KR20170020486A - 접착형 세포의 배양 방법, 배양 용기 및 단백질의 생산 방법 - Google Patents

접착형 세포의 배양 방법, 배양 용기 및 단백질의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 접착형 세포를 부유 상태로 해도, 사멸시키지 않고 증식시킬 수 있는 접착형 세포의 배양 방법, 액체 배지와, 당해 액체 배지 중에 부유하여 생존하고 있는 접착형 세포를 포함하는, 지환 구조 함유 중합체를 사용하여 이루어지는 배양 용기, 및, 단백질의 생산 방법이다. 접착형 세포와 지환 구조 함유 중합체 성형체를 접촉시킴으로써, 당해 접착형 세포를 액체 배지 중에 부유시킨 상태에서 증식시킬 수 있다.

Description

접착형 세포의 배양 방법, 배양 용기 및 단백질의 생산 방법{METHOD FOR CULTURING ADHESIVE CELLS, CULTURE VESSEL, AND METHOD FOR PRODUCING PROTEIN}
본 발명은, 접착형 세포를 부유 상태로 해도, 사멸시키지 않고 증식시킬 수 있는 접착형 세포의 배양 방법, 액체 배지와, 당해 액체 배지 중에 부유하여 생존하고 있는 접착형 세포를 포함하는, 지환 구조 함유 중합체를 사용하여 이루어지는 배양 용기, 및, 단백질의 생산 방법에 관한 것이다.
신약 개발 연구나, 만능 세포, 줄기세포를 대상으로 한 연구에 있어서, 목적하는 단백질을 유전자 재조합법에 의해 생산시키는 것이 행해지고 있다. 예를 들어, 재조합 의약품으로서, 암 치료나 류머티즘 치료에 이용되는 항체나, 적혈구를 늘리기 위한 호르몬인 에리트로포이에틴(EPO) 등의 단백질을 성분으로 하는 것이 알려져 있다. 이들 재조합 의약품은, 예기하지 않은 부작용이 일어날 리스크가 종래의 화학 합성에 의한 의약품보다 적다고 생각되고 있어, 매우 주목받고 있다.
그러나, 재조합 의약품은, 치료를 위하여 투여하는 양이 많고, 또한, 생산하기 위한 비용이 높은 경우가 있어, 충분히 보급하기에는 이르지 못하고 않다. 따라서, 생산성을 높이는 것이 과제로 되어 있다.
재조합 의약품은, 예를 들어, CHO 세포 등의 접착형 세포에, 목적하는 단백질의 유전자를 도입하여, 무혈청 배지에 순화시키고, 부유 상태에서 증식하게 된 재조합 CHO 세포 내에서, 목적하는 단백질을 생합성시킴으로써 생산된다. 재조합 의약품의 생산성을 높이기 위해서는, 세포의 밀도가 높은 상태에서 세포를 배양하는 것이 바람직하다고 생각된다.
목적하는 단백질의 생산성을 향상시키는 방법으로서, 마이크로캐리어를 이용하는 것이 알려져 있다(비특허문헌 1). 이 방법에 있어서는, CHO 세포를 마이크로캐리어에 접착시키고, 이것을 배양액 중에 분산시킨다. 이 때문에, CHO 세포를 부유 상태로 하지 않고, 배양액 중에서 교반 배양할 수 있다.
그러나, 이 방법에 있어서는 마이크로캐리어가 고가라는 문제나, 마이크로캐리어의 표면에만 세포가 존재하기 때문에, 배양액 중에 있어서의 세포 밀도를 충분히 높게 하는 것이 곤란하다는 문제가 있었다.
또한, 접착형 세포인 CHO 세포를 부유시켜 배양하는 방법으로는, 예를 들어, 특허문헌 1에는, 목적하는 단백질을 코드하는 유전자와 디하이드로 엽산 환원 효소 유전자를 갖는 플라스미드를 CHO 세포에 유전자 도입하고, 얻어진 재조합 CHO 세포를, 통상보다 세포 밀도가 낮은 조건으로 배양을 반복함으로써, 재조합 CHO 세포를 부유 상태에서 배양하는 방법이 기재되어 있다.
그러나, 이 방법은, CHO 세포를 부유 상태로 할 때까지 배양을 반복하는 것이기 때문에, 그 때까지 8주일 정도라는 긴 시간이 필요하게 된다. 또한, 계대 배양 기간이 길어지면, 유전자의 변이나 세포의 변질 등의 상태를 관리하고, 확인하는 수고와 비용이 증가하게 된다.
또한, 특허문헌 2에는, 디하이드로 엽산 환원 효소 유전자 결손주 세포에, 인간 안티트롬빈 유전자와 디하이드로 엽산 환원 효소 유전자를 편입시키고, 부유 상태로 한 재조합 CHO 세포를, 할로우 파이버형 배양 장치를 사용하여 배양함으로써, 이 세포를 부유시키면서, 인간 안티트롬빈을 제조하는 방법이 기재되어 있다.
그러나, 이 방법에는, 할로우 파이버를 조합한 장치가 복잡하고 고가이기 때문에, 비용 면에서의 문제가 있었다. 또한, 대량 배양을 위하여 할로우 파이버 사이즈를 크게 하면, 할로우 파이버의 양단에서의 배지 교환이 균등하지 않고, 배지가 불균일해지기 쉬웠다. 그 결과, 배지의 pH 등이 변화하여, 할로우 파이버 내의 세포에 스트레스가 가해지기 때문에, 목적하는 단백질의 생산성이 저하될 우려가 있었다.
일본 공개특허공보 평2-009388호 일본 공개특허공보 2005-073509호
http://www.gelifesciences.co.jp/catalog/0830.html
상기와 같이, 지금까지도 접착형 세포를 고밀도의 조건으로 배양하는 기술이 몇 가지 제안되어 왔지만, 보다 효율적으로, 또한, 보다 저렴하게 배양할 수 있는 방법이 요망되고 있는 것이 현재의 상태이다.
본 발명은, 이러한 실정을 감안하여 이루어진 것으로서, 접착형 세포를 특수한 조작을 필요로 하지 않고, 부유 상태로 해도, 사멸시키지 않고 증식시킬 수 있는 접착형 세포의 배양 방법, 액체 배지와, 당해 액체 배지 중에 부유하여 생존하고 있는 접착형 세포를 포함하는, 지환 구조 함유 중합체를 사용하여 이루어지는 배양 용기, 및, 상기 접착형 세포의 배양 방법을 이용한 단백질의 생산 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 검토한 결과, 배양 세포에, 지환 구조 함유 중합체 성형체를 접촉시킴으로써, 본래, 지지체인 세포외 기질을 필요로 하는 접착형 세포를, 액체 배지 중에 부유 상태에서 생존 또한 증식시킬 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
이렇게 하여 본 발명에 의하면, 하기 (1)~(5)의 접착형 세포의 배양 방법, (6), (7)의 배양 용기, 및 (8)의 단백질의 생산 방법이 제공된다.
(1) 접착형 세포와 지환 구조 함유 중합체 성형체를 접촉시킴으로써, 당해 접착형 세포를 액체 배지 중에 부유시킨 상태에서 증식시키는 것을 특징으로 하는, 접착형 세포의 배양 방법.
(2) 상기 접착형 세포가, 외래 유전자를 발현하는 유전자 재조합된 것인 (1)에 기재된 접착형 세포의 배양 방법.
(3) 상기 접착형 세포가 CHO 세포인 (1) 또는 (2)에 기재된 접착형 세포의 배양 방법.
(4) 상기 접착형 세포가, 외래 유전자를 발현할 수 있는 세포인 (1) 또는 (2)에 기재된 접착형 세포의 배양 방법.
(5) 상기 부유 상태의 접착형 세포가, 세포괴를 형성한 것인 (1)~(4) 중 어느 하나에 기재된 접착형 세포의 배양 방법.
(6) 액체 배지와, 당해 액체 배지 중에 부유하여 생존하고 있는 접착형 세포를 포함하는, 지환 구조 함유 중합체를 사용하여 이루어지는 배양 용기.
(7) 상기 접착형 세포가 세포괴를 형성한 것인 (6)에 기재된 배양 용기.
(8) 생리 활성 단백질을 코드하는 외래 유전자를 발현할 수 있는 재조합 세포의 배양 중에, 당해 세포와 지환 구조 함유 중합체 성형체를 접촉시키는 것을 특징으로 하는, 당해 단백질의 생산 방법.
본 발명에 의하면, 접착형 세포를 특수한 조작을 필요로 하지 않고, 부유 상태로 해도, 사멸시키지 않고 증식시킬 수 있는 접착형 세포의 배양 방법, 액체 배지와, 당해 액체 배지 중에 부유하여 생존하고 있는 접착형 세포를 포함하는, 지환 구조 함유 중합체를 사용하여 이루어지는 배양 용기, 및, 상기 접착형 세포의 배양 방법을 이용한 단백질의 생산 방법이 제공된다.
도 1은 재조합 CHO 세포를 배양하였을 때의, 경과 일수에 대한 생세포수를 나타내는 그래프이다.
도 2는 재조합 CHO 세포를 17일간 배양하였을 때의, 배지 중의 EPO의 농도를 나타내는 그래프이다.
도 3은 재조합 CHO 세포를 배양하였을 때의, 배지 중의 EPO의 농도와, 세포 내의 성분의 누설을 반영한 LDH 활성 측정값의 상관 관계를 나타내는 그래프이다.
본 발명의 방법은, 접착형 세포와 지환 구조 함유 중합체 성형체를 접촉시킴으로써, 당해 접착형 세포를, 액체 배지 중에 부유시킨 상태에서 증식시키는 것을 특징으로 하는, 접착형 세포의 배양 방법이다.
본 발명에 사용하는 접착형 세포는, 특별히 한정되지 않고, 목적에 따라 임의로 선택할 수 있다. 본 발명에 있어서, 접착형 세포란 접착형 세포 그 자체여도 되고, 접착형 세포 유래의 세포여도 된다. 접착형 세포 그 자체란, 통상의 배양 조건에 있어서, 세포외 기질에 접착함으로써 생존 및 증식이 가능한 세포로, 부착 의존성 세포라고도 일컬어지는 세포이다. 접착형 세포 유래의 세포란, 접착형 세포를 순화 배양하여 부유 상태에서도 생존·증식 가능하게 된 세포 등, 접착형 세포에 어떠한 외적 요인을 부여함으로써 세포외 기질에 접착하지 않아도 생존하고, 또한 증식이 가능한 세포이다. 접착형 세포로는, CHO 세포, VERO 세포, NIH3T3 세포, HEK293 세포 등으로 대표되는, 유전자 조작의 숙주 세포나 바이러스 감수성이 있는 세포를 들 수 있고, 그 중에서도 CHO 세포가 바람직하다.
또한, 접착형 세포는, 외래 유전자를 발현하는 유전자 재조합된 것이 바람직하다. 이러한 세포로는, 파지나 플라스미드의 벡터 등을 이용한 형질 도입 등에 의해, 외래 유전자를 발현할 수 있는 것을 들 수 있다.
여기서 외래 유전자는, 목적에 따라 임의로 선택할 수 있다. 구체적으로는, 에리트로포이에틴(이하, 「EPO」라고 한다), 인터페론(α, β, γ), 과립구 콜로니 자극 인자 G-CSF, 인터로이킨, 과립구 매크로파지·콜로니 자극 인자 GM-CSF, 인간 성장 호르몬, 인슐린, 글루카곤 HGF, 혈액 응고 제VIII 인자, 인간형 항체 등의 사이토카인이나 호르몬과 같은 생리 활성 단백질을 코드하는 유전자를 들 수 있다.
이러한 재조합 세포의 배양 중에 지환 구조 함유 중합체 성형체를 접촉시키면, 생리 활성 단백질의 생산량이 증대된다.
본 발명에 있어서, 세포를 배양할 때에는, 액체 배지가 사용된다.
액체 배지로는, 통상, pH 완충 작용이 있고, 삼투압이 세포에 호적한 것이며, 세포의 영양 성분을 포함하고, 또한, 세포에 대하여 독성이 없는 것이 사용된다.
pH 완충 작용을 나타내는 성분으로는, 트리스염산염, 각종 인산염, 각종 탄산염 등을 들 수 있다.
액체 배지의 삼투압 조정은, 통상, 세포의 삼투압과 대략 동일해지도록, 칼륨 이온, 나트륨 이온, 칼슘 이온, 글루코스 등의 농도를 조정한 수용액을 사용하여 행하여진다. 이러한 수용액으로는, 구체적으로는, 인산 완충 생리 식염수, 트리스 완충 생리 식염수, HEPES 완충 생리 식염수 등의 생리 식염수; 락트산 링거액, 아세트산 링거액, 중탄산 링거액 등의 링거액; 등을 들 수 있다.
세포의 영양 성분으로는, 아미노산, 핵산, 비타민류, 미네랄류 등을 들 수 있다.
액체 배지로는, RPMI-1640, HAM, α-MEM, DMEM, EMEM, F-12, F-10, M-199 등의 각종 시판품을 이용할 수 있다.
액체 배지에는, 첨가제를 배합하는 것도 가능하다. 첨가제로는, 단백질 등의 유도 인자, 분화 유도 활성을 갖는 저분자 화합물, 미네랄, 금속, 비타민 성분 등을 들 수 있다.
사용하는 첨가제로는, 세포 표면의 수용체에 작용하는 리간드, 아고니스트, 안타고니스트; 핵 내 수용체의 리간드, 아고니스트, 안타고니스트; 콜라겐이나 파이브넥틴 등의 세포 외 매트릭스; 세포 외 매트릭스의 일부분 혹은, 모사한 화합물; 세포 내의 정보 전달 경로에 관련된 단백질에 작용하는 성분; 세포 내의 1차 대사 또는 2차 대사의 효소에 작용하는 성분; 세포 내의 핵 내 또는 미토콘드리아 내의 유전자의 발현에 영향을 미치는 성분; 바이러스 벡터 등과 조합시켜 세포 내에 도입할 수 있는 DNA나 RNA; 등을 들 수 있다.
이들 첨가제는 1종 단독으로 혹은 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
세포의 배양 조건은 특별히 한정되지 않고, 사용하는 세포나 목적에 따라 임의 결정할 수 있다.
예를 들어, 이산화탄소 농도가 5% 정도이고, 온도가 20℃~37℃의 범위에서 일정하게 유지된, 가습된 항온기를 사용하여 세포를 배양할 수 있다.
본 발명에 사용하는 지환 구조 함유 중합체 성형체는, 지환 구조 함유 중합체를 임의의 형상으로 성형하여 이루어지는 것이다.
지환 구조 함유 중합체는, 주쇄 및/또는 측쇄에 지환 구조를 갖는 수지이며, 기계적 강도, 내열성 등의 관점에서, 주쇄에 지환 구조를 함유하는 것이 바람직하다.
상기 지환 구조로는, 포화 고리형 탄화수소(시클로알칸) 구조, 불포화 고리형 탄화수소(시클로알켄) 구조 등을 들 수 있으나, 기계적 강도, 내열성 등의 관점에서, 시클로알칸 구조나 시클로알켄 구조가 바람직하고, 그 중에서도 시클로알칸 구조를 갖는 것이 가장 바람직하다.
지환 구조를 구성하는 탄소 원자수는, 특별한 제한은 없지만, 통상 4~30개, 바람직하게는 5~20개, 보다 바람직하게는 5~15개이다. 지환 구조를 구성하는 탄소 원자수가 이 범위 내일 때에, 기계적 강도, 내열성, 및 성형성의 특성이 고도로 밸런스되어 호적하다.
지환 구조 함유 중합체 중의 지환 구조를 갖는 반복 단위의 비율은, 사용 목적에 따라 임의 선택되면 되는데, 통상 30 중량% 이상, 바람직하게는 50 중량% 이상, 보다 바람직하게는 70 중량%이다. 지환 구조 함유 중합체 중의 지환 구조를 갖는 반복 단위의 비율이 과도하게 적으면 내열성이 떨어져 바람직하지 않다. 지환 구조 함유 중합체 중의 지환 구조를 갖는 반복 단위 이외의 잔부는, 특별한 한정은 없고, 사용 목적에 따라 임의 선택된다.
지환 구조 함유 중합체의 구체예로는, (1) 노르보르넨계 중합체, (2) 단환의 고리형 올레핀계 중합체, (3) 고리형 공액 디엔계 중합체, (4) 비닐 지환식 탄화수소계 중합체, 및 (1)~(4)의 수소화물 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 내열성, 기계적 강도 등의 관점에서, 노르보르넨계 중합체 및 그 수소화물이 바람직하다.
(1) 노르보르넨계 중합체
노르보르넨계 중합체는, 노르보르넨 골격을 갖는 단량체인 노르보르넨계 단량체를 중합하여 이루어지는 것이며, 개환 중합에 의해 얻어지는 것과, 부가 중합에 의해 얻어지는 것으로 대별된다.
개환 중합에 의해 얻어지는 것으로는, 노르보르넨계 단량체의 개환 중합체 및 노르보르넨계 단량체와 이것과 개환 공중합 가능한 그 밖의 단량체의 개환 중합체, 그리고 이들의 수소화물 등을 들 수 있다. 부가 중합에 의해 얻어지는 것으로는, 노르보르넨계 단량체의 부가 중합체 및 노르보르넨계 단량체와 이것과 공중합 가능한 그 밖의 단량체의 부가 중합체 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 노르보르넨계 단량체의 개환 중합체 수소화물이, 내열성, 기계적 강도 등의 관점에서 바람직하다.
노르보르넨계 단량체로는, 비시클로[2.2.1]헵타-2-엔(관용명 노르보르넨), 5-메틸-비시클로[2.2.1]헵타-2-엔, 5,5-디메틸-비시클로[2.2.1]헵타-2-엔, 5-에틸-비시클로[2.2.1]헵타-2-엔, 5-에틸리덴-비시클로[2.2.1]헵타-2-엔, 5-비닐-비시클로[2.2.1]헵타-2-엔, 5-프로페닐비시클로[2.2.1]헵타-2-엔, 5-메톡시카르보닐-비시클로[2.2.1]헵타-2-엔, 5-시아노비시클로[2.2.1]헵타-2-엔, 5-메틸-5-메톡시카르보닐-비시클로[2.2.1]헵타-2-엔 등의 2환식 단량체;
트리시클로[4.3.01,6.12,5]데카-3,7-디엔(관용명 디시클로펜타디엔), 2-메틸디시클로펜타디엔, 2,3-디메틸디시클로펜타디엔, 2,3-디하이드록시디시클로펜타디엔 등의 3환식 단량체;
테트라시클로[4.4.0.12,5.17,10]-3-도데센(테트라시클로도데센), 테트라시클로[4.4.0.12,5.17,10]-3-도데센, 8-메틸테트라시클로[4.4.0.12,5.17,10]-3-도데센, 8-에틸테트라시클로[4.4.0.12,5.17,10]-3-도데센, 8-에틸리덴테트라시클로[4.4.0.12,5.17,10]-3-도데센, 8,9-디메틸테트라시클로[4.4.0.12,5.17,10]-3-도데센, 8-에틸-9-메틸테트라시클로[4.4.0.12,5.17,10]-3-도데센, 8-에틸리덴-9-메틸테트라시클로[4.4.0.12,5.17,10]-3-도데센, 8-메틸-8-카르복시메틸테트라시클로[4.4.0.12,5.17,10]-3-도데센, 7,8-벤조트리시클로[4.3.0.12,5]데카-3-엔(관용명 메타노테트라하이드로플루오렌: 1,4-메타노-1,4,4a,9a-테트라하이드로플루오렌이라고도 한다), 1,4-메타노-8-메틸-1,4,4a,9a-테트라하이드로플루오렌, 1,4-메타노-8-클로로-1,4,4a,9a-테트라하이드로플루오렌, 1,4-메타노-8-브로모-1,4,4a,9a-테트라하이드로플루오렌 등의 4환식 단량체; 등을 들 수 있다.
노르보르넨계 단량체와 개환 공중합 가능한 그 밖의 단량체로는, 시클로헥센, 시클로헵텐, 시클로옥텐, 1,4-시클로헥사디엔, 1,5-시클로옥타디엔, 1,5-시클로데카디엔, 1,5,9-시클로도데카트리엔, 1,5,9,13-시클로헥사데카테트라엔 등의 단환의 시클로올레핀계 단량체를 들 수 있다.
이들 단량체는, 치환기를 1종 또는 2종 이상 갖고 있어도 된다. 치환기로는, 알킬기, 알킬렌기, 아릴기, 실릴기, 알콕시카르보닐기, 알킬리덴기 등을 들 수 있다.
노르보르넨계 단량체와 부가 공중합 가능한 그 밖의 단량체로는, 에틸렌, 프로필렌, 1-부텐, 1-펜텐, 1-헥센 등의 탄소수 2~20의 α-올레핀계 단량체; 시클로부텐, 시클로펜텐, 시클로헥센, 시클로옥텐, 테트라시클로[9.2.1.02,10.03,8]테트라데카-3,5,7,12-테트라엔(3a,5,6,7a-테트라하이드로-4,7-메타노-1H-인덴이라고도 한다) 등의 시클로올레핀계 단량체; 1,4-헥사디엔, 4-메틸-1,4-헥사디엔, 5-메틸-1,4-헥사디엔, 1,7-옥타디엔 등의 비공액 디엔계 단량체; 등을 들 수 있다.
이들 중에서도, 노르보르넨계 단량체와 부가 공중합 가능한 그 밖의 단량체로는, α-올레핀계 단량체가 바람직하고, 에틸렌이 보다 바람직하다.
이들 단량체는, 치환기를 1종 또는 2종 이상 갖고 있어도 된다. 치환기로는, 알킬기, 알킬렌기, 아릴기, 실릴기, 알콕시카르보닐기, 알킬리덴기 등을 들 수 있다.
노르보르넨계 단량체의 개환 중합체, 또는 노르보르넨계 단량체와 이것과 개환 공중합 가능한 그 밖의 단량체의 개환 중합체는, 단량체 성분을, 공지의 개환 중합 촉매의 존재 하에서 중합하여 얻을 수 있다. 개환 중합 촉매로는, 예를 들어, 루테늄, 오스뮴 등의 금속의 할로겐화물과, 질산염 또는 아세틸아세톤 화합물, 및 환원제로 이루어지는 촉매, 혹은, 티탄, 지르코늄, 텅스텐, 몰리브덴 등의 금속의 할로겐화물 또는 아세틸아세톤 화합물과, 유기 알루미늄 화합물로 이루어지는 촉매를 사용할 수 있다.
노르보르넨계 단량체의 개환 중합체 수소화물은, 통상, 상기 개환 중합체의 중합 용액에, 니켈, 팔라듐 등의 천이 금속을 포함하는 공지의 수소화 촉매를 첨가하고, 탄소-탄소 불포화 결합을 수소화함으로써 얻을 수 있다.
노르보르넨계 단량체의 부가 중합체, 또는 노르보르넨계 단량체와 이것과 공중합 가능한 그 밖의 단량체의 부가 중합체는, 단량체 성분을, 공지의 부가 중합 촉매의 존재 하에서 중합하여 얻을 수 있다. 부가 중합 촉매로는, 예를 들어, 티탄, 지르코늄 또는 바나듐 화합물과 유기 알루미늄 화합물로 이루어지는 촉매를 사용할 수 있다.
(2) 단환의 고리형 올레핀계 중합체
단환의 고리형 올레핀계 중합체로는, 예를 들어, 시클로헥센, 시클로헵텐, 시클로옥텐 등의, 단환의 고리형 올레핀계 단량체의 부가 중합체를 사용할 수 있다.
(3) 고리형 공액 디엔계 중합체
고리형 공액 디엔계 중합체로는, 예를 들어, 시클로펜타디엔, 시클로헥사디엔 등의 고리형 공액 디엔계 단량체를 1,2- 또는 1,4- 부가 중합한 중합체 및 그 수소화물 등을 사용할 수 있다.
(4) 비닐 지환식 탄화수소 중합체
비닐 지환식 탄화수소 중합체로는, 예를 들어, 비닐시클로헥센, 비닐시클로헥산 등의 비닐 지환식 탄화수소계 단량체의 중합체 및 그 수소화물; 스티렌, α-메틸스티렌 등의 비닐 방향족계 단량체의 중합체의 방향고리 부분의 수소화물; 등을 들 수 있다. 비닐 지환식 탄화수소 중합체는, 이들 단량체와 공중합 가능한 다른 단량체와의 공중합체여도 된다.
지환 구조 함유 중합체의 분자량에 특별한 제한은 없지만, 시클로헥산 용액(중합체가 용해되지 않는 경우에는 톨루엔 용액)의 겔·퍼미에이션·크로마토그래피로 측정한 폴리스티렌 환산의 중량 평균 분자량으로, 통상 5,000 이상이고, 바람직하게는 5,000~500,000, 보다 바람직하게는 8,000~200,000, 특히 바람직하게는 10,000~100,000이다. 중량 평균 분자량이 이 범위 내일 때에, 기계적 강도와 성형 가공성이 고도로 밸런스되어 호적하다.
지환 구조 함유 중합체의 유리 전이 온도는, 사용 목적에 따라 임의 선택되면 되는데, 통상 50~300℃, 바람직하게는 100~280℃, 특히 바람직하게는 115~250℃, 더욱 바람직하게는 130~200℃이다. 유리 전이 온도가 이 범위 내일 때에, 내열성과 성형 가공성이 고도로 밸런스되어 호적하다.
본 발명에 있어서 유리 전이 온도는 JIS K 7121에 기초하여 측정된 것이다.
이들 지환 구조 함유 중합체는, 각각 단독으로, 혹은 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 지환 구조 함유 중합체에는, 열가소성 수지 재료에서 통상 사용되고 있는 배합제, 예를 들어, 연질 중합체, 산화 방지제, 자외선 흡수제, 광안정제, 근적외선 흡수제, 이형제, 염료나 안료 등의 착색제, 가소제, 대전 방지제, 형광 증백제 등의 배합제를, 통상 채용되는 양, 첨가할 수 있다.
또한, 지환 구조 함유 중합체에는, 연질 중합체 이외의 그 밖의 중합체(이하, 간단히 「그 밖의 중합체」라고 한다)를 혼합해도 된다. 지환 구조 함유 중합체에 혼합되는 그 밖의 중합체의 양은, 지환 구조 함유 중합체 100 중량부에 대하여, 통상 200 중량부 이하, 바람직하게는 150 중량부 이하, 보다 바람직하게는 100 중량부 이하이다.
지환 구조 함유 중합체에 대하여 배합하는 각종 배합제나 그 밖의 중합체의 비율이 지나치게 많으면 세포가 부유하기 어려워지기 때문에, 어느 것이나 지환 구조 함유 중합체의 성질을 손상하지 않는 범위에서 배합하는 것이 바람직하다.
배합제나 그 밖의 중합체와의 혼합 방법은, 폴리머 중에 배합제가 충분히 분산되는 방법이면, 특별히 한정되지 않는다. 또한, 배합의 순서에 특별한 제한은 없다. 배합 방법으로는, 예를 들어, 믹서, 1축 혼련기, 2축 혼련기, 롤, 브라벤더, 압출기 등을 사용하여 수지를 용융 상태에서 혼련하는 방법, 적당한 용제에 용해하여 분산시킨 후, 응고법, 캐스트법, 또는 직접 건조법에 의해 용제를 제거하는 방법 등을 들 수 있다.
2축 혼련기를 사용하는 경우, 혼련 후에는, 통상은 용융 상태에서 봉상으로 압출하고, 스트랜드 커터로 적당한 길이로 잘라, 펠릿화하여 사용되는 경우가 많다.
지환 구조 함유 중합체의 성형 방법은, 세포와 접촉시킬 때에 사용하는 지환 구조 함유 중합체 성형체의 형상에 따라 임의로 선택할 수 있다. 성형 방법으로는, 예를 들어, 사출 성형법, 압출 성형법, 캐스트 성형법, 인플레이션 성형법, 블로우 성형법, 진공 성형법, 프레스 성형법, 압축 성형법, 회전 성형법, 캘린더 성형법, 압연 성형법, 절삭 성형법, 방사 등을 들 수 있고, 이들 성형법을 조합하거나, 성형 후 필요에 따라 연신 등의 후처리를 할 수도 있다.
지환 구조 함유 중합체 성형체의 형상에 특별한 제한은 없고, 판상, 가루상, 입자상, 끈상, 시트상, 기타 어떠한 형상이어도 된다. 또한, 그 표면은 평평해도 되고, 요철 형상을 갖고 있어도 되며, 중공상의 성형체여도 된다. 또한 상이한 형상의 성형체를, 접착제 등을 개재하거나 또는 개재하지 않고 조합하여 별도의 성형체로 할 수도 있다.
또한, 세포와 접촉할 수 있는 한에 있어서, 디쉬, 플레이트, 백, 튜브, 스캐폴드, 컵, 자 퍼멘터 등의 배양 용기; 교반 날개, 교반자, 배플, 연결 튜브 등 배양 장치의 부품; 피펫, 교반 소자, 필터, 셀 스크레이퍼 등의 배양 조작에 사용하는 배양 기구; 등의 일부 또는 전부를 구성하는 부재여도 된다.
본 발명에 있어서는, 성형체를 배양 세포와 접촉시킴에 있어서, 성형체를 멸균 처리하는 것이 바람직하다.
멸균 처리의 방법에 특별한 제한은 없고, 고압 증기법이나 건열법 등의 가열법; γ선이나 전자선 등의 방사선을 조사하는 방사선법이나 고주파를 조사하는 조사법; 산화에틸렌 가스(EOG) 등의 가스를 접촉시키는 가스법; 멸균 필터를 사용하는 여과법; 등, 의료 분야에서 일반적으로 채용되는 방법에서, 성형체의 형상이나 사용하는 세포에 따라 선택할 수 있다. 그 중에서도, 표면 상태의 변화가 적은 점에서, 가스법이 바람직하다.
또한, 이들 성형체 표면은, 플라즈마 처리, 코로나 방전 처리, 오존 처리, 자외선 조사 처리 등 배양 용기에 대하여 일반적으로 실시하는, 멸균 목적 이외의 처리를 행할 수도 있다. 단, 이들 표면 처리 조작을 실시함으로써 발생하는 비용을 억제할 수 있는 점이나, 표면 처리에 따른 형성체 표면의 부분 분해에 의해 청정성이 손상될 우려가 있는 점, 세포의 부유화능이 저하될 우려가 있는 점 등에서, 이들 표면 처리 조작을 행하지 않거나, 또는 표면 처리 전의 용기 저면(배양액에 접하는 측)의 물 접촉각에 대하여, 사용시의 동일 저면의 물 접촉각이 ±20%, 바람직하게는 ±10%인 약한 표면 처리밖에 되어 있지 않은 것이 바람직하다. 여기서, 물 접촉각은, 전자동 접촉각계(쿄와 계면 과학사 제조 「LCD-400S」)를 사용하여, 디쉬 저면을 Φ30 mm의 서클 커터로 잘라내어 시료의 중심과, 그 곳을 중앙으로 하는 1변 20 mm의 정방형의 정점 4개소, 합계 5개소를 측정점으로 하여, 액적의 반경 r과 높이 h를 구하고, tanθ1 = h/r, θ = 2arctan(h/r)로 구해지는 θ이다(θ/2법).
배양 세포와 지환 구조 함유 중합체 성형체를 접촉시키는 방법은, 지환 구조 함유 중합체 성형체의 형상에 따라 임의의 방법을 채용하면 된다. 예를 들어, 지환 구조 함유 중합체 성형체를 혼합한 배지 중에서 세포를 배양하는 방법; 지환 구조 함유 중합체를 사용하여 성형된 배양 용기 내에서 세포를 배양하는 방법; 지환 구조 함유 중합체를 사용하여 성형된 배양 기구를 사용하여 배양 조작을 행하는 방법; 등을 들 수 있고, 이들을 조합할 수도 있다.
한편, 세포에는, 정보 전달능이 있기 때문에, 배양 중의 모든 배양 세포가 지환 구조 함유 중합체 성형체에 접촉할 필요는 없고, 또한, 배양 기간 전체에 걸쳐 양자가 접촉하고 있을 필요도 없다. 단, 접촉에 의한 효과는 경시적으로 저하되기 때문에, 접촉 시간은 긴 편이 바람직하다.
배양 세포와, 지환 구조 함유 중합체 성형체의 접촉 온도는 세포가 증식할 수 있는 온도이면 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 방법에 의해 장기간 배양되어 부유 상태에서 생존하고 있는 세포는, 통상, 세포괴를 형성하고 있다. 「세포괴」란, 단독으로의 세포 이외의 세포 집합으로, 2개 이상의 세포가 1개로 합쳐진 상태를 말한다.
본 발명에 있어서 세포가 「생존하고 있다」는 것은, 세포 내에서 대사 활동을 행하여, 세포 증식이 가능한 상태를 말한다. 예를 들어, 세포 외의 배지 중에 포함되는 성분이 세포 내부로 침입·침투해 온 경우에, 그 성분이 세포의 생명 활동에 불필요하면, 세포 외부로 배제할 수 있는 생명 활동을 일으킬 수 있는 상태를 말한다. 세포가 생존하고 있는지의 여부는, 실험적으로는, 트리판 블루 등의 생명 활동에 불필요한 색소를 세포 외의 액에 첨가하여, 세포 내로 침입·침투한 색소를 세포 외로 배제할 수 있는 상태의 세포는 생존하고 있는 세포, 배제할 수 없는 세포는 사멸 세포로서 판정할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서는, 세포괴 중의 세포도 사멸은 하지 않고, 세포가 형질 도입된 세포이면, 증식하고, 또한 단백질을 생산하는 능력을 갖고 있다.
이와 같이, 본 발명의 방법에 있어서는, 접착형 세포여도, 부유 상태에서 배양하는 것이 가능하기 때문에, 높은 밀도로 배양할 수 있다.
「높은 밀도」란, 폴리스티렌제 디쉬에서 배양한 접착 세포의 컨플루언트 세포수의 1.5배 이상, 바람직하게는 2배 이상을 말한다.
상기와 같이, 본 발명의 배양 방법은, 접착형 세포여도 부유 상태에서 높은 밀도로 배양할 수 있기 때문에, 당해 세포에 단백질을 생산시킬 때에, 바람직하게 이용된다.
예를 들어, 생리 활성 단백질을 코드하는 외래 유전자를 발현할 수 있는 재조합 세포의 배양 중에, 당해 세포와 지환식 구조 함유 중합체 성형체를 접촉시킴으로써, 단백질을 대량으로 생산시킬 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
〔제조예 1〕 재조합 EPO 생산 CHO 세포의 제작
항생 물질 G418에 대한 내성 유전자를 내포하는 벡터 pLXRN(Chlontech사 제조)의 발현 유전자의 삽입 사이트에, EPO 유전자 배열을 삽입하여 플라스미드 pLXRN-EPO를 구축하였다. 구축한 플라스미드 중의 EPO 유전자는, 그 염기 서열 해석을 행함으로써 확인하였다.
다음으로, 구축한 플라스미드 pLXRN-EPO와 플라스미드 pVSV-G(Clontech사 제조)를, 패키지 세포인 GP293T 세포(Clontech사 제조)에 형질 도입함으로써, EPO 유전자를 함유하는 바이러스 입자를 조제하였다.
한편, 세포로의 플라스미드 pLXRN-EPO의 도입 조작을 위한 유전자 도입 시약으로서, 리포펙타민(Lipofectamine)(invitorogen사 제조)을 사용하고, 유전자 도입 조작은 제조사의 매뉴얼에 따랐다.
유전자 도입 조작을 행한 GP293T 세포를 배양하고, 그 배양 상청을 취출하여, 필터 여과하고, 8 μg/ml의 폴리브렌(Santacruz사 제조)을 첨가함으로써, EPO 유전자를 보유한 바이러스 입자를 포함하는 배양 상청 시료를 조제하였다.
계속해서, 미리 배양한 CHO 세포 시료의 배양액을 제거하고, 상기의 EPO 유전자를 보유한 바이러스 입자를 포함하는 배양 상청 시료를 첨가하여, 8시간 배양 유지함으로써, EPO 유전자를 보유한 바이러스 입자를 CHO 세포에 감염시켰다.
8시간의 인큐베이션 후에, CHO 세포의 배양 배지로 교환을 하고, 재조합 EPO를 생산하는 CHO 세포의 배양 조작을 행하였다.
바이러스의 감염은, 이하와 같이 게놈 PCR에 의해 확인하였다. 먼저, Instagene(BioRad사 제조)을 사용하여, 감염 조작을 행한 CHO 세포로부터 게놈을 추출하고, pLXRN-EPO 서열이 게놈에 도입되어 있는 것을 PCR로 확인하였다. PCR에 사용한 프라이머(Primer)는, pLXRN-seq-F(5'-CGCCTCCGTCTGAATTTTT) 및 pLXRN-seq-R(TCCCTATGCAAAAGCGAAAC)로 하였다.
바이러스가 감염되고, 게놈에 EPO 유전자가 편입된 CHO 세포를 선발하기 위하여, 항생 물질 G418을 배지에 첨가하고, 배양 유지하여, 항생 물질 G418 내성의 CHO 세포를 약제 선택함으로써, 재조합 EPO 생산 CHO 세포(이하, EPO 생산 CHO 세포라고 한다.)를 선발하였다.
〔실시예 1〕
지환 구조 함유 중합체로서, 제오넥스(등록상표) 790R(닛폰 제온사 제조, 노르보르넨계 개환 중합체 수소화물; 이하, 간단히 「790R」이라고 한다)을 사용하여, 사출 성형법에 의해, 직경 3 cm의 디쉬를 제작하였다. 이하, 이 디쉬를 「790R제 디쉬」라고 한다.
배양 용기로서 790R제 디쉬를 사용하고, 액체 배지로서 10% 소 태아 혈청을 포함하는 Ham 배지를 사용하여, EPO 생산 CHO 세포를 1.25 × 104 cells/cm2로 파종하고, 5% CO2 분위기 37℃의 조건으로 17일간 배양을 행하였다. 배양 도중 11일 시점에서, 물의 증산에 의해 배지액량이 감소하였으므로, 배지액량을 유지하기 위하여, 감소한 액량과 동량의 배지를 첨가하였다.
배양으로부터 2일째, 7일째, 10일째, 14일째 및 17일째에, 이하의 방법에 의해 생세포수를 계측하였다.
(세포수의 계측)
부유 상태에 있는 세포에 대해서는, 배양 상청을 취출하여 원심 처리에 의해 침전 회수한 세포를 트리판 블루 염색하여 생세포와 사멸 세포를 구별하고, 생세포수를 계측하였다.
한편, 디쉬 저면에 접착되어 있는 세포는, 생리 식염수로 세정 후, 트립신 처리에 의해 디쉬로부터 세포를 박리한 후, 이들을 트리판 블루 염색하여 생세포와 사세포를 구별하고, 생세포수를 계측하였다.
〔비교예 1〕
실시예 1에 있어서, 790R제 디쉬 대신에, 폴리스티렌제 디쉬〔팔콘(등록상표) 디쉬(벡턴 디킨슨사 제조, 모델 번호 353001)〕(이하, 「폴리스티렌제 디쉬」라고 칭한다)를 사용한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 하여 배양을 행하고, 생세포수를 계측하였다.
배양 7일째에서는, 790R제 디쉬의 EPO 생산 CHO 세포는, 괴상이 되어, 비접촉형의 상태에서 증식하고 있는 것이 관찰되었다. 한편, 폴리스티렌제 디쉬에서는, 살아 있는 EPO 생산 CHO 세포의 다수는 저면에 접착한 상태의 것이며, 배지 중에 부유하고 있는 세포는, 1개의 세포 단독으로 존재하고, 또한, 대부분이 사멸 상태에 있었다.
도 1에 나타내는 바와 같이, 790R제 디쉬를 사용한 배양에 있어서의 생세포수는, 폴리스티렌제 디쉬를 사용하여 배양한 것과 비교하여, 배양 7일째에서, 약 5배의 값이다.
또한, 배양 10일째에서는, 790R제 디쉬와 폴리스티렌제 디쉬 모두, 생세포수가 감소하였으나, 11일째에서의 배지 추가에 의해, 790R제 디쉬에서의 생세포는 다시 증가하고 있다. 이와 같이, 790R제 디쉬는, 배지 추가 등의 조작에 의해, 용이하게 생세포수를 재증가시킬 수 있는 것이다.
한편, 폴리스티렌제 디쉬에서는, 배지 추가에 의해서도, 생세포수의 증가는 거의 관찰되지 않았다.
〔실시예 2〕
배양 용기로서 790R제 디쉬를 사용하고, EPO 생산 CHO 세포를 3회 반복 배양하였다. 배양 17일째에 있어서의 배지를 사용하여, ELISA법(eBioscience사 제조의 human EPO Platinum ELISA)에 의해, 활성형 EPO량을 측정하였다.
〔비교예 2〕
실시예 2에 있어서, 790R제 디쉬 대신에, 폴리스티렌제 디쉬를 사용한 것을 제외하고, 실시예 2와 동일하게 하여 배양을 행하고, 활성형 EPO량을 측정하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 790R제 디쉬에서 배양한 EPO 생산 CHO 세포로부터 생산된 EPO량은, 기존의 배양 기술에 상당하는 폴리스티렌제 디쉬에서 배양한 것과 비교하여 약 5배이며, 본 발명에 의하면, 종래 기술에서는 얻어지지 않는 고농도의 EPO를 생산할 수 있는 것이 나타났다.
〔실시예 3〕
배양 용기로서 790R제 디쉬를 사용하여, EPO 생산 CHO 세포를 배양하였다. 이어서, 그 배양 배지를 사용하여, 세포 내의 대사 효소인 락트산 탈수소효소(이하, 「LDH」라고 한다)의 활성을 측정하고, EPO 생산 CHO 세포의 사멸에 의한 세포 내의 성분의 누설의 정도를 조사하였다. 한편, LDH 측정은, LDH Cytotoxicity Detection Kit(Takara사 제조)를 사용하였다.
〔비교예 3〕
실시예 3에 있어서, 790R제 디쉬 대신에, 폴리스티렌제 디쉬를 사용한 것을 제외하고, 실시예 3과 동일하게 하여 배양을 행하고, LDH 측정을 행하였다.
도 3의 그래프에 있어서, 가로축은 배지 중의 EPO 농도를 나타내고, 세로축은 LDH 활성값을 나타낸다. 790R제 디쉬에서 배양하였을 때의 배지에 대한 측정값을 동그라미로, 폴리스티렌제 디쉬에서 배양하였을 때의 배지에 대한 측정값을 세모로 나타낸다.
어느 디쉬를 사용한 경우도, EPO 농도가 높아짐에 따라, 세포의 누설 성분량이 증가하는데, 폴리스티렌제 디쉬에서의 배양과 비교하여, 790R제 디쉬에서의 배양에서는, 세포의 누설 성분량이 보다 적은 것을 알 수 있다.
산업상 이용가능성
본 발명의 방법에 의하면, 세포를 사용하여, 재조합 단백질을 생산하는 경우에 있어서, 보다 고밀도의 조건으로 세포를 배양할 수 있어, 목적하는 단백질이 고농도로 얻어진다. 이 때문에, 세포 배양에 있어서의 조작 횟수를 보다 적게 하거나, 배양 규모를 보다 작게 하거나 할 수 있어, 인건비나, 장치, 배지 등에 필요로 하는 비용을 억제할 수 있다.
또한, 목적하는 단백질이 고농도로 얻어지기 때문에, 변성되기 쉬운 단백질을 농축하는 수고가 경감되는 동시에, 그러한 단백질이 변성될 리스크를 경감할 수 있다.
또한, 세포 내로부터의 누설물이 적기 때문에, 단백질을 정제하는 경우에 있어서, 정제 비용이 경감되어, 경제적으로 유리한 것에 더하여, 보다 고순도의 단백질의 정제가 기대되므로, 발열 등의 부작용을 일으킬 가능성이 있는 성분의 혼입의 리스크가 경감된다.
의약품 개발 연구 등의 바이오테크놀러지 연구에 있어서는, 소량의 스케일로, 보다 고농도이며 고순도의 재조합 단백질을 얻는 것이 기대되므로, 본 발명의 방법은, 생리 활성 평가의 실험 등의 원활한 진척에 공헌할 수 있다. 그 결과, 의약품 등의 개발 비용이 억제되는 동시에, 제조 비용도 저감할 수 있다.

Claims (8)

  1. 접착형 세포와 지환 구조 함유 중합체 성형체를 접촉시킴으로써, 당해 접착형 세포를 액체 배지 중에 부유시킨 상태에서 증식시키는 것을 특징으로 하는, 접착형 세포의 배양 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 접착형 세포가, 외래 유전자를 발현하는 유전자 재조합된 것인 접착형 세포의 배양 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 접착형 세포가 CHO 세포인 접착형 세포의 배양 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 접착형 세포가, 외래 유전자를 발현할 수 있는 세포인 접착형 세포의 배양 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 부유 상태의 접착형 세포가, 세포괴를 형성한 것인 접착형 세포의 배양 방법.
  6. 액체 배지와, 당해 액체 배지 중에 부유하여 생존하고 있는 접착형 세포를 포함하는, 지환 구조 함유 중합체를 사용하여 이루어지는 배양 용기.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 접착형 세포가 세포괴를 형성한 것인 배양 용기.
  8. 생리 활성 단백질을 코드하는 외래 유전자를 발현할 수 있는 재조합 세포의 배양 중에, 당해 세포와 지환 구조 함유 중합체 성형체를 접촉시키는 것을 특징으로 하는, 당해 단백질의 생산 방법.
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