KR20170036829A - 동백 식물 세포 배양 추출물을 함유한 항노화 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동백 식물세포 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 동백 식물세포 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 항노화 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 동백 식물 세포 배양물 또는 그 추출물 함유 피부 외용제 조성물은 피부 세포에 독성이 없으면서도 피부노화방지, 피부 콜라겐 합성능이 탁월하여 주름 개선에 효능이 있으며, 피부 보습, 피부 진정, 항균, 여드름 개선, 자외선에 따른 피부 보호, 피부 손상 개선, 피부 수렴, 피부 장벽 강화, 탄력 개선 효능을 가지고 있다.

Description

동백 식물 세포 배양 추출물을 함유한 항노화 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법{Anti-aging composition for skin external application comprising Camellia japonica Plant Cell Culture Extract and Method for Preparing the Same}

본 발명은 동백 식물세포 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 동백 식물세포 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 항노화 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

인간의 피부는 시간이 지남에 따라 내적으로는 신진대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하고, 면역 세포의 기능과 세포들의 활성이 저하되어 생체에 필요한 면역 단백질 및 생체 구성 단백질들의 생합성이 줄어들게 되어 생기는 내인성 노화(intrinsic aging)와, 외적으로는 각종 오염물질과 자외선에 의한 광노화(photoaging)에 의해, 피부가 얇아지며 (내인성 노화의 경우), 탄력이 감소하게 되며 자외선 조사에 노출됨에 따라 표피 내 각질형성세포와 멜라닌세포가 UVB에 의해 세포손상을 받게 된다. 피부 노화는 태양광선에 노출되지 않는 부위에서 나타나는 연대학적 노화 (chronologic aging)와 태양광선의 노출부에서 일어나는 퇴행성 변화가 연대학적 노화와 복합되어 일어나는 광인성 노화 (actinic ageing) 로 구분된다. 연대학적 노화에서는 특징적인 임상 피부소견으로 미세한 주름, 진피의 위축, 피하지방층의 감소 등이 관찰된다. 광노화 과정에서는 거칠고 깊은 주름 (coatse wrinkling and furrowing)이 나타나고 비정상적인 탄력질양 물질(elastotic material)이 축적되어 피부가 가죽같이 두터워지며 느슨해진다. 만성적 일광손상을 입은 피부에서 볼 수 있는 현상은 진피의 상부 쪽 교원질의 비정상적인 탄력질양 물질의 침착 (solar elastosis)과 프로테오글리칸 (proteoglycan)이 증가되고 진피의 주단백질인 콜라겐이 현저히 감소되는 것이다. 콜라겐은 피부에 강도와 장력을 부여하며 이로 인해 외부의 자극이나 힘으로부터 피부를 보호하는 역할을 하며 진피층의 90%를 차지하고 있어 콜라겐의 감소는 피부와 노화와 밀접한 관계를 가지고 있다.피부를 구성하는 세포에서는 내인성 노화나, 광노화에 의해 세포활성이 떨어지고, 신호전달체계가 불완전해지면서 피부조직을 분해하는 효소인 MMPs (matrix metalloproteinases)의 생합성이 증가하고, 콜라겐의 생합성이 감소하여 주름살이 생기고 탄력이 감소하고, 피부흑화를 초래하는 멜라닌생성이 증가하는 것으로 알려져있다.

한편, 피부장벽(Stratum corneum, Skin barrier)은 죽은 각질세포(Coneocyte)와 세포간 지질(Intercellular lipid)로 구성되어 있고, 외부 자극으로부터 피부를 보호하며 피부에서 수분이 증발하는 것을 막아주는 피부 보호막으로서 피부건강에 핵심적인 기능을 담당한다. 즉, 체내에서 지나친 수분 방출을 막고 화학물질이나 미생물처럼 해로운 물질이 우리 몸 안으로 들어오는 것을 막아준다. 죽은 각질세포의 표면을 구성하는 각질세포 외피에는 세포간 지질의 안정성에 중요한 역할을 한다. 각질세포 외피는 involucrin, loricrin, filaggrin 등의 단백질 막으로 구성되어있다.

각질형성세포는 분화를 통화 각질화 과정을 통해 피부 장벽을 만든다. 피부 장벽 기능은 노화가 진행되거나 외부 요소들에 의해 파괴될 수 있으며, 노화된 피부는 아세톤 또는 테이프 스트리핑(tape stripping)에 의해 쉽게 파괴된다. 피부 장벽의 손상은 피부 수분량 감소와 주름을 일으킬 수 있다.

또한, 밀착연접은 세포연접의 한 종류로 occluding, claudin, tricellulin, junctional adhesion molecule(JAM), zona occluden(ZO) 등으로 구성되어 있다. 밀착연접은 세포막에 포함된 부분과 세포내 부분으로 나눌 수 있다. Occludin과 claudin은 세포막에 포함된 밀착연접 구성 단백질이다. Occludin은 밀착연접에서 처음으로 발견된 막관통 단백질로 4개의 막관통 영역을 가지고 있다. Occludin은 밀착연접의 구성 성분일 뿐만 아니라 밀착연접의 기능을 조절하는 것으로 알려졌다. Occludin과 함께 밀착연접 구성 단백질인 claudin도 4개의 막관통 영역을 가지고 있다. 밀착연접은 세포 간의 연결고리로 이웃한 세포와 세포 사이의 간격을 메워주고 작은 물질들의 이동을 조절하는 기능을 하며, 세포와 세포 간의 물질투과를 조절하고 세포의 극성을 유지하는 역할도 담당한다. 최근, 연구결과를 통해 밀착연접이 피부 장벽 기능에 있어서 중요한 역할을 담당하고 있다고 보고되었다.

피부 건강에 핵심적인 역할을 하는 피부 장벽의 손상 방지 및 강화를 위한 다양한 항노화 화장품 소재 개발(특허문헌 1, 2 및 3)이 시급한 실정이다.

특허문헌 1 : 대한민국 등록특허 제10-0727743호 특허문헌 2 : 대한민국 공개특허 제10-2014-0016556호 특허문헌 3: 대한민국 공개특허 제10-2013-0001842호

본 발명자들은 피부의 견고성을 개선하고, 태양 노출 및 다른 환경적 스트레스와 같은 외부적,내부적 원인으로부터 유래하는 주름과 같은 노화의 가시적 증상을 방지하거나 감소시키는데 동백 식물의 세포 배양물 또는 그 추출물이 유용함을 확인하고, 피부노화개선 또는 방지, 피부주름개선, 피부장벽강화, 피부보습, 피부수렴, 피부진정, 자외선에 따른 피부 보호, 자외선에 의한 피부 손상 개선을 비롯한 피부노화방지, 피부노화 개선, 즉, 항노화에 효능이 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 우수한 항노화 효능을 가지는 동백 식물의 세포 배양물의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 목적은 동백 식물의 세포 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 피부 외용제 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 동백 식물의 세포 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명은 인체에 안전하면서도 피부 노화 개선 효능이 우수한 항노화 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 피부 노화 방지 또는 개선, 피부주름개선, 피부장벽강화, 피부보습, 피부수렴, 피부진정, 항균, 여드름 개선, 자외선에 따른 피부 보호, 자외선에 의한 피부 손상 개선을 비롯한 피부 노화방지, 피부노화 개선, 즉, 항노화에 효능을 가지는 동백 식물 세포 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 것을 특징으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 동백 (Camellia japonica) 식물의 조직으로부터 식물세포를 분리하여 배양하는 것을 특징으로 하는 동백 식물 세포 배양물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 동백꽃의 종자, 태좌, 씨방 또는 꽃잎으로부터 세포를 분리하여 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 동백나무의 종자, 잎, 줄기, 또는 뿌리로부터 세포를 분리하여 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 식물 세포 배양시에, 식물생장 조절물질을 함유하는 배지에 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으며,특히, NAA(α-naphtalene acetic acid) 또는 6-BAP(6-Benzylaminopurine), 이들 모두를 함유하는 배지에서 식물 세포를 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 동백(Camellia japonica) 식물의 식물 세포 배양물 또는 그 추출물을 제조하여 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 동백 식물의 식물 세포 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시켜 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 동백 식물의 식물세포 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시킨 다음, 초음파 추출 또는 열수 추출하여 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 동백(Camellia japonica) 식물의 세포 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 피부개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 피부개선용은 피부 노화 방지 또는 개선, 피부 주름 개선용, 피부 수렴용, 피부 보습용, 모공 수축용, 피부 항균용 또는 여드름 개선용, 피부 장벽 기능 보호 또는 강화용, 자외선에 따른 피부 보호 또는 피부 손상 개선용, 피부 진정용인 것을 특징으로 할 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

동백나무(Camellia japonica Linne)는 차나무과 동백나무속에 속하는 늘푸른큰키나무이다. 동백나무속은 동남 아시아에 약 100종이 분포되어 있으며 우리나라에는 남부에 1종이 분포되어 있으며, 꽃의 형태 및 색깔 그리고 잎 등에 많은 변화를 가져다 주는 수많은 원예품종이 만들어져 관상수로 널리 심어지고 있다. 높이는 5~15미터까지 자라며 우리나라 제주도 및 남부지방의 산과 들에서 자란다. 나무껍질은 회갈색~황갈색이고 밋밋하며 매끄러우며 광택이 있고 가지는 연한 갈색으로 털이 없다. 잎은 어긋나고 타원형~긴타원형으로 두꺼운 가죽질이고 끝이 뾰족하며 가장자리에 물결 모양의 잔톱니가 있다. 잎 앞면은 광택이 있고 뒷면은 연녹색이다. 잎자루는 길이가 약 5mm이다.

동백나무의 개화기는 12~다음해 4월이며 결실기는 가을이다. 가지 끝이나 잎겨드랑이에 붉은색꽃이 1송이씩 피는데 꽃받침은 많고 떨어지며 꽃자루가 없다. 5~7개의 꽃잎은 비스듬히 퍼지고 수술은 많으며 꽃잎에 붙어서 꽃잎이 떨어질 때 함께 떨어진다. 꽃밥은 노란색이며 암술대는 3개로 갈라진다. 둥그스름한 삭과 열매는 길이 2~3cm로 가을에 붉은색으로 익으면 3갈래로 갈라지면서 속에 든 검은 갈색의 씨가 나온다. 종자는 타원형에 가깝고 배면(背面)에 모서리가 있으며 길이는 약 2cm, 지름은 1.5cm이다. 옛날에는 씨에서 짠 기름을 '동백기름'이라하여 부인들의 머릿기름 등으로 사용하였다.

흰색 꽃이 피는 것을 '흰동백(Camellia japonica Linne for. albipetala H.Chang)'이라고 부른다. 또한 일본에서 들어온 애기동백(Camellia sasanqua Thunberg)은 동백나무에 비해 잎이 작고 꽃잎 밑부분이 붙지 않음으로 구별되며 뜰동백(Camellia japonica var. hortensis Mak.)은 꽃잎이 거의 수평으로 퍼진다.

동백나무의 다른 이름은 산다(山茶, 산다화:山茶花: 본초강목), 홍다화(紅茶花: 분류초약성), 동백(冬柏), 해홍화(海紅花), 여심화(女心花), 동백목(冬柏木), 동백나무, 해석류, 동백기름나무 등으로 부른다.

동백나무의 꽃봉오리의 채취시기는 춘분부터 곡우(4월 20일) 사이에 채취한다. 일반적으로 꽃봉오리가 볼록하고 꽃이 피려고 할 때에 채취하여 햇볕에 말리거나 약한 불에 쬐어 말려 종이로 싸서 봉하고 건조하고 통풍이 잘 되는 곳에 보관한다.

동백꽃은 leucoanthocyanin, anthocyanin 등이 함유되어 있다. 과실에는 지방유, camellin, thachysaponin이 들어 있고 thachysaponin을 가수 분해한 후, camelliagenin A, B, C를 얻으며 잎에는 I-epicatechol, d-catechol이 들어 있다.

한편, Telomerase는 catalytic subunit인 telomerase reverse transcriptase (TERT)와 telomerase RNA component (TERC)로 이루어져 있으며, telomere length의 조절, aging 및 tumorigenesis에 중요한 역할을 한다. 뿐만 아니라, 다양한 cellular signaling을 통해서 DNA repair, chromatin remodeling 및 metabolism 등의 조절에도 관여한다. 실제로 최근의 많은 연구들은 이러한 telomerase의 기능이 다양한 유전자들과의 상호작용에 의해서 조절됨을 증명하고 있다.

대부분의 정상적인 인간의 체세포는 DNA end replication problem에 의해 세포 분열이 일어날 때마다 telomic DNA가 점점 짧아지게 된다. telomere가 점점 짧아지는 것은 세포의 노화와 세포의 복제 제한성을 조절하는 중요한 메커니즘이 된다. 이때 telomerase는 telomere length유지에 중요한 역할을 하며, nucloeytic degradation과 end to end fusion이 일어나 cell death나 유전자 재조합이 일어나는 것을 막아준다.

telomere length유지의 telomerase의 역할 이상으로 telomerase의 생리학적 기능에 관한 여러 가지 증거들이 제시되어 있었다. 예를 들어 telomerase가 발현되었을 때는 cellular stress를 인위적으로 유도하더라도 cell survival이 증가하며, cell death를 일으키는 화학물질로부터 cell을 보호하는데, telomerase activity와 독립적으로 TERT 역할이 중요한 것으로 알려져 있다. 따라서, TERT의 주요한 기능인 telomere length 조절과는 독립적으로 aging에도 TERT가 관여한다.

즉, 정상세포에서 telomere의 소실은 세포노화를 유발하여 telomere 길이를 유지시키는 역전사 효소인 telomerase는 세포의 분화촉진 및 분열조직감소와 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서는, 항노화 소재로서의 가능성을 파악하기 위하여, 교원질 생성촉진작용 및 각질세포의 분화와 관련된 지표들에 대한 활성을 통하여 동백 식물 세포 배양물 또는 그 추출물이 항노화 소재로서 효능이 있음을 확인하였고, 아울러, 피부세포 분화 지표인 filaggrin 생성 촉진, 즉, 각질세포의 증식과 분화를 촉진하여 표피세포로 하여금 필라그린 생성을 증가시키도록 하는 작용을 확인하였다.

일 관점에서, 본 발명은 동백 (Camellia japonica) 식물의 조직으로부터 식물세포를 분리하여 배양하는 것을 특징으로 하는 동백 식물 세포 배양물의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서, 동백 식물은 동백 나무, 동백 꽃을 포함하는 개념으로, 예컨대, 동백 식물의 조직은 동백꽃이나 나무의 종자, 동백꽃의 태좌, 동백꽃의 씨방, 동백나무의 잎, 동백나무 줄기, 동백나무 뿌리 등을 포함한 개념이다.

본 발명에 있어서, 상기 식물 세포의 배양은, 동백꽃의 종자, 태좌, 씨방 또는 꽃잎으로부터 세포를 분리하여 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.

식물의 태좌(胎座, Placenta)는 동물 유래의 태반과 같이, 종자 육성을 주관하는 중요한 부위로, 암술의 씨방(자방, 子房, Ovary)안에서 밑씨가 붙는 부분이다. 보통 씨방을 형성하는 심피(心皮, carpel)의 가장자리에 있는데, 때로는 심피의 중맥에도 있다. 또 씨방의 기저나, 기저로부터 씨방 안에 직립하는 기둥 모양으로 생길 때도 있다.

본 발명에 있어서, 상기 식물 세포의 배양은, 동백나무의 종자, 잎, 줄기, 또는 뿌리로부터 세포를 분리하여 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.

식물조직배양은 살아있는 작은 식물 조직을 기내(in vitro)에서 무균적으로 배양하여 배양 목적에 따라서 식물 세포, 기관 및 식물체를 증식 시키는 기술이다. 식물조직배양에는 식물이 지니는 기본적인 특성을 이용한다고 볼 수 있다. 식물조직배양 기술은 식물이 지니는 독특한 특징인 식물의 체세포로부터 식물체를 재생시킬 수 있는 분화전능성(totipotency)을 이용하는 것을 기반으로 하는 기술이다. 즉, 식물의 단세포(원형질체 포함), 잎 및 뿌리 절편을 특정 영양물질 및 생장 조절제가 첨가된 배지에 배양하면 이들 세포 및 조직으로부터 식물체가 재생될 수 있다. 이러한 식물이 분화전능성(totipotency)을 지니는 능력은 식물이 지니는 특성인 고착 생활과 장기간 생존을 위하여 열악한 환경 및 초식동물의 피해로부터 생존을 하기 위한 전략이다. 따라서 식물은 잃어버린 기관을 다시 재생시키기 위한 능력을 갖게 되었다고 볼 수 있다. 모식물체로부터 분리된 식물조직세포는 적정배양환경에서 배양하면 완전한 식물체로 재생될 수 있는 잠재력 즉, 전형성능을 가지고 있는 식물은 발생학 등의 학술적인 중요성은 물론이지만 화장품 원료 등의 실용화를 위해서도 활용가치가 크다.

본 발명에 있어서, 상기 식물 세포 배양시에, 식물생장 조절물질을 함유하는 배지에 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으며,특히, NAA(α-naphtalene acetic acid) 또는 6-BAP(6-Benzylaminopurine), 이들 모두를 함유하는 배지에서 식물 세포를 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 NAA(α-naphtalene acetic acid)는 1-10mg/L, 바람직하게는 2-8mg/L, 4-6mg/L로 포함할 수 있고, 상기 6-BAP는 0.01-1mg/L, 바람직하게는 0.05-0.5mg/L, 0.08-0.3mg/L로 포함할 수 있다.

다른 관점에서, 본 발명은 동백 식물 (Camellia japonica) 세포 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 동백 식물 세포 배양물 또는 그 추출물은 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 내지 10 중량%로 함유할 수 있다. 이러한 비율은 단지 바람직한 범위일 뿐이며, 예컨대, 하기 실시예에서는 1 중량%,또는 2.5중량%, 5중량%, 10중량% 등의 경우를 실험한 결과를 포함하고 있으나, 이 이외에 1%, 0.5% 이하, 20%, 30% 이상 경우도, 우수한 항노화 - 피부 노화 방지, 노화 개선, 피부장벽 강화, 개선, 피부 수렴, 주름개선 기능, 피부 보습, 피부 진정, 항균, 여드름 개선, 자외선에 따른 피부보호 효능 등을 가짐은 당업자에게 자명하다.

본 발명은 동백 식물의 세포 배양물 또는 그 추출물을 함유한 피부개선용 피부외용제 조성물의 제조방법은 다음의 단계를 포함한다:

(a) 동백 식물의 조직으로부터 식물세포를 분리하여 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계에서 얻어진 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 조성물을 제조하는 단계.

본 발명에 있어서, 상기 동백 식물 세포 배양물 (배양체) 자체를 사용하거나, 배양물을 여과하여 사용하거나, 배양물을 파쇄하여 사용하거나, 배양물을 건조시켜 분말화한 다음, 정제수에 녹여 사용할 수 있다.

상기 (a)단계에서, 구체적으로는 동백 식물 세포를 배양하기 위해 적절한 배지를 선택할 수 있다. 기술 분야에서 식물조직배양에 일반적으로 사용되고 있는 배지가 있다면, 제한 없이 사용가능하다. 식물에서는 일반적으로 MS배지, B5배지 등을 주로 사용하고, 일 예로, MS배지의 조성(1L기준시)은 NH₄NO₃ 1650 mg, KNO₃ 1900 mg, CaCl₂.2H₂O 440 mg, MgSO₄.7H₂O 370 mg, KH₂PO₄ 170 mg, KI 0.83 mg, H₃BO₃ 6.2 mg, MnSO₄.4H₂O 22.3 mg, ZnSO₄.7H2O 8.6 mg, Na₂MoO₄.2H₂O 0.25 mg, CuSO₄,5H₂O 0.025 mg, CoCl₂.6H₂O 0.025 mg, FeSO₄.7H₂O 27.8 mg, Na₂EDTA.2H₂O 37.3 mg, Myoinositol 100 mg, Nicotinic acid 0.5 mg, Pyridoxine-HCl 0.5 mg, Thiamine-HCl 0.5 mg, Glycine 2 mg, Sucrose 30000 mg 이다.

본 발명에 있어서, 상기 (b)단계에서 있어서, (a)단계의 배양을 통해 얻어진 동백 식물 세포 배양물 그대로를 포함하는 조성물을 적절한 형태의 피부 외용제 조성물로 제조하거나, 또는 상기 배양물을 공지된 추출 방법을 통해 추출물 형태로 수득하여 적절한 형태의 피부 외용제 조성물로 제조할 수 있다.

예컨대, 상기 (b)단계는, (a)단계에서 얻어진 동백 식물 세포 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시켜 조성물을 제조하거나, (a)단계에서 얻어진 동백 식물 세포 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시킨 다음, 냉수 추출, 열수 추출 또는 에탄올 추출하여 조성물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

또 다른 예로, 상기 (a)단계에서 얻어진 배양물을 열풍 건조후 분말화하여 수분을 증발시켜 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서, "추출물"은 상기 동백 식물 세포 배양 추출물을 분말화하거나, 냉수추출법, 열수추출법, 에탄올 추출법 등 종래 알려진 다양한 추출법에 의해 수득한 추출물을 의미한다.

본 발명에서 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 추출, 열수 추출 등이 있다. 여기서, 열수추출의 경우, 열탕증류기에서 8~48시간동안, 80~100℃ 로 가열하여 열수 추출물을 얻는다.

냉수 추출의 경우, 예컨대, 냉수 (15-25℃)에 상기 태좌조직 배양물 자체 또는 그것의 건조된 분말을 혼합하여 3일동안 추출하여 냉수추출물을 얻는다.

또는, 물, 유기 용매, 또는 이의 혼합 용매를 사용하여 추출하는 방법으로 제조될 수 있다. 추출한 액은 바로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 유기용매를 사용하여 추출하는 경우, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매인 유기용매를 사용하며 생약의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 약제의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 특히, 본 발명에 있어서는 에탄올 추출물, 바람직하게는 20-50% 에탄올 추출물, 일 구체예로써 50% 에탄올 추출물이 바람직하며, 추출방법은 실시예에 기재된 바와 같이, 50% 에탄올에 섞은 후 3일동안 교반하여 얻는다.

본 발명에 있어서, 상기 추출물은 농축, 또는 희석하여 사용할 수 있고, 추출물의 증류액을 사용할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 항노화란, 피부 보호 및 피부 상태 개선, 피부 미백, 피부 노화 및 주름의 예방 또는 개선, 모공 수축, 축소, 피부 수렴, 피부 보습, 피부 진정, 피부 보호 및 피부의 염증 반응의 완화, 면역질환 개선능, 또는 피부 장벽 기능 개선, 피부자극 완화, 피부 세포 증식 및 재생능, 항산화능, 콜라겐 합성 증진능, 자외선에 따른 피부 보호, 자외선에 의한 피부 손상개선, 항균, 여드름개선 등을 모두 포함하는 개념이다.

본 발명에 있어서, "유효성분으로 함유하는"의 의미는, 피부 외용제 조성물로써 피부 수렴, 피부 진정, 피부 장벽 강화, 개선, 주름 개선을 비롯한 항노화에 따른 피부 개선 효과를 나타낼 수 있는, 예컨대, 피부 외용제 조성물로써 주름개선효능과 관련된 콜라겐 합성, TERT 발현 증가, 아쿠아포린-3 발현 증가, 피부수렴, 주름 개선, 피부장벽 강화, 개선 등을 나타낼 수 있는 정도의 유효량을 함유하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 피부 수렴 작용의 원리는 피부 단백질의 고분자 flavonoids와 결합하여 가교결합을 형성하여 피부가 수축되는 현상을 말한다. 수렴이란 뜻에는 기본적으로 주름이 지고 혹은 움츠린다는 의미가 있으며, 수렴제는 피부와 점막 혈관 등을 수축시키는 작용이 있고, 세포간극 및 림프간극을 가로막아 점액의 분비를 억제시키는 효과가 있다. 또한 수렴제는 단백질과 결합하는 성질을 가지기 때문에 일반적으로 헤모글로빈의 단백질이 추출물과 결합하는 정도에 따라서 수렴효과 정도를 판단할 수 있다. 이러한 수렴작용에는 외용 혹은 내용에 의해서 피부와 점막의 표면에 난용성의 피막을 형성하고 그 결과 국소를 보호하거나, 혹은 조직을 조밀하게 하여 세포막의 투과성을 감소시키는 효과가 있다고 할 수 있다.

이러한 피부에 대한 수렴 작용에는, 화학적 수렴작용과 물리적 수림작용의 두 가지로 구분됩니다. 화학적 수렴작용은 탄닌과 같이 단백질 응고작용을 하는 물질에 의해 땀샘과 모공이 일시적으로 수축 되는 것을 말한다. 반면에 물리적 수렴작용은 차가운 물을 피부에 사용하거나 에탄올의 휘발 로 피부의 온도를 저하시켜 땀샘과 모공을 일시적으로 수축시키는 것을 말한다. 또한, 이러한 피부 수렴은 여름철 같은 경우나 스트레스로 인해서, 피지가 더 많이 생기다보면 피부 트러블이 발생하고, 피부 트러블이 일어난 부위는 점점 더 빨개지게 되는데, 피부 진정이란 이러한 피부 트러블을 완화시키는 것을 의미하며, 피부 수렴과는 구별되는 작용이다.

본 발명에 따른 피부 장벽 보호 기능에 있어서, 피부장벽(skin barrier)은 표피의 최외곽 층인 각질층(stratum corneum)은 주로 무핵의 편평한 각질세포(corneocyte)로 이루어져 있다. 정상적인 표피세포의 분열 및 분화과정을 통해 유지되는 피부장벽의 각질세포가 합성하는 세라마이드, 콜레스테롤, 및 지방산과 같은 세포간 지질로 형성된 다층지질막(multi lamella lipid layer)는 피부 내의 수분이 증발하지 않도록 방어막 역할을 한다. 한편, 이들 세포간 지질 중 오메가 히드록시 세라마이드는 각질세포(corneocyte) 외곽층의 단백질인 인볼루크린(involucrin)과 화학적 공유결합으로 연결되어 각질세포지질막(corneocyte lipid envelope, CLE)을 형성함으로써 다층 지질막 형태의 세포간 지질을 물리적으로 안정화시키는 역할을 하여 장벽기능을 강화시키는 역할을 하게 된다.

본 발명의 조성물은 피부도포를 통해 각질층에 전달되어 각질세포의 분화를 촉진시켜, 표피층의 두께를 두껍게 개선시키는 효과가 있을 뿐 아니라, 피부장벽 손상을 회복시키는 효과가 우수하여 기능성 화장료 조성물로써 활용이 가능하며, 피부장벽의 손상에 의해 유발되는 피부질환의 치료 및 예방에 유용하게 사용할 수 있다. 상기 피부장벽 손상에 의해 유발되는 피부질환 으로는 아토피 피부염(atopic dermatitis), 피부건조증(xeroderma),건선(psoriasis), 어린선(ichthyosis), 여드름 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 피부 장벽 보호 기전은 밀착연접 구성 단백질인 occludin과 claudin-1의 단백질량 증가를 통해 확인하였다. Filaggrin은 각질형성세포가 분화단계에서 발현시키는 여러 구조 단백질 중 하나로 표피의 기저층으로부터 각질층까지 분화가 이루어지도록 하는데에 관여하며, 피부 조직의 수분유지에 필수적인 천연보습인자(Natural moisture factor, NMF)의 주체를 이루기도 해 피부의 수분 유지 및 피부막기능의 주요한 지표로 사용되는데, 본 발명에 따른 동백 식물 세포 배양물은 필라그린의 유전자 발현이 월등히 증가됨에 따라 우수한 피부 장벽 보호, 강화, 개선 기능을 가진다.

또한, 본 발명에 따른 동백 식물 세포 배양물 또는 그 추출물을 함유한 조성물이 항균 효능을 가지고 있으며, 따라서, 항균용 또는 여드름 균의 항균에 기반한 여드름 개선용으로 활용가능하다.

아울러, 본 발명에 따른 동백 식물 세포 배양물이 자외선 조사에 따른 피부 세포 보호 효과가 월등함을 확인한 바, 자외선 조사에 따른 피부 보호용으로도 활용 가능하다.

다시말해, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은, 피부 장벽 기능 강화 또는 보호, 개선, 프로콜라겐 증가, 콜라겐 생합성 증가능에 기초한 피부 주름개선, TERT 우수한 발현능에 의한 피부 노화 방지 또는 개선용으로 적용될 수 있으며, 이외에도 자외선과 같은 광노화로부터의 피부 보호, 피부 손상 개선, 여드름 개선, 피부 진정, 피부 수렴, 피부 보습, 모공 축소용 등으로도 적용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물 또는 약제학적 조성물일 수 있다.

상기 화장료 조성물에 있어서는, 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.

상기 담체는 본 발명의 피부 외용제 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량 %로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발명의 피부 외용제 조성물이 제조되는 후술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로써, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 상기 동백 식물 세포 배양 추출물 이외에 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글키롤, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 에탄올, 트리에탄올아민 등을 포함할 수 있으며, 방부제, 항료, 착색료, 정제수 등을 필요에 따라 미량 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은, 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 화장수, 에센스, 젤, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말, 또는 젤라틴 등의 피막이 있는 캅셀 (소프트 캅셀, 하드 캅셀) 제형 등의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 있어서의 피부는 얼굴 뿐만 아니라, 두피, 전신도 포함되는 개념으로, 이러한 두피에 적용될 수 있는 피부 외용제 조성물로써, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 발모제 등이 있고, 전신에 적용될 수 있는 바디클렌져 등의 용도로써 다양한 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 동백 식물 세포 배양 추출물을 함유 피부 외용제 조성물의 제조방법은 전술한 제조방법에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 제조방법을 일부 변형시킨 방법으로도 본 발명에 따른 동백 식물 세포 배양 추출물을 함유 피부 외용제 조성물을 제조할 수 있다.

특히, 상기 피부 외용제 조성물은 본 발명에 특별히 개시된 제조방법 이외에도, 통상적으로 알려진 제조방법을 이용하여, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조될 수 있다.

화장료 조성물로 제조될 경우, 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

또한, 적합한 화장품의 제형으로는, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일,염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

이러한, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 콜라겐 합성 증진능에 따른 주름 개선, 우수한 TERT 발현능에 의한 피부 노화 방지 또는 개선, 피부 수렴, 피부 장벽 기능 보호, 강화, 개선을 할 수 있는 등 항노화의 기능성 화장품의 형태를 포함한다.

본 발명에 있어서, 약제학적 조성물의 경우, 하기 실시예에서 제시하는 피부 상태 개선을 위한 약제학적 조성물로써 기능할 수 있다.

이러한 약제학적 조성물은 유효성분인 동백 식물 세포 배양물 또는 그 추출물 외에, "약학적으로 허용가능한 담체"를 포함할 수 있으며, 이러한 담체는 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제 및 방부제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 약학 조성물은 첨가제를 더 포함할 수 있다. 상기 첨가제로 향료, 비타민, 및 항산화제가 포함될 수 있다. 상기 담체로 약제학적으로 허용 가능한 담체는 모두 가능하며, 예를 들면, 희석제로는 유당, 덱스트린, 타피오카(tapioca) 녹말, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘 또는 탈크, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필셀룰로오스일 수 있다. 또한, 붕해제로는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산나트륨, 폴라크릴린칼륨, 또는 크로스포비돈, 감미제로는 백당, 과당, 솔비톨, 또는 아스파탐, 안정제로는 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 베타-사이클로덱스트린, 또는 잔탄검, 방부제로는 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 또는 솔빈산칼륨일 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 약제학적 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 경구 투여제제, 주사제, 좌제, 경피 투여제제, 및 경비 투여제제의 제형으로 제제화되어 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 제형은 액제, 현탁제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 또는 엑스제와 같은 경구 투여용 제형일 수 있다.

본 발명에 따른 동백 식물 세포 배양물 또는 그 추출물 함유 피부 외용제 조성물은 피부 세포에 독성이 없으면서도 우수한 TERT 발현능을 가짐으로써 피부노화방지 또는 개선가능하고, 피부 콜라겐 합성능이 탁월하여 주름 개선에 효능이 있으며, 피부 보습, 피부 진정, 항균, 여드름 개선, 자외선에 따른 피부 보호, 피부 손상 개선, 피부 수렴, 피부 장벽 강화능 등을 가지고 있다.

도 1은 본 발명에 따른 동백 나무의 식물세포 배양물을 나타낸 사진이다.
도 2는 본 발명에 따른 동백 종자로부터의 발아과정을 나타낸 사진이다.
도 3은 본 발명에 따른 발아된 동백 식물체로부터의 잎(Leaf), 줄기(Stem) 및 뿌리(Root)로부터의 세포 유도과정을 나타낸 사진이다.
도 4는 본 발명에 따른 동백꽃으로부터 태좌세포, 꽃잎세포 및 동백나무 잎 세포 유도과정을 나타낸 사진이다.
도 5는 본 발명에 따른 동백 식물세포 배양 추출물의 피부 세포 독성 시험 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 동백 식물세포 배양 추출물의 항노화 관련 유전자인 TERT 발현 영향 시험 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 동백 식물세포 배양 추출물의 프로콜라겐 합성 증진 시험 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 동백 식물세포 배양 추출물의 보습 관련 유전자인 Aquaporin-3 단백질 발현 영향 시험 결과이다.
도 9는 동백꽃 유래 태좌 세포배양 추출물 HPLC에 의한 성분 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 동백꽃 유래 씨방 세포배양 추출물 HPLC에 의한 성분 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11는 동백꽃 유래 꽃잎 세포배양 추출물 HPLC에 의한 성분 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 동백나무 유래 잎 세포배양 추출물 HPLC에 의한 성분 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 동백나무 유래 뿌리 세포배양 추출물 HPLC에 의한 성분 분석 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 이하의 실시예에서는 동백 식물 세포 배양 추출물에 관한 효능을 확인하였으나, 추출물이 아닌 배양물 자체에 대해서도 이러한 효과가 있음은 당업자에게 자명할 것이다.

1-1. 본 발명에 따른 동백나무 부위별 세포 추출물의 제조

(1) 동백나무 종자로부터의 발아

동백나무 종자의 표면을 살균하기 위하여, 동백나무 종자(제주도 서귀포시 안덕면 서광리)를 70% 에탄올에 30초간 침지시키고, 2% 치아염소산나트륨(Sodium hypochlorite)에 5분 진탕하여 살균 후, 멸균수로 세척하였다. 살균된 동백나무 종자를 흙에 치상하고 25℃, 습도 70%의 생장상에서 5주간 배양하여 발아를 유도하였다 (도 2).

(2) 세포 분리

2.1 동백꽃으로부터 태좌(Placenta)세포 분리

배양을 위해서, 동백꽃을 70 % 에탄올 및 0.5 % sodium hypochlorite로 5분간 멸균 소독하고, 멸균수로 여러 차례 씻어줬다. 조심스럽게 핀셋을 이용하여 씨방벽을 벗겨내고, 태좌세포를 분리하여 3% Sucrose, 5 mg α-naphtalene acetic acid(NAA) 및 0.1 mg 6-Benzylaminopurine (6-BAP)가 포함된 MS 배지(Duchefa, Cat# M0256)에서 2~ 3주간 배양하였다.

2.2 동백꽃으로부터 씨방(Ovary) 세포 분리

배양을 위해서, 동백꽃을 70 % 에탄올 및 0.5 % sodium hypochlorite로 5분간 멸균 소독하고, 멸균수로 여러 차례 씻어줬다. 조심스럽게 핀셋을 이용하여 씨방(ovary)으로부터 세포를 분리하여 3% Sucrose, 5 mg α-naphtalene acetic acid(NAA) 및 0.1 mg 6-Benzylaminopurine (6-BAP)가 포함된 MS 배지(Duchefa, Cat# M0256)에서 2~ 3주간 배양하였다.

2.3 동백꽃잎(Flower) 세포 분리

배양을 위해서, 동백꽃잎 70 % 에탄올 및 0.5 % sodium hypochlorite로 1분간 멸균 소독하고, 멸균수로 여러 차례 씻어줬다. 조심스럽게 핀셋과 날카로운 칼을 이용하여 단번에 잘라, 잘라진 꽃 부분이 3% Sucrose, 5 mg α-naphtalene acetic acid(NAA) 및 0.1 mg 6-Benzylaminopurine (6-BAP)가 포함된 MS 배지(Duchefa, Cat# M0256)에서 2~ 3주간 배양하였다.

2.4 동백나무 잎(Leaf) 세포 분리

배양을 위해서, 동백나무 잎을 70 % 에탄올 및 0.5 % sodium hypochlorite로 1분간 멸균 소독하고, 멸균수로 여러 차례 씻어줬다. 조심스럽게 핀셋과 날카로운 칼을 이용하여 단번에 잘라, 잘라진 잎 부분이 3% Sucrose, 5 mg α-naphtalene acetic acid(NAA) 및 0.1 mg 6-Benzylaminopurine (6-BAP)가 포함된 MS 배지(Duchefa, Cat# M0256)에서 2~ 3주간 배양하였다.

2.5 동백나무 줄기(Stem) 세포 분리

배양을 위해서, 동백나무 줄기를 70 % 에탄올 및 0.5 % sodium hypochlorite로 1분간 멸균 소독하고, 멸균수로 여러 차례 씻어줬다. 조심스럽게 핀셋과 날카로운 칼을 이용하여 단번에 잘라, 잘라진 줄기 부분이 3% Sucrose, 5 mg α-naphtalene acetic acid(NAA) 및 0.1 mg 6-Benzylaminopurine (6-BAP)가 포함된 MS 배지(Duchefa, Cat# M0256)에서 2~ 3주간 배양하였다.

2.6 동백나무 뿌리(Root) 세포 분리

배양을 위해서, 동백나무의 뿌리를 70 % 에탄올 및 0.5 % sodium hypochlorite로 1분간 멸균 소독하고, 멸균수로 여러 차례 씻어줬다. 조심스럽게 핀셋과 날카로운 칼을 이용하여 단번에 잘라, 잘라진 뿌리 부분이 3% Sucrose, 5 mg α-naphtalene acetic acid(NAA) 및 0.1 mg 6-Benzylaminopurine (6-BAP)가 포함된 MS 배지(Duchefa, Cat# M0256)에서 2~ 3주간 배양하였다.

도 3은 본 발명에 따른 발아된 동백 식물체로부터의 잎(Leaf), 줄기(Stem) 및 뿌리(Root)로부터의 세포 유도과정을 나타낸 사진이다. 도 4는 동백꽃으로부터 태좌세포, 꽃잎세포 및 동백나무 잎 세포 유도과정을 나타낸 사진이다.

(3) 분리된 동백 태좌, 씨방, 꽃잎, 잎, 줄기 및 뿌리세포의 배양 및 대량생산

무균적으로 분리된 동백 태좌, 씨방, 꽃잎, 잎, 줄기 및 뿌리세포를 3% Sucrose가 포함된 MS배지에서 2~ 3주의 일정기간 간격으로 계대 배양하였고, 이후, 풍선형 생물반응기(삼성과학)를 이용하여 Agar를 제외한 동일한 조성의 액체 배지에서 온도 25℃, 공기공급량을 0.1vvm으로 일정하게 조절하며 14일 간격으로 배양 증식하여 대량생산하였다 (도 1).

(4) 동백 태좌, 씨방, 꽃잎, 잎, 줄기 및 뿌리세포 배양추출물의 제조

생물반응기를 이용하여 증식된 동백 태좌, 씨방, 꽃잎, 잎, 줄기 및 뿌리세포를 수확하여 깨끗한 티슈로 충분히 수분을 제거한 후 60℃로 2일 동안 건조기에서 건조하였다. 건조된 동백 태좌, 씨방, 꽃잎, 잎, 줄기 및 뿌리세포 배양체 50 g을 용기에 담고, 정제수 10 L를 넣은 후, 열탕증류기에서 8 ~ 48시간동안, 80 ~ 100℃ 로 가열하여 열수 추출물을 얻었다. 추출 후, mesh로 여과하여 고형분을 제거하고, 동백 태좌, 씨방, 꽃잎, 잎, 줄기 및 뿌리세포배양추출물을 제조하였다.

실험예 1 : 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물의 피부 세포에 대한 독성효과 시험(Cytotoxicity Test)

상기 실시예 1에 따라 얻어진 동백 태좌, 씨방, 꽃잎, 잎, 줄기 및 뿌리세포배양추출물의 피부 세포에 대한 독성효과를 알아보기 위하여, 인간각질형성 세포(Human Skin Keratinocyte, HaCaT)를 사용하였다. 인간각질형성 세포를 1×10⁴cells/ml의 농도로 하여 24 well 배양판에 접종하였다. 배지는 10 % FBS를 함유한 DMEM(Dubelcco'S Modified Eagle Medium, BRL,USA)을 사용하였다. 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 48시간 배양하여 배양용기 표면적의 25 ~ 30%만큼 배양되면, 실시예 1에서 제조된 조성물이 0.1 % ~ 10 % 함유된 FBS-free DMEM으로 교체하여 24시간 더 배양하였다. 배양 후 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브롬화물 (MTT, Sigma M5655, USA) 용액 (2.5 mg/ml)을 50 ㎕첨가하고 3시간동안 추가로 배양한 후 상등액을 제거하고, 각 well 당 200㎕ 의 Dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma D2650, USA)용액을 가한 후 20분간 교반하여 형성된 포르마잔(formazan) 결정을 녹인 다음, 100 ㎕씩을 96 well 로 취하여 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)로 570 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 피부 세포의 증식 활성 정도는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 하기 수학식 1에 따라 계산하여 백분율로 표시하였다.

[수학식 1]

세포독성효과(%) = (추출물 처리시의 흡광도/대조군의 흡광도)× 100

도 5에 나타난 바와 같이, 부위별 식물세포배양 추출물 즉, 동백 태좌, 씨방, 꽃잎, 잎, 줄기 및 뿌리 세포배양 추출물인 1 ~ 20 % 농도로 처리하였을 때, 20 % 씨방배양추출물을 제외한 피부세포 Viability에 영향을 미치지 않음을 확인하였다.

실험예 2 : 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물의 항노화 관련 유전자 TERT 발현 영향 시험

2.1 세포배양

인간 각질형성세포주(HaCaT)를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 10% Fatal bovine serum(FBS), 1% Antibiotic-Antimycotic(GIBCO, Cat.# 15240-062)과 함께 100 mm/60.1 cm culture dish에서 37℃, 5% CO₂의 조건으로 배양한다. 인간각질형성세포가 80%이상 confluence 될 때 96 well plate에 1×10⁴ cells/well 분주한 후 세포배양 조건에서 confluence가 80%이상 도달 될 때까지 배양하고, 80% 이상의 confluence가 되면 배지를 DMEM free 배지(without FBS)로 교환 후 시험물질을 처리한다. 물질처리 후 24시간동안 추가 배양하여 각 물질이 Telomerase reverse transcriptase(TERT)의 발현에 어떠한 영향이 있는지 Real-time PCR 법을 수행하여 확인하고, 양성 대조군으로 1mM shikimic acid를 사용하였다.

2.2 RNA Isolation 및 Real-Time PCR 분석

RNA isolation과 cDNA 합성은 SuperPrep cell lysis & RT Kit for qPCR (TOYOBO Cat.# SCQ-101)이용한다. 배지를 제거한 세포는 DPBS로 한번 wash하고, 50㎕ cell lysis mixture (lysis buffer에 gDAN remover를 첨가한 mixture)을 넣고 실온에서 5분간 incubation 한 후 stop buffer를 넣어 반응을 멈추게 하여 ice에 보관한다. RT reaction mixture 32㎕에 추출한 mRNA 8l를 취하여 넣고 PCR를 수행하여 cDNA를 합성한다. PCR 조건은 37℃ 15min, 50℃ 5min, 98℃ 5min에서 수행한다. 유전자의 발현을 비교분석하기 위하여 상기에서 합성한 cDNA를 template로하여 Thunderbird SYBR qPCR Mix (TOYOBO Cat.# QPS-201)의 매뉴얼에 따라 Rotor Gene Q Real-time PCR Machine (Qiagen)으로 진행한다. 실험에 사용한 primer들은 Qiagen사의 QuantiTectprimerassays(Telomerase reverse transcriptase(TERT) Cat.# QT00073409)를 사용하였다. 상대적인 발현율은 Housekeeping gene (GAPDH, Cat.# QT01192646)로 Normalization였다. Real-time PCR 조건은 다음과 같다.

< Real-time cycler conditions> Step	Time	Temperature
Reverse transcription	30 min	50
PCR initial activation step	15 min	95
3-step cycling
Denaturation	15 s	94
Annealing	30 s	60
Extension	30 s	72
Number of cycles	45

상기 실시예 1에 따라 얻어진 동백 식물세포 배양추출물을 대상으로 항노화 관련 유전자인 TERT(Telomerase Reverse Transcriptase) 발현을 통한 세포수명 연장 효능 평가를 확인한 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 동백 식물세포 배양추출물은 우수한 TERT 발현능을 가지고 있으며, 특히, 5 % 농도의 Placenta, Ovary, Flower 및 1 % Leaf에서 양성 대조군으로 사용된 1mM Shikimic acid보다 뛰어난 발현양을 확인하였다.

실험예 3 : 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물의 Procollagen 합성 증진 시험

인간섬유아세포(Human Skin Fibroblast)를 37℃, 5% CO₂배양기에서 일정한 습도를 유지하는 세포 배양기내에서 10% FBS, Penicillin(50U/ml), Streptomycin(50/ml)를 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco, USA)으로 배양하여, 1×10⁵개/ml로 48 well plate에 500㎕ 씩 분주한 다음 24시간 배양하였다. 대조군과 시험물질인 상기 실시예 1에 따라 얻어진 동백 식물세포 배양 추출물을 함유한 배지를 넣고 48시간동안 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양하였다. 48시간 후, 배지의 상층액을 각각 20㎕ 을 취해 Procollagen Type I C-Peptide EIA Kit(PICP, Takara, Cat No. MK101)를 이용하여 측정함으로써 새로 합성된 콜라겐 양을 측정하였다. PICP양은 ng/1×10⁵세포로 환산하였으며, 하기 수학식 2에 따라 계산하였다.

[수학식 2]

동백 태좌, 씨방, 뿌리, 꽃잎, 잎 세포배양추출물 처리에 의한 콜라겐 합성과 관련한 Procollagen 생성량을 측정한 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 동백 잎 유래 식물세포배양추출물 10, 20ppm, Ovary유래 식물세포배양추출물 10 ppm 처리시 유의적인 procollagen 합성 증진 효능을 다른 부위에서 유래한 식물세포배양추출물보다 월등히 증가하여 탁월한 콜라겐 합성 증진 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

실험예 4: 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물의 피부 장벽 기능 확인 시험

4.1 세포배양

인간표피각질형성세포가 80 %이상 confluence 될 때 96 well plate에 1×10⁴ cells/well 분주한 후 농도별로 함유된 실시예 1에 따른 동백 태좌, 씨방, 꽃잎, 잎, 줄기 및 뿌리세포배양추출물을 처리한 후 24시간 추가 배양하여 Filaggrin 유전자 발현을 Real-time PCR 법으로 확인하였다.

4.2 RNA Isolation 및 Real-Time PCR 분석

RNA isolation과 cDNA 합성은 SuperPrep cell lysis & RT Kit for qPCR (TOYOBO Cat.# SCQ-101)이용한다. 배지를 제거한 세포는 DPBS로 한번 wash하고, 50㎕ cell lysis mixture (lysis buffer에 gDAN remover를 첨가한 mixture)을 넣고 실온에서 5분간 incubation 한 후 stop buffer를 넣어 반응을 멈추게 하여 ice에 보관한다. RT reaction mixture 32㎕에 추출한 mRNA 8l를 취하여 넣고 PCR를 수행하여 cDNA를 합성한다. PCR 조건은 37℃ 15min, 50℃ 5min, 98℃ 5min에서 수행한다. 유전자의 발현을 비교분석하기 위하여 상기에서 합성한 cDNA를 template로하여 Thunderbird SYBR qPCR Mix (TOYOBO Cat.# QPS-201)의 매뉴얼에 따라 Rotor Gene Q Real-time PCR Machine (Qiagen)으로 진행한다. 실험에 사용한 primer들은 Qiagen사의 QuantiTectprimerassays(Filaggrin Cat.#QT01192646)를 사용하였다. 상대적인 발현율은 Housekeeping gene (GAPDH, Cat.# QT01192646)로 Normalization였다. Real-time PCR 조건은 다음과 같다.

< Real-time cycler conditions> Step	Time	Temperature
Reverse transcription	30 min	50
PCR initial activation step	15 min	95
3-step cycling
Denaturation	15 s	94
Annealing	30 s	60
Extension	30 s	72
Number of cycles	45

처리농도	부위	Filaggrin 유전자 발현율 (Relative Expression of Filaggrin)
음성 대조군	-	1.00
1 %	태좌	1.52
	씨방	1.38
	꽃잎	0.98
	잎	1.09
	줄기	1.08
	뿌리	1.14
2.5 %	태좌	3.38
	씨방	2.89
	꽃잎	1.20
	잎	2.01
	줄기	1.38
	뿌리	1.91
5.0 %	태좌	2.21
	씨방	1.50
	꽃잎	0.95
	잎	1.51
	줄기	1.05
	뿌리	1.28

피부세포 내에서 각질형성세포의 정상적인 분화를 촉진하고, 피부에서의 자연보습인자로 변환되는 filaggrin의 피부 내 발현을 촉진함으로써 피부장벽기능을 개선할 수 있음을 확인할 수 있다. 따라서, 실시예 1에 따른 동백으로부터 유래한 태좌, 씨방, 꽃잎, 잎, 줄기 및 뿌리세포배양추출물의 Filaggrin 유전자의 발현을 측정한 결과, 상기 표 3에 나타난 바와 같이, 동백 식물 세포 배양추출물의 우수한 발현증가능을 확인할 수 있었으며, 특히, 동백 태좌세포와 씨방 유래 세포가 다른 부위에 유래한 추출물보다 유전자 발현양이 월등히 증가함을 확인하였다.

실험예 5: 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물의 보습 관련 유전자 Aquaporin-3 단백질 발현 영향 시험

HaCaT(human keratinocyte)를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 10% Fatal bovine serum(FBS), 1% Antibiotic-Antimycotic(GIBCO, Cat.#15240-062)과 함께 100 mm/60.1 cm culture dish에서 37℃, 5% CO₂의 조건으로 배양한다. HaCaT이 90%정도 confluence 될 때 100 mm/60.1 cm culture dish에 1×10⁵cells/12 well plate 분주한 후 24시간 배양하고, 실시예 1에 따라 얻어진 동백식물세포배양추출물인 시험물질을 농도별로 처리한다. 물질처리 후 4시간동안 추가배양 후 cell lysis buffer(0.1% SDS, 1% NP40, 150 mM NaCl, 0.5% sodium deoxycholate, 50 mM Tris-Cl(pH 7.5) and protease inhibitors [Roche,Mannheim, Germany])를 이용해 단백질을 추출하고 BCA assay로 단백질을 정량한다. 정량한 단백질의 일정량을 SDS-polyacrylamide gel에 loading하여 전기영동으로 분리하고, NC membrane으로 분리된 protein을 transfer 시킨다. 이 membrane을 blocking solution(5% skim milk in TBST(Tris-buffered saline with 0.1% Tween 20))에 담가 30분이상 blocking 시키고 TBST로 washing 후 primary antibody (AQP3, Santa Cruz, Cat.# sc-9885) solution에 담가 4℃에서 overnight으로 반응시킨다. 그 후에 TBST로 10분간 3번 washing하고 Primary antibody conjugated secondary antibody (AQP3 : goat)를 2시간동안 반응시킨다. 이렇게 완성된 blot은 ECL solution kit(amersham, UK)으로 발색하여 분석한다.

보습 관련 Aquaporin-3 단백질 발현을 통한 보습효과를 확인한 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 동백 꽃잎, 잎, 태좌 식물세포 배양추출물이 우수한 보습 효능을 가짐을 알 수 있었으며, 특히, 동백 꽃잎 유래 식물세포배양체가 피부세포에 적용하였을 경우, Aquaporin 3 발현에 의한 가장 뛰어난 보습효과를 확인하였다.

실험예 6: 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물의 피부 수렴 효과 시험

수렴(Astringency)이란 라틴어의 as(to)와 stringere(bind)에서 유래된 말로 결합반응(binding reaction)으로 정의한다. 피부에서 수렴작용이란 피부 단백질이 고분자 flavonoids와 결합하여 가교결합을 형성하여 피부가 수축되는 현상을 말한다. 일반적으로 수렴제라고 알려진 것은 유기산 금속염과 무기산 금속염, 알코올류로 금속염과 무기산 금속염은 피부에 독성을 유발하거나 피부질환을 초래하기 때문에 화장품 용도로는 부적합하다. 알코올류는 에탄올과 이소플로판올이 수렴제로 사용되고 있으나 에탄올 사용이 20 % 이상일때는 피부에 심한 자극을 일으킬 수 있기 때문에 최근 천연물에 대한 수렴효과의 관심이 높아지고 있다. 향장품의 피부에 대한 수렴작용으로는 화학적 수렴작용과 물리적 수렴작용의 두 가지로 구분이 되는데 화학적 수렴작용은 탄닌과 같이 단백질 응고작용을 하는 물질에 의해 과잉의 피지나 땀의 분비를 억제하여 땀샘과 모공이 일시적으로 수축되는 작용을 말하며, 반면에 물리적 수렴작용은 차가운 물을 피부에 사용하거나 에탄올의 휘발로 피부의 온도를 저하시켜 땀샘과 모공을 일시적으로 수축시키는 것을 말한다. 화장품에 있어서 수렴제는 얼굴 부위에 확대된 모공을 수축시키는 기능을 하여 일시적으로 탄력과 당김을 주어 감각적인 만족감과 더불어 화장을 잘 받게 해주는 기능 등으로 피부를 긴장시켜 정돈하기 위해 사용된다. 또, 각질층에 수분, 보습성분을 보유하는 것외에 수렴작용과 피지분비 억제작용을 하며 산뜻한 사용감을 가지며 화장의 지워짐을 방지하여 주는 기능을 갖고 있다.

실시예 1에 따라 얻어진 동백 식물 세포 배양 추출물의 피부 수렴 효과 측정을 위해 피부단백질과 유사한 혈액단백질(hemoglobin)을 사용하여 측정하였다. 원심분리관 용기에 각각의 시료용액과 헤모글로빈 용액(500ppm)을 1:1로 넣어서 진탕 혼합한 다음 1,500 rpm에서 3분간 원심분리 후 576 nm에서 흡광도를 측정하였다. 수렴효과의 측정은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

[수학식 3]

수렴효과(%) = (1-시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도)×100

처리농도	부위	수렴 효과 측정 (Astringent activity test) ( % of control)
음성 대조군	-	0
Tannic acid (500 ppm)		37.9
1 %	태좌	32
	씨방	11
	꽃잎	28
	잎	12
	줄기	3
	뿌리	13
2.5 %	태좌	28
	씨방	8
	꽃잎	21
	잎	6
	줄기	4
	뿌리	11
5.0 %	태좌	25
	씨방	17
	꽃잎	19
	잎	8
	줄기	9
	뿌리	10

실시예 1에 따른 동백 유래 태좌, 씨방, 꽃잎, 잎, 줄기 및 뿌리세포배양추출물의 수렴 효과를 측정한 결과, 표 4에 나타난 바와 같이, 우수한 수렴 효능을 나타냄을 확인할 수 있었으며, 특히, 태좌와 꽃잎 부위 수렴효과가 다른 씨방, 잎, 줄기 및 뿌리와 비교하여 수렴효과가 뛰어남을 확인하였다.

실험예 7: 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물의 항균효과 측정

여드름 균을 대상으로 실시예 1에 따라 얻어진 동백 유래 태좌, 씨방, 꽃잎, 잎 및 뿌리 세포 추출물과 화학합성 항균제인 트리클로산의 항균효과를 비교 실험하였다.

여드름 균 (Propionibacterium acnes ATCC 6919)에 대한 항균력 시험은 액체 재비 희석 방법으로 하였다. 액체 BHI배지 2ml에 각 시료(실시예 1에서 제조한 동백식물세포 배양추출물)를 0 ~ 5 % 농도까지 1 % 간격으로 희석한 후, 1 X 10⁶/ml 균액 20㎕ 를 접종하여 48시간 동안 배양시켰다. 혼탁도를 기준으로 성장이 저해된 최소 농도를 최저 성장 저해 농도 (MIC)라고 정의하였다.

	부위	최저 성장 저해 농도 (%) Propionibacterium acnes ATCC 6919
1	태좌	1
2	씨방	3
3	꽃잎	2
4	잎	2
5	줄기	5
6	뿌리	3

상기 표 5에 나타난 바와 같이, 동백 유래 태좌, 씨방, 꽃잎, 잎, 줄기 및 뿌리세포배양추출물이 여드름 균에 대한 항균력이 있음을 알 수 있으며, 그중에서도 태좌부위가 우수함을 알 수 있었다.

실험예 8: 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물의 피부진정 효과

피부 트러블이 심한 지원자 대상으로 평가 그룹당 30명이 되도록 그룹을 나눈 후, 각 그룹당 실시예 1에 따라 얻어진 1%의 동백 유래 태좌, 씨방, 꽃잎, 잎, 줄기 및 뿌리 식물세포 배양 추출물을 지급하고 2주일간 매일 1회 제품을 사용하게 한 후, 평가전과 사용 2주일 후의 피부 트러블 완화 효과 및 피부 진정 효과를 평가하게 하여 평균을 산출하여 각 시험물질의 피부 진정효과를 평가하였다.

피부 상태 평가 기준	평 점
1. 피부 여드름, 뾰루지, 아토피 등 피부 트러블이 매우 악화됨 여드름, 뾰루지, 아토피 등 피부 트러블이 약간 악화됨 여드름, 뾰루지, 아토피 등 피부 트러블이 상태가 사용전과 같음 여드름, 뾰루지, 아토피 등 피부 트러블이 약간 개선됨 여드름, 뾰루지, 아토피 등 피부 트러블이 매우 개선됨	1 2 3 4 5
2. 피부 진정 효과 건조감, 가려움, 따가움 등 피부상태가 매우 민감해짐 건조감, 가려움, 따가움 등 피부상태가 약간 민감해짐 건조감, 가려움, 따가움 등 피부상태가 사용전과 같음 건조감, 가려움, 따가움 등 피부상태가 약간 진정됨 건조감, 가려움, 따가움 등 피부상태가 매우 진정됨	1 2 3 4 5

동백 유도 부위	피부 트러블 완화 효과	피부 진정 효과
대조군 (정제수)	1.9	2.0
태좌 세포배양 추출물	3.7	4.2
씨방 세포배양 추출물	3.9	4.0
꽃잎 세포배양 추출물	4.3	4.5
잎 세포배양 추출물	3.8	4.2
줄기 세포배양 추출물	3.5	2.9
뿌리 세포배양 추출물	4.8	5.0

상기 표 7에서 알 수 있듯이, 본 발명에 따라 동백 유래 부위별 1 % 태좌, 씨방, 꽃잎, 잎, 줄기 및 뿌리 세포배양 추출물이 정제수만을 사용한 것보다 피부 트러블 완화 효과 및 피부 진정 효과, 피부 트러블 완화효과가 모두 향상되는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 9: 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물의 자외선에 의한 피부세포 보호 효과

UV 조사에 사용할 광원으로는 302 nm 파장의 자외선을 방출하는 Ultraviolet Cross-Linker CL-1000 (Ultra-Violet Products, CA)을 사용하였다. 각질형성세포인 HaCaT 세포를 1x10⁵ cells/ml 농도로 24-well plate에 넣고 배양기에서 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 인산완충액으로 세척하였다. 인산완충액을 500 ml 첨가한 다음 자외선을 10 mJ/cm² 로 조사 후 FBS를 포함하지 않은 배지로 교체하고 실시예 1에 따라 얻어진 동백 식물세포 배양 추출물인 시료를 농도별로 처리한 다음 24시간 추가 배양하였다. 여기에, MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma) 5 mg/ml을 첨가한 후 배양기에서 3시간 배양한 후 형성된 formazan을 DMSO에 녹이고, 96well plate로 옮긴 후 565 nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다.

UV조사	동백 부위별 식물세포	Cell Viability (% of Control)
		처리농도 0.5 %	처리농도 1 %
-	대조군	100	100
+	대조군	50	52
+	태좌	67	89
	씨방	68	78
	꽃잎	65	72
	잎	70	75
	뿌리	62	68
	줄기	55	57

실시예 1에 따른 0.5 % 및 1 % 동백나무로부터 유도된 태좌, 씨방 꽃잎, 잎, 뿌리 및 줄기 식물세포배양 추출물의 자외선에 의한 각질형성세포 보호 효과를 알아보기 위하여 실험한 결과, 상기 표 8에 나타난 바와 같이, 대조군과 비교하여 자외선 조사에 대한 뛰어난 세포보호효과를 확인하였다.

실험예 10: 동백 태좌, 씨방, 꽃잎, 잎 및 뿌리세포 추출물의 HPLC에 의한 성분분석

실시예 1에 따라 얻어진 동백 유래 태좌, 씨방, 꽃잎, 잎 및 뿌리 세포 추출물의 HPLC에 의하여 성분분석을 수행하였다. 분석조건은 다음과 같다.

구 분	분 석 조 건
HPLC 기기 종류	Waters 1525 Binary HPLC Pump
Column 종류	Gemini 5 C18 110 A (Phenomenex 사)
Column 규격	250 * 4.60 mm, 5 micron
용매 조건	- 용매 A : Water (0.1 % TFA (Trifluoro acetic acid) 함유) - 용매 B : Acetonitrile (0.1 % TFA (Trifluoro acetic acid) 함유)
파장	245 nm (UV 램프)
유속	1 ml/min

그 결과, 도 9 내지 도 13의 성분 분석결과가 얻어졌다.

화장료 조성물의 제조

본 발명의 실시예 1의 동백 식물세포 배양 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장품으로 영양화장수, 크림, 에센스 등의 유화 제형의 화장품 및 유연화장수 등의 가용화 제형의 화장품을 제조하였다.

제조예 2-1: 화장수

다음 처방에 따라 통상의 화장수 제조 방법에 따라 제조하였다.

원 료 명	중량 %(w/w)
글리세린	5.0
디프로필렌글리콜	3.0
히아루론산	0.5
폴리옥시에틸렌 경화피마자유	0.1
폴리에틸렌 올레일에틸	0.1
에탄올	5.0
방부제	0.15
항료	적량
착색료	적량
실시예 1의 동백 식물세포 배양추출물	2.0
정제수	to 100

제조예 2-2: 에센스

다음 처방에 따라 통상의 에센스 제조 방법에 따라 제조하였다.

원 료 명	중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올	1.0
자기유화형모노스테아린산	1.0
밀납	0.5
스쿠알란	5.0
이소세틸옥타노에이트	3.0
디메틸실록산	0.3
모노스테아린산소르비탄	0.5
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜	8.0
글리세린	4.0
프로필렌글리콜	0.2
카르복시폴리머	0.22
트리에탄올아민	0.25
방부제	적량
향료	적량
착색료	적량
실시예 1의 동백 식물세포 배양추출물	7.0
정제수	to 100

제조예 2-3: 로션

다음 처방에 따라 통상의 로션 제조 방법에 따라 제조하였다.

원료명	중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올	0.8
자기유화형모노스테아린산	1.0
밀납	0.5
스테아린산	0.5
유동파라핀	7.0
스쿠알란	5.0
마카데미아오일	3.0
이소세틸옥타노에이트	2.0
디메틸실록산	0.3
모노스테아린산소르비탄	0.5
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜	1.2
글리세린	4.0
프로필렌글리콜	4.0
베타인	4.0
카르복시폴리머	0.12
트리에탄올아민	0.15
방부제	0.25
향료	적량
착색료	적량
실시예 1의 동백 식물세포 배양추출물	5.0
정제수	to 100

제조예 2-4: 크림

다음 처방에 따라 통상의 크림 제조 방법에 따라 제조하였다.

원 료 명	중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올	3.0
자기유화형모노스테아린산	1.5
친유형모노스테아린산	1.5
밀납	0.5
유동파라핀	8.0
스쿠알란	7.0
이소세틸옥타노에이트	4.0
정제호호바유	4.0
디메틸실록산	0.3
모노스테아린산소르비탄	1.0
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜	1.2
글리세린	6.0
프로필렌글리콜	4.0
베타인	4.0
산탄검	0.06
트리에탄올아민	0.10
방부제	0.25
향료	적량
착색료	적량
실시예 1의 동백 식물세포 배양추출물	7.0
정제수	to 100

제조예 2-5: 젤

다음 처방에 따라 통상의 젤 제조 방법에 따라 제조하였다.

원료명	중량 %(w/w)
글리세린	4.0
프로필렌글리콜	4.0
에탄올	10
폴리옥시에틸렌경화피마자유	0.1
카르복시폴리머	0.30
트리에탄올아민	0.30
방부제	적량
향료	적량
착색료	적량
실시예 1의 동백 식물세포 배양추출물	1.0
정제수	to 100

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (17)

1. 동백 (Camellia japonica) 식물의 조직으로부터 식물세포를 분리하여 배양하는 것을 특징으로 하는 동백 식물 세포 배양물의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 동백꽃의 종자, 태좌, 씨방 또는 꽃잎으로부터 세포를 분리하여 배양하는 것을 특징으로 하는 동백 식물 세포 배양물의 제조방법.
3. 제1항에 있어서, 동백나무의 종자, 잎, 줄기, 또는 뿌리로부터 세포를 분리하여 배양하는 것을 특징으로 하는 동백 식물 세포 배양물의 제조방법.
4. 제1항에 있어서, NAA(α-naphtalene acetic acid) 또는 6-BAP(6-Benzylaminopurine) 함유 배지에서 식물 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 동백 식물 세포 배양물의 제조 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 동백(Camellia japonica) 식물의 식물 세포 배양물 또는 그 추출물을 제조하여 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물의 제조방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 동백 식물의 식물 세포 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시켜 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 동백 식물의 식물세포 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시킨 다음, 초음파 추출 또는 열수 추출하여 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 동백(Camellia japonica) 식물의 세포 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 피부개선용 피부 외용제 조성물.
9. 제8항에 있어서, 상기 피부개선용은 피부 노화 방지 또는 개선인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
10. 제8항에 있어서, 상기 피부개선용은 피부 주름 개선용인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
11. 제8항에 있어서, 상기 피부개선용은 피부 수렴용인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
12. 제8항에 있어서, 상기 피부개선용은 피부 보습용인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
13. 제8항에 있어서, 상기 피부개선용은 모공 수축용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
14. 제8항에 있어서, 상기 피부개선용은 피부 항균용 또는 여드름 개선용 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
15. 제8항에 있어서, 상기 피부개선용은 피부 장벽 기능 보호 또는 강화용 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
16. 제8항에 있어서, 상기 피부개선용은 자외선에 따른 피부 보호 또는 피부 손상 개선용인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
17. 제8항에 있어서, 상기 피부개선용은 피부 진정용인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
    

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