KR20170061693A - 적은 아크릴산을 갖는 아미드 화합물의 제조를 위한 수단 및 방법 - Google Patents
적은 아크릴산을 갖는 아미드 화합물의 제조를 위한 수단 및 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 생체 촉매로서 니트릴 히드라타아제 (NH아제) 및 아미다아제 생성 미생물을 사용하여 부산물로서 적은 아크릴산을 갖는 니트릴 화합물로부터 아미드 화합물을 생성하는 수단 및 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명의 방법에 의해 수득된 수성 아미드 화합물, 및 아크릴아미드 또는 폴리아크릴아미드를 포함하는 조성물 및 상기 니트릴 화합물을 아미드 화합물로 전환하기 위해 니트릴 화합물과 접촉될 때 적어도 400 의 NH아제/아미다아제 활성 비율을 나타내는 건조 미생물이 제공된다.
Description
본 발명은 생체 촉매 (biocatalyst) 로서 니트릴 히드라타아제 (NH아제) 및 아미다아제 생성 미생물 (이 미생물은 상기 니트릴 화합물과 접촉되기 전에 건조 단계에 의해 예비-처리됨) 을 사용하여 니트릴 화합물로부터 아미드 화합물을 생성하는 방법, 및 니트릴 화합물로부터 아미드 화합물을 생성하기 위한 상기 미생물의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 니트릴 히드라타아제 및 아미다아제 생성 미생물에 의해 니트릴 화합물로부터 아미드 화합물을 제조할 때 아크릴산 부산물의 형성을 감소시키는 방법, 및 상기 미생물의 아미다아제 활성을 감소시키거나 NH아제/아미다아제를 증가시키기 위한 건조법의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 수득된 수성 아미드 화합물, 및 아크릴아미드 또는 폴리아크릴아미드를 포함하는 조성물, 및 니트릴 화합물을 아미드 화합물로 전환하기 위해 니트릴 화합물과 접촉될 때 400 이상의 NH아제/아미다아제 활성 비율을 나타내는 건조 미생물이 제공된다.
아크릴아미드는 아크릴아미드의 중합체 및 공중합체를 형성하기 위한 단량체로서 사용된다. 이러한 중합 및 공중합 반응을 위해, 생물전환 (bioconversion) 에 의해 제조된 아크릴아미드 수용액이 사용될 수 있다. 그러나, 아크릴아미드 용액 내의 높은 아크릴산 함량이 생성된 아크릴아미드 중합체 및 공중합체의 감소된 성능을 야기한다는 것이 밝혀졌다. 더욱 구체적으로는, 아크릴산의 존재는 아크릴아미드 중합체 및 공중합체 물질의 물리적 특성을 상당히 손상시킬 수 있고, 이는 다양한 적용, 예컨대 수처리, 제지, 오일 회수 또는 채굴에서 감소된 용해도 및 성능을 야기한다.
니트릴 히드라타아제 (NH아제), 니트릴을 아미드로 가수분해시키는 미생물 효소의 발견 이래로, NH아제 활성을 갖는 미생물은 아미드 화합물의 산업적 제조에 집중적으로 사용되고 있다. 아미드의 화학적 합성에 비해 온건한 반응 조건으로 인해, 생체 촉매로서 NH아제 생성 미생물의 사용이 점점 더 증가하고 있다.
실제로, NH아제 생성 미생물에 의한 니트릴 생물전환의 가장 익히 공지된 상업적 예 중 하나는 아크릴로니트릴로부터의 아크릴아미드의 생산이다.
그러나, 생체 촉매로서 NH아제 생성 미생물의 사용에 있어 도전 과제는 효소 아미다아제에 의해 매개된 부반응의 발생이다. NH아제는 니트릴 화합물을 상응하는 아미드 화합물로 가수분해시키는 한편, 아미다아제는 또한 아미드 화합물을 상응하는 카르복시산, 특히 아크릴산으로 전환한다.
본 발명 하의 기술적 과제는, 생체 촉매로서 NH아제 및 아미다아제 생성 미생물을 사용하는 니트릴 화합물로부터의 아미드 화합물 제조에서 부산물로서의 아크릴산 형성으로 인해 발생하는 문제를 해결하는 것이다.
상기 기술적 과제는 청구항에 반영되고, 상세한 설명에 기재되고, 이하 실시예 및 도면에 예시된 구현예를 제공하여 해결된다.
놀랍게도 본 발명자들은, 니트릴 히드라타아제 (NH아제) 및 아미다아제를 생성하고 생물전환을 위한 생체 촉매로서 역할을 하는 미생물이 니트릴 화합물과 접촉되기 전에 건조 단계에 의해 예비-처리될 때, 니트릴 화합물의 아미드 화합물로의 생물전환에서의 부산물로서의 카르복시산 생성, 특히 아크릴산 생성이 훨씬 감소된다는 것을 밝혀냈다. 이론에 얽매이지 않으면서, 상기 미생물이 적용되는 건조 단계로 인해, 아미다아제 활성이 감소될 수 있어, NH아제의 활성에 의해 생성되는 아미드로부터의 아크릴산 생성이 감소된다는 것이 밝혀졌다. 다른 말로, 상기 건조 미생물은 NH아제 활성을 더 선호하는 NH아제 활성과 아미다아제 활성 사이의 비율을 갖는 것으로 보이는데, 즉 아미다아제 활성에 대한 NH아제 활성의 비율은 >1.0, 예컨대 적어도 >10, >50, >100, >200, >300 또는 >400 이다.
실제로, 첨부된 실시예에서 입증된 바와 같이, 이후 상기 미생물에 의한 생물전환에 적용되는 니트릴 화합물과 접촉되기 전에 건조 단계에 의해 예비-처리된 미생물은 NH아제/아미다아제 활성과 관련하여 최고값을 갖는다는 것이 명백하다. 설정 (setting up) 이 거의 동량의 생체 촉매 ("설정에서 NHase 활성" 으로 반영됨) 를 함유한다는 사실을 감안하여, 건조 단계, 즉 생체 촉매를 니트릴 화합물과 접촉시키기 전에 이를 건조 단계에 적용하는 것은 부산물 아크릴산의 양에 영향을 상당히 준다는 것이 명백하다. 이는 건조 단계로 인해, 아미다아제 활성은 상기 건조 미생물이 부산물로서 적은 아크릴산을 갖는 아미드 화합물을 생성할 정도로 감소된다는 것 (이는 가장 우측 컬럼으로부터 명백함) 을 의미한다. 요컨대, 반응 매개변수는 상이한 설정 사이에 동일하게 유지되므로, 아크릴산의 양 감소의 개선이 건조 단계의 결과로 간주될 수 있음이 명백하다.
따라서, 본 발명은 니트릴 화합물과 니트릴 히드라타아제 (NH아제) 및 아미다아제 생성 미생물을 접촉시키는 것을 포함하는, 니트릴 화합물로부터 아미드 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이고, 여기서 상기 미생물은 상기 니트릴 화합물과 접촉되기 전에 건조 단계에 의해 예비-처리된다.
본 발명은 또한 (a) NH아제 및 아미다아제 생성 미생물을 건조시키는 단계; 및 (b) 니트릴 화합물과 상기 미생물을 접촉시키는 단계를 포함하는, 니트릴 화합물로부터 아미드 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 놀라운 발견에 따라, 본원에서 아크릴로니트릴과 NH아제 및 아미다아제 생성 미생물 (상기 미생물은 본원에 정의된 바와 같은 것임) 을 접촉시키는 것을 포함하는, 니트릴 화합물로부터 아미드 화합물을 제조할 때 아크릴산의 형성을 감소시키는 방법이 제공된다.
또한 제공되는 것은 NH아제 및 아미다아제 생성 미생물을 건조시키는 것을 포함하는, 증가된 NH아제/아미다아제 활성 비율을 갖는 미생물의 제조 방법이다.
마찬가지로, NH아제 및 아미다아제 생성 미생물을 건조시키는 것을 포함하는, 감소된 아미다아제 활성을 갖는 미생물의 제조 방법이 본원에 기재되어 있다.
또한, 본 발명은 니트릴 화합물로부터 아미드 혼합물을 제조하기 위한 본원에 정의된 NH아제 및 아미다아제 생성 미생물의 용도를 제공한다.
유사하게, 본 발명은 NH아제 및 아미다아제 생성 미생물의 NH아제/아미다아제 활성 비율을 증가시키기 위한 건조법의 용도를 제공하거나, 대안적으로 또는 또한 NH아제 및 아미다아제 생성 미생물의 아미다아제 활성을 감소시키기 위한 건조법의 용도를 제공한다.
본 발명자들의 발견에 따라 아미드 용액은, 니트릴 화합물의 아미드 화합물로의 전환의 부산물로서 적은 아크릴산을 함유하기 때문에, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득된 아미드 화합물 수용액을 제공한다.
또한 본 발명자들의 발견에 따라, 본원에서 아크릴아미드 또는 폴리아크릴아미드 및 NH아제 및 아미다아제 생성 미생물을 포함하는 조성물이 제공되고, 상기 미생물은 바람직하게는 적어도 400 의 NH아제/아미다아제 활성 비율을 나타낸다.
본 발명은 이하에서 여러 예시적 구현예를 참조로 하여 상세히 기재될 것이다. 수많은 구체적 상세 사항이 제시되어, 본 발명의 구현예의 전반적 이해를 제공할 것이다. 본 발명에 따른 방법, 조성물 또는 용도의 단일 특징을 추가로 정의 및 구체화할 때, 상기 정의 및 구체적 사항이 본원에 기재 및 제공된 바와 같은 모든 본 발명의 방법, 본 발명의 조성물 및 본 발명의 용도에 적용된다.
또한, 구현예는 하기 제시된 특정 상세한 사항 중 일부 또는 모두가 없이도 실시될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 다른 예에서, 익히 공지된 방법 단계는 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않기 위해 상세히 기재되지는 않는다.
본 발명의 발견에 따라 드러난 바와 같이, NH아제 및 아미다아제 생성 미생물은 니트릴 화합물을 아미드 화합물로 전환할 수 있지만, -다른 상기 NH아제 및 아미다아제 생성 미생물과 대조적으로- 상기 미생물은, 아미드 화합물로의 생물전환에 적용되어야 하는 니트릴 화합물과 이를 접촉시키기 전에 건조 단계에 의해 예비-처리되는 경우에 적은 카르복시산, 특히 아크릴산을 생성한다. 이러한 상기 건조 미생물의 특성은, 특히 아크릴산이 아미드로부터 폴리아크릴아미드로의 후속 중합 반응에서 문제를 야기하기 때문에 유리하다. 따라서, 낮은 아미다아제 활성을 가지면서 그 NH아제 활성이 본질적으로 바뀌지 않아, 미생물이 카르복시산, 특히 아크릴산의 낮은 양/농도를 갖는 아미드 화합물을 생성하는 미생물 형태의 생체 촉매를 제공하는 것이 본 발명자들에 의한 뛰어난 성과이다. 중요하게는, 본 발명자들은 NH아제 및 아미다아제 생성 미생물을 유전자 조작하거나 상기 미생물을 돌연변이화제 등에 적용하지 않고서, 또는 상기 (우연한) 자연-발생 미생물에 대해 과도하게 스크리닝하지 않고서, 그러나 아미드 화합물로의 그의 생물전환 과정에서 니트릴 화합물과 상기 미생물을 접촉시키기 전에 건조 단계에 NH아제 및 아미다아제 생성 미생물을 적용하는 것을 신중하게 관찰함으로써, 이러한 성과를 달성하였다.
따라서, 본 발명은 니트릴 화합물과 니트릴 히드라타아제 (NH아제) 및 아미다아제 생성 미생물을 접촉시키는 것을 포함하는, 니트릴 화합물로부터의 아미드 화합물의 제조 방법을 제공하고, 여기서 상기 미생물은 상기 니트릴 화합물과 접촉되기 전에 건조 단계에 의해 예비-처리된다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 니트릴 화합물로부터 아미드 화합물을 제조하는 방법을 제공한다: (a) NH아제 및 아미다아제 생성 미생물을 건조시키는 단계; 및 (b) 니트릴 화합물과 상기 미생물을 접촉시키는 단계.
또한, 본 발명은 NH아제 및 아미다아제를 생성할 수 있는 건조 미생물을 제공하고, 여기서 NH아제 및 아미다아제 활성 사이의 비율은 >1.0, 예컨대 적어도 >10, >50, >100, >200, >300 또는 >400 이고, 상기 건조 미생물은 아미드 화합물로 (생물)전환되어야 하는 니트릴 화합물과 접촉되기 전에 건조되지 않는 동일한 미생물과 비교했을 때 부산물로서 훨씬 적은 아크릴산을 갖는 아미드 화합물을 생성할 수 있다.
용어 "접촉되기 전에 건조 단계에 의해 예비-처리됨" 은, 미생물이 이것이 본 발명의 방법 및 용도 중 어느 하나에 적용되기 전에 상기 미생물을 건조시키는 수단 및/또는 방법에 의해 처리된다는 것을 의미한다. 특히, 미생물은 이것이 상기 미생물에 의해 (생물)전환되어야 하는 니트릴 화합물과 접촉되기 전에 건조된다. 따라서, 본 발명의 바람직한 미생물은 상기 건조 미생물에 의해 아미드 화합물로 (생물)전환되어야 하는 니트릴 화합물과 접촉되기 (또는 접촉시키기) 전에 건조된다 (건조 단계에 적용된다). 바람직하게는, 건조 단계는 미생물의 총 질량 중 최대 30, 25, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 또는 5 중량 백분율 (% w/w) 의 잔여 물 함량을 갖는 미생물을 야기한다. "미생물의 총 질량" 은 이에 따라 그와 같은 미생물의 질량으로 반드시 제한될 필요는 없으나 (비록 이는 예를 들어 미생물이 건조 단계 전에 물로 세척될 때 당연히 가능하기는 함), 그 존재가 미생물의 수확 및/또는 세척 단계 등의 결과로 간주될 수 있는 성분을 추가로 포함할 수 있다. 뒤따르는 것은 "미생물의 총 질량" 은 (미생물 이외에) 잔여량의 저장 완충액 성분/염 예컨대 TRIS-기반 완충액, 식염수 기반 완충액 등, 및/또는 잔여량의 배양 배지, 성장 배지, 배양액, 발효 브로쓰 예를 들어 미생물 등을 배양하는데 사용된 발효 브로쓰, 안정화제, 첨가제 (예를 들어 건조 첨가제) 등을 추가로 포함할 수 있다.
용어 "미생물(들)" 은 본원에서 사용될 때 "니트릴 히드라타아제 및 아미다아제 생성 미생물(들)" 또는 대안적으로 "NH아제 및 아미다아제 생성 미생물(들)" 을 포함한다. 본 발명의 맥락에서 미생물은 바람직하게는 박테리아, 진균 또는 이스트이다. 본 발명의 미생물은, 바람직하게는 상기 미생물에 의한 아미드 화합물로의 생물전환에 적용되는 니트릴 화합물과 접촉되기 전에 건조 단계에 의해 예비-처리된다. 본 발명의 미생물은 바람직하게는 건조되기 전에 고정화 (immobilize) 되지 않는다. 본원에서 사용된 "고정화" 는 당업자에 공지된 임의의 고정화 기술, 예컨대 제한 없이, 지지체 매트릭스에 미생물을 결합 또는 흡착시키는 것, 미생물을 지지체 매트릭스에 포획 또는 캡슐화하는 것을 나타낸다.
본 발명에서, "NH아제 및 아미다아제 생성 미생물" 은 상응하는 아미드 화합물로 니트릴 화합물을 전환하기 위한 생체 촉매로서 사용되거나 사용하기 위한 것이다. 언급된 바와 같이, 상기 미생물은 바람직하게는 아미드 화합물로의 생물전환에 적용된 니트릴 화합물과 접촉되기 전에 건조 단계에 의해 예비-처리된다. 그 결과, 상기 미생물은 아미드 화합물로 전환되어야 하는 니트릴 화합물과 접촉되기 전에 건조되지 않은 동일한 비생물과 비교했을 때 부산물로서 훨씬 적은 아크릴산을 갖는 아미드 화합물을 제조할 수 있다.
"니트릴 화합물" 은 NH아제의 작용에 의해 아미드 화합물로 본 발명의 미생물에 의해 전환된다. 니트릴 화합물은 -C≡N 관능기를 갖는 임의의 유기 화합물이다. 바람직한 니트릴 화합물은 아크릴로니트릴이다. 본원에 개시된 방법에서 메트아크릴로니트릴, 아세토니트릴 또는 3-시아노피리딘을 사용하는 것이 또한 예상된다.
"아미드 화합물" 은 아미다아제에 의해 아미드 화합물로 전환된다. 아미드 화합물은 관능기 RnC(O)xNR'2 를 갖고, 여기서 R 및 R' 은 H 또는 유기 기를 나타낸다. 유기 아미드의 경우 n=1, x=1 이다. 아미드 화합물의 예는 아크릴아미드이다. 본 발명의 방법에 관해 예상되는 아미드 화합물의 추가 예는 메트아크릴아미드, 아세트아미드 또는 니코틴아미드이다.
본 발명에서, "NH아제 및 아미다아제 생성 미생물" 은 효소 NH아제 및 아미다아제를 생성할 수 있는 임의의 미생물일 수 있다. 이와 관련하여, 미생물이 자연적으로 NH아제 및 아미다아제를 인코팅하는지 또는 이것이 상기 효소를 인코딩하기 위해 유전적으로 개질되는지는 본 발명과 관련이 없다. 또한, 생체 촉매는 NH아제 및 아미다아제를 자연적으로 인코딩하고, 추가로 유전자 조작되어 예를 들어 NH아제의 생성을 증가시키거나 NH아제의 안정성 및/또는 유출을 증가시키거나, 아미다아제의 생성을 감소시키거나, 아미다아제의 안정성 및/또는 유출을 증가시키는 미생물일 수 있다.
본 발명의 맥락에서 자연적으로 인코딩된 NH아제가 아닌 "NH아제 및 아미다아제 생성 미생물" 은, NH 아제를 인코딩하는 유전자를 자연적으로 함유하지 않지만, 예컨대 NH아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하기 위해 (예를 들어 변형, 형질도입, 트랜스펙션 (transfection), 컨쥬게이션 (conjugation), 또는 업계에 공지된 세포에 폴리뉴클레오티드를 수송 또는 삽입하는데 적합한 기타 방법을 통함; Sambrook and Russell 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 참조) 조작되어, 미생물이 NH아제 효소를 생성하고 안정하게 유지할 수 있게 하는, 유전자 조작 미생물일 수 있다. 이러한 목적으로, NH아제 유전자 또는 mRNA 각각의 전사 및 해독을 허용하는 것이 필요할 수 있는 추가 폴리뉴클레오티드를 삽입하는 것이 추가로 필요할 수 있다. 상기 추가 폴리뉴클레오티드는 특히 프로모터 서열, 또는 복제 기원 또는 기타 플라스미드-제어 서열을 포함할 수 있다. 이러한 맥락에서, NH아제를 인코딩하는 유전자를 자연적으로 함유하지는 않지만 예컨대 NH아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하기 위해 조작되는 상기 유전자 조작된 미생물은, 원핵 또는 진핵 미생물일 수 있다. 상기 원핵 미생물의 예는 예를 들어 종 대장균 (Escherichia coli.) 의 대표물을 포함한다. 상기 진핵 미생물의 예는 예를 들어 이스트 (예를 들어 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae)) 를 포함한다.
마찬가지로, 아미다아제를 자연적으로 인코딩하지 않는 "NH아제 및 아미다아제 생성 미생물" 은, 아미다아제를 인코딩하는 유전자를 자연적으로 함유하지 않지만 예컨대 아미다아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하기 위해 조작되어 (예를 들어 변형, 형질도입, 트랜스펙션, 컨쥬게이션, 또는 업계에 공지된 세포에 폴리뉴클레오티드를 수송 또는 삽입하기에 적합한 기타 방법을 통함; Sambrook and Russell 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 참조), 미생물이 아미다아제 효소를 생성하고 안정하게 유지할 수 있게 하는 유전자 조작 미생물일 수 있다. 이러한 목적으로, 각각 아미다아제 유전자 또는 mRNA 의 전사 및 해독을 허용하는데 필요할 수 있는 추가 폴리뉴클레오티드를 삽입하는 것이 추가로 필요할 수 있다. 상기 추가 폴리뉴클레오티드는 특히 프로모터 서열, 또는 복제 기원 또는 기타 플라스미드-제어 서열을 포함할 수 있다. 이러한 맥락에서, 아미다아제를 인코딩하는 유전자를 자연적으로 함유하지 않지만 예컨대 아미다아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하기 위해 조작되는 상기 유전자 조작된 미생물은 원핵 또는 진핵 미생물일 수 있다. 상기 원핵 미생물의 예는 예를 들어 종 대장균의 대표물을 포함한다. 상기 진핵 미생물의 예는 예를 들어 이스트 (예를 들어, 사카로마이세스 세레비시에) 를 포함한다.
NH아제를 (자연적으로 또는 비자연적으로) 인코딩하는 "NH아제 및 아미다아제 생성 미생물" 은 일반적으로 또한 NH아제를 생성하고 안정하게 유지할 수 있다. 그러나 본 발명에 따르면, 상기 미생물이 건조되고/되거나 니트릴 화합물과 접촉될 때, 미생물의 배양 (또는 발효) 동안 오로지 NH아제를 생성 (이에 따라 이후 NH아제를 함유함) 하는 것이 또한 가능하다. 상기 경우에, 미생물이 본원에 기재 및 제공된 방법 동안 NH아제를 더이상 생성하지 않지만, 이는 이들이 건조 이전에 생성하고 이들이 건조 이후에 여전히 함유하는 NH아제 단위를 통해서만 작용하는 것이 가능하다. 당업자에 의해 쉽게 이해되는 바와 같이, 일부 NH아제 분자는 미생물 (예를 들어 미생물의 용해로 인함) 을 떠날 수 있고 생체 촉매로서 용액에서 자유롭게 작용하는 것이 또한 가능하다.
마찬가지로, 아미다아제를 (자연적으로 또는 비자연적으로) 인코딩하는 "NH아제 및 아미다아제 생성 미생물" 은 일반적으로 또한 아미다아제를 생성하고 안정하게 유지할 수 있다. 그러나 본 발명에 따르면, 건조되고/되거나 니트릴 화합물과 접촉될 때, 상기 미생물이 미생물의 배양 (또는 발효) 동안 오로지 아미다아제를 생성 (이에 따라 이후 아미다아제를 함유함) 하는 것이 또한 가능하다. 상기 경우에, 미생물은 본원에 기재 및 제공된 방법 동안 더 이상 아미다아제를 생성하지 않지만, 이는 이들이 건조 이전에 생성하고 이들이 여전히 건조 이후에 함유하는 아미다아제 단위를 통해서만 작용하는 것이 가능하다.
본 발명의 맥락에서, NH아제 및 아미다아제를 자연적으로 인코딩하는 "NH아제 및 아미다아제 생성 미생물" 은 특히 속 로도코쿠스 (Rhodococcus), 아스페르길루스 (Aspergillus), 아시도보락스 (Acidovorax), 아그로박테리움 (Agrobacterium), 바실루스 (Bacillus), 브라디리조비움 (Bradyrhizobium), 브레비박테리움 (Brevibacterium), 부르크홀데리아 (Burkholderia), 에스케리키아 (Escherichia), 지오바실루스 (Geobacillus), 클레브시엘라 (Klebsiella), 메소리조비움 (Mesorhizobium), 모락셀라 (Moraxella), 판토에아 (Pantoea), 슈도모나스 (Pseudomonas), 리조비움 (Rhizobium), 로도슈도모나스 (Rhodopseudomonas), 세라티아 (Serratia), 아미콜라토프시스 (Amycolatopsis), 아트로박테르 (Arthrobacter), 브레비박테리움 (Brevibacterium), 코리네박테리움 (Corynebacterium), 마이크로박테리움 (Microbacterium), 마이크로코쿠스 (Micrococcus), 노카르디아 (Nocardia), 슈도노카르디아 (Pseudonocardia), 트리코데르마 (Trichoderma), 미로테시움 (Myrothecium), 아우레오바시듐 (Aureobasidium), 칸디다 (Candida), 크립토코쿠스 (Cryptococcus), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 지오트리쿰 (Geotrichum), 한세니아스포라 (Hanseniaspora), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 피키아 (Pichia), 로도토룰라 (Rhodotorula), 코모모나스 (Comomonas), 및 피로코쿠스 (Pyrococcus) 의 박테리아를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 미생물은 속 로도코쿠스, 슈도모나스, 에스케리키아 및 지오바실루스의 박테리아로부터 선택된다.
특히, "NH아제 및 아미다아제 생성 미생물" 은 특히 하기 종 로도코쿠스 로도크로우스 (Rhodococcus rhodochrous), 로도코쿠스 피리디노보란스 (Rhodococcus pyridinovorans), 로도코쿠스 에리트로폴리스 (Rhodococcus erythropolis), 로도코쿠스 에쿠이 (Rhodococcus equi), 로도코쿠스 러버 (Rhodococcus ruber), 로도코쿠스 오파쿠스 (Rhodococcus opacus), 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger), 아시도보락스 아베나에 (Acidovorax avenae), 아시도보락스 파실리스 (Acidovorax facilis), 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens), 아그로박테리움 라디오박테르 (Agrobacterium radiobacter), 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실루스 팔리두스 (Bacillus pallidus), 바실루스 스미티 (Bacillus smithii), 바실루스 sp BR449, 브라디리조비움 올리고트로피쿰 (Bradyrhizobium oligotrophicum), 브라디리조비움 디아조에피시엔스 (Bradyrhizobium diazoefficiens), 브라디리조비움 자포니쿰 (Bradyrhizobium japonicum), 부르크홀데리아 세노세파시아 (Burkholderia cenocepacia), 부르크홀데리아 글라디올리 (Burkholderia gladioli), 대장균 (Escherichia coli), 지오바실루스 sp. RAPc8, 클레브시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca), 클레브시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumonia), 클레브시엘라 바리이콜라 (Klebsiella variicola), 메소리조비움 시세리 (Mesorhizobium ciceri), 메소리조비움 오포투니스툼 (Mesorhizobium opportunistum), 메소리조비움 sp F28, 모락셀라 (Moraxella), 판토에아 엔도피티카 (Pantoea endophytica), 판토에아 아글로메란스 (Pantoea agglomerans), 슈도모나스 클로로라피스 (Pseudomonas chlororaphis), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida), 리조비움 (Rhizobium), 로도슈도모나스 팔루스트리스 (Rhodopseudomonas palustris), 세라티아 리쿠에파시엔스 (Serratia liquefaciens), 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens), 아미콜라토프시스 (Amycolatopsis), 아트로박테르 (Arthrobacter), 브레비박테리움 sp CH1, 브레비박테리움 sp CH2, 브레비박테리움 sp R312, 브레비박테리움 임페리알레 (Brevibacterium imperiale), 코리네박테리움 니트릴로필루스 (Corynebacterium nitrilophilus), 코리네박테리움 슈도디프테리티쿰 (Corynebacterium pseudodiphteriticum), 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 호프마니 (Corynebacterium hoffmanii), 마이크로박테리움 임페리알레 (Microbacterium imperiale), 마이크로박테리움 스메그마티스 (Microbacterium smegmatis), 마이크로코쿠스 루테우스 (Micrococcus luteus), 노카르디아 글로베룰라 (Nocardia globerula), 노카르디아 로도크로우스 (Nocardia rhodochrous), 슈도노카르디아 터모필라 (Pseudonocardia thermophila), 트리코데르마 (Trichoderma), 미로테시움 베루카리아 (Myrothecium verrucaria), 아우레오바시듐 풀루란스 (Aureobasidium pullulans), 칸디다 파마타 (Candida famata), 칸디다 길리에르몬디 (Candida guilliermondii), 칸디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis), 크립토코쿠스 플라부스 (Cryptococcus flavus), 크립토코쿠스 sp UFMG- Y28, 데바리오마이세스 한세이 (Debaryomyces hanseii), 지오트리쿰 칸디둠 (Geotrichum candidum), 지오트리쿰 sp JR1, 한세니아스포라 (Hanseniaspora), 클루이베로마이세스 터모톨레란스 (Kluyveromyces thermotolerans), 피키아 클루이베리 (Pichia kluyveri), 로도토룰라 글루티니스 (Rhodotorula glutinis), 코모모나스 테스토스테로니 (Comomonas testosteroni), 피로코쿠스 아비시 (Pyrococcus abyssi), 피로코쿠스 푸리오수스 (Pyrococcus furiosus), 피로코쿠스 호리코시 (Pyrococcus horikoshii), 브레비박테리움 카세이 (Brevibacterium casei), 또는 노카르디아 sp 163 을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, "NH아제 및 아미다아제 생성 미생물" 은 종 로도코쿠스 로도크로우스 (Rhodococcus rhodochrous) 또는 로도코쿠스 피리디노보란스 (Rhodococcus pyridinovorans) 의 박테리아이다. 이러한 종의 바람직한 대표물은 로도코쿠스 로도크로우스 (NCIMB 41164), 로도코쿠스 로도크로우스 (FERM BP-1478), 로도코쿠스 로도크로우스 M8, 및 로도코쿠스 로도크로우스 M33 이다.
본 발명의 내용에서, "니트릴 히드라타아제" ("NH아제") 는, 니트릴의 이의 상응하는 아미드로의 수화를 촉매 작용하는 미생물 효소를 나타낸다 (IUBMB 효소 명명법 EC 4.2.1.84). 그러나, 본원에서 사용된 용어 "니트릴 히드라타아제" 및 "NH아제" 는 또한 예를 들어 니트릴 화합물 (예를 들어, 아크릴로니트릴) 을 아미드 화합물 (예를 들어, 아크릴아미드) 로 더욱 빠르게 전환할 수 있거나, 더 높은 수율/시간-비율로 생성될 수 있거나, 더욱 안정한 (이들이 니트릴 화합물 (예를 들어, 아크릴로니트릴) 의 아미드 화합물 (예를 들어, 아크릴아미드) 로의 전환 (즉 수화) 을 촉매작용할 수 있는 한 그러한), 개질 또는 향상된 효소를 포함한다.
아크릴로니트릴을 아크릴아미드로 전환하는 주어진 생체 촉매 (예를 들어, "NH아제 및 아미다아제 생성 미생물") 의 능력을 측정하는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 예로서, 본 발명의 맥락에서, 본 발명의 의미에서 아크릴로니트릴을 아크릴아미드로 전환할 수 있는 주어진 생체 촉매의 활성은 하기와 같이 측정된다: 먼저 10 분 동안 1,000 rpm 에서 에펜도르프 튜브 쉐이커에서 25 ℃ 에서 25 ㎕ 의 아크릴로니트릴 및 875 ㎕ 의 50 mM 칼륨 포스페이트 완충액과 100 ㎕ 의 세포 현탁액, 세포 용해물, 용해된 효소 분말, 또는 생각되는 니트릴 히드라타아제를 함유하는 임의의 기타 제제를 반응시킨다. 반응 시간 10 분 이후, 샘플은 꺼내지고, 즉시 1.4% 염산을 동일 부피 첨가하여 켄칭될 수 있다. 샘플 혼합 이후, 세포는 10,000 rpm 으로 1 분 동안 원심분리하여 제거될 수 있고, 형성된 아크릴아미드의 양은 HPLC 에 의해 맑은 상청액을 분석하여 측정된다. 본 발명의 맥락에서 효소가 니트릴 히드라타아제인 것으로 확인되는 경우, 아크릴아미드의 농도는 0.25 내지 1.25 mmol/l 일 것이고 -필요한 경우, 샘플은 그에 따라 희석되고 전환이 반복되어야 한다. 효소 활성은 이후 반응 시간 (이는 10 분 걸림) 으로 HPLC 분석으로부터 유래된 아크릴아미드 농도를 나누고, 이러한 값과 HPLC 샘플과 본래의 샘플 사이의 희석 배수를 곱함으로써, 아크릴아미드의 농도로부터 추정될 수 있다. 활성 >5 U/mg 건조 세포 중량, 바람직하게는 >25 U/mg 건조 세포 중량, 더 바람직하게는 >50 U/mg 건조 세포 중량, 가장 바람직하게는 >100 U/mg 건조 세포 중량은 기능적으로 발현된 니트릴 히드라타아제의 존재를 나타내고, 본 발명의 맥락에서 니트릴 히드라타아제로서 고려된다.
본 발명의 맥락에서, 니트릴 히드라타아제는 SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 서열 (R. 로도크로우스의 니트릴 히드라타아제의 알파-서브유닛:
및/또는 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 서열 (R. 로도크로우스의 니트릴 히드라타아제의 베타-서브유닛:
과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 더 바람직하게는 적어도 96%, 더 바람직하게는 적어도 97%, 더 바람직하게는 적어도 98%, 더 바람직하게는 적어도 99%, 더 바람직하게는 적어도 99.5%, 및 가장 바람직하게는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드일 수 있고, 단 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드는 본원에 기재 및 예시된 아크릴로니트릴의 아크릴아미드로의 수화를 촉매작용할 수 있다 (즉, 니트릴 히드라타아제 활성을 가짐). 또한 본 발명의 맥락에서, 니트릴 히드라타아제는 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열 (R. 로도크로우스의 니트릴 히드라타아제의 알파-서브유닛:
및/또는 SEQ ID NO: 4 (R. 로도크로우스의 니트릴 히드라타아제의 베타-서브유닛:
과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 더 바람직하게는 적어도 96%, 더 바람직하게는 적어도 97%, 더 바람직하게는 적어도 98%, 더 바람직하게는 적어도 99%, 더 바람직하게는 적어도 99.5%, 가장 바람직하게는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 폴리펩티드일 수 있고, 단 상기 폴리펩티드는 본원에 기재 및 예시된 아크릴아미드로의 아크릴로니트릴의 수화를 촉매작용할 수 있다.
둘 이상의 서열 (예를 들어 핵산 서열 또는 아미노산 서열) 사이의 상동성 (identity) 의 수준은 예를 들어 BLAST 분석에 의해 업계에 공지된 방법에 의해 쉽게 측정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 맥락에서, 예를 들어 서열 비교에 의해 비교하고자 하는 두 서열 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열) 이 상동성이 다른 경우, 용어 "상동성" 은 더 짧은 서열, 및 상기 더 짧은 서열에 매칭되는 더 긴 서열의 해당 부분을 나타낼 수 있다. 따라서, 비교하고자 하는 서열이 동일한 길이를 갖지 않을 때, 상동성 정도는 바람직하게는 더 긴 서열의 뉴클레오티드 잔기와 동일한 더 짧은 서열의 뉴클레오티드 잔기의 백분율, 또는 더 짧은 서열의 뉴클레오티드 서열과 동일한 더 긴 서열의 뉴클레오티드의 백분율을 나타낼 수 있다. 이러한 맥락에서, 당업자는 쉽게 더 짧은 서열에 매칭되는 더 긴 서열의 해당 부분을 결정하는 위치에 있다. 또한, 본원에 사용된 바와 같이, 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 상동성 수준은 각각의 서열의 전체 길이를 나타낼 수 있고 바람직하게는 쌍으로 평가되고, 여기서 각각의 갭은 하나의 미스매치로 계수된다. 이러한 서열 비교에 대한 정의 (예를 들어, "상동성" 값의 확립) 는 본원에 기재 및 개시된 모든 서열에 적용된다.
또한, 본원에서 사용된 용어 "상동성" 은 상응하는 서열 사이의 기능적 및/또는 구조적 동등성이 있음을 의미한다. 본원에 기재된 특정 핵산/아미노산 서열에 대해 주어진 상동성 수준을 갖는 핵산/아미노산 서열은, 바람직하게는 동일한 생물학적 기능을 갖는 이러한 서열의 유도체/변형체를 나타낼 수 있다. 이는 자연 발생 변이, 예를 들어 기타 변형체, 종 등, 또는 돌연변이로부터의 서열일 수 있고, 상기 돌연변이는 자연적으로 형성될 수 있거나 고의적 돌연변이 생성에 의해 생성될 수 있다. 또한, 변이는 합성적으로 생성된 서열일 수 있다. 변형체는 자연 발생 변형체 또는 합성적 생성 변형체 또는 재조합 DNA 기술에 의해 생성된 변형체일 수 있다. 상기 기재된 핵산 서열로부터의 편차는 예를 들어 결실, 치환, 부가, 삽입 및/또는 재조합에 의해 생성될 수 있다. 용어 "부가" 는 주어진 서열의 말단에 하나 이상의 핵산 잔기/아미노산을 부가하는 것을 나타내는 한편, "삽입" 은 주어진 서열 내에 하나 이상의 핵산 잔기/아미노산을 삽입하는 것을 나타낸다. 용어 "결실" 은 주어진 서열에서의 하나 이상의 핵산 잔기 또는 아미노산 잔기의 결실 또는 제거를 나타낸다. 용어 "치환" 은 주어진 서열에서의 하나 이상의 핵산 잔기/아미노산 잔기의 대체를 나타낸다. 또다시, 여기서 사용된 이러한 정의는 필요한 부분만 약간 수정하여 본원에 제공 및 기재된 모든 서열에 적용된다.
일반적으로, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산" 또는 "핵산 분자" 는 동의어로 이해된다. 일반적으로, 핵산 분자는 특히 DNA 분자, RNA 분자, 올리고뉴클레오티드 티오포스페이트, 치환 리보-올리고뉴클레오티드 또는 PNA 분자를 포함할 수 있다. 또한, 용어 "핵산 분자" 는 업계에 공지된 DNA 또는 RNA 또는 이의 혼성체 또는 이의 임의의 변형을 나타낼 수 있다 (예를 들어 US 5525711, US 471 1955, US 5792608 또는 EP 302175 변형예 참조). 폴리뉴클레오티드 서열은 단일- 또는 이중- 가닥, 선형 또는 원형, 천연 또는 합성일 수 있고, 임의의 크기 제한이 없다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열은 게놈 DNA, cDNA, 미토콘드리아 DNA, mRNA, 안티센스 RNA, 리보자임 RNA 및 상기 RNA 를 인코딩하는 DNA 또는 키메로플라스트 (chimeroplast) (Gamper, Nucleic Acids Research, 2000, 28, 4332 - 4339) 일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 벡터, 플라스미드 또는 바이러스성 DNA 또는 RNA 의 형태일 수 있다. 또한 본원에 기재되는 것은, 상기 기재된 핵산 분자를 보완하는 핵산 분자 및 본원에 기재된 핵산 분자를 혼성화할 수 있는 핵산 분자이다. 본원에 기재된 핵산 분자는 또한 본 발명의 맥락에서 핵산 분자의 분절일 수 있다. 특히, 상기 분절은 기능성 분절이다. 상기 기능성 분절의 예는 프라이머로서 역할할 수 있는 핵산 분자이다.
"아미다아제" 는 아미드의 이의 상응하는 카르복시산으로의 가수분해를 촉매작용하는 미생물 효소를 나타낸다 (IUBMB 효소 명명법 EC 3.5.1.4. "아미다아제"). 아미다아제는 바람직하게는 NH아제와 함께 공동-발현되고 NH아제에 의해 생성된 아미드를 상응하는 카르복시산으로 추가로 전환하는 아미다아제를 나타낸다. 본원에서 사용된 용어 "아미다아제" 는 상기 효소가 여전히 아미다아제 활성을 갖는 한, 개질 또는 손상된 효소를 또한 포함한다.
이론에 얽매이지 않으면서, 생체 촉매 (즉 미생물) 의 건조는 아미다아제의 활성을 감소시키고, 이에 따라 NH아제 활성은 더 낮은 정도로 감소되거나 바뀌지 않고 유지된다는 것이 이해된다. 실제로, 본 발명자들은 NH아제 및 아미다아제 생성 미생물이 건조 단계에 의해 예비-처리된 후 상기 미생물에 의한 생물전환 (니트릴 화합물의 아미드 화합물로의 생물전환) 에 적용되어야 하는 니트릴 화합물과 접촉될 때, NH아제 활성이 아미다아제의 활성보다 높다는 것을 관찰하였다.
상기 언급된 바와 같이, 미생물이 상기 미생물에 의해 아미드 화합물로 전환되어야 하는 니트릴 화합물과 접촉되기 전에 건조 단계에 의해 예비-처리될 때, 상기 미생물은 상기 니트릴 화합물과 접촉되기 전에 건조 단계에 의해 예비-처리되지 않은 동일한 미생물과 비교했을 때 적은 아크릴산을 갖는 아미드 화합물을 생성할 수 있다는 것이 본 발명자들에 의해 관찰되었다.
따라서, 본 발명의 미생물은 바람직하게는 적어도 400 유닛의 NH아제/아미다아제 활성 비율을 갖는다. NH아제 활성은 바람직하게는 상기 본원에 기재된 바와 같이 측정된다.
또한 본 발명의 발견에 따르면, 본 발명의 방법에 나타난 접촉 단계는 건조 미생물을 사용하여 수행된다. 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 나타난 접촉 단계는 재구성 미생물에 의해 수행된다. 재구성 미생물은 현탁되는, 즉 슬러리에 존재하거나 수용액 예컨대 물 또는 생리적 pH 를 갖는 완충액, 또는 수성 조성물에 용해된 건조 미생물이다. 후자는 하나 이상의 추가 성분 예컨대 글루코오스를 함유할 수 있다. 재구성은 본원에서 미생물이 니트릴 화합물과 접촉되기 이전의 건조 미생물에 대한 수성 조성물의 첨가를 나타낸다. 따라서, 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에서, 접촉 단계는 수성 조성물에 현탁되는 건조 미생물에 의해 수행될 수 있다. 상기 수성 조성물은 제한 없이, 물 (예를 들어 탈이온수) 및 완충액 (예를 들어 포스페이트 완충액) 을 포함한다.
상기 주어진 바와 같이, 본 발명의 방법에 나타난 접촉 단계는 분말, 과립 및/또는 현탁액의 형태인 미생물에 의해 수행되는 것이 바람직하다. 접촉 단계를 수행하기 위해 매트릭스-결합된 미생물을 또한 사용할 수 있다.
상기 설명된 바와 같이, 본원에 기재된 방법 및 용도에 또한 적용된 본 발명의 미생물의 아미다아제 활성에 대한 NH아제 활성의 비율은 참조 미생물과 비교했을 때 증가된다.
실제로, 첨부된 실시예에 나타난 바와 같이, 건조 단계에 의해 예비-처리된 후 상기 미생물에 의한 생물전환에 이후 적용되는 니트릴 화합물과 접촉되는 미생물은 건조 단계에 의해 예비-처리되지 않은 미생물에 비해 최저 아크릴산 값을 갖는다는 것이 명백하다. 이러한 발견은, 비건조 미생물은 더 많은 아크릴산을 부산물로서 생성 (여기서 아크릴산은 아미드 화합물의 아크릴산으로의 전환으로부터 야기됨) 하기 때문에, 건조 미생물의 아미다아제 활성이 감소 또는 손상되는 것으로 보여짐을 시사한다. 그 결과, NH아제 활성은, -(감소된) 아미다아제 활성에 비해- 증가된다. 실제로, 건조 단계로 인해, 아미다아제 활성은 상기 건조 미생물이 표 1 및 2 의 가장 우측 열로부터 명백한, 적은 아크릴산을 부산물로서 갖는 아미드 화합물을 생성할 정도로 감소된다. 요컨대, 실시예 1 및 2 에 적용된 바와 같은 반응 매개변수가 상이한 설정 사이에 동일하게 유지되기 때문에, 아크릴산 양의 감소의 개선은 건조 단계의 덕일 수 있음이 명백하다.
본원에서 비건조 생체 촉매 (즉, 미생물) 를 나타낼 때 "참조 미생물" 이 사용될 수 있다. 이에 따라 참조 미생물은, 상기 니트릴 화합물과 접촉되기 전에 건조 단계에 의해 예비-처리되는 본 발명의 미생물에 의해 아미드 화합물로 전환되어야 하는 니트릴 화합물과 접촉되기 전에 건조 단계에 의해 예비-처리되지 않은 것이다. 적합한 "참조 미생물" 은 예를 들어 본 발명의 방법(들) 에서 생체 촉매로서 사용된 미생물로서 동일한 균주의 비건조 미생물이다. 또한, "참조 미생물" 은 건조 전에 본 발명의 방법에서 사용된 생체 촉매 (즉, 미생물) 에 해당할 수 있다. 이러한 경우, 이는 방법의 건조 단계 a) 전후에 생체 촉매로서 사용된 미생물의 NH아제/아미다아제 활성을 측정하고, 건조가 미생물의 NH아제/아미다아제 활성을 증가시키는지를 측정하기 위해 NH아제/아미다아제 활성 모두를 비교할 수 있다. 또한 로도코쿠스 로도크로우스 (NCIMB 41164) 는 "참조 미생물" 로서 사용될 수 있다. 단계 a) 에서 수행된 건조 방법이 사용된 미생물의 NH아제/아미다아제 활성 비율을 증가시키는지를 측정하기 위해, 이는 단계 a) 에서 수행된 건조 공정에 로도코쿠스 로도크로우스 (NCIMB 41164) 를 부가적으로 또는 대안적으로 적용시킬 수 있다. 로도코쿠스 로도크로우스 (NCIMB 41164) 의 NH아제/아미다아제 활성 비율이 단계 a) 에서 수행된 건조에 의해 증가되는 경우, 본 발명의 방법에서 생체 촉매로서 사용된 미생물의 NH아제/아미다아제 활성 비율이 마찬가지로 단계 a) 에서 수행된 건조에 의해 감소된다는 것이 가정되어야 한다.
본 발명 내에서, 미생물은 바람직하게는 미생물의 건조 및 건조 미생물과 니트릴 화합물의 접촉 사이에서 배양되지 않는다. 본원에서 사용된 "배양" 은 미생물이 배양 배지에 현탁되고, 미생물이 성장하게 하는 조건 하에 유지하는 것을 의미한다.
미생물의 건조 및 건조 미생물과 니트릴 화합물의 접촉 사이에서, 미생물은 미생물이 이의 NH아제/아미다아제 활성 비율을 건조 이전에 회복하는 것을 저해하는 조건 하에 유지된다.
아미다아제 활성에 대한 NH아제 활성의 비율 의 증가는 바람직하게는 적어도 1.4 이상, 예컨대 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 또는 2.5, 또는 심지어 그 이상의 배에 의한다.
유사하게는, NH아제 활성에 대한 아미다아제 활성의 비율 의 감소는 바람직하게는 적어도 0.7 이하, 예컨대 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 또는 0.1, 또는 심지어 그 이하의 배에 의한다.
본 발명의 발견에 따르면, 하기 단계를 포함하는, 니트릴 화합물로부터 아미드 화합물을 생성하는 방법이 제공된다: (a) NH아제 및 아미다아제 생성 미생물을 건조하는 단계; 및 (b) 니트릴 화합물과 상기 미생물을 접촉시키는 단계.
NH아제 활성은 예를 들어 상기 본원에 기재된 바와 같이 당업자의 일반 지식에 따라 측정 및 결정된다.
유사하게는, 아미다아제 활성은 당업자의 일반 지식에 따라 측정 및 결정된다. 예를 들어, 아미다아제 활성은 630 nm 에서 아크릴아미드 분해로부터 유리된 암모니아를 측정하여 실온에서 검정될 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 바와 같이, 생체 촉매로서 사용된 미생물의 건조는 상기 미생물의 NH아제/아미다아제 활성 비율을 증가시킨다. 바람직하게는, 건조는 분무 건조, 동결-건조, 가열 건조, 공기 건조, 진공 건조, 유동층 건조 및/또는 분무 과립화에 의해 매개된다. 이와 관련하여, 분무 건조 및 동결 건조가 바람직한데, 이는 일반적으로 분무- 또는 동결 건조에 적용되는 생체 촉매를 사용함으로써, 기타 방법을 사용해 건조된 미생물을 사용하는 것에 비하여 니트릴 화합물로부터 아미드 화합물의 제조 동안 더 높은 아크릴산 형성 감소가 달성되기 때문이다. 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에서, 미생물의 건조는 건조 미생물이 니트릴 화합물과 접촉되기 직전에 수행된다. 대안적으로, 미생물은 건조 및 건조 미생물과 니트릴 화합물의 접촉 사이에 저장될 수 있다. 건조 단계 및 접촉 단계 사이에서 미생물의 저장의 경우, 건조 미생물은 건조 상태로 유지될 수 있고 (즉, 미생물은 재구성되지 않음), 동결될 수 있고, 열로부터 보호될 수 있고, 수분으로부터 보호될 수 있고, 및/또는 배양되지 않을 수 있다.
건조 미생물이 니트릴 화합물과 접촉되는 시점에 건조 미생물의 형태에 대한 특정 제한은 없다. 건조 미생물은 건조될 수 있고/있거나, 본원에 기재된 건조법 중 어느 하나, 예컨대 분무-건조 또는 동결 건조에 의해 달성될 수 있는 건조 생성물의 형태일 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 방법 및 추가 구현예 중 어느 하나에서, 접촉 단계는 미생물의 총 질량 중 최대 30, 25, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5 중량% (% w/w) 의 잔여 물 함량을 갖는 미생물에 의해 수행될 수 있다. 잔여 물 함량을 측정하는 방법은 당업자에게 익숙하다. 예를 들어, 본 발명의 맥락에서 건조 미생물의 샘플의 잔여 물 함량은 열중량 측정 분석 (thermogravimetric analysis) 을 통해 측정될 수 있다. 열중량 측정 분석의 시작시에 샘플의 초기 중량이 측정된다. 샘플은 이후 가열되고 물은 증발한다. 가열은 샘플 중량이 일정하게 유지될 때까지 지속된다. 분석 종료시에 일정한 중량 및 초기 중량 사이의 차이는 분석 동안 증발된 물의 양을 나타내고, 이는 샘플의 잔여 물 함량의 계산을 허용한다. 열중량 측정 분석을 통한 잔여 물 함량의 측정의 경우, 미생물의 샘플은 예를 들어 샘플 중량이 적어도 30 초 동안 일정하게 유지될 때까지 130 ℃ 에서 작동된 'Mettler Toledo HB43-S 할로겐 수분 분석기' 에서 분석될 수 있다. "미생물의 총 질량" 은 이에 따라 상기와 같은 미생물의 질량으로 반드시 제한될 필요는 없으나 (비록 이는 당연히 예를 들어 미생물이 건조 단계 이전에 물로 세척될 때 가능하기는 함), 그 존재가 미생물의 배양 및/또는 세척 단계 등의 결과로 간주될 수 있는 성분을 추가로 포함할 수 있다. 뒤따르는 것은, "미생물의 총 질량" 이 잔여량의 저장 완충액 성분/염 예컨대 TRIS-기반 완충액, 식염수 기반 완충액 등 및/또는 잔여량의 배양 배지, 성장 배지, 배양액, 발효 브로쓰 예를 들어 미생물 등의 배양에 사용된 발효 브로쓰, 안정화제, 첨가제 (예를 들어, 건조 첨가제) 등을 (미생물 이외에) 추가로 포함할 수 있다는 것이다.
본 발명은 또한 NH아제 및 아미다아제 생성 미생물을 건조시키는 것을 포함하는 증가된 NH아제/아미다아제 활성 비율을 갖는 미생물의 제조 방법, 및 NH아제 및 아미다아제 생성 미생물을 건조시키는 것을 포함하는 감소된 아미다아제 활성을 갖는 미생물의 제조 방법을 본 발명자들의 발견에 따라 제공한다.
상기 설명된 바와 같이, 본 발명에 의해 달성되는 주요 목표는 적은 또는 감소된 아크릴산을 부산물로서 갖는 생물-전환된 아미드 화합물 (니트릴 화합물로부터 생물-전환됨) 인데, 이는 아크릴산이 아미드 화합물의 후속 중합에서 어려움을 야기하는 것으로 공지되어 있기 때문이다. 따라서, 이러한 성과는 아크릴로니트릴과 NH아제 및 아미다아제 생성 미생물을 접촉시키는 것을 포함하는, 니트릴 화합물로부터 아미드 화합물을 제조할 때 아크릴산의 형성을 감소시키는 방법을 제공함으로써 반영되며, 여기서 상기 미생물은 상기 니트릴 화합물과 접촉되기 전에 건조 단계에 의해 예비-처리된다. 특히, 본 발명자들은 본원에 기재된 니트릴 화합물과 접촉되기 전에 건조 단계에 의해 예비-처리되는 미생물을 사용함으로써, 아크릴산의 형성이 참조 방법에 비해 적어도 15 %, 바람직하게는 적어도 20 %, 더 바람직하게는 적어도 25 %, 보다 더 바람직하게는 적어도 30 %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 40 %, 가장 바람직하게는 적어도 50 % 감소될 수 있다는 것을 밝혀냈다.
본 발명자들은 생물전환 반응 (특히 산업적 규모) 이 바람직하게는 상당히 단순한 방식으로 수행되어야 함을 추가로 고려하였다. 특히, 본 발명의 생체 촉매를 포함하는 NH아제를 사용하는 니트릴 화합물의 아미드 화합물로의 생물전환과 관련하여, 본 발명자들은 반응 혼합물 중 완충액의 몰 농도를 비교적 낮게, 바람직하게는 가능한 한 낮게 유지하는 것이 생물전환 공정에 있어 여러 이점을 갖는 것으로 여겼다. 예를 들어, 비교적 대량의 완충액이 반응 혼합물에 존재하는 경우, 이는 이후 폐수에 비교적 대량으로 존재할 것이다. 이는 완충액이 또다시 폐수로부터 제거되어야 할 것이고, 이는 추가적인 기술적 노력 및 비용을 야기할 것임을 의미한다. 또한, 생성물 중 비교적 대량의 완충액의 존재, 즉 아미드 용액은 후속 반응 단계, 예를 들어 중합 또는 공중합 반응에 부정적 영향을 줄 수 있다. 따라서, 비교적 대량의 완충액이 생물전환의 반응 혼합물에 첨가되는 경우, 이는 추가 반응 단계 이전에 아미드 용액으로부터 분리되어야 할 것이고 이는 추가적인 기술적 노력 및 비용을 동발할 것이며, 또는 완충액은 생성물 품질의 저하를 야기할 수 있다. 따라서, 니트릴 화합물의 아미드 화합물로의 생물전환은 바람직하게는 비교적 낮은 양의 완충액의 존재 하에 수용액 중에서 수행된다.
니트릴 화합물의 아미드 화합물로의 생물전환을 위한 반응 혼합물의 제조의 경우, 본 발명의 방법에 의해, 예를 들어 분무 건조 또는 동결 건조에 의해 수득된 건조 생체 촉매는 일반적으로 물에 현탁될 수 있고, 생체 촉매를 함유하는 상기 수성 혼합물은 이후 생물전환이 수행되고 생체 촉매가 수성 혼합물 및 상응하는 아미드로 전환되는 니트릴 화합물과 접촉되는 반응기에 수송될 수 있다. 그러나, 본 발명자들은 놀랍게도, 본 발명의 건조 생체 촉매가 비완충 수용액과 혼합되는 경우 생체 촉매를 함유하는 수성 혼합물의 pH 가 약산성 범위 (예를 들어 pH 5 내지 6.5) 에 있을 것임을 밝혀냈다. 이는 건조, 예를 들어 분무 건조 또는 동결 건조 이전에 습윤 생체 촉매가 전형적으로 중성 pH (예를 들어, pH 6.7 내지 7.5) 를 갖는 매질에 있기 때문에 놀랍다. 또한, 반응 혼합물은 생물전환 동안 오히려 약염기성이다. 이론에 얽매이지 않기를 바라면서, 건조 단계 동안 암모니아 (NH3) 는 생물전환 이전에 수용액과 혼합될 때 건조 생체 촉매의 약산성 pH 를 야기하는 매질로부터 제거되는 것으로 여겨진다.
이와 관련하여, 본 발명자들은 놀랍게도, 건조 생체 촉매의 수성 혼합물의 산성 pH 가 NH아제의 약화된 활성을 야기하고 이러한 약화가 비가역성일 수 있음을 밝혀냈으며, 이는 NH아제 활성이 심지어 생물전환이 중성 또는 약염기성 pH 를 갖는 반응 혼합물에서 수행되는 경우에도 약화되어 유지될 것임을 의미한다.
본 발명자들은 다양한 실험을 수행하였고, 건조 생체 촉매가 생물전환 전에 이를 완충 수용액에 현탁시킴으로써 활성화되는 경우 (여기서 용액은 중성 또는 약염기성 pH (예를 들어 pH 6.6 내지 9) 를 가짐), 생체 촉매가 실질적으로 증가된 NH아제 활성을 가질 것임을 밝혀냈다. 이러한 높은 NH아제 활성은 심지어 활성화 혼합물 (즉, 생체 촉매를 포함하는 완충 수성 혼합물) 이 비완충 수용액에 수송되어 반응 혼합물을 생성하는 경우에도 유지된다. 이러한 증가된 NH아제 활성에 의해, 생물전환의 총 반응 시간은 동량의 생체 촉매가 분무 건조 이후 완충액 없이 물에 현탁되는 생물전환의 반응 시간에 비해 중대하게 감소된다. 또한, 반응 혼합물에 단순히 완충액을 첨가하는 것은, 건조 생체 촉매가 반응 혼합물에 대한 첨가 이전의 활성화로서 완충액에 재현탁될 때와 동일한 효과를 야기하지 않는다. 본 발명자에 의해 수행된 추가 실험에 따르면, 생체 촉매는 완충액이 발효 이후 세포 현탁액에 첨가되고 생체 촉매가 완충액과 함께 건조되고, 이후 물 또는 완충액에 재현탁될 때 실질적으로 증가된 NH아제 활성을 또한 갖는다.
상기 제시된 바와 같이, 생체 촉매의 활성화는 완충액을 함유하는 수용액에 건조 생체 촉매를 현탁시킴으로써 수행될 수 있다. 상기 활성화는 수규모로 수행될 수 있고, 즉 활성화에 필요한 반응 부피는 비교적 작다. 다른 한편으로는, 니트릴 화합물의 아미드 화합물로의 생물전환이 수행되는 반응 혼합물은 일반적으로 비교적 큰 부피를 갖는다. 반응 혼합물의 부피에 비해 활성화 혼합물의 낮은 부피로 인해, 완충액 성분은 활성화 혼합물이 니트릴 화합물의 아미드 화합물로의 생물전환을 위해 반응기에 수송될 때 반응 혼합물에 희석된다. 그럼에도 불구하고, 활성화 동안 완충액의 유익한 효과는 생물전환에서 보존된다. 이전에 언급한 바와 같이, 향상된 NH아제 활성의 결과, 생체 촉매를 사용한 니트릴 화합물의 아미드 화합물로의 생물전환은 동량의 생체 촉매가 사용되는 경우 높은 반응 속도를 나타낸다. 또한 생체 촉매의 양은, 활성화 단계를 겪지 않은 생체 촉매, 즉 건조 이후 단지 물에 재현탁된 생체 촉매의 비감소된 양을 사용할 때의 반응 속도보다 심지어 더 높은 반응 속도를 달성하면서, 감소될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 수성 혼합물에 니트릴 화합물로부터 아미드 화합물을 생성하는 방법에 관한 것이고, 이 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 건조 단계에 의한 생체 촉매의 예비-처리; (b) 활성화 혼합물을 생성하기 위해 수용액과 본 발명의 건조 생체 촉매를 혼합하는 것을 포함하는 활성화 단계, 여기서 활성화 혼합물은 완충액을 포함함; 및 (c) 반응 혼합물에서 본 발명의 생체 촉매를 사용하여 니트릴 화합물을 아미드 화합물로 전환하는 단계, 여기서 반응 혼합물은 상기 단계 (b) 의 완충액을 포함하고, 반응 혼합물 중 상기 완충액의 몰 농도에 대한 활성화 혼합물 중 완충액의 몰 농도의 비율은 약 2:1 이상이다. 특히, 활성화 혼합물 중 완충액의 몰 농도 대 반응 혼합물 중 상기 완충액의 몰 농도의 비율은 전환 종료 이전에 약 2:1 이상이다. 비율이 전환 동안 일정하게 유지되는 것은 본원에 개시된 방법 중 어느 하나에서 필요하지 않다. 더욱이 비율은 비율이 약 2:1 이상인 한 전환 동안 변화할 수 있다. 예를 들어, 비율은 전환 동안 증가할 수 있다. 이는 반응 혼합물을 희석시키고 이에 따라 반응 혼합물 중 완충액 농도를 감소시키는 전환 동안 반응물질이 반응 혼합물에 첨가되는 경우일 수 있다. 예를 들어, 니트릴 화합물 및/또는 물은 전환 동안 반응 혼합물에 반응물질로서 공급될 수 있다. 이는 반응 혼합물의 부피를 증가시키고, 이에 따라 반응 혼합물 중 완충액의 몰 농도를 감소시킨다. 반응 혼합물 중 완충액의 몰 농도의 감소 결과, 반응 혼합물 중 완충액의 몰 농도에 대한 활성화 혼합물 중 완충액의 몰 농도의 비율이 증가한다. 따라서, 이러한 실시예로부터 볼 수 있는 바와 같이, 몰 비율은 전환 반응 동안에 걸쳐 변화할 수 있다.
활성화 혼합물 중 완충액의 몰 농도 대 반응 혼합물 중 상기 완충액의 몰 농도의 비율은 약 3:1 이상, 바람직하게는 약 4:1 이상, 더 바람직하게는 약 5:1 이상, 보다 더 바람직하게는 약 7:1 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 10:1 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 20:1 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 50:1 이상, 가장 바람직하게는 약 100:1 이상일 수 있음이 또한 예상된다. 특히, 이러한 비율은 전환 종료 전에 존재한다. 반응 혼합물 중 완충액의 몰 농도 및 활성화 혼합물 중 완충액의 몰 농도와 관련하여, 이러한 농도는 모두 mol/L (리터 당 몰) 로 나타내어진다. 반응 혼합물 중 완충액의 몰 농도 및 활성화 혼합물 중 완충액의 몰 농도의 비율을 계산할 때, 활성화 혼합물 중 완충액의 몰 농도 및 반응 혼합물 중 완충액의 몰 농도 모두는 mol/L 로 취해진다. 활성화 혼합물의 완충액이 활성화 단계 이후 및 생체 촉매가 니트릴 화합물과 접촉되기 이전에 적어도 일부 제거될 수 있다는 것이 또한 본 발명에 의해 고려될 수 있다. 설명적 예로서, 이는 활성화 혼합물의 원심분리 이후 상청액의 폐기, 임의로는 이후 생체 촉매와 또다른 수용액의 접촉, 또는 또다른 설명적 예로서 여과에 의해 이루어질 수 있다. 상기 경우에, 생체 촉매 (현탁액) 은 전형적으로 생체 촉매가 니트릴 화합물과 접촉될 때 전형적으로 잔여 완충액을 여전히 함유할 것이다. 더 적은 잔여 완충액이 생체 촉매에 존재하면, 반응 혼합물 중 상기 완충액의 몰 농도에 대한 활성화 혼합물 중 완충액의 몰 농도의 더 높은 비율이 전형적으로 있을 수 있음이 당업자에 의해 이해된다.
건조 생체 촉매의 맥락에서 본원에 사용된 용어 "활성화" 는 일반적으로 건조 생체 촉매와 수용액을 혼합하여 생체 촉매 및 완충액을 포함하는 수성 혼합물을 생성하는 것을 나타낸다. 상기 혼합물은 또한 "활성화 혼합물" 로서 본원에 나타내어진다. 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라, 활성화 혼합물은 완충액과 수용액을 혼합하여 완충 수용액을 생성하고, 이후 완충 수용액에 건조 생체 촉매를 용해 또는 현탁시킴으로써 제조될 수 있다. 활성화 혼합물은, 또한 건조 생체 촉매와 완충액 성분, 특히 건조 완충액 성분을 혼합하고, 이후 혼합물에 물을 첨가하거나 물에 혼합물을 첨가하고, 완충액 성분을 용해시키는 것 뿐만 아니라 건조 생체 촉매를 용해 또는 재현탁시키는 것에 의해 또한 제조될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "반응 혼합물" 은 생체 촉매 및 니트릴 화합물 및/또는 아미드 화합물을 포함하는 수성 혼합물을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법 중 어느 하나에 따른 반응 혼합물은, 활성화 단계를 겪는 생체 촉매, 수용액 및 니트릴 화합물을 조합하여 생성될 수 있다. 전형적으로, 생체 촉매는 반응 혼합물에서 니트릴 화합물의 아미드 화합물로의 전환을 촉매작용한다. 따라서, 용어 "반응 혼합물" 은 전형적으로 반응 시작시, 수용액에서 생체 촉매가 먼저 니트릴 화합물에 접촉될 때, 및 전환이 중단 또는 종료된 이후지만 수용액, 생체 촉매 및 아미드 또는 니트릴 화합물이 여전히 혼합물에 존재할 때를 포함하여 전환 공정의 임의의 시간에, 물, 생체 촉매 및 니트릴 및/또는 아미드 화합물을 포함하는 혼합물을 나타낸다.
본원에서 사용된 용어 "전환의 종료 이전" 은, 반응 혼합물에서 니트릴의 아미드로의 전환이 여전히 계속되는 동안 임의의 시간을 나타낸다. 전형적으로 이는 반응 혼합물이 존재하고 전환이 아직 종료 또는 중단되지 않은 임의의 시간을 나타낸다.
생체 촉매가 본 발명의 건조 단계에 적용되어 건조 생체 촉매를 생성하기 전에 생체 촉매 현탁액 또는 용액에 완충액이 첨가될 수 있다는 것이 본원에 개시된 방법에서 또한 예상된다. 생체 촉매는 완충액이 첨가되기 전에 또한 세척될 수 있다. 건조 단계 이전 완충액을 첨가함으로써, 건조 생체 촉매는 건조 단계 이전에 첨가되는 건조 완충액 성분을 포함한다. 따라서, 완충액을 포함하는 건조 생체 촉매와 수용액을 접촉시킬 때, 완충액 성분은 용해되고, 이는 생체 촉매와 함께 활성화 혼합물을 생성한다. 또한, 본원에 개시된 방법에서 생체 촉매는 완충액으로 처리되고 이후 생체 촉매는 건조 단계에 적용되어 건조 생체 촉매를 생성하고, 이는 이후 완충 용액에 용해 또는 재현탁되어 활성화 혼합물을 생성한다는 것이 또한 예상된다.
생체 촉매가 본원에 개시된 방법에 따른 완충액에 의해 활성화되는 경우, 상기 활성화는 긴 기간을 필요로 하지 않는다. 바람직하게는, 상기 생체 촉매의 활성화는 약 1 분 이상, 더 바람직하게는 약 5 분 이상, 보다 더 바람직하게는 약 10 분 내지 약 10 시간, 보다 더 바람직하게는 약 20 분 내지 약 5 시간, 가장 바람직하게는 약 30 분 내지 약 2 시간 동안 수행된다. 활성화 혼합물을 생성하기 위해 건조 생체 촉매가 완충 수용액으로 처리될 때, 상기 활성화 혼합물은 전형적으로 생물전환에 직접 사용되고, 즉 수용액 및 니트릴 화합물과 직접 혼합되어 반응 혼합물을 생성한다. 다른 한편으로는, 생체 촉매가 건조 단계 이전에 완충 용액 또는 완충 염으로 활성화되는 경우, 건조 생체 촉매는 이후 수 개월 동안 저장된 이후 상기 활성화 생체 촉매와 수용액을 합쳐 활성화 혼합물을 생성하고, 상기 활성화 혼합물과 수용액 및 니트릴 화합물을 추가 혼합하여 반응 혼합물을 생성한다. 본 발명자들에 의해 밝혀진 바와 같이, 상기 생체 촉매는 저장 기간 동안 활성을 유의하게 상실하지 않는다. 이는 상기 활성화 변형물의 추가 이점으로 보여질 수 있다.
또한 본원에 개시된 방법에 의해, 활성화 혼합물에 포함된 완충액의 pKa 가 약 6 내지 약 9, 바람직하게는 약 6.5 내지 약 8 범위라는 것이 예상된다. 여기서, 완충액은 단일 성분을 포함할 수 있거나, 하나 초과의 완충액 성분의 혼합물일 수 있다. 또한 하나의 단일 성분은 하나 초과의 pKa 값을 가질 수 있음이 이해된다. 완충액은 전형적으로 이것이 pKa 가 약 6 내지 약 9 의 범위인 완충액 성분을 포함하는 경우, pKa 가 약 6 내지 약 9 범위이다. 예를 들어, 포스페이트는 3 개의 pKa 값 2.1, 7.2 및 12.7 을 갖는다. 포스페이트의 pKa 값 중 하나는 약 6 내지 약 9 의 범위 이내이므로, 포스페이트를 포함하는 완충액은 pKa 가 약 6 내지 약 9 범위인 완충액으로 이해될 수 있다.
활성화 혼합물은 pH 값이 약 6.6 내지 약 9, 바람직하게는 약 6.6 내지 약 8.8, 더 바람직하게는 약 6.7 내지 약 8.6, 보다 더 바람직하게는 약 6.8 내지 약 8.4, 더욱 더 바람직하게는 약 6.9 내지 약 8.2, 가장 바람직하게는 약 7 내지 약 8 인 것으로 또한 예상된다.
또한 상이한 완충액은 본원에 개시된 방법에서 사용되기에, 즉 생체 촉매의 NH아제 활성을 증가시키기에 매우 적합하다. 완충액이 무기 완충액 또는 유기 완충액을 포함함이 예상된다. 또한 완충액은 비술폰산 완충액 또는 카르복시산 완충액을 포함할 수 있음이 또한 예상된다. 본 발명에 사용될 수 있는 적합한 완충액은 포스페이트, 시트레이트, 카르보네이트, 2-[(2-히드록시-1,1-비스(히드록시메틸)에틸)아미노] 에탄술폰산 (TES), 1,4-피페라진디에탄술폰산 (PIPES), N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄술폰산 (ACES), 및 트리스(히드록시메틸) 아미노메탄 (TRIS), 및 이의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물을 포함할 수 있다. 특히, 완충액은 포스페이트 완충액 또는 시트레이트 완충액 또는 이의 조합을 포함한다. 바람직하게는, 완충액은 포스페이트 완충액이다.
또한 완충액은 약 10 mM 내지 약 1 M, 바람직하게는 약 20 mM 내지 약 500 mM, 더 바람직하게는 약 50 mM 내지 약 200 mM, 보다 더 바람직하게는 약 70 mM 내지 약 130 mM, 가장 바람직하게는 약 80 mM 내지 약 120 mM 의 활성화 혼합물 중의 농도인 것으로 예상된다.
또한 반응 혼합물 중 완충액 농도는 약 100 mM 이하, 바람직하게는 약 50 mM 이하, 더 바람직하게는 약 20 mM 이하, 보다 더 바람직하게는 약 10 mM 이하, 더욱 더 바람직하게는 약 5 mM 내지 약 1 pM, 더욱 더 바람직하게는 약 4 mM 내지 약 1 pM, 더욱 더 바람직하게는 약 3 mM 내지 약 1 pM, 더욱 더 바람직하게는 약 2 mM 내지 약 1 pM, 더욱 더 바람직하게는 약 1 mM 내지 약 1 pM, 더욱 더 바람직하게는 약 0.8 mM 내지 약 1 pM, 더욱 더 바람직하게는 약 0.5 mM 내지 약 1 pM, 더욱 더 바람직하게는 약 0.4 mM 내지 약 1 pM, 더욱 더 바람직하게는 약 0.3 mM 내지 약 1 pM, 더욱 더 바람직하게는 약 0.2 mM 내지 약 1 pM, 가장 바람직하게는 약 0.1 mM 내지 약 1 pM 인 것으로 예상된다.
또한 활성화 온도는 약 0 ℃ 내지 약 50 ℃, 바람직하게는 약 10 ℃ 내지 약 40℃, 더 바람직하게는 약 20℃ 내지 약 37℃ 범위인 것으로 예상된다.
그러나, 본 발명은 오로지 방법만을 포함하는 것은 아니고, 이는 또한 하기 용도를 포함한다.
니트릴 화합물로부터 아미드 화합물을 제조하기 위한 본원에 기재된 NH아제 및 아미다아제 생성 미생물의 용도.
NH아제 및 아미다아제 생성 미생물의 NH아제/아미다아제 활성 비율을 증가시키기 위한 건조법의 용도.
NH아제 및 아미다아제 생성 미생물의 아미다아제 활성을 감소시키기 위한 건조법의 용도.
본 발명의 방법의 맥락에서 본원에 기재된 구현예 및 정의는 필요한 부분만 약간 수정하여 본 발명의 용도에 동등하게 적용될 수 있다.
또다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득된 아미드 화합물 수용액을 제공한다. 상기 아미드 화합물 수용액은 바람직하게는 동일한 기관으로부터 수득된 아미드 화합물 수용액 (이는 그러나 니트릴 화합물과 접촉되기 전에 건조 단계에 의해 예비-처리되지 않음) 에 비하여 감소된 아크릴산 함량에 의해 특징지어진다. 특히 상기 아미드 화합물 수용액의 아크릴산의 농도는 1500 ppm 이하, 바람직하게는 1200 ppm 이하, 더 바람직하게는 1000 ppm 이하, 또한 바람직하게는 750 ppm 이하, 보다 더 바람직하게는 500 ppm 이하, 더욱 더 바람직하게는 300 ppm 이하, 더욱 더 바람직하게는 200 ppm 이하, 가장 바람직하게는 100 ppm 이하이고, 여기서 ppm 으로의 표시는 각각 중량부에 관한 것이고 각각 아미드 화합물 수용액의 총 중량에 대해 나타내어진다.
또한, 본 발명은 아크릴아미드 또는 폴리아크릴아미드 및 NH아제 및 아미다아제 생성 미생물을 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 미생물은 적어도 400 유닛의 NH아제/아미다아제 활성 비율 및/또는 참조 미생물과 비교했을 때 적어도 1.7 배로 증가되는 아미다아제 활성에 대한 NH아제 활성의 비율을 나타낸다.
맥락에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 본원에 사용된 바와 같이 및 첨부된 청구항에서, 단수 형태는 맥락이 명백하게 달리 나타내지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "작용제" 에 대한 언급은 상기 상이한 작용제 하나 이상을 포함하고, "방법" 에 대한 언급은 본원에 기재된 방법으로 개질 또는 치환될 수 있는 당업자에 공지된 동등한 단계 및 방법에 대한 언급을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 복수의 언급된 구성요소 사이의 접속어 "및/또는" 은 개별 및 조합된 옵션 모두를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 두 구성요소가 "및/또는" 에 의해 결합된 경우, 제 1 옵션은 제 2 구성요소가 없는 제 1 구성요소의 적용성을 나타낸다. 제 2 옵션은 제 1 구성요소가 없는 제 2 구성요소의 적용성을 나타낸다. 제 3 옵션은 제 1 및 제 2 구성요소 함께의 적용성을 나타낸다. 이러한 옵션 중 어느 하나는 상기 의미 내에 있고, 이에 따라 본원에 사용된 용어 "및/또는" 의 요건을 만족하는 것으로 이해된다. 옵션 중 하나 초과의 동시 적용성이 또한 상기 의미 내에 있고, 이에 따라 본원에 사용된 용어 "및/또는" 의 요건을 만족하는 것으로 이해된다.
달리 나타내지 않는 한, 일련의 구성 요소에 선행하는 용어 "적어도" 는 일련의 구성요소 모두를 나타내는 것으로 이해된다. 당업자는 단지 통상적 실험을 사용하여, 본원에 기재된 본 발명의 특정 구현예에 대한 많은 동등물을 인식하거나 알아낼 수 있을 것이다. 상기 동등물은 본 발명에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서 및 이하의 청구항 전반에 걸쳐, 맥락이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다" 및 변형 예컨대 "포함함" 및 "포함하는" 은, 나타낸 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 군의 내포를 시사하나 임의의 기타 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 군을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다. 본원에서 사용될 때 용어 "포함하는" 은 용어 "함유하는" 또는 때때로 본원에서 사용될 때 용어 "갖는" 으로 치환될 수 있다.
본원에서 기재된 바와 같은, "바람직한 구현예" 또는 "바람직한 양상" 은 "본 발명의 바람직한 구현예" 또는 "본 발명의 바람직한 양상" 을 의미한다. 또한 본원에 기재된 바와 같은 "구현예", "또다른 구현예", "양상", "또다른 양상" 은 "본 발명의 구현예", "본 발명의 또다른 구현예", "본 발명의 양상" 및 "본 발명의 또다른 양상" 을 각각 의미한다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학적 및 기술적 용어는 당업자에 의해 통상 이해되는 의미를 가질 것이다. 본 발명의 방법 및 기술은 일반적으로 업계에 익히 공지된 통상적 방법에 따라 수행된다. 당업자는 단지 통상적 실험을 사용하여, 본원에 기재된 본 발명의 특정 구현예에 대한 많은 동등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 상기 동등물은 본 발명에 의해 포함되는 것이 의도된다.
여러 문헌이 본 명세서의 내용 전체에 걸쳐 언급된다. 본원에 언급된 문헌 각각 (모든 특허, 특허 출원, 과학 문헌, 제조사 사양, 지시사항 등을 포함) 은, 위에서든 아래에서든지, 본원에서 그 전체가 참조 인용된다. 본원에서 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 상기 개시물보다 선행하는 권리가 없다는 인정으로 해석되지 않는다.
도면의 간단한 설명
도 1: 생체 촉매로서 분무 건조된 로도코쿠스 로도크로우스 NCIMB 41164 를 적용하는, 아크릴로니트릴의 아크릴아미드로의 생물전환에서 w/w % 로의 아크릴아미드 (ACM, 어두운 회색으로 도시됨) [%] 및 아크릴로니트릴 (ACN, 밝은 회색으로 도시됨) [%] 농도의 시간 경과. 건조 생체 촉매는 분무 건조 이후 물에 재현탁된다. 3.36 g 의 건조 생체 촉매 (배치 Ch10) 의 총량이 사용되었고, 이는 생물전환 시작 전에 측정된 116 kU/g 의 NH아제 활성을 가졌다. 반응은 26 ℃ 에서 4 L 규모 (L = 리터) 로 수행되었다. 반응의 시작시에, 2.4 g 의 건조 생체 촉매에 상응하는 재현탁 생체 촉매가 반응기에 첨가되었다. 생물전환의 시작 0 h 내지 1 h 이후의 ACN 농도는 반응기에 ACN 을 공급함으로써 2 w/w % 로 유지되었다. 생물전환의 시작 1 시간 이후에, 0.96 g 건조 생체 촉매에 상응하는 재현탁 생체 촉매가 반응기에 첨가되었다. 생물전환의 시작 1 h 이후, ACN 농도는 총량 1553 g 의 아크릴로니트릴이 반응기에 첨가될 때까지 0.8 w/w % 로 유지되었다. 전체 전환 (< 100 ppm 잔여 ACN) 까지 총 반응 시간은 13.78 h 이었다.
도 2: 생체 촉매로서 분무 건조된 로도코쿠스 로도크로우스 NCIMB 41164 를 적용하는 아크릴로니트릴의 아크릴아미드로의 생물전환에서 w/w % 로의 아크릴아미드 (ACM, 어두운 회색으로 도시됨) [%] 및 아크릴로니트릴 (ACN, 밝은 회색으로 도시됨) [%] 농도의 시간 경과. 건조 생체 촉매는 분무 건조 이후 33 mL 의 100 mM 포스페이트 완충액 (pH 7.0) 에 재현탁되고, 이는 본원에 개시된 활성화 단계에 해당한다. 활성화 단계는 1.0 h 동안 수행되었다. 총량 3.36 g 의 건조 생체 촉매 (배치 Ch10) 가 사용되었고, 이는 생물전환의 시작 전에 측정된 116 kU/g 의 NH아제 활성을 가졌다. 반응은 26 ℃ 에서 4 L 규모 (L = 리터) 로 수행되었다. 반응의 시작시에, 2.4 g 건조 생체 촉매에 상응하는 재현탁 생체 촉매가 반응기에 첨가되었다. 생물전환의 시작 0 h 내지 1 h 이후 ACN 농도는 반응기에 ACN 을 공급함으로써 2 w/w % 로 유지되었다. 생물전환의 시작 1 h 이후에, 0.96 g 건조 생체 촉매에 상응하는 재현탁 생체 촉매가 반응기에 첨가되었다. 생물전환 시작 이후 1 h 후에, ACN 농도는 총량 1553 g 의 아크릴로니트릴이 반응기에 첨가될 때까지 0.8 % w/w 로 유지되었다. 전체 전환 (< 100 ppm 잔여 ACN) 까지 총 반응 시간은 2.31 h 이었다.
도 3: 생체 촉매로서 분무 건조된 로도코쿠스 로도크로우스 NCIMB 41164 를 적용하는 아크릴로니트릴의 아크릴아미드로의 생물전환에서 w/w % 로의 아크릴아미드 (ACM, 어두운 회색으로 도시됨) [%] 및 아크릴로니트릴 (ACN, 밝은 회색으로 도시됨) [%] 농도의 시간 경과. 건조 생체 촉매는 분무 건조 이후 물에 재현탁되었다. 총량 3.36 g 의 건조 생체 촉매 (배치 Ch10) 가 사용되었고, 이는 생물전환의 시작 전에 측정된 116 kU/g 의 NH아제 활성을 가졌다. 반응은 26 ℃ 에서 4 L 규모 (L = 리터) 로 수행되었다. 생체 촉매 부가 직전에, 33 mL 의 100 mM 포스페이트 완충액 (pH 7.0) 이 반응기에 첨가되었고, 이는 도 2 에 도시된 실험의 활성화 단계에서 사용된 완충액의 양에 해당한다. 반응의 시작시에, 2.4 g 의 건조 생체 촉매에 상응하는 재현탁 생체 촉매가 반응기에 첨가되었다. 생물전환의 시작 0 h 내지 1 h 이후 ACN 농도는 반응기에 ACN 을 공급함으로써 2 w/w % 로 유지되었다. 생물전환의 시작 1 h 이후, 0.96 g 건조 생체 촉매에 상응하는 재현탁 생체 촉매가 반응기에 첨가되었다. 생물전환의 시작 이후 1 h 후에, ACN 농도는 총량 1553 g 의 아크릴로니트릴이 반응기에 첨가될 때까지 0.8 w/w % 로 유지되었다. 완전 전환 (< 100 ppm 잔여 ACN) 까지 총 반응 시간은 11.98 h 이었다.
도 4: 생체 촉매로서 분무 건조된 로도코쿠스 로도크로우스 NCIMB 41164 를 적용하는 아크릴로니트릴의 아크릴아미드로의 생물전환에서 w/w % 로의 아크릴아미드 (ACM, 어두운 회색으로 도시됨) [%] 및 아크릴로니트릴 (ACN, 밝은 회색으로 도시됨) [%] 농도의 시간 경과. 건조 생체 촉매는 30 mL 의 100 mM 포스페이트 완충액 (pH 7.0) 에 재현탁되었고, 이는 본원에 개시된 활성화 단계에 상응한다. 활성화 단계는 0.5h 동안 수행되었다. 1.8 g 의 건조 생체 촉매 (배치 Ch 10) 가 사용되었고, 이는 생물전환의 시작 전에 측정된 116 kU/g 의 NH아제 활성을 가졌다. 반응은 23 ℃ 에서 4 L 규모 (L = 리터) 에서 수행되었다. 반응의 시작시에, 1.8 g 의 건조 생체 촉매에 상응하는 재현탁 생체 촉매가 반응기에 첨가되었다. 생물전환의 시작 이후 ACN 농도는 총량 1553 g 의 아크릴로니트릴이 반응기에 첨가될 때까지, 반응기에 ACN 을 공급함으로써 1 w/w % 로 유지되었다. 완전 전환 (< 100 ppm 잔여 ACN) 까지 총 반응 시간은 7.13 h 이었다.
도 5: 생체 촉매로서 분무 건조된 로도코쿠스 로도크로우스 NCIMB 41164 를 적용하는 아크릴로니트릴의 아크릴아미드로의 생물전환에서 w/w % 로의 아크릴아미드 (ACM, 어두운 회색으로 도시됨) [%] 및 아크릴로니트릴 (ACN, 밝은 회색으로 도시됨) [%] 농도의 시간 경과. 건조 생체 촉매는 물에 재현탁되었다. 총량 1.29 g 의 건조 생체 촉매 (배치 V3) 가 사용되었고, 이는 생물전환 시작 전에 측정된 172 kU/g 의 NH아제 활성을 가졌다. 반응은 26 ℃ 에서 4 L 규모 (L = 리터) 에서 수행되었다. 반응의 시작시에, 0.92 g 의 건조 생체 촉매에 상응하는 재현탁 생체 촉매가 반응기에 첨가되었다. 생물전환의 시작 0 h 내지 1 h 이후 ACN 농도는 반응기에 ACN 을 공급함으로써 2 w/w % 로 유지되었다. 생물전환의 시작 1 h 이후, 0.37 g 건조 생체 촉매에 상응하는 재현탁 생체 촉매가 반응기에 첨가되었다. 생물전환의 시작 이후 1 h 후에, ACN 농도는 총량 1553 g 의 아크릴로니트릴이 반응기에 첨가될 때까지 0.8 w/w % 로 유지되었다. 완전 전환 (< 100 ppm 잔여 ACN) 은 20 h 이후 달성되지 않았다.
도 6: 생체 촉매로서 분무 건조된 로도코쿠스 로도크로우스 NCIMB 41164 를 적용하는 아크릴로니트릴의 아크릴아미드로의 생물전환에서 w/w % 로의 아크릴아미드 (ACM, 어두운 회색으로 도시됨) [%] 및 아크릴로니트릴 (ACN, 밝은 회색으로 도시됨) [%] 농도의 시간 경과. 건조 생체 촉매는 30 mL 의 100 mM 포스페이트 완충액 (pH 8.0) 에 재현탁되었고, 이는 활성화 단계에 해당한다. 활성화 단계는 0.5 h 동안 수행되었다. 총량 1.29 g 의 건조 생체 촉매 (배치 V3) 이 사용되었고, 이는 생물전환의 시작 전에 측정된 172 kU/g 의 NH아제 활성을 가졌다. 반응은 26 ℃ 에서 4 L 규모 (L = 리터) 로 수행되었다. 반응의 시작시에, 0.92 g 의 건조 생체 촉매에 상응하는 재현탁 생체 촉매가 반응기에 첨가되었다. 생물전환의 시작 0 h 내지 1 h 이후 ACN 농도는 반응기에 ACN 을 공급함으로써 2 w/w % 로 유지되었다. 생물전환의 시작 1 h 이후, 0.37 g 건조 생체 촉매에 상응하는 재현탁 생체 촉매가 반응기에 첨가되었다. 생물전환의 시작 이후 1 h 후에, ACN 농도는 총량 1553 g 의 아크릴로니트릴이 반응기에 첨가될 때까지 0.8 w/w % 로 유지되었다. 완전 전환 (< 100 ppm 잔여 ACN) 까지 총 반응 시간은 4.4 h 이었다.
도 7: 생체 촉매로서 분무 건조된 로도코쿠스 로도크로우스 NCIMB 41164 를 적용하는 아크릴로니트릴의 아크릴아미드로의 생물전환에서 w/w % 로의 아크릴아미드 (ACM, 어두운 회색으로 도시됨) [%] 및 아크릴로니트릴 (ACN, 밝은 회색으로 도시됨) [%] 농도의 시간 경과. 건조 생체 촉매는 30 mL 의 100 mM 시트레이트 완충액 (pH 7.0) 에 재현탁되었고, 이는 활성화 단계에 해당한다. 활성화 단계는 0.5 h 동안 수행되었다. 총량 1.29 g 의 건조 생체 촉매 (배치 V3) 이 사용되었고, 이는 생물전환의 시작 전에 측정된 172 kU/g 의 NH아제 활성을 가졌다. 반응은 26 ℃ 에서 4 L 규모 (L = 리터) 로 수행되었다. 반응의 시작시에, 0.92 g 의 건조 생체 촉매에 상응하는 재현탁 생체 촉매가 반응기에 첨가되었다. 생물전환의 시작 0 h 내지 1 h 이후 ACN 농도는 반응기에 ACN 을 공급함으로써 2 w/w % 로 유지되었다. 생물전환의 시작 1 h 이후, 0.37 g 건조 생체 촉매에 상응하는 재현탁 생체 촉매가 반응기에 첨가되었다. 생물전환의 시작 이후 1 h 후에, ACN 농도는 총량 1553 g 의 아크릴로니트릴이 반응기에 첨가될 때까지 0.8 w/w % 로 유지되었다. 완전 전환 (< 100 ppm 잔여 ACN) 까지 총 반응 시간은 7.25 h 이었다.
실시예
하기 실시예는 본원에 제공된 발명을 추가로 기재 및 예시하나, 본원에 정의된 임의의 상세한 설명 또는 구현예로 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
니트릴 화합물로부터의 아미드 화합물 제조와 관련하여 3 가지 실험을 수행하였다. 제조를 위한 접종은 생체 촉매, 상기 생체 촉매의 농축물, 분무-건조 생체 촉매 또는 동결-건조 생체 촉매를 함유하는 발효 브로쓰엿다. 농축물은, 아미드 화합물로 전환되는 상기 니트릴 화합물과 접촉되기 전에 건조 단계에 의한 이의 예비-처리 이전의 생체 촉매의 형태이다. 농축물은 액체 발효 브로쓰를 감소시킴으로써, 예를 들어 원심 분리에 의해 농축되는 것을 의미한다. 따라서, 본 실시예에 사용되는 발효 브로쓰, 농축물 및 건조 분말은 동일한 생체 촉매를 함유한다.
NH아제 및 아미다아제 사이의 활성 비율 및 NH아제 활성은 통상 공지된 과정에 따라 측정되었다. 설정에서 NH아제 활성은, 모든 설정이 거의 동일한 NH아제 활성에 의해 반영되는 바와 같이 동량의 생체 촉매를 함유한다는 것을 의미한다. 따라서, 조건은 발효 브로쓰, 농도 및 건조 분말과 동일하였다. 또한, 아크릴산의 농도가 측정되었다. 이러한 데이터는 아래 표 1 및 생물전환 반응의 끝에 요약되어 있다.
실시예 1: 물 및 20 g 의 ACN 을 반응기에 넣었다. 물 + 생체 촉매의 총량이 2447 g 이도록 물의 양을 조절하였다. 생체 촉매의 3 가지 상이한 형태를 독립적 실행에서 사용하였다:
(i) 로도코쿠스 로도크로우스 NCIMB 41164 를 함유하는 발효 브로쓰. 물 함량: 88.2% (w/w).
(ii) (i) 로부터의 발효 브로쓰가 원심 분리에 의해 농축된 농축물. 물 함량: 83.5% (w/w).
(iii) (ii) 로부터의 농축물의 분무 건조에 의해 수득된 건조 분말. 건조 분말의 잔여 물 함량: 8.05% (w/w). 115 ℃ 기체 주입구 온도 및 65 ℃ 기체 배출구 온도에서 분무 건조를 작업함.
반응이 시작되는 반응기에 생체 촉매를 첨가하였다. 반응 동안, 1533 g 의 추가적 아크릴로니트릴을 첨가하여, 마지막에 전체 반응 배치 크기는 4000 g 이었다. 온도를 반응 동안 26 ℃ 에서 일정하게 유지하였다. ACN 농도를 온라인 FTIR 에 의해 측정하고, ACN 의 첨가 속도를 조절하여, 반응 혼합물 중 ACN 농도를 전체 ACN 이 반응에 첨가될 때까지 0.8 ± 0.1 % (w/w) 로 일정하게 유지하였다. 전환으로 인해 ACN 농도가 100 ppm 미만으로 감소된 이후 반응을 중단하였다. 반응의 마지막에, 모든 실행에서 아크릴아미드 (ACM)-농도는 51% (w/w) 이상이었다.
실시예 2: 반응기에 물 및 60 g 의 ACN 을 넣었다. 물 + 생체 촉매의 총량이 2447 g 이도록 물의 양을 조절하였다. 3 가지 상이한 형태의 생체 촉매를 독립적 실행에서 사용하였다:
(i) 로도코쿠스 로도크로우스 NCIMB 41164 를 함유하는 발효 브로쓰. 물 함량: 91.8% (w/w).
(ii) (i) 의 발효 브로쓰가 원심 분리에 의해 농축된 농축물. 물 함량: 85.3% (w/w).
(iii) (ii) 로부터의 농축물의 분무 건조에 의해 수득된 건조 분말. 건조 분말의 잔여 물 함량: 6.8% (w/w). 115 ℃ 기체 주입구 온도 및 60 ℃ 기체 배출구 온도에서 분무 건조를 작업함.
반응이 시작되는 반응기에 생체 촉매를 첨가하였다. 반응 동안, 1493 g 의 추가 아크릴로니트릴을 첨가하여, 전체 반응 배치 크기는 마지막에 4000 g 이었다. 반응 동안 26 ℃ 에서 일정하게 온도를 유지하였다. ACN 농도를 온라인 FTIR 에 의해 측정하고, ACN 의 첨가 속도를 조절하여, 반응 혼합물 중 ACN 농도를 제어하였다. 반응의 첫 번째 시간 동안, ACN 농도를 2.0 % ± 0.15% (w/w) 에서 일정하게 유지한 후, 전체 ACN 이 반응에 첨가될 때까지 이를 0.8% ± 0.15% (w/w) 에서 일정하게 유지하였다. ACN 농도가 전환으로 인해 100 ppm 미만으로 감소된 이후 반응을 중단하였다. 반응의 마지막에, ACM-농도는 매 실행에서 50% (w/w) 이상이었다.
실시예 3: 물 및 60 g 의 ACN 을 반응기에 넣었다. 물 + 생체 촉매의 총량이 2447 g 이도록 물의 양을 조절하였다. 2 가지 상이한 형태의 생체 촉매를 독립적 실행에서 사용하였다:
(i) 로도코쿠스 로도크로우스 NCIMB 41164 를 함유하는 발효 브로쓰가 원심분리에 의해 농축되는 농축물. 물 함량: 81% (w/w).
(ii) (i) 로부터의 농축물의 동결 건조에 의해 수득된 건조 분말. 건조 분말의 잔여 물 함량: 6.8% (w/w).
반응이 시작되는 반응기에 생체 촉매를 첨가하였다. 반응 동안, 1493 g 의 추가 아크릴로니트릴을 첨가하여, 마지막에 전체 반응 배치 크기는 4000 g 이었다. 반응 동안 26 ℃ 에서 온도를 일정하게 유지하였다. ACN 농도를 온라인 FTIR 에 의해 측정하고, ACN 의 첨가 속도를 조절하여 반응 혼합물 중 ACN 농도를 제어하였다. 반응의 첫 번째 시간 동안, ACN 농도를 2.0% ± 0.15% (w/w) 에서 일정하게 유지한 후, 이를 전체 ACN 이 반응에 첨가될 때까지 0.8% ± 0.15% (w/w) 에서 일정하게 유지하였다. ACN 농도가 전환으로 인해 100 ppm 미만으로 감소된 이후 반응을 중단하였다. 반응의 마지막에, ACM-농도는 매 실행에서 50% (w/w) 이상이었다.
표 1
상기 미생물에 의한 생물전환에 이후 적용되는 니트릴 화합물과 접촉되기 전에 건조 단계에 의해 예비-처리된 미생물은 NH아제/아미다아제 활성과 관련하여 가장 높은 값을 갖는다는 것이 명백하다. 각 반응 (설정) 에서 거의 동량의 생체 촉매 (각각의 사용된 생체 촉매 형태, 즉 발효/농축물/분무-건조물/동결-건조물의 NH아제 활성에 의해 측정됨) 가 사용되었다는 사실을 고려하면, 건조 단계, 즉 니트릴 화합물과 접촉되기 전에 생체 촉매를 건조 단계에 적용하는 것은 부산물 아크릴산의 양에 상당히 영향을 준다는 것이 명백하다. 이는 건조 단계로 인해, 아미다아제 활성은 상기 건조 미생물이 가장 우측 열로부터 명백한 적은 아크릴산을 부산물로서 갖는 아미드 화합물을 생성할 정도로 감소된다는 것을 의미한다. 요컨대, 반응 매개변수가 상이한 설정 사이에서 동일하게 유지되기 때문에, 아크릴산 양의 감소에 있어서의 개선은 건조 단계의 결과로 간주될 수 있음이 명백하다.
실시예 4: Christ Alpha 2-4 LSCplus 실험실 동결 건조기에서 농축된 발효 브로쓰의 냉동건조 (lyophilisation) 에 의해 동결 건조 분말을 수득하였다. -20 ℃ 에서 밤새 농축물을 먼저 동결시키고, 이후 건조시켰다. 건조 동안 선반 온도는 -25 ℃ 였고, 컨덴서 온도는 -82 ℃ 였고, 챔버 압력은 0.25 mbar 이었다.
반응기에 물 및 18 g 의 ACN 을 넣었다. 물의 양을 조절하여, 물 + 생체 촉매의 총량이 1835 g 이었다. 2 가지 상이한 형태의 생체 촉매를 독립적 실행에서 사용하였다:
(i) 로도코쿠스 로도크로우스 J1 을 함유하는 발효 브로쓰. 물 함량: 96.1% (w/w).
(ii) 83.6 % (w/w) 의 물 함량까지의 원심 분리에 의한 (i) 의 농축 및 농축물의 동결 건조에 의해 수득된 건조 분말.
반응이 시작되는 반응기에 생체 촉매를 첨가하였다. 반응 동안, 1147 g 의 추가 아크릴로니트릴을 첨가하여, 전체 반응 배치 크기는 마지막에 3000 g 이었다. 반응 동안 23 ℃ 에서 일정하게 온도를 유지하였다. ACN 농도를 온라인 FTIR 에 의해 측정하였고, ACN 의 첨가 속도를 조절하여, 반응 혼합물 중 ACN 농도를 전체 ACN 이 반응에 첨가될 때까지 1.0 ± 0.1% (w/w) 에서 일정하게 유지하였다. ACN 농도가 전환으로 인해 100 ppm 미만으로 감소된 이후 반응을 중단하였다. 반응의 마지막에, ACM 농도는 매 실행에서 51% (w/w) 이상이었다.
실시예 5: 반응 혼합물 중 ACN 농도가 반응 동안 0.3 ± 0.1% (w/w) 에서 제어된 것을 제외하고는, 상기 실시예 4 에서와 같이 실험을 수행하였다.
실시예 4-5 로부터의 결과를 아래 표 2 에 나타냈다.
표 2
실시예 6: 분무 건조 생체 촉매의 활성화
원심 분리 튜브 (Falcon®) 에 분무 건조 생체 촉매를 칭량하고, 본원에 개시된 활성화 단계를 위해 30 ml 완충액에 현탁시켰다. 달리 나타내지 않는 한, 상기 완충액은 100 mM 포스페이트 완충액, pH 7.0 이었다. 생체 촉매는 실온에서 0.5 h 동안 완충-처리된다. 이후 바이오매스 (생체 촉매) 현탁액을 반응기에 수송하고, 1h 동안 추가로 인큐베이션하였다. 반응기에 대한 바이오매스 현탁액의 부가 이후, 원심분리 튜브를 물로 헹구고, 용매를 또한 반응기에 수송하였다. 이러한 양의 물은 반응기에 칭량된 물로 고려된다.
실시예 7: 생물전환에 일반적인 프로토콜
냉각을 위한 외부 순환 루프를 갖는 교반 탱크 반응기 (rpm = 250, 부피 V = 4 L) 에서 아크릴로니트릴의 수화를 일반적으로 수행한다. 이러한 목적으로, 2.4 L 의 물 뿐만 아니라 생체 촉매를 반응기에 충전한다. 바이오매스를 로도코쿠스 로도크로우스 (이는 사전에 물에 현탁됨) 의 분무 건조 세포로서 첨가한다. 본원에 기재된 바와 같이, 본원에 개시된 활성화 단계에 따라 완충액에 분무 건조 세포를 또한 직접 현탁시킬 수 있다. 반응을 시작하기 위해, 공정 제어 시스템을 사용하여 교반 탱크 반응기에 아크릴로니트릴을 투여한다. 0.5 내지 5 w/w % 의 일정한 농도의 아크릴로니트릴을, 공정 제어 장치 (Labview) 와 직접 커뮤니케이션하는 온라인 푸리에 변환 적외선 (FTIR: Fourier Transform Infrared) 분석의 사용에 의해 조절한다. 20 내지 29 ℃ 에서 반응 온도를 일정하게 유지한다. 1553 g 아크릴로니트릴의 첨가 이후 아크릴로니트릴의 투여를 중단한다. 잔여 아크릴로니트릴의 완전한 전환 이후, 즉 100 ppm 미만의 잔여 ACN 농도가 달성되고 52 w/w % 아크릴아미드를 달성할 때, 반응을 종료한다.
실시예 8: HPLC 에 의해 수득된 아크릴아미드 수용액 중 아크릴산, 아크릴아미드, 아크릴산 및 아크릴로니트릴의 농도의 측정
아크릴아미드, 아크릴산 및 아크릴로니트릴의 함량을 측정하기 위해 하기 조건을 적용하였다:
컬럼:
Aqua C18, 250*4.6 mm (Phenomenex)
가드 컬럼:
C18 Aqua
온도:
40 ℃
유속:
1.00 ml/min
주입 부피:
1.0 ㎕
검출:
UV 검출기, 파장 210 nm
중단 시간:
8.0 분
후속 시간:
0.0 분
최대 압력:
250 bar
용리액 A:
10 mM KH2PO4, pH 2.5
용리액 B:
아세토니트릴
구배:
매트릭스:
발효 브로쓰, 생물전환 혼합물
샘플을 0.22 ㎛ 를 통해 여과함
피분석물:
실시예 9
아크릴로니트릴의 아크릴아미드로의 생물전환 반응에, 배치 Ch10 의 분무 건조 로도코쿠스 로도크로우스 (NCIMB 41164) 를 사용하였다. 생물전환 반응을 실시예 7 의 프로토콜에 따라 수행하였다.
실행 1 (도 1 에 도시됨) 에서, 물에 재현탁된 3.36 g 생체 촉매를 사용하였다 (2.4 g 의 생체 촉매를 생물전환의 시작시에 첨가하고, 0.96 g 의 생체 촉매를 1 h 이후 첨가하였음). 실행 2 (도 2 에 도시됨) 에서, 본 발명에 따라 100 mM 포스페이트 완충액 (pH 7.0) 에 의해 활성화되는 3.36 g 생체 촉매 (2.4 g 생체 촉매를 생물전환 시작시에 첨가하고, 0.96 g 생체 촉매를 1 h 이후 첨가함) 를 사용하였다. 활성화를 실시예 6 에 따라 수행하였다. 실행 3 (도 3 에 도시됨) 에서, 물에 재현탁된 3.36 g 생체 촉매를 사용 (2.4 g 생체 촉매를 생물전환의 시작시에 첨가하고, 0.96 g 생체 촉매를 1 h 이후 첨가함) 하였으나, 실행 2 의 활성화 단계에서 사용하는 포스페이트 완충액 동량을 생체 촉매의 부가 전에 반응기에 직접 첨가하였다. 실행 4 (도 4 에 도시됨) 에서, 실시에 6 에 따라 100 mM 포스페이트 완충액 (pH 7.0) 으로 완충-처리되는 1.8 g 생체 촉매 (1.8 g 생체 촉매를 생물전환의 시작시에 첨가함) 를 사용하였다. 결과를 아래 표에 열거한다.
실행 2 로부터 볼 수 있는 바와 같이 (도 2), 포스페이트 완충액을 사용한 건조 생체 촉매의 활성화는 13.78 h (실행 1, 도 1) 로부터 2.31 h 로 총 반응 시간을 감소시킨다. 실행 3 (도 3) 은 건조 생체 촉매의 활성화 없는 반응 혼합물에 대한 포스페이트 완충액의 부가는 실행 1 에 비해 반응 시간에 거의 영향을 주지 않음을 보여준다. 실행 4 (도 4) 는 건조 생체 촉매가 포스페이트 완충액을 사용하여 활성화된 경우 생체 촉매의 양이 3.36 g 으로부터 1.8 g 으로 감소될 수 있는 한편, 총 반응 시간은 실행 1 에서와 같이 3.36 g 의 비완충-처리된 생체 촉매를 사용하는 것보다 여전히 적음을 입증한다.
실시예 10:
아크릴로니트릴의 아크릴아미드로의 생물전환 반응에 배치 V3 의 분무 건조된 로도코쿠스 로도크로우스 (NCIMB 41164) 를 사용하였다. 생물전환 반응을 실시예 7 의 프로토콜에 따라 수행하였다.
실행 5 (도 5 에 도시됨) 에서, 물에 재현탁된 1.29 g 생체 촉매를 사용하였다 (0.92 g 생체 촉매를 생물전환의 시작시에 첨가하고, 0.37 g 의 생체 촉매를 1 h 이후 첨가함). 실행 6 (도 6 에 도시됨) 에서, 본원에 개시된 바와 같은 100 mM 포스페이트 완충액 (pH 8.0) 에 의해 활성화된 1.29 g 생체 촉매 (0.92 g 생체 촉매를 생물전환의 시작시에 첨가하였고, 0.37 g 생체 촉매를 1 h 이후에 첨가하였음) 를 사용하였다. 실시예 6 에 따라 활성화를 수행하였다. 실행 7 (도 7 에 도시됨) 에서, 100 mM 시트레이트 완충액 (pH 7.0) 에 의해 활성화된 1.29 g 생체 촉매 (0.92 g 생체 촉매를 생물전환의 시작시에 첨가하였고, 0.37 g 생체 촉매를 1 h 이후 첨가하였음) 를 사용하였다. 결과를 아래 표에 열거한다.
실행 6 및 7 에서 볼 수 있는 바와 같이 (도 6 및 7), 포스페이트 완충액 (100 mM, pH 8.0) 및 시트레이트 완충액 (100 mM, pH 7.0) 에 의한 배치 V3 의 로도코쿠스 로도크로우스 (NCIMB 41164) 의 활성화 단계 모두는, 20 h 이후 불완전 전환으로부터 각각 4.39 h 및 7.25 h 이후 완전 전환으로의 총 반응 시간의 극적인 감소를 야기한다.
SEQUENCE LISTING
<110> BASF SE
<120> Means and methods for producing amide compounds with less acrylic
acid
<130> BAS15078PCT
<150> EP14003378.8
<151> 2014-09-30
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 612
<212> DNA
<213> Rhodococcus rhodochrous
<220>
<223> alpha-subunit of nitrile hydratase of Rhodococcus rhodochrous
<400> 1
gtgagcgagc acgtcaataa gtacacggag tacgaggcac gtaccaaggc gatcgaaacc 60
ttgctgtacg agcgagggct catcacgccc gccgcggtcg accgagtcgt ttcgtactac 120
gagaacgaga tcggcccgat gggcggtgcc aaggtcgtgg ccaagtcctg ggtggaccct 180
gagtaccgca agtggctcga agaggacgcg acggccgcga tggcgtcatt gggctatgcc 240
ggtgagcagg cacaccaaat ttcggcggtc ttcaacgact cccaaacgca tcacgtggtg 300
gtgtgcactc tgtgttcgtg ctatccgtgg ccggtgcttg gtctcccgcc cgcctggtac 360
aagagcatgg agtaccggtc ccgagtggta gcggaccctc gtggagtgct caagcgcgat 420
ttcggtttcg acatccccga tgaggtggag gtcagggttt gggacagcag ctccgaaatc 480
cgctacatcg tcatcccgga acggccggcc ggcaccgacg gttggtccga ggaggagctg 540
acgaagctgg tgagccggga ctcgatgatc ggtgtcagta atgcgctcac accgcaggaa 600
gtgatcgtat ga 612
<210> 2
<211> 203
<212> PRT
<213> Rhodococcus rhodochrous
<220>
<223> alpha-subunit of nitrile hydratase of Rhodococcus rhodochrous
<400> 2
Val Ser Glu His Val Asn Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys
1 5 10 15
Ala Ile Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala
20 25 30
Val Asp Arg Val Val Ser Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly
35 40 45
Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys
50 55 60
Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr Ala Ala Met Ala Ser Leu Gly Tyr Ala
65 70 75 80
Gly Glu Gln Ala His Gln Ile Ser Ala Val Phe Asn Asp Ser Gln Thr
85 90 95
His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val
100 105 110
Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser Arg
115 120 125
Val Val Ala Asp Pro Arg Gly Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe Asp
130 135 140
Ile Pro Asp Glu Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Ile
145 150 155 160
Arg Tyr Ile Val Ile Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser
165 170 175
Glu Glu Glu Leu Thr Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly Val
180 185 190
Ser Asn Ala Leu Thr Pro Gln Glu Val Ile Val
195 200
<210> 3
<211> 690
<212> DNA
<213> Rhodococcus rhodochrous
<220>
<223> beta-subunit of nitrile hydratase of Rhodococcus rhodochrous
<400> 3
atggatggta tccacgacac aggcggcatg accggatacg gaccggtccc ctatcagaag 60
gacgagccct tcttccacta cgagtgggag ggtcggaccc tgtcaattct gacttggatg 120
catctcaagg gcatatcgtg gtgggacaag tcgcggttct tccgggagtc gatggggaac 180
gaaaactacg tcaacgagat tcgcaactcg tactacaccc actggctgag tgcggcagaa 240
cgtatcctcg tcgccgacaa gatcatcacc gaagaagagc gaaagcaccg tgtgcaagag 300
atccttgagg gtcggtacac ggacaggaag ccgtcgcgga agttcgatcc ggcccagatc 360
gagaaggcga tcgaacggct tcacgagccc cactccctag cgcttccagg agcggagccg 420
agtttctctc tcggtgacaa gatcaaagtg aagagtatga acccgctggg acacacacgg 480
tgcccgaaat atgtgcggaa caagatcggg gaaatcgtcg cctaccacgg ctgccagatc 540
tatcccgaga gcagctccgc cggcctcggc gacgatcctc gcccgctcta cacggtcgcg 600
ttttccgccc aggaactgtg gggcgacgac ggaaacggga aagacgtagt gtgcgtcgat 660
ctctgggaac cgtacctgat ctctgcgtga 690
<210> 4
<211> 229
<212> PRT
<213> Rhodococcus rhodochrous
<220>
<223> beta-subunit of nitrile hydratase of Rhodococcus rhodochrous
<400> 4
Met Asp Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val
1 5 10 15
Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg
20 25 30
Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Ile Ser Trp Trp
35 40 45
Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val
50 55 60
Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu
65 70 75 80
Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His
85 90 95
Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Lys Pro Ser
100 105 110
Arg Lys Phe Asp Pro Ala Gln Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His
115 120 125
Glu Pro His Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu
130 135 140
Gly Asp Lys Ile Lys Val Lys Ser Met Asn Pro Leu Gly His Thr Arg
145 150 155 160
Cys Pro Lys Tyr Val Arg Asn Lys Ile Gly Glu Ile Val Ala Tyr His
165 170 175
Gly Cys Gln Ile Tyr Pro Glu Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly Asp Asp
180 185 190
Pro Arg Pro Leu Tyr Thr Val Ala Phe Ser Ala Gln Glu Leu Trp Gly
195 200 205
Asp Asp Gly Asn Gly Lys Asp Val Val Cys Val Asp Leu Trp Glu Pro
210 215 220
Tyr Leu Ile Ser Ala
225
Claims (30)
- 니트릴 화합물과 니트릴 히드라타아제 (NH아제) 및 아미다아제 생성 미생물을 접촉시키는 것을 포함하는, 니트릴 화합물로부터의 아미드 화합물 제조 방법으로서, 상기 미생물이 상기 니트릴 화합물과 접촉되기 전에 건조 단계에 의해 예비-처리되는 제조 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 미생물의 아미다아제 활성에 대한 NH아제 활성의 비율이 참조 미생물과 비교했을 때 증가되는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 미생물의 아미다아제 활성에 대한 NH아제 활성의 비율이 참조 미생물과 비교했을 때 적어도 1.4, 1.5, 1.6 또는 1.7 배로 증가되는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 미생물의 NH아제 활성에 대한 아미다아제 활성의 비율이 참조 미생물과 비교했을 때 적어도 0.7 또는 0.6 배로 감소되는 방법.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 400 이상의 NH아제/아미다아제 활성 비율을 나타내는 방법.
- 하기 단계를 포함하는, 니트릴 화합물로부터의 아미드 화합물 제조 방법:
a) NH아제 및 아미다아제 생성 미생물을 건조시키는 단계; 및
b) 니트릴 화합물과 상기 미생물을 접촉시키는 단계. - 제 6 항에 있어서, 단계 a) 가 상기 미생물의 NH아제/아미다아제 활성 비율을 증가시키는 방법.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 건조가 분무 건조, 동결-건조, 가열 건조, 공기 건조, 진공 건조, 유동층 건조 및/또는 분무 과립화에 의해 매개되고, 분무 건조 및 동결 건조가 바람직한 방법.
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉 단계가 건조 미생물을 사용해 수행되는 방법.
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉 단계가 재구성 미생물을 사용해 수행되는 방법.
- 제 10 항에 있어서, 미생물이 수성 조성물에 현탁되는 방법.
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉 단계가 분말, 과립, 현탁액 및/또는 매트릭스 결합 미생물의 형태인 미생물을 사용해 수행되는 방법.
- 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 박테리아인 방법.
- 제 13 항에 있어서, 미생물이 로도코쿠스 (Rhodococcus), 아스페르길루스 (Aspergillus), 아시도보락스 (Acidovorax), 아그로박테리움 (Agrobacterium), 바실루스 (Bacillus), 브라디리조비움 (Bradyrhizobium), 부르크홀데리아 (Burkholderia), 에스케리키아 (Escherichia), 지오바실루스 (Geobacillus), 클레브시엘라 (Klebsiella), 메소리조비움 (Mesorhizobium), 모락셀라 (Moraxella), 판토에아 (Pantoea), 슈도모나스 (Pseudomonas), 리조비움 (Rhizobium), 로도슈도모나스 (Rhodopseudomonas), 세라티아 (Serratia), 아미콜라토프시스 (Amycolatopsis), 아트로박테르 (Arthrobacter), 브레비박테리움 (Brevibacterium), 코리네박테리움 (Corynebacterium), 마이크로박테리움 (Microbacterium), 마이크로코쿠스 (Micrococcus), 노카르디아 (Nocardia), 슈도노카르디아 (Pseudonocardia), 트리코데르마 (Trichoderma), 미로테시움 (Myrothecium), 아우레오바시듐 (Aureobasidium), 칸디다 (Candida), 크립토코쿠스 (Cryptococcus), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 지오트리쿰 (Geotrichum), 한세니아스포라 (Hanseniaspora), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 피키아 (Pichia), 로도토룰라 (Rhodotorula), 코모모나스 (Comomonas), 및 피로코쿠스 (Pyrococcus) 의 군으로부터 선택되는 방법.
- 제 14 항에 있어서, 미생물이 로도코쿠스 (Rhodococcus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 에스케리키아 (Escherichia) 및 지오바실루스 (Geobacillus) 의 군으로부터 선택되는 방법.
- 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 미생물이 로도코쿠스 로도크로우스 (Rhodococcus rhodochrous), 로도코쿠스 피리디노보란스 (Rhodococcus pyridinovorans), 로도코쿠스 에리트로폴리스 (Rhodococcus erythropolis), 로도코쿠스 에쿠이 (Rhodococcus equi), 로도코쿠스 러버 (Rhodococcus ruber), 로도코쿠스 오파쿠스 (Rhodococcus opacus), 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger), 아시도보락스 아베나에 (Acidovorax avenae), 아시도보락스 파실리스 (Acidovorax facilis), 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens), 아그로박테리움 라디오박테르 (Agrobacterium radiobacter), 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실루스 팔리두스 (Bacillus pallidus), 바실루스 스미티 (Bacillus smithii), 바실루스 sp BR449, 브라디리조비움 올리고트로피쿰 (Bradyrhizobium oligotrophicum), 브라디리조비움 디아조에피시엔스 (Bradyrhizobium diazoefficiens), 브라디리조비움 자포니쿰 (Bradyrhizobium japonicum), 부르크홀데리아 세노세파시아 (Burkholderia cenocepacia), 부르크홀데리아 글라디올리 (Burkholderia gladioli), 대장균 (Escherichia coli), 지오바실루스 sp. RAPc8, 클레브시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca), 클레브시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumonia), 클레브시엘라 바리이콜라 (Klebsiella variicola), 메소리조비움 시세리 (Mesorhizobium ciceri), 메소리조비움 오포투니스툼 (Mesorhizobium opportunistum), 메소리조비움 sp F28, 모락셀라 (Moraxella), 판토에아 엔도피티카 (Pantoea endophytica), 판토에아 아글로메란스 (Pantoea agglomerans), 슈도모나스 클로로라피스 (Pseudomonas chlororaphis), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida), 리조비움 (Rhizobium), 로도슈도모나스 팔루스트리스 (Rhodopseudomonas palustris), 세라티아 리쿠에파시엔스 (Serratia liquefaciens), 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens), 아미콜라토프시스 (Amycolatopsis), 아트로박테르 (Arthrobacter), 브레비박테리움 sp CH1, 브레비박테리움 sp CH2, 브레비박테리움 sp R312, 브레비박테리움 임페리알레 (Brevibacterium imperiale), 코리네박테리움 니트릴로필루스 (Corynebacterium nitrilophilus), 코리네박테리움 슈도디프테리티쿰 (Corynebacterium pseudodiphteriticum), 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 호프마니 (Corynebacterium hoffmanii), 마이크로박테리움 임페리알레 (Microbacterium imperiale), 마이크로박테리움 스메그마티스 (Microbacterium smegmatis), 마이크로코쿠스 루테우스 (Micrococcus luteus), 노카르디아 글로베룰라 (Nocardia globerula), 노카르디아 로도크로우스 (Nocardia rhodochrous), 슈도노카르디아 터모필라 (Pseudonocardia thermophila), 트리코데르마 (Trichoderma), 미로테시움 베루카리아 (Myrothecium verrucaria), 아우레오바시듐 풀루란스 (Aureobasidium pullulans), 칸디다 파마타 (Candida famata), 칸디다 길리에르몬디 (Candida guilliermondii), 칸디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis), 크립토코쿠스 플라부스 (Cryptococcus flavus), 크립토코쿠스 sp UFMG- Y28, 데바리오마이세스 한세이 (Debaryomyces hanseii), 지오트리쿰 칸디둠 (Geotrichum candidum), 지오트리쿰 sp JR1, 한세니아스포라 (Hanseniaspora), 클루이베로마이세스 터모톨레란스 (Kluyveromyces thermotolerans), 피키아 클루이베리 (Pichia kluyveri), 로도토룰라 글루티니스 (Rhodotorula glutinis), 코모모나스 테스토스테로니 (Comomonas testosteroni), 피로코쿠스 아비시 (Pyrococcus abyssi), 피로코쿠스 푸리오수스 (Pyrococcus furiosus), 피로코쿠스 호리코시 (Pyrococcus horikoshii), 브레비박테리움 카세이 (Brevibacterium casei), 또는 노카르디아 sp 163 의 군으로부터 선택되는 방법.
- 제 16 항에 있어서, 미생물이 로도코쿠스 로도크로우스 (Rhodococcus rhodochrous) 또는 로도코쿠스 피리디노보란스 (Rhodococcus pyridinovorans) 인 방법.
- 제 17 항에 있어서, 미생물이 로도코쿠스 로도크로우스 (NCIMB 41164), 로도코쿠스 로도크로우스 (FERM BP-1478) 또는 로도코쿠스 로도크로우스 M33 인 방법.
- 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 니트릴 화합물이 아크릴로니트릴인 방법.
- 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 아미드 화합물이 아크릴아미드인 방법.
- 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 방법:
(a) 건조 단계에 의한 생체 촉매의 예비-처리 단계;
(b) 단계 (a) 에서 수득된 건조 생체 촉매와 수용액을 혼합하여 활성화 혼합물을 생성하는 것을 포함하는 활성화 단계, 여기서 활성화 혼합물은 완충액을 포함함, 및
(c) 반응 혼합물 중 건조 생체 촉매를 사용하여 니트릴 화합물을 아미드 화합물로 전환하는 단계, 여기서 반응 혼합물은 상기 단계 (b) 의 완충액을 포함함,
여기서 임의로는 전환의 종료 전에, 활성화 혼합물 중 완충액의 몰 농도 대 반응 혼합물 중 상기 완충액의 몰 농도의 비율은 약 2:1 이상임. - NH아제 및 아미다아제 생성 미생물을 건조시키는 것을 포함하는, 증가된 NH아제/아미다아제 활성 비율을 갖는 미생물의 제조 방법.
- NH아제 및 아미다아제 생성 미생물을 건조시키는 것을 포함하는, 감소된 아미다아제 활성을 갖는 미생물의 제조 방법.
- 아크릴로니트릴과 NH아제 및 아미다아제 생성 미생물을 접촉시키는 것을 포함하는, 니트릴 화합물로부터 아미드 화합물을 생성할 때의 아크릴산 형성의 감소 방법으로서, 상기 미생물이 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 정의된 것인 감소 방법.
- 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NH아제 및 아미다아제 생성 미생물이 건조되기 전에 고정화되지 않는 방법.
- 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 아미드 화합물 수용액.
- 아크릴아미드 또는 폴리아크릴아미드 및 NH아제 및 아미다아제 생성 미생물을 포함하는 조성물로서, 상기 미생물이 400 이상의 NH아제/아미다아제 활성 비율, 및/또는 참조 미생물과 비교했을 때 적어도 1.7 배로 증가되는 아미다아제 활성에 대한 NH아제 활성의 비율을 나타내는 조성물.
- 니트릴 화합물로부터 아미드 화합물을 제조하기 위한, 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 정의된 NH아제 및 아미다아제 생성 미생물의 용도.
- NH아제 및 아미다아제 생성 미생물의 NH아제/아미다아제 활성 비율을 증가시키기 위한, 건조법의 용도.
- NH아제 및 아미다아제 생성 미생물의 아미다아제 활성을 감소시키기 위한, 건조법의 용도.
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