu Asp Thr Ile
225 230 235 240
Lys Ala Glu Gly Gln Cys Leu Val Phe Glu Ser Ser Arg Arg Asn Cys
245 250 255
Ala Gly Phe Ala Lys Thr Ala Ser Ser Lys Val Ala Lys Ile Leu Asp
260 265 270
Asn Asp Ile Met Ile Lys Leu Ala Gly Ile Ala Glu Glu Val Glu Ser
275 280 285
Thr Gly Glu Thr Asp Thr Ala Ile Val Leu Ala Asn Cys Ile Arg Lys
290 295 300
Gly Val Ala Phe His His Ala Gly Leu Asn Ser Asn His Arg Lys Leu
305 310 315 320
Val Glu Asn Gly Phe Arg Gln Asn Leu Ile Lys Val Ile Ser Ser Thr
325 330 335
Pro Thr Leu Ala Ala Gly Leu Asn Leu Pro Ala Arg Arg Val Ile Ile
340 345 350
Arg Ser Tyr Arg Arg Phe Asp Ser Asn Phe Gly Met Gln Pro Ile Pro
355 360 365
Val Leu Glu Tyr Lys Gln Met Ala Gly Arg Ala Gly Arg Pro His Leu
370 375 380
Asp Pro Tyr Gly Glu Ser Val Leu Leu Ala Lys Thr Tyr Asp Glu Phe
385 390 395 400
Ala Gln Leu Met Glu Asn Tyr Val Glu Ala Asp Ala Glu Asp Ile Trp
405 410 415
Ser Lys Leu Gly Thr Glu Asn Ala Leu Arg Thr His Val Leu Ser Thr
420 425 430
Ile Val Asn Gly Phe Ala Ser Thr Arg Gln Glu Leu Phe Asp Phe Phe
435 440 445
Gly Ala Thr Phe Phe Ala Tyr Gln Gln Asp Lys Trp Met Leu Glu Glu
450 455 460
Val Ile Asn Asp Cys Leu Glu Phe Leu Ile Asp Lys Ala Met Val Ser
465 470 475 480
Glu Thr Glu Asp Ile Glu Asp Ala Ser Lys Leu Phe Leu Arg Gly Thr
485 490 495
Arg Leu Gly Ser Leu Val Ser Met Leu Tyr Ile Asp Pro Leu Ser Gly
500 505 510
Ser Lys Ile Val Asp Gly Phe Lys Asp Ile Gly Lys Ser Thr Gly Gly
515 520 525
Asn Met Gly Ser Leu Glu Asp Asp Lys Gly Asp Asp Ile Thr Val Thr
530 535 540
Asp Met Thr Leu Leu His Leu Val Cys Ser Thr Pro Asp Met Arg Gln
545 550 555 560
Leu Tyr Leu Arg Asn Thr Asp Tyr Thr Ile Val Asn Glu Tyr Ile Val
565 570 575
Ala His Ser Asp Glu Phe His Glu Ile Pro Asp Lys Leu Lys Glu Thr
580 585 590
Asp Tyr Glu Trp Phe Met Gly Glu Val Lys Thr Ala Met Leu Leu Glu
595 600 605
Glu Trp Val Thr Glu Val Ser Ala Glu Asp Ile Thr Arg His Phe Asn
610 615 620
Val Gly Glu Gly Asp Ile His Ala Leu Ala Asp Thr Ser Glu Trp Leu
625 630 635 640
Met His Ala Ala Ala Lys Leu Ala Glu Leu Leu Gly Val Glu Tyr Ser
645 650 655
Ser His Ala Tyr Ser Leu Glu Lys Arg Ile Arg Tyr Gly Ser Gly Leu
660 665 670
Asp Leu Met Glu Leu Val Gly Ile Arg Gly Val Gly Arg Val Arg Ala
675 680 685
Arg Lys Leu Tyr Asn Ala Gly Phe Val Ser Val Ala Lys Leu Lys Gly
690 695 700
Ala Asp Ile Ser Val Leu Ser Lys Leu Val Gly Pro Lys Val Ala Tyr
705 710 715 720
Asn Ile Leu Ser Gly Ile Gly Val Arg Val Asn Asp Lys His Phe Asn
725 730 735
Ser Ala Pro Ile Ser Ser Asn Thr Leu Asp Thr Leu Leu Asp Lys Asn
740 745 750
Gln Lys Thr Phe Asn Asp Phe Gln
755 760
<210> 19
<211> 707
<212> PRT
<213> Cenarchaeum symbiosum
<400> 19
Met Arg Ile Ser Glu Leu Asp Ile Pro Arg Pro Ala Ile Glu Phe Leu
1 5 10 15
Glu Gly Glu Gly Tyr Lys Lys Leu Tyr Pro Pro Gln Ala Ala Ala Ala
20 25 30
Lys Ala Gly Leu Thr Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Ser Ala Pro Thr
35 40 45
Ala Ser Gly Lys Thr Leu Ile Ala Ala Ile Ala Met Ile Ser His Leu
50 55 60
Ser Arg Asn Arg Gly Lys Ala Val Tyr Leu Ser Pro Leu Arg Ala Leu
65 70 75 80
Ala Ala Glu Lys Phe Ala Glu Phe Gly Lys Ile Gly Gly Ile Pro Leu
85 90 95
Gly Arg Pro Val Arg Val Gly Val Ser Thr Gly Asp Phe Glu Lys Ala
100 105 110
Gly Arg Ser Leu Gly Asn Asn Asp Ile Leu Val Leu Thr Asn Glu Arg
115 120 125
Met Asp Ser Leu Ile Arg Arg Arg Pro Asp Trp Met Asp Glu Val Gly
130 135 140
Leu Val Ile Ala Asp Glu Ile His Leu Ile Gly Asp Arg Ser Arg Gly
145 150 155 160
Pro Thr Leu Glu Met Val Leu Thr Lys Leu Arg Gly Leu Arg Ser Ser
165 170 175
Pro Gln Val Val Ala Leu Ser Ala Thr Ile Ser Asn Ala Asp Glu Ile
180 185 190
Ala Gly Trp Leu Asp Cys Thr Leu Val His Ser Thr Trp Arg Pro Val
195 200 205
Pro Leu Ser Glu Gly Val Tyr Gln Asp Gly Glu Val Ala Met Gly Asp
210 215 220
Gly Ser Arg His Glu Val Ala Ala Thr Gly Gly Gly Pro Ala Val Asp
225 230 235 240
Leu Ala Ala Glu Ser Val Ala Glu Gly Gly Gln Ser Leu Ile Phe Ala
245 250 255
Asp Thr Arg Ala Arg Ser Ala Ser Leu Ala Ala Lys Ala Ser Ala Val
260 265 270
Ile Pro Glu Ala Lys Gly Ala Asp Ala Ala Lys Leu Ala Ala Ala Ala
275 280 285
Lys Lys Ile Ile Ser Ser Gly Gly Glu Thr Lys Leu Ala Lys Thr Leu
290 295 300
Ala Glu Leu Val Glu Lys Gly Ala Ala Phe His His Ala Gly Leu Asn
305 310 315 320
Gln Asp Cys Arg Ser Val Val Glu Glu Glu Phe Arg Ser Gly Arg Ile
325 330 335
Arg Leu Leu Ala Ser Thr Pro Thr Leu Ala Ala Gly Val Asn Leu Pro
340 345 350
Ala Arg Arg Val Val Ile Ser Ser Val Met Arg Tyr Asn Ser Ser Ser
355 360 365
Gly Met Ser Glu Pro Ile Ser Ile Leu Glu Tyr Lys Gln Leu Cys Gly
370 375 380
Arg Ala Gly Arg Pro Gln Tyr Asp Lys Ser Gly Glu Ala Ile Val Val
385 390 395 400
Gly Gly Val Asn Ala Asp Glu Ile Phe Asp Arg Tyr Ile Gly Gly Glu
405 410 415
Pro Glu Pro Ile Arg Ser Ala Met Val Asp Asp Arg Ala Leu Arg Ile
420 425 430
His Val Leu Ser Leu Val Thr Thr Ser Pro Gly Ile Lys Glu Asp Asp
435 440 445
Val Thr Glu Phe Phe Leu Gly Thr Leu Gly Gly Gln Gln Ser Gly Glu
450 455 460
Ser Thr Val Lys Phe Ser Val Ala Val Ala Leu Arg Phe Leu Gln Glu
465 470 475 480
Glu Gly Met Leu Gly Arg Arg Gly Gly Arg Leu Ala Ala Thr Lys Met
485 490 495
Gly Arg Leu Val Ser Arg Leu Tyr Met Asp Pro Met Thr Ala Val Thr
500 505 510
Leu Arg Asp Ala Val Gly Glu Ala Ser Pro Gly Arg Met His Thr Leu
515 520 525
Gly Phe Leu His Leu Val Ser Glu Cys Ser Glu Phe Met Pro Arg Phe
530 535 540
Ala Leu Arg Gln Lys Asp His Glu Val Ala Glu Met Met Leu Glu Ala
545 550 555 560
Gly Arg Gly Glu Leu Leu Arg Pro Val Tyr Ser Tyr Glu Cys Gly Arg
565 570 575
Gly Leu Leu Ala Leu His Arg Trp Ile Gly Glu Ser Pro Glu Ala Lys
580 585 590
Leu Ala Glu Asp Leu Lys Phe Glu Ser Gly Asp Val His Arg Met Val
595 600 605
Glu Ser Ser Gly Trp Leu Leu Arg Cys Ile Trp Glu Ile Ser Lys His
610 615 620
Gln Glu Arg Pro Asp Leu Leu Gly Glu Leu Asp Val Leu Arg Ser Arg
625 630 635 640
Val Ala Tyr Gly Ile Lys Ala Glu Leu Val Pro Leu Val Ser Ile Lys
645 650 655
Gly Ile Gly Arg Val Arg Ser Arg Arg Leu Phe Arg Gly Gly Ile Lys
660 665 670
Gly Pro Gly Asp Leu Ala Ala Val Pro Val Glu Arg Leu Ser Arg Val
675 680 685
Glu Gly Ile Gly Ala Thr Leu Ala Asn Asn Ile Lys Ser Gln Leu Arg
690 695 700
Lys Gly Gly
705
<210> 20
<211> 720
<212> PRT
<213> Thermococcus gammatolerans
<400> 20
Met Lys Val Asp Glu Leu Pro Val Asp Glu Arg Leu Lys Ala Val Leu
1 5 10 15
Lys Glu Arg Gly Ile Glu Glu Leu Tyr Pro Pro Gln Ala Glu Ala Leu
20 25 30
Lys Ser Gly Ala Leu Glu Gly Arg Asn Leu Val Leu Ala Ile Pro Thr
35 40 45
Ala Ser Gly Lys Thr Leu Val Ser Glu Ile Val Met Val Asn Lys Leu
50 55 60
Ile Gln Glu Gly Gly Lys Ala Val Tyr Leu Val Pro Leu Lys Ala Leu
65 70 75 80
Ala Glu Glu Lys Tyr Arg Glu Phe Lys Glu Trp Glu Lys Leu Gly Leu
85 90 95
Lys Val Ala Ala Thr Thr Gly Asp Tyr Asp Ser Thr Asp Asp Trp Leu
100 105 110
Gly Arg Tyr Asp Ile Ile Val Ala Thr Ala Glu Lys Phe Asp Ser Leu
115 120 125
Leu Arg His Gly Ala Arg Trp Ile Asn Asp Val Lys Leu Val Val Ala
130 135 140
Asp Glu Val His Leu Ile Gly Ser Tyr Asp Arg Gly Ala Thr Leu Glu
145 150 155 160
Met Ile Leu Thr His Met Leu Gly Arg Ala Gln Ile Leu Ala Leu Ser
165 170 175
Ala Thr Val Gly Asn Ala Glu Glu Leu Ala Glu Trp Leu Asp Ala Ser
180 185 190
Leu Val Val Ser Asp Trp Arg Pro Val Gln Leu Arg Arg Gly Val Phe
195 200 205
His Leu Gly Thr Leu Ile Trp Glu Asp Gly Lys Val Glu Ser Tyr Pro
210 215 220
Glu Asn Trp Tyr Ser Leu Val Val Asp Ala Val Lys Arg Gly Lys Gly
225 230 235 240
Ala Leu Val Phe Val Asn Thr Arg Arg Ser Ala Glu Lys Glu Ala Leu
245 250 255
Ala Leu Ser Lys Leu Val Ser Ser His Leu Thr Lys Pro Glu Lys Arg
260 265 270
Ala Leu Glu Ser Leu Ala Ser Gln Leu Glu Asp Asn Pro Thr Ser Glu
275 280 285
Lys Leu Lys Arg Ala Leu Arg Gly Gly Val Ala Phe His His Ala Gly
290 295 300
Leu Ser Arg Val Glu Arg Thr Leu Ile Glu Asp Ala Phe Arg Glu Gly
305 310 315 320
Leu Ile Lys Val Ile Thr Ala Thr Pro Thr Leu Ser Ala Gly Val Asn
325 330 335
Leu Pro Ser Phe Arg Val Ile Ile Arg Asp Thr Lys Arg Tyr Ala Gly
340 345 350
Phe Gly Trp Thr Asp Ile Pro Val Leu Glu Ile Gln Gln Met Met Gly
355 360 365
Arg Ala Gly Arg Pro Arg Tyr Asp Lys Tyr Gly Glu Ala Ile Ile Val
370 375 380
Ala Arg Thr Asp Glu Pro Gly Lys Leu Met Glu Arg Tyr Ile Arg Gly
385 390 395 400
Lys Pro Glu Lys Leu Phe Ser Met Leu Ala Asn Glu Gln Ala Phe Arg
405 410 415
Ser Gln Val Leu Ala Leu Ile Thr Asn Phe Gly Ile Arg Ser Phe Pro
420 425 430
Glu Leu Val Arg Phe Leu Glu Arg Thr Phe Tyr Ala His Gln Arg Lys
435 440 445
Asp Leu Ser Ser Leu Glu Tyr Lys Ala Lys Glu Val Val Tyr Phe Leu
450 455 460
Ile Glu Asn Glu Phe Ile Asp Leu Asp Leu Glu Asp Arg Phe Ile Pro
465 470 475 480
Leu Pro Phe Gly Lys Arg Thr Ser Gln Leu Tyr Ile Asp Pro Leu Thr
485 490 495
Ala Lys Lys Phe Lys Asp Ala Phe Pro Ala Ile Glu Arg Asn Pro Asn
500 505 510
Pro Phe Gly Ile Phe Gln Leu Ile Ala Ser Thr Pro Asp Met Ala Thr
515 520 525
Leu Thr Ala Arg Arg Arg Glu Met Glu Asp Tyr Leu Asp Leu Ala Tyr
530 535 540
Glu Leu Glu Asp Lys Leu Tyr Ala Ser Ile Pro Tyr Tyr Glu Asp Ser
545 550 555 560
Arg Phe Gln Gly Phe Leu Gly Gln Val Lys Thr Ala Lys Val Leu Leu
565 570 575
Asp Trp Ile Asn Glu Val Pro Glu Ala Arg Ile Tyr Glu Thr Tyr Ser
580 585 590
Ile Asp Pro Gly Asp Leu Tyr Arg Leu Leu Glu Leu Ala Asp Trp Leu
595 600 605
Met Tyr Ser Leu Ile Glu Leu Tyr Lys Leu Phe Glu Pro Lys Glu Glu
610 615 620
Ile Leu Asn Tyr Leu Arg Asp Leu His Leu Arg Leu Arg His Gly Val
625 630 635 640
Arg Glu Glu Leu Leu Glu Leu Val Arg Leu Pro Asn Ile Gly Arg Lys
645 650 655
Arg Ala Arg Ala Leu Tyr Asn Ala Gly Phe Arg Ser Val Glu Ala Ile
660 665 670
Ala Asn Ala Lys Pro Ala Glu Leu Leu Ala Val Glu Gly Ile Gly Ala
675 680 685
Lys Ile Leu Asp Gly Ile Tyr Arg His Leu Gly Ile Glu Lys Arg Val
690 695 700
Thr Glu Glu Lys Pro Lys Arg Lys Gly Thr Leu Glu Asp Phe Leu Arg
705 710 715 720
<210> 21
<211> 799
<212> PRT
<213> Methanospirillum hungatei
<400> 21
Met Glu Ile Ala Ser Leu Pro Leu Pro Asp Ser Phe Ile Arg Ala Cys
1 5 10 15
His Ala Lys Gly Ile Arg Ser Leu Tyr Pro Pro Gln Ala Glu Cys Ile
20 25 30
Glu Lys Gly Leu Leu Glu Gly Lys Asn Leu Leu Ile Ser Ile Pro Thr
35 40 45
Ala Ser Gly Lys Thr Leu Leu Ala Glu Met Ala Met Trp Ser Arg Ile
50 55 60
Ala Ala Gly Gly Lys Cys Leu Tyr Ile Val Pro Leu Arg Ala Leu Ala
65 70 75 80
Ser Glu Lys Tyr Asp Glu Phe Ser Lys Lys Gly Val Ile Arg Val Gly
85 90 95
Ile Ala Thr Gly Asp Leu Asp Arg Thr Asp Ala Tyr Leu Gly Glu Asn
100 105 110
Asp Ile Ile Val Ala Thr Ser Glu Lys Thr Asp Ser Leu Leu Arg Asn
115 120 125
Arg Thr Pro Trp Leu Ser Gln Ile Thr Cys Ile Val Leu Asp Glu Val
130 135 140
His Leu Ile Gly Ser Glu Asn Arg Gly Ala Thr Leu Glu Met Val Ile
145 150 155 160
Thr Lys Leu Arg Tyr Thr Asn Pro Val Met Gln Ile Ile Gly Leu Ser
165 170 175
Ala Thr Ile Gly Asn Pro Ala Gln Leu Ala Glu Trp Leu Asp Ala Thr
180 185 190
Leu Ile Thr Ser Thr Trp Arg Pro Val Asp Leu Arg Gln Gly Val Tyr
195 200 205
Tyr Asn Gly Lys Ile Arg Phe Ser Asp Ser Glu Arg Pro Ile Gln Gly
210 215 220
Lys Thr Lys His Asp Asp Leu Asn Leu Cys Leu Asp Thr Ile Glu Glu
225 230 235 240
Gly Gly Gln Cys Leu Val Phe Val Ser Ser Arg Arg Asn Ala Glu Gly
245 250 255
Phe Ala Lys Lys Ala Ala Gly Ala Leu Lys Ala Gly Ser Pro Asp Ser
260 265 270
Lys Ala Leu Ala Gln Glu Leu Arg Arg Leu Arg Asp Arg Asp Glu Gly
275 280 285
Asn Val Leu Ala Asp Cys Val Glu Arg Gly Ala Ala Phe His His Ala
290 295 300
Gly Leu Ile Arg Gln Glu Arg Thr Ile Ile Glu Glu Gly Phe Arg Asn
305 310 315 320
Gly Tyr Ile Glu Val Ile Ala Ala Thr Pro Thr Leu Ala Ala Gly Leu
325 330 335
Asn Leu Pro Ala Arg Arg Val Ile Ile Arg Asp Tyr Asn Arg Phe Ala
340 345 350
Ser Gly Leu Gly Met Val Pro Ile Pro Val Gly Glu Tyr His Gln Met
355 360 365
Ala Gly Arg Ala Gly Arg Pro His Leu Asp Pro Tyr Gly Glu Ala Val
370 375 380
Leu Leu Ala Lys Asp Ala Pro Ser Val Glu Arg Leu Phe Glu Thr Phe
385 390 395 400
Ile Asp Ala Glu Ala Glu Arg Val Asp Ser Gln Cys Val Asp Asp Ala
405 410 415
Ser Leu Cys Ala His Ile Leu Ser Leu Ile Ala Thr Gly Phe Ala His
420 425 430
Asp Gln Glu Ala Leu Ser Ser Phe Met Glu Arg Thr Phe Tyr Phe Phe
435 440 445
Gln His Pro Lys Thr Arg Ser Leu Pro Arg Leu Val Ala Asp Ala Ile
450 455 460
Arg Phe Leu Thr Thr Ala Gly Met Val Glu Glu Arg Glu Asn Thr Leu
465 470 475 480
Ser Ala Thr Arg Leu Gly Ser Leu Val Ser Arg Leu Tyr Leu Asn Pro
485 490 495
Cys Thr Ala Arg Leu Ile Leu Asp Ser Leu Lys Ser Cys Lys Thr Pro
500 505 510
Thr Leu Ile Gly Leu Leu His Val Ile Cys Val Ser Pro Asp Met Gln
515 520 525
Arg Leu Tyr Leu Lys Ala Ala Asp Thr Gln Leu Leu Arg Thr Phe Leu
530 535 540
Phe Lys His Lys Asp Asp Leu Ile Leu Pro Leu Pro Phe Glu Gln Glu
545 550 555 560
Glu Glu Glu Leu Trp Leu Ser Gly Leu Lys Thr Ala Leu Val Leu Thr
565 570 575
Asp Trp Ala Asp Glu Phe Ser Glu Gly Met Ile Glu Glu Arg Tyr Gly
580 585 590
Ile Gly Ala Gly Asp Leu Tyr Asn Ile Val Asp Ser Gly Lys Trp Leu
595 600 605
Leu His Gly Thr Glu Arg Leu Val Ser Val Glu Met Pro Glu Met Ser
610 615 620
Gln Val Val Lys Thr Leu Ser Val Arg Val His His Gly Val Lys Ser
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Ala Gly Leu Ser Thr Ile Ala Arg Ile Ile Gly Glu Gly Ile Ala Arg
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<213> Escherichia coli
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<212> PRT
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<210> 25
<211> 970
<212> PRT
<213> Clostridium botulinum
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Phe Ala Ser Asp Asn Tyr Tyr Ala Ser Ala Asp Ala Asp Arg Ser Gly
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245 250 255
Ser Lys Glu Gly Ile Glu Asp Arg Ala Thr Leu Ser Lys Gln Trp Ser
260 265 270
Glu Ala Ala Gln Ser Ile Gly Leu Asp Leu Lys Pro Leu Val Asp Arg
275 280 285
Ala Arg Thr Lys Ala Leu Gly Gln Gly Met Glu Ala Thr Arg Ile Gly
290 295 300
Ser Leu Val Glu Arg Gly Arg Ala Trp Leu Ser Arg Phe Ala Ala His
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500 505 510
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515 520 525
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Leu Ala Asn Leu Ala Gly Val His Arg Leu Val Leu Ile Gly Asp Arg
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Lys Gln Leu Gly Ala Val Asp Ala Gly Lys Pro Phe Ala Leu Leu Gln
595 600 605
Arg Ala Gly Ile Ala Arg Ala Glu Met Ala Thr Asn Leu Arg Ala Arg
610 615 620
Asp Pro Val Val Arg Glu Ala Gln Ala Ala Ala Gln Ala Gly Asp Val
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Arg Lys Ala Leu Arg His Leu Lys Ser His Thr Val Glu Ala Arg Gly
645 650 655
Asp Gly Ala Gln Val Ala Ala Glu Thr Trp Leu Ala Leu Asp Lys Glu
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Thr Arg Ala Arg Thr Ser Ile Tyr Ala Ser Gly Arg Ala Ile Arg Ser
675 680 685
Ala Val Asn Ala Ala Val Gln Gln Gly Leu Leu Ala Ser Arg Glu Ile
690 695 700
Gly Pro Ala Lys Met Lys Leu Glu Val Leu Asp Arg Val Asn Thr Thr
705 710 715 720
Arg Glu Glu Leu Arg His Leu Pro Ala Tyr Arg Ala Gly Arg Val Leu
725 730 735
Glu Val Ser Arg Lys Gln Gln Ala Leu Gly Leu Phe Ile Gly Glu Tyr
740 745 750
Arg Val Ile Gly Gln Asp Arg Lys Gly Lys Leu Val Glu Val Glu Asp
755 760 765
Lys Arg Gly Lys Arg Phe Arg Phe Asp Pro Ala Arg Ile Arg Ala Gly
770 775 780
Lys Gly Asp Asp Asn Leu Thr Leu Leu Glu Pro Arg Lys Leu Glu Ile
785 790 795 800
His Glu Gly Asp Arg Ile Arg Trp Thr Arg Asn Asp His Arg Arg Gly
805 810 815
Leu Phe Asn Ala Asp Gln Ala Arg Val Val Glu Ile Ala Asn Gly Lys
820 825 830
Val Thr Phe Glu Thr Ser Lys Gly Asp Leu Val Glu Leu Lys Lys Asp
835 840 845
Asp Pro Met Leu Lys Arg Ile Asp Leu Ala Tyr Ala Leu Asn Val His
850 855 860
Met Ala Gln Gly Leu Thr Ser Asp Arg Gly Ile Ala Val Met Asp Ser
865 870 875 880
Arg Glu Arg Asn Leu Ser Asn Gln Lys Thr Phe Leu Val Thr Val Thr
885 890 895
Arg Leu Arg Asp His Leu Thr Leu Val Val Asp Ser Ala Asp Lys Leu
900 905 910
Gly Ala Ala Val Ala Arg Asn Lys Gly Glu Lys Ala Ser Ala Ile Glu
915 920 925
Val Thr Gly Ser Val Lys Pro Thr Ala Thr Lys Gly Ser Gly Val Asp
930 935 940
Gln Pro Lys Ser Val Glu Ala Asn Lys Ala Glu Lys Glu Leu Thr Arg
945 950 955 960
Ser Lys Ser Lys Thr Leu Asp Phe Gly Ile
965 970
<210> 26
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Example MuA substrate of the invention.
<400> 26
gttttcgcat ttatcgtgaa acgctttcgc gtttttcgtg cgccgcttca 50
<210> 27
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Example MuA substrate of the invention.
<400> 27
caaaagcgta aatagcactt tgcgaaagcg caaaaagcac gcggcgaagt 50
<210> 28
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Example MuA substrate of the invention.
<400> 28
caaaagcgta aatagcactt tgcgaaagcg caaaaagcac gcggcgaagt ctag 54
<210> 29
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence used in Example 1.
<400> 29
gcgttctgtt tcggatgtat gttttcatac atccgaaaca gaacgctttt gttttcgcat 60
ttatcgtgaa acgctttcgc gtttttcgtg cgccgcttca 100
<210> 30
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence used in Example 1.
<400> 30
gaagcggcgc acgaaaaacg cgaaagcgtt tcacgataat gcgaaaac 48
<210> 31
<211> 48502
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence used in Example 1.
<400> 31
gggcggcgac ctcgcgggtt ttcgctattt atgaaaattt tccggtttaa ggcgtttccg 60
ttcttcttcg tcataactta atgtttttat ttaaaatacc ctctgaaaag aaaggaaacg 120
acaggtgctg aaagcgaggc tttttggcct ctgtcgtttc ctttctctgt ttttgtccgt 180
ggaatgaaca atggaagtca acaaaaagca gctggctgac attttcggtg cgagtatccg 240
taccattcag aactggcagg aacagggaat gcccgttctg cgaggcggtg gcaagggtaa 300
tgaggtgctt tatgactctg ccgccgtcat aaaatggtat gccgaaaggg atgctgaaat 360
tgagaacgaa aagctgcgcc gggaggttga agaactgcgg caggccagcg aggcagatct 420
ccagccagga actattgagt acgaacgcca tcgacttacg cgtgcgcagg ccgacgcaca 480
ggaactgaag aatgccagag actccgctga agtggtggaa accgcattct gtactttcgt 540
gctgtcgcgg atcgcaggtg aaattgccag tattctcgac gggctccccc tgtcggtgca 600
gcggcgtttt ccggaactgg aaaaccgaca tgttgatttc ctgaaacggg atatcatcaa 660
agccatgaac aaagcagccg cgctggatga actgataccg gggttgctga gtgaatatat 720
cgaacagtca ggttaacagg ctgcggcatt ttgtccgcgc cgggcttcgc tcactgttca 780
ggccggagcc acagaccgcc gttgaatggg cggatgctaa ttactatctc ccgaaagaat 840
ccgcatacca ggaagggcgc tgggaaacac tgccctttca gcgggccatc atgaatgcga 900
tgggcagcga ctacatccgt gaggtgaatg tggtgaagtc tgcccgtgtc ggttattcca 960
aaatgctgct gggtgtttat gcctacttta tagagcataa gcagcgcaac acccttatct 1020
ggttgccgac ggatggtgat gccgagaact ttatgaaaac ccacgttgag ccgactattc 1080
gtgatattcc gtcgctgctg gcgctggccc cgtggtatgg caaaaagcac cgggataaca 1140
cgctcaccat gaagcgtttc actaatgggc gtggcttctg gtgcctgggc ggtaaagcgg 1200
caaaaaacta ccgtgaaaag tcggtggatg tggcgggtta tgatgaactt gctgcttttg 1260
atgatgatat tgaacaggaa ggctctccga cgttcctggg tgacaagcgt attgaaggct 1320
cggtctggcc aaagtccatc cgtggctcca cgccaaaagt gagaggcacc tgtcagattg 1380
agcgtgcagc cagtgaatcc ccgcatttta tgcgttttca tgttgcctgc ccgcattgcg 1440
gggaggagca gtatcttaaa tttggcgaca aagagacgcc gtttggcctc aaatggacgc 1500
cggatgaccc ctccagcgtg ttttatctct gcgagcataa tgcctgcgtc atccgccagc 1560
aggagctgga ctttactgat gcccgttata tctgcgaaaa gaccgggatc tggacccgtg 1620
atggcattct ctggttttcg tcatccggtg aagagattga gccacctgac agtgtgacct 1680
ttcacatctg gacagcgtac agcccgttca ccacctgggt gcagattgtc aaagactgga 1740
tgaaaacgaa aggggatacg ggaaaacgta aaaccttcgt aaacaccacg ctcggtgaga 1800
cgtgggaggc gaaaattggc gaacgtccgg atgctgaagt gatggcagag cggaaagagc 1860
attattcagc gcccgttcct gaccgtgtgg cttacctgac cgccggtatc gactcccagc 1920
tggaccgcta cgaaatgcgc gtatggggat gggggccggg tgaggaaagc tggctgattg 1980
accggcagat tattatgggc cgccacgacg atgaacagac gctgctgcgt gtggatgagg 2040
ccatcaataa aacctatacc cgccggaatg gtgcagaaat gtcgatatcc cgtatctgct 2100
gggatactgg cgggattgac ccgaccattg tgtatgaacg ctcgaaaaaa catgggctgt 2160
tccgggtgat ccccattaaa ggggcatccg tctacggaaa gccggtggcc agcatgccac 2220
gtaagcgaaa caaaaacggg gtttacctta ccgaaatcgg tacggatacc gcgaaagagc 2280
agatttataa ccgcttcaca ctgacgccgg aaggggatga accgcttccc ggtgccgttc 2340
acttcccgaa taacccggat atttttgatc tgaccgaagc gcagcagctg actgctgaag 2400
agcaggtcga aaaatgggtg gatggcagga aaaaaatact gtgggacagc aaaaagcgac 2460
gcaatgaggc actcgactgc ttcgtttatg cgctggcggc gctgcgcatc agtatttccc 2520
gctggcagct ggatctcagt gcgctgctgg cgagcctgca ggaagaggat ggtgcagcaa 2580
ccaacaagaa aacactggca gattacgccc gtgccttatc cggagaggat gaatgacgcg 2640
acaggaagaa cttgccgctg cccgtgcggc actgcatgac ctgatgacag gtaaacgggt 2700
ggcaacagta cagaaagacg gacgaagggt ggagtttacg gccacttccg tgtctgacct 2760
gaaaaaatat attgcagagc tggaagtgca gaccggcatg acacagcgac gcaggggacc 2820
tgcaggattt tatgtatgaa aacgcccacc attcccaccc ttctggggcc ggacggcatg 2880
acatcgctgc gcgaatatgc cggttatcac ggcggtggca gcggatttgg agggcagttg 2940
cggtcgtgga acccaccgag tgaaagtgtg gatgcagccc tgttgcccaa ctttacccgt 3000
ggcaatgccc gcgcagacga tctggtacgc aataacggct atgccgccaa cgccatccag 3060
ctgcatcagg atcatatcgt cgggtctttt ttccggctca gtcatcgccc aagctggcgc 3120
tatctgggca tcggggagga agaagcccgt gccttttccc gcgaggttga agcggcatgg 3180
aaagagtttg ccgaggatga ctgctgctgc attgacgttg agcgaaaacg cacgtttacc 3240
atgatgattc gggaaggtgt ggccatgcac gcctttaacg gtgaactgtt cgttcaggcc 3300
acctgggata ccagttcgtc gcggcttttc cggacacagt tccggatggt cagcccgaag 3360
cgcatcagca acccgaacaa taccggcgac agccggaact gccgtgccgg tgtgcagatt 3420
aatgacagcg gtgcggcgct gggatattac gtcagcgagg acgggtatcc tggctggatg 3480
ccgcagaaat ggacatggat accccgtgag ttacccggcg ggcgcgcctc gttcattcac 3540
gtttttgaac ccgtggagga cgggcagact cgcggtgcaa atgtgtttta cagcgtgatg 3600
gagcagatga agatgctcga cacgctgcag aacacgcagc tgcagagcgc cattgtgaag 3660
gcgatgtatg ccgccaccat tgagagtgag ctggatacgc agtcagcgat ggattttatt 3720
ctgggcgcga acagtcagga gcagcgggaa aggctgaccg gctggattgg tgaaattgcc 3780
gcgtattacg ccgcagcgcc ggtccggctg ggaggcgcaa aagtaccgca cctgatgccg 3840
ggtgactcac tgaacctgca gacggctcag gatacggata acggctactc cgtgtttgag 3900
cagtcactgc tgcggtatat cgctgccggg ctgggtgtct cgtatgagca gctttcccgg 3960
aattacgccc agatgagcta ctccacggca cgggccagtg cgaacgagtc gtgggcgtac 4020
tttatggggc ggcgaaaatt cgtcgcatcc cgtcaggcga gccagatgtt tctgtgctgg 4080
ctggaagagg ccatcgttcg ccgcgtggtg acgttacctt caaaagcgcg cttcagtttt 4140
caggaagccc gcagtgcctg ggggaactgc gactggatag gctccggtcg tatggccatc 4200
gatggtctga aagaagttca ggaagcggtg atgctgatag aagccggact gagtacctac 4260
gagaaagagt gcgcaaaacg cggtgacgac tatcaggaaa tttttgccca gcaggtccgt 4320
gaaacgatgg agcgccgtgc agccggtctt aaaccgcccg cctgggcggc tgcagcattt 4380
gaatccgggc tgcgacaatc aacagaggag gagaagagtg acagcagagc tgcgtaatct 4440
cccgcatatt gccagcatgg cctttaatga gccgctgatg cttgaacccg cctatgcgcg 4500
ggttttcttt tgtgcgcttg caggccagct tgggatcagc agcctgacgg atgcggtgtc 4560
cggcgacagc ctgactgccc aggaggcact cgcgacgctg gcattatccg gtgatgatga 4620
cggaccacga caggcccgca gttatcaggt catgaacggc atcgccgtgc tgccggtgtc 4680
cggcacgctg gtcagccgga cgcgggcgct gcagccgtac tcggggatga ccggttacaa 4740
cggcattatc gcccgtctgc aacaggctgc cagcgatccg atggtggacg gcattctgct 4800
cgatatggac acgcccggcg ggatggtggc gggggcattt gactgcgctg acatcatcgc 4860
ccgtgtgcgt gacataaaac cggtatgggc gcttgccaac gacatgaact gcagtgcagg 4920
tcagttgctt gccagtgccg cctcccggcg tctggtcacg cagaccgccc ggacaggctc 4980
catcggcgtc atgatggctc acagtaatta cggtgctgcg ctggagaaac agggtgtgga 5040
aatcacgctg atttacagcg gcagccataa ggtggatggc aacccctaca gccatcttcc 5100
ggatgacgtc cgggagacac tgcagtcccg gatggacgca acccgccaga tgtttgcgca 5160
gaaggtgtcg gcatataccg gcctgtccgt gcaggttgtg ctggataccg aggctgcagt 5220
gtacagcggt caggaggcca ttgatgccgg actggctgat gaacttgtta acagcaccga 5280
tgcgatcacc gtcatgcgtg atgcactgga tgcacgtaaa tcccgtctct caggagggcg 5340
aatgaccaaa gagactcaat caacaactgt ttcagccact gcttcgcagg ctgacgttac 5400
tgacgtggtg ccagcgacgg agggcgagaa cgccagcgcg gcgcagccgg acgtgaacgc 5460
gcagatcacc gcagcggttg cggcagaaaa cagccgcatt atggggatcc tcaactgtga 5520
ggaggctcac ggacgcgaag aacaggcacg cgtgctggca gaaacccccg gtatgaccgt 5580
gaaaacggcc cgccgcattc tggccgcagc accacagagt gcacaggcgc gcagtgacac 5640
tgcgctggat cgtctgatgc agggggcacc ggcaccgctg gctgcaggta acccggcatc 5700
tgatgccgtt aacgatttgc tgaacacacc agtgtaaggg atgtttatga cgagcaaaga 5760
aacctttacc cattaccagc cgcagggcaa cagtgacccg gctcataccg caaccgcgcc 5820
cggcggattg agtgcgaaag cgcctgcaat gaccccgctg atgctggaca cctccagccg 5880
taagctggtt gcgtgggatg gcaccaccga cggtgctgcc gttggcattc ttgcggttgc 5940
tgctgaccag accagcacca cgctgacgtt ctacaagtcc ggcacgttcc gttatgagga 6000
tgtgctctgg ccggaggctg ccagcgacga gacgaaaaaa cggaccgcgt ttgccggaac 6060
ggcaatcagc atcgtttaac tttacccttc atcactaaag gccgcctgtg cggctttttt 6120
tacgggattt ttttatgtcg atgtacacaa ccgcccaact gctggcggca aatgagcaga 6180
aatttaagtt tgatccgctg tttctgcgtc tctttttccg tgagagctat cccttcacca 6240
cggagaaagt ctatctctca caaattccgg gactggtaaa catggcgctg tacgtttcgc 6300
cgattgtttc cggtgaggtt atccgttccc gtggcggctc cacctctgaa tttacgccgg 6360
gatatgtcaa gccgaagcat gaagtgaatc cgcagatgac cctgcgtcgc ctgccggatg 6420
aagatccgca gaatctggcg gacccggctt accgccgccg tcgcatcatc atgcagaaca 6480
tgcgtgacga agagctggcc attgctcagg tcgaagagat gcaggcagtt tctgccgtgc 6540
ttaagggcaa atacaccatg accggtgaag ccttcgatcc ggttgaggtg gatatgggcc 6600
gcagtgagga gaataacatc acgcagtccg gcggcacgga gtggagcaag cgtgacaagt 6660
ccacgtatga cccgaccgac gatatcgaag cctacgcgct gaacgccagc ggtgtggtga 6720
atatcatcgt gttcgatccg aaaggctggg cgctgttccg ttccttcaaa gccgtcaagg 6780
agaagctgga tacccgtcgt ggctctaatt ccgagctgga gacagcggtg aaagacctgg 6840
gcaaagcggt gtcctataag gggatgtatg gcgatgtggc catcgtcgtg tattccggac 6900
agtacgtgga aaacggcgtc aaaaagaact tcctgccgga caacacgatg gtgctgggga 6960
acactcaggc acgcggtctg cgcacctatg gctgcattca ggatgcggac gcacagcgcg 7020
aaggcattaa cgcctctgcc cgttacccga aaaactgggt gaccaccggc gatccggcgc 7080
gtgagttcac catgattcag tcagcaccgc tgatgctgct ggctgaccct gatgagttcg 7140
tgtccgtaca actggcgtaa tcatggccct tcggggccat tgtttctctg tggaggagtc 7200
catgacgaaa gatgaactga ttgcccgtct ccgctcgctg ggtgaacaac tgaaccgtga 7260
tgtcagcctg acggggacga aagaagaact ggcgctccgt gtggcagagc tgaaagagga 7320
gcttgatgac acggatgaaa ctgccggtca ggacacccct ctcagccggg aaaatgtgct 7380
gaccggacat gaaaatgagg tgggatcagc gcagccggat accgtgattc tggatacgtc 7440
tgaactggtc acggtcgtgg cactggtgaa gctgcatact gatgcacttc acgccacgcg 7500
ggatgaacct gtggcatttg tgctgccggg aacggcgttt cgtgtctctg ccggtgtggc 7560
agccgaaatg acagagcgcg gcctggccag aatgcaataa cgggaggcgc tgtggctgat 7620
ttcgataacc tgttcgatgc tgccattgcc cgcgccgatg aaacgatacg cgggtacatg 7680
ggaacgtcag ccaccattac atccggtgag cagtcaggtg cggtgatacg tggtgttttt 7740
gatgaccctg aaaatatcag ctatgccgga cagggcgtgc gcgttgaagg ctccagcccg 7800
tccctgtttg tccggactga tgaggtgcgg cagctgcggc gtggagacac gctgaccatc 7860
ggtgaggaaa atttctgggt agatcgggtt tcgccggatg atggcggaag ttgtcatctc 7920
tggcttggac ggggcgtacc gcctgccgtt aaccgtcgcc gctgaaaggg ggatgtatgg 7980
ccataaaagg tcttgagcag gccgttgaaa acctcagccg tatcagcaaa acggcggtgc 8040
ctggtgccgc cgcaatggcc attaaccgcg ttgcttcatc cgcgatatcg cagtcggcgt 8100
cacaggttgc ccgtgagaca aaggtacgcc ggaaactggt aaaggaaagg gccaggctga 8160
aaagggccac ggtcaaaaat ccgcaggcca gaatcaaagt taaccggggg gatttgcccg 8220
taatcaagct gggtaatgcg cgggttgtcc tttcgcgccg caggcgtcgt aaaaaggggc 8280
agcgttcatc cctgaaaggt ggcggcagcg tgcttgtggt gggtaaccgt cgtattcccg 8340
gcgcgtttat tcagcaactg aaaaatggcc ggtggcatgt catgcagcgt gtggctggga 8400
aaaaccgtta ccccattgat gtggtgaaaa tcccgatggc ggtgccgctg accacggcgt 8460
ttaaacaaaa tattgagcgg atacggcgtg aacgtcttcc gaaagagctg ggctatgcgc 8520
tgcagcatca actgaggatg gtaataaagc gatgaaacat actgaactcc gtgcagccgt 8580
actggatgca ctggagaagc atgacaccgg ggcgacgttt tttgatggtc gccccgctgt 8640
ttttgatgag gcggattttc cggcagttgc cgtttatctc accggcgctg aatacacggg 8700
cgaagagctg gacagcgata cctggcaggc ggagctgcat atcgaagttt tcctgcctgc 8760
tcaggtgccg gattcagagc tggatgcgtg gatggagtcc cggatttatc cggtgatgag 8820
cgatatcccg gcactgtcag atttgatcac cagtatggtg gccagcggct atgactaccg 8880
gcgcgacgat gatgcgggct tgtggagttc agccgatctg acttatgtca ttacctatga 8940
aatgtgagga cgctatgcct gtaccaaatc ctacaatgcc ggtgaaaggt gccgggacca 9000
ccctgtgggt ttataagggg agcggtgacc cttacgcgaa tccgctttca gacgttgact 9060
ggtcgcgtct ggcaaaagtt aaagacctga cgcccggcga actgaccgct gagtcctatg 9120
acgacagcta tctcgatgat gaagatgcag actggactgc gaccgggcag gggcagaaat 9180
ctgccggaga taccagcttc acgctggcgt ggatgcccgg agagcagggg cagcaggcgc 9240
tgctggcgtg gtttaatgaa ggcgataccc gtgcctataa aatccgcttc ccgaacggca 9300
cggtcgatgt gttccgtggc tgggtcagca gtatcggtaa ggcggtgacg gcgaaggaag 9360
tgatcacccg cacggtgaaa gtcaccaatg tgggacgtcc gtcgatggca gaagatcgca 9420
gcacggtaac agcggcaacc ggcatgaccg tgacgcctgc cagcacctcg gtggtgaaag 9480
ggcagagcac cacgctgacc gtggccttcc agccggaggg cgtaaccgac aagagctttc 9540
gtgcggtgtc tgcggataaa acaaaagcca ccgtgtcggt cagtggtatg accatcaccg 9600
tgaacggcgt tgctgcaggc aaggtcaaca ttccggttgt atccggtaat ggtgagtttg 9660
ctgcggttgc agaaattacc gtcaccgcca gttaatccgg agagtcagcg atgttcctga 9720
aaaccgaatc atttgaacat aacggtgtga ccgtcacgct ttctgaactg tcagccctgc 9780
agcgcattga gcatctcgcc ctgatgaaac ggcaggcaga acaggcggag tcagacagca 9840
accggaagtt tactgtggaa gacgccatca gaaccggcgc gtttctggtg gcgatgtccc 9900
tgtggcataa ccatccgcag aagacgcaga tgccgtccat gaatgaagcc gttaaacaga 9960
ttgagcagga agtgcttacc acctggccca cggaggcaat ttctcatgct gaaaacgtgg 10020
tgtaccggct gtctggtatg tatgagtttg tggtgaataa tgcccctgaa cagacagagg 10080
acgccgggcc cgcagagcct gtttctgcgg gaaagtgttc gacggtgagc tgagttttgc 10140
cctgaaactg gcgcgtgaga tggggcgacc cgactggcgt gccatgcttg ccgggatgtc 10200
atccacggag tatgccgact ggcaccgctt ttacagtacc cattattttc atgatgttct 10260
gctggatatg cacttttccg ggctgacgta caccgtgctc agcctgtttt tcagcgatcc 10320
ggatatgcat ccgctggatt tcagtctgct gaaccggcgc gaggctgacg aagagcctga 10380
agatgatgtg ctgatgcaga aagcggcagg gcttgccgga ggtgtccgct ttggcccgga 10440
cgggaatgaa gttatccccg cttccccgga tgtggcggac atgacggagg atgacgtaat 10500
gctgatgaca gtatcagaag ggatcgcagg aggagtccgg tatggctgaa ccggtaggcg 10560
atctggtcgt tgatttgagt ctggatgcgg ccagatttga cgagcagatg gccagagtca 10620
ggcgtcattt ttctggtacg gaaagtgatg cgaaaaaaac agcggcagtc gttgaacagt 10680
cgctgagccg acaggcgctg gctgcacaga aagcggggat ttccgtcggg cagtataaag 10740
ccgccatgcg tatgctgcct gcacagttca ccgacgtggc cacgcagctt gcaggcgggc 10800
aaagtccgtg gctgatcctg ctgcaacagg gggggcaggt gaaggactcc ttcggcggga 10860
tgatccccat gttcaggggg cttgccggtg cgatcaccct gccgatggtg ggggccacct 10920
cgctggcggt ggcgaccggt gcgctggcgt atgcctggta tcagggcaac tcaaccctgt 10980
ccgatttcaa caaaacgctg gtcctttccg gcaatcaggc gggactgacg gcagatcgta 11040
tgctggtcct gtccagagcc gggcaggcgg cagggctgac gtttaaccag accagcgagt 11100
cactcagcgc actggttaag gcgggggtaa gcggtgaggc tcagattgcg tccatcagcc 11160
agagtgtggc gcgtttctcc tctgcatccg gcgtggaggt ggacaaggtc gctgaagcct 11220
tcgggaagct gaccacagac ccgacgtcgg ggctgacggc gatggctcgc cagttccata 11280
acgtgtcggc ggagcagatt gcgtatgttg ctcagttgca gcgttccggc gatgaagccg 11340
gggcattgca ggcggcgaac gaggccgcaa cgaaagggtt tgatgaccag acccgccgcc 11400
tgaaagagaa catgggcacg ctggagacct gggcagacag gactgcgcgg gcattcaaat 11460
ccatgtggga tgcggtgctg gatattggtc gtcctgatac cgcgcaggag atgctgatta 11520
aggcagaggc tgcgtataag aaagcagacg acatctggaa tctgcgcaag gatgattatt 11580
ttgttaacga tgaagcgcgg gcgcgttact gggatgatcg tgaaaaggcc cgtcttgcgc 11640
ttgaagccgc ccgaaagaag gctgagcagc agactcaaca ggacaaaaat gcgcagcagc 11700
agagcgatac cgaagcgtca cggctgaaat ataccgaaga ggcgcagaag gcttacgaac 11760
ggctgcagac gccgctggag aaatataccg cccgtcagga agaactgaac aaggcactga 11820
aagacgggaa aatcctgcag gcggattaca acacgctgat ggcggcggcg aaaaaggatt 11880
atgaagcgac gctgaaaaag ccgaaacagt ccagcgtgaa ggtgtctgcg ggcgatcgtc 11940
aggaagacag tgctcatgct gccctgctga cgcttcaggc agaactccgg acgctggaga 12000
agcatgccgg agcaaatgag aaaatcagcc agcagcgccg ggatttgtgg aaggcggaga 12060
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agcagcaacg ggcaaaacgg gccgccattg atgcgaaaag ccgggggctg actgaccggc 12300
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taaaaacacc tcacgagtta aaacacctaa gttctcaccg aatgtctcaa tatccggacg 25620
gataatattt attgcttctc ttgaccgtag gactttccac atgcaggatt ttggaacctc 25680
ttgcagtact actggggaat gagttgcaat tattgctaca ccattgcgtg catcgagtaa 25740
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atcgaataaa actaatgact tttcgccaac gacatctact aatcttgtga tagtaaataa 25860
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ggcagcaagt gggggacagc agaagacctg accgccgcag agtggatgtt tgacatggtg 39300
aagactatcg caccatcagc cagaaaaccg aattttgctg ggtgggctaa cgatatccgc 39360
ctgatgcgtg aacgtgacgg acgtaaccac cgcgacatgt gtgtgctgtt ccgctgggca 39420
tgccaggaca acttctggtc cggtaacgtg ctgagcccgg ccaaactccg cgataagtgg 39480
acccaactcg aaatcaaccg taacaagcaa caggcaggcg tgacagccag caaaccaaaa 39540
ctcgacctga caaacacaga ctggatttac ggggtggatc tatgaaaaac atcgccgcac 39600
agatggttaa ctttgaccgt gagcagatgc gtcggatcgc caacaacatg ccggaacagt 39660
acgacgaaaa gccgcaggta cagcaggtag cgcagatcat caacggtgtg ttcagccagt 39720
tactggcaac tttcccggcg agcctggcta accgtgacca gaacgaagtg aacgaaatcc 39780
gtcgccagtg ggttctggct tttcgggaaa acgggatcac cacgatggaa caggttaacg 39840
caggaatgcg cgtagcccgt cggcagaatc gaccatttct gccatcaccc gggcagtttg 39900
ttgcatggtg ccgggaagaa gcatccgtta ccgccggact gccaaacgtc agcgagctgg 39960
ttgatatggt ttacgagtat tgccggaagc gaggcctgta tccggatgcg gagtcttatc 40020
cgtggaaatc aaacgcgcac tactggctgg ttaccaacct gtatcagaac atgcgggcca 40080
atgcgcttac tgatgcggaa ttacgccgta aggccgcaga tgagcttgtc catatgactg 40140
cgagaattaa ccgtggtgag gcgatccctg aaccagtaaa acaacttcct gtcatgggcg 40200
gtagacctct aaatcgtgca caggctctgg cgaagatcgc agaaatcaaa gctaagttcg 40260
gactgaaagg agcaagtgta tgacgggcaa agaggcaatt attcattacc tggggacgca 40320
taatagcttc tgtgcgccgg acgttgccgc gctaacaggc gcaacagtaa ccagcataaa 40380
tcaggccgcg gctaaaatgg cacgggcagg tcttctggtt atcgaaggta aggtctggcg 40440
aacggtgtat taccggtttg ctaccaggga agaacgggaa ggaaagatga gcacgaacct 40500
ggtttttaag gagtgtcgcc agagtgccgc gatgaaacgg gtattggcgg tatatggagt 40560
taaaagatga ccatctacat tactgagcta ataacaggcc tgctggtaat cgcaggcctt 40620
tttatttggg ggagagggaa gtcatgaaaa aactaacctt tgaaattcga tctccagcac 40680
atcagcaaaa cgctattcac gcagtacagc aaatccttcc agacccaacc aaaccaatcg 40740
tagtaaccat tcaggaacgc aaccgcagct tagaccaaaa caggaagcta tgggcctgct 40800
taggtgacgt ctctcgtcag gttgaatggc atggtcgctg gctggatgca gaaagctgga 40860
agtgtgtgtt taccgcagca ttaaagcagc aggatgttgt tcctaacctt gccgggaatg 40920
gctttgtggt aataggccag tcaaccagca ggatgcgtgt aggcgaattt gcggagctat 40980
tagagcttat acaggcattc ggtacagagc gtggcgttaa gtggtcagac gaagcgagac 41040
tggctctgga gtggaaagcg agatggggag acagggctgc atgataaatg tcgttagttt 41100
ctccggtggc aggacgtcag catatttgct ctggctaatg gagcaaaagc gacgggcagg 41160
taaagacgtg cattacgttt tcatggatac aggttgtgaa catccaatga catatcggtt 41220
tgtcagggaa gttgtgaagt tctgggatat accgctcacc gtattgcagg ttgatatcaa 41280
cccggagctt ggacagccaa atggttatac ggtatgggaa ccaaaggata ttcagacgcg 41340
aatgcctgtt ctgaagccat ttatcgatat ggtaaagaaa tatggcactc catacgtcgg 41400
cggcgcgttc tgcactgaca gattaaaact cgttcccttc accaaatact gtgatgacca 41460
tttcgggcga gggaattaca ccacgtggat tggcatcaga gctgatgaac cgaagcggct 41520
aaagccaaag cctggaatca gatatcttgc tgaactgtca gactttgaga aggaagatat 41580
cctcgcatgg tggaagcaac aaccattcga tttgcaaata ccggaacatc tcggtaactg 41640
catattctgc attaaaaaat caacgcaaaa aatcggactt gcctgcaaag atgaggaggg 41700
attgcagcgt gtttttaatg aggtcatcac gggatcccat gtgcgtgacg gacatcggga 41760
aacgccaaag gagattatgt accgaggaag aatgtcgctg gacggtatcg cgaaaatgta 41820
ttcagaaaat gattatcaag ccctgtatca ggacatggta cgagctaaaa gattcgatac 41880
cggctcttgt tctgagtcat gcgaaatatt tggagggcag cttgatttcg acttcgggag 41940
ggaagctgca tgatgcgatg ttatcggtgc ggtgaatgca aagaagataa ccgcttccga 42000
ccaaatcaac cttactggaa tcgatggtgt ctccggtgtg aaagaacacc aacaggggtg 42060
ttaccactac cgcaggaaaa ggaggacgtg tggcgagaca gcgacgaagt atcaccgaca 42120
taatctgcga aaactgcaaa taccttccaa cgaaacgcac cagaaataaa cccaagccaa 42180
tcccaaaaga atctgacgta aaaaccttca actacacggc tcacctgtgg gatatccggt 42240
ggctaagacg tcgtgcgagg aaaacaaggt gattgaccaa aatcgaagtt acgaacaaga 42300
aagcgtcgag cgagctttaa cgtgcgctaa ctgcggtcag aagctgcatg tgctggaagt 42360
tcacgtgtgt gagcactgct gcgcagaact gatgagcgat ccgaatagct cgatgcacga 42420
ggaagaagat gatggctaaa ccagcgcgaa gacgatgtaa aaacgatgaa tgccgggaat 42480
ggtttcaccc tgcattcgct aatcagtggt ggtgctctcc agagtgtgga accaagatag 42540
cactcgaacg acgaagtaaa gaacgcgaaa aagcggaaaa agcagcagag aagaaacgac 42600
gacgagagga gcagaaacag aaagataaac ttaagattcg aaaactcgcc ttaaagcccc 42660
gcagttactg gattaaacaa gcccaacaag ccgtaaacgc cttcatcaga gaaagagacc 42720
gcgacttacc atgtatctcg tgcggaacgc tcacgtctgc tcagtgggat gccggacatt 42780
accggacaac tgctgcggca cctcaactcc gatttaatga acgcaatatt cacaagcaat 42840
gcgtggtgtg caaccagcac aaaagcggaa atctcgttcc gtatcgcgtc gaactgatta 42900
gccgcatcgg gcaggaagca gtagacgaaa tcgaatcaaa ccataaccgc catcgctgga 42960
ctatcgaaga gtgcaaggcg atcaaggcag agtaccaaca gaaactcaaa gacctgcgaa 43020
atagcagaag tgaggccgca tgacgttctc agtaaaaacc attccagaca tgctcgttga 43080
aacatacgga aatcagacag aagtagcacg cagactgaaa tgtagtcgcg gtacggtcag 43140
aaaatacgtt gatgataaag acgggaaaat gcacgccatc gtcaacgacg ttctcatggt 43200
tcatcgcgga tggagtgaaa gagatgcgct attacgaaaa aattgatggc agcaaatacc 43260
gaaatatttg ggtagttggc gatctgcacg gatgctacac gaacctgatg aacaaactgg 43320
atacgattgg attcgacaac aaaaaagacc tgcttatctc ggtgggcgat ttggttgatc 43380
gtggtgcaga gaacgttgaa tgcctggaat taatcacatt cccctggttc agagctgtac 43440
gtggaaacca tgagcaaatg atgattgatg gcttatcaga gcgtggaaac gttaatcact 43500
ggctgcttaa tggcggtggc tggttcttta atctcgatta cgacaaagaa attctggcta 43560
aagctcttgc ccataaagca gatgaacttc cgttaatcat cgaactggtg agcaaagata 43620
aaaaatatgt tatctgccac gccgattatc cctttgacga atacgagttt ggaaagccag 43680
ttgatcatca gcaggtaatc tggaaccgcg aacgaatcag caactcacaa aacgggatcg 43740
tgaaagaaat caaaggcgcg gacacgttca tctttggtca tacgccagca gtgaaaccac 43800
tcaagtttgc caaccaaatg tatatcgata ccggcgcagt gttctgcgga aacctaacat 43860
tgattcaggt acagggagaa ggcgcatgag actcgaaagc gtagctaaat ttcattcgcc 43920
aaaaagcccg atgatgagcg actcaccacg ggccacggct tctgactctc tttccggtac 43980
tgatgtgatg gctgctatgg ggatggcgca atcacaagcc ggattcggta tggctgcatt 44040
ctgcggtaag cacgaactca gccagaacga caaacaaaag gctatcaact atctgatgca 44100
atttgcacac aaggtatcgg ggaaataccg tggtgtggca aagcttgaag gaaatactaa 44160
ggcaaaggta ctgcaagtgc tcgcaacatt cgcttatgcg gattattgcc gtagtgccgc 44220
gacgccgggg gcaagatgca gagattgcca tggtacaggc cgtgcggttg atattgccaa 44280
aacagagctg tgggggagag ttgtcgagaa agagtgcgga agatgcaaag gcgtcggcta 44340
ttcaaggatg ccagcaagcg cagcatatcg cgctgtgacg atgctaatcc caaaccttac 44400
ccaacccacc tggtcacgca ctgttaagcc gctgtatgac gctctggtgg tgcaatgcca 44460
caaagaagag tcaatcgcag acaacatttt gaatgcggtc acacgttagc agcatgattg 44520
ccacggatgg caacatatta acggcatgat attgacttat tgaataaaat tgggtaaatt 44580
tgactcaacg atgggttaat tcgctcgttg tggtagtgag atgaaaagag gcggcgctta 44640
ctaccgattc cgcctagttg gtcacttcga cgtatcgtct ggaactccaa ccatcgcagg 44700
cagagaggtc tgcaaaatgc aatcccgaaa cagttcgcag gtaatagtta gagcctgcat 44760
aacggtttcg ggatttttta tatctgcaca acaggtaaga gcattgagtc gataatcgtg 44820
aagagtcggc gagcctggtt agccagtgct ctttccgttg tgctgaatta agcgaatacc 44880
ggaagcagaa ccggatcacc aaatgcgtac aggcgtcatc gccgcccagc aacagcacaa 44940
cccaaactga gccgtagcca ctgtctgtcc tgaattcatt agtaatagtt acgctgcggc 45000
cttttacaca tgaccttcgt gaaagcgggt ggcaggaggt cgcgctaaca acctcctgcc 45060
gttttgcccg tgcatatcgg tcacgaacaa atctgattac taaacacagt agcctggatt 45120
tgttctatca gtaatcgacc ttattcctaa ttaaatagag caaatcccct tattgggggt 45180
aagacatgaa gatgccagaa aaacatgacc tgttggccgc cattctcgcg gcaaaggaac 45240
aaggcatcgg ggcaatcctt gcgtttgcaa tggcgtacct tcgcggcaga tataatggcg 45300
gtgcgtttac aaaaacagta atcgacgcaa cgatgtgcgc cattatcgcc tagttcattc 45360
gtgaccttct cgacttcgcc ggactaagta gcaatctcgc ttatataacg agcgtgttta 45420
tcggctacat cggtactgac tcgattggtt cgcttatcaa acgcttcgct gctaaaaaag 45480
ccggagtaga agatggtaga aatcaataat caacgtaagg cgttcctcga tatgctggcg 45540
tggtcggagg gaactgataa cggacgtcag aaaaccagaa atcatggtta tgacgtcatt 45600
gtaggcggag agctatttac tgattactcc gatcaccctc gcaaacttgt cacgctaaac 45660
ccaaaactca aatcaacagg cgccggacgc taccagcttc tttcccgttg gtgggatgcc 45720
taccgcaagc agcttggcct gaaagacttc tctccgaaaa gtcaggacgc tgtggcattg 45780
cagcagatta aggagcgtgg cgctttacct atgattgatc gtggtgatat ccgtcaggca 45840
atcgaccgtt gcagcaatat ctgggcttca ctgccgggcg ctggttatgg tcagttcgag 45900
cataaggctg acagcctgat tgcaaaattc aaagaagcgg gcggaacggt cagagagatt 45960
gatgtatgag cagagtcacc gcgattatct ccgctctggt tatctgcatc atcgtctgcc 46020
tgtcatgggc tgttaatcat taccgtgata acgccattac ctacaaagcc cagcgcgaca 46080
aaaatgccag agaactgaag ctggcgaacg cggcaattac tgacatgcag atgcgtcagc 46140
gtgatgttgc tgcgctcgat gcaaaataca cgaaggagtt agctgatgct aaagctgaaa 46200
atgatgctct gcgtgatgat gttgccgctg gtcgtcgtcg gttgcacatc aaagcagtct 46260
gtcagtcagt gcgtgaagcc accaccgcct ccggcgtgga taatgcagcc tccccccgac 46320
tggcagacac cgctgaacgg gattatttca ccctcagaga gaggctgatc actatgcaaa 46380
aacaactgga aggaacccag aagtatatta atgagcagtg cagatagagt tgcccatatc 46440
gatgggcaac tcatgcaatt attgtgagca atacacacgc gcttccagcg gagtataaat 46500
gcctaaagta ataaaaccga gcaatccatt tacgaatgtt tgctgggttt ctgttttaac 46560
aacattttct gcgccgccac aaattttggc tgcatcgaca gttttcttct gcccaattcc 46620
agaaacgaag aaatgatggg tgatggtttc ctttggtgct actgctgccg gtttgttttg 46680
aacagtaaac gtctgttgag cacatcctgt aataagcagg gccagcgcag tagcgagtag 46740
catttttttc atggtgttat tcccgatgct ttttgaagtt cgcagaatcg tatgtgtaga 46800
aaattaaaca aaccctaaac aatgagttga aatttcatat tgttaatatt tattaatgta 46860
tgtcaggtgc gatgaatcgt cattgtattc ccggattaac tatgtccaca gccctgacgg 46920
ggaacttctc tgcgggagtg tccgggaata attaaaacga tgcacacagg gtttagcgcg 46980
tacacgtatt gcattatgcc aacgccccgg tgctgacacg gaagaaaccg gacgttatga 47040
tttagcgtgg aaagatttgt gtagtgttct gaatgctctc agtaaatagt aatgaattat 47100
caaaggtata gtaatatctt ttatgttcat ggatatttgt aacccatcgg aaaactcctg 47160
ctttagcaag attttccctg tattgctgaa atgtgatttc tcttgatttc aacctatcat 47220
aggacgtttc tataagatgc gtgtttcttg agaatttaac atttacaacc tttttaagtc 47280
cttttattaa cacggtgtta tcgttttcta acacgatgtg aatattatct gtggctagat 47340
agtaaatata atgtgagacg ttgtgacgtt ttagttcaga ataaaacaat tcacagtcta 47400
aatcttttcg cacttgatcg aatatttctt taaaaatggc aacctgagcc attggtaaaa 47460
ccttccatgt gatacgaggg cgcgtagttt gcattatcgt ttttatcgtt tcaatctggt 47520
ctgacctcct tgtgttttgt tgatgattta tgtcaaatat taggaatgtt ttcacttaat 47580
agtattggtt gcgtaacaaa gtgcggtcct gctggcattc tggagggaaa tacaaccgac 47640
agatgtatgt aaggccaacg tgctcaaatc ttcatacaga aagatttgaa gtaatatttt 47700
aaccgctaga tgaagagcaa gcgcatggag cgacaaaatg aataaagaac aatctgctga 47760
tgatccctcc gtggatctga ttcgtgtaaa aaatatgctt aatagcacca tttctatgag 47820
ttaccctgat gttgtaattg catgtataga acataaggtg tctctggaag cattcagagc 47880
aattgaggca gcgttggtga agcacgataa taatatgaag gattattccc tggtggttga 47940
ctgatcacca taactgctaa tcattcaaac tatttagtct gtgacagagc caacacgcag 48000
tctgtcactg tcaggaaagt ggtaaaactg caactcaatt actgcaatgc cctcgtaatt 48060
aagtgaattt acaatatcgt cctgttcgga gggaagaacg cgggatgttc attcttcatc 48120
acttttaatt gatgtatatg ctctcttttc tgacgttagt ctccgacggc aggcttcaat 48180
gacccaggct gagaaattcc cggacccttt ttgctcaaga gcgatgttaa tttgttcaat 48240
catttggtta ggaaagcgga tgttgcgggt tgttgttctg cgggttctgt tcttcgttga 48300
catgaggttg ccccgtattc agtgtcgctg atttgtattg tctgaagttg tttttacgtt 48360
aagttgatgc agatcaatta atacgatacc tgcgtcataa ttgattattt gacgtggttt 48420
gatggcctcc acgcacgttg tgatatgtag atgataatca ttatcacttt acgggtcctt 48480
tccggtgatc cgacaggtta cg 48502
<210> 32
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence used in Example 1.
<400> 32
tttttttttt tt 12
<210> 33
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence used in Example 1.
<400> 33
ggttgtttct gttggtgctg atattgcggc gtctgcttgg gtgtttaacc t 51
<210> 34
<211> 68
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence used in Example 1.
<400> 34
ggttaaacac ccaagcagac gccgcaatat cagcaccaac agaaacaacc tttgaggcga 60
gcggtcaa 68
<210> 35
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence used in Example 1.
<400> 35
ttgaccgctc gcctc 15
<210> 36
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence used in Example 2.
<400> 36
gatctgaagc ggcgcacgaa aaacgcgaaa gcgtttcacg ataatgcgaa aac 53
<210> 37
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence used in Example 2.
<400> 37
ttttgttttc gcatttatcg tgaaacgctt tcgcgttttt cgtgcgccgc ttca 54
Claims (22)
- (a) 주형 폴리뉴클레오티드를, 각각 (i) 적어도 하나의 오버행 및 (ii) 적어도 하나의 오버행을 포함하는 가닥으로부터 반대 가닥에 적어도 하나의 헤어핀 루프를 포함하는 이중 가닥 MuA 기질의 집단 및 MuA 트랜스포사제와 접촉시켜, 트랜스포사제가 주형 폴리뉴클레오티드를 단편화하고 기질을 이중 가닥 단편의 한 말단 또는 양 말단에 라이게이션함으로써, 복수 개의 단편/기질 구축물이 생성되도록 하는 단계;
(b) 상기 단편/기질 구축물을 폴리머라제와 접촉시켜, 폴리머라제가 오버행을 포함하는 가닥을 옮겨놓고 이들을, 헤어핀 루프를 포함하는 가닥을 보완하는 가닥으로 대체시킴으로써, 각각 주형 폴리뉴클레오티드의 이중 가닥 단편을 포함하는 복수 개의 이중 가닥 구축물을 생성시키도록 하는 단계; 및
(c) 이중 가닥 구축물의 두 가닥을 분리시키고 가닥을 주형으로 사용하여, 각각 적어도 하나의 헤어핀 루프에 의해 연결된 두 상보적 가닥을 포함하는 복수 개의 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 형성시키는 단계
를 포함하는, 주형 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 방법. - 제1항에 있어서, 단계 (c)가, pH, 온도 및 이온 강도 중 하나 이상을 증가시킴으로써 이중 가닥 구축물의 두 가닥을 분리시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (c)가 상기 분리된 가닥을 폴리머라제와 접촉시켜, 폴리머라제가 상기 가닥을 주형으로서 사용하여 복수 개의 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 형성하도록 하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (c)가 (i) 복수 개의 분리된 가닥을, 뉴클레오티드 올리고머가 가닥과 혼성화할 수 있는 조건하에 상기 가닥 내의 모든 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드의 모든 가능한 조합을 포함하는 뉴클레오티드 올리고머의 집단과 접촉시키는 단계; 및 (ii) 상기 가닥과 혼성화하는 올리고머를 함께 라이게이션하여 복수 개의 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 형성시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 (c)가 복수 개의 이중 가닥 구축물을 폴리머라제와 접촉시켜, 폴리머라제가 이중 가닥 구축물의 두 가닥을 동시에 분리시키고 이들 가닥을 주형으로서 사용하여 복수 개의 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 형성시키도록 하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 헤어핀 루프가 각 기질의 두 가닥을 연결시키지 않는 것인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 오버행이, 그 길이가 4, 5 또는 6개의 뉴클레오티드인 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 각 기질이 선택 가능한 결합성 모이어티를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 각 기질이, 막횡단 세공을 통하여 우선적으로 삽입될 수 있는 리더 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, (d) 복수 개의 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에, 헤어핀 루프와는 반대 말단에서 Y 어댑터를 부착시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 Y 어댑터는 임의로, 막횡단 세공을 통하여 우선적으로 삽입될 수 있는 리더 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 결합성 단백질을 복수 개의 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드와 결합시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따르는 방법을 이용하여 생성된 복수 개의 변형된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드.
- 주형 폴리뉴클레오티드를 변형시키기 위한, 제1항, 제6항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 MuA 기질의 집단.
- a) 변형된 폴리뉴클레오티드를 막횡단 세공과 접촉시켜, 폴리뉴클레오티드의 적어도 하나의 가닥이 상기 세공을 통하여 이동하도록 하는 단계; 및
b) 적어도 하나의 가닥이 세공에 대하여 이동함에 따라, 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 특징을 나타내는 하나 이상의 측정치를 취함으로써, 변형된 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명하는 단계
를 포함하는, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따르는 방법을 이용하여 변형된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명하는 방법. - a) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따르는 방법을 이용하여 주형 폴리뉴클레오티드를 변형시켜 복수 개의 변형된 폴리뉴클레오티드를 생성시키는 단계;
b) 각각의 변형된 폴리뉴클레오티드를 막횡단 세공과 접촉시켜, 각 폴리뉴클레오티드의 적어도 하나의 가닥이 세공을 통하여 이동하도록 하는 단계; 및
c) 각 폴리뉴클레오티드가 세공에 대하여 이동함에 따라, 각 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 특징을 나타내는 하나 이상의 측정치를 취함으로써, 주형 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명하는 단계
를 포함하는, 주형 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명하는 방법. - 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기/각 변형된 폴리뉴클레오티드의 양 가닥이 세공을 통하여 이동하는 것인 방법.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 특징이 (i) 폴리뉴클레오티드의 길이, (ii) 폴리뉴클레오티드의 실체, (iii) 폴리뉴클레오티드의 서열, (iv) 폴리뉴클레오티드의 2차 구조 및 (v) 폴리뉴클레오티드가 변형되는 지의 여부로부터 선택되는 것인 방법.
- 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉 단계 (a) 또는 접촉 단계 (b)가, 상기/각 변형된 폴리뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드 결합성 단백질과 접촉시켜, 단백질이 세공을 통한 상기/각 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어하도록 하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제18항에 있어서,
(i) 상기/각 변형된 폴리뉴클레오티드를 막횡단 세공 및 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 결합성 단백질과 접촉시켜, 상기/각 폴리뉴클레오티드의 적어도 하나의 가닥이 세공을 통하여 이동하고 하나 이상의 단백질이 세공을 통한 상기/각 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어하도록 하는 단계; 및
(ii) 상기/각 폴리뉴클레오티드가 세공에 대하여 이동함에 따라 세공을 관통하는, 상기/각 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 특징을 나타내는 전류를 측정함으로써, 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명하는 단계
를 포함하는 방법. - 제19항에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 결합성 단백질이 막횡단 세공과 접촉되기 전에, 상기/각 변형된 폴리뉴클레오티드와 결합되는 것인 방법.
- 제19항 또는 제20항에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 결합성 단백질이 헬리카제로부터 유래되는 것인 방법.
- (a) 제1항, 제6항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 MuA 기질의 집단, (b) MuA 트랜스포사제 및 (c) 폴리머라제를 포함하는, 주형 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 변형시키기 위한 키트.
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