KR20140016556A

KR20140016556A - 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 유효성분으로 포함하는 피부장벽 손상의 개선 또는 치료, 또는 피부장벽 기능의 개선 또는 강화용 조성물

Info

Publication number: KR20140016556A
Application number: KR1020120083266A
Authority: KR
Inventors: 박장서; 남진주; 김진욱; 이은옥
Original assignee: 동국대학교 산학협력단; 주식회사 엘씨에스바이오텍
Priority date: 2012-07-30
Filing date: 2012-07-30
Publication date: 2014-02-10
Also published as: KR101461625B1

Abstract

본 발명은 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 유효성분으로 포함하는 피부장벽 손상의 개선 또는 치료, 또는 피부장벽 기능의 개선 또는 강화용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신은 여러 가지 용매에 대한 용해도가 높고, 안정성이 높으면서도 장벽기능 손상에 대한 회복능력 및 강화효과가 뛰어나고 각질세포의 분화를 촉진시키며 표피층의 두께를 두껍게 개선시키는 효과를 우수하게 나타냄으로써, 피부장벽 손상의 개선 또는 치료, 피부장벽 기능의 개선 또는 강화용 조성물로서 매우 유용하게 사용할 수 있다.

Description

16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 유효성분으로 포함하는 피부장벽 손상의 개선 또는 치료, 또는 피부장벽 기능의 개선 또는 강화용 조성물{Composition for ameliorating or treating skin barrier damage, or for improving or reinforcing skin barrier function comprising 16-hydroxyhexadecanoic phytosphingosine}

본 발명은 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신(16-hydroxyhexadecanoic phytosphingosine)을 유효성분으로 포함하는 피부장벽 손상의 개선 또는 치료용 조성물, 또는 피부장벽 기능의 개선 또는 강화용 조성물에 관한 것이다.

세라마이드는 스핑고신, 피토스핑고신, 스핑가닌이라는 스핑고 염기(sphingoid base)에 지방산이 아미드 결합된 물질이다. 세라마이드는 그 구조를 이루는 지방산 및 스핑고 염기의 종류에 따라 분류되며, 피부에서는 현재까지 7~9종의 세라마이드가 확인되었고 그 기능에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 현재까지 알려진 피부에서의 세라마이드의 대표적인 역할은 지질 이중층을 형성하고 피부 보습을 담당하는 것 외에도, 콜레스테롤의 용해성에 기여, 생체막의 유동성 감소, 피부세포 분화와 성장 촉진, 및 피부에서의 신호전달 매개 등이 있다.

한편, 각질층 또는 피부 장벽(Stratum corneum, Skin barrier)은 죽은 각질세포(Coneocyte)와 세포간 지질(Intercellular lipid)로 구성되어 있고, 외부 자극으로부터 피부를 보호하며 피부에서 수분이 증발하는 것을 막아주는 피부 보호막으로서 피부건강에 핵심적인 기능을 담당한다. 특히, 피부의 수분 불투과성은 죽은 각질세포(corneocyte)와 세포간 지질에 의해 획득되는데, 죽은 각질세포의 표면을 구성하는 각질세포 외피(corneocyte envelope)는 세포간 지질의 안정성에 중요한 역할을 한다. 각질세포 외피는 인볼루크린(involucrin), 로리크린(loricrin), 필라그린(filaggrin) 등의 단백질 막으로 구성되며, 상기한 세라마이드 중에서도 오메가-히드록시 세라마이드(ω-hydroxyceramide)가 이 단백질에 강력하게 결합하여 피부장벽의 구조를 견고하게 한다는 것이 보고되었다. 그러나, 아직까지 오메가-히드록시 세라마이드를 피부에 외용할 경우의 효과에 관하여서는 전혀 알려진 바가 없으며, 이에 대한 연구도 전무한 상태이다. 또한, 이러한 오메가-히드록시 세라마이드는 피부의 각질 표면층(stratum corneum)의 중량 중 2%에 불과하여 동물의 피부에서 이를 추출하여 산업적으로 이용하기에는 경제성이 매우 낮은 문제점이 있었다.

따라서, 산업적으로 대량 생산이 용이한 천연물질이 아닌, 합성 오메가-히드록시 세라마이드를 이용한 피부장벽 손상 치료제, 피부장벽 기능 개선제 또는 강화제에 대한 개발의 필요성이 절실히 요구되고 있다.

본 발명자들은 피부장벽 개선 또는 강화 효과를 갖는 물질을 탐색하기 위하여 연구하던 중, 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신이 피부장벽 손상에 따른 회복능력 및 강화효과가 뛰어나고 각질세포의 분화를 촉진시키며 표피층을 두껍게 개선시키는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 유효성분으로 포함하는 피부장벽 손상의 개선 또는 치료용 약학적 조성물 및 피부장벽 기능의 개선 또는 강화용 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 유효성분으로 포함하는 피부장벽 손상의 개선 또는 치료용 약학적 조성물를 제공한다.

또한, 본 발명은 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 유효성분으로 포함하는 피부장벽 기능의 개선 또는 강화용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신은 여러 가지 용매에 대한 용해도가 높고, 안정성이 높으면서도 장벽기능 손상에 대한 회복능력이 뛰어나고 각질세포의 분화를 촉진시키며 표피층의 두께를 두껍게 개선시키는 효과를 우수하게 나타냄으로써, 피부장벽 손상의 개선 또는 치료 및 피부장벽 기능의 개선 또는 강화용 조성물로서 매우 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신(16-hydroxyhexadecanoic phytosphingosine)의 NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신의 DSC(differential scanning calorimetry) 분석결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신 리포좀 제형의 안정성을 나타낸 도이다.
도 4은 본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신 리포좀(좌) 및 이를 포함하는 스킨 제형(우)의 안정성을 6개월 동안 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신 리포좀을 포함하는 에멀젼 제형의 안정성을 6개월 동안 관찰한 결과(좌) 및 에멀젼 제형의 전자현미경 사진(우)을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신 함유 또는 비함유 리포좀의 물리적 피부장벽 손상에 대한 회복능력을 경표피 수분손실량(TEWL)의 측정결과로 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신 리포좀 및 세라마이드-3의 물리적 피부장벽 손상에 대한 회복능력을 경표피 수분손실량의 측정결과로 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신 함유 또는 비함유 리포좀의 계면활성제에 의한 피부장벽 손상에 대한 저항력을 경표피 수분손실량의 측정결과로 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신이 각질세포(keratinocyte) 분화에 미치는 영향을 각질 세포의 분화 마커인 TG1(transglutaminase-1) 및 IVL(involucrin) 유전자의 발현량의 측정결과로 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신이 각질세포의 분화를 방해하는 UVB 조건 하에서 각질세포 분화에 미치는 영향을 각질 세포의 분화 마커인 TG1 및 IVL 유전자의 발현량의 측정결과로 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신이 각질세포 외피(corneocyte envelope)의 형성에 미치는 영향을 표피 세포의 분화 마커인 TG1(transglutaminase-1) 및 IVL(involucrin) 단백질의 발현정도를 웨스턴블롯으로 측정하여 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신이 각질세포 외피의 형성에 미치는 영향을 면역염색법을 이용하여 IVL(involucrin)과 TG1(transglutaminase-1) 단백질의 발현 정도의 측정결과로 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신이 각질세포 외피의 형성에 미치는 영향을 면역염색법을 이용하여 로리크린(loricrin) 단백질의 발현 정도의 측정결과로 나타낸 도이다.
도 14는 본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신이 표피층의 두께 개선에 미치는 영향을 HE 염색한 표피층의 관찰 결과로 나타낸 도이다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 유효성분으로 포함하는 피부장벽 손상의 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 유효성분으로 포함하는 피부장벽 기능의 개선 또는 강화용 화장료 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신은 시판되는 것을 구입하거나, 또는 하기 반응식 1과 같은 방법으로 제조하여 얻을 수 있다.

[반응식 1]

본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신은

(a) 16-히드록시헥사데칸산을 유기용매에 녹인 후, 피리딘 및 아세트산무수물과 반응시켜 아세틸기로 보호된 16-아세톡시헥사데칸산을 제조하는 단계;

(b) 상기 아세틸기로 보호화된 16-아세톡시헥사데칸산을 메틸렌 클로라이드 용매 하에 트리에틸아민, 파라톨루엔술폰산 및 피토스핑고신과 반응시켜 16-아세톡시헥사데카노익 피토스핑고신을 제조하는 단계; 및

(c) 상기 16-아세톡시헥사데카노익 피토스핑고신을 염기조건 하에 알코올 용매에서 반응시켜 탈보호화된 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 제조하는 단계; 를 포함하여 제조될 수 있다.

상기 유기용매는 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 헥산, 테트라히드로푸란, 디메틸포름아미드, 디메틸설폭사이드 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 알코올 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신은 여러 가지 용매에 대한 용해도가 높고, 안정성이 높으면서도 장벽기능 손상에 대한 회복능력이 뛰어나고 각질세포의 분화를 촉진시키며, 표피층의 두께를 두껍게 개선시키는 효과가 있다. 따라서, 본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신은 피부장벽 손상의 개선 또는 치료, 피부장벽 기능의 개선 또는 강화제로 매우 유용하게 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신은 피부에 도포하는 것으로서 피부에 침투가 용이하도록 리포좀의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에서 “리포좀”이란 자기 스스로 회합하는 콜로이드 입자들의 구형 인지질 소낭(vesicle)으로서, 친수성 머리와 소수성 꼬리의 양 친매성 분자의 상호작용에 의하여 자발적으로 정렬된 구조를 만든다. 약물전달에 사용되는 리포좀은 일반적으로 밀폐형의 이중막(bilayer) 구조로서 수용성 핵 내부에 친수성 물질을 함유할 수 있고, 양친매성 물질 또는 친유성 물질들은 지질 이중층 내부에 함유할 수 있다. 또한, 상기 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신 리포좀의 형성에는 불포화레시틴, 바람직하게는 정제 대두 레시틴을 사용할 수 있고, 이러한 불포화레시틴은 각질층을 유화시키고 소수성분자의 피부투과를 촉진시키는 효과가 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 외에 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 희석제를 추가로 포함함으로써 통상적인 방법으로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제로 제형화될 수 있다.

본 발명에 따른 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신은 약학적 조성물 총 중량에 대하여 0.001~ 10 중량%로 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태, 피부질환의 종류 및 진행 정도에 따라 달리할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신의 바람직한 적용량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물의 형태 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 피부장벽 손상의 개선 또는 치료 효과를 위해서, 1일 0.0001 mg/kg 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg으로 하루에 한번 또는 수회로 나누어 적용할 수 있다.

상기 피부장벽(skin barrier), 즉, 표피의 최외곽 층인 각질층(stratum corneum)은 주로 무핵의 편평한 각질세포(corneocyte)로 이루저져 있다. 정상적인 표피세포의 분열 및 분화과정을 통해 유지되는 피부장벽의 각질세포가 합성하는 세라마이드, 콜레스테롤, 및 지방산과 같은 세포간 지질로 형성된 다층지질막(multi lamella lipid layer)는 피부 내의 수분이 증발하지 않도록 방어막 역할을 한다. 한편, 이들 세포간 지질 중 오메가 히드록시 세라마이드는 각질세포(corneocyte) 외곽층의 단백질인 인볼루크린(involucrin)과 화학적 공유결합으로 연결되어 각질세포지질막(corneocyte lipid envelope, CLE)을 형성함으로써 다층 지질막 형태의 세포간 지질을 물리적으로 안정화시키는 역할을 하여 장벽기능을 강화시키는 역할을 하게 된다.

본 발명의 약학적 조성물 및 이를 포함하는 피부 외용제 조성물은 피부세포 내 오메가하이드록시세라마이드와 유사한 화학적구조를 가지고 있어 피부도포를 통해 각질층에 전달되어 CLE 형성을 증진시키는 동시에 각질세포의 분화를 촉진시켜, 표피층의 두께를 두껍게 개선시키는 효과가 있을 뿐 아니라, 피부장벽 손상을 회복시키는 효과가 우수하여 피부장벽의 손상에 의해 유발되는 피부질환의 치료 및 예방에 유용하게 사용할 수 있다. 상기 피부장벽 손상에 의해 유발되는 피부질환 으로는 아토피 피부염(atopic dermatitis), 피부건조증(xeroderma), 건선(psoriasis), 어린선(ichthyosis), 여드름 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물은 상기 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신 외에도 필요에 따라 물, 생리식염수, 글리세롤, 계면활성제, 보습제, 증점제, 킬레이트제, 색소 등 피부외용 부형제와 혼합되어 제조될 수 있으며, 통상의 피부외용 화장료 조성물의 제조방법에 따라, 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 화장료 조성물은 상기 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 포함하는 연고제(ointment), 크림(cream), 유연화장수(스킨), 수렴화장수(로션), 에멀젼, 아스트린젠트, 맛사지크림, 영양크림, 에센스, 팩, 파우더, 서스펜션, 스프레이 또는 미용액 등의 형태로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 당해 조성물 분야에서 통상적으로 사용되는 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다. 상기 조성물에 있어서, 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신의 함량은 피부장벽 피부장벽 기능의 개선 또는 강화 효과를 달성하기에 유효한 양, 예를 들면, 조성물 총 중량에 대하여 0.001~10 중량%로 함유될 수 있고, 바람직하게는 약 0.01~5 중량%로 함유될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

제조예 1. 16- 히드록시헥사데카노익 피토스핑고신의 제조

본 발명의 16-히드록시 헥사데카노익 피토스핑고신(16-hydroxyhexadecanoic phytosphingosine)은 하기와 같은 방법에 의하여 제조하였다.

1-1. 16-아세톡시헥사데칸산(16- acetoxyhexadecanoic acid )의 제조

먼저 250ml 플라스크에 16-히드록시헥사데칸산(16-hydroxyhexadecanoic acid) 10g(36.7mmol), 메틸렌클로라이드 100ml를 넣고 교반하였다. 그 후, 피리딘 3.19g(40.4mmol)과 아세트산무수물 4.5g(44mmol)을 반응 용기에 넣고 50℃ 하에서 90분간 반응시켰다. 반응 종결 후, 용매를 감압증류하여 제거하고 에틸아세테이트 200ml와 2N HCl 수용액 50ml로 세척하였다. 에틸아세테이트 층을 취하여 황산나트륨(Na₂SO₄)으로 건조처리한 다음, 여과한 여과물을 톨루엔 50ml로 2회 갑압 농축하여 아세트산을 제거한 후, 아세틸기로 보호화된 16-아세톡시헥사데칸산 10g(86%) 을 얻었다.

1-2. 16- 아세톡시헥사데카노익 피토스핑고신의 제조

500ml 용량의 둥근바닥 플라스크에 상기 1-1.에서 수득한 16-아세톡시헥사데칸산 11.77g (37.45mmol)과 메틸렌클로라이드 300ml를 넣고 교반하였다. 상기 용액에 트리에틸아민 10.39ml (74.9mmol)와 파라톨루엔설폰산 7.14g (37.45mmol)을 가하고, 상온에서 10분간 교반한 다음 파이토스핑고신 10.7g (33.71mmol)을 가하였다. 상기 용액을 환류 상태에서 8시간 동안 교반 하면서 반응시켰다. 반응 종결 후 생성물을 정제수 300ml로 2회 씻어준 후 감압 농축하여 흰색의 고체인 16-아세톡시헥사데카노익 피토스핑고신 18g (84% 수율)을 얻었다.

1-3. 16- 히드록시헥사데카노익 피토스핑고신의 제조

500ml 둥근바닥 플라스크에 상기 1-2.에서 수득한 16-아세톡시헥사데카노익 피토스핑고신 18g과 메틸알콜 300ml를 넣어 10분간 교반하였다. 상기 용액에 10% NaOH 수용액을 가하여 pH 10까지 적정한 후, 환류 상태에서 4시간 동안 교반하였다. 반응이 끝난 후 용액을 농축하고 정제수 500ml로 흰색의 고체 생성물을 수회 세척하여 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신 15g (86% 수율)을 얻었다.

상기 제조된 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신의 NMR 스펙트럼은 도 1에 나타내었다.

실험예 1. 본 발명의 16- 히드록시헥사데카노익 피토스핑고신의 물성 분석

1-1. 가용화 용매의 탐색

본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신(16-hydroxyhexadecanoic phytosphingosine)의 활용을 위한 가용화 용매를 탐색하였다. 각 실험조건 및 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

용매	PY		OHC		C3B		C3A
농도	1%	0.1%	1%	0.1%	1%	0.1%	1%	0.1%
에탄올	-	+	+	+	+	+	+	+
이소세틸알코올	+	+	-	+	-	+	+	+
데실올레산	-	-	-	-	-	-	-	-
C12-15 알킬 벤조산	-	+	-	+	+	-	-	-
이소프로필 팔미트산	-	-	-	-	-	-	-	-

PY: Phytosphingosine

OHC: 16-hydroxyhexadecanoic phytosphingosine,

C3B: Ceramide 3B

C3A: Ceramide 3A

또한, 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 화장품 제형에서 활용하기 위해 폴리올 및 오일류에 대한 용해도를 조사하였으며, 실험조건 및 결과는 하기의 표 2 및 표 3에 나타내었다.

폴리올(Polyol) 종류	세라마이드	16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신
미네랄 오일(점도 : 70cs)	0.01%	0.01%
조조바 오일(Jojoba Oil)/니콜	0.05%	0.015%
Lexol GT 865/Inolex	0.05%	0.015%
Eutanol G/Cognis	0.1%	0.1%
프로필렌 글리콜	불용성	불용성
이소세틸알코올	0.8%	0.2%
이소스테아르산	0.8%	0.06%
호두 오일	0.02%	0.005%
아보카도 오일	0.02%	0.005%

오일 종류	Transparent Contents
미네랄 오일(Parcol 70)	<0.01%
조조바 오일	<0.03%
MCT	<0.02%
조조바 오일+ MCT(50:50)	<0.07%
조조바 오일+미네랄 오일(50:50)	<0.03%

1-2. DSC ( differential scanning calorimetry , 시차주사열량측정법) 분석

본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신의 용융점(melting point)를 측정하기 위하여, 시차주사열량 측정법을 사용하였다. 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 DSC 팬 위에 놓고 가열하면서 온도의 변화를 그래프로 기록하였다.

결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신은 세라마이드와 비교하여 약 10℃ 정도 높은 용융점을 나타냄을 알 수 있었다.

제제예 1. 본 발명의 16- 히드록시헥사데카노익 피토스핑고신의 제형

1-1. 16- 히드록시헥사데카노익 피토스핑고신 리포좀의 제조

16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 포함한 리포좀을 제조하였다. 리포좀의 제조에는 불포화도를 없애기 위해 수첨한 정제 대두 레시틴을 사용하였다. 정제 대두 레시틴 인지질의 일반적인 조성은 하기 표 4에 나타내었다.

성분	중량%
포스파티딜콜린	70-95
포스파티딜에탄올아민	0-15
포스파티딜이노시톨	0-2
리소포스파티딜콜린	0-5

수첨한 레시틴과 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 30:1의 몰비로 혼합하여 에탄올에 용해시켰다. 얻어진 용액으로부터 용매를 증발시키며 박막을 형성시켰다. 그 후, 지질의 상전이 온도 이상인 60℃에서 수화시키고 초음파 처리하여 일정 크기의 리포좀을 제조하였다(HPC 90 + Y3J).

1-2. 16- 히드록시헥사데카노익 피토스핑고신 에멀젼의 제조

16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 이용한 에멀젼을 제조하였다. 에멀젼의 제조에는 하기 표 5의 Phase A 및 B의 물질을 잘 혼합한 뒤, Phase C 및 D의 물질을 차례로 혼합하여 통상의 에멀젼 제조방법으로 제조하였다.

Phase A	D-Water 65.98
	Disodium EDTA 0.02
	Glycerin 3.0
	Carbomer 10.0
Phase B	Stearic Acid 1.0
	Cetyl Alcohol 1.4
	Stearyl Alcohol 1.4
	Glyceryl Stearate 1.0
	Sorbitan Stearate(Aracel 60)/Uniquema 0.2
	Mineral Oil(Parcol 70)/Penreco 3.0
	Caprylic/Capric Triglyceride(Lexol GT 865)/Inolex 4.0
	Macadamia Ternifolia Seed Oil 0.2
	Dimethicone(Dow Corning 200)/Dow 0.3
	Sorbitan Sesquioleate(Aracel 83)/Uniquema 1.2
	Polysorbate 60(Tween 60)/Uniquema 3.0
	Jojoba Oil 3.0
	16- hydroxyhexadecanoic phytosphingosine 0.5
Phase C	TEA 3.0
Phase D	Water q.s.
Phase D	Imidazolidinyl Urea 0.2

1-3. 유연화장수( 스킨 ) 제조

16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신(16-hydroxyhexadecanoic phytosphingosine) 0.01 중량%, 글리세린 5.0 중량%, 1,3-부칠렌글리콜 3.0 중량%, 피이지 1500 1.0 중량%, 알란토인 0.1 중량%, DL-판테놀 0.3 중량%, EDTA-2NA 0.02 중량%, 벤조페논-9 0.04 중량%, 소듐히아루로네이트 5.0 중량%, 에탄올 10.0 중량%, 옥틸도데세스-16 중량%, 폴리솔베이트 20 중량%, 및 미량의 방부제, 향, 색소와 잔량의 정제수를 혼합하여 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 함유하는 유연화장수를 제조하였다.

1-4. 수렴화장수 제조

16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신 0.01 중량%, 글리세린 2.0 중량%, 1,3-부칠렌글리콜 2.0 중량%, 피이지 1500 1.0 중량%, 알란토인 0.2 중량%, DL-판테놀 0.2 중량%, 소듐히아루로네이트 3.0 중량%, 에탄올 15.0 중량%, 옥틸도데세스-16 0.2 중량%, 폴리솔베이트 20 0.3 중량%, 위치하젤추출물 2.0 중량%, 및 미량의 구연산, 방부제, 향, 색소와 잔량의 정제수를 혼합하여 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 함유하는 수렴화장수를 제조하였다.

1-5. 영양화장수(로션) 제조

16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신 0.01 중량%, 글리세린 5.0 중량%, 1,3-부칠렌글리콜 3.0 중량%, 소듐히아루로네이트 5.0 중량%, 에탄올 10.0 중량%, 폴리솔베이트 60 중량%, 글리세릴스테아레이트 에이스 1.5 중량%, 세테아릴알콜 1.5 중량%, 라놀린 1.5 중량%, 솔비탄스테아레이트 0.5 중량%, 경하식물유 1.0 중량%, 광물유 5.0 중량%, 스쿠알란 3.0 중량%, 트리옥타노인 2.0 중량%, 디메치콘 0.8 중량%, 초산토코페롤 0.5 중량%, 카르복시비닐폴리머 0.12 중량%, 트리에탄올아민 0.12 중량%, 및 미량의 방부제, 향, 색소와 잔량의 정제수를 혼합하여 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 함유하는 영양화장수를 제조하였다.

실험예 2. 본 발명의 16- 히드록시헥사데카노익 피토스핑고신의 제형별 안정성 분석

2-1. 리포좀 제형의 안정성

상기 실시예 2에서 제조한 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신 리포좀의 안정성을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

실험군으로는 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신 리포좀을 사용하였고, 대조군으로는 수첨한 레시틴만으로 구성된 지질로 제조한 리포좀(HPC only), 세라마이드-3 (올레산)으로 제조한 리포좀 (HPC 90 + Y3O, HPC 90 + Y3S), 올레산으로 제조한 리포좀(HPC 90 + OA), 및 스테아르산으로 제조한 리포좀(HPC 90 + SA)을 사용하였다. 안정성은 각 리포좀에 강력한 가용화제인 데옥시콜릭산을 가한 후, 분광광도계로 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 초기 흡광도에 대한 데옥시콜릭산 첨가 후의 상대적 흡광도(Relative absorbance)를 지질에 대한 데옥시콜릭산(DOC)의 비율(DOC/Lipid ratio)로 나타내어 각 리포좀 간의 안정성을 비교하였다.

결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 함유한 리포좀의 안정성이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.

2-2. 16- 히드록시헥사데카노익 피토스핑고신 리포좀 및 스킨 제형의 장기 안정성

상기 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신 리포좀 및 스킨 제형의 장기 온도 안정성을 측정하였다. 안정성은 4℃, 상온, 및 40℃ 에서 6개월간 관찰하였다.

결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신 리포좀은 각 온도에서 6개월간 안정하게 유지되었고(도 4, 좌), 리포좀을 스킨 제형에 첨가한 상태(도 4, 우)에서도 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신 리포좀이 6개월간 유지되는 것을 확인하였다.

2-3. 16- 히드록시헥사데카노익 피토스핑고신 리포좀 에멀젼의 장기 제형 안정성

상기의 리포좀을 포함하는 에멀젼 제형의 장기 온도 안정성을 검사하였다. 안정성은 4℃, 상온, 및 40℃에서 6개월간 관찰하였다. 에멀젼 제형에서는 caprylic/capric triglyceride를 30% 포집시킨 에멀젼을 사용하였다.

결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신 에멀젼은 각 온도에서 6개월간 안정하게 유지되었다(도 4, 좌). 또한, 상기 에멀젼의 전자현미경 사진(도 4, 우)으로부터 에멀젼 내부에 리포좀이 균일하게 유지되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 1. 본 발명의 16- 히드록시헥사데카노익 피토스핑고신이 피부장벽 손상의 회복에 미치는 영향

본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신이 피부장벽 손상의 회복에 미치는 영향을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

1-1. 피부장벽 손상 후 24시간 동안의 장벽기능 회복능

15마리의 생후 4개월의 암컷 무모마우스의 등 부분을 테이프 스트립핑(tape stripping)하여 인위적으로 손상을 유도하고, 본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 포함하는 리포좀을 실험군으로, 포함하지 않은 리포좀 및 세라마이드-3를 대조군으로 하여 각각 피부 손상부위에 도포하였다. 그 후, TEWL meter(Transepidermal water loss meter, 경표피 수분 증발량 측정장치)를 이용하여 6시간마다 총 24시간 동안 평균 수분 증발량을 측정하였다.

결과는 도 6 및 도 7에 나타내었다.

도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신의 장벽기능 손상에 대한 회복 능력은 24시간 동안 대조군에 비하여 매우 우수하였다.

1-2. 피부장벽 손상의 치료 효과

피부장벽 손상의 치료 효과를 알아보기 위하여 상기 3-1과 동일한 방법으로 실험을 수행하였으며, 24시간, 48시간의 TEWL 수치를 측정하여 기록하였다.

결과는 하기 표 6에 나타내었다.

표 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신 리포좀을 도포한 실험군에서 48시간 째부터는 TEWL이 정상수치와 근사하게 측정되어, 대조군에 비하여 피부장벽 손상에 대한 회복 능력이 매우 우수함을 알 수 있다.

실시예 2. 본 발명의 16- 히드록시헥사데카노익 피토스핑고신이 피부장벽의 물리적 손상에 대한 저항력에 미치는 영향

본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신이 피부장벽의 손상에 대한 저항력에 미치는 영향을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

2-1. 테이프 스트립핑 실험( Tape stripping test )

본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신(16-hydroxyhexadecanoic phytosphingosine)가 피부장벽의 물리적 손상에 대한 저항력에 미치는 영향을 알아보기 위하여 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 포함하는 리포좀을 실험군으로, 포함하지 않는 리포좀을 대조군으로 하여 각각 5마리의 무모 마우스 등에 도포하고 48시간 동안 방치하였다. 그 다음, 테이프 스트립핑을 반복하면서 평균 TEWL을 측정하여 장벽손상에 대한 저항력을 평가하였다.

결과는 표 7에 나타내었다.

표 7에 나타낸 바와 같이, 리포좀을 도포한 마우스는 평균 5.2번, 본 발명의 히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 도포한 마우스는 평균 7.2번의 테이프 스트립핑으로 TEWL 수치가 30이상이 되는 것을 확인하였다. 따라서, 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신은 피부 장벽의 물리적 손상에 대한 저항력을 강화시키는 효과가 매우 뛰어남을 알 수 있다.

2-2. 계면활성제( SDS , 비누) 실험

본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신(16-hydroxyhexadecanoic phytosphingosine)이 피부장벽의 계면활성제에 의한 자극성 손상에 대한 저항력에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 상기 2-1과 같은 방법으로 처리한 마우스를 10%의 SDS(sodium dodecyl sulfate) 또는 일반 세안용 비누를 처리하여 평균 TEWL을 측정하였다.

결과는 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 정상 TEWL을 100으로 하여 평가하였을 때, 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 포함하지 않은 리포좀을 도포한 마우스에서는 TEWL이 각각 140(SDS), 120(세안용 비누) 이상으로 증가한 반면, 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신 리포좀을 도포한 마우스에서는 TEWL이 약 110 이하의 수치를 기록하여 본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신은 피부 장벽의 계면활성제에 의한 손상에 대한 저항력을 강화시키는 효과가 매우 뛰어남을 알 수 있다.

실시예 3. 본 발명의 16- 히드록시헥사데카노익 피토스핑고신이 각질세포( keratinocyte )의 분화에 미치는 영향

본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신(16-hydroxyhexadecanoic phytosphingosine) 0.25 μg/ml - 10 μg/ml을 HaCaT 각질세포(keratinocyte)에 처리하여 5일간 배양한 후, 피부 표피 세포의 대표적인 분화 마커인 TG1(transglutaminase-1) 및 IVL(involucrin)의 유전자 발현량을 real time RT-PCR을 이용하여 확인하였다.

결과는 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 자연적인 각질세포의 분화유도에 있어서, 5 μg/ml의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신 리포좀을 처리한 실험군이 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 포함하지 않은 리포좀이나 세라마이드-3를 도포한 대조군보다 월등히 높은 분화 마커 유전자 발현을 유도함을 확인하였다.

또한, 각질세포의 분화에 장애를 주는 조건에서 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신이 각질세포 분화능에 미치는 영향을 알아보기 위해 상기 실험물질들의 처리 전에 UVB 12.5mJ/㎠을 처리하였다.

결과는 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 2.5 μg/ml과 5 μg/ml의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신 리포좀을 처리한 실험군에서 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 포함하지 않은 리포좀과 세라마이드 3를 처리한 대조군에 비해 IVL과 TG1의 발현양이 상대적으로 증가했음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신은 각질세포의 분화를 촉진시키는 능력이 우수함을 알 수 있다.

실시예 4. 본 발명의 16- 히드록시헥사데카노익 피토스핑고신이 각질세포 외피( corneocyte envelope) 형성에 미치는 영향

4-1. 웨스턴 블롯

본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신(16-hydroxyhexadecanoic phytosphingosine)이 각질세포 외피(CE, corneocyte envelope) 형성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, HaCaT 각질세포(keratinocyte)를 이용한 in vitro 실험으로 각질세포 외피를 구성하는 주요한 단백질인 IVL 및 TG1의 발현량을 확인하였다. 웨스턴 블롯을 통해 해당 항체를 단백질에 부탁하여 발현량을 측정하였다.

결과는 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타낸 바와 같이, 대조군인 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 포함하지 않은 리포좀과 세라마이드-3에 비하여 본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신 리포좀을 도포한 마우스에서 IVL 및 TG1의 양이 2.5 μg/ml - 10 μg/ml 사이에서 농도 의존적으로 증가함을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신은 피부장벽 기능에 매우 중요한 각질세포 외피 형성을 촉진시키는 효과가 우수함을 알 수 있다.

4-2. 면역 염색법

본 발명의 합성 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신(16-hydroxyhexadecanoic phytosphingosine)이 각질세포 외피형성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 면역염색법을 이용하여IVL(involucrin)과 TG1(TGase-1)의 발현량을 확인하였다. 구체적으로는, 무모 마우스의 피부에 각각 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 포함한 리포좀 또는 포함하지 않은 리포좀을 처리한 후 48 시간 방치한 다음, 생검하여 표피를 획득하고, 여기에 항원-항체반응을 이용한 IVL 및 TG1에 대한 면역 염색을 수행하였다.

결과는 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이, 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 포함하지 않은 리포좀을 처리한 쥐의 피부에 비해 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신 리포좀을 처리한 쥐의 표피에서 IVL(involucrin)과 TG1(Transglutaminase-1)의 발현양이 증가함을 확인하였다.

또한, 각질세포 외피 형성에 장애를 주는 조건에서 본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신이 각질세포 외피 형성에 미치는 영향을 알아보기 위해, 인공피부(Epiderm FT)에 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 포함한 리포좀 또는 포함하지 않은 리포좀을 처리하기 전에 UVB 12. 5mJ/㎠를 처리한 다음, 항원-항체 반응을 이용한 로리크린(loricrin)에 대한 면역염색을 수행하였다.

결과는 도 13에 나타내었다.

도 13에 나타낸 바와 같이, 리포좀을 처리한 쥐의 피부에 비해 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신 리포좀을 처리한 쥐의 표피에서 24시간 째에는 로리크린(loricrin)의 발현양이 대조군에 비해 두드러지지 않았으나, 48시간 째에는 표피층에 두껍게 발현이 증가되었음을 확인하였다.

실시예 5. 본 발명의 16- 히드록시헥사데카노익 피토스핑고신이 표피층의 두께 개선에 미치는 영향

본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신(16-hydroxyhexadecanoic phytosphingosine)이 표피층의 두께 개선에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 인공피부 (Epiderm FT)를 UVB 12.5 mJ/㎠ 처리 하여 상기 실시예 4.와 동일한 방법으로 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 포함한 리포좀 또는 포함하지 않은 리포좀을 처리한 다음, HE 염색을 통해 48 시간 후 표피층의 두께를 확인하였다.

결과는 도 14에 나타내었다.

도 14에 나타낸 바와 같이, UVB를 조사하지 않은 피부, UVB를 조사한 피부, UVB를 조사한 후 리포좀을 처리한 피부와 UVB를 조사한 후 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신 리포좀을 처리한 피부를 각각 비교하여 확인하였을 때, 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신 리포좀을 처리한 피부의 표피층이 견고하게 두터워졌음을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신은 피부 표피층의 두께를 개선시키는 효과가 뛰어남을 알 수 있다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신(16-hydroxyhexadecanoic phytosphingosine)을 유효성분으로 포함하는 피부장벽 손상의 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서, 상기 조성물은 리포좀 형태로 제형화된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신은 조성물 총 중량의 0.001~10 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항의 약학적 조성물을 포함하는, 피부장벽 손상에 의해 유발되는 피부질환의 예방 또는 치료용 피부 외용제 조성물.
제4항에 있어서, 상기 피부장벽 손상에 의해 유발되는 피부질환은 아토피 피부염(atopic dermatitis), 피부건조증(xeroderma), 건선(psoriasis), 어린선(ichthyosis), 여드름으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신을 유효성분으로 포함하는 피부장벽 기능의 개선 또는 강화용 화장료 조성물.
[화학식 1]
제6항에 있어서, 상기 조성물은 리포좀 형태로 제형화된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제6항에 있어서, 상기 16-히드록시헥사데카노익 피토스핑고신은 조성물 총 중량의 0.001~10 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.