KR20170017687A

KR20170017687A - Ｉｃｓ를 구비하는 진단용 마이크로 디바이스 및 이를 이용한 회전식 진단 방법

Info

Publication number: KR20170017687A
Application number: KR1020160001638A
Authority: KR
Inventors: 서태석; 정재환; 박현규
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2015-08-07
Filing date: 2016-01-06
Publication date: 2017-02-15
Also published as: KR101763510B1

Abstract

본 발명에 의하면, 회전중심으로부터 이격되어서 위치하고 반경방향을 따라서 배치되는 적어도 하나의 단위 공정부(110); 및 상기 단위 공정부 각각으로 RT-LAMP 용액을 로딩하는 RT-LAMP 용액 로딩부(120)를 포함하며, 상기 다수의 단위 공정부 각각은 병원균을 검출하는 ICS(180)를 구비하는 검출부(111)와, 상기 검출부에 대해 원주방향 일측에 배치되어서 상기 ICS로 RT-LAMP 생성물을 공급하는 RT-LAMP 생성물 공급부(115)와, 상기 검출부를 사이에 두고 상기 RT-LAMP 생성물 공급부(115)의 반대측에 배치되어서 상기 ICS로 런닝 버퍼액을 공급하는 런닝액 공급부(118)를 구비하는 것을 특징으로 하는 진단용 마이크로 디바이스가 제공된다.

Description

ＩＣＳ를 구비하는 진단용 마이크로 디바이스 및 이를 이용한 회전식 진단 방법 {MICRODEVICE INTEGRATED WITH ICS AND DIAGNOSIS METHOD USING THE SAME}

본 발명은 유전자 분석을 통한 병원균 검출에 사용되는 마이크로 디바이스에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 RT-LAMP 반응을 자동화하여 저비용으로 높은 신뢰도로 인플루엔자 바이러스와 같은 병원균을 분석할 수 있는 ICS를 구비하는 진단용 마이크로 디바이스 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것이다.

유행성 인플루엔자 A 바이러스는 연간 약 이십오만명 내지 오십만명의 사망자를 전세계에서 발생하는 것으로 보고되고 있다. 돼지 유행성 인플루엔자 A 바이러스는 214개국 이상의 나라에서 발병하여 많은 수의 사망자를 발생시키고 있다.

특히 조류 독감(H5, H7, 및 H9 아형)은 인간에게 전염되어 높은 치사율을 보일 수 있다. 이에 따라, 인플루엔자에 대한 빠른 휴대 방식의 진단 도구의 개발이 필요한 상황이다.

RT-PCR(Reverse transcriptase polymerase chain reaction) 기반 유전자 분석은 인플루엔자 A 바이러스 타이핑에 대한 가장 높은 민감도를 갖는 정확한 진단 수단으로 여겨지고 있다. 하지만, RT-PCR 방법은 반복되는 열적 싸이클링 공정과 정확한 온도 조절수단이 필요하며, 이는 결국 비용과 시간의 증가로 이어진다. 이러한 한계를 극복하기 위하여, 다양한 등온 증폭 방법이 연구되고 있다. 이러한 연구 중 LAMP는 빠르고 간단하며 높은 민감도의 등온 증폭 방법으로 여겨지고 있다. LAMP는 DNA 폴리머라제와 여섯개의 LAMP 프라이머 조합을 이용하여 표적 DNA 주형을 섭씨 60 내지 65도로 1시간 이내로 연장시킨다.

바이러스 검출 목적으로 LAMP를 적용시키기 위하여, LAMP 공정 중 역전사 효소를 첨가하는 RT-LAMP(reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification)가 개발되었다. 다양한 병원균, 예를 들어 심각한 급성 호흡 증후군, 인플루엔자 A 바이러스 및 구제역 질환 병원균이 RT-LAMP 방식으로 분석되었다. RT-LAMP 생성물의 분석 방법으로, 형광 시그널의 탁도 분석, 비색법 등이 활용되는데, 특히 ICS에 기반한 비색 검출 방식은 저비용, 간단한 공정 등으로 널리 사용되고 있다.

하지만, RT-LAMP 반응은 종종 오염 문제를 발생시키기 때문에, 칩 상에서의 완벽히 자동화된 처리 공정이 요구된다. 따라서, RT-LAMP 반응을 자동화하여 저비용으로 높은 신뢰도로 인플루엔자 바이러스와 같은 병원균을 분석하는 장치 및 방법이 요구된다.

따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 RT-LAMP 반응을 자동화하여 저비용으로 높은 신뢰도로 인플루엔자 바이러스와 같은 병원균을 분석하는 진단 장치 및 이를 이용한 진단 방법을 제공하는 것이다.

상기한 본 발명의 해결하고자 하는 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면에 따르면,

회전중심으로부터 이격되어서 위치하고 반경방향을 따라서 배치되는 적어도 하나의 단위 공정부(110); 및 상기 단위 공정부 각각으로 RT-LAMP 용액을 로딩하는 RT-LAMP 용액 로딩부(120)를 포함하며, 상기 다수의 단위 공정부 각각은 병원균을 검출하는 ICS(180)를 구비하는 검출부(111)와, 상기 검출부에 대해 원주방향 일측에 배치되어서 상기 ICS로 RT-LAMP 생성물을 공급하는 RT-LAMP 생성물 공급부(115)와, 상기 검출부를 사이에 두고 상기 RT-LAMP 생성물 공급부(115)의 반대측에 배치되어서 상기 ICS로 런닝 버퍼액을 공급하는 런닝액 공급부(118)를 구비하는 것을 특징으로 하는 진단용 마이크로 디바이스가 제공된다.

상기 RT-LAMP 용액 로딩부는, 회전중심을 중심으로 원주방향을 따라서 지그재그 형태로 연장되어서 형성되어서 모세관을 형성하는 RT-LAMP 용액 분배 채널(121)과, 상기 RT-LAMP 용액 분배 채널로부터 반경방향 바깥으로 연장되어서 그 끝단이 상기 RT-LAMP 생성물 공급부와 연결되는 다수의 RT-LAMP 용액 공급 채널(125)을 구비할 수 있다.

상기 RT-LAMP 용액 공급 채널(125)은 상기 RT-LAMP 용액 분배 채널에서 반경방향 바깥쪽으로 돌출되는 외측 돌출부(122)로부터 반경방향 바깥쪽으로 연장될 수 있다.

상기 RT-LAMP 용액 로딩부는, 상기 RT-LAMP 용액 분배 채널의 반경방향 안쪽에 위치하고 상기 RT-LAMP 용액 분배 채널과 연결되는 고리형상의 공기 챔버(124)를 더 구비할 수 있다.

상기 공기 챔버는 상기 RT-LAMP 용액 분배 채널에서 반경방향 안쪽으로 돌출되는 내측 돌출부(123)와 연결될 수 있다.

상기 RT-LAMP 용액 공급 채널은 짝수 개이며, 상기 다수의 RT-LAMP 용액 공급 채널 중 반경방향을 따라서 인접한 두 RT-LAMP 용액 공급 채널은 동일한 RT-LAMP 생성물 공급부와 연결될 수 있다.

상기 RT-LAMP 생성물 공급부는 RT-LAMP 공정에 필요한 프라이머가 수용되고 상기 RT-LAMP 용액이 공급되는 RT-LAMP 챔버(115a)와, 상기 ICS로 RT-LAMP 공정에 의한 RT-LAMP 생성물을 전달하는 RT-LAMP 공급 채널(117)을 구비할 수 있다.

상기 RT-LAMP 생성물 공급부는 상기 RT-LAMP 챔버와 상기 RT-LAMP 공급 채널(117)을 연결하는 RT-LAMP 생성물 흐름 제어 채널(116)을 더 구비하며, 상기 RT-LAMP 생성물 흐름 제어 채널은 상기 RT-LAMP 챔버에서 생성된 RT-LAMP 생성물의 흐름을 반경방향 안쪽에서 바깥쪽으로 전환시키는 전환 곡선부(116a)를 구비할 수 있다.

상기 RT-LAMP 생성물 공급부는 상기 RT-LAMP 생성물 흐름 제어 채널의 하류 끝단에 위치하는 모세관 밸브(116b)를 더 구비할 수 있다.

상기 런닝 버퍼액 공급부는 런닝 버퍼액이 저장되는 런닝 버퍼액 챔버(118a)와, 상기 런닝 버퍼액 챔버에 저장된 런닝 버퍼액을 상기 ICS로 전달하는 런닝 버퍼액 도입 채널(119)을 구비하며, 상기 런닝 버퍼액 도입 채널은 런닝 버퍼액의 흐름을 반경방향 안쪽에서 바깥쪽으로 전환시키는 제1 내측 전환 곡선부(119c)와, 상기 제1 내측 전환 곡선부의 하류에 위치하며 런닝 버퍼액의 흐름을 반경방향 바깥쪽에서 안쪽으로 전환시키는 외측 전환 곡선부(119d)와, 상기 외측 전환 곡선부의 하류에 위치하며 런닝 버퍼액의 흐름을 반경방향 안쪽에서 바깥쪽으로 전환시키는 제2 내측 전환 곡선부(119e)를 구비하는 런닝 버퍼액 흐름 제어 채널(119a)를 구비할 수 있다.

상기 런닝 버퍼액 공급부는 상기 런닝 버퍼액 챔버의 반경방향 바깥쪽에 위치하는 모세관 구조의 밸브부(118c)를 더 구비할 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 측면에 따르면,

RT-LAMP 용액 로딩부(120)가 형성되는 제1 패턴 형성층(140); 상기 제1 패턴 형성층과 접합되고 RT-LAMP 공정에 필요한 프라이머가 수용되고 상기 RT-LAMP 용액 로딩부로부터 RT-LAMP 용액을 전달받는 RT-LAMP 챔버(115a)와, 런닝 버퍼액이 저장되는 런닝 버퍼액 챔버(118a)가 형성되는 제2 패턴 형성층(150); 및 상기 RT-LAMP 챔버와 연결되어서 RT-LAMP 생성물을 공급받고 및 상기 런닝 버퍼액 챔버로부터 런닝 버퍼액을 공급받는 ICS(180); 및 상기 ICS가 수용되는 ICS 수용홈(171)이 형성되고 상기 제1 패턴 형성층의 반대편에서 상기 제2 패턴 형성층과 접합되는 제3 패턴 형성층을 포함하는 진단용 마이크로 디바이스가 제공된다.

상기 RT-LAMP 용액 로딩부는, 상기 제2 패턴 형성층과 대향하는 면에 회전중심을 중심으로 원주방향을 따라서 지그재그 형태로 연장되어서 형성되어서 모세관을 형성하는 RT-LAMP 용액 분배 채널(121)과, 상기 제2 패턴 형성층과 대향하는 면에 상기 RT-LAMP 용액 분배 채널로부터 반경방향 바깥으로 연장되는 RT-LAMP 용액 공급 채널(125)과, 상기 제2 패턴 형성층에 형성되어서 상기 RT-LAMP 용액 공급 채널과 상기 RT-LAMP 챔버를 연결하는 연결 통공(125a)을 구비할 수 있다.

상기 RT-LAMP 용액 로딩부는 상기 제2 패턴 형성층과 대향하는 면에 형성된 고리 형상의 공기 챔버(124)를 더 구비하며, 상기 공기 챔버(124)는 상기 RT-LAMP 용액 분배 채널보다 반경방향 안쪽에 위치하며, 상기 RT-LAMP 용액 분배 채널의 반경방향 안쪽으로 돌출되는 내측 돌출부(123)와 연결될 수 있다.

상기 마이크로 디바이스는 RT-LAMP 생성물을 상기 ICS로 공급하는 RT-LAMP 생성물 공급 채널(117)을 더 포함하며, 상기 RT-LAMP 생성물 공급 채널은, 상기 제2 패턴 형성층에서 상기 제3 패턴 형성층과 대항하는 면에 형성되는 제1 채널부(152)와, 상기 제1 패턴 형성층에서 상기 제2 패턴 형성층과 대향하는 면에 형성되는 제2 채널부(141)와, 상기 제2 패턴 형성층에 형성되는 관통구멍으로서 상기 제1 채널부와 상기 제2 채널부를 연결하는 연결 통공(153)과, 상기 제2 패턴 형성층에 형성되는 관통구멍으로서 상기 ICS로 RT-LAMP 생성물을 배출하는 배출 통공(153)을 구비할 수 있다.

상기 마이크로 디바이스는 런닝 버퍼액을 상기 ICS로 공급하는 런닝 버퍼액 공급 채널(119b)를 더 포함하며, 상기 런닝 버퍼액 공급 채널은, 상기 제2 패턴 형성층에서 상기 제3 패턴 형성층과 대향하는 면에 형성되는 제1 채널부(157)와, 상기 제1 패턴 형성층에서 상기 제2 패턴 형성층과 대향하는 면에 형성되는 제2 채널부(143)와, 상기 제2 패턴 형성층에 형성되는 관통구멍으로서 상기 제1 채널부와 상기 제2 채널부를 연결하는 연결 통공(158)과, 상기 제2 패턴 형성층에 형성되는 관통구멍으로서 상기 ICS로 런닝 버퍼액을 배출하는 배출 통공(159)을 구비할 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면,

회전중심으로부터 이격되어서 위치하고 반경방향을 따라서 차례대로 배치되는 다수의 단위 공정부(110); 및 상기 단위 공정부 각각으로 RT-LAMP 용액을 균일하게 로딩하는 RT-LAMP 용액 로딩부(120)를 포함하며, 상기 다수의 단위 공정부 각각은 병원균을 검출하는 ICS(180)를 구비하는 검출부(111)와, 상기 검출부에 대해 원주방향 일측에 배치되어서 상기 ICS로 RT-LAMP 생성물을 공급하는 RT-LAMP 생성물 공급부(115)와, 상기 검출부를 사이에 두고 상기 RT-LAMP 생성물 공급부(115)의 반대측에 배치되어서 상기 ICS로 런닝 버퍼액을 공급하는 런닝액 공급부(118)를 구비하며, 상기 RT-LAMP 생성물 공급부는 상기 RT-LAMP 챔버와 상기 RT-LAMP 공급 채널(117)을 연결하는 RT-LAMP 생성물 흐름 제어 채널(116)을 더 구비하며, 상기 RT-LAMP 생성물 흐름 제어 채널은 상기 RT-LAMP 챔버에서 생성된 RT-LAMP 생성물의 흐름을 반경방향 안쪽에서 바깥쪽으로 전환시키는 전환 곡선부(116a)를 구비하며, 상기 런닝 버퍼액 공급부는, 런닝 버퍼액이 저장되는 런닝 버퍼액 챔버(118a)와, 런닝 버퍼액의 흐름을 반경방향 안쪽에서 바깥쪽으로 전환시키는 제1 내측 전환 곡선부(119c)와, 상기 제1 내측 전환 곡선부의 하류에 위치하며 런닝 버퍼액의 흐름을 반경방향 바깥쪽에서 안쪽으로 전환시키는 외측 전환 곡선부(119d)와, 상기 외측 전환 곡선부의 하류에 위치하며 런닝 버퍼액의 흐름을 반경방향 안쪽에서 바깥쪽으로 전환시키는 제2 내측 전환 곡선부(119e)를 구비하는 런닝 버퍼액 흐름 제어 채널(119a)를 구비하는 진단용 마이크로 디바이스를 이용한 진단 방법으로서, 상기 RT-LAMP 용액 로딩부에 RT-LAMP 용액을 로딩하는 단계; 상기 진단용 마이크로 디바이스를 회전시켜서 상기 RT-LAMP 용액을 상기 RT-LAMP 챔버로 공급하는 단계; 상기 진단용 마이크로 디바이스의 회전을 정지시켜서 상기 RT-LAMP 용액의 상기 외측 전환 곡선부(119d)의 통과와, 상기 런닝 버퍼액의 상기 제1 내측 전환 곡선부의 통과를 허용하는 단계; 상기 RT-LAMP 챔버에서의 RT-LAMP 공정을 수행하여 RT-LAMP 생성물을 생성하는 단계; 상기 진단용 마이크로 디바이스를 회전시켜서 RT-LAMP 생성물을 상기 ICS로 공급하는 단계; 상기 진단용 마이크로 디바이스의 회전을 정지시켜서 상기 런닝 버퍼액의 상기 제2 내측 전환곡선부의 통과를 허용하는 단계; 상기 진단용 마이크로 디바이스를 회전시켜서 상기 런닝 버퍼액을 상기 ICS로 공급하는 단계를 포함하는 마이크로 디바이스를 이용한 진단 방법이 제공된다.

본 발명에 의하면, 상기한 본 발명의 해결하고자 하는 과제를 모두 달성할 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 회전형 다단(multiplex) RT-LAMP-ICS 마이크로 디바이스를 제공하여, 인플루엔자 A 바이러스와 같은 표적 바이러스를 검출한다. RT-LAMP 용액 및 러닝 버퍼액의 로딩과 분배가 칩 상에서 RPM 제어와 마이크로채널의 설계만으로 정확하게 수행될 수 있다. 또한 등온반응에 따라 증폭된 H1 및 M 유전자는 칩 내부에서 바로 ICS에서 분석될 수 있으며, 그 결과 인플루엔자 A H1N1 아형을 식별할 수 있다. 더 나아가 10 카피 수준의 낮은 농도에서도 바이러스 검출이 가능하며, ICS와 RT-LAMP를 하나의 디바이스에 결합시킴으로써, 높은 신뢰도를 가지면서 휴대 가능한 바이러스 검출 장치가 구현 가능하다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 진단용 마이크로 디바이스를 도시한 사시도이다.
도 2a는 도 1에 도시된 진단용 마이크로 디바이스를 도시한 평면도이다.
도 2b는 도 2a에서 하나의 단위 공정부와 RT-LAMP 용액 로딩부를 확대하여 도시한 도면이다.
도 3은 도 1에 도시된 진단용 마이크로 디바이스의 각 층을 분리하여 도시한 사시도이다.
도 4는 도 3에 도시된 커버층의 평면도이다.
도 5는 도 3에 도시된 제1 패턴 형성층의 평면도이다.
도 6은 도 3에 도시된 제2 패턴 형성층의 평면도이다.
도 7은 도 3에 도시된 제3 패턴 형성층의 평면도이다.
도 8은 도 2b에서 A-A'선에 대한 단면도이다.
도 9는 도 2b에서 B-B'선에 대한 단면도이다.
도 10은 도 2b에서 C-C'선에 대한 단면도이다.
도 11은 도 2b에서 D-D'선에 대한 단면도이다.
도 12a 내지 도 12h는 도 1에 도시된 마이크로 디바이스에서 진단이 수행되는 과정을 도시한 도면이다.
도 13은 본 발명의 진단 방법에 따른 유전자 발현 검출 결과이다.
도 14는 본 발명의 진단 방법에 의한 시간에 따른 유전자 발현 여부에 대한 ICS 검출 결과이다.
도 15는 본 발명의 진단 방법에 따른 LOD 검출 결과이다.
도 16은 본 발명의 진단 방법에 따른 바이러스 아형에 대한 특이성 실험 결과이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 직접화된 원심형 마이크로 디바이스를 제공하여, 다단(multiplex) RT-LAMP 반응을 수행하며, ICS 기반 산물(amplicon) 검출을 인플루엔자 A 바이러스 병원형과 아형에 대하여 연속적으로 수행하였다.

본 발명의 일 실시예에 따른 RT-LAMP-ICS 직접 칩은 칩상에 3개로 패터닝되어, 다단 유전자 발현이 가능하다. 인플루엔자 A H1N1 바이러스를 모델로 하여, 본 발명의 일 실시예에서는, 헤마그그루티닌(hemagglutinin (HA))과, 보존 매트릭스(conserved matrix (M)) 유전자 발현을 본 발명에 따른 마이크로 디바이스로 1시간 이내로 유도하여, 인플루엔자 A H1N1 바이러스를 아형 분석(subtype)할 수 있었다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 진단용 마이크로 디바이스를 도시한 사시도이고, 도 2a는 도 1에 도시된 진단용 마이크로 디바이스를 도시한 평면도이며, 도 2b는 도 2a에서 일부를 확대하여 도시한 도면이다. 도 1 내지 도 2b를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 진단용 마이크로 디바이스(100)는 대체로 디스크 형상으로서, 그 중심에는 회전중심(O)이 마련된다. 진단용 마이크로 디바이스(100)는 회전중심(O)으로부터 반경방향으로 이격되어서 위치하고 원주방향을 따라서 차례대로 배치되는 다수의 단위 공정부(110)와, 다수의 단위 공정부(110) 각각으로 RT-LAMP 용액을 균일하게 로딩하는 RT-LAMP 용액 로딩부(120)를 포함한다. 본 실시예에서는 단위 공정부(110)가 3개인 것으로 설명하는데, 본 발명은 단위 공정부(110)의 수를 3개로 제한하지 않는다. 본 발명은 진단용 마이크로 디바이스가 2개 이하의 단위 공정부를 구비하거나 4개 이상의 단위 공정부를 구비하는 경우도 포함한다. 또한, 본 실시예에서는 진단용 마이크로 디바이스(100)가 디스크 형상인 것으로 설명하지만, 본 발명은 진단용 마이크로 디바이스(100)를 디스크 형상으로 제한하지 않는다.

진단용 마이크로 디바이스(100)는 다층 구조로서, 도 3에는 진단용 마이크로 디바이스(100)의 각 층이 분리하여 도시되어 있다. 도 3을 참조하면, 진단용 마이크로 디바이스(100)는 커버층(130)과, 커버층(130)의 아래에 위치하는 제1 패턴 형성층(140)과, 제1 패턴 형성층(140)의 아래에 위치하는 제2 패턴 형성층(150)과, 제1 패턴 형성층(140)과 제2 패턴 형성층(150)을 결합시키는 제1 접합 필름층(160)과, 제2 패턴 형성층(150)의 아래에 위치하는 제3 패턴 형성층(170)과, 제3 패턴 형성층(170)에 장착되는 다수의 자가면역진단 스트립(ICS : Immunochromatographic strip, 이하 'ICS'라 함)(180)과, 제2 패턴 형성층(150)과 제3 패턴 형성층(170)을 결합시키는 제2 접합 필름층(190)을 구비한다. 본 실시예에서는 커버층(130), 제1 패턴 형성층(140), 제2 패턴 형성층(150) 및 제3 패턴 형성층(170)이 폴리카보네이트(PC)와 같은 합성수지 재질인 것으로 설명하는데, 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 본 실시예에서 커버층(130)은 2mm 두께이고, 3개의 패턴 형성층(140) 각각은 1mm 두께이며, 두 접합 필름층(160, 190) 각각은 50㎛ 두께인 것으로 설명한다. 커버층(130)을 제외하고 나머지 층은 원형 마커를 이용하여 정밀하게 조립되며, 열압착에 의해 강하게 접합된다.

도 4는 도 3에 도시된 커버층의 평면도이고, 도 5는 도 3에 도시된 제1 패턴 형성층의 평면도이며, 도 6은 도 3에 도시된 제2 패턴 형성층의 평면도이고, 도 7은 도 3에 도시된 제3 패턴 형성층의 평면도이다. 도 8은 도 2a에서 A-A'선에 대한 단면도이고, 도 9는 도 2a에서 B-B'선에 대한 단면도이며, 도 10은 도 2a에서 C-C'선에 대한 단면도이고, 도 11은 도 2a에서 D-D'선에 대한 단면도이다. 이하, 도 1 내지 도 11을 참조하여, 진단용 마이크로 디바이스(100)의 각 구성을 구체적으로 설명한다.

도 2a와 도 2b를 참조하면, 단위 공정부(110)는 검출부(111)와, 검출부(111)에 대해 원주방향 일측에 배치되는 RT-LAMP 생성물 공급부(115)와, 검출부(111)를 사이에 두고 RT-LAMP 생성물 공급부(115)의 반대측에 위치하는 런닝 버퍼액 공급부(118)를 구비한다.

검출부(111)는 제3 패턴 형성층(170)에 형성된 ICS 수용홈(171)에 수용되어서 병원균을 검출하는 ICS(180)를 구비한다. ICS 수용홈(171)은 제3 패턴 형성층(170)에서 제2 패턴 형성층(150)과 대향하는 면에 형성된다.

ICS(180)는 전체적으로 얇은 막대형상으로서, 회전 중심(O)에 대해 대체로 반경방향을 따라서 연장되도록 ICS 수용홈(171) 내에 수용되며, 원주방향을 따라서는 RT-LAMP 생성물 공급부(115)와 런닝 버퍼액 공급부(118)의 사이에 위치한다. ICS(180)는 지지체(181)와, 버퍼액 로딩 패드(182)와, 흡수 패드(183)와, 검출 패드(184)와, 컨쥬게이트(conjugate) 패드(185)를 구비한다.

지지체(181)는 반경방향을 따라서 길게 연장된 바아(bar) 형태로서, 지지체(181)의 상면에 버퍼액 로딩 패드(182), 흡수 패드(183) 및 검출 패드(184)가 접착된다. ICS(180)는 ICS 수용홈(171)에 수용되었을 때, 지지체(181)는 ICS 수용홈(171)의 바닥과 접하고, 버퍼액 로딩 패드(182), 흡수 패드(183) 및 검출 패드(184)는 제2 패턴 형성층(150) 쪽을 향하게 된다.

버퍼액 로딩 패드(182)는 지지체(181)의 길이방향 양단 중 반경방향 바깥쪽 단부에 위치한다. 버퍼액 로딩 패드(182)는 지지체(181)의 상면에 접착된다. 버퍼액 로딩 패드(182)는 런닝 버퍼액 공급부(118)로부터 공급되는 런닝 버퍼액을 흡수한다. 버퍼액 로딩 패드(182)에 흡수된 런닝 버퍼액은 반경방향 안쪽으로 균일하게 유동한다.

흡수 패드(183)는 지지체(181)의 길이방향 양단 중 반경방향 안쪽 단부에 버퍼액 로딩 패드(182)와 이격되어서 위치한다. 흡수 패드(183)는 지지체(181)의 상면에 접착된다. 흡수 패드(183)는 액체를 흡수하여 버퍼액 로딩 패드(182)로부터 흡수 패드(183) 쪽으로 액체의 유동이 원활히 이루어지도록 한다.

검출 패드(184)는 버퍼액 로딩 패드(182)와 흡수 패드(183) 사이에서 연장된다. 검출 패드(184)는 지지체(181)의 상면에 접착되고, 검출 패드(184)의 양단은 버퍼액 로딩 패드(182)와 흡수 패드(183)에 각각 접촉한다. 도시되지는 않았으나, 검출 패드(184)에는 다수의 테스트 라인(test line)과, 하나의 제어 라인(control line)이 마련된다. 테스트 라인의 발색 상태에 따라 검출이 확인되며, 제어 라인의 발색에 의해 시료의 통과 여부가 확인된다.

컨쥬게이트 패드(185)는 검출 패드(184)의 길이방향 양단 중 버퍼액 로딩 패드(182)에 접하여 위치한다. 컨쥬게이트 패드(185)는 검출 패드(184)의 상면에 접착되고, 컨쥬게이트 패드(185)에는 진단 대상인 RT-LAMP 생성물이 RT-LAMP 생성물 공급부(115)로부터 공급된다. 컨쥬게이트 패드(185)는 RT-LAMP 생성물에 함유되어 있는 검출 대상 물질과 특이적으로 결합하는 유동성 컨쥬게이트를 포함한다.

RT-LAMP 생성물 공급부(115)는 RT-LAMP 챔버(115a)와, RT-LAMP 생성물 흐름 제어 채널(116)과, RT-LAMP 생성물 공급 채널(117)를 구비한다.

RT-LAMP 챔버(115a)는 제2 패턴 형성층(150)에서 제3 패턴 형성층(170)과 대향하는 면에 형성된다. RT-LAMP 챔버(115a)에는 합텐으로 표지된 냉동 건조된 프라이머 조합(A)이 채워져 있다. 제2 패턴 형성층(150)에서 제3 패턴 형성층(170)과 대향하는 면에는 RT-LAMP 챔버(115a)와 이어지면서 RT-LAMP 챔버(115a)보다 반경방향 안쪽에 위치하는 RT-LAMP 용액 유입 공간(151)이 마련된다. RT-LAMP 챔버(115a)의 주변에는 열차폐 구조(101, 102)가 형성된다. 열차폐 구조(101, 102)는 관통 슬롯의 형태로서, 열차폐 구조(101, 102)에 의해 RT-LAMP 반응시 ICS(180)로의 열 확산이 방지된다.

RT-LAMP 생성물 흐름 제어 채널(116)은 제2 패턴 형성층(150)에서 제3 패턴 형성층(170)과 대향하는 면에 RT-LAMP 챔버(115a)로부터 연장되어서 형성된다. RT-LAMP 생성물 흐름 제어 채널(116)은 RT-LAMP 챔버(115a)로부터 대체로 반경방향 안쪽으로 연장된 후 부드러운 곡선을 이루며 방향이 반경방향 바깥쪽으로 전환되어서 연장되고 끝단이 RT-LAMP 생성물 공급 채널(117)과 연결된다. 그에 따라, RT-LAMP 생성물 흐름 제어 채널(116)은 RT-LAMP 생성물의 흐름을 반경방향 안쪽에서 바깥쪽으로 전환시키는 전환 곡선부(116a)를 구비한다. RT-LAMP 생성물 흐름 제어 채널(116)의 하류 끝단에는 원형 형태의 모세관 밸브(예를 들어 1mm 깊이)(116b)가 패터닝되어서, RT-LAMP 반응 중 용액이 ICS(180)로 누액되는 것을 방지한다.

RT-LAMP 생성물 공급 채널(117)은 RT-RAMP 생성물 흐름 제어 채널(116)의 끝단으로부터 대체로 반경방향 바깥쪽으로 비스듬하게 연장되어서 RT-LAMP 생성물 공급 채널(117)로부터 배출되는 RT-LAMP 생성물을 ICS(180)의 컨쥬게이트 패드(185)로 안내한다. RT-LAMP 생성물 공급 채널(117)은 제2 패턴 형성층(150)에 형성된 제1 채널부(152)와, 제1 패턴 형성층(140)에 형성된 제2 채널부(141)와, 제2 패턴 형성층(150)에 형성된 연결 통공(153)과, 제2 패턴 형성층(150)에 형성된 배출 통공(155)을 구비한다.

제1 채널부(152)는 제2 패턴 형성층(150)에서 제3 패턴 형성층(170)과 대향하는 면에 형성된다. 제1 채널부(152)는 RT-RAMP 생성물 흐름 제어 채널(116)의 끝단으로부터 대체로 반경방향 바깥쪽으로 ICS(180)를 향해 비스듬하게 연장된다.

제2 채널부(141)는 제1 패턴 형성층(140)에서 제2 패턴 형성층(150)과 대향하는 면에 형성된다. 제2 채널부(141)는 제1 채널부(152)의 반경방향 끝단으로부터 대체로 반경방향 바깥쪽으로 연장되어서 그 끝단이 ICS(180)의 컨쥬게이트 패드(185)의 상부에 위치한다.

연결 통공(153)은 제2 패턴 형성층(150)에 형성되는 관통 구멍으로서, 제1 채널부(152)와 제2 채널부(141)를 연결한다.

배출 통공(155)은 제2 패턴 형성층(150)에 형성되는 관통 구멍으로서, 제2 채널부(141)의 반경방향 바깥 끝단과 ICS(180)의 컨쥬게이트 패드(185)의 상부를 연결한다. 배출 통공(155)을 통해 배출되는 RT-LAMP 생성물이 ICS(180)의 컨쥬게이트 패드(185)로 공급된다.

런닝 버퍼액 공급부(118)는 검출부(111)를 사이에 두고 RT-LAM 생성물 공급부(115)의 건너편에 위치한다. 런닝 버퍼액 공급부(118)는 런닝 버퍼액을 ICS(180)의 버퍼액 로딩 패드(182)로 공급한다. 런닝 버퍼액 공급부(118)는 런닝 버퍼액 챔버(118a)와, 런닝 버퍼액 수용부(118b)와, 런닝 버퍼액 도입 채널(119)을 구비한다.

런닝 버퍼액 챔버(118a)는 ICS(180)를 사이에 두고 RT-LAMP 생성물 공급부(115)의 건너편에 위치한다. 런닝 버퍼액 챔버(118a)에는 런닝 버퍼액이 저장된다. 런닝 버퍼액으로 구성성분이 25mM 나트륨 카보네이트 버퍼액(pH 9.6), 1% casein, 0.4 mM EDTA, 0.2% alpha-cyclodextrin, 0.2% Triton-100, 0.4 M UREA, 0.1% sodium azide인 것을 사용하는데, 이는 하나의 예로서 본 발명은 이에 제한되는 것은 아니다. 런닝 버퍼액은 ICS(180)에서 진단 대상 유전자 물질인 RT-LAMP 생성물의 유동을 돕는다. 런닝 버퍼액 챔버(118a)는 제2 패턴 형성층(150)에서 제3 패턴 형성층(170)과 대향하는 면에 형성된다. 런닝 버퍼액 챔버(118a)의 용량은 50μL이다.

런닝 버퍼액 수용부(118b)는 런닝 버퍼액 챔버(118a)의 반경방향 바깥쪽에 인접하여 위치하며, 런닝 버퍼액 챔버(118a)는 제2 패턴 형성층(150)에서 제3 패턴 형성층(170)과 대향하는 면에 형성된다. 런닝 버퍼액 수용부(118b)와 런닝 버퍼액 챔버(190)의 사이에는 밸브부(118c)가 구비된다. 밸브부(118c)는 높이 차에 의해 형성된 모세관(깊이 50㎛) 형태의 수동 밸브로서, 런닝 버퍼액 챔버(118a)에 저장된 런닝 버퍼액이 쉽게 런닝 버퍼액 수용부(118b)로 이동하지 못하도록 한다. 진단용 마이크로 디바이스(100)가 회전중심(O)을 중심으로 회전할 때 발생하는 원심력에 의해 런닝 버퍼액 챔버(118a)에 저장된 런닝 버퍼액이 밸브부(118c)를 넘은 후 런닝 버퍼액 수용부(118b)로 유입된다.

런닝 버퍼액 도입 채널(119)는 런닝 버퍼액 수용부(118b)의 반경방향 바깥쪽 끝단과 ICS(180)의 버퍼액 로딩 패드(182)를 연결한다. 런닝 버퍼액 도입 채널(119)은 런닝 버퍼액 흐름 제어 채널(119a)과, 런닝 버퍼액 공급 채널(119b)을 구비한다.

런닝 버퍼액 흐름 제어 채널(119a)은 제2 패턴 형성층(150)에서 제3 패턴 형성층(170)을 대향하는 면에 런닝 버퍼액 수용부(118b)의 반경방향 바깥쪽 끝부분으로부터 연장되어서 형성된다. 런닝 버퍼액 흐름 제어 채널(119a)는 런닝 버퍼액 수용부(118b)의 반경방향 끝부분으로부터 부드러운 곡선을 이루며 방향이 반경방향 안쪽으로 전환되어서 연장되고 이어서 부드러운 곡선을 이루며 방향이 반경방향 바깥쪽으로 전환되어서 연장되며, 다시 부드러운 곡선을 이루며 방향이 반경방향 안쪽으로 전환되어서 연장되고, 이어서 부드러운 곡선을 이루며 방향이 반경방향 바깥쪽으로 전환되어서 연장된다. 그에 따라, 런닝 버퍼액 흐름 제어 채널(119a)은 런닝 버퍼액의 흐름 방향을 따라 상류측으로부터 하류측 방향으로 차례대로 배치되는 제1 내측 전환 곡선부(119c)와, 외측 전환 곡선부(119d)와, 제2 내측 전환 곡선부(119e)를 구비한다. 제1 내측 전환 곡선부(119c)는 런닝 버퍼액의 흐름을 반경방향 안쪽에서 바깥쪽으로 전환시켜서 런닝 버퍼액을 외측 전환 곡선부(119d)로 유입시킨다. 외측 전환 곡선부(119d)는 런닝 버퍼액의 흐름을 반경방향 바깥쪽에서 안쪽으로 전환시켜서 런닝 버퍼액을 제2 내측 전환 곡선부(119e)로 유입시킨다. 제2 내측 전환 곡선부(119e)는 런닝 버퍼액의 흐름을 반경방향 안쪽에서 바깥쪽으로 전환시켜서 런닝 버퍼액을 런닝 버퍼액 공급 채널(119b)로 유입시킨다. 런닝 버퍼액 흐름 제어 채널(119a)은 Vistex 용액으로 처리되어 친수화된다.

런닝 버퍼액 공급 채널(119b)은 런닝 버퍼액 흐름 제어 채널(119a)의 끝단으로부터 대체로 반경방향 바깥쪽으로 비스듬하게 연장되어서 런닝 버퍼액 흐름 제어 채널(119a)로부터 배출되는 런닝 버퍼액을 ICS(180)의 버퍼액 로딩 패드(182)로 안내한다. 런닝 버퍼액 공급 채널(119b)은 제2 패턴 형성층(150)에 형성된 제1 채널부(157)와, 제1 패턴 형성층(140)에 형성된 제2 채널부(143)와, 제2 패턴 형성층(150)에 형성된 연결 통공(158)과, 제2 패턴 형성층(150)에 형성된 배출 통공(159)을 구비한다.

제1 채널부(157)는 제2 패턴 형성층(150)에서 제3 패턴 형성층(170)과 대향하는 면에 형성된다. 제1 채널부(157)는 런닝 버퍼액 흐름 제어 채널(119a)의 끝단으로부터 대체로 반경방향 바깥쪽으로 ICS(180)를 향해 비스듬하게 연장된다.

제2 채널부(143)는 제1 패턴 형성층(140)에서 제2 패턴 형성층(150)과 대향하는 면에 형성된다. 제2 채널부(143)는 제1 채널부(157)의 반경방향 끝단으로부터 대체로 반경방향 바깥쪽으로 연장되어서 그 끝단이 ICS(180)의 버퍼액 로딩 패드(182)의 상부에 위치한다.

연결 통공(158)은 제2 패턴 형성층(150)에 형성되는 관통 구멍으로서, 제1 채널부(157)와 제2 채널부(143)를 연결한다.

배출 통공(159)은 제2 패턴 형성층(150)에 형성되는 관통 구멍으로서, 제2 채널부(143)의 반경방향 바깥 끝단과 ICS(180)의 버퍼액 로딩 패드(182)의 상부를 연결한다. 배출 통공(159)을 통해 배출되는 런닝 버퍼액이 ICS(180)의 버퍼액 로딩 패드(182)로 공급된다.

RT-LAMP 용액 로딩부(120)는 다수의 단위 공정부(110) 각각으로 RT-LAMP 용액을 균일하게 로딩한다. 본 실시예에서는 RT-LAMP 용액으로 RT-LAMP 칵테일(23μL 부피)을 2μL 용량의 바이러스성 RNA 주형 용액과 혼합한 것이다. RT-LAMP 용액 로딩부(120)는 RT-LAMP 용액 분배 채널(121)과, 공기 챔버(124)와, 다수의 RT-LAMP 용액 공급 채널(125)과, 시료 주입구(126)와, 주입구 연결 채널(127)과, 시료 배출구(128)와, 배출구 연결 채널(129)을 구비한다.

RT-LAMP 용액 분배 채널(121)은 회전중심(O)을 중심으로 원주방향을 따라서 지그재그 형태로 연장되어서 형성된다. RT-LAMP 분배 채널(121)은 제1 패턴 형성층(140)에서 제2 패턴 형성층(150)과 대향하는 면에 예를 들어 580㎛의 폭과 150㎛의 깊이로 형성되어서 모세관을 이룬다. RT-LAMP 용액 분배 채널(121)은 RT-LAMP 용액 유입 공간(151)보다 반경방향 안쪽에 위치한다. 본 실시예에서는 RT-LAMP 용액 분배 채널(121)에서 반경방향 바깥쪽으로 뾰족하게 돌출되는 외측 돌출부(122)가 6개인 것으로 설명하는데, 이는 RT-LAMP 챔버(115a)의 개수의 2배인 것으로, 돌출부(122)의 개수는 RT-LAMP 챔버(115a)의 개수에 따라 달라질 수 있다. RT-LAMP 용액 분배 채널(121)에는 RT-LAMP 용액이 모세관 현상에 의해 자동으로 채워지게 되며, RT-LAMP 용액 분배 채널(121)에 채워진 용액은 안정적으로 저장되어서 이웃하는 채널로 새어나오지 않는데, 이는 채널의 깊이 차이에 의한 것이다.

공기 챔버(124)는 회전중심(O)을 중심으로 하는 고리형상으로서, 제1 패턴 형성층(140)에서 제2 패턴 형성층(150)과 대향하는 면에 예를 들어 500㎛의 깊이로 형성된다. 공기 챔버(124)는 RT-LAMP 용액 분배 채널(121)보다 반경방향 안쪽에 위치하며, RT-LAMP 용액 분배 채널(121)의 반경방향 안쪽으로 뾰족하게 돌출되는 내측 돌출부(123)와 연결되어서, RT-LAMP 용액 분배 채널(121)로 공기압을 인가한다.

다수의 RT-LAMP 용액 공급 채널(125)은 제1 패턴 형성층(140)에서 제2 패턴 형성층(150)과 대향하는 면에 형성된다. 각 RT-LAMP 용액 공급 채널(125)은 RT-LAMP 용액 분배 채널(121)의 외측 돌출부(122)로부터 반경방향 바깥쪽으로 연장되며, 인접하는 두 RT-LAMP 용액 공급 채널(125)의 끝단은 RT-LAMP 용액 유입 공간(151)의 상부에서 연결된다. 연결된 두 RT-LAMP 용액 공급 채널(125)의 끝단은 제2 패턴 형성층(150)에 형성된 연결 통공(125a)에 의해 RT-LAMP 용액 유입 공간(151)과 연결된다.

시료 주입구(126)는 RT-LAMP 용액을 주입하기 위한 것으로서, 제1 패턴 형성층(140)에 관통구 형태로 형성된다.

주입구 연결 채널(127)은 제1 패턴 형성층(140)에서 제2 패턴 형성층(150)과 대향하는 면에 형성되며, 시료 주입구(126)와 RT-LAMP 용액 분배 채널의 일단부를 연결한다.

시료 배출구(128)는 RT-LAMP 용액을 배출하기 위한 것으로서, 제1 패턴 형성층(140)에 관통구 형태로 형성된다.

배출구 연결 채널(129)은 제1 패턴 형성층(140)에서 제2 패턴 형성층(150)과 대향하는 면에 형성되며, 시료 배출구(128)와 RT-LAMP 용액 분배 채널의 타단부를 연결한다.

위에서 설명된 진단용 마이크로 디바이스(100)는 다음과 같이 제조된다. 먼저, 각 층을 접합하기 전 RT-LAMP H1 및 M 유전자 프라이머 혼합액(각 0.3 μL)를 상기 제2 패턴 형성층(150)의 RT-LAMP 챔버(115a)에 떨어뜨린 후, 섭씨 4도로 2시간 동안 건조시켰다. 상기 RT-LAMP 프리이머 혼합물은 3 μL 용량에서, 각 외측 프라이머(F3 및 B3)의 10 pmol, 각 내측 프라이머(FIP 및 BIP)의 100 pmol, 그리고 각 루프 프라이머(LF 및 LB) 50 pmol로 이루어진다. 본 발명에 따른 마이크로 디바이스의 전체 두께는 커버층(130)을 제외하고, 3.10 mm이었으며, 커버층(130)는 RT-LAMP-ICS 마이크로 디바이스의 등온 증폭 공정 전 디바이스에 RT-LAMP 챔버와 히팅 블 사이의 완벽한 접촉을 위해 장착된다.

상기한 본 발명의 진단용 마이크로 디바이스(100)를 이용한 진단 방법을 설명하면 다음과 같다.

먼저, 커버층(130)이 최종적으로 접합되기 전의 마이크로 디바이스(100)에 RT-RAMP 용액과 런닝 버퍼액을 주입한다. RT-RAMP 용액은 RT-LAMP 칵테일(23 μL 부피)를 2 μL 용량의 바이러스성 RNA 주형 용액과 혼합한 것으로서, RT-LAMP 용액 7 μL을 마이크로 디바이스(100)의 시료 주입구(126)을 통해 주입하였다. RT-LAMP 용액(S)은 RT-LAMP 용액 분배 채널(121)을 모세관 힘에 의하여 1분 내로 직접 채우게 되는데, 이는 도 12a에 도시된 바와 같다. 또한, 러닝 버퍼액(R)(25 mM 나트륨 카보네이트 완충액(pH 9.6), 1% casein, 0.4 mM EDTA, 0.2% alpha-cyclodextrin, 0.2% Triton-100, 0.4 M urea, 0.1% sodium azide)은 도 12a에 도시된 바와 같이 50 μL를 러닝 버퍼액 챔버(118a)에 로딩하였다. RT-LAMP 용액(S) 및 러닝 버퍼액(R) 로딩과 동시에, 시료 주입구(126), 시료 배출구(128) 및 러닝 버퍼액 챔버(118a)를 접착필름으로 강하게 밀봉하여, 증발 또는 오염 문제를 방지한다.

다음, 마이크로 디바이스(100)를 회전 장치를 이용하여 4000RPM의 회전 속도로 1분간 회전시킨다. 이때의 마이크로 디바이스(100)의 상대가 도 12b에 도시되어 있다. 도 12b에 도시된 바와 같이, RT-LAMP 용액(S)은 정확하게 세 부분으로 분리되어 3개의 RT-LAMP 챔버(115a) 쪽으로 RT-LAMP 용액 공급 채널(125)을 통해 균일하게 이동하며, RT-LAMP 용액(S)은 도 12c에 도시된 바와 같이 RT-LAMP 챔버(115a)로 2 μL 씩 주입되며, RT-LAMP 용액(S)은 전환 곡선부(116a)에 의해 RT-LAMP 챔버(115a)에 주입된 상태를 유지한다. RT-LAMP 챔버(115a)에서 합텐으로 표지된 냉동 건조된 프라이머 조합(A)은 로딩된 RT-LAMP 용액(S)에 의해 다시 수화된다. RT-LAMP 챔버(115a)로 유입되지 못하고 남은 RT-LAMP 용액은 시료 주입구(도 12a의 126)시료 배출구(도 12a의 128)로 이동한다. 또한, 도 12c에 도시된 바와 같이, 런닝 버퍼액(R)은 밸브부(118c)를 통과하고 런닝 버퍼액 수용부(118b)에 수용되고 런닝 버퍼택 흐름 제어 채널(119a)의 제1 내측 전환 곡선부(119c)을 통과하지 못하는 상태를 유지하게 된다.

다음, 회전이 멈추면, 갑작스런 원심력 감소에 따라 RT-LAMP 용액(S)은 전환 곡선부(116a)를 통과하고 런닝 버퍼액(R)은 제1 내측 전환 곡선부(119c)를 통과한 후 멈추게 되며, 이 상태는 도 12d에 도시된 바와 같다. 다음, 커버층(도 3의 130)을 접합한 후 커버층(130)이 접합된 마이크로 디바이스(100)를 이용하여 RT-LAMP 반응을 섭씨 66도에서 40분간 수행하여 도 12e에 도시된 바와 같이 RT-LAMP 생성물(T)이 얻어진다. RT-LAMP 생성물(T)을 루프 프라이머로부터의 합텐과 비오틴-dUTP로부터의 비오틴으로 표지화한다.

RT-RAMP 반응 후, 증폭된 RT-LAMP 생성물(T)을 ICS(180)로 공급하기 위해 마이크로 디바이스(100)를 다시 1분간 800RMP으로 회전시키며, 이 상태가 도 12f에 도시되어 있다. 도 12f에 도시된 바와 같이 RT-LAMP 생성물(T)은 RT-LAMP 생성물 공급 채널(117)을 통해 ICS(180)의 컨쥬게이트 패드(185)로 공급되며, 런닝 버퍼액(R)은 외측 전환 곡선(119d)를 통과한 후 멈추게 된다. 이 상태에서, 회전을 멈추면, 런닝 버퍼액(R)은 제2 내측 전환 곡선부(119e)를 통과하며, 다시 30초간 800RPM으로 회전시키면 도 12g에 도시된 바와 같이 런닝 버퍼액(R)은 런닝 버퍼액 공급 채널(119b)을 통해 ICS(180)의 버퍼액 로딩 패드(182)로 공급된다. 이후, 회전이 멈추고, RT-LAMP 생성물은 컨쥬게이트 패드(185)에 로딩되어, 금 나오 입자와 비오틴-스트렙타비딘 상호작용에 의하여 결합된다.

상기 금 나노입자와 RT-LAMP 생성물과의 결합물은 테스트 라인 영역으로 이동하여, 합텐과 안티-합텐 상호작용을 통하여 15분 이내에 포획된다(도 12h 참조).

비색 ICS 검출 결과에 따라 M 유전자 및/또는 HA 유전자 발현 여부를 알 수 있다. 테스트 라인 1 (Digoxigenin 항체로 표지화)은 M 유전자 발현을 알려주며, 테스트 라인 2(Texas Red로 표지화)는 HA 유전자 발현을 알려준다.

본 발명에 따른 RT-LAMP-ICS 마이크로 디바이스를 사용하여 인플루엔자 A H1N1 바이러스의 H1 및 M 유전자의 모노플레스 표적을 검출하였다. 본 발명의 일 실시예에서 H1 및 M 유전자 표적 프라이머 조합은 다른 RT-LAMP 챔버에서 건조시켰다. 음성 대조군으로 하나의 RT-LAMP 챔버에는 아무런 프라이머 조합을 투입하지 않았다. 인플루엔자 A H1N1 바이러스 주형을 함유하는 RT-LAMP 용액을 시료 주입구와 3개의 RT-LAMP 반응 챔버에 동시에 로딩하였다. 복수의 모노플렉스 유전자 발현 검출이 ICS에서 수행되었다(도 13 참조). H1 유전자 발현을 테스트 라인 2의 보라색 선으로 확인할 수 있었다(도 13 (b) (i) 참조). M 유전자 발현 또한 테스트 라인 1과 대조군 라인에서의 양성 시그널을 통하여 확인할 수 있었다(도 13 (b) (ii) 참조). 하지만, 음성 대조군 실험에서는 대조군 라인에서만 보라색 선이 확인되었다(도 13 (b) (iii) 참조).

본 발명에 따른 마이크로 시스템을 이용한 인플루엔자 A 바이러스 검출시 소요되는 속도 개선 효과를 증명하기 위하여, 멀티플레스 RT-LAMP 반응 시간을 60 분 내지 20분으로 조절하였다.

인플루엔자 A H1N1 바이러스 RNA가 주형으로 사용되었고, H1 및 보존 M 유전자를 표적으로 선택하였다. 하나의 RT-LAMP 챔버에서, H1 및 M 유전자 프라이머 조합을 함께 로딩한 후, 냉동 건조시켰다. 바이러스 RNA의 양은 10⁶으로 고정시켰다.

모든 테스트를 적어도 3회 반복하였다. 인플루엔자 A H1N1 바이러스는 3개의 보라색 선의 확인을 통하여 성공적으로 검출되었는데, 상기 3개의 보라색 선은 H1 및 M 유전자 발현을 의미한다. 반응 시간이 증가함에 따라, 밴드 신호는 더 강해지고 선명해졌다(도 14 참조). 심지어 30분의 RT-LAMP 반응시간에서도, 멀티플렉스 H1 및 M 유전자 산물은 ICS를 통하여 검출되었다. 20분 반응시간에서는 ICS에서의 밴드 신호가 너무 흐릿하게 나타나, 높은 신뢰도로 검출 여부를 확인할 수 없었다.

미세한 양임에도 불구하고 인플루엔자 바이러스는 유행성으로 확대될 가능성이 있으므로, 높은 민감도의 진단 방식이 필요하다. 본 발명에 따른 멀티플렉스 RT-LAMP-ICS 마이크로 디바이스의 민감도를 확인하기 위하여, 검출 한계(LOD) 방식을 채용하였다. 인플루엔자 A H1N1 바이러스 RNA를 10배씩 연속적으로 희석하고, 섭씨 60도로 40분간 멀티플렉스 RT-LAMP 반응을 하였다. 40분은 적은 수의 RNA에서도 성공도를 높이기 위하여 선택된 반응시간이다. 멀티플렉스 RT-LAMP 반응을 적어도 3회 수행하였다. 도 15에 도시된 바와 같이, H1 및 M 유전자의 멀티플렉스 표적은 성공적으로 증폭된 후 ICS에서 검출되었다(3개의 밴드 신호). 심지어 H1N1 바이러스 RNA가 10 카피인 경우에도, 테스트 라인 1과 2에서 양성 신호가 검출되었다. 전체 공정 시간은 RT-LAMP 반응시간인 40분을 포함해서 55분이었다.

멀티플렉스 RT-LAMP 반응의 선택도를 측정하기 위하여, 3개의 상이한 반응을 수행하였다. 이를 위하여 하나의 표적 주형(인플루엔자 A H1N1 바이러스 RNA)을 단일 RT-LAMP-ICS 마이크로 디바이스에 사용하였다. 각각 H1 및 M 유전자, H3 및 M 유전자, H5 및 M 유전자를 표적으로 하는 3 종류 조합의 RT-LAMP 프라이머를 준비하였고, 각각은 인플루엔자 A H1N1, 인플루엔자 A H3N2, 인플루엔자 A H5N1을 서브타입한다.

각 프라이머 조합은 상이한 RT-LAMP 챔버에 별도로 로딩된 후, 건조된다. 인플루엔자 A H1N1 바이러스 RNA를 함유하는 RT-LAMP 용액은 3개의 RT-LAMP 챔버로 분리되고, 섭시 66도로 40분간 멀티플렉스 등온 반응이 동시에 수행된다.

도 16은 디바이스에서 진행된 멀티플렉스 RT-LAMP 반응의 결과를 나타낸다.

도 16을 참조하면, H1 & M 유전자 표적 프라이머 조합을 함유하는 RT-LAMP 챔버만이 ICS 상에 3개의 밴드를 생성하였다 H3 및 H5 표적 프라이머는 인플루엔자 A H1N1 바이러스 RNA에 특이적이지 않으므로, 다른 ICS는 단지 2개의 양성 밴드(M 유전자에 대한 테스트 라인 1과 대조 라인)만이 나타났다. 이 결과들은 특이적 프라이머 설계와 본 발명에 따른 멀티플렉스 RT-LAMP-ICS 디바이스의 조합에 따라 빠르고 특이적인 인플루엔자 A 바이러스의 검출이 가능하다는 것을 나타낸다.

이상 설명한 바와 같이 본 발명은 회전형 다단(multiplex) RT-LAMP-ICS 마이크로 디바이스를 제공하여, 인플루엔자 A 바이러스와 같은 표적 바이러스를 검출한다. RT-LAMP 용액 및 러닝 버퍼액의 로딩과 분배가 칩 상에서 RPM 제어와 마이크로채널의 설계만으로 정확하게 수행될 수 있다. 또한 등온반응에 따라 증폭된 H1 및 M 유전자는 칩 내부에서 바로 ICS에서 분석될 수 있으며, 그 결과 인플루엔자 A H1N1 아형을 식별할 수 있다. 더 나아가 10 카피 수준의 낮은 농도에서도 바이러스 검출이 가능하며, ICS와 RT-LAMP를 하나의 디바이스에 결합시킴으로써, 높은 신뢰도를 가지면서 휴대 가능한 바이러스 검출 장치가 구현 가능하다.

이상 실시예들을 통해 본 발명을 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 실시예들은 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정되거나 변경될 수 있으며, 당업자는 이러한 수정과 변경도 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

100 : 마이크로 디바이스 110 : 단위 공정부
111 : 검출부 115 : RT-LAMP 생성물 공급부
115a : RT-LAMP 챔버 116 : RT-LAMP 생성물 흐름 제어 채널
117 : RT-LAMP 생성물 공급 채널 118 : 런닝 버퍼액 공급부
118a : 런닝 버퍼액 챔버 118b : 런닝 버퍼액 수용부
119 : 런닝 버퍼액 도입 채널 119a : 런넝 버퍼액 흐름 제어 채널
119b : 런닝 버퍼액 공급 채널 120 : RT-LAMP 용액 로딩부
130 : 커버층 140 : 제1 패턴 형성층
150 : 제2 패턴 형성층 160 : 제1 접합 필름층
170 : 제3 패턴 형성층 180 : ICS
190 : 제2 접합 필름층

Claims

회전중심으로부터 이격되어서 위치하고 반경방향을 따라서 배치되는 적어도 하나의 단위 공정부(110); 및
상기 단위 공정부 각각으로 RT-LAMP 용액을 로딩하는 RT-LAMP 용액 로딩부(120)를 포함하며,
상기 다수의 단위 공정부 각각은 병원균을 검출하는 ICS(180)를 구비하는 검출부(111)와, 상기 검출부에 대해 원주방향 일측에 배치되어서 상기 ICS로 RT-LAMP 생성물을 공급하는 RT-LAMP 생성물 공급부(115)와, 상기 검출부를 사이에 두고 상기 RT-LAMP 생성물 공급부(115)의 반대측에 배치되어서 상기 ICS로 런닝 버퍼액을 공급하는 런닝액 공급부(118)를 구비하는 것을 특징으로 하는 진단용 마이크로 디바이스.
청구항 1에 있어서,
상기 RT-LAMP 용액 로딩부는,
회전중심을 중심으로 원주방향을 따라서 지그재그 형태로 연장되어서 형성되어서 모세관을 형성하는 RT-LAMP 용액 분배 채널(121)과,
상기 RT-LAMP 용액 분배 채널로부터 반경방향 바깥으로 연장되어서 그 끝단이 상기 RT-LAMP 생성물 공급부와 연결되는 다수의 RT-LAMP 용액 공급 채널(125)을 구비하는 것을 특징으로 하는 진단용 마이크로 디바이스.
청구항 2에 있어서,
상기 RT-LAMP 용액 공급 채널(125)은 상기 RT-LAMP 용액 분배 채널에서 반경방향 바깥쪽으로 돌출되는 외측 돌출부(122)로부터 반경방향 바깥쪽으로 연장되는 것을 특징으로 하는 진단용 마이크로 디바이스.
청구항 2에 있어서,
상기 RT-LAMP 용액 로딩부는,
상기 RT-LAMP 용액 분배 채널과 연결되는 고리형상의 공기 챔버(124)를 더 구비하며,
상기 공기 챔버는 상기 RT-LAMP 용액 분배 채널의 반경방향 안쪽에 위치하는 것을 특징으로 하는 진단용 마이크로 디바이스.
청구항 4에 있어서,
상기 공기 챔버는 상기 RT-LAMP 용액 분배 채널에서 반경방향 안쪽으로 돌출되는 내측 돌출부(123)와 연결되는 것을 특징으로 하는 진단용 마이크로 디바이스.
청구항 2에 있어서,
상기 RT-LAMP 용액 공급 채널(125)은 짝수 개이며, 상기 다수의 RT-LAMP 용액 공급 채널 중 반경방향을 따라서 인접한 두 RT-LAMP 용액 공급 채널(125)은 동일한 RT-LAMP 생성물 공급부(115)와 연결되는 것을 특징으로 하는 진단용 마이크로 디바이스.
청구항 1에 있어서,
상기 RT-LAMP 생성물 공급부는 RT-LAMP 공정에 필요한 프라이머가 수용되고 상기 RT-LAMP 용액이 공급되는 RT-LAMP 챔버(115a)와, 상기 ICS로 RT-LAMP 공정에 의한 RT-LAMP 생성물을 전달하는 RT-LAMP 공급 채널(117)을 구비하는 것을 특징으로 하는 진단용 마이크로 디바이스.
청구항 7에 있어서,
상기 RT-LAMP 생성물 공급부는 상기 RT-LAMP 챔버와 상기 RT-LAMP 공급 채널(117)을 연결하는 RT-LAMP 생성물 흐름 제어 채널(116)을 더 구비하며,
상기 RT-LAMP 생성물 흐름 제어 채널은 상기 RT-LAMP 챔버에서 생성된 RT-LAMP 생성물의 흐름을 반경방향 안쪽에서 바깥쪽으로 전환시키는 전환 곡선부(116a)를 구비하는 것을 특징으로 하는 진단용 마이크로 디바이스
청구항 8에 있어서,
상기 RT-LAMP 생성물 공급부는 상기 RT-LAMP 생성물 흐름 제어 채널의 하류 끝단에 위치하는 모세관 밸브(116b)를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 진단용 마이크로 디바이스.
청구항 1에 있어서,
상기 런닝 버퍼액 공급부는
런닝 버퍼액이 저장되는 런닝 버퍼액 챔버(118a)와,
상기 런닝 버퍼액 챔버에 저장된 런닝 버퍼액을 상기 ICS로 전달하는 런닝 버퍼액 도입 채널(119)을 구비하며,
상기 런닝 버퍼액 도입 채널은 런닝 버퍼액의 흐름을 반경방향 안쪽에서 바깥쪽으로 전환시키는 제1 내측 전환 곡선부(119c)와, 상기 제1 내측 전환 곡선부의 하류에 위치하며 런닝 버퍼액의 흐름을 반경방향 바깥쪽에서 안쪽으로 전환시키는 외측 전환 곡선부(119d)와, 상기 외측 전환 곡선부의 하류에 위치하며 런닝 버퍼액의 흐름을 반경방향 안쪽에서 바깥쪽으로 전환시키는 제2 내측 전환 곡선부(119e)를 구비하는 런닝 버퍼액 흐름 제어 채널(119a)를 구비하는 것을 특징으로 하는 진단용 마이크로 디바이스.
청구항 10에 있어서,
상기 런닝 버퍼액 공급부는 상기 런닝 버퍼액 챔버의 반경방향 바깥쪽에 위치하는 모세관 구조의 밸브부(118c)를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 진단용 마이크로 디바이스.
RT-LAMP 용액 로딩부(120)가 형성되는 제1 패턴 형성층(140);
상기 제1 패턴 형성층과 접합되고 RT-LAMP 공정에 필요한 프라이머가 수용되고 상기 RT-LAMP 용액 로딩부로부터 RT-LAMP 용액을 전달받는 RT-LAMP 챔버(115a)와, 런닝 버퍼액이 저장되는 런닝 버퍼액 챔버(118a)가 형성되는 제2 패턴 형성층(150); 및
상기 RT-LAMP 챔버와 연결되어서 RT-LAMP 생성물을 공급받고 및 상기 런닝 버퍼액 챔버로부터 런닝 버퍼액을 공급받는 ICS(180); 및
상기 ICS가 수용되는 ICS 수용홈(171)이 형성되고 상기 제1 패턴 형성층의 반대편에서 상기 제2 패턴 형성층과 접합되는 제3 패턴 형성층을 포함하는 진단용 마이크로 디바이스.
청구항 12에 있어서,
상기 RT-LAMP 용액 로딩부는,
상기 제2 패턴 형성층과 대향하는 면에 회전중심을 중심으로 원주방향을 따라서 지그재그 형태로 연장되어서 형성되어서 모세관을 형성하는 RT-LAMP 용액 분배 채널(121)과,
상기 제2 패턴 형성층과 대향하는 면에 상기 RT-LAMP 용액 분배 채널로부터 반경방향 바깥으로 연장되는 RT-LAMP 용액 공급 채널(125)과,
상기 제2 패턴 형성층에 형성되어서 상기 RT-LAMP 용액 공급 채널과 상기 RT-LAMP 챔버를 연결하는 연결 통공(125a)을 구비하는 것을 특징으로 하는 진단용 마이크로 디바이스.
청구항 13에 있어서,
상기 RT-LAMP 용액 로딩부는 상기 제2 패턴 형성층과 대향하는 면에 형성된 고리 형상의 공기 챔버(124)를 더 구비하며,
상기 공기 챔버(124)는 상기 RT-LAMP 용액 분배 채널보다 반경방향 안쪽에 위치하며, 상기 RT-LAMP 용액 분배 채널의 반경방향 안쪽으로 돌출되는 내측 돌출부(123)와 연결되는 것을 특징으로 하는 진단용 마이크로 디바이스.
청구항 12에 있어서,
RT-LAMP 생성물을 상기 ICS로 공급하는 RT-LAMP 생성물 공급 채널(117)을 더 포함하며,
상기 RT-LAMP 생성물 공급 채널은,
상기 제2 패턴 형성층에서 상기 제3 패턴 형성층과 대항하는 면에 형성되는 제1 채널부(152)와, 상기 제1 패턴 형성층에서 상기 제2 패턴 형성층과 대향하는 면에 형성되는 제2 채널부(141)와, 상기 제2 패턴 형성층에 형성되는 관통구멍으로서 상기 제1 채널부와 상기 제2 채널부를 연결하는 연결 통공(153)과, 상기 제2 패턴 형성층에 형성되는 관통구멍으로서 상기 ICS로 RT-LAMP 생성물을 배출하는 배출 통공(153)을 구비하는 것을 특징으로 하는 진단용 마이크로 디바이스.
청구항 12에 있어서,
런닝 버퍼액을 상기 ICS로 공급하는 런닝 버퍼액 공급 채널(119b)를 더 포함하며,
상기 런닝 버퍼액 공급 채널은,
상기 제2 패턴 형성층에서 상기 제3 패턴 형성층과 대향하는 면에 형성되는 제1 채널부(157)와, 상기 제1 패턴 형성층에서 상기 제2 패턴 형성층과 대향하는 면에 형성되는 제2 채널부(143)와, 상기 제2 패턴 형성층에 형성되는 관통구멍으로서 상기 제1 채널부와 상기 제2 채널부를 연결하는 연결 통공(158)과, 상기 제2 패턴 형성층에 형성되는 관통구멍으로서 상기 ICS로 런닝 버퍼액을 배출하는 배출 통공(159)을 구비하는 것을 특징으로 하는 진단용 마이크로 디바이스.
회전중심으로부터 이격되어서 위치하고 반경방향을 따라서 차례대로 배치되는 다수의 단위 공정부(110); 및 상기 단위 공정부 각각으로 RT-LAMP 용액을 균일하게 로딩하는 RT-LAMP 용액 로딩부(120)를 포함하며, 상기 다수의 단위 공정부 각각은 병원균을 검출하는 ICS(180)를 구비하는 검출부(111)와, 상기 검출부에 대해 원주방향 일측에 배치되어서 상기 ICS로 RT-LAMP 생성물을 공급하는 RT-LAMP 생성물 공급부(115)와, 상기 검출부를 사이에 두고 상기 RT-LAMP 생성물 공급부(115)의 반대측에 배치되어서 상기 ICS로 런닝 버퍼액을 공급하는 런닝액 공급부(118)를 구비하며, 상기 RT-LAMP 생성물 공급부는 상기 RT-LAMP 챔버와 상기 RT-LAMP 공급 채널(117)을 연결하는 RT-LAMP 생성물 흐름 제어 채널(116)을 더 구비하며, 상기 RT-LAMP 생성물 흐름 제어 채널은 상기 RT-LAMP 챔버에서 생성된 RT-LAMP 생성물의 흐름을 반경방향 안쪽에서 바깥쪽으로 전환시키는 전환 곡선부(116a)를 구비하며, 상기 런닝 버퍼액 공급부는, 런닝 버퍼액이 저장되는 런닝 버퍼액 챔버(118a)와, 런닝 버퍼액의 흐름을 반경방향 안쪽에서 바깥쪽으로 전환시키는 제1 내측 전환 곡선부(119c)와, 상기 제1 내측 전환 곡선부의 하류에 위치하며 런닝 버퍼액의 흐름을 반경방향 바깥쪽에서 안쪽으로 전환시키는 외측 전환 곡선부(119d)와, 상기 외측 전환 곡선부의 하류에 위치하며 런닝 버퍼액의 흐름을 반경방향 안쪽에서 바깥쪽으로 전환시키는 제2 내측 전환 곡선부(119e)를 구비하는 런닝 버퍼액 흐름 제어 채널(119a)를 구비하는 진단용 마이크로 디바이스를 이용한 진단 방법으로서,
상기 RT-LAMP 용액 로딩부에 RT-LAMP 용액을 로딩하는 단계;
상기 진단용 마이크로 디바이스를 회전시켜서 상기 RT-LAMP 용액을 상기 RT-LAMP 챔버로 공급하는 단계;
상기 진단용 마이크로 디바이스의 회전을 정지시켜서 상기 RT-LAMP 용액의 상기 외측 전환 곡선부(119d)의 통과와, 상기 런닝 버퍼액의 상기 제1 내측 전환 곡선부의 통과를 허용하는 단계;
상기 RT-LAMP 챔버에서의 RT-LAMP 공정을 수행하여 RT-LAMP 생성물을 생성하는 단계;
상기 진단용 마이크로 디바이스를 회전시켜서 RT-LAMP 생성물을 상기 ICS로 공급하는 단계;
상기 진단용 마이크로 디바이스의 회전을 정지시켜서 상기 런닝 버퍼액의 상기 제2 내측 전환곡선부의 통과를 허용하는 단계;
상기 진단용 마이크로 디바이스를 회전시켜서 상기 런닝 버퍼액을 상기 ICS로 공급하는 단계를 포함하는 마이크로 디바이스를 이용한 진단 방법.