KR20170029547A

KR20170029547A - 트러플의 수성 추출물 및 이의 미용 조성물

Info

Publication number: KR20170029547A
Application number: KR1020177002964A
Authority: KR
Inventors: 프레데리크 포르톨란; 발레리 레쿠오이; 장-마리 보토; 조엘 만텔린; 이사벨 임베르트; 누하 돔로지; 노엘 가르시아; 나딘 에이 페르노뎃; 켈리 동; 에드워드 펠레; 칼 하니
Original assignee: 아이에스피 인베스트먼츠 엘엘씨; 이엘씨 매니지먼트 엘엘씨
Priority date: 2014-07-08
Filing date: 2015-07-07
Publication date: 2017-03-15
Also published as: WO2016007461A1; CA2954271A1; CA2954271C; JP2017520630A; JP6917301B2; EP3166649B1; ES2874888T3; EP3166649A1; US20170202773A1; KR102033837B1; AU2015288007B2; EP3166649A4; US10821069B2; AU2015288007A1

Abstract

본 발명은 5 kDa 미만의 분자량을 가진 화합물을 포함하는, 피부 미용 용도를 위한 트러플(Truffle) 추출물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 피부 및 각질성 부속물의 노화 및 광노화의 징후를 감소시키고/시키거나 보정하고 자외선으로 인한 공격으로부터 피부를 보호하도록 디자인된 미용 치료 방법에 관한 것이다.

Description

트러플의 수성 추출물 및 이의 미용 조성물{AQUEOUS EXTRACT OF TRUFFLE AND COSMETIC COMPOSITION THEREOF}

본 발명은 미용 분야, 보다 구체적으로 피부 관리 분야에 속한다. 본 발명은 트러플 추출물, 및 트러플 추출물을 포함하는 미용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 피부 및 각질성 부속물의 노화 및 광노화의 징후를 감소시키고/시키거나 보정하고 자외선으로 인한 공격으로부터 피부를 보호하도록 디자인된 미용 치료 방법에 관한 것이다.

트러플 추출물은 단독으로 사용될 수 있거나 다른 활성제와 함께 사용될 수 있다.

피부는 신체의 전체 표면을 덮고 보호, 감각, 면역, 대사 또는 열조절 기능을 보장하는 여러 층들(진피, 증식층 및 각질층)로 구성된 중요한 기관이다. 피부는 다른 기관처럼 노화된다.

예를 들면, 피부의 외관은 다양한 종류의 내부(질환 및 호르몬 변화, 예컨대, 임신) 또는 외부 공격(환경적 요인, 예컨대, 오염, 일광, 병원체 등)에 의해 변형된다. 그 후, 주름 및 미세한 선, 과다색소침착 또는 과소색소침착 잡티, 피부의 건조함 또는 심지어 탈수, 표피의 얇아짐, 탄력섬유증, 결점, 검버섯 등이 나타날 수 있다. 이들 변화들 전부가 피부뿐만 아니라 각질성 부속물, 예컨대, 손발톱 및 모발에도 영향을 미친다.

세포내 대사 또는 외부 공격에 의해 생성된 화학적으로 불안정한 고도의 반응성 종인 유리 라디칼(free radical)은 노화 과정, 보다 구체적으로 산화되고 손상된 단백질의 형성에 있어서 핵심 역할을 수행한다고 공지되어 있다(Harman et al. "Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry" J. Gerontol., 11, 298-300). 이 외부 공격은 자외선, 독소, 대기 오염물질 및 소화 산화제를 포함할 수 있다. 자외선 피부 노출은 반응성 산소 종(ROS)의 광범위한 생성을 유도한다. 이들은 DNA, 단백질, 지방산 및 사카라이드와 반응하여 산화적 손상을 야기할 수 있다.

피부에서, 거대분자로의 변경(지질성 과산화, 단백질의 카보닐화) 현상을 특징으로 하고 특히 엘라스틴, 콜라겐 또는 피브로넥틴에 영향을 미치는 자외선에 노출된 부위에서 일어나는 조기 노화가 관찰된다.

산화적 손상의 축적의 중요한 결과들 중 하나는 ATP를 생성하는 세포의 성능의 감소이다(Porteous et al., Eur J Biochem 1998, 257(1):192-201). 따라서, 세포 노화의 현상은 세포가 겪는 산화적 손상과 관련되어 있지만, 세포가 생존하는 데 필요한 에너지 생성 과정과도 관련되어 있다.

진균은 살아있는 유기체들의 광범위한 패밀리인 것으로 공지되어 있다. 일부 야생 버섯들 및 재배가능한 버섯들의 자실체(fruiting body)는 전통적인 의약 및 미용품에서 사용되고 있는 의학적 화합물을 함유한다고 공지되어 있다. 진균은 환경적인 스트레스에 저항하기 위해 그들의 진화 동안 다양한 성질들을 발생시키고, 일부 진균 화합물들은 유기체에 대한 생활 환경 및 천연 환경에 의해 야기된 손상을 완화시키는 효과를 가질 수 있는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 진균 유래의 신규 천연 생체활성 화합물에 대한 연구는 강화되고 있다.

예를 들면, 차가버섯(Inonotus obliquus)은 ROS로부터 세포를 보호하는 데 있어서 핵심 요소인 효소, 예컨대, 수퍼록사이드 디스뮤타제(SOD)를 함유한다.

또한, 트러플은 일부 상태들, 예컨대, 면역 및 고지질혈증의 개선에 효과적인 것으로 공지되어 있다.

괴경(Tuber) 속은 자낭균(Ascomycete) 문에 속하고 지하생 진균이다. 괴경 진균 속은 트러플의 일부 종들을 포함한다. 이들 트러플 종들은 나무 및 관목과 외균근(ectomycorrhizal) 공생을 확립하고 자실체를 형성하는 지하생 진균이다.

트러플 종들 중 일부는 그들의 자실체 특징적인 향 및 좋은 맛 때문에 식품으로서 매우 귀하게 여겨진다. 이들 종들은 "트러플" 또는 "진짜 트러플"로서 지칭되고, 이들은 유명한 프랑스 및 이탈리아 요리에서 널리 사용되는 귀하고 값비싼 산해진미이다.

본 발명의 설명에서, "트러플"은 하기 종들을 지칭한다: 블랙 트러플(프랑스로부터 페리고르드(Perigord) 트러플로서도 공지되어 있음, 학명: 투버 멜라노스포룸(Tuber melanosporum)), 이탈리아 화이트 트러플(학명: 투버 마그나툼 피코(Tuber magnatum pico)), 버건디(Burgundy) 트러플(투버 운시나툼(Tuber uncinatum)), 칼라하리(Kalahari) 트러플(테르페지아 페일리이(Terfezia pfeilii)), 라이온(Lion) 트러플(트레페지아 레오니스(Trefezia leonis)), 썸머 트러플(투버 애스티붐(Tuber aestivum)), 윈터 트러플(투버 브루말레(Tuber brumale)), 중국 트러플(투버 시넨시스(Tuber sinensis) 또는 투버 인디쿰(Tuber indicum)) 및 비안케토(Bianchetto) 또는 화이티시(whitish) 트러플(투버 보르키이(Tuber borchii)).

피부의 치료를 위해 시판되는 다양한 항노화 미용 제품들에도 불구하고, 활성제로서 천연 성분을 사용하여 항노화 또는 회춘 이익을 피부, 모발 및/또는 손발톱에게 제공하는 효과적인 국소 적용 미용 조성물에 대한 필요성이 여전히 존재한다. 화학적으로 합성된 비천연 생성물은 환경적으로 또는 개인적으로 불안전한 것으로서 인식될 수 있다. 대조적으로, 천연 생성물은 순수하고 순하고 화학적으로 합성된 생성물보다 더 우수한 것으로서 인식된다. 식물 또는 허브로부터 추출된 다수의 천연 기초 생성물들은 유리 라디칼 손상의 효과를 중화시킬 수 있는 항산화제/유리 라디칼 제거제를 함유하는 것으로 공지되어 있다. 추가로, 이들은 진피의 손상된 결합 조직 구조물의 합성 및 복구, 및 표피의 장벽 기능을 자극하는 물질을 함유할 수 있다.

본 발명의 목적은 신규 활성 성분의 수요가 항상 존재하는 미용 산업을 위한 천연 유래의 신규 추출물을 제공하는 것이다.

이 목적을 위해, 본 발명은 피부 및/또는 부속물의 미용 치료를 위한 트러플 추출물을 제안한다.

더 구체적으로, 본 발명에 따라, 트러플 추출물은 투버 멜라노스포룸의 자실체로부터 수득된다.

본 발명자들은 트러플(투버 멜라노스포룸)의 수성 추출물이 미토콘드리아 반응성 산소 종(ROS)의 생성을 감소시킬 수 있고 아데노신 트라이포스페이트(ATP) 생성을 증가시킬 수 있고 외부 스트레스, 예컨대, 자외선 노출 후 세포 생존력을 증가시킬 수 있는 미용 활성제라는 것을 확인하였다.

도 1: 미토콘드리아 반응성 산소 종 생성에 대한 실시예 1에 따른 트러플 추출물의 효과.
도 2: 로테논(rotenone)을 사용한 처리 후 미토콘드리아 반응성 산소 종 생성에 대한 실시예 2에 따른 트러플 추출물의 효과.
도 3: 자외선 B를 사용한 처리 후 미토콘드리아 반응성 산소 종 생성에 대한 실시예 1에 따른 트러플 추출물의 효과.
도 4: 자외선 A를 사용한 처리 후 섬유모세포에서의 ATP 수준에 대한 실시예 1에 따른 트러플 추출물의 효과.
도 5: 자외선 A를 사용한 처리 후 섬유모세포의 생존력에 대한 실시예 1에 따른 트러플 추출물의 효과.

본 발명의 주요 목적은 5 kDa 미만의 분자량을 가진 화합물을 포함하는, 미용 용도를 위한 신규 트러플 수성 추출물이다.

본 발명에서 "트러플"은 그의 자실체 특징적인 향 및 좋은 맛으로 인해 식품으로서 매우 귀하게 여겨지는 괴경 속의 트러플 종을 지칭한다. 트러플은 예를 들면, 블랙 트러플(프랑스로부터 페리고르드 트러플로서도 공지되어 있음, 학명: 투버 멜라노스포룸), 이탈리아 화이트 트러플(학명: 투버 마그나툼 피코), 버건디 트러플(투버 운시나툼), 칼라하리 트러플(테르페지아 페일리이), 라이온 트러플(트레페지아 레오니스), 썸머 트러플(투버 애스티붐), 윈터 트러플(투버 브루말레), 중국 트러플(투버 시넨시스 또는 투버 인디쿰) 및 비안케토 또는 화이티시 트러플(투버 보르키이)을 포함한다.

피부는 피부를 구성하는 덮개 조직, 점막 및 피부 부속물(모발, 속눈썹 및 눈썹을 포함함) 전부를 지칭한다.

본 발명이 일반적으로 포유동물, 보다 구체적으로 인간을 위해 디자인된다는 것은 명백하다.

본 발명자들은 피부 및 각질성 부속물의 노화 및 광노화의 피부 징후를 감소시키고/시키거나 보정하고 자외선으로 인한 공격으로부터 피부를 보호하는 데 유용한 생물학적 활성을 실제로 확인하였다.

"노화 및 광노화의 피부 징후"는 노화로 인한 피부 및 피부 부속물의 외관의 모든 변화들, 예컨대, 피부의 얇아짐, 처짐, 수화의 상실 및 이완증, 깊은 주름 및 미세한 선, 탄력 및 색조의 상실, 진피 위축 또는 자외선에의 노출로부터 발생된 피부의 임의의 다른 내부 분해, 간반(liver spots) 및 검버섯을 지칭한다. "일광 흑색점", "노인 흑색점", "노인 검버섯" 및 "노인 주근깨"로서도 공지되어 있는 간반은 태양으로부터의 자외선에의 노출로 인한 노화 및 광노화와 관련된 피부 상의 잡티이다. 간반은 밝은 갈색부터 적색 또는 흑색까지 색채 면에서 다양하고 태양에 가장 자주 노출된 부위, 특히 손, 얼굴, 어깨, 팔 및 이마, 및 대머리인 경우 두피에 위치한다.

본 발명에 따른 트러플 추출물의 생물학적 활성은 미토콘드리아 반응성 산소 종(ROS)의 생성을 감소시키고, 아데노신 트라이포스페이트(ATP) 생성을 증가시키고 외부 스트레스, 예를 들면, 자외선 노출 후 세포 생존력을 증가시키는 트러플의 수성 추출물의 능력으로 시험관 내에서 정의되어 있다.

"수성 추출물"은 물을 사용한 추출에 의해 수득된 화합물들의 혼합물인 것으로 이해된다.

"국소 적용"은 상기 트러플 추출물을 함유하는 조성물을 피부 또는 점막의 표면 상에 적용하거나 펴 바르는 것으로 이해된다.

"생리학적으로 허용가능한"은 본 발명에 따른 활성제 또는 상기 활성제를 함유하는 조성물이 독성 또는 과민증 반응을 유발하지 않으면서 피부 또는 점막과 접촉하기에 적합하다는 것으로 이해된다.

본 발명에 따른 활성제는 수성 추출 후 생물학적 활성 화합물을 방출하는 효소적 가수분해에 의해 수득될 수 있다. 바람직하게는, 효소적 가수분해는 카보하이드라제(carbohydrase) 및 프로테아제(protease)로부터 선택된 효소에 의해 수행된다.

트러플에서 발견되는 다수의 화합물들이 생물학적 활성을 가질 가능성이 있다. 조절된 가수분해는 이 화합물들이 방출될 수 있게 한다.

바람직한 실시양태에서, 트러플 추출물은 괴경 종, 보다 바람직하게는 투버 멜라노스포룸으로부터 수득되고, 보다 바람직하게는 트러플 추출물은 트러플 자실체로부터 수득된다.

트러플은 지하생 진균이다. 트러플은 그의 진화 동안 기류를 통해 그의 포자를 분산시키는 능력을 상실하였고, 그 대신에 동물 소비 및 그의 포자의 후속 분산에 의해 증식한다. 용어 "트러플 자실체"는 포자 생성 구조물을 지탱하는 다세포 구조물인 트러플 지하생 자낭과를 지칭한다. 자실체는 진균 수명 주기의 유성 생식기의 부분이고, 상기 수명 주기의 나머지는 영양 균사체 성장 및 무성 포자 생성을 특징으로 한다.

트러플 자실체는 시험관내 조절된 조건 하에 아직 수득될 수 없기 때문에, 자낭과 발생 및 성숙을 유발하는 형태발생적 사건들뿐만 아니라 이들의 기저 분자적 기초에 대한 본 발명자들의 지식은 꽤 제한되어 있다. 자실체의 형성 동안 유전자 발현의 변화는 기재되어 있다(Gabella et al., 2005). 더욱이, 트러플 균사체 및 트러플 자실체는 2개의 상이한 구획들로서 간주되고, 상이한 조성 및 함량을 가진 것으로 공지되어 있다(Tang et al., Food Chemistry 132 (2012) 1207-1213; Splivallo et al., Phytochemistry 68 (2007) 2584-2598).

본 실시양태의 장점들 중 하나는 성숙 시 수확된 트러플로부터의 자실체에는 천연 균사체 또는 시험관내 성장된 균사체에 비해 흥미로운 상이한 화합물들이 매우 풍부하다는 점이다.

당업자에게 공지되어 있는 모든 수성 추출 또는 정제 방법들은 본 발명에 따른 추출물의 제조를 위해 이용될 수 있다.

첫 번째 단계에서, 트러플 물질을 물에서 분쇄하고 물에 불린다.

실온에서 또는 40℃ 내지 90℃의 가열된 물을 사용하여 물 추출을 수행할 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 2시간 동안 50℃에서 가열된 물에 불림으로써 추출을 수행한다.

그 다음, 이 원료 용액을 조절된 조건 하에 가수분해하여 가용성 화합물을 생성한다.

본 발명에 따라, 가수분해는 화학적으로 수행되거나 유리하게는 카보하이드라제 또는 셀룰라제 및 프로테아제에 의해 수행된다. 따라서, 카보하이드라제(예를 들면, 비스코자임(VISCOZYM)^®: 아라바나제(arabanase), 셀룰라제, β-글루카나제(glucanase), 헤미셀룰라제(hemicellulase) 및 자일라나제(xylanase)를 비롯한 광범위한 카보하이드라제들을 함유하는 다중효소 복합체; 글루카넥스(GLUCANEX)^®: 효모(트라이코데르마 하르지아눔(Trichoderma harzianum))로부터 추출된 베타 글루카나제, 및 식물(파파인(papain), 브로멜라인(bromelain), 피신(ficin)) 및 미생물(아스퍼길러스(Aspergillus), 리조퍼스(Rhizopus), 바실러스(Bacillus) 등)에 의해 생성된 엔도프로테아제(endoproteases))의 사용이 본원에서 언급될 수 있다.

가수분해는 동시에 여러 효소들을 사용함으로써 수행될 수 있거나, 한 번에 하나의 효소를 사용하는 하나의 가수분해 단계를 잇달아 실시함으로써 수행될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 첫 번째 가수분해는 40℃ 내지 80℃의 온도 및 3 내지 6의 pH에서 1시간 내지 2시간 동안 1% 내지 10%의 카보하이드라제 효소에 의해 수행된다.

특히 바람직한 실시양태에서, 첫 번째 가수분해는 55℃ 및 4.5 내지 5의 pH에서 2시간 동안 비스코자임^® 또는 글루카넥스^®에 의해 수행된다.

바람직한 실시양태에서, 두 번째 가수분해는 40℃ 내지 80℃의 온도 및 3 내지 6의 pH에서 1시간 내지 2시간 동안 1% 내지 10%의 엔도프로테아제 효소에 의해 수행된다.

특히 바람직한 실시양태에서, 두 번째 가수분해는 55℃ 및 4.5 내지 5의 pH에서 2시간 동안 2% 브로멜라인에 의해 수행된다.

가수분해 단계 후, 수득된 용액은 불투명하다. 잔류물을 제거하기 위해, 원심분리 및 여과가 수행된다. 감소하는 다공성을 가진 필터를 사용하는 연속적인 여과가 수행된다. 수득된 여과액은 투명하고 선명한 용액이다.

그 다음, 효소 불활성화 단계가 수행된다. 바람직하게는, 효소는 예를 들면, 수득된 여과액을 40℃ 내지 90℃, 바람직하게는 80℃에서 2시간 내지 하룻밤 동안 가열함으로써 열적으로 불활성화된다.

효소의 열적 불활성화 후, 잔류 효소를 더 제거하고 저분자량을 가진 화합물을 선택하기 위해 추가 여과가 임의적으로 수행될 수 있다.

불활성화 및 여과에 의한 제거 후, 거의 모든 효소들이 여과액으로부터 제거된다. 따라서, 첫 번째 활성 여과액이 수득된다.

장점은 수득된 활성 여과액이 피부에 자극을 줄 수 있거나 알레르기를 일으킬 수 있는 잔류 효소를 함유하지 않는다는 점이다. 실제로, 단백질분해 효소, 예컨대, 파파인은 피부에 적용될 때 매우 자극적인 것으로 공지되어 있다.

정화 및 효소 불활성화 후, 차콜이 여과액에 첨가된다.

실제로, 트러플 추출물은 미용 적용을 위해 불쾌하게 만드는 냄새나는 휘발성 화합물을 방출하는 것으로 공지되어 있다. 차콜은 유리하게는 이 냄새나는 휘발성 화합물을 흡수한다.

예를 들면, 차콜 SX 플러스(NORIT^®)가 냄새를 제거하기 위해 실온에서 30분 동안 바람직하게는 0.1% 내지 1%의 농도, 보다 바람직하게는 0.25% 내지 0.5%의 농도로 첨가된다.

유리하게는, 이 농도 범위들은 차콜에 의해 흡수된 활성 분자의 일부를 갖지 않으면서 추출물의 불쾌한 냄새를 유의하게 감소시킨다.

그 다음, 여과액은 용매, 예컨대, 물, 글리세롤, 에탄올, 프로판다이올, 부틸렌 글리콜, 다이프로필렌 글리콜, 에톡실화된 또는 프로폭실화된 글리콜, 사이클릭 폴리올 또는 이들 용매들의 임의의 혼합물, 예를 들면, 30% 글리세롤 및 0.5% 나트륨 벤조에이트에 의해 3 내지 10 g/건조 물질 Kg, 바람직하게는 5 g/건조 물질 Kg의 농도로 희석된다.

그 다음, 임의적으로, 희석된 활성제는 예를 들면, 65℃의 오븐 내에서 하룻밤 동안 멸균 여과에 의해 멸균된다.

본 발명에 따라 수득된 추출물은 정성적으로 및 정량적으로 분석된다.

특징은 다음과 같다:

- 단백질: <2 g/kg

- 당: 약 1 내지 3 g/kg

- 아미노산: 1 내지 2 g/kg

- 페놀성 화합물: 0.1 내지 0.3 g/Kg

박층 크로마토그래피 분석은 본 발명자들의 최종 추출물이 트러플, 보다 구체적으로 투버 멜라노스포룸에 대해 기재된 바에 따라 예상된 아미노산을 포함한다는 것을 보여주었다.

SDS PAGE 전기영동은 수득된 추출물이 5 kDa 미만의 분자량을 가진 펩티드들로 구성된다는 것을 보여주었다.

유리하게는, 조절된 가수분해는 트러플 자실체로부터의 관심 있는 분자에 접근할 수 있게 한다. 본 발명에 따른 추출물은 관심 있는 화합물이 풍부하고 천연 단백질 및 탄수화물의 용해로부터 새롭게 형성된 화합물이 풍부한 트러플 추출물이다.

본 발명에 따른 추출물은 5 kDa 미만의 분자량을 가진 화합물을 포함한다. 본 발명에 따른 추출물의 장점은 작은 화합물이 알레르기유발 효과를 갖지 않으면서 보다 더 안정하고 재생산가능하다는 점이다.

이 희석 단계 후, 활성제는 미용 분야에서 사용되는 미용 또는 약학 담체, 예컨대, 리포좀 또는 임의의 다른 마이크로캡슐 내에 캡슐화될 수 있거나 도입될 수 있거나, 분말성 유기 중합체 또는 광물 지지체, 예컨대, 탈크 및 벤토나이트 상에 흡착될 수 있다.

본 발명의 두 번째 양태는 수성 추출 및 조절된 가수분해에 의해 수득된 트러플 추출물을 포함하는 미용 조성물이고, 이때 화합물은 5 kDa 미만의 분자량을 가진다.

바람직한 실시양태에서, 미용 조성물은 투버 멜라노스포룸으로부터의 트러플 추출물을 포함한다.

본 발명에 따른 조성물은 임의의 적절한 방식으로, 특히 경구적으로, 비경구적으로 또는 국소적으로 적용될 수 있고, 상기 조성물의 제제화는 특히 미용 또는 피부과 조성물을 위해 당업자에 의해 조정될 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 유리하게는 국소적으로 투여되도록 디자인된다. 따라서, 이 조성물은 생리학적으로 허용가능한, 즉 피부 및 상피 부속물에 적합한 매질을 함유해야 하고, 모든 미용 또는 피부과 제형들을 커버해야 한다.

본 발명의 유리한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 활성제는 효과적인 양으로, 즉 최종 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.0001% 내지 20%의 농도, 바람직하게는 약 0.001% 내지 5%의 농도로 본 발명의 조성물에 존재한다.

이 조성물은 구체적으로 수성, 하이드로알콜성 또는 유성 용액; 또는 수중유 에멀전, 유중수 에멀전 또는 다중 에멀전의 형태로 존재할 수 있고; 이들은 피부, 점막, 입술 및/또는 상피 부속물 상에의 적용에 맞춰진 크림(cream), 현탁액 또는 심지어 분말의 형태로 존재할 수도 있다. 이 조성물은 거의 유체일 수도 있고, 크림, 로션(lotion), 밀크(milk), 세럼(serum), 포마드(pomade), 겔(gel), 페이스트(paste) 또는 무스(mousse)의 외관을 가질 수 있다. 상기 조성물은 막대로서 고체 형태로 존재할 수도 있거나, 에어로졸로서 피부에 적용될 수 있다. 상기 조성물은 스킨케어 제품 및/또는 메이크업 제품으로서도 사용될 수 있다.

뿐만 아니라, 상기 조성물은 적용 범위에서 예상되는 임의의 통상적으로 사용되는 첨가제 및 그의 제제화에 필요한 첨가제, 예컨대, 보조용매(에탄올, 글리세롤, 벤질 알코올, 댐퍼(damper) 등), 점도증가제, 점도감소제, 유화제, 항산화제, 착색제, 태양 필터, 안료, 충전제, 보존제, 방향제, 향 흡수제, 필수 오일, 올리고요소(oligoelement), 필수 지방산, 계면활성제, 필름 형성 중합체, 화학적 필터 또는 광물, 보습제 또는 온수 등을 포함한다. 예를 들면, 수용성, 바람직하게는 천연 중합체, 예컨대, 폴리사카라이드 또는 폴리펩티드, 메틸셀룰로스 또는 하이드록시프로필셀룰로스 유형의 셀룰로스 유도체, 또는 심지어 합성 중합체, 폴록사머, 카보머, 실록산, PVA 또는 PVP, 특히 애쉬랜드(Ashland)에 의해 시판되는 중합체가 언급될 수 있다.

모든 경우, 당업자는 이들 첨가제들 및 이들의 비율이 본 발명에 따른 조성물의 원하는 유리한 성질에 유해하지 않는 방식으로 선택된다는 것을 보장할 것이다. 이들 첨가제들은 예를 들면, 조성물의 총 중량의 0.01% 내지 20%의 농도로 존재할 수 있다. 본 발명의 조성물이 에멀전일 때, 지방층은 조성물의 총 중량을 기준으로 5 내지 80 중량%, 바람직하게는 5 내지 50 중량%를 차지할 수 있다. 조성물에서 사용되는 유화제 및 보조유화제는 관련 분야에서 전형적으로 사용되는 유화제들 및 보조유화제들로부터 선택될 것이다. 예를 들면, 이들은 조성물의 총 중량을 기준으로 0.3 내지 30 중량%의 비율로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 활성제는 단독으로 사용될 수 있거나 다른 활성 성분과 함께 사용될 수 있다는 것이 잘 이해된다.

나아가, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 조성물은 유리하게는 하나 이상의 다른 활성제를 함유한다. 하기 유형의 성분들이 비-한정적 방식으로 언급될 수 있다: 다른 펩티드 활성제, 식물성 추출물, 치료제, 항노화제, 주름방지제, 진정제, 항-유리 라디칼, 항-자외선 물질, 진피 거대분자 합성 또는 활력 대사를 자극하는 물질, 보습제, 항균제, 항진균제, 소염제, 마취제, 피부 분화, 피부 착색 또는 탈색을 조절하는 물질, 및 손발톱 및 머리 성장을 자극하는 물질.

항-유리 라디칼 또는 항산화제, 또는 진피 거대분자 합성 또는 활력 대사를 자극하는 물질을 사용하는 것이 바람직하다.

보다 구체적인 실시양태에서, 본 발명에 따른 조성물은 본 발명에 따른 트러플 추출물 이외에

- 선크림, 자외선 및 적외선 스크린;

- 항-유리 라디칼 물질;

- DHEA(데하이드로에피안드로스테론);

- 하나 이상의 사이토크롬 c-활성화 화합물; 및/또는

- 하나(또는 하나 이상)의 아쿠아포린(aquaporin) 활성화 화합물; 및/또는

- 하나(또는 하나 이상)의 시르투인(sirtuin) 활성화 화합물; 및/또는

- 세포 부착을 증가시키는 하나(또는 하나 이상)의 화합물; 및/또는

- 콜라겐 또는 라미닌 유형의 매트릭스 단백질 등의 생성을 증가시키는 하나(또는 하나 이상)의 화합물;

- 하나(또는 하나 이상)의 HSP 단백질 조절 화합물;

- 세포 에너지를 증가시키는 하나(또는 하나 이상)의 화합물;

- 하나(또는 하나 이상)의 착색 조절 화합물, 예컨대, 효모, 아마란쓰(amaranth), 아마씨, 콩, 카카오, 옥수수, 대두, 해바라기, 평지씨 또는 땅콩 펩티드 추출물;

- 피부 장벽 기능을 개선하는 하나(또는 하나 이상)의 화합물;

- 하나(또는 하나 이상)의 미토콘드리아 보호 화합물;

- 비타민 A, 특히 레티노산, 레티놀, 레티놀 프로프리오네이트, 레티놀 팔미테이트;

- 비타민 B3, 특히 니아신아미드, 토코페롤의 니코니테이트;

- 비타민 B5, 비타민 B6, 비타민 B12, 판테놀;

- 비타민 C, 특히 아스코르브산, 아스코르빌 글루코사이드, 아스코르빌 테트라팔미테이트, 마그네슘 및 나트륨 아스코르빌 포스페이트;

- 비타민 E, F, H, K, PP, 및 코엔자임 Q10;

- 메탈로프로테이나제(metalloproteinase) 억제제, 조직 억제제 메탈로프로테이나제의 활성화제(TIMP);

- 아미노산, 특히 아르기닌, 오르니틴, 하이드록시프롤린, 하이드록시프롤린 다이팔미테이트, 팔미토일글리신, 하이드록시라이신, 메티오닌 및 이의 유도체, N-아실화된 아미노산;

- 다이펩티드, 트라이펩티드, 테트라펩티드, 펜타펩티드 및 헥사펩티드를 비롯한 천연 또는 합성 펩티드들 및 이들의 친유성 유도체, 이성질체, 및 다른 분자, 예컨대, 금속성 이온(즉, 구리, 아연, 망간, 마그네슘 등)과의 착물을 비롯한 천연 또는 합성 펩티드, 및 상표명 매트릭실(MATRIXYL)^®, 아르기렐린(ARGIRELINE)^®, 콜락실(COLLAXYL)™, 펩티드 빈시(PEPTIDE VINCI) 02™, 크로노겐(CHRONOGEN)™, 라미닉실(LAMINIXYL) IS™, 펩티드 Q10™ 하에 시판되는 펩티드들;

- 가수분해 또는 임의의 다른 방법에 의해 수득된 펩티드성 식물 추출물, 예컨대, 대두 추출물, 외알밀 추출물, 비티스 비니페라(vitis vinifera) 추출물, 평지씨 추출물, 아마씨 추출물, 쌀 추출물, 옥수수 추출물, 땅콩 추출물, 캐럽 추출물, 콩 추출물, 또는 잠두 추출물;

- 효모 추출물, 아르테미아 살리나(artemia salina) 추출물;

- 데하이드로아세트산(DHA);

- 천연 또는 합성 파이스토스테롤;

- 알파-하이드록시산 및 베타-하이드록시산, 실라놀;

- 당 아민, 글루코스아민, D-글루코스아민, N-아세틸-글루코스아민, D-아세틸-D-글루코스아민, 만노스아민, N-아세틸 만노스아민, 갈락토스아민, N-아세틸 갈락토스아민;

- 폴리페놀, 이소플라본, 플라보노이드, 예컨대, 포도 추출물, 소나무 추출물, 올리브 추출물;

- 지질, 예컨대, 세라마이드 또는 인지질;

- 동물 오일, 예컨대, 스쿠알렌 또는 스쿠알란; 또는

- 식물성 오일, 예컨대, 아몬드 오일, 코코넛 오일, 피마자 오일, 호호바 오일, 올리브 오일, 평지씨 오일, 땅콩 오일, 해바라기 오일, 맥아 오일, 옥수수 배아 오일, 대두 오일, 면실 오일, 알팔파(alfalfa) 오일, 양귀비 오일, 호박씨 오일, 달맞이꽃 오일, 수수 오일, 보리 오일, 호밀 오일, 해바라기 오일, 패션(passion) 오일, 헤이즐넛 오일, 팜 오일, 아프리콧 커넬(apricot kernel) 오일, 아보카도 오일, 금잔화 오일, 에톡실화된 식물성 오일, 또는 시어 버터(shea butter)

를 포함한다. 상기 언급된 화합물들은 천연, 예컨대, 식물의 펩티드 가수분해물, 또는 합성, 예컨대, 펩티드 화합물일 수 있다.

본 발명의 세 번째 양태는 본 발명에 따른 트러플 추출물을 포함하는 조성물을 피부, 점막 및/또는 피부 부속물에 국소적으로 적용하는 단계를 포함하는, 피부 및 각질성 부속물의 노화 및 광노화의 징후를 감소시키고/시키거나 보정하는 미용 방법이다.

"노화 및 광노화의 피부 징후"는 노화로 인한 피부 및 피부 부속물의 외관의 모든 변화들, 예컨대, 피부의 얇아짐, 처짐, 수화의 상실 및 이완증, 깊은 주름 및 미세한 선, 탄력 및 색조의 상실, 진피 위축 또는 자외선에의 노출로부터 발생된 피부의 임의의 다른 내부 분해, 간반 및 검버섯을 지칭한다.

본 발명의 네 번째 목적은 자외선으로 인한 공격으로부터 피부를 보호하도록 디자인된 미용 방법이고, 이때 본 발명에 따른 트러플 추출물을 포함하는 미용 조성물은 치료될 피부 상에 국소적으로 적용된다.

본 발명의 다섯 번째 목적은 피부 세포에서 ATP 수준을 증가시키도록 디자인된 미용 방법이고, 이때 본 발명에 따른 트러플 추출물을 포함하는 미용 조성물은 치료될 피부 상에 국소적으로 적용된다.

본 발명의 여섯 번째 목적은 피부 세포에서 ROS 수준을 감소시키도록 디자인된 미용 방법이고, 이때 본 발명에 따른 트러플 추출물을 포함하는 미용 조성물은 치료될 피부 상에 국소적으로 적용된다.

이 미용 방법에 특이적인 실시양태도 상기 설명으로부터 발생된다.

본 발명의 추가 장점 및 특징은 제공된 예시적 및 비-한정적 실시예를 읽음으로써 더 상세히 파악될 수 있다.

실시예 1: 트러플 추출물(투버 멜라노스포룸)의 제조

100 g의 블랙 트러플(투버 멜라노스포룸)을 1 리터의 물에서 분쇄한다. 4% 비스코자임^®을 혼합물에 첨가하고, 용액을 50℃에서 2시간 동안 가열한다. 비스코자임^®은 아라바나제, 셀룰라제, β-글루카나제, 헤미셀룰라제 및 자일라나제를 비롯한 광범위한 카보하이드라제들을 함유하는 다중효소 복합체이다. 그 다음, 2% 브로멜라인을 용액에 첨가하고 혼합물을 50℃ 내지 55℃에서 2시간 동안 가열한다. 그 후, 용액을 80℃에서 2시간 동안 가열하여 효소를 불활성화시킨다.

원심분리 후, 감소하는 다공성을 가진 필터 상에서 상청액을 여과한다. 정제 과정은 투명한 밝은 용액을 수득하기 위해 감소하는 다공성(0.2 ㎛까지)을 가진 세이츠-오리온(Seitz-Orion) 필터를 사용하는 연속적인 여과로 시작된다.

정화 후, 여과액을 65℃에서 하룻밤 동안 가열한 후, 차콜(SX 플러스 - 0.25%)을 실온에서 30분 동안 첨가하여 냄새를 제거한다. 그 다음, 여과액을 30% 글리세롤 및 0.5% 나트륨 벤조에이트로 희석하여, 6 g/Kg 건조 물질을 가진 추출물을 수득한다.

그 후, 횡단-유동 여과를 이용하여 효소 및 고분자량 단백질을 제거함으로써 이 용액을 정제한다.

표준 절차를 이용하여 트러플 추출물을 분석한다. 수득된 트러플 추출물의 특징은 다음과 같다: 건조 물질: 6 g/kg - 단백질: <1 g/kg - 당: 2 g/kg - 아미노산: 1.4 g/kg - 페놀성 화합물 0.1 - 0.3 g/Kg.

SDS PAGE 전기영동(NuPAGE^® 바이스-트라이스 프리-캐스트(인비트로겐(Invitrogen)))을 수행하여 추출물의 단백질의 분자량을 평가한다. 트러플 추출물을 환원 변성 조건 하에 NuPAGE^® LDS 샘플 완충제에서 10분 동안 70℃까지 가열한다. 환원된 단백질이 전기영동 동안 재산화하지 않도록 NuPAGE^® 항산화제 용액을 내부 챔버(캐쏘드)에 첨가한다. 분자량에 대한 마커로서 표준물 시블루 플러스2(SeeBlue Plus2)와 함께 NuPAGE^® MES 런닝 완충제를 사용하여 단백질 이동을 수행한다. 쿠마시(Coomassie)^® 브릴리언트 블루(Brilliant Blue) R-250을 사용하여 단백질 염색을 수행한다.

수득된 추출물은 3.5 kDa 미만의 분자량을 가진 펩티드들로 구성된다.

실시예 2: 트러플 추출물(투버 멜라노스포룸)의 제조

100 g의 블랙 트러플(투버 멜라노스포룸)을 1 리터의 물에서 분쇄한다. 4% 글루카넥스^®를 혼합물에 첨가하고, 용액을 50℃에서 2시간 동안 가열한다. 글루카넥스^®는 효모(트라이코데르마 하르지아눔)로부터 추출된 베타 글루카나제이다. 그 다음, 2% 브로멜라인을 용액에 첨가하고 혼합물을 50℃ 내지 55℃에서 2시간 동안 가열한다. 원심분리 후, 감소하는 다공성을 가진 필터 상에서 상청액을 여과한다.

정화 후, 여과액을 65℃에서 하룻밤 동안 가열한 후, 차콜(SX 플러스 - 0.25%)을 실온에서 30분 동안 첨가하여 냄새를 제거한다. 그 다음, 여과액을 30% 글리세롤 및 0.5% 나트륨 벤조에이트로 희석하여, 8 g/Kg 건조 물질을 가진 추출물을 수득한다.

다음 단계는 물-글리세롤 혼합물에서의 희석 단계이다. 그 다음, 희석된 활성제를 멸균 여과로 멸균한다.

표준 절차를 이용하여 트러플 추출물을 분석한다. 수득된 트러플 추출물의 특징은 다음과 같다: 건조 물질: 8 g/kg - 단백질: <1 g/kg - 당: 6.9 g/kg - 아미노산: 1.4 g/kg.

SDS PAGE 전기영동(NuPAGE^® 바이스-트라이스 프리-캐스트(인비트로겐))을 수행하여 추출물의 단백질의 분자량을 평가한다. 트러플 추출물을 환원 변성 조건 하에 NuPAGE^® LDS 샘플 완충제에서 10분 동안 70℃까지 가열한다. 환원된 단백질이 전기영동 동안 재산화하지 않도록 NuPAGE^® 항산화제 용액을 내부 챔버(캐쏘드)에 첨가한다. 분자량에 대한 마커로서 표준물 시블루 플러스2와 함께 NuPAGE^® MES 런닝 완충제를 사용하여 단백질 이동을 수행한다. 쿠마시^® 브릴리언트 블루 R-250을 사용하여 단백질 염색을 수행한다.

실시예 3: 미토콘드리아 반응성 산소 종 생성에 대한 실시예 1에 따른 트러플 추출물의 효과

본 연구의 목적은 미토콘드리아 반응성 산소 종(ROS) 생성에 대한 실시예 1에 따른 트러플 추출물의 효과를 확인하는 것이다.

방법: 52세 유럽 여성 복부 피부로부터 추출된 정상 인간 각질세포를 8웰 배양 퍼마녹스(PERMANOX)^® 플라스틱 슬라이드(써모 사이언티픽, 미국 매사추세츠주 왈쌈 소재)에 시딩하였다. 50 ㎍·㎖^-1 소 뇌하수체 추출물(깁코(Gibco)), 5 ng·㎖^-1 인간 재조합 EGF(깁코) 및 0.1 mg·㎖^-1 프리모신(PRIMOCIN)™(인비보겐(Invivogen), 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)으로 보충된 KSFM 배지(깁코, 뉴질랜드 오클랜드 소재)에서 48시간 동안 실시예 1에 따른 트러플 추출물을 하루에 2회 적용하여(각각 0.01% 및 0.05%) 세포를 전처리하였다. 배양 배지를 1시간 동안 새로운 KSFM으로 교체하였다. 항온처리 말기에, 5 μM 미토속스(MITOSOX)^®(라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재) 용액을 5% CO₂ 대기 하에 37℃에서 20분 동안 더 항온처리하였다. 세포를 행크의 균형 잡힌 염 용액(Hank's Balanced Salt Solution)(깁코)으로 3회 세척하였고 20분 동안 포름알데하이드 3.7%(시그마, 독일 스테인하임 소재)로 고정시킨 후, 0.3 μM DAPI 용액(라이프 테크놀로지스)으로 10분 동안 염색함으로써 핵을 보여주었다. 20x 대물렌즈를 가진 도립 제이스 악시오버트(Zeiss Axiovert) 200M 현미경(제이스, 독일 오버코헨 소재)으로 디지털 영상을 획득하였다. 볼로시티(Volocity) 획득 소프트웨어(퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 미국 매사추세츠주 왈쌈 소재)에 커플링된 퀴미징(Qimaging) EXI 블루 카메라(퀴미징, 캐나다 브리티쉬 콜럼비아 서레이 소재)로 사진을 촬영하였다. 모든 값들은 평균 ± SEM으로서 표시된다. 데이터의 통계학적 유의성을 대응 스튜던츠 t-검정으로 평가하였다(n=3, p≤ 0.05는 유의한 것으로서 간주되었고; p≤ 0.01은 매우 유의한 것으로서 간주되었고; p≤ 0.005는 고도로 유의한 것으로서 간주되었다).

결과: 도 1로 표시된 바와 같이, 본 발명자들은 비처리된 각질세포에 비해 실시예 1에 따른 0.01% 트러플 추출물로 처리된 각질세포에서 ROS 생성의 23% 감소를 관찰하였고, 비처리된 각질세포에 비해 실시예 1에 따른 0.05% 트러플 추출물로 처리된 각질세포에서 ROS 생성의 고도로 유의한 66% 감소를 관찰하였다.

결론: 실시예 1에 따른 트러플 추출물은 피부에서 미토콘드리아 ROS 수준을 감소시킨다.

실시예 4: ROS의 로테논-유도된 생성 후 미토콘드리아 반응성 산소 종에 대한 실시예 2에 따른 트러플 추출물의 효과

본 연구의 목적은 미토콘드리아 반응성 산소 종(ROS) 생성에 대한 실시예 2에 따른 트러플 추출물의 효과를 확인하는 것이다. 미토콘드리아 ROS를 전자 수송 쇄 복합체 억제제인 로테논으로 유도하였다.

방법: 52세 유럽 여성 복부 피부로부터 추출된 정상 인간 각질세포를 8웰 배양 퍼마녹스^® 플라스틱 슬라이드(써모 사이언티픽, 미국 매사추세츠주 왈쌈 소재)에 시딩하였다. 50 ㎍·㎖^-1 소 뇌하수체 추출물(깁코), 5 ng·㎖^-1 인간 재조합 EGF(깁코) 및 0.1 mg·㎖^-1 프리모신™(인비보겐, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)으로 보충된 KSFM 배지(깁코, 뉴질랜드 오클랜드 소재)에서 48시간 동안 실시예 2의 트러플 추출물을 하루에 2회 적용하여(각각 0.01% 및 0.05%) 세포를 전처리하였다. 그 다음, 1 μM 로테논을 4시간 동안 세포에 적용하였다. 스트레스 직후, 배양 배지를 1시간 동안 새로운 KSFM으로 교체하였다. 항온처리 말기에, 5 μM 미토속스^®(라이프 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재) 용액을 5% CO₂ 대기 하에 37℃에서 20분 동안 더 항온처리하였다. 세포를 행크의 균형 잡힌 염 용액(깁코)으로 3회 세척하였고 20분 동안 포름알데하이드 3.7%(시그마, 독일 스테인하임 소재)로 고정시킨 후, 0.3 μM DAPI 용액(라이프 테크놀로지스)으로 10분 동안 염색함으로써 핵을 보여주었다. 20x 대물렌즈를 가진 도립 제이스 악시오버트 200M 현미경(제이스, 독일 오버코헨 소재)으로 디지털 영상을 획득하였다. 볼로시티 획득 소프트웨어(퍼킨 엘머, 미국 매사추세츠주 왈쌈 소재)에 커플링된 퀴미징 EXI 블루 카메라(퀴미징, 캐나다 브리티쉬 콜럼비아 서레이 소재)로 사진을 촬영하였다. 모든 값들은 평균 ± SEM으로서 표시된다. 데이터의 통계학적 유의성을 대응 스튜던츠 t-검정으로 평가하였다(n=3, p≤ 0.05는 유의한 것으로서 간주되었고; p≤ 0.01은 매우 유의한 것으로서 간주되었고; p≤ 0.005는 고도로 유의한 것으로서 간주되었다).

결과: 도 2는 결과를 보여준다. 먼저, 본 발명자들은 비처리된 대조군에 비해, 로테논 처리가 각질세포에서 ROS 생성의 45% 증가를 발생시켰다는 것을 관찰하였다.

본 발명자들은 로테논 처리 후 실시예 2에 따른 0.01% 및 0.05% 트러플 추출물로 처리된 각질세포에서의 ROS 생성의 증가가 트러플 추출물로 처리되지 않고 로테논으로 처리된 각질세포에 비해 각각 27% 및 42% 더 낮았다는 것을 관찰하였다.

결론: 실시예 1에 따른 트러플 추출물은 로테논-유도된 미토콘드리아 ROS 생성으로부터 피부를 효과적으로 보호한다.

실시예 5: ROS의 자외선 B-유도된 생성 후 미토콘드리아 반응성 산소 종에 대한 실시예 1에 따른 트러플 추출물의 효과

방법: 52세 유럽 여성 복부 피부로부터 추출된 정상 인간 각질세포를 8웰 배양 퍼마녹스^® 플라스틱 슬라이드(써모 사이언티픽, 미국 매사추세츠주 왈쌈 소재)에 시딩하였다. 50 ㎍·㎖^-1 소 뇌하수체 추출물(깁코), 5 ng·㎖^-1 인간 재조합 EGF(깁코) 및 0.1 mg·㎖^-1 프리모신™(인비보겐, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)으로 보충된 KSFM 배지(깁코, 뉴질랜드 오클랜드 소재)에서 48시간 동안 트러플 추출물을 하루에 2회 적용하여(각각 0.01% 및 0.05%) 세포를 전처리하였다. 그 다음, 75 mJ/cm² UVB를 4시간 동안 세포에 적용하였다. 스트레스 직후, 배양 배지를 1시간 동안 새로운 KSFM으로 교체하였다. 항온처리 말기에, 5 μM 미토속스^®(라이프 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재) 용액을 5% CO₂ 대기 하에 37℃에서 20분 동안 더 항온처리하였다. 세포를 행크의 균형 잡힌 염 용액(깁코)으로 3회 세척하였고 20분 동안 포름알데하이드 3.7%(시그마, 독일 스테인하임 소재)로 고정시킨 후, 0.3 μM DAPI 용액(라이프 테크놀로지스)으로 10분 동안 염색함으로써 핵을 보여주었다. 20x 대물렌즈를 가진 도립 제이스 악시오버트 200M 현미경(제이스, 독일 오버코헨 소재)으로 디지털 영상을 획득하였다. 볼로시티 획득 소프트웨어(퍼킨 엘머, 미국 매사추세츠주 왈쌈 소재)에 커플링된 퀴미징 EXI 블루 카메라(퀴미징, 캐나다 브리티쉬 콜럼비아 서레이 소재)로 사진을 촬영하였다. 모든 값들은 평균 ± SEM으로서 표시된다. 데이터의 통계학적 유의성을 대응 스튜던츠 t-검정으로 평가하였다(n=3, p≤ 0.05는 유의한 것으로서 간주되었고; p≤ 0.01은 매우 유의한 것으로서 간주되었고; p≤ 0.005는 고도로 유의한 것으로서 간주되었다).

결과: 도 3은 결과를 보여준다. 먼저, 본 발명자들은 자외선 B-유도된 스트레스가 비처리된 대조군에 비해 각질세포에서 ROS 생성의 18% 증가를 발생시켰다는 것을 관찰하였다.

본 발명자들은 로테논 처리 후 실시예 2에 따른 0.01% 및 0.05% 트러플 추출물로 처리된 각질세포에서의 ROS 생성의 증가가 트러플 추출물 및 자외선 B로 처리되지 않은 각질세포에 비해 각각 29% 및 64% 더 낮았다는 것을 관찰하였다.

결론: 실시예 1에 따른 트러플 추출물은 자외선 B-유도된 미토콘드리아 ROS 생성으로부터 피부를 효과적으로 보호한다.

실시예 6: 섬유모세포에서의 ATP 수준에 대한 실시예 1에 따른 트러플 추출물의 효과

본 연구의 목적은 아데노신 트라이포스페이트(또는 ATP)의 세포내 수준에 대한 실시예 1에 따른 트러플 추출물의 효과를 확인하는 것이다.

방법: 62세 기증자로부터의 정상 인간 섬유모세포를 24시간 동안 0.001%의 실시예 1에 따른 트러플 추출물로 처리하고 자외선 A(10 J/cm²)로 방사선조사한 후, 동일한 농도의 실시예 1에 따른 트러플 추출물의 존재 하에 24시간 동안 다시 배양한다. 비처리된 대조군 및 비-방사선조사된 대조군을 동일한 조건 하에 수행한다.

ATP 분석 키트는 초파리(포티너스 파이랄리스(Photinus pyralis)) 루시퍼라제 기초의 아데노신 5'-트라이포스페이트(ATP) 모니터링 시스템이다. 이 분석은 배양물에서 세포내 ATP의 총 수준을 측정하는 데 사용된다. ATP 분석은 ATP와 첨가된 루시퍼라제 및 D-루시페린의 반응에 의해 야기된 광의 생성에 기초한다. 방사된 광은 세포 내부의 ATP 농도에 비례한다.

5 ㎖의 기질 완충제 용액에서 ATP 분석 키트의 동결건조된 기질 용액을 재구성함으로써 기질 용액을 제조한다. 세포를 PBS로 세척한 후, 50 ㎕의 용해 용액을 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 진탕기 상에 5분 동안 놓아둔다. 각각의 웰로부터 20 ㎕를 회수하고, 각각의 웰에 20 ㎕의 마이크로 BCA™ 단백질 분석 작업 용액을 함유하는 96웰 플레이트 내에 넣는다. 50 ㎕의 기질 용액을 각각의 웰에 첨가한다. 플레이트를 진탕기 상에 5분 동안 놓아둔다. 발광측정기를 이용하여 발광을 측정한다.

결과: 도 4는 결과를 보여준다. 본 발명자들은 비처리된 섬유모세포에 비해, 실시예 1에 따른 0.001% 트러플 추출물로 처리되고 자외선 A로 방사선조사된 섬유모세포에서 ATP 수준의 9% 증가를 관찰하였다.

결론: 실시예 1에 따른 트러플 추출물은 자외선 A 스트레스를 받은 피부 세포에서 ATP 수준을 효과적으로 증가시킨다.

실시예 7: 섬유모세포 생존력에 대한 실시예 1에 따른 트러플 추출물의 효과

본 연구의 목적은 자외선 A에 의해 스트레스를 받은 정상 인간 섬유모세포에 대한 실시예 1에 따른 트러플 추출물의 보호 효과를 확인하는 것이다.

이를 수행하기 위해, 세포 생존력 시험을 알라마블루(AlamarBlue) 생존력 분석으로 수행하였다.

방법: 62세 기증자로부터의 정상 인간 섬유모세포를 24시간 동안 0.001%의 실시예 1에 따른 트러플 추출물로 처리하고 자외선 A(10 J/cm²)로 방사선조사한 후, 동일한 농도의 실시예 1에 따른 트러플 추출물의 존재 하에 24시간 동안 다시 배양한다.

비처리된 대조군 및 비-방사선조사된 대조군을 동일한 조건 하에 수행한다. 실험의 말기에, 10%의 알라마블루^®를 함유하는 200 ㎕ 용액에서 세포를 항온처리한 후 항온처리기 내에서 2시간 동안 항온처리하고, 530 nM 여기 및 590 nm 방사에서 형광 플레이트 판독기 상에서 형광을 판독한다.

알라마블루^® 시약의 활성 성분인 레사주린(resazurin)은 청색 색채를 띠고 사실상 형광성을 갖지 않는 무독성 세포 투과가능한 화합물이다. 레사주린은 세포 내로 들어갔을 때 적색 색채를 띠고 높은 형광성을 갖는 화합물인 레소루핀(resorufin)으로 환원된다. 생존 세포는 레사주린을 레소루핀으로 계속 전환시켜, 세포를 둘러싸는 배지의 전체 형광도 및 색채를 증가시킨다. 그 다음, 형광 강도는 미토콘드리아 효소 활성 및 생존 세포의 수에 직접 비례한다.

결과: 도 5는 결과를 보여준다. 알라마블루 생존력 분석에 의한 세포 생존력의 평가는 실시예 1에 따른 트러플 추출물이 자외선 A 방사선조사 후 세포 생존력을 10%까지 증가시킨다는 것을 보여준다.

결론: 0.001%의 실시예 1에 따른 트러플 추출물은 세포 생존력을 증가시키고 자외선 A의 세포독성 효과로부터 피부 세포를 효과적으로 보호한다.

실시예 8: 조성물의 제조

1 - 데이 크림

작동 모드:

지방층의 성분들의 중량을 측정하고 이 성분들을 교반 하에 70℃까지 가열한다. 층 B를 제조하고 70℃까지 가열한다. 층 A를 층 B에 유화시킨다. 층 C를 교반 하에 약 50℃에서 첨가한다. 활성제를 40℃ 미만에서 첨가한다(층 D). 방향제를 첨가하고 실온까지 냉각시킨다.

2 - 태양 보호 크림

층 A 및 층 B의 성분들을 70℃ 내지 75℃에서 별도로 가열한다. 층 B를 교반 하에 층 A에 유화시킨다. 교반을 증가시키면서 층 C를 45℃에서 첨가한다. 그 다음, 온도가 40℃ 미만일 때 층 D를 첨가한다. 집중적인 교반 하에 냉각을 25℃까지 계속 수행한다.

3 - 항노화 크림

층 A를 제조하고 65℃ 내지 70℃에서 용융시킨다. 층 C를 65℃ 내지 70℃까지 가열한다. AB를 C에 유화시키기 직전에 층 B를 층 A에 첨가한다. 약 45℃에서 층 D를 첨가하여 카보머를 중화시킨다. 그 다음, 층 E를 약한 교반 하에 첨가하고, 25℃까지 냉각을 계속 수행한다. 그 후, 원하는 경우 층 F를 첨가한다.

4 - 보호 데이 크림

층 A를 제조하고 교반 하에 75℃까지 가열한다. 교반 하에 카보폴에 이어 잔탄 검을 분산시킴으로써 층 B를 제조한다. 그대로 놓아둔다. 75℃까지 가열한다.

75℃에서 로터 스테이터(rotor stator) 교반 하에 A를 B에 유화시킨다. 60℃에서 빠른 교반 하에 층 C로 중화시킨다. 40℃까지 냉각시킨 후, 층 D에 이어 층 E(둘 다 투명할 때까지 미리 균질화됨)를 첨가한다. 약한 교반 하에 냉각을 계속 수행하고 층 F를 첨가한다.

Claims

5 kDa 미만의 분자량을 가진 화합물을 포함하는, 미용 용도를 위한 트러플(truffle) 수성 추출물.
제1항에 있어서,
투버 멜라노스포룸(Tuber Melanosporum)으로부터 수득된 트러플 수성 추출물.
제1항에 있어서,
자실체(fruiting body)로부터 수득된 트러플 수성 추출물.
제1항에 있어서,
수성 추출, 및 카보하이드라제(carbohydrase) 및 프로테아제(protease)로부터 선택된 효소로 수행된 효소적 가수분해에 의해 수득된 트러플 수성 추출물.
제1항에 있어서,
효소적 가수분해 후, 효소 불활성화 단계가 수행되는, 트러플 수성 추출물.
제1항에 있어서,
물, 글리세롤, 에탄올, 프로판다이올, 부틸렌 글리콜, 다이프로필렌 글리콜, 에톡실화된 또는 프로폭실화된 글리콜, 사이클릭 폴리올 및 이들 용매들의 임의의 혼합물로부터 선택된 용매에서 희석된 트러플 수성 추출물.
수성 추출 및 효소적 가수분해에 의해 수득된 트러플 추출물을 포함하는 미용 조성물로서, 상기 트러플 추출물이 5 kDa 미만의 분자량을 가진 화합물 및 생리학적으로 허용가능한 매질을 포함하는, 미용 조성물.
제7항에 있어서,
트러플 추출물이 조성물의 총 중량의 약 0.0001 중량% 내지 약 20 중량%의 농도로 사용되는, 미용 조성물.
제7항에 있어서,
트러플 추출물이 조성물의 총 중량의 약 0.0005 중량% 내지 약 5 중량%의 농도로 사용되는, 미용 조성물.
제7항에 있어서,
국소 적용에 맞춰진 형태로 존재하는 미용 조성물.
제7항에 있어서,
겔(gel), 크림(cream), 밤(balm), 밀크(milk) 또는 발포 제품(foaming product)의 형태로 존재하는 미용 조성물.
제7항에 있어서,
하나 이상의 다른 활성제를 추가로 포함하는 미용 조성물.
제7항에 있어서,
항산화제, 식물의 가수분해물, 합성 펩티드 화합물, 선스크린(sunscreen) 및 주름방지제(anti-wrinkle agent)로부터 선택된 하나 이상의 다른 활성제를 추가로 포함하는 미용 조성물.
수성 추출 및 효소적 가수분해에 의해 수득된 트러플 추출물을 포함하는 미용 조성물을 피부, 점막 및/또는 표피 피부 부속물(appendage)에 국소 적용하는 단계를 포함하는, 피부 및 각질성 부속물의 노화 및 광노화의 징후를 감소시키고/시키거나 보정하는 방법으로서, 상기 트러플 추출물이 5 kDa 미만의 분자량을 가진 화합물 및 생리학적으로 허용가능한 매질을 포함하는, 방법.
제14항에 있어서,
미용 조성물을 치료될 피부에 국소 적용하는 단계를 포함하는, 자외선으로 인한 공격으로부터 피부를 보호하도록 디자인된 방법.
제14항에 있어서,
트러플 추출물을 포함하는 미용 조성물을 치료될 피부에 국소 적용하는 단계를 포함하는, 피부 세포에서 ATP 수준을 증가시키도록 디자인된 방법.
제14항에 있어서,
트러플을 포함하는 미용 조성물을 치료될 피부에 국소 적용하는 단계를 포함하는, 피부 세포에서 반응성 산소 종 수준을 감소시키도록 디자인된 방법.