KR20170058941A - 페닐글리신 메틸에스테르의 염 - Google Patents

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디에스엠 시노켐 파마슈티칼스 네덜란드 비.브이.
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Abstract

본 발명은 D-페닐글리신 메틸에스테르의 헤미 황산염, 상기 염의 제조방법, 및 항생제 및 D-페닐글리신 메틸에스테르의 유리 염기의 효소적 합성에서의 상기 염의 사용에 관한 것이다.

Description

페닐글리신 메틸에스테르의 염{SALT OF PHENYLGLYCINE METHYL ESTER}
본 발명은 o-페닐글리신 메틸에스테르의 헤미 황산염(hemi sulfuric acid salt), 상기 염의 제조방법, 및 항생제의 효소적 합성에서의 상기 염의 사용에 관한 것이다.
아미드 또는 에스테르와 같은 측쇄 산 유도체(side chain acid derivative)를 이용한 부모 아미노 β-락탐 모이어티(moiety)의 아실화에 의한 반합성(semisynthetic) β-락탐 항생제의 효소적 제조는, 예를 들어 DE 2163792，DE 2621618， EP 339751，EP 473008，US 3,816,253，WO 92/01061，WO 93/12250，WO 96/02663，WO 96/05318，WO 96/23796, WO 97/04086，WO 98/56946，WO 99/20786，WO 2005/00367，WO 2006/069984 및 WO 2008/110527과 같은 특허문헌들에 널리 개시되어 있다. 당분야에서 사용되는 효소들은 대부분의 경우에 대장균(Escherichia coli)으로부터 얻어진 페니실린 아실라아제이고, 다양한 타입의 수불용성 물질들에 고정화되어 사용된다(예를 들어, WO 97/04086).
생체 촉매(biocatalysts)의 민감성으로 인해, 일반적으로 효소 공정은 오염물의 존재와 관련하여 엄격한 요구조건을 갖는다. 종종, 원하지 않는 불순물들이 효소의 적절한 기능을 방해한다. 이러한 이유로, 아미드 또는 에스테르와 같은 측쇄 산 유도체를 이용한 부모 아미노 β-락탐 모이어티의 아실화에 의한 반합성 β-락탐 항생제의 효소적 제조에 있어서, 출발물질들도 가능한 가장 높은 순도를 갖는 것이 바람직하다. 출발물질들의 순도는 일반적으로 출발물질들을 분리함으로써 달성되고, 바람직하게는 결정화를 이용하여 달성된다. 예를 들어, 암목실린(amoxicillin), 세파드록실(cefadroxil) 및 세프프로질(cefprozil)과 같은 항생제의 측쇄인 D-4-하이드록시페닐글리신의 경우, 아미드 또는 에스테르와 같은 활성화 유도체들의 결정화는 쉽게 달성될 수 있다. 그러나, 암피실린(ampicillin), 세파클러(cefaclor) 및 세파렉신(cephalexin)과 같은 항생제의 측쇄인 D-페닐글리신의 경우는 결정화가 주요 문제점이 된다. 지금까지, 암피실린, 세파클러 및 세파렉신의 효소적 제조에 있어서 가장 바람직한 출발물질들 중 하나인 결정성 D-페닐글리신 메틸에스테르의 분리에 대해 어떠한 보고도 되어있지 않다. 그러나, WO 2008/110527에 개시된 바와 같이, D-페닐글리신이 단지 흔적량으로 존재하여도 효소적 커플링 반응(enzymatic coupling reaction)의 수율에 매우 부정적 영향을 미치기 때문에, 고도로 정제된 D-페닐글리신 메틸에스테르가 요구된다. 이러한 이유로, 효소적 커플링 반응의 조건하에서의 유리(free) 측쇄들의 낮은 용해도로 인해, 효소적 커플링 반응에 있어서 유리 측쇄의 농도에 상한값이 존재하게 된다. 이 상한값은 유리 측쇄가 결정화되거나 침전물로 침전되지 않아야만 한다는 요구조건에 의해 결정되고, 이는 상기 침전물이 효소적 커플링 반응의 진행에 부정적 영향을 미치기 때문이다. 더구나, 반합성 β-락탐 화합물의 하류 공정(downstream processing)의 최종 단계들에서, 예를 들어 반합성 β-락탐 화합물의 최종 결정화 단계의 모액으로부터 오염물인 D-페닐글리신은 제거되어야만 한다. D-페닐글리신의 농도가 높을수록, 더많은 모액에서 D-페닐글리신이 제거될 것이 요구되고, 이로 인해 반합성 β-락탐 화합물의 손실률도 높아지게 된다. 고체 형태의 측쇄 에스테르를 분리하는 단위 조작(unit operation)은 반합성 항생제의 제조 공정을 복잡하게 만들어서, 그의 제조 비용 중 상당 비용을 차지하게 된다. 따라서, D-페닐글리신 메틸에스테르 중의 원하지 않는 D-페닐글리신의 양은 가능한한 적어야만 한다.
이를 달성하기 위하여, D-페닐글리신 메틸에스테르는 염의 형태로 분리될 수 있다. 알킬- 또는 아릴 설폰산 염 및 염산 염들과 같은 여러 염들이 보고되어 있고, 그러한 분리 공정을 통하여 원하지 않는 흔적량의 D-페닐글리신이 제거될 수 있다. 그러나, 이들 염들은 새로운 유기 불순물 염의 도입과 같은 다른 불리한 문제점을 야기시킨다. 원칙적으로, 염산 염은 D-페닐글리신 메틸에스테르의 정제된 유도체의 분리를 위한 매력적인 후보이지만, 불리하게도, 페니실린 아실라아제는 염산 염의 존재에 의해 부정적인 영향을 받는 효소 부류이고, 따라서 효소적 합성에서 D-페닐글리신의 염산 염의 사용은 해결해야 할 원래의 문제점보다 더 심각한 추가적 문제점들을 수반한다. 이러한 이유로, 분리가능하고, 충분한 순도를 가지며, D-페닐글리신 메틸에스테르의 염산 염에 수반되는 문제점을 갖지 않는 D-페닐글리신 메틸에스테르 유도체들이 여전히 요구되고 있다.
본 발명의 목적은, 분리가능하고, 충분한 순도를 가지며, 암피실린, 세파클러 및 세파렉신을 제조하기 위한 효소적 공정에 대한 부작용 없이 사용될 수 있는 D-페닐글리신 메틸에스테르 유도체를 제공하는 것이다.
본 명세서에서 용어 "핵(nucleus)"은 반합성 β-락탐의 β-락탐 모이어티를 의미하고, 페넴(penem) 또는 세펨(cephem), 예를 들어 6-아미노페니실란산(6-APA), 7-아미노데아세톡시-세팔로스포란산(7-ADCA), 7-아미노세팔로스포란산(7-ACA) 또는 7-아미노-3-클로로-3-세펨-4-카르복실레이트(7-ACCA)일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "측쇄(side chain)"은 반합성 β-락탐 화합물에서, 본 명세서에서 정의된 바의 핵의 6-아미노 또는 7-아미노 위치에 부착되는 모이어티를 의미하는데, 즉 암피실린, 세파클러 또는 세파렉신에서 D-페닐글리신을 의미한다.
용어 "유리 측쇄(free side chain)"는 측쇄의 비유도체화(un-derivatized) 형태, 즉 D-페닐글리신이다.
용어 "측쇄 에스테르"는 유리 측쇄의 카르복실기가 알코올로 에스테르화된 유리 측쇄의 에스테르 형태를 의미하고, 예를 들어 D-페닐글리신 메틸에스테르이다. 상기 측쇄 에스테르는 유리 염기 또는 염의 형태, 예를 들어 황산염의 형태일 수 있다.
용어 "D-페닐글리신 메틸에스테르의 헤미 황산염(hemi sulfuric acid salt)"는 (PGMH)2SO4로 약칭되며, 화학식 C18H24N2SO8을 갖는 하기 화학식(1)의 화합물을 의미한다.
Figure pct00001
첫번째 측면에서，본 발명은 분리된 형태의 o-페닐글리신 메틸에스테르의 헤미 황산염((PGMH)2SO4)을 제공한다. 바람직하게는, 상기 (PGMH)2SO4는 결정성이다. 하나의 구체예에서, 결정성 (PGMH)2SO4는 도 1에 도시된 XRD 분말 회절 패턴을 갖는다. 바람직하게는, 상기 XRD 분말 회절 패턴은 6.1±0.2도(degrees) 2-세타(theta)，12.1±0.2도 2-세타，18.8±0.2도 2-세타 및 24.1±0.2도 2-세타에 피크들을 나타낸다. 더욱 바람직하게는, 상기 XRD 분말 회절 패턴은 7.9±0.2도 2-세타，14.4±0.2도 2-세타，15.6±0.2도 2-세타，16.7±0.2도 2-세타，19.5±0.2도 2-세타 및 25.6±0.2도 2-세타에 추가 피크들을 나타낸다.
본 발명의 (PGMH)2SO4는 안정한 고체이다. D-페닐글리신 메틸에스테르의 알려진 유일한 다른 안정한 무기산 염은 염산 염이다. 그러나, 상기 염산 염은 효소 성능에 대한 부정적 영향 및 부산물로서 부식성 클로라이드의 방출과 같은 결점들을 갖는다. 클로라이드의 생성은 산업적 반응기들에 해로운 효과를 미치는 것으로 알려져 있고, 이러한 현상은 본 발명의 (PGMH)2SO4를 사용하여 제조되는 설페이트의 경우에는 발생하지 않는다. 놀랍게도, 암피실린, 세파클러 또는 세파렉신과 같은 반합성 D-페닐글리신 함유 β-락탐 화합물들의 효소적 합성에 있어서 본 발명의 (PGMH)2SO4의 적용은 US 8,541,199에 개시된 바와 같은 D-페닐글리신 메틸에스테르의 황산염 용액의 사용과 비교시, 우월한 결과들을 나타내었다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 (PGMH)2SO4의 사용에 의해, 세파렉신 항생제는 높은 수율, 높은 전환율 및 원하지 않는 D-페닐글리신의 낮은 생성율로 7-ADCA로부터 효소적으로 제조될 수 있다.
두번째 측면에서, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는 (PGMH)2SO4의 제조방법을 제공한다:
(a) 유기용매 중의 D-페닐글리신 메틸에스테르 용액을 황산과 접촉시키는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 수득된 혼합물로부터 D-페닐글리신 메틸에스테르의 헤미 황산염을 분리하는 단계.
바람직하게는, 황산의 양은, 황산의 몰량이 (PGMH)2SO4의 몰량에 대해 0.4 내지 0.6이 되는 양으로 선택된다. 바람직한 구체예에 있어서, (PGMH)2SO4는 상기 단계 (a)에서의 수상(aqueous phase)을 분리하고, 그로부터 (PGMH)2SO4를 결정화함으로써 분리될 수 있다. 결정화는 당분야 기술자에게 알려진 방법들로 수행될 수 있고, 예를 들어 온도를 낮춤으로써 수행될 수 있다. 바람직한 결정화 온도는 -5℃ 내지 15℃이고, 더욱 바람직하게는 0℃ 내지 10℃이다.
하나의 구체예에서, 전체 수율은 상기 방법의 단계 (b)에서의 분리 후에 남아있는 수상을 재순환(recycling)시킴으로써 향상될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 상기한 방법의 다음 사이클에서 단계 (a)의 혼합물에 수성 모액(mother liquor)이 첨가된다. 바람직하게는, 재순환은 상기 모액이 단계 (a)의 혼합물에 수성 모액을 첨가하기 전에, 수성 모액의 일부량을 버리는 방식으로 수행된다. 적합한 분량은 1 내지 50부피%, 바람직하게는 2 내지 25부피%, 더욱 바람직하게는 3 내지 15부피%이다. 상기와 같은 상분리의 결과로서, 상기 재순환은 불순물의 축적없이 수행될 수 있다는 것이 밝혀졌다.
이 두번째 측면의 방법은 다양한 유기용매들을 이용하여 수행될 수 있다. 바람직한 용매는 물에서의 용해도가 0%(w/w) 내지 25%(w/w)이고, 극성 지수(polarity index)가 1 내지 5인 용매들이다. 바람직하게는, 상기 극성 지수는 일반적으로 최선의 결과를 나타낼 수 있는 2 내지 3이다. 바람직한 용매는 부틸아세테이트, 디에틸에스테르, 에틸아세테이트, 메틸이소부틸케톤 및 메틸 터셔리-부틸에테르이다.
세번째 측면에서, 본 발명은, 각각 페니실린 아실라아제, 바람직하게는 고정화된 페니실린 아실라아제의 존재하에, (PGMH)2SO4를 6-아미노페니실란산(6-APA), 7-아미노-3-클로로-3-세펨-4-카르복실레이트(7-ACCA) 또는 7-아미노데아세톡시-세팔로스포란산(7-ADCA)과 접촉시키는 것을 포함하는, 암피실린, 세파클러 또는 세파렉신의 제조 공정에서 (PGMH)2SO4의 사용을 제공한다. 상기 효소적 반응은, 본 명세서에서 인용된 당분야에서 알려진 공정들 중 어느 것에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 암피실린의 합성은 EP 339751 또는 WO 98/56946에 개시된 바에 따라 수행될 수 있다. 유사하게, 세파렉신의 합성은 WO 96/23976에 개시된 바에 따라 수행될 수 있다. 세파클러의 합성은 WO 2006/069984에 개시된 바에 따라 수행될 수 있다.
효소적 커플링 반응 후에, 반합성 β-락탐 항생제는 알려진 방법들을 사용하여 회수될 수 있다. 예를 들어, 효소 반응물은 상향 교반을 적용하여 하부의 체(bottom seive)를 통해 배출될 수 있다. 결과의 반합성 β-락탐 항생제 현탁액은 유리 필터를 통하여 여과될 수 있다.
효소적 커플링 반응 후에 존재하는 유리 측쇄의 낮은 함량에 기인하여, 최종의 반합성 β-락탐 항생제의 결정화는 β-락탐 항생제의 높은 농도에서 수행될 수 있고, 결과적으로 높은 수율을 제공한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 상기 세번째 측면은 D-페닐글리신 메틸에스테르 유리 염기의 제조에 있어서 D-페닐글리신 메틸에스테르의 헤미 황산염의 사용을 제공한다. 그러한 사용은, D-페닐글리신 메틸에스테르의 메틸설페이트에 대해 WO 2008/110527에 개시된 공정에 따라서 성공적으로 달성될 수 있다. 본 발명에 따른 D-페닐글리신 메틸에스테르의 헤미 황산염의 사용은, D-페닐글리신 메틸에스테르 유리 염기의 모액 손실이 감소함으로 인해, WO 2008/110527에 개시된 D-페닐글리신 메틸에스테르 유리 염기의 제조 공정에 비해 우월한 결과들을 제공한다는 것이 밝혀졌다.
도 1은 D-페닐글리신 메틸에스테르의 헤미 황산염의 XRD 스펙트럼이다. X-축: 2-세타 값(도; degree). Y-축: 강도(cps). 다음의 뚜렷한 피크들이 확인될 수 있다.
Figure pct00002
[ 실시예 ]
일반사항
X- 레이 분말 회절 분석
시료를 (백그라운드 산란을 최소화하기 위한) 내부 나이프 및 공동(직경 2cm)을 갖는 폐쇄된 시료 홀더 상에 로딩하였다. 상기 로딩은, 시료 제조 동안에 먼지 생성을 최소화하기 위하여, 그라인딩 없이 흄후드(fume hood)에서 수행되었다. 시료들을 Bruker 사제의 X-레이 분말 회절기 D2 Phaser로 분석하였다. 상기 기기는 1° 개방각, 0.1mm 수용 슬릿 및 니켈 필터를 갖는 LynxEye 검출기를 사용한다. 회절각 2θ는 2°내지 60°의 범위이고, ∼0.008°의 스텝(2θ에서) 및 카운트 타임 4초/스텝을 갖는다. 시료를 (양호한 통계치를 얻기 위하여) 측정 동안에 15rpm으로 회전시키고, 데이터는 대략적으로 백그라운드를 제외한 것이다.
HPLC 분석
칼럼: HPLC 칼럼 크라운팩 CR(-)(DAICEL), 길이 150mm, 직경 4mm, 입자들의 직경 5㎛.
용리액: HClO4 용액, pH=2.0. 칭량된 1.43g의 HClO4(70%, 1.43g)를 크로마토그래피를 위하여 물로 1000ml로 희석하고, 용액의 pH를 확인하였다.
크로마토그래피 조건:
ㆍ용리액: HClO4, pH=2
ㆍ 등용매(isocratic) 조건
ㆍ 유속: 1.0ml.min-1
ㆍ 주입 부피: 20㎕
ㆍ 파장: 220nm
ㆍ 칼럼 온도: 실온, 20~25℃
ㆍ 크로마토그램 시간: 30분
ㆍ 체류 시간(대략):
- L-페닐글리신: 2.7분
- D-페닐글리신: 8.7분
- L-페닐글리신 메틸에스테르: 9.3분
- D-페닐글리신 메틸에스테르: 21.0분
D- 페닐글리신 메틸에스테르의 수성 용액의 제조 (또한, WO 2008/110527 참조, US 8,541,199의 실시예 8의 유사한 공정 - 함량들이 다르지만 동일한 생성물이 얻어지고, 실시예 4에서 사용됨)
D-페닐글리신(PG; 135g)을 메탄올(252mL)에 현탁시키고, 농황산(98%, 107g)을 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 약 73℃에서 2시간 동안 환류하에 유지하고, 진공 펌프를 사용하여 감압하에서 농축시켰다. 대기압으로부터 20mbar로 압력을 낮추고, 동시에 반응혼합물의 온도를 40℃에서 80℃로 증가시켰다. 메탄올(126mL, 100g)을 첨가하고, 결과의 혼합물을 약 81℃에서 1시간 동안 환류하에 유지하고, 상기한 바와 같이 농축시켰다. 상기 공정을 4회 더 반복하였다(메탄올 첨가, 환류 및 농축). 최종적으로, 메탄올(126mL)을 첨가하고, 얻어진 용액을 추가 1시간 동안 환류하고, 주위 온도로 냉각시켰다. pH가 2.3~2.4가 될 때가지 암모니아(15mL)를 35분에 걸쳐 일정한 속도로 적가하였다. 물(75mL)을 첨가하고, 감압하, 50℃ 이하의 온도에서 메탄올을 증류하여 제거하였다. 최종 D-페닐글리신 메틸에스테르(PGM) 용액의 pH는 2.0이었고, 전환율은 99.0%이었다.
실시예 1
( PGMH ) 2 SO 4 의 시드(seed)의 제조
상기 일반사항에서와 같이 제조된 D-페닐글리신 메틸에스테르의 수성 용액(1800g)을 메틸 터셔리-부틸에테르(900ml)와 물(25ml)의 혼합물에 5~10℃에서 첨가하였고, 8M NaOH의 첨가에 의해 pH를 9.2로 유지하였다. 상분리를 실시하였다. 수상은 메틸 터셔리-부틸에테르(600ml)로 추출하였다. 두 유기상들을 조합하여, 물(5mL)에 첨가하였고, 48%(w/w) H2SO4의 첨가에 의해 pH를 4.2로 유지하였다. 상들을 분리하였다. 점성의 유성(oily) 수상(탁한(turbid))이 얻어졌다. 상기 혼합물의 일부를, 진공하(2mbar) 20℃에서 중량이 더이상 감소되지 않을 때까지 증발시켰다. 점성의 오일이 얻어졌다. 수일동안 20℃에서 저장한 결과, 오일 내에 결정들이 형성되었다. 이들 결정들의 일부는 나머지 수상(그동안 3℃에서 저장되었음)에 시드로서 사용되었다. 3℃에서 매우 느린 결정화가 관찰되었다. 결정 현탁액을 여과하였다. 결정들을 HPLC로 분석하였다. 상기 결정들은 D-페닐글리신으로 오염된 것으로 판명되었다. 여과액을 실온에서 밤새 방치한 결과, 여과액에서 결정들이 다시 형성되었다. 이들 결정들을 분리하여, 이어지는 실험들에서 시드로서 사용하였다.
실시예 2
( PGMH ) 2 SO 4 의 제조
상기 일반사항에서와 같이 제조된 D-페닐글리신 메틸에스테르의 수성 용액(1800g)을 메틸 터셔리-부틸에테르(900ml)와 물(25ml)의 혼합물에 5~10℃에서 첨가하였고, 8M NaOH의 첨가에 의해 pH를 9.2로 유지하였다. 상분리를 실시하였다. 수상은 메틸 터셔리-부틸에테르(600ml)로 추출하였다. 두 유기상들을 조합하였다. 유기상을 HPLC로 분석한 결과, 350.4g의 D-페닐글리신 메틸에스테르를 포함하는 것으로 결정되었다. 유기상을 물(5mL)에 첨가하고, 48%(w/w) H2SO4를 첨가하여 pH를 4.2로 유지하였다. 48%(w/w) H2SO4의 소비량은 201.7g이었다. D-페닐글리신 메틸에스테르(350.4g, 2.1mol) 및 첨가된 H2SO4(201.7×0.48=96.8g, 1.0mol)의 몰비는 2:1이었다. 상분리를 하였다. 점성의 오일성 수상(탁한)이 수득되었다. 상기 실시예 1과 같이 제조된 시드를 상기 수상에 첨가하였다. 대량의 결정화가 개시되었고, 1분 이내에 혼합물은 흰색 결정들의 고체 케이크로 되었다. 상기 결정들의 젖은 케이크를 진공하 20℃에서 건조시켰다. 상기 결정들 중의 D-페닐글리신 메틸에스테르의 분석치는 73%(w/w)이었고, D-페닐글리신 메틸에스테르의 헤미 황산염 중의 D-페닐글리신 메틸에스테르의 이론치는 100×2×165.2/(2×165.2+98)=77%이다.
실시예 3
온도에 따른 ( PGMH ) 2 SO 4 의 수용해도
상기 실시예 2에 기재된 바의 (PGMH)2SO4의 제조에 있어서, pH 4.2에서의 유기상의 분리시, (PGMH)2SO4는 과포화상태이다. 이 시점에서, 유기상이 수상으로부터 분리되기 전에 결정화가 개시될 수 있다. 유기용매의 존재하에서의 (PGMH)2SO4의 결정화를 피할 공정을 설계하고, 유기상의 분리 후에 결정화를 제어하기 위하여, 온도에 따른 (PGMH)2SO4의 용해도를 조사하였다. 상기 실시예 2에서 기재된 바와 같이 제조된 D-페닐글리신 메틸에스테르의 헤미 황산염(1g)을 20℃에서 물(2g)과 혼합하고, 고체 물질을 용해시켰다. 추가의 D-페닐글리신 메틸에스테르의 헤미 황산염(1g)을 첨가하고, 혼합물을 20℃에서 25분 동안 진탕하였다. 상등액의 약 0.5mL 분액을 여과하고, 여과액 중의 D-페닐글리신 메틸에스테르의 헤미 황산염의 농도를 HPLC로 측정하였다. 혼합물의 나머지는 3℃에서 교반하였다. 물(2mL)을 첨가하고 혼합하였다. 추가의 D-페닐글리신 메틸에스테르의 헤미 황산염(0.5g)을 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 진탕하였다. 모든 고체가 용해된 것은 아니었다. 상등액의 약 0.5mL 분액을 여과하고, 여과액 중의 D-페닐글리신 메틸에스테르의 헤미 황산염의 농도를 HPLC로 측정하였다. HPLC 분석 결과는 표 1에 나타내었다.
[표 1]
온도에 따른 D-페닐글리신 메틸에스테르의 수용해도
Figure pct00003
20℃에서의 용해도는, 20℃, pH 4.2에서 유기용매 중의 D-페닐글리신 메틸에스테르를 수성 H2SO4와 혼합한 후에 상분리를 가능하게 하여야 한다. 이어서, 수상을 3℃로 냉각한 결과, 혼합물 kg 당 D-페닐글리신 메틸에스테르의 헤미 황산염 약 478-268=210g이 결정화되었다. 3℃에서 결정 현탁액으로부터 D-페닐글리신 메틸에스테르의 헤미 황산염을 분리한 후에, 모액은 유기용매 중의 D-페닐글리신 메틸에스테르를 물/H2SO4/모액으로 추출하기 위해 재사용될 수 있다.
실시예 4
( PGMH ) 2 SO 4 vs PGM 용액을 사용한 세파렉신의 제조
7-아미노데아세톡시세팔로스포란산(7-ADCA, 55.4g)을 물(237mL)에 현탁시키고, 온도를 20℃로 조절하였다. 암모니아 수용액(25%)을 첨가하여 pH 7.0을 유지하면서 혼합물을 5분 동안 교반하였다. 고정화된 효소(US 8,541,199에 개시된 변이체 1을 포함; 18.7g)를 물(25mL)과 함께 첨가하였다. 그런 다음, 고체 (PGMH)2SO4(61.5g)을 200분에 걸쳐 일정한 속도로 첨가하고, 모든 (PGMH)2SO4가 첨가되면, 암모니아 수용액(25%) 또는 황산 수용액(30%)으로 pH를 7.0으로 유지하였다. 230분 후에, 황산 수용액(30%)을 첨가하여 pH를 5.8로 조절하였다. 반응 과정 동안에, 시료들을 취해서 HPLC로 분석하였고, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
[표 2]
고체 (PGMH)2SO4를 사용하여 7-ADCA로부터 세파렉신의 제조
Figure pct00004
성분들의 함량은 중량%이다.
전환율: 100×세파렉신 몰수/(세파렉신 + 7-ADCA 몰수)
비율: (세파렉신 + PGM + PG 몰수)/(세파렉신 + 7-ADCA 몰수)
S/H: 합성/가수분해 비율, 또는 세파렉신 몰수/PG 몰수
비교를 위하여, 상기 세파렉신 프로토콜을, 고체 (PGMH)2SO4 대신에 PGM 용액(US 8,541,199의 실시예 8에서 제조; 100.7g; PGM 분석: 44%)을 사용하여 반복하였다. 초기의 7-ADCA 현탁액의 제조에 있어서, 물 237mL 대신에 물 187mL를 사용하였다. 반응 과정 동안에, 시료들을 취해서, HPLC로 분석하였고, 그 결과를 표 3에 나타내었다.
[표 3]
PGM 용액을 사용하여 7-ADCA로부터 세파렉신의 제조
Figure pct00005
항목들은 표 2에서 정의된 바와 같다.
상기 표 2 및 표 3을 살펴보면, 고체 (PGMH)2SO4의 사용은 PGM 용액의 사용에 비해, 세파렉신 최대 생성율, 최대 전환율 및 전체 S/H 비율의 관점들에서 훨씬 우수한 결과들을 나타내었다.

Claims (14)

  1. D-페닐글리신 메틸에스테르의 헤미 황산염.
  2. 제1항에 있어서, 상기 D-페닐글리신 메틸에스테르의 헤미 황산염은 6.1±0.2도(degrees) 2-세타(theta)，12.1±0.2도 2-세타，18.8±0.2도 2-세타 및 24.1±0.2도 2-세타에 피크들을 포함하는 XRD 분말 회절 패턴을 갖는 D-페닐글리신 메틸에스테르의 헤미 황산염.
  3. 제2항에 있어서, 7.9±0.2도 2-세타，14.4±0.2도 2-세타，15.6±0.2도 2-세타, 16.7±0.2도 2-세타, 19.5±0.2도 2-세타 및 25.6±0.2도 2-세타에 피크들을 더 포함하는 D-페닐글리신 메틸에스테르의 헤미 황산염.
  4. 다음의 단계들을 포함하는 D-페닐글리신 메틸에스테르의 헤미 황산염의 제조방법:
    (a) 유기용매 중의 D-페닐글리신 메틸에스테르의 용액을 황산과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 수득된 혼합물로부터 D-페닐글리신 메틸에스테르의 헤미 황산염을 분리하는 단계,
    여기서, 상기 단계 (a)에서 황산의 몰량은 D-페닐글리신 메틸에스테르의 몰량에 대해 0.4 내지 0.6이다.
  5. 제4항에 있어서, 상기 단계 (a) 후에 수상을 분리하고, 상기 단계 (b)는 상기 수상에서 수행되는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 단계 (a) 후에 수득된 수상은 결정화 되는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 결정화는 상기 단계 (a) 후에 수득된 상기 수상의 온도를 낮춤으로써 수행되는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 결정화는 -5℃ 내지 15℃의 온도에서 수행되는 방법.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서의 분리 후에 남아있는 수상을 제4항의 방법의 상기 단계 (a)의 혼합물에 첨가하는 방법.
  10. 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기용매의 수용해도는 0%(w/w) 내지 25%(w/w)이고, 상기 유기용매의 극성 지수는 1 내지 5인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 극성 지수는 2 내지 3인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 유기용매는 부틸아세테이트, 디에틸에테르, 에틸아세테이트, 메틸이소부틸케톤 및 메틸 터셔리-부틸에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  13. 페니실린 아실라아제의 존재하에, D-페닐글리신 메틸에스테르의 헤미 황산염을 각각 6-아미노페니실란산, 7-아미노-3-클로로-3-세펨-4-카르복실레이트 또는 7-아미노데아세톡시-세팔로스포란산과 접촉시키는 것을 포함하는, 암피실린, 세파클러 또는 세파렉신의 각각의 제조를 위한 D-페닐글리신 메틸에스테르의 헤미 황산염의 사용.
  14. D-페닐글리신 메틸에스테르의 유리 염기의 제조를 위한 D-페닐글리신 메틸에스테르의 헤미 황산염의 사용.
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