KR20170049436A

KR20170049436A - 중쇄 아미노카르복시산의 생산 방법

Info

Publication number: KR20170049436A
Application number: KR1020160141019A
Authority: KR
Inventors: 안정오; 이홍원; 박규연; 장민정; 전우영
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2015-10-27
Filing date: 2016-10-27
Publication date: 2017-05-10
Also published as: EP3375880A4; KR101903553B1; US20180327724A1; JP7164112B2; JP2018531615A; EP3375880B1; EP3375880A1; CN108473993A

Abstract

본 발명은 중쇄 아미노카르복시산의 생산 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 ω-산화 대사 경로 중의 지방 알데히드 디하이드로게나아제 유전자 및 β-산화 대사 경로 관련 유전자가 제거되고, 또한 ω-트랜스아미나아제 유전자가 도입된 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 배양함으로써, 지방산으로부터 중쇄 아미노카르복시산을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 미생물은 지방 알데히드의 추가적인 산화 및 β-산화 대사를 방지하고, 또한 말단에 아민기를 도입함으로써 지방산과 같은 기질로부터 중쇄 아미노카르복시산, 예컨대 나일론 12의 원료가 되는 12-아미노도데칸산을 높은 수율로 생산할 수 있다.

Description

중쇄 아미노카르복시산의 생산 방법{METHOD FOR PRODUCTION OF MEDIUM CHAIN AMINOCARBOXYLIC ACID}

본 발명은 중쇄 아미노카르복시산의 생산 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 ω-산화 대사 경로 중의 지방 알데히드 디하이드로게나아제(fatty alcohol dehydrogenase) 유전자 및 β-산화 대사 경로 관련 유전자가 제거되고, 또한 ω-트랜스아미나아제(transaminase) 유전자가 도입된 재조합 미생물을 배양함으로써, 지방산으로부터 중쇄 아미노카르복시산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

바이오플랫폼 화합물은 바이오매스 유래 원료를 기반으로 하여 생물학적 또는 화학적 전환을 통해 생산된 것으로, 고분자 모노머, 신소재 등의 합성에 사용되고 있다.

바이오플랫폼 화합물 중 중쇄 아미노카르복시산은 폴리아미드의 단량체로 사용되는 물질로서, 상기 폴리아미드는 지방족 폴리아미드, 방향족 폴리아미드, 지방족 고리 폴리아미드로 분류된다. 지방족 폴리아미드의 대표적인 것에는 나일론 12, 나일론 6 및 나일론 66 등이 있고, 방향족 폴리아미드는 내열성을 더욱 향상시키기 위해 방향족 골격을 도입한 것으로, 아라미드(aramid)라는 이름으로 알려져 있다.

나일론은 대표적인 엔지니어링 플라스틱 소재로서 1940년 이후부터 높은 결정성과 기계적 강도, 열적 안정성, 우수한 내마모/내마찰 특성 등에 의해 그 수요와 용도가 꾸준히 증가하고 있는 추세이며, 나일론의 열적, 기계적 성질을 향상시키기 위한 다양한 분야의 연구가 지속적으로 진행되어 왔다. 그 중에서 나일론의 내마모성 향상을 위해서 왁스, 흑연을 함침시키는 연구가 있으며, 그 외에도 고분자 가교에 의한 물성 향상 연구가 진행되고 있다. 나일론 중에서도 12-아미노도데칸산(aminododecanic acid)의 중축합 방식으로 합성되는 나일론 12는 비중이 작고, 저온 특성 및 내마모성이 우수하며, 자외선의 영향이 적어 내후성이 강하고, 또한 다른 나일론 수지(나일론 6, 66)에 비하여 -CH₂- 사슬 길이가 매우 길기 때문에, 동일 중량에서 아미드 관능기와 H₂O의 수소 결합을 갖는 확률이 낮아 나일론 수지의 가장 큰 단점인 수분 흡습에 의한 기계적 강도의 저하를 방지할 수 있기 때문에 자동차용 부품 재료, 항공기 재료, 내열성 특수 섬유 등에 다양하게 적용되고 있다(비특허문헌 1).

12-아미노도데칸산과 같은 중쇄 아미노카르복시산의 생산은 화학적 합성이나 미생물 발효를 통한 생물학적 방법으로 이루어질 수 있는데, 이러한 생물학적 방법을 이용할 경우에는 대사공학 기술을 이용한 신규 균주 개발 및 발효공정의 최적화가 요구된다.

종래에 중쇄 아미노카르복시산을 생산할 수 있는 균주로는 β-산화 대사 경로와 ω-산화 대사 경로를 함께 갖고 있는 미생물이 이용될 수 있고, 예컨대 대장균으로부터 ω-아미노도데칸산을 생산하는 방법이 알려져 있다(특허문헌 1). 그러나, 중쇄 아미노카르복시산은 중쇄 알데히드 카르복시산에 아민기를 전달하는 과정을 추가로 도입하여 제조되기 때문에, 상기 미생물을 이용한 중쇄 아미노카르복시산의 생산에 있어서는 그 수율이 높지 않다는 문제점이 있었다.

US2010/0324257 A1

신범식 외, 폴리머, 35(1):30-34, 2011

본 발명은 ω-산화 대사 경로 중의 지방 알데히드 디하이드로게나아제 유전자 및 β-산화 대사 경로 관련 유전자가 제거되고, 또한 ω-트랜스아미나아제 유전자가 도입된 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 배양함으로써, 지방산으로부터 중쇄 아미노카르복시산을 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 ω-산화 대사 경로 중의 지방 알데히드 디하이드로게나아제 유전자 및 β-산화 대사 경로 관련 유전자가 제거되고, 또한 ω-트랜스아미나아제 유전자가 도입된 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 지방 알데히드 디하이드로게나아제 및 β-산화 대사 경로 관련 유전자는 미생물 내에 존재하는 모든 상동형 유전자가 제거된 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 지방 알데히드 디하이드로게나아제 및 β-산화 대사 경로 관련 유전자는 해당 미생물 내에 존재하는 일부 상동형 유전자가 제거된 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 지방 알데히드 디하이드로게나아제 유전자는 FALDH1, FALDH2, FALDH3 및 FALDH4 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 β-산화 대사 경로 관련 유전자는 아실-CoA 옥시다아제 유전자일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 아실-CoA 옥시다아제 유전자는 ACO1, ACO2, ACO3, ACO4, ACO5 및 ACO6 유전자로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 미생물은 효모 또는 대장균일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 효모는 야로위아 속(Yarrowia sp.), 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.), 피키아 속(Pichia sp.) 및 캔디다 속(Candida sp.)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 효모일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 야로위아 속의 효모는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 ω-산화 대사 경로 중의 지방 알데히드 디하이드로게나아제 유전자 및 β-산화 대사 경로 관련 유전자가 제거되고, 또한 ω-트랜스아미나아제 유전자가 도입된 재조합 미생물을 제조하는 단계; 및 (2) 상기 재조합 미생물에 기질을 처리하여 배양하는 단계를 포함하는 중쇄 아미노카르복시산의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 기질은 지방산일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 지방산 및 중쇄 아미노카르복시산은 탄소수 5 내지 30, 바람직하게는 탄소수 6 내지 20, 보다 바람직하게는 탄소수 8 내지 16을 가질 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 지방산은 도데칸산일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 중쇄 아미노카르복시산은 12-아미노도데칸산일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 미생물은 ω-산화 대사 경로 중의 지방 알데히드 디하이드로게나아제 유전자 및 β-산화 대사 경로 관련 유전자가 제거되고, 또한 ω-트랜스아미나아제 유전자가 도입됨으로써, 지방산과 같은 기질로부터 중쇄 아미노카르복시산, 예컨대 나일론 12의 원료가 되는 12-아미노도데칸산을 높은 수율로 생산할 수 있다.

도 1은 ω-산화 및 β-산화 대사 반응과 관련된 생성물 및 관련 효소의 종류를 보여주는 것이다.
도 2는 ω-산화와 관련된 지방 알데히드 디하이드로게나아제 유전자 및 β-산화 대사 경로 관련 유전자가 제거되고, 또한 ω-트랜스아미나아제 유전자가 도입된 재조합 미생물의 제조 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 3은 균주 개량을 위한 유전자 낙-아웃을 위해 선별 마커로 사용될 ura3 유전자와 낙-아웃 카세트 삽입 후 ura3 유전자를 제거하기 위한 팝-아웃(pop-out)을 갖는 벡터를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 형질전환 미생물의 제조에 사용된 낙-아웃 카세트의 제작 과정을 보여주는 개략도이다.
도 5는 균주 개량을 위해 ω-트랜스아미나아제 유전자가 포함된 형절전환 벡터를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 형질전환 미생물에서 낙-아웃 및 형질도입된 유전자의 종류를 보여주는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 형질전환 미생물이 기질인 도데칸산으로부터 생성한 중쇄 아미노카르복시산의 양을 보여주는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 Y2-36 균주를 플라스크에서 배양시 기질인 도데칸산으로부터 생성한 중쇄 아미노카르복시산의 양을 보여주는 그래프이다.
도 9는 본 발명의 Y2-36 균주에서 기질인 도데칸산으로부터 중쇄 아미노카르복시산이 생성되었음을 보여주는 GC/MS 데이터이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ω-산화 대사 경로 중의 지방 알데히드 디하이드로게나아제 유전자 및 β-산화 대사 경로 관련 유전자가 제거되고, 또한 ω-트랜스아미나아제 유전자가 도입된 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 "ω-산화"란 용어는 지방산의 메틸기 말단이 산화되어 디카르복시산이 형성되는 대사 과정을 의미하고, "β-산화"란 용어는 카르복시기에서 β-자리의 탄소원자가 산화되어 아세틸 CoA를 방출하면서 그때마다 탄소 원자수가 2개 적은 지방산이 되면서 점차 분해되어 가는 대사 과정을 의미한다. 상기 ω-산화 및 β-산화의 개념과 이러한 대사 과정에 관여하고 있는 효소들에 대해서는 생화학 분야의 통상의 기술자에게 있어서 널리 알려져 있다. 예컨대, ω-산화에 있어서, 지방산이 기질로 이용될 경우에는 먼저 시토크롬 P450 및 NADPH-시토크롬 P450 리덕타아제(reductase)의 작용에 의해 ω-히드록시 지방산이 생성되고, 상기 ω-히드록시 지방산은 지방 알코올 디하이드로게나아제 및 지방 알코올 옥시다아제의 작용에 의해 ω-알데히드 지방산이 생성되며, 상기 ω-알데히드 지방산은 지방 알데히드 디하이드로게나아제의 작용에 의해 디카르복시산이 제조된다. 또한, β-산화에 있어서는 아실-CoA 옥시다아제에 의해 탄소 원자수가 2개 적은 지방산이 생성된다(도 1 참조).

트랜스아미나아제(TA, EC 2.6.1.X)는 자연계에 널리 존재하며 생물의 질소대사에서 아민기의 전이에 관여하는 효소이다. 일반적으로 트랜스아미나아제는 한 아미노산의 아미노기를 제거하여 다른 α-케토산(keto acid)에 전이하는 역할을 한다. 트랜스아미나아제는 넓은 기질특이성, 높은 광학선택성, 빠른 반응속도, 뛰어난 안정성, 그리고 조효소 재생산이 필요 없는 점 등의 여러 뛰어난 장점 때문에 광학적으로 순수한 비천연아미노산 및 아민화합물의 생산을 위해 트랜스아미나아제가 사용되고 있다. 트랜스아미나아제는 Pfam 데이터베이스에 나오는 단백질의 구조와 다중 서열 배열(alignments)을 바탕으로 5개의 그룹으로 나눌 수 있는데, 이중 ω-아미노산:피루베이트 트랜스아미나아제, 오르니틴(ornithine) 트랜스아미나아제, 4-아미노부티레이트 트랜스아미나아제 등을 포함하고 있는 그룹 Ⅲ에 속하는 트랜스아미나아제를 ω-트랜스아미나아제라 한다. 일반적인 트랜스아미나아제와는 달리, ω-트랜스아미나아제는 알파가 아닌 위치에 아민기가 있는 아미노산 또는 카르복실기가 없는 아민 화합물의 아민기를 2-케토글루타레이트 또는 피루베이트와 같은 아민 수용체에 전달해주는 반응을 수행한다. 따라서, ω-트랜스아미나아제는 광학활성 아민 화합물의 생산에 매우 유용한 효소로 사용될 수 있다. 예컨대, ω-트랜스아미나아제는 1990년에 미국의 셀진사(Celgene Co.)가 키랄 아민을 최초로 합성하는데 사용하였고, 최근에는 키랄 아민의 비대칭 합성(asymmetric synthesis) 연구와 동적 분할(kinetic resolution) 향상 관련 연구에서 중요하게 다루어지고 있으며, 2012년 독일의 에보닉사(Evonik)에서 크로모박테리움 비올라세움(Chromobacterium violaceum) DSM30191 균주의 ω-트랜스아미나아제를 이용하여 12-옥소라우르산 메틸 에스테르를 12-아미노라우르산 메틸 에스테르로 전환시킨 예도 알려져 있다.

본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 지방 알데히드 디하이드로게나아제 유전자는 해당 미생물 내에 존재하는 모든 상동형 유전자가 제거된 것이 바람직하지만, 경우에 따라 이들 중 일부 유전자가 제거된 재조합 미생물도 본 발명에 있어서 적용될 수 있다.

본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 지방 알데히드 디하이드로게나아제 유전자는 FALDH1, FALDH2, FALDH3 및 FALDH4 유전자로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 FALDH1, FALDH2, FALDH3 및 FALDH4 유전자는 각각 서열번호 1 및 서열번호 4로 이루어지는 염기서열을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 β-산화 대사 경로 관련 유전자는 해당 미생물 내에 존재하는 모든 상동형 유전자가 제거된 것이 바람직하지만, 경우에 따라 이들 중 일부 유전자가 제거된 재조합 미생물도 본 발명에 있어서 적용될 수 있다. 상기 β-산화 대사 경로 관련 유전자는 아실-CoA 옥시다아제 유전자인 것이 바람직하고, 상기 아실-CoA 옥시다아제 유전자는 ACO1, ACO2, ACO3, ACO4, ACO5 및 ACO6 유전자로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다(도 2 참조). 본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 ACO1, ACO2, ACO3, ACO4, ACO5 및 ACO6 유전자는 각각 서열번호 5 및 서열번호 10으로 이루어지는 염기서열을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 ω-트랜스아미나아제 유전자는 서열번호 11로 이루어지는 염기서열을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 본 기술분야에 공지된 통상의 유전자 재조합 기술을 이용하여 상기 지방 알데히드 디하이드로게나아제 유전자 및 β-산화 대사 경로 관련 유전자가 제거되고, 또한 ω-트랜스아미나아제 유전자가 도입된 재조합 미생물을 제조할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 "제거"란 용어는 해당 유전자의 일부 또는 전부가 물리적으로 제거된 것뿐만 아니라, 해당 유전자로부터 전사된 mRNA로부터 단백질이 만들어지지 않는 상태 및 해당 유전자로부터 발현된 단백질이 기능을 하지 못하는 상태 등도 포괄적으로 포함하는 의미로 사용된다. 또한, 상기 "도입"이란 용어는 미생물의 게놈 내에 유전자가 삽입되거나, 또는 미생물의 게놈 내에 유전자가 삽입되지 않은 채로 해당 유전자가 발현되는 경우 모두를 포괄적으로 포함하는 의미로 사용된다. 사용될 수 있는 유전자 재조합 기술로는 형질전환(transformation), 형질도입(transduction), 형질주입(transfection), 미세주입(microinjection), 전기천공(electroporation) 등의 방법을 예시할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 사용될 수 있는 미생물은 ω-산화 및 β-산화 대사 과정을 모두 갖고 있는 임의의 미생물이 제한없이 사용될 수 있으며, 예컨대 효모를 포함하는 진핵생물 및 대장균을 포함하는 원핵생물 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 구현예에 따르면, 상기 미생물은 효모를 사용하는 것이 바람직하며, 상기 효모로는 야로위아 속, 사카로마이세스 속, 피키아 속, 캔디다 속 등의 효모가 제한없이 사용될 수 있고, 이 중에서도 야로위아 리폴리티카, 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 캔디다 인판티콜라(Candida infanticola), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 피키아 알코홀로피아(Pichia alcoholophia) 또는 캔디다 마이코더마(Candida mycoderma)를 사용하는 것이 바람직하며, 야로위아 리폴리티카를 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

상기와 같이, 지방 알데히드 디하이드로게나아제 유전자 및 β-산화 대사 경로 관련 유전자가 제거되고, 또한 ω-트랜스아미나아제 유전자가 도입된 미생물의 경우, 지방산이 기질로 공급되면 시토크롬 P450 및 NADPH-시토크롬 P450 리덕타아제의 작용에 의해 카르복시기 반대편의 말단이 산화되어 알코올이 형성된 후, 상기 알코올은 지방 알코올 디하이드로게나아제 및 지방 알코올 옥시다아제의 작용에 의해 히드록시기가 산화되어 알데히드가 형성되지만, 지방 알데히드 디하이드로게나아제가 제거되어 있기 때문에 더 이상의 산화가 일어나지 못하게 된다. 그리고, 상기와 같이 형성된 지방산 알데히드는 ω-트랜스아미나아제의 작용에 의해 아민화되어 아미노카르복시산이 형성된다.

또한, 본 발명은

(1) ω-산화 대사 경로 중의 지방 알데히드 디하이드로게나아제 유전자 및 β-산화 대사 경로 관련 유전자가 제거되고, 또한 ω-트랜스아미나아제 유전자가 도입된 재조합 미생물을 제조하는 단계; 및

(2) 상기 재조합 미생물에 기질을 처리하여 배양하는 단계를 포함하는 중쇄 아미노카르복시산의 생산 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 ω-산화 대사 경로 중의 지방 알데히드 디하이드로게나아제 유전자 및 β-산화 대사 경로 관련 유전자가 제거되고, 또한 ω-트랜스아미나아제 유전자가 도입된 재조합 미생물을 이용하여 지방산 알데히드의 추가적인 산화 및 β-산화 대사를 방지하고, 또한 중쇄 알데히드 지방산에 아민기를 도입함으로써 중쇄 아미노카르복시산을 높은 수율로 생산할 수 있다. 상기 지방 알데히드 디하이드로게나아제 및 β-산화 대사 경로 관련 유전자는 해당 미생물 내에 존재하는 모든 상동형 유전자가 제거된 것이 바람직하지만, 경우에 따라 이들 중 일부 유전자가 제거된 재조합 미생물도 본 발명에 있어서 적용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 사용될 수 있는 미생물은 ω-산화 및 β-산화 대사 과정을 모두 갖고 있는 임의의 미생물이 제한없이 사용될 수 있으며, 예컨대 효모를 포함하는 진핵생물 및 대장균을 포함하는 원핵생물 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 구현예에 따르면, 상기 미생물은 효모를 사용하는 것이 바람직하며, 상기 효모로는 야로위아 속, 사카로마이세스 속, 피키아 속, 캔디다 속 등의 효모가 제한없이 사용될 수 있고, 이 중에서도 야로위아 리폴리티카, 캔디다 트로피칼리스, 캔디다 인판티콜라, 사카로마이세스 세레비지애, 피키아 알코홀로피아 또는 캔디다 마이코더마를 사용하는 것이 바람직하며, 야로위아 리폴리티카를 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에 있어서, 본 기술분야에 공지된 통상의 유전자 재조합 기술을 이용하여 상기 지방 알데히드 디하이드로게나아제 유전자 및 β-산화 대사 경로 관련 유전자가 제거되고, 또한 ω-트랜스아미나아제 유전자가 도입된 재조합 미생물을 제조할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 "제거"란 용어는 해당 유전자의 일부 또는 전부가 물리적으로 제거된 것뿐만 아니라, 해당 유전자로부터 전사된 mRNA로부터 단백질이 만들어지지 않는 상태 및 해당 유전자로부터 발현된 단백질이 기능을 하지 못하는 상태 등도 포괄적으로 포함하는 의미로 사용된다. 또한, 상기 "도입"이란 용어는 미생물의 게놈 내에 유전자가 삽입되거나, 또는 미생물의 게놈 내에 유전자가 삽입되지 않은 채로 해당 유전자가 발현되는 경우 모두를 포괄적으로 포함하는 의미로 사용된다.

본 발명에 있어서, "중쇄 아미노카르복시산"은 탄소수 5 내지 30, 바람직하게는 8 내지 16을 갖는 중쇄 아미노카르복시산을 모두 포함하는 의미로 사용된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 중쇄 아미노카르복시산은 탄소수 12의 12-아미노도데칸산인 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 단계 (2)의 기질은 지방산일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 구현예에 따르면, 상기 지방산으로는 탄소수 5 내지 30, 바람직하게는 8 내지 16을 갖는 지방산, 보다 바람직하게는 탄소수 12의 도데칸산이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 낙-아웃 카세트의 제작

균주 개량을 위한 유전자 낙-아웃을 위해 선별 마커로 사용될 ura3 유전자와 낙-아웃 카세트 삽입 후 ura3 유전자를 제거하기 위한 팝-아웃을 갖는 벡터를 제작하였다(도 3). 상기 Ura3 유전자는 야로위아 유래의 유전자를 사용하였고, 균주 개량에 사용된 팝-아웃 영역은 총 4가지 서열로 2종의 유전자에서 참조하였으며, 하나는 바실러스 유래의 글루타메이트 생산 유전자, 다른 하나는 살모넬라 또는 클로닝 벡터 pHUKH 유래의 his 오페론에 관여된 유전자를 사용하였다. 상기 팝-아웃 벡터의 제작을 위해 사용된 프라이머와 서열은 아래 표 1에 나타내었다.

팝-아웃 벡터
이름		염기서열	서열번호
HisG1	BglII F	aattgggcccagatctcagaccggttcagacaggat	13
	EcoRI R	tctctgggcggaattcggaggtgcggatatgaggta	14
	NotI F	tgTTTCTCGgcggccgccagaccggttcagacaggat	15
	BamHI R	TCCAACGCGTGGATCCggaggtgcggatatgaggta	16
HisG2	BglII F	aattgggcccagatctaacgctacctcgaccagaaa	17
	EcoRI R	tctctgggcggaattctcttctcgatcggcagtacc	18
	NotI F	tgTTTCTCGgcggccgcaacgctacctcgaccagaaa	19
	BamHI R	TCCAACGCGTGGATCCtcttctcgatcggcagtacc	20
glt2	BglII F	aattgggcccagatctTCAGAACTTGCGCCGATAAA	21
	EcoRI R	tctctgggcggaattcCTTTGCCAGCTAGACCATAGAG	22
	NotI F	tgTTTCTCGgcggccgcTCAGAACTTGCGCCGATAAA	23
	BamHI R	TCCAACGCGTGGATCCCTTTGCCAGCTAGACCATAGAG	24
glt3	BglII F	aattgggcccagatctATTGGCGGGTTCGTTACTT	25
	EcoRI R	tctctgggcggaattcCCTGGAAGAAGGCCGTATTATC	26
	NotI F	tgTTTCTCGgcggccgcATTGGCGGGTTCGTTACTT	27
	BamHI R	TCCAACGCGTGGATCCCCTGGAAGAAGGCCGTATTATC	28

낙-아웃 카세트의 제작은 도 4와 같이 진행하였다. 우선 야로위아의 게놈 DNA로부터 낙-아웃시킬 상동성 영역(homologous region, HR)의 PCR과 팝-아웃 벡터로부터 5'과 3'의 두 조각 PCR을 각각 진행하였다. 이후, 5' HR과 3' HR 각각을 PO-ura3 부위와 정렬(align) PCR(2^ndPCR)을 진행하여 낙-아웃 카세트를 제작하였다. 각각의 상동성 영역을 증폭하기 위해 사용한 프라이머와 서열은 표 2에 나타내었다.

유전자 결실
이름		염기서열	서열번호
ACO1	F1	TTCCTCAATGGTGGAGAAGA	29
	R1	TCTTTATCCTGTCTGAACCGGTCTG GTACCATAGTCCTTGCCATGC	30
	F2	ATCGCTACCTCATATCCGCACCTCC CTTCTGTCCCCCGAGTTTCT	31
	R2	AAGAAGGGCTTGAGAGTCG	32
ACO2	F1	CCCAACAACACTGGCAC	33
	R1	TCTTTATCCTGTCTGAACCGGTCTG CTCCTCATCGTAGATGGC	34
	F2	ATCGCTACCTCATATCCGCACCTCC gacaagacccgacaggc	35
	R2	AGACCAGAGTCCTCTTCG	36
ACO3	F1	Accttcacagagccaccca	37
	R1	ATGGCTCTCTGGGCGgtgttgggggtgttgatgatg	38
	F2	TTGTTGTGTTTCTCGcaaggttctcatcgaggcctg	39
	R2	Aggaaaggtcgaagagtgctct	40
ACO4	F1	Actgcgagagcgatctg	41
	R1	TCTTTATCCTGTCTGAACCGGTCTG TTCATGAGCATGTAGTTTCG	42
	F2	ATCGCTACCTCATATCCGCACCTCC gaggacgacaaagccggag	43
	R2	AGAGCAGAGTCCTCCTCAA	44
ACO5	F1	AACTTCCTCACAGGCAGCGAGC	45
	R1	ATGGCTCTCTGGGCG GAGTAGAGAGTGGGAGTTGAGGTC	46
	F2	ttgttgtgtttctcg ccccgtcaaggacgctgag	47
	R2	ACAGTAAGGTGGGGCTTGACTC	48
ACO6	F1	AGTCCCTCAACACGTTTACCG	49
	R1	TCTTTATCCTGTCTGAACCGGTCTG CCATTTAGTGGCAGCAACGTT	50
	F2	ATCGCTACCTCATATCCGCACCTCC GAGCTCTGATCAACCGAACC	51
	R2	AGGAAGGGTCTAATGACAGA	52
FALDH1	F1	AATCACTCCTCCTACGC	53
	R1	TCTTTATCCTGTCTGAACCGGTCTG TGGTCTCGGGGACACCTC	54
	F2	ATCGCTACCTCATATCCGCACCTCC CCATCATCAAGCCCCGAA	55
	R2	ACCGACATAATCTGAGCAAT	56
FALDH2	F1	Accactaggtgagatcgag	57
	R1	TCTTTATCCTGTCTGAACCGGTCTG CTCCGACACTACCGGAACGC	58
	F2	ATCGCTACCTCATATCCGCACCTCC CTTGCTCCCACAGTTGTT	59
	R2	GATCACCCAGAACCATAGC	60
FALDH3	F1	GTGACCCCCACCACGTCAC	61
	R1	TCTTTATCCTGTCTGAACCGGTCTG TTCTGACATTTTCAGCGCCAC	62
	F2	ATCGCTACCTCATATCCGCACCTCC CCATTACGAGCGTTTGACGG	63
	R2	CAGGGCTGGGGACCACC	64
FALDH4	F1	TACCGACTGGACCAGATTC	65
	R1	TCTTTATCCTGTCTGAACCGGTCTG CGGCAGTGGCAATGATCTTAC	66
	F2	ATCGCTACCTCATATCCGCACCTCC GACTCGATTCATCGCTCCTAC	67
	R2	CAAATCTTTCGGAAGATTCGG	68

팝-아웃 영역과 ura3를 두 조각으로 PCR하기 위해 사용한 프라이머는 표 3에 나타내었다.

팝-아웃 카세트
이름		염기서열	서열번호
HISG1	F	cagaccggttcagacaggat	69
HISG1	R	ggaggtgcggatatgaggta	70
HISG2	F	aacgctacctcgaccagaaa	71
HISG2	R	tcttctcgatcggcagtacc	72
glt2	F	TCAGAACTTGCGCCGATAAA	73
glt2	R	CTTTGCCAGCTAGACCATAGAG	74
glt3	F	ATTGGCGGGTTCGTTACTT	75
glt3	R	CCTGGAAGAAGGCCGTATTATC	76
Bipartite	Ulura3 cs 2B	Atgccctcctacgaagctcgagc	77
Bipartite	Ylura3F	Ctcccaacgagaagctggcc	78

실시예 2. 형질도입 벡터의 제작

ω-트랜스아미나아제를 야로위아 균주에 삽입시키기 위하여 도 5에 같은 벡터를 제작하였으며, 이를 위해 사용한 프라이머는 표 4에 나타내었다.

트랜스아미나아제 벡터
이름	염기서열	서열번호
EXP1 -F	ccaagcttggtaccgagctcaGagtttggcgcccgttttttc	79
EXP1 -R	CGTTGTTTTTGCATATGTGCTGTAGATATGTCTTGTGTGTAA	80
TEF -F	ccaagcttggtaccgagctcaaactttggcaaagaggctgca	81
TEF -R	CGTTGTTTTTGCATATGTTTGAATGATTCTTATACTCAGAAG	82
ALK1 -F	ccaagcttggtaccgagctcagatctgtgcgcctctacagaccc	83
ALK1 -R	CGTTGTTTTTGCATATGagtgcaggagtattctggggagga	84
XPR2t -F2	gtcgacgcaattaacagatagtttgccg	85
XPR2t -R3	ctcgagggatcccggaaaacaaaacacgacag	86
TA -F	CATATGCAAAAACAACGTACTACCTCCC	87
TA -R	gtcgacTTAGGCCAAACCACGGGCTTTC	88
ATATG2 -ER-F	actcctgcactCATatgtccaacgccctcaacctg	89
XTATG2 -ER-F	ccaatccaacacatatgtccaacgccctcaacctg	90
ER-R-1	CGTTGTTTTTGCATAGAACCGCCACCGCCGCTACCGCCACCGCCCGAACCGCCACCGCCgaatcgtgaaatatccttgggct	91
ER-R-2	CGTTGTTTTTGCATatgAGAACCGCCACCGCCGCTACCGCCACCGCCCGAACCGCCACCGCCgaatcgtgaaatatccttgggct	92
ETATG2 -ER-1	tgattacgccaagcttGagtttggcgcccgttttttc	93
ETATG2 -ER-2	acaggttgagggcgttggacatATGTGCTGTAGATATGTCTTGTGTGTAA	94
TTATG2 -ER-1	tgattacgccaagcttaaactttggcaaagaggctg	95
TTATG2 -ER-2	acaggttgagggcgttggacatATGtttgaatgattcttatactcagaag	96
ER-F	atgtccaacgccctcaacctg	97
ER-R-3	CGTTGTTTTTGCATAGAACCGCCACCGCCGCTAC	98

트랜스아미나아제 카세트의 제작은 벡터로부터 2 조각의 PCR 산물 획득시 프로모터부터 ura3까지 증폭하여 카세트 제작에 사용했다는 점을 제외하고는 도 4와 동일한 방법으로 진행하였다. 카세트 제작을 위해 사용한 프라이머는 아래 표 5에 나타내었다.

트랜스아미나아제 카세트
이름	염기서열	서열번호
TA - FALDH4 -F1	TACCGACTGGACCAGATTC	99
TA - FALDH4 -R1	CGGCAGTGGCAATGATCTTAC	100
TA - FALDH4 -F2	ctcctctatggtctagctggcaaagACTCGATTCATCGCTCCTAC	101
TA - FALDH4 -R2	CAAATCTTTCGGAAGATTCGG	102
ATATG2 -F	gtcggtaagatcattgccactgccgagatctgtgcgcctctacagac	103
ETATG2 -F	gtcggtaagatcattgccactgccgGagtttggcgcccgttttttc	104
TTATG2 -F	gtcggtaagatcattgccactgccgaaactttggcaaagaggctgc	105
XTATG2 -F	gtcggtaagatcattgccactgccgacgcgtggagagtttgggtt	106

본 발명의 재조합 미생물 균주의 개량을 위해 사용한 유전자 서열들은 각각 서열목록에 기재하였으며, 표 6에 요약하였다.

유전자	서열번호	유전자	서열번호
FALDH1	1	ACO3	7
FALDH2	2	ACO4	8
FALDH3	3	ACO5	9
FALDH4	4	ACO6	10
ACO1	5	ω-트랜스아미나아제	11
ACO2	6	Ura3	12

실시예 3. 재조합 미생물 균주의 제작

상기 실시예 1에서 제조된 낙-아웃 카세트 및 실시예 2에서 제조된 형질도입 벡터를 이용하여 야생형 야로위아 균주에 존재하는 ω-산화 대사 경로 중의 지방 알데히드 디하이드로게나아제 유전자 및 β-산화 대사 경로 관련 유전자의 일부 또는 전부가 제거되고, 또한 ω-트랜스아미나아제 유전자가 도입된 총 8종의 낙-아웃 균주를 제작하였다(도 6). 구체적으로, 유전자를 낙-아웃 또는 도입할 균주를 YPD 플레이트에 도말하여 30℃에서 16-24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 루프로 긁어서 원-스텝 버퍼(45% PEG4000, 100mM DTT, 0.1L LiAc, 25㎍ single-strand carrier DNA) 100㎕에 넣고 볼텍싱한 후, 낙-아웃 카세트 및 형질도입 벡터(1ng 이상)를 첨가하여 다시 볼텍싱하였고, 39℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 샘플을 선택 배지(YNB w/o 아미노산 6.7g/L, Glucose 20g/L)에 로딩한 뒤 30℃에서 48시간 동안 배양하여 제작된 카세트가 삽입된 균주를 선택하였다. 이후, 선택된 균주의 게놈 상에 카세트들이 정확히 삽입되었는지 확인하기 위해 표 2의 유전자 결실에 포함된 프라이들을 이용하여 PCR을 통해 확인하였다.

카세트가 삽입된 균주는 다른 카세트의 삽입을 진행하기 위해 팝-아웃 과정을 진행하였다. 선택 배지에서 선택된 균주를 YPD 배지 2㎖에 접종하여 30℃에서 16시간 이상 배양한 후, 배양액 200㎕를 5' FOA 배지(YNB w/o 아미노산 6.7g/L, Glucose 20g/L, 5' FOA 0.8g/L, uracil 0.1g/L, uridine 0.1g/L)에 도말하여 30℃에서 48시간 동안 배양하였다. 5' FOA 배지에서 자란 균주들은 YPD 플레이트와 UD 플레이트에 피킹(picking)하여 YPD 플레이트에서 자란 균주들을 선별하였고, 다시 표 2의 프라이머들을 이용하여 PCR 과정을 통해 ura3 유전자가 제거되었는지 여부를 확인하였다. Ura3가 제거된 균주들은 다른 유전자의 낙-아웃을 진행하였다.

실시예 4. 재조합 미생물 균주의 배양

배양 테스트할 균주를 전날 2 ㎖ YPD 배지(Bacto Laboratories, Yeast extract 10g/L, peptone 20g/L, glucose 20g/L)에 접종하여 30℃, 200rpm에서 하루 동안 키웠다. 24-웰 플레이트에 표 7에 기재된 조성을 갖는 성장기 배지(pH 6.0) 2 ㎖을 넣고, 전배양한 배양액 1%를 접종한 후, 플레이트 교반기에서 30℃, 450 rpm으로 하루 동안 배양하였다. 하루 배양한 균주들을 표 8에 기재된 전환기 배지(pH 7.6) 900 ㎕가 분주된 새로운 플레이트에 900 ㎕씩 접종하면서 기질 200 ㎕를 함께 첨가하였고, 30℃, 450 rpm으로 하루 동안 배양하였다. 이때, 기질로는 DMSO에 용해된 도데칸산 10 g/L를 사용하였다.

성장기 배지 pH 6.0
성분		농도(g/L)
글루코오스		50
YNB w/o 아미노산		6.7
효모 추출물		10
(NH₄)₂SO₄		5
우라실		0.05
0.1M 포스페이트 버퍼
25℃에서 0.1M 칼륨 포스페이트 버퍼의 제조
pH	1M K₂HPO₄의 부피(㎖)	1M KH₂PO₄의 부피(㎖)
6.0	13.2	86.8

전환기 배지 pH 7.6
성분		농도(g/L)
글루코오스		30
YNB w/o 아미노산		6.7
효모 추출물		3
(NH₄)₂SO₄		15
우라실		0.05
L-알라닌		10
0.1M 포스페이트 버퍼
25℃에서 0.1M 칼륨 포스페이트 버퍼의 제조
pH	1M K₂HPO₄의 부피(㎖)	1M KH₂PO₄의 부피(㎖)
7.6	86.6	13.4

그 결과, β-산화 대사 관련 유전자만 낙-아웃된 Y1-11 균주의 경우 기질인 도데칸산으로부터 12-아미노도데칸산을 생산할 수 없었지만, 지방 알데히드 디하이드로게나아제 유전자가 추가로 낙-아웃되고 ω-트랜스아미나아제가 도입된 Y2-20, Y-2-25, Y2-30, Y2-35, Y2-36 및 Y3-1 균주는 모두 뛰어난 12-아미노도데칸산 합성 능력을 보여주었다(도 7). 또한, 상기 Y2-36 균주는 플라스크에서 배양시에 8 ㎎/L 정도의 12-아미노도데칸산 합성 능력을 보여주었다(도 8). 이하의 실험에서는 Y2-36 균주를 이용한 시료 분석 실험을 수행하였다.

실시예 5. 시료의 분석

실시예 4에서 12-아미노도데칸산 합성 능력이 가장 뛰어난 것으로 나타난 Y2-36 균주의 배양액 500 ㎕에 6N 황산 100 ㎕를 넣은 후, 메틸화 반응을 위해 톨루엔 10% 및 염산 2.2%가 포함된 메탄올 500 ㎕를 첨가하였고 100℃에서 1시간 동안 메틸화 반응을 수행하였다. 상기 반응액에 10N 수산화나트륨 100 ㎕ 및 디에틸 에테르 500 ㎕를 넣고 충분히 볼텍싱(vortexing)한 후 12,000rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 이후, 용매층만 분리하여 하기의 분석 조건에서 GC/MS 분석을 수행하였다.

분석 조건

① 기기: Agilent 5975 MSD

② 컬럼: HP-5MS

③ 온도: 오븐(150℃ 내지 230℃)

④ 캐리어 가스: He

⑤ 유속: 1 ㎖/분

그 결과, 본 발명의 재조합 Y2-36 균주는 기질인 도데칸산으로부터 12-아미노도데칸산을 합성할 수 있음을 확인하였다(도 9).

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> METHOD FOR PRODUCTION OF MEDIUM CHAIN AMINOCARBOXYLIC ACID <130> 2016-DPA-1675 <150> KR 10-2015-0149254 <151> 2015-10-27 <160> 106 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1602 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <220> <221> gene <222> (1)..(1602) <223> FALDH1 gene <400> 1 atgtcctggg aaacaatcac tcctcctacg ccaatcgata cgtttgacag caacttgcaa 60 cgtcttcgag actctttcga gaccggcaag ctcgactctg tcgactaccg tctcgagcag 120 ctgcgaaccc tgtggttcaa gttctacgac aacctcgaca acatctacga ggcggtcacc 180 aaggatctcc atcgacccag gttcgaaacc gagctcaccg aggtactgtt tgttcgagac 240 gagttctcca ccgtcatcaa gaacctgcga aagtgggtca aggaagaaaa ggtggagaac 300 cccggaggcc ccttccagtt tgccaacccc cgaatccgac ccgttcctct gggagtggtg 360 ctggtcatca ctccctggaa ctaccccgtc atgctcaaca tctcacctgt gattgccgcc 420 attgctgccg gctgtcccat cgtgctcaag atgtccgagc tgtctcccca cacttccgct 480 gttcttggcc gaatcttcaa ggaggccctg gaccccggta tcatccaggt tgtttacgga 540 ggtgtccccg agaccaccgc ccttcttacc cagcattggg acaagatcat gtacaccgga 600 aacggagccg ttggtcgaat catcgcccag gccgcggtca agaacctgac tcctctagct 660 cttgagcttg gtggcaagtc acccgtgttc atcacttcca actgcaagag cgttatgacg 720 gccgctcggc gaatcgtgtg gggcaagttt gtcaacgccg gccagatctg tgtcgctcca 780 gactacattc tggttgctcc cgaaaaggag gccgagctcg tcgcttgtat caaggaggtg 840 ctccaagaac gatacggctc caagagagac gcccaccacc ccgatctgtc ccatatcatt 900 tccaagcccc attggaagcg tattcacaac atgatcgccc agaccaaggg agacatccag 960 gtgggtggac tcgagaacgc cgacgaagac caaaagttca tccagcccac aatcgtctcc 1020 aacgttccag atgacgacat tctcatgcag gacgagattt tcggacccat catccccatc 1080 atcaagcccc gaaccctcgg ccagcaggtt gattacgtca caagaaacca tgacaccccc 1140 ctggccatgt acatcttctc tgacgacccc aaggaggtgg actggctaca gacccgaatc 1200 cgagctggtt ctgtaaacat caacgaggtc attgagcagg tcggactggc ctctctgcct 1260 ctcagtggag ttggagcttc cggaaccgga gcataccatg gaaaattctc cttcgatgtc 1320 ttcacccaca agcaggccgt tatgggacag cccacctggc ccttctttga atacctcatg 1380 tattaccggt accctcctta ctccgagtac aagatgaagg tgctccgaac cctgttccca 1440 ccggttctga ttcctcgaac cggccgaccc gacgctactg ttcttcagcg agttctcggc 1500 aacaagctgc tttggatcat tattgccgcc cttgttgcgt acgccaaacg aaatgagctg 1560 ctcatcacca ttgctcagat tatgtcggtg tttattaagt ag 1602 <210> 2 <211> 1566 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <220> <221> gene <222> (1)..(1566) <223> FALDH2 gene <400> 2 atgtcagagt tcgattggga gtcaattttg ccggcaacac cactaggtga gatcgagaag 60 gatattcaaa ccctacgaca gggcttcagg tccggaaaga cgctggattt gaacttcagg 120 cttgaccaga ttcgtaagct tttctatgct ctctatgata atgtcgatgc gatcaaagaa 180 gcaattcata aggatctcgg acgtccggtc ttcgagactg aactttgcga gatctccttt 240 cagtggggtg aattcaataa tgtcgtttct aacttgaaga aatgggcagc tgatgagacg 300 gtgaagggaa ccaccattca atacactctc acccggccaa agattagaaa gcgtccactt 360 ggtaccgtcc ttatcatatc tccttggaac tacccatttg ttctgaccat ctctcccctg 420 cttgctgctc tagcggcagg aaatacggtg gccctaaagt tctccgaaat gtgcccacat 480 acatcgcttt tgctgggaaa gttgtgcaca gaggcacttg ataaagaaat tttcaaggca 540 tttcagggag gcgttccggt agtgtcggag attctcaagt acaagttcga caaaatcatg 600 tacactggaa atcatcgagt tggcaagatc atcttggacg cagctaacaa atacctcacc 660 cccgttattt tggagcttgg aggcaaatca ccagtcttcg tgactaagaa ttgccaaaac 720 gtatctcttg ctgccaagcg tgctctgtgg ggtaaactgg tcaacgctgg acaaacatgc 780 gttgcccccg attacatcat cgtcgagcct gaggtcgaac aggagtttat caaagcttgc 840 cagtactggg ttgagaagtt ctaccgaggt ggagttgact ctgatcataa ggacttcact 900 catattgcaa cacctggaca ttggagacga ttgacatcca tgcttgccca gacagaggga 960 aatatcatca caggcggaaa ttcggacgag aaatcacggt ttcttgctcc cacagttgtt 1020 gcgaaagttc ctgatggtga ttctttgatg aatgatgaga tctttggccc tatcctgccc 1080 atcctgacag ccagatccgt tgacgaaggt attcgctatg ttcatgagaa tcacgacact 1140 cccctggcca tgtatgtctt tactgataat gcatcagaag gagagtatat ccaatctcaa 1200 atcaactcag gtggcctgat attcaatgat agtcttgttc acgttggctg cgtgcaggcg 1260 ccttttggtg gtgtcggcca atccggctat gggtcttatc acggcgaaga ttccttcttg 1320 gctttttcac acaggcagac tttcatgaag cagccccatt tcatcgaacg accaatggcg 1380 atcagatatg ccccctacac tagtcgaaaa caaaaggctg tccagggtag tctagctgct 1440 ccatcttttc ctcgaacagg aaaggttgac cgctccctgt tggagcggat atttggtaag 1500 ctatggttct gggtgatcgt tttagggcta ggagcagcca gtttgaagtc aggaattttc 1560 ttatga 1566 <210> 3 <211> 1590 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <220> <221> gene <222> (1)..(1590) <223> FALDH3 gene <400> 3 atgactacca ctgccacaga gacccccacg acaaacgtga cccccaccac gtcactgccc 60 aaggagaccg cctccccagg agggaccgct tctgtcaaca cgtcattcga ctgggagagc 120 atctgcggca agacgccgtt ggaggagatc gagtcggaca tttcgcgtct caaaaagacc 180 ttccgatcgg gcaaaactct ggatctggac taccgactcg accagatccg aaacctggcg 240 tatgcgatcc gcgataacga aaacaagatc cgcgacgcca tcaaggcgga cctgaaacga 300 cctgacttcg aaaccatggc ggccgagttc tcggtccaga tgggcgaatt caactacgtg 360 gtcaaaaacc tgccgaaatg ggtcaaggac gaaaaagtca agggaaccag catggcgtac 420 tggaactcgt cgccaaagat ccggaaacgg cccctgggct ccgtgcttgt catcacgccc 480 tggaactacc cactgattct ggccgtgtcg cctgttctgg gcgccattgc cgcaggcaac 540 accgtggcgc tgaaaatgtc agaaatgtca cccaacgcgt caaaggtgat tggcgacatt 600 atgacagctg ccctggaccc ccagctcttt caatgcttct tcggaggagt ccccgaaacc 660 accgagatcc tcaaacacag atgggacaag atcatgtaca ccggaaacgg caaagtgggc 720 cgaatcatct gtgaggctgc caacaagtac ttgacacctg tggagctcga actcggagga 780 aagtcgcctg ttttcgtcac caaacactgc tccaacctgg aaatggccgc ccgccgaatc 840 atctggggca aattcgtcaa cggaggacaa acctgcgtgg ctccagacta cgttctggtg 900 tgtcccgagg tccacgacaa atttgtggct gcctgtcaaa aggtgctgga caagttctac 960 cctaacaact ctgccgagtc cgagatggcc catatcgcca cccctctcca ttacgagcgt 1020 ttgacgggcc tgctcaattc cacccgaggt aaggtcgttg ctggaggcac tttcaactcg 1080 gccacccggt tcattgctcc tacgattgtc gacggagtgg atgccaacga ttctctgatg 1140 cagggagaac tgtttggtcc tcttctcccc attgtcaagg ccatgagcac cgaggctgcc 1200 tgcaactttg tgcttgagca ccaccccacc cccctggcag agtacatctt ttcagataac 1260 aattctgaga ttgattacat ccgagatcga gtgtcgtctg gaggtctcgt gatcaacgac 1320 actctgatcc acgtgggatg cgtacaggcg ccctttggag gtgtcggaga cagtggaaat 1380 ggaggatacc atggcaagca cactttcgat ttgttcagcc attctcagac ggtcctcaga 1440 caacccggat gggtcgaaat gctgcagaag aaacggtatc ctccgtacaa caagagcaac 1500 gagaagtttg tccggagaat ggtggtcccc agccctggtt ttccccggga gggtgacgtg 1560 agaggatttt ggtcgagact cttcaactag 1590 <210> 4 <211> 1560 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <220> <221> gene <222> (1)..(1560) <223> FALDH4 gene <400> 4 atgtctacct ttgattggga atccattgtg cctgccactc ctctcgacca gattcctggc 60 gacatccagc gactgcgaaa gggcttccga tccggaaaga ccctcgatct caactaccga 120 ctggaccaga ttcgaaactt gcactacgtc ctcagagaca atgtcgaggc catcaaggac 180 gccgtgtaca aggatctcgg ccgacccaag cacgagactg acctgtgcga ggtgggtttc 240 ctgtggggcg agtttaacaa cgtggttgcc aacctcaaga agtgggccgc cgacgaggac 300 gtcaagacca acctgcagta ctccatctcc tcccccaaga tccgaaagcg acctcttgga 360 aacgtgctca tcatctcgcc ctggaactac ccctttatgc tgaccgtgtc tcctctcatt 420 ggagctctgg ctgccggtaa cactgtggct gtcaagttct ccgaaatggc cccccacact 480 tccaaaattg ttggcgactt gtgcaccaag gccctcgacc ccgacgtctt ccaggccatc 540 cagggaggtg tccccgtcgt caccaagacc ctcgagcaga agttcgacaa gattatgtac 600 actggtaacc acactgtcgg taagatcatt gccactgccg ccaacaagta cctgacaccc 660 gtcatcctcg agctcggagg taagtcgccc gtttttgtca ccaagaactg caagaacatc 720 aagcttgccg ctaagcgagc cctgtggggt aaggtggtaa acgctggcca gacctgtgtg 780 gctcccgact acgtgattgt cgagcccgag gtggagcagg agtttatcga cgcctgcaag 840 tactggatta acgagttcta cagtggtaag attgaccagt acaaccccga ctttgccaag 900 atcgccaccc ccaaccactg gaaccgactt acctccatgt tgagcaagtc caagggagag 960 atcattactg gaggtaacac tgacgagaag actcgattca tcgctcctac tgtcgtcgca 1020 aaggtccccg acaatgattc cctgatggag gacgagattt tcggccctct tctgcccatt 1080 ctcactgccc gatccgtcga ggagggtatc aagtacgtgc acgagaacca cgacacccct 1140 cttgccatgt acgtcttcac tgacaaggcc tctgagggcg actacatcca gtcccagatc 1200 aactctggtg gccttatctt caatgacact ctgatccacg ttggatgtgt ccaggctccg 1260 tttggtggtg tcggcatgtc cggttacggt gcttaccatg gcgaggactc cttcctggcc 1320 ttcacccacc gacaaaccta cctcaaccag cccaagcttc tggagcctct tcaggacgtg 1380 cgatacgccc cctacaccaa aaccaagcga agcatggtca agaacctgct gctggtcggc 1440 cccattttcc cccgaaccgg 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acccgatgag gacgaggaga tttgcgacct ggacgagtag 2100 2100 <210> 10 <211> 2070 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <220> <221> gene <222> (1)..(2070) <223> ACO6 gene <400> 10 atgctctctc aacagtccct caacacgttt accgagcccc cggtcgaaat ggcccgggag 60 cgaaaccaga cttccttcaa cccgcgtctg ctgacgtact ttctggacgg aggcgaaaag 120 aacactctgc ttatggaccg actgatgcaa gagtacgagc gagaccctgt gtttcgaaac 180 gagggcgact acgatattac cgatgtggcc cagtcgcgag agctggcctt caagcgaatc 240 gccaagctca tcgagtatgt gcacaccgac gacgaggaga cgtatctgta ccgatgcatg 300 cttctgggcc aaatcgatat gggagccttt gcccggtacg ccatccacca cggagtctgg 360 ggcggtgcca ttcgaggtgc aggaacgcct gagcagtacg aattctgggt caagaaagga 420 tctctgtcgg ttaagaagtt ctatggatcc ttctccatga ccgagctggg ccacggcagt 480 aacttggtgg gtctggagac caccgccacc ctggacaaga acgcagacga gttcgtgatc 540 aacactccca acgttgctgc cactaaatgg tggatcggag gagccgccga taccgccact 600 cacacagctg tgtttgcacg tctcattgtc gacggagagg accacggtgt caagacgttt 660 gtggtgcagc tgcgagacgt ggagactcac aacctgatgc ctggtattgc tatcggagac 720 tgcggcaaga agatgggacg tcagggaacc gacaacggct ggatccagtt cacccatgtg 780 cgaattcccc gacagaacat gctcatgcga tactgtcacg tggacagcga cggaaatgtt 840 accgagccca tgatggctca gatggcctac ggagctcttc tggctggccg agtcggaatg 900 gccatggaca gttatttcac ctcgcgaaag ttccttacca ttgctcttcg atatgccacc 960 attcgacgag cttttgctgc cggaggaggt caggagacca agctgatcga ctacccttac 1020 caccagcgac gtctgctccc cctcatggcc cagacatatg ccatcaagtg caccgccgat 1080 aaggtcagag atcagttcgt caaggtcacc gacatgctcc taaacctcga tgtttctgac 1140 caagaggccg tgcccaaggc cattgccgag gctaaggagc tcttctctgt ttctgctggt 1200 gtcaaggcta ccacaacttg ggcttgcgca cacaccattg accagtgcag acaggcgtgt 1260 ggaggccacg gatactctgc ttacaacggt tttggacgtg cttactccga ttgggtgatc 1320 cagtgcacct gggagggaga caataacatt ctgtgtctgt cagctggcag agctctggtc 1380 cagtctaacc gagctgtccg ggctggcaag cccattggag gtcctaccgc ctacctggct 1440 gctcccgctg gttcccccaa gctcgctggt cgaaacttgt acgaccccaa ggtcatgatt 1500 ggggcctggg agactgtttc ccgagctctg atcaaccgaa ccaccgatga gtttgaggtg 1560 ctggccaaga agggtctgtc tactgcccag gcctacgagg agctgtccca gcaacgattc 1620 ctgtgtactc gaatccacac ccgtctgtac atggtcaaga acttctacga gcgaattgcc 1680 gaggagggca ccgagttcac caaggagcct cttaccagac ttgccaacct gtacgccttc 1740 tggtccgtcg aagaggaggc tggaatcttc ctccgagagg gctacatcac tccccaggag 1800 ctcaagtaca tcagtgccga gatccgaaag cagctcttgg aggtgcgaaa ggacgtcatt 1860 ggctacaccg atgccttcaa cgtgcctgat tttttcctca actctgccat tggacgagct 1920 gacggagatg tctacaagaa ctacttcaag gtggtcaaca ctcagaaccc tccccaagac 1980 cctcgacctc cttattacga gtctgtcatt agacccttcc tgttccgaaa ggacgaggat 2040 gaggaaattt gctctcttga ggatgagtag 2070 <210> 11 <211> 1380 <212> DNA <213> Chromobacterium violaceum DSM30191 <220> <221> gene <222> (1)..(1380) <223> transaminase gene <400> 11 atgcaaaaac aacgtactac ctcccaatgg agagaattgg atgcagccca tcatttgcat 60 ccatttaccg acaccgcatc cttgaatcaa gctggcgcac gtgtgatgac ccgtggcgag 120 ggcgtttacc tgtgggattc tgagggtaac aaaatcattg atggtatggc cggtttgtgg 180 tgtgtgaacg tgggttatgg tcgtaaagac ttcgcagaag cagcccgtcg tcagatggaa 240 gaattgcctt tctacaacac tttcttcaaa actacccacc cagctgtggt cgagttgtct 300 tccttgttgg ccgaagttac cccagctggt ttcgaccgcg ttttctacac caattcgggc 360 tccgagtctg ttgacaccat gatccgtatg gtgcgccgtt attgggacgt ccagggcaag 420 cctgagaaga aaaccttgat tggccgctgg aatggttatc atggttccac cattggtggc 480 gcatcgttgg gcggtatgaa atacatgcac gaacagggcg atttgcctat cccaggtatg 540 gcccacattg agcagccttg gtggtataag cacggtaaag atatgacccc tgacgaattt 600 ggtgtggttg ccgcacgctg gttggaagaa aagatcttgg agatcggtgc cgataaggtc 660 gcagcctttg ttggcgagcc aattcaaggt gcaggtggtg ttatcgtccc acctgcaacc 720 tactggccag agatcgagcg tatttgccgt aagtatgacg ttttgttggt cgccgatgaa 780 gtgatctgcg gcttcggtcg caccggtgag tggtttggtc accaacactt tggcttccag 840 cctgacttgt ttaccgccgc aaagggcttg tcttccggtt acttgcctat tggtgctgtt 900 tttgtgggta aacgcgtcgc agaaggcttg attgccggtg gcgactttaa tcatggcttc 960 acctactccg gccatcctgt gtgcgcagca gtcgcacacg caaatgtcgc cgctttgcgc 1020 gacgaaggca ttgtacagcg cgttaaagac gatattggtc catacatgca gaagcgctgg 1080 cgtgaaacct tctctcgttt cgagcacgtc gatgatgtgc gtggcgttgg tatggttcaa 1140 gccttcactt tggtcaaaaa caaggcaaag cgtgagttgt ttcctgattt cggtgagatc 1200 ggtaccttgt gccgtgacat ctttttccgt aacaacttga ttatgcgtgc atgtggtgat 1260 cacatcgtgt ccgcaccacc tttggttatg acccgtgccg aagtggacga gatgttggca 1320 gtggcagagc gctgtttgga agagtttgag cagaccttga aagcccgtgg tttggcctaa 1380 1380 <210> 12 <211> 1205 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <220> <221> gene <222> (1)..(1205) <223> Ura3 gene <400> 12 cgcccagaga gccattgacg ttctttctaa tttggaccga tagccgtata gtccagtcta 60 tctataagtt caactaactc gtaactatta ccataacata tacttcactg ccccagataa 120 ggttccgata aaaagttctg cagactaaat ttatttcagt ctcctcttca ccaccaaaat 180 gccctcctac gaagctcgag ctaacgtcca caagtccgcc tttgccgctc gagtgctcaa 240 gctcgtggca gccaagaaaa ccaacctgtg tgcttctctg gatgttacca ccaccaagga 300 gctcattgag cttgccgata aggtcggacc ttatgtgtgc atgatcaaaa cccatatcga 360 catcattgac gacttcacct acgccggcac tgtgctcccc ctcaaggaac ttgctcttaa 420 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primer for HisG1 <400> 13 aattgggccc agatctcaga ccggttcaga caggat 36 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoRI R primer for HisG1 <400> 14 tctctgggcg gaattcggag gtgcggatat gaggta 36 <210> 15 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NotI F primer for HisG1 <400> 15 tgtttctcgg cggccgccag accggttcag acaggat 37 <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BamHI R primer for HisG1 <400> 16 tccaacgcgt ggatccggag gtgcggatat gaggta 36 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BglII F primer for HisG2 <400> 17 aattgggccc agatctaacg ctacctcgac cagaaa 36 <210> 18 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoRI R primer for HisG2 <400> 18 tctctgggcg gaattctctt ctcgatcggc agtacc 36 <210> 19 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NotI F primer for HisG2 <400> 19 tgtttctcgg cggccgcaac gctacctcga ccagaaa 37 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BamHI R primer for HisG2 <400> 20 tccaacgcgt ggatcctctt ctcgatcggc agtacc 36 <210> 21 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BglII F primer for glt2 <400> 21 aattgggccc agatcttcag aacttgcgcc gataaa 36 <210> 22 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoRI R primer for glt2 <400> 22 tctctgggcg gaattccttt gccagctaga ccatagag 38 <210> 23 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NotI F primer for glt2 <400> 23 tgtttctcgg cggccgctca gaacttgcgc cgataaa 37 <210> 24 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BamHI R primer for glt2 <400> 24 tccaacgcgt ggatcccttt gccagctaga ccatagag 38 <210> 25 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BglII F primer for glt3 <400> 25 aattgggccc agatctattg gcgggttcgt tactt 35 <210> 26 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoRI R primer for glt3 <400> 26 tctctgggcg gaattccctg gaagaaggcc gtattatc 38 <210> 27 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NotI F 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tctttatcct gtctgaaccg gtctgttcat gagcatgtag tttcg 45 <210> 43 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F2 primer for ACO4 <400> 43 atcgctacct catatccgca cctccgagga cgacaaagcc ggag 44 <210> 44 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R2 primer for ACO4 <400> 44 agagcagagt cctcctcaa 19 <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F1 primer for ACO5 <400> 45 aacttcctca caggcagcga gc 22 <210> 46 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1 primer for ACO5 <400> 46 atggctctct gggcggagta gagagtggga gttgaggtc 39 <210> 47 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F2 primer for ACO5 <400> 47 ttgttgtgtt tctcgccccg tcaaggacgc tgag 34 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R2 primer for ACO5 <400> 48 acagtaaggt ggggcttgac tc 22 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F1 primer for ACO6 <400> 49 agtccctcaa cacgtttacc g 21 <210> 50 <211> 46 <212> DNA <213> 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20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for glt2 <400> 73 tcagaacttg cgccgataaa 20 <210> 74 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for glt2 <400> 74 ctttgccagc tagaccatag ag 22 <210> 75 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for glt3 <400> 75 attggcgggt tcgttactt 19 <210> 76 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for glt3 <400> 76 cctggaagaa ggccgtatta tc 22 <210> 77 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ulura3 cs 2B primer for Bipartite <400> 77 atgccctcct acgaagctcg agc 23 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ylura3F primer for Bipartite <400> 78 ctcccaacga gaagctggcc 20 <210> 79 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EXP1-F primer for transaminase vector <400> 79 ccaagcttgg taccgagctc agagtttggc gcccgttttt tc 42 <210> 80 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EXP1-R primer for transaminase vector <400> 80 cgttgttttt gcatatgtgc tgtagatatg tcttgtgtgt aa 42 <210> 81 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEF-F primer for transaminase vector <400> 81 ccaagcttgg taccgagctc aaactttggc aaagaggctg ca 42 <210> 82 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEF-R primer for transaminase vector <400> 82 cgttgttttt gcatatgttt gaatgattct tatactcaga ag 42 <210> 83 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK1-F primer for transaminase vector <400> 83 ccaagcttgg taccgagctc agatctgtgc gcctctacag accc 44 <210> 84 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK1-R primer for transaminase vector <400> 84 cgttgttttt gcatatgagt gcaggagtat tctggggagg a 41 <210> 85 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XPR2t-F2 primer for transaminase vector <400> 85 gtcgacgcaa ttaacagata gtttgccg 28 <210> 86 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XPR2t-R3 primer for transaminase vector <400> 86 ctcgagggat cccggaaaac aaaacacgac ag 32 <210> 87 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TA-F primer for transaminase vector <400> 87 catatgcaaa aacaacgtac tacctccc 28 <210> 88 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TA-R primer for transaminase vector <400> 88 gtcgacttag gccaaaccac gggctttc 28 <210> 89 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATATG2-ER-F primer for transaminase vector <400> 89 actcctgcac tcatatgtcc aacgccctca acctg 35 <210> 90 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XTATG2-ER-F primer for transaminase vector <400> 90 ccaatccaac acatatgtcc aacgccctca acctg 35 <210> 91 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ER-R-1 primer for transaminase vector <400> 91 cgttgttttt gcatagaacc gccaccgccg ctaccgccac cgcccgaacc gccaccgccg 60 aatcgtgaaa tatccttggg ct 82 <210> 92 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ER-R-2 primer for transaminase vector <400> 92 cgttgttttt gcatatgaga accgccaccg ccgctaccgc caccgcccga accgccaccg 60 ccgaatcgtg aaatatcctt gggct 85 <210> 93 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ETATG2-ER-1 primer for transaminase vector <400> 93 tgattacgcc aagcttgagt ttggcgcccg ttttttc 37 <210> 94 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ETATG2-ER-2 primer for transaminase vector <400> 94 acaggttgag ggcgttggac atatgtgctg tagatatgtc ttgtgtgtaa 50 <210> 95 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTATG2-ER-1 primer for transaminase vector <400> 95 tgattacgcc aagcttaaac tttggcaaag aggctg 36 <210> 96 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTATG2-ER-2 primer for transaminase vector <400> 96 acaggttgag ggcgttggac atatgtttga atgattctta tactcagaag 50 <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ER-F primer for transaminase vector <400> 97 atgtccaacg ccctcaacct g 21 <210> 98 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ER-R-3 primer for transaminase vector <400> 98 cgttgttttt gcatagaacc gccaccgccg ctac 34 <210> 99 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TA-FALDH4-F1 primer for transaminase vector <400> 99 taccgactgg accagattc 19 <210> 100 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TA-FALDH4-R1 primer for transaminase vector <400> 100 cggcagtggc aatgatctta c 21 <210> 101 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TA-FALDH4-F2 primer for transaminase vector <400> 101 ctcctctatg gtctagctgg caaagactcg attcatcgct cctac 45 <210> 102 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TA-FALDH4-R2 primer for transaminase vector <400> 102 caaatctttc ggaagattcg g 21 <210> 103 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATATG2-F primer for transaminase vector <400> 103 gtcggtaaga tcattgccac tgccgagatc tgtgcgcctc tacagac 47 <210> 104 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ETATG2-F primer for transaminase vector <400> 104 gtcggtaaga tcattgccac tgccggagtt tggcgcccgt tttttc 46 <210> 105 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTATG2-F primer for transaminase vector <400> 105 gtcggtaaga tcattgccac tgccgaaact ttggcaaaga ggctgc 46 <210> 106 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XTATG2-F primer for transaminase vector <400> 106 gtcggtaaga tcattgccac tgccgacgcg tggagagttt gggtt 45

Claims

ω-산화 대사 경로 중의 지방 알데히드 디하이드로게나아제 유전자 및 β-산화 대사 경로 관련 유전자가 제거되고, 또한 ω-트랜스아미나아제 유전자가 도입된 재조합 미생물.
청구항 1에 있어서,
상기 지방 알데히드 디하이드로게나아제 및 β-산화 대사 경로 관련 유전자는 미생물 내에 존재하는 모든 상동형 유전자가 제거된 재조합 미생물.
청구항 1에 있어서,
상기 지방 알데히드 디하이드로게나아제 및 β-산화 대사 경로 관련 유전자는 해당 미생물 내에 존재하는 일부 상동형 유전자가 제거된 재조합 미생물.
청구항 1에 있어서,
상기 지방 알데히드 디하이드로게나아제 유전자는 FALDH1, FALDH2, FALDH3 및 FALDH4 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 재조합 미생물.
청구항 4에 있어서,
상기 FALDH1, FALDH2, FALDH3 및 FALDH4 유전자는 각각 서열번호 1 및 서열번호 4로 이루어지는 염기서열을 포함하는 재조합 미생물.
청구항 1에 있어서,
상기 β-산화 대사 경로 관련 유전자는 아실-CoA 옥시다아제 유전자인 재조합 미생물.
청구항 6에 있어서,
상기 아실-CoA 옥시다아제 유전자는 ACO1, ACO2, ACO3, ACO4, ACO5 및 ACO6 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 재조합 미생물.
청구항 7에 있어서,
상기 ACO1, ACO2, ACO3, ACO4, ACO5 및 ACO6 유전자는 각각 서열번호 5 및 서열번호 10으로 이루어지는 염기서열을 포함하는 재조합 미생물.
청구항 1에 있어서,
상기 ω-트랜스아미나아제 유전자는 서열번호 11로 이루어지는 염기서열을 포함하는 재조합 미생물.
청구항 1에 있어서,
상기 미생물은 효모 또는 대장균인 재조합 미생물.
청구항 10에 있어서,
상기 효모는 야로위아 속, 사카로마이세스 속, 피키아 속 및 캔디다 속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 효모인 재조합 미생물.
청구항 11에 있어서,
상기 야로위아 속의 효모는 야로위아 리폴리티카인 재조합 미생물.
(1) 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 제조하는 단계; 및
(2) 상기 재조합 미생물에 기질을 처리하여 배양하는 단계를 포함하는 중쇄 아미노카르복시산의 생산 방법.
청구항 13에 있어서,
상기 기질은 지방산인 중쇄 아미노카르복시산의 생산 방법.
청구항 14에 있어서,
상기 지방산은 탄소수 5 내지 30을 갖는 지방산인 중쇄 아미노카르복시산의 생산 방법.
청구항 15에 있어서,
상기 지방산은 도데칸산인 중쇄 아미노카르복시산의 생산 방법.
청구항 13에 있어서,
상기 중쇄 아미노카르복시산은 탄소수 5 내지 30을 갖는 중쇄 아미노카르복시산 화합물인 중쇄 아미노카르복시산의 생산 방법.
청구항 17에 있어서,
상기 중쇄 아미노카르복시산은 12-아미노도데칸산인 중쇄 아미노카르복시산의 생산 방법.