KR20160146650A - 알츠하이머병의 조기진단을 위한 바이오마커 및 방법 - Google Patents

알츠하이머병의 조기진단을 위한 바이오마커 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 제1 측면에서 적어도 4개의 특이적 바이오마커가 측정되는 대상체에서 알츠하이머병을 진단하거나 또는 알츠하이머병의 발병 위험을 결정할 뿐만 아니라 중증 알츠하이머병의 존재를 결정하는 방법에 관한 것이다. 또한, 적어도 4개의 특이적 바이오마커를 위한 검출 수단, 특히 항체를 포함하는 키트 및 어레이가 제공된다. 또한, 알츠하이머병을 진단하거나 또는 알츠하이머병의 발병 위험을 결정하기 위한 컴퓨터 프로그램 제품 및 컴퓨터 실행방법이 제공된다.

Description

알츠하이머병의 조기진단을 위한 바이오마커 및 방법 {BIOMARKER AND METHODS FOR EARLY DIAGNOSIS OF ALZHEIMER'S DISEASE}
본 발명은 제1 측면에서 적어도 4개의 특이적 바이오마커의 조합이 측정되는 대상체에서 알츠하이머병을 진단하거나 또는 알츠하이머병의 발병 위험을 결정하거나 또는 중증 알츠하이머병의 존재를 결정하는 방법에 관한 것이다. 또한, 적어도 4개의 특이적 바이오 마커를 위한 검출 수단, 특히 항체를 포함하는 키트 및 어레이가 제공된다. 또한, 알츠하이머병을 진단하거나 또는 알츠하이머병의 발병 위험을 결정하거나 또는 중증 알츠하이머병의 존재를 결정하기 위한 컴퓨터 프로그램 제품 및 컴퓨터 실행방법이 제공된다.
알츠하이머병(AD)은 인간의 삶에 막대한 비용을 수반하는 진행성 뇌 질환이다. 질병의 영향은 특히 위험에 처한 노인의 수가 점점 높아짐에 따라 개발 도상국 정부의 관심이 증가하고 있다. 알츠하이머병은 치매의 가장 흔한 형태로, 기억 상실 및 기타 인지장애에 대한 일반적인 용어이다. 일반적으로, 치매는 혈관성 치매와 알츠하이머병 또는 알츠하이머형 치매를 비롯한 퇴행성 치매의 형태를 포함한다. 치매의 다양한 유형은 아밀로이도패시(amyloidopathy) (알츠하이머형 치매), 타우오패시(tauopathy) (루이소체병, 크로이츠 펠트-야곱병, 피크병) 및 시누클레이노패시(synucleinopathy) (파킨슨 병)로 기재되어 있다.
치매의 가장 큰 위험 인자는 나이이다. 일부 형태의 치매는 50세 이하의 사람에서 발생하지만, 85세 이상의 사람이 이 증상을 경험할 가능성이 더 높다. 일부 개체는 알츠하이머병 및 헌팅턴 병 등의 특정 형태의 치매를 발병하는데 유전적으로 더욱 민감하다. 또한, 여러 가지 요인들이 임시 또는 영구 치매, 예를 들면 뇌 손상(뇌졸중으로 인한 손상 포함), 영양실조, 감염, 약물 반응, 중독, 뇌종양 또는 병변을 야기할 수 있다.
알츠하이머병은 만성 진행성 신경 퇴행성 질환이며, 치매의 가장 널리 퍼진 형태이다. 신경영상처리 방법을 포함한 최근의 진단수단은 지속적으로 개선되고 있다. 그럼에도 불구하고, 알츠하이머병의 진단의 민감성 및 특이성을 증가시키기 위한 도전이 여전히 존재한다. 두 개의 진단분야는 특히 도전적이다: 첫째, 경증 인지장애 및 정상적인 노화와 알츠하이머병의 초기 단계를 구분하며, 둘째, 특히 유사한 임상 증상이 다양한 유형의 치매에 의해 공유되는 경우 진단 특이성을 증가시킨다. 현재까지 뇌척수액(CSF)으로부터 β-아밀로이드(1-42), 총 타우(tau) 및 포스포-타우-181의 분석은 알츠하이머병을 진단하고 높은 신뢰성과 타당성으로 이를 다른 형태의 치매와 구별하기 위한 최선의 생물학적 마커이다. Marksteiner J. 등 (Drugs Today 43(6):423-31, 2007)은 CSF 바이오마커 및 추정 혈액 관련 마커의 사용을 검토하고 있다. 경증 인지장애의 위험이 타우 단백질의 유전자 변이에 의해 영향을 받으며 또한 경증 인지장애가 알츠하이머병과 공통의 유전적 배경을 공유한다는 것이 제안되고 있다. 이것은 인지기능 저하에 대한 유전적 위험을 규명하고 효과적인 임상 시험을 설계하는 것을 도울 수 있다. Welge V. 등(J. Neural. Transm. 116(2):203-12, 2009)은 뇌척수액(CSF) 농도에 있어서, 비율 Abeta1-42/Abeta1-38/p-타우가 비-알츠하이머 치매 환자로부터 알츠하이머병(AD)를 강력하게 판별하고 또한 적용 가능한 검사와 감별 진단 AD 바이오마커에 대한 정확성 요건을 충족한다.
알츠하이머 협회는 질환의 과정 중에 7개의 단계를 제공한다: 즉 1: 손상 없음, 2 경증 매우 감소 (초기 단계), 3 경증 감소, 4 중정도 감소, 5 중정도의 심한 저하, 6 중증 감소, 및 7 증증 매우 감소.
신경 퇴행성 질환의 조기 검출이 환자의 더욱 효과적인 치료를 가능하게 한다. 최근의 연구는 알츠하이머병과 같은 질환은 신경 퇴화가 발생하는 동안 그러나 임상증상이 나타나기 전에, 아마도 몇 년 지속되는 증상발병전 상(pre-symptomatic phase)을 특징으로 함을 입증했다. 이것은 도전, 즉 이러한 전임상 기간 중에 개체를 확인하는 방법, 및 기회를 나타낸다. 예방적 치료는 질병의 증상이 나타나기 전에 전임상 기간 동안 시작할 수 있었다. 따라서, 임상 연구의 주요한 목적은 신경 퇴행 임시 과정에서 진단을 후진시키기 위한 도구를 개발함으로써 이들 질환의 조기 검출을 개선하는 것이다. 더욱이, 개체가 알츠하이머병을 발병할 위험성이 있다는 것을 조기에 확인하는 것이 매우 바람직하다. AD의 예방과 치료가 상기 신경 퇴행성 질환의 조기 검출뿐만 아니라, AD의 상기 말기 진행을 지연하는데 환자에게 더욱 효과적인 것으로 본 분야에서 기술되어 있다.
응집 아밀로이드-베타 (아베타) 펩타이드는 알츠하이머병의 병리에 관여하고 있다. 시험관 및 생체 내에서 이들 응집물은 구형 올리고머 및 선형 피브릴을 포함하는 다양한 모폴로지에서 발견되며, 이것은 상이한 생물학적 활성을 갖는다. 산발성 알츠하이머병(AD)의 진단 및 모니터링은 말기 질환을 갖는 개체의 임상검사에 오랫동안 의존하여 왔다. 그러나 향후 항-AD 치료는 개체가 신경 퇴행의 아주 가벼운 증상을 나타낼 때 최적으로 시작된다. 여기에는 AD의 경증 인지장애 단계를 위한 코어 바이오마커로서 뇌척수액 아밀로이드-베타 (아베타)에 대한 의견일치가 개발중이다. 아베타는 AD의 병인에 직접 관련되어 있거나 또는 다른 주요 병원성 인자와의 밀접하게 상관관계가 있다. 상기 아베타는 베타-부위 APP 절단 효소 1 및 감마-세크레타제 복합체에 의존하는 단백질 분해 처리에 의해 아밀로이드 전구체 단백질(APP)에서 생성되며 또한 광범위한 프로테아제에 의해 분해된다.
뇌척수액(CSF)에서 아밀로이드-베타 (아베타 (1-40) 및 아베타 (1-42))의 40 및 42 아미노산 잔기 형태는 알츠하이머병(AD)의 잠재적 바이오마커로서 제안되었다. CSF중 아베타 펩타이드의 정량 분석은 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA)과정 등의 면역흡착 기반 분석의 사용에 거의 독점적으로 의존하여 왔다. 그러나, 아베타 펩타이드가 용이하게 자기 응집하거나 다른 단백질 및 유리 제품에 결합하는 성질 때문에, 이러한 분석은 매우 도전적이다. 분석은 번역 후 변형(post-translational modification)을 행하는 펩타이드의 잠재성 및 CSF의 내생적 구성요소(endogenous components)를 이용한 ELISA 어세이(assay)에서 교차 반응 가능성에 의해 더욱 복잡화된다. 최근의 연구 결과는 아베타 (1-40)에 비하여 플라즈마 아베타(1-42) 감소가 AD의 위험을 증가시킬 수 있음을 시사하고 있다 AD (Hampel H. et al., Alzheimers Dement. 4(1):38-48, 2008).
종양 괴사 인자 알파 (TNF-알파)는 종양 괴사 인자 (TNF) 상과(superfamily)에 속하는 다기능성 염증유발 사이토카인이다. 이 사이토카인은 주로 대식세포에 의해 분비된다. 이것은 세포 증식, 분화, 세포사멸, 지질 대사 및 응고를 포함하는 생물학적 과정의 넓은 스펙트럼의 조절에 관여한다. 이 사이토카인은 자가면역 질환, 인슐린 내성, 및 암을 포함하는 다양한 질환에 관여하고 있다. 마우스의 녹아웃 연구는 또한 이 사이토카인의 신경보호 기능을 제안하였다.
알츠하이머병(AD)에서 주요한 요인으로서 염증의 개념은 지금까지 항염증제의 보호효과의 면역학적 증거와 함께 병변과 관련된 자멸형 변화의 사후 연구 결과를 기반으로 하여 왔다. 지금 염증제 인터루킨 1 알파, 인터루킨 1 베타, 인터루킨 6, 종양괴사 인자 알파, 알파(2)-매크로 글로불린, 및 알파(1)-안티키모트립신에서 총 10 다형성에 의해 실질적으로 영향을 받는다는 증거가 있다. 다형성은 모두 공통적인 것이다.
WO 2005/052292 및 WO 2006/133423은 체액에서 AD 및 다른 신경질환의 진단, 층화(stratification) 및 모니터링을 위한 방법 및 조성물을 기술한다. 예를 들면, 상기 WO 출원으로부터 유래하는 EP 2 211 183 B1은 AD의 진단 및 모니터링 방법을 확인하며, 여기서 바이오마커로서 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 2 (EGFBP-2)가 측정된다. 상기 인용된 특허출원은 이른바 AD를 포함하는 신경질환을 진단하는데 적합해야 하는 다수의 가능한 바이오마커를 제공한다. 그러나, 높은 정확도로 AD의 진단 및 예측을 허용하는 특정 세트의 바이오마커는 기술되어 있지 않다. 그 외에, Thambisetty, N. 등[biomarkers and medicine, future medicine, London, Volume 4, No. 1, pages 65 to 79]는 도전적이지만 실현 가능한 AD의 혈액 기반 바이오마커를 기술한다. WO 2009/149185는 이중 가변 도메인 면역글로불린 및 그의 용도를 기술하고 있다.
최근의 연구결과는 알츠하이머병(AD)의 병인에 있어서 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF)의 관여를 시사하였다. BDNF는 성인 뇌의 신경 기능, 시냅스 가소성 및 구조적 완전성의 유지에 관여하는 내인성 단백질이다. BDNF 혈청 및 뇌척수액(CSF) 농도는 9명의 정상 압력 수두증(NPH) 환자와 28세 연령에 매치한 건강한 대조군에 비하여 27명의 AD 환자에 민감한 ELISA에 의해 평가했다. 건강한 대조군 (21.3 ng/ml; p=0.041/p=0.017)에 비하여 AD (18.6 ng/ml) 및 NPH 환자(18.1 ng/ml)에서 BDNF의 혈청 농도의 현저한 감소가 발견되었다. BDNF 혈청 농도는 AD 및 NPH 환자 모두에서 CSF 레벨, 연령 또는 미니 멘탈 스테이트 검사(MMSE) 점수와 상관하지 않았다. AD 및 NPH에서 BDNF 혈청 레벨의 감소는 영양 지원의 부족을 반영하여 두 개의 질환에서 진행성 퇴행에 기여할 수 있다.
만성 염증은 알츠하이머병(AD)의 특성이다. AD의 위험과 관련된 상호 작용은 염증유발성성 사이토카인, 인터루킨-6 (IL-6) 및 항 염증성 사이토카인, 인터루킨-10 (IL-10)에 대한 유전자의 조절영역에서 다형체들 사이에서 이루어 지는 것으로 보고 되었다. 부분적으로 두 개의 유전자에서 유전적 변화로 인하여, 일부 노인에서 IL-6 및 IL-10 모두의 조절장애는 AD의 발병에 기여할 수 있다 (Cambarros O. et al., J. Neuroinflammation 23(6):22, 2009).
IL-6 (인터페론 베타 2로도 명명됨)은 알츠하이머병(AD)에서 크게 증가하며 또한 당뇨병과 같은 다른 질환에 강한 상관관계를 가지고 있다. IL-6는 또한 다른 신경 퇴행성 질환 및 우울증과 상관관계를 가진다. 알츠하이머병(AD)의 역할도 또한 인터루킨 IL-10, IL-18 및 혈관 상피세포 성장 인자 (VEGF)에 대해 의심된다. Malaguera L. et al. (Neuropa-thology 26(4):307-12, 2006)은 IL-18의 레벨이 비-치매성의, 연령에 매치한 대상체(age-matched subjects)에 비하여 AD 및 혈관 치매를 가진 환자에서 현저하게 상승하였음을 밝혀 내었다.
Mateo 등(Acta Neurol. Scand. 116(1):56-8, 2007)은 혈관 내피 성장 인자(VEGF)가 중요한 신경 영양성 및 신경보호 작용을 결정한다고 기술하였다. 저혈청 VEGF 레벨은 알츠하이머병에 관련이 있다.
신경보호의 완전성은 인지기능장애 및 AD의 발병에 대하여 중요한 구성요소이다. 알츠하이머병 환자의 군은 건강한 노인 대상체 (IGF-1, 9.5 ± 2.4 pg/ml; VEGF, 105 ± 31 pg/ml; 및 TGF-베타 1, 68 ± 18 pg/ml)에 비하여 인슐린 유사 성장 인자-1 (IGF-1) (3.7 ± 1.2 pg/ml), 혈관 상피 성장 인자 (VEGF) (63 ± 18 pg/ml) 및 TGF-베타 1 (33 ± 10 pg/ml)의 심한 감소를 기준선으로 입증하였다. IGF-1과 VEGF 농도 사이에 유의적 양의 상관관계가 건강한 대상체 (r=0.87, p<0.001) 및 AD 대상체에서 모두 발견되었다 (Luppi C. et al., Arch. Gerontol. Geriatr. 49(Suppl. 1): 173-84, 2009).
혈장 호모시스테인의 상승은 인지장애, 치매, 우울증, 골다공증 골절 및 기능 저하 등의 노화와 함께 발견되는 일반적인 문제와 관련이 있다. 헤모시스테인 레벨은 알츠하이머병(AD) 환자 또는 대조군에서보다 혈관성 치매 환자에서 더 높은 것으로 알려져 있다. 상승된 혈장 호모시스테인 농도 및 낮은 혈청 엽산 농도는 치매 및 AD의 발병의 독립적 예측인자이다. 혈장 호모시스테인 레벨의 정상범위는 5 내지 15μmol/L, AD 환자의 경우 15μmol/L 초과이다.
단구 화학주성 단백질 1 (MCP-1)은 죽상동맥경화증, 울혈성 심부전 및 류마티스성 관절염 등의 단핵구 풍부 세포 침윤을 특징으로 하는 다양한 질환에서 현저하게 유도된다.
혈청중에 C-반응성 단백질(CRP)의 레벨 증가의 검출은 임의의 특정 질환에 특이적이지 않다. 이것은 염증성 과정의 유용한 지표이다. 플라즈마 CRP는 만연된 경증 인지장애(MCI)와 관련되며 또한 집단 베이스 세팅에서 침해 없는 노인의 비 건망증 MCI와 관련된다. 이들 연구 결과는 MCI의 병인에서 염증의 관여를 제안한다. 높은 플라즈마 CRP 레벨은 MCI를 가진 환자에서 기능 저하 촉진과 침해 위험 증가와 관련이 있다. AD환자는 혈관성 치매 환자 (각각 4.2 ± 0.6 대 1.7 ± 0.2, p < 0.001)보다 더 높은 CRP 레벨을 가졌다. 단계적 다중 로지스틱 회귀 분석은 치매 (교차비 = OR = 4.965, 95 % 신뢰 구간 = CI = 1.402-13.23, P = 0.004), 피브리노겐 (OR = 1.011, CI = 1.007-1.015, P <0.001), 및 연령 (OR = 1.158, CI = 1.063-1.261, P <0.001)이 독립적으로 높은 레벨의 CRP와 상관관계가 있음을 나타냈다. 이 연구는 염증이 AD에서 병인적 역할을 할 수 있다는 것을 제시하고 있다 (Mancinella A. et al., Arch. Gerontol. Geriatr. 49(Suppl 1): 185-94, 2009).
알츠하이머병에 대한 현재 치료법은 없지만, 그 치료를 위한 약물 및 비 약물 기반의 접근 방식이 있다. 일반적으로 약물 치료는 증상의 진행을 느리게 하는 것에 관한 것이다. 몇몇 바이오마커는 큰 그룹의 환자에 효과적인 것으로 잘 입증되었지만 성공은 그의 초기 단계에서 질병 매개물을 확인하는 것과 직접 상관된다. 이것은 분자 수단을 통하여 적시에 정확한 형태의 진단에 대한 필요성을 정당화한다. (Ray S. et al., Nat. Med. 13(11):1359-62, 2007).
결론적으로, 초기 알츠하이머병의 개선된 진단 검사는 여러 가지 장점을 갖는다. 조기 진단은 이 질병의 초기 단계의 사람들에게 약물에 대한 의사 결정 과정에 기여할 수 있다. 기존의 약물들은, 이들이 모두 작용하려고 하는 경우, 질환의 초기 단계에서 가장 잘 작용한다. 조기 검출은 조기 처치(intervention)를 허용한다. 약물이 개발됨에 따라 앞으로 조기검출은 알츠하이머병이 진행됨에 따라 발생하는 뇌에 대한 비가역적 손상을 방지할 수 있다고 할 수 있다. 따라서, 높은 특이성으로 초기 단계에서 AD의 진단을 가능하게 하는 방법 및 테스트 시스템에 대한 지속적인 필요성이 존재한다. 또한, 다른 유형의 치매와 AD를 구별하기 위하여, 새로운 방법 및 분석이 필요하다. 즉, AD의 후기 단계를 식별하면 치료 요법(treatment regimen)의 결정을 가능하게 하는 것을 보조한다.
본 발명은 제1 측면에서 알츠하이머병을 진단하거나 또는 알츠하이머병의 발병 위험을 예측하는 방법으로,
a) 대상체로부터 생물학적 시료 중에 AD 바이오마커의 레벨 또는 양을 측정하는 단계; 및
b) 상기 바이오마커의 레벨 또는 양을 기준으로 AD의 존재 또는 AD의 발병 위험을 결정하거나 진단하는 단계
를 포함하며,
여기서 상기 바이오마커는 뇌 유래 신경영양 인자 (BDNF), 인슐린 유사 성장 인자-1 (IGF-1), 종양 성장 인자 베타 1 (TGF- 베타 1), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 인터류킨 18 (IL-18), 및 단구 화학주성 단백질 1 (MCP-1)으로부터 선택된 적어도 4개의 바이오마커이며, 또한 제1 실시형태에서 IL-18 및/또는 MCP-1의 증가, 및/또는 BDNF, IGF-1, VEGF 및/또는 TGF- 베타 1의 감소가 AD의 존재 또는 AD의 발병 위험을 나타내는 방법에 관한 것이다. 또한 호모시스테인은 진단의 입증을 위한 추가의 바이오마커로서 사용될 수 있다. AD 환자에서 호모시스테인 레벨 또는 양은 감소한다.
더욱이, 대상체에서 알츠하이머병(AD)의 상태를 결정하는 방법으로,
a) 대상체로부터 생물학적 시료 중에 AD 바이오마커의 레벨 또는 양을 측정하는 단계; 및
b) 상기 바이오마커의 레벨 또는 양을 기준으로 높은 특이성으로 AD의 존재 또는 상태를 결정하는 단계
를 포함하며,
여기서 상기 AD 바이오마커는 뇌 유래 신경영양 인자 (BDNF), 인슐린 유사 성장 인자-1 (IGF-1), 종양 성장 인자 베타 1 (TGF- 베타 1), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 인터류킨 18 (IL-18), 및 단구 화학주성 단백질 1 (MCP-1)으로부터 선택된 적어도 4개의 바이오마커이며, 또한 IL-18 및/또는 VEGF의 증가, 및/또는 BDNF, IGF-1, MCP-1 및/또는 TGF- 베타 1의 감소가 중증 AD의 존재를 나타내는 방법에 관한 것이다.
즉, 다른 실시형태에서, 치매 환자의 중증 AD로부터 시작하는 AD의 말기 단계에서 고통하고 있다는 입증은 IL-18 및/또는 VEGF의 증가, 및/또는 BDNF, IGF-1, MCP-1 및/또는 TGF- 베타 1의 감소를 특징으로 한다.
상기 기준 마커의 적어도 4개의 조합은 한편으로는 적어도 90 %의 높은 특이성으로 AD 발병의 조기진단 및 검출을 가능하게 하며, 다른 한편으로는 적어도 90%의 높은 특이성으로 중증의 존재를 결정한다.
바이오마커 BDNF, IGF-1, TGF-베타 1, VEGF, IL-18 및 MCP-1 중 적어도 4개, 적어도 약 5개 또는 모든 바이오마커를 측정하는 것이 바람직하다.
상기 확인된 바이오마커의 적어도 4개를 포함하는 바이오마커 분자 징후(molecular signature)은 임상 AD을 예측하는데 평균 90%, 약 95%, 특히 96% 정확도, 유사한 민감도를 달성한다. 적어도, 바이오마커 분자 징후는 적절한 치료법의 초기 시작에서 알츠하이머병에 대한 위험의 조기 검출을 가능하게 할 뿐만 아니라 중증 AD의 존재를 결정하는 것을 가능하게 한다.
그 외에, 제2 측면에서, 본 발명은 알츠하이머병의 발병 위험을 진단하거나 결정하는데 사용하기 위한, 뇌 유래 신경영양 인자 (BDNF), 인슐린 유사 성장 인자-1 (IGF-1), 종양 성장 인자 베타 1 (TGF- 베타 1), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 인터류킨 18 (IL-18) 및 단구 화학주성 단백질 1 (MCP-1), 및 임의로 호모시스테인으로부터 선택된 적어도 4개의 바이오마커에 대한 검출 수단을 포함하는,알츠하이머병의 발병 위험을 진단하거나 예측할 뿐만 아니라 중증 AD의 존재를 결정하는데 사용하기 위한 키트로, 임의로, AD의 존재 또는 발병 위험을 진단할 뿐만 아니라 중증 AD의 존재를 결정하기 위한 본 발명에 따른 방법에서 키트의 사용방법 설명서를 포함하는 키트에 관한 것이다.
더욱이, 본 발명은 개체의 생물학적 시료 중에 바이오마커의 레벨 또는 양을 결정한 다음, 바이오마커의 기준 레벨 또는 양에 비하여 상기 바이오마커의 적어도 4개, 적어도 약 5개의 증가 또는 감소를 결정함으로써 AD의 평가 또는 치료 대조군으로, 진단에 사용하기 위한 본 명세서에 정의된 바와 같은 바이오마커의 적어도 4개, 적어도 약 5개의 시험관내 용도에 관한 것이다. 바이오마커는 상기 레벨 또는 양이 각각 상기 특이적 바이오마커에 대한 컷오프(cut-off)의 이상 또는 이하인 경우의 AD를 나타낸다. 더욱이, 본 발명은 본 발명에 따른 바이오마커의 적어도 4개를 검출하기 위한 수단을 포함하는 어레이, 특히 상기 검출 수단이 항체이고 상기 바이오마커의 검출이 면역학적으로 수행되는 어레이 또는 키트에 관한 것이다.
또한 본 발명은 하기 단계를 포함하는 AD를 진단하거나 또는 AD의 발병 위험을 결정하는 컴퓨터 실행 방법에 관한 것이다:
a) 대상체 및, 임의로, 대조군의 생물학적 시료 중에 본 발명에 따른 AD 바이오마커의 적어도 4개의 측정 레벨 또는 측정량의 데이터를 얻는 단계;
b) 데이터 베이스로부터 얻어지거나 또는 컷오프 대조군의 측정 레벨 또는 측정량으로서 얻어진 컷오프 값과 상기 시료 중에 AD 바이오마커의 레벨 또는 양을 비교하여 단계 a)의 데이터를 계산하는 단계; 및
c) 어느 레벨 또는 양이 컷오프 레벨 이상 또는 이하로 증가 또는 감소하는지 바이오마커를 확인하는 단계.
마지막으로, 본 발명은 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 컴퓨터 실행 가능 명령을 갖는 컴퓨터 매체 또는 컴퓨터 프로그램 제품에 관한 것이다.
도 1에서, 각 프로브의 할당을 나타내는 마이크로티터 플레이트 구조가 제공된다. 각 시료는 2회 측정한다. 또한 플레이트 상에 내부 대조군을 갖는 양성 대조군, 음성 대조군 및 컷오프 대조군을 나타낸다. 본 건에서는 5명의 환자 시료를 시험한다.
도 2에서는, 표 5에 나타낸 마커 조합의 특이성을 나타낸다. 입증되는 바와 같이, 6개의 마커 중 적어도 4개의 마커를 사용하면 90% 이상의 특이성을 허용한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "알츠하이머"는, 특히 NINCDS-ARDA 기준(National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke, and Alzheimer's Disease and Related Disorders Association)에서 정의된 바와 같이, 위축으로 대뇌 피질의 신경 세포를 사멸하거나 또는 대뇌의 전두엽 및 측두엽에서 대뇌회(대뇌피질의 융기)를 감소시키는 퇴행성 뇌 질환을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "진단"은 병리학적 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적과 관련하여, "진단"은 체액의 생체외 분석에 기초하여 알츠하이머병이 걸릴 위험도를 결정하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "바이오마커"는 질환 상태를 나타낼 수 있는 물질을 의미한다. 알츠하이머병의 진단에 관한 본 발명의 문맥에서, "바이오마커"는 뇌세포가 정상상태에 있거나 알츠하이머병에 의해 공격받는지를 나타내는 물질을 의미한다. "바이오마커"는 폴리펩티드 및 당 단백질을 포함하며, 이것의 양은 알츠하이머병을 앓고 있거나 또는 정상의 건강한 대상체에 비하여 알츠하이머병에 걸리기 쉬운 환자에서 증가하거나 감소한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "혈액"은 전혈, 혈청 및 혈장을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 생체분자의 항원영역에 특이적으로 결합하는 면역 글로불린을 의미한다. 본 발명의 목적과 관련하여, 항체는 바이오마커에 특이적으로 결합하며, 또한 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 및 재조합 항체를 포함한다. 또한 본 발명의 항체는 항체 분자의 기능적 단편은 물론 2개의 전체 길이 경쇄 및 2 개의 전체 길이 중쇄를 갖는 완전한 형태를 포함한다. 항체 분자의 기능적 단편은 적어도 항원-결합 기능을 보유하는 단편을 의미하며 또한 Fab, F(ab')2, Fv, 및 유사 단편을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항원-항체 복합체"는 그것을 인식하는 항체에 바이오마커의 결합 제품을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "포함하다" 또는 "포함하는" 및 "함유하다" 또는 "함유하는"은 "이루어져 있다"및 "이루어진"의 실시형태를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "컷오프 레벨"은 AD를 앓고 있거나 또는 AD 발병 위험에 있는 개체들을 구별할 수 있도록 결정된 상대 레벨 또는 절대 레벨을 의미한다. 컷-오프 레벨은 상대 레벨의 경우에 배수 차이(fold difference)로서 또는 절대값의 경우에, 예를 들어 ng 또는 pg/ml로서 표시되는 단백질 레벨의 경우에 특성값으로 주어진다. 본 명세서에서 지적된 바와 같이, 각각 컷오프 레벨 이하 또는 이상인 값은 AD의 진단을 가능하게 하거나 또는 AD의 발병 위험을 결정하거나, 또는 중증 AD의 존재를 결정하고 최종적으로 AD 환자의 치료 조절을 가능하게 하는 것으로 간주된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "AD 바이오마커"는 AD 진단 바이오마커인 바이오마커를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "예측하는"은 개체가 생물학적 질환을 발병할 가능성이 현저하게 높다고 발견하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "생물학적 시료"는 개체로부터 얻어진 다양한 시료 유형을 포함하며 또한 진단 또는 모니터링 분석에서 사용될 수 있다. 생물학적 유체 시료는 혈액, 뇌척수액(CSF), 뇨 및 생물 유래의 다른 액체 시료를 포함한다. 필요에 따라, 시료는 예를 들면 농축 및 분리를 위해 미리 처리할 수 있다.
"개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간이고, 용어 개체 또는 대상체는 본 명세서에서 서로 교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "기준값"은 절대값, 상대값, 상한 및/또는 하한을 갖는 값, 수치의 범위, 평균치(average value), 중간값, 평균값(mean value), 또는 특정의 대조군 또는 기준선 값에 비교한 수치일 수 있다. 기준값은 개개의 시료값, 예를 들면 더욱 조기 시점에서 얻어진 검사하려는 개체로부터의 시료에서 얻어진 수치, 또는 검사하는 개체 이외의 AD 환자의 시료로부터 얻어진 수치, 또는 "정상" 개체, 즉 AD로 진단되지 않는 개체로부터의 시료에서 얻어진 수치에 기초할 수 있다. 기준값은 다수의 시료, 예를 들면 복수의 AD 환자 또는 정상 개체로부터 얻어진 시료에 기초할 수 있고, 시험하려는 시료를 포함하는 시료 군에 기초할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 하나 ("a" "an") 및 상기 ("the")는 별도의 기재가 없는 한 단수 또는 복수를 의미할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "배수 차이"는 AD 바이오마커의 측정 값과 기준값과의 차이의 크기를 숫자로 나타낸 것이다. 배수 차이는 측정 값의 숫자를 기준치의 숫자로 나누어 계산된다. 예를 들어 AD 바이오마커의 측정 값이 20 나노 그램 / 밀리리터 (ng/ml)이고 기준값이 10 ng/ml인 경우, 배수 차이는 2 이다. 대안적으로, AD 바이오마커의 측정값이 10 ng/ml이고 기준값이 20ng/ml 인 경우, 배수 차이는 50%이다.
본 발명자들은 뇌 유래 신경영양 인자 (BDNF), 인슈린 유사 성장 인자-1 (IGF-1), 종양 성장 인자 베타 1 (TGF- 베타 1), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 인터류킨 18 (IL-18), 및 단구 화학주성 단백질 1 (MCP-1), 및 임의로 호모시스테인으로부터 선택된 적어도 4개의 바이오마커의 조합의 레벨 또는 양을 측정하는 경우, 또한 제1 실시형태에서, 대상체로부터 생물학적 시료에서 IL-18, MCP-1 및/또는 호모시스테인의 증가, 및/또는 BDNF, IGF-1, VEGF 및/또는 TGF- 베타 1의 감소를 결정하는 경우, 단지 1, 2 또는 3 마커의 조합을 사용하는 것보다 더 높은 특이성으로 알츠하이머병의 발병 위험을 결정하거나 AD를 조기 진단하는 것이 가능하다. 특히, 알츠하이머병 또는 알츠하이머병의 발병 위험은 본 명세서에 명시된 6개의 마커의 발현 레벨의 변화, 즉 IL-18, MCP-1 및/또는 호모시스테인의 증가 뿐만 아니라 BDNF, IGF-1, VEGF 및/또는 TGF- 베타 1의 감소와 관련되어 있다는 것이 확인되었다. 또한, 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 인슐린 유사 성장 인자-1 (IGF-1), 종양 성장 인자 베타 1 (TGF- 베타 1), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 인터류킨 18 (IL-18), 및 단구 화학주성 단백질 1 (MCP-1)의 적어도 4개, 바람직하게는 적어도 5개, 대략 모두 6개의 바이오마커를 조합하는 경우, 특이성 및 민감도는 AD의 진단 또는 예후를 가능하게 하기에 충분히 높으며, 반면 단일 바이오마커 각각은 상이한 질병 및 AD와 다른 증상에서 변할 수 있다. 더욱이, 호모시스테인의 양 또는 레벨은 그 결과를 확인하는데 사용할 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명에 따른 방법은 다른 형태의 확립된 치매와 AD를 차별화시키며 또한 후기 단계, 즉 AD의 중증 단계 및 매우 중증 단계를 결정하게 한다. 즉 확립된 AD는 BDNF, IGF-1, MCP-1 및/또는 TGF 베타 1의 감소 및/또는 VEGF 및/또는 IL-18의 증가를 특징으로 한다. 표 2는 정상의 건강한 대조군 및 중증 알츠하이머병 환자군의 혈청 시료 중에 상기 단백질의 측정량을 나타낸다. 이와 관련하여, 용어 "중증" 및 "확립된"은 본 명세서에서 서로 교환적으로 사용된다는 것이 주지된다.
바이오마커 단백질 정상의 건강한 대조군 알츠하이머병 군 AD의 증가 또는 감소
BDNF 22.8 +/- 1.6 ng/ml 2-12 ng/ml 감소
IGF-1 70-200 ng/ml 30- 60 ng/ml 감소
VEGF 314 +/- 15 pg/ml 400-2000 pg/ml 증가, 혈관성 AD
TGF-베타1 70 - 200 pg/ml 3-30 pg/ml 감소
MCP-1 160 pg/ml 60 pg/ml 감소
IL-18 100-200 pg/ml 320 pg/ml 증가
특히, 본원에서 정의된 바와 같은 6개의 바이오마커 중 적어도 4개의 바이오마커가 각각 증가하거나 또는 감소하는 경우, AD를 진단하거나 AD의 발병 위험을 결정하는 정확도는 물론 중증 AD의 존재를 결정하는 정확도가 매우 높으며 또한 치료를 모니터링할 수 있다. 특히 정확도는 적어도 90%, 예를 들면 적어도 95% 및 일부 경우에 적어도 96%이다. 예를 들면, 방법의 민감도는 적어도 90%, 적어도 약 95%, 예를 들면 적어도 96%의 범위이다. 그 외에, 본 발명에 따른 방법의 특이성은 적어도 85%, 적어도 약 90%, 예를 들면 적어도 92% 또는 적어도 95%이다. 이런 이유로, 본 발명에 따른 바이오마커의 특이적 조합은 높은 정확도로, 특히 선행기술에 비하여 높은 정확도로 AD를 진단하거나 결정할 수 있다.
원하는 경우, 본 발명에 따른 바이오마커는 당해 분야에 공지된 다른 바이오마커와 결합될 수 있으며 또한 적합한 AD 바이오마커로서 기술될 수 있다. 당업자는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 바이오마커와 결합될 수 있는 적절한 바이오마커를 잘 알고 있다.
바이오마커의 무리는 대조군에 비해 AD를 앓고 있는 대상체에서의 그의 레벨 또는 양에서 변동하는 것으로 당업계에서 기술되어 있다. 그러나, 그의 특이성 및 민감도, 즉 정확도는, 특히 단일 바이오마커가 다른 질환에서 그의 발현 레벨 또는 양에서 역시 변동할 수 있다는 사실에 비추어 보아, 대상체에서 AD를 진단하거나 또는 AD 발병 위험을 결정하는데 충분하거나 만족스럽지 않다.
반면, 본 발명에 따른 바이오마커의 세트, 즉 본 발명에 따른 바이오마커의 적어도 4개가 되는 바이오마커는 AD를 조기에 진단할 수 있을 뿐만 아니라 높은 정확도 및 특이성으로 중증 AD의 존재를 결정할 수 있다.
또한 용어 "측정하는", "결정하는" 또는 "진단하는"은 AD 바이오마커의 레벨 또는 양을 물리적으로 측정하고, 물리적으로 결정하고 또는 물리적으로 진단하는 단계를 포함한다. 다시 말하면, 이 방법은 AD 바이오마커의 레벨 또는 양을 측정하고 상기 측정 레벨 또는 양을 이용하여 결정하거나 진단하는데 유용한 공지 방법으로 AD 바이오마커의 레벨 또는 양을 측정하는 단계를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 바이오마커는 그의 펩타이드 또는 단백질 형태로 결정된다. 그러나, 예를 들면 생물학적 시료 중 mRNA 레벨 또는 양을 기준으로, 핵산 수준에 대한 AD 바이오마커의 레벨 또는 양을 측정할 수도 있다.
본 발명에 따르면, 본 명세서에 기술된 방법은 각각 시험관내 및/또는 생체내 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 본 방법은 개체로부터 얻어지고 시험관내에서 제공된 시료를 기반으로 하는 시험관내 방법이다.
본 발명자들은 특이적 바이오마커, 즉 뇌 유래 신경영양 인자 (BDNF), 인슐린 유사 성장 인자-1 (IGF-1), 종양 성장 인자 베타 1 (TGF-베타 1), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 인터류킨 18 (IL-18), 및 단구 화학주성 단백질 1 (MCP-1)의 레벨 또는 양을 측정하고 결정하면 AD의 발병 위험을 진단하거나 예측하는 것이 가능할 뿐만 아니라 다른 유형의 치매와 AD를 구별하고 AD의 후기 단계를 결정할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 하기 동정된 바와 같은 바이오마커의 조합을 측정한다:
a) BDNF, IGF-1, VEGF 및 TGF-베타 1;
b) BDNF, IGF-1, VEGF, IL-18 및 MCP-1;
c) BDNF, VEGF, TGF-베타 1, IL-18 및 MCP-1;
d) IGF-1, VEGF, TGF-베타 1, IL-18, MCP-1.
또 다른 바람직한 실시형태는 다음 조합을 포함한다:
e) BDNF, IGF-1, VEGF 및 MCP-1
f) BDNF, IGF-1, TGF-베타 1, MCP-1
g) BDNF, IGF-1, VEGF, TGF-베타 1, MCP-1.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 방법은 본 명세서에 정의된 바와 같은 모든 바이오마커의 레벨 또는 양을 측정하는 단계를 포함한다. 그 외에, 호모시스테인의 레벨 또는 양도 또한 결정된다.
언급한 바와 같이, 바이오마커 징후, 다시 말하면, 본 발명에 따른 바이오마커의 레벨 또는 양은 임상적 알츠하이머병을 예측하는데 평균 96%의 정확도로 가능하다. 이것은 치매의 명백한 징후를 갖는 환자가 AD에 의해 반영된다는 것으로 확인하는 데 사용할 수 있고, 또한 불분명한 증후군 또는 경증 인지손상을 갖는 환자를 진단하는데 사용할 수 있고, 이러한 환자는 AD에 걸릴 실질적 또는 더 높은 위험도를 갖는다. AD를 진단하는 기술분야와 비교하여, 본원의 청구된 바이오마커는 실질적인 장점을 가지고 있다. 예를 들면, 모든 바이오마커는 혈액 중에 존재한다. 이들은 표준 장비로 혈액 또는 혈청 시료 중에서 용이하게 및 확실하게 측정할 수 있으며, 또한 조직 또는 뇌척수액을 분석할 필요가 없다.
본 발명의 일 실시형태에서, 생물학적 시료는 혈액, 조직 또는 체액으로부터 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 생물학적 시료는 혈액, 특히 혈청이다.
언급한 바와 같이, 일 실시형태에서, 바이오마커 IL-18 및 MCP-1 뿐만아니라 호모시스테인도, 대조군 대상체로서 사용된 비-질환 인간의 그룹에서 바이오마커의 레벨 또는 양에 비하여, AD 환자의 시료에서, 특히 초기 질환 단계에서, 유사하게는 AD 환자군의 혈액에서, 증가한다. 확립된 (중증) AD의 경우, 바이오마커 IL-18 및 VEGF가 증가한다.
또한 BDNF, IGF-1, TGF-베타 1 및 VEGF는 비-질환 인간의 그룹의 시료에서 양에 비하여, AD 환자 그룹의 시료에서, 특히 초기 질환 단계에서, 더 낮은 양으로 존재한다. 확립된 (중증) AD의 경우, 바이오마커 BDNF, IGF-1, TGF-베타 1 및 MCP-1이 증가한다.
즉, 단일 바이오마커의 경우 대조군 그룹 또는 기준 그룹 대비 양 또는 레벨의 변화는 AD 그룹에서 최대 70%까지 범위이며, 반면 본 명세서에 정의된 바와 같은 바이오마커의 조합, 즉 적어도 4개의 바이오마커의 레벨 또는 양의 변화 또는 변동을 결정하는 것은 AD의 발병 위험의 결정 또는 진단의 정확도를 90% 이상으로 증가시킨다.
예를 들면, BDNF는 대조군 대상체에 대하여 AD 환자의 혈액 중에 거의 70%로 감소한다. 사이토카인은 나이에 따라 높은 유의적 관계를 보여준다.
표 1은 정상의 건강한 대조군 그룹 및 조기 알츠하이머병 환자 그룹의 혈청 시료에서 바이오마커 단백질 및 상기 단백질의 측정량을 보여준다.
바이오마커 단백질 정상의 건강한 대조군 그룹 알츠하이머병 환자 그룹 AD의 증가 또는 감소
BDNF 21.3 ng/ml 2-10 ng/m 감소
IGF-1 70-200ng/ml 60 ng/ml 감소
VEGF 309 pg/ml 210 pg/ml 감소
TGF-베타1 370 pg/ml 10-80 pg/ml 감소
MCP-1 160 pg/ml 400-700 pg/ml 증가
II-18 100-200 pg/ml 320 pg/ml 증가
본 발명에 따른 바이오마커의 레벨 또는 양의 측정은 공지의 방법으로 수행한다. 예를 들면, 단백질 수준에 대한 레벨 또는 양을 측정하는 경우에, 면역 분석은 예를 들어 ELISA, RIA, 방사선 면역 확산, 웨스턴 블롯, 오우크테를로니 (Ouchterlony) 면역 확산, 로켓 면역 전기 영동, 면역조직염색, 면역 침강 분석, 보체 결합 분석, FACS 및 단백질 칩 분석 뿐만 아니라 면역 형광 분석, 다중 면역 분석, 라인 분석 또는 도트 로트 분석을 수행한다.
바람직한 실시형태에서는 ELISA를 수행한다. 바이오마커의 레벨 또는 양을 측정하기 위한 측정 수단의 전형적인 예는 단백질 특이적 항체를 포함한다. 특이적 분자 항체는 당해 기술분야에 공지되어 있거나 또는 당해 분야에 기술된 방법에 기초하여 용이하게 제조할 수 있다. 단백질 레벨을 측정하는 것은 항체와 같은 단백질에 특이적으로 결합하는 측정 수단측정 수단여 단백질의 양을 측정하는 것을 의미한다. 상기 측정 방법은 상술한 방법 중 어느 하나에 정의되어 있을 수 있다. 일반적으로 상기 방법은 항원 항체 복합체를 형성하는 것 및 공지의 방법에 의해 복합체를 결정하는 것을 포함한다.
항원-항체 복합체 형성의 양은 바이오마커 단백질의 발현 라벨 또는 검출 라벨의 신호 크기를 측정함으로써 결정할 수 있다. 즉, 항체는, 이로 제한되지 않지만, 효소, 형광 마커, 리간드, 발광체, 미립자 및 레독스 분자의 그룹을 포함하는 당해분야에 공지된 검출 라벨로 표지할 수 있다. 검출 라벨로서 사용할 수 있는 효소의 예는, 이로 제한되지 않지만, D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코스옥시다제, 헥소키나제, GDP아제, RN아제, 루시퍼라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 아스파테이트 아미노트란스페라제, 및 포스포에놀피루베이트 데카르복실라제를 포함한다. 형광 바이오마커의 예는, 이로 제한되지 않지만, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌 및 플루오레사민을 포함한다. 리간드의 예는, 이로 제한되지 않지만, 비오틴, 아비딘, 및 비오틴 및 아비딘 유도체를 포함한다.
상술한 바와 같이, 상기 언급된 단백질 바이오마커로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단잭질의 종류의 레벨을 측정하기 위하여, 본 발명은 바이오마커 단백질에 특이적인 작용제, 예를 들면, 항체를, 바람직하게는 모노클로날 항체, 재조합 항체 또는 항체 단편의 형태로 포함하는 조성물을 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 방법은 상기 생물학적 시료에서 측정된 AD 바이오마커의 레벨 또는 양을 상기 바이오마커의 기준 레벨 또는 양과 비교하는 단계를 포함한다. 상기 기준 레벨은
a) AD를 앓고 있지 않는 집단으로부터 얻어진 평균 레벨; 및/또는
b) AD 환자를 포함하는 개체의 군으로부터 평균 또는 중간 레벨이다.
특히 바이오마커의 레벨 또는 양은 각각 컷오프 레벨 이상 또는 이하인지 여부가 결정된다.
예를 들면, 표 3 및 4는 조기 진단의 경우에 혈청 시료 같은 혈액 시료에서 바이오마커 단백질의 레벨 또는 양을 측정할 때 컷오프 레벨을 제공한다 (표 3).
바이오마커 단백질 AD의 증가 또는 감소 AD 병원성으로 컷오프
BNDF 감소 < 10 ng/ml
IGF-1 감소 < 60 ng/ml
VEGF 감소 < 250 pg/ml
TGF-베타1 감소 < 300 pg/ml
MCP-1 증가 > 300 pg/ml
II-18 증가 > 200 pg/ml
예를 들면, BNDF의 경우, 상기 양은 적어도 50% 감소하며, 예를 들면 정상의건강한 대조군 그룹에서 20 ng/ml에서 AD 환자 그룹에서 약 10 ng/ml 또는 그 이하까지 감소한다. IGF-1에서 변화는 약 40% 이상의 감소이며, 예를 들면 70 ng/ml 이상에서 60 ng/ml 또는 그 이하로 감소이다. VEGF에서 감소는 약 18% 또는 그 이상이그 , 예를 들면 309 pg/ml 에서 250 pg/ml 또는 그 이하이다. TGF-베타 1에서 감소는 적어도 20%이며, 예를 들면 370 pg/ml 에서 300 pg/ml 또는 그 이하이다. MCP-1에서 증가는 40% 또는 그 이상, 예를 들어 160 pg/ml 에서 300 pg/ml 또는 그 이상이다. IL-18에서의 증가는 적어도 15%, 예를 들면 200 pg/ml 또는 그 이상이다. 또한, 호모시스테인의 레벨 또는 양은 본 명세서에 정의된 바와 같은 바이오마커를 사용하여 얻어진 결과를 검증하거나 확인하기 위해 결정할 수 있다.
그 외에, 표 4는 중증 AD를 갖는 환자의 경우에 컷오프 레벨을 보여준다.
바이오마커 AD의 증가 또는 감소 AD 병원성으로 컷오프
BDNF 감소 < 20 ng/ml
IGF-1 감소 < 90 ng/ml
VEGF 증가 > 400 ng/ml
TGF-베타1 감소 < 50 pg/ml
MCP-1 감소 < 100 pg/ml
IL-18 증가 > 300 pg/ml
다른 측면에서, 본 발명은 알츠하이머병의 발병 위험을 진단하거나 결정할 뿐만 아니라, 중증 AD의 존재를 결정하는데 사용하기 위한, 뇌 유래 신경영양 인자 (BDNF), 인슐린 유사 성장 인자-1 (IGF-1), 종양 성장 인자 베타 1 (TGF- 베타 1), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 인터류킨 18 (IL-18) 및 단구 화학주성 단백질 1 (MCP-1)으로부터 선택된 적어도 4개의 바이오마커에 대한 검출 수단을 포함하는 키트로, 임의로, AD의 존재 또는 AD의 발병 위험을 진단할 뿐만 아니라 중증 AD의 존재를 결정하기 위한 본 발명에 따른 방법에 따른 방법에서의 키트의 사용방법 설명서를 포함하는 키트에 관한 것이다.
진단 바이오마커를 검출하기 위한 본 발명 키트는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하며 또한 라벨에 결합된 이차 항체, 예를 들면 기질과 발색반응을 위해 유용한 효소; 라벨과 발색반응을 유도하기 위한 발색 기질 용액; 세척 용액; 및 효소반응 정지 용액을 추가로 포함할 수 있다. 이것은 적절한 마이크로플레이트, 표준 용액 및 프로토콜을 추가로 포함할 수 있다. 라벨에 결합된 이차 항체 대신에, 상기 또는 하기 기술되는 바이오마커에 특이적인 (일차) 항체 자체는 라벨에 결합할 수 있다.
진단 바이오마커를 검출하기 위한 본 발명의 키트는 항원-항체 결합 반응을 통하여 항원을 정량적으로 또는 정성적으로 분석함으로써 알츠하이머병을 진단할 있으며, 항원-항체 결합반응은 통상적인 방법, 예를 들면 ELISA (효소 결합 면역 흡착 분석) 또는 샌드위치 분석에 의해 측정할 수 있다. 예를 들면 상기 또는 하기 기술된 바와 같은 진단 바이오마커를 검출하기 위한 키트는 분석물 및 대조군으로 코팅된 96-웰 마이크로티터 플레이트 표면을 이용하여 재조합 모노클로날 항체 단백질과 반응시키기 위한 ELISA를 수행하는 방식으로 제공될 수 있다. 항원-항체 결합 반응을 위한 수용체로서, 슬라이드 글래스, 니트로셀룰로오스 멤브레인, 또는 폴리비닐 또는 폴리스티렌 수지의 웰 플레이트가 사용될 수 있다.
발색 반응을 수행하는 통상적인 라벨, 예컨대 HRP (서양고추냉이 퍼옥시다아제), 알칼리성 포스파타제, 콜로이드성 골드, 형광 라벨, 예컨대 플루오레스세인, FITC (폴리 L-라이신-플로우레스세인 이소티오시아네이트) 또는 RITC (로다민-B 이소시아네이트), 또는 염료가 이차 항체 결합체의 라벨로서 또는 일차 항체 결합체의 라벨로서 바람직하게 사용될 수 있다.
발색 반응을 생성하는 기질은 라벨에 따라 선택된다. 특히 바람직한 기질은 퍼옥시다이제, 예를 들면 서양고추냉이 퍼옥시다아제와 함께 사용되는 것들이며, 또한 예를 들면 TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘), ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티오졸린-6-설폰산)), 또는 OPD (o-페닐렌디아민)이다. 바람직하게, 발색 기질은 완충용액 (예를 들면 0.1M 소듐 아세테이트, pH 5.5) 중에 용해 상태로 제조된다. 항체 결합체의 라벨로서 사용되는 HRP (서양고추냉이 퍼옥시다아제)는 과산화 수소의 존재하에 발색 기질, 예를 들면 TMB를 분해하여 발색 침전물을 생성시킨다. 발색 침전물의 침전 정도를 육안으로 체크함으로써, 단백질 바이오마커의 존재 또는 부존재가 검출된다. TMB의 색상은 450 nm에서 측정되며, ABTS의 색상은 420 nm에서 측정되며 또한 OPD의 색상은 492 nm에서 측정된다. 황산용액 (H2SO4)는 퍼옥시다아제 효소 정지 용액으로서 바람직하게 사용될 수 있다.
대안적으로, 효소 라벨로서 알칼리성 포스파타제 및 발색 기질로서 PNPP (파라-니트로페닐포스페이트)가 사용될 수 있다. 니트로페놀의 황색 색상은 405 nm에서 측정할 수 있다. 이 반응은 수산화 나트륨을 첨가함으로써 정지된다.
세척 용액은 바람직하게는 포스페이트 완충용액, NaCl 및 트윈 20을 포함하며, 또한 더욱 바람직하게는 0.02M 포스페이트 완충용액, 0.13 M NaCl, 및 0.05% 트윈 20을 포함하는 완충용액이다. 항원-항체 결합 반응을 수행하여 항원-항체 복합체를 형성한 후, 항원-항체 복합체는 이차 항체 결합체와 반응한 다음, 반응기에 적정량의 세척 용액을 첨가하여 3 내지 6회 세척한다.
또한, 바이오마커의 양을 결정하는 다른 방법은, 특히 RIA (방사선 면역분석), 폴리아크릴아미드 겔에 대한 웨스턴 블롯, 면역학적 블롯, 및 면역조직화학 염색이 검토된다. 상기 키트는 당해분야에 잘 알려진 바와 같이 바이오마커의 정량적 결정을 위해 검토되는 특수한 방법에 적합하다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 바이오마커 단백질의 양은 TMB, ABTS 및 OPD로부터 선택된 발색 기질 및 서양고추냉이 퍼옥시다아제에 의한 ELISA로 측정한다.
상기에서 확인한 바와 같이, 상기 검출 수단은 예를 들면 단백질 수준에 대한 바이오마커의 레벨 또는 양을 결정하는 경우에 항체이다. 대안적으로, 검출 수단은 핵산수준에 대한 레벨 또는 양을 검출하는 경우에 핵산 분자일 수 있다.
예들 들면, 상기 키트는 ELISA 또는 당업자에게 알려진 다른 적절한 면역분석이다.
더욱이 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 바이오마커의 적어도 4개를 검출하기 위한 수단, 예를 들면 상기 바이오마커의 적어도 5개, 특히 본 명세서에 정의된 바와 같은 바이오마커의 적어도 6개를 검출하기 위한 수단을 포함하는 어레이를 제공한다.
본 발명에 따른 키트 또는 어레이는 본 발명에 따른 방법을 수행하는데 특히 유용하다. 상기 키트 또는 어레이의 실시형태에서, 검출 수단은 본 명세서에 정의된 바와 같은 바이오마커에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 같은 항체이다.
예를 들면, 본 발명에 따른 어레이는 마이크로티터-플레이트일 수 있다.
상기 마이크로티터-플레이트는 양성 대조군, 음성 대조군 및/또는 컷오프 대조군의 레벨 또는 양을 결정함과 동시에, 바이오마커의 레벨 또는 양을 결정할 수 있다. 이에 따라, 상기 어레이는 상기 바이오마커의 증가 또는 감소, 특히 컷오프 레벨 이상 또는 이하로 상기 바이오마커를 증가 또는 감소를 결정하게 할 수 있으며, 따라서 AD의 존재 또는 AD의 발병 위험을 용이하게 결정하거나 또는 진단할 뿐만 아니라 상기 바이오마커의 레벨 또는 양에 기초하여 중증 AD의 존재를 결정하는 것이 가능하다. 도 1에서는 적절한 마이크로티터-플레이트를 나타내는 구조가 제공된다. 확인되는 바와 같이, 환자 시료 1 내지 5는 본 발명에 따른 7개의 바이오마커로부터 선택된 6개의 분석물, 즉 분석물 1 내지 6으로 시험한다. 그 외에, 양성 대조군은 물론 음성 대조군이 제공된다. 더욱이, 시료 중에 바이오마커의 레벨 또는 양이 AD의 결정 또는 진단을 가능하게 하는데 적절한지 여부를 결정하기 위하여, 컷오프 대조군이 제공된다. 따라서 동일한 어레이 상의 이러한 대조군은 AD 바이오마커의 측정 레벨 또는 양이 진단에 적절한지 여부를 용이하게 결정하는 것이 가능하게 한다. 이것은 컴퓨터 실행방법 또는 시스템에 특히 유용하다.
즉, 본 발명은 다른 측면에서 개체의 생물학적 시료 중에 상기 바이오마커의 레벨 또는 양을 결정하고, 상기 바이오마커의 기준 레벨 또는 양에 비하여 상기 바이오마커 중 적어도 4개, 약 적어도 5개, 약 6개 또는 전부의 증가 또는 감소를 결정함으로써 알츠하이머병의 진단, 위험 평가 또는 치료 조절에 사용하기 위한 본 명세서에 정의된 바와 같은 바이오마커의 적어도 4개, 약 5개, 예를 들면 6개 또는 전부의 시험관내 용도로, 여기서 기준 레벨은 AD로 감염되지 않은 집단으로부터 얻어진 평균 레벨; 및/또는 AD 환자를 포함하는 개체의 그룹으로부터 중간 레벨이며, 따라서 상기 개개 바이오마커의 컷오프 레벨은 증가 또는 감소의 동정을 허용하는데 사용된다. 본 발명의 일 실시형태에서, 컷오프 레벨은 예를 들면 본 발명에 따른 어레이에서 기술된 바와 같이 본 발명에 따른 방법에서 대조군으로서 존재하는 적절한 컷오프 대조군에 의해 반영된다.
더욱이, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 AD를 진단하거나 또는 AD의 발병 위험을 결정하는 컴퓨터 실행방법에 관한 것이다:
a) 대상체 및, 임의로, 대조군의 생물학적 시료에서 본 명세서에 정의된 바와 같은 AD 바이오마커, 즉, 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 인슐린 유사 성장 인자-1 (IGF-1), 종양 성장 인자 베타 1 (TGF- 베타 1), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 인터류킨 18 (IL-18), 및 단구 화학주성 단백질 1 (MCP-1) 중 적어도 4개의 측정 레벨 또는 양의 데이터를 얻는 단계;
b) 데이터 베이스로부터 얻어지거나 또는 컷오프 대조군의 측정 레벨 또는 측정량으로서 얻어진 컷오프 값와 상기 시료에서 바이오마커의 레벨 또는 양을 비교하여 단계 a)의 데이터를 계산하는 단계; 및
c) 어느 레벨 또는 양이 컷오프 레벨 이상 또는 이하로 증가 또는 감소하는지 바이오마커를 분석 및 동정하는 단계.
임의로, 상기 방법은 바이오마커의 각각에 대한 결과 또는 단순히 양성 또는 음성 진단 또는 위험도 평가의 결과를 출력 장치, 예를 들면 색깔있고, 강조표시된 프리젠테이션 형태로 나타내는 단계를 추가로 포함한다.
예를 들면, 상기 분석은 주요 성분 분석에 의해 수행된다. 분석은 오류 분석에 의해 수행할 수 있다.
마지막으로, 본 발명은 본 발명에 따른 방법의 단계들을 수행하기 위한 컴퓨터 실행 가능 명령을 갖는 컴퓨터 매체 또는 컴퓨터 프로그램 제품에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 측정값과 기준값의 비교는 측정값과 기준값 사이의 배수차이를 계산하여 측정값이 컷오프 레벨 이상 또는 이하인지 여부를 동정하도록 하는 것을 포함한다.
실시예
실시예 1: 퇴행성 뇌 질환을 갖는 환자로부터 및 정상의 건강한 대상체로부터 채취한 혈액의 정량적 단백질 분석
알츠하이머병을 가진 환자 및 건강한 인간 대상체의 대조군으로부터의 혈액 시료는 환자의 동의 및 다음과 같은 적용가능한 윤리지침에 따라 채취한다.
혈청 분리 튜브를 사용하고 시료는 대략 1000 x g에서 20분 동안 원심분리 전에 실온에서 2 시간 또는 4℃에서 하룻밤 응고시켰다. 새로 준비한 혈청을 즉시 분석하거나 시료를 -20 또는 -80℃로 분취액으로 저장하였다. 반복되는 냉동/해동 사이클은 피해야 한다.
ELISA (시료 항원을 검출하기 위한 샌드위치 ELISA)는 다음의 마커 단백질, BDNF, IGF-1, TGF-베타 1, VEGF, MCP-1 및 IL-18의 채취된 시료의 항원에 특이적인항체를 사용하여 수행한다.
실시예 2: BDNF, IGF-1, TGF-베타 1, VEGF, IL-18 및 MCP-1에 대한 ELISA
각 항원의 pH 7.4, PBS 중 1.0 ml (1 μg/ml) 표준 희석액을 준비한다. 실온에서 10분 동안 유지시키고 서서히 진탕한다.
IL-18, TGF-베타 1, VEGF, BDNF, MCP-1 및 IGF-1에 대한 항체로 미리 코팅한 웰은 각각 B&D Biosciences, Bachem, Novagen, Invitrogen, 또는 GenScript 또는 기타로부터 구입한다.
상기 언급된 1 μg/ml 표준 항원용액의 각 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 및 1:64 희석액을 각각 100 ㎕ 준비하고 1 웰마다 (7개 웰)에 첨가한다. 여덟째 웰은 블랭크(blank)를 위해 비축된다. 웰들은 플레이트 실러로 밀봉하고 계속 진탕(700 rpm)하면서 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 플레이트를 흡입하고, 400 ㎕ 세척 용액으로 3 회 세척하고 다시 흡입한다. 이어서 100 ㎕의 각각의 항-HRP-결합 항체를 플레이트의 각 웰에 첨가하고 700rpm으로 진탕하면서 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션한다. 각 웰의 내용물을 흡입한다. 플레이트는 200 ㎕의 OPD (o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드) 기질 용액의 첨가 전에 다시 3 회 세척한다. OPD 기질 용액은 공급된 OPD 희석액에 두 개의 10 mg OPD 정제를 첨가한 다음 50 ㎕의 3% H2O2를 첨가하여 제조한다. 이어서 플레이트는 색상이 발현하는 동안 어두운 곳에서 20 내지 25분 동안 인큐베이션한다. 색상 발현은 100 ㎕의 정지 용액 (3N 황산)을 첨가하여 정지한다. 플레이트는 492 nm에서 마이크로플레이트 리더로 해독한다.
OPD 대신에, ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)), TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘), 또는 DAB (3,3'-디아미노벤지딘)을 발색 기질로서 사용할 수 있다.
대안적으로, 효소로서 알칼리성 포스파타제 및 PNPP (파라-니트로페닐포스페이트)를 사용할 수 있다. 니트로페놀의 황색은 실온에서 15 분 후에 405 nm에서 측정할 수 있다. 이 반응은 동일 부피의 0.75 M NaOH를 첨가함으로써 정지한다.
표준 곡선은 플레이트에 대한 표준으로부터 생성되고 이것은 시료 중에 표제 항원의 농도를 계산하는데 사용된다.
실시예 3: 알츠하이머병 환자 및 정상의 건강한 대상체로부터의 시료를 시험
96-웰 높은 결합 스트립웰(Stripwell) 면역분석 플레이트 (Corning Life Sciences, NY, 또는 BD Bioscience)는 10 ㎍/ml의 농도로 각각 IL-18, TGF-베타 1, VEGF, BDNF, MCP-1, 및 IGF-1의 항체(B & D Biosciences, Genscript, Invitrogen, Genzyme, IBL 인터내셔날, Innogenetics, 또는 Calbio chem으로부터 구입한 특이적 항체의 희석된 1:100 용액 20㎕)로 미리 코팅하고 차단한다. 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16; 및 1:64의 비로 PBS로 희석된 혈장 시료 100㎕를 각각의 미리 코팅된 웰에 첨가한다. 플레이트는 700rpm으로 회전시키면서 2 시간 동안 실온에서 인큐베이션한다. 웰을 4℃에서 하룻밤 PBS 중에 3% 소혈청 알부민으로 차단한다. PBS/0.1% 트윈 20으로 3회 세척한 후, BDNF, IGF-1, TGF-베타 1, VEGF, IL-18 및 MCP-1의 특이적 항체 100 ㎕을 각 웰에 적용하고 4℃에서 하룻밤 인큐베이션한다. 일차 항체에 특이적인 HRP-결합 이차 항체 50 ㎕을 첨가하고 700 rpm으로 회전시키면서 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션한다. 플레이트는 0.1 M PBS (소듐 비카보네이트 완충액, Sigma, pH 9.6)로 3회 세척하여 결합되지 않는 항체-효소 결합체를 제거한다. 100μl의 TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)을 첨가하고, 메탄올 중 H2O2의 3% 용액의 존재하에 효소를 황색 효소로 전환한다. 반응은 100μl의 3N 황산을 첨가함으로써 정지된다. 플레이트 웰의 흡광도는 450 nm에서 측정하여 항원의 존재 및 양을 결정한다. 흡광도 및 농도의 상관관계는 시험 시료의 표준 (기준) 곡선이다.
표 5는 본 명세서에 정의된 바와 같은 바이오마커의 조합을 나타내며, 여기서 넘버링은 다음과 같다: 1=BDNF, 2 = IGF-1,3 = VEGF, 4 0 TGF-베타 1,5 = MCP-1,6 = IL-18
Figure pct00001
실시예 4: 호모시스테인의 결정
호모시스테인은 Araki A. 및 Sako Y., J.의 [Chromatogr. 422:43-52, 1987]의 절차에 따라 형광 검출에 의해 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 측정한다.
결과
도 2에서는 특이성에 대해 본 명세서에 기술된 바와 같은 6개의 마커 중 적어도 4개를 조합하는 관계를 나타낸다. 입증된 바와 같이, 적어도 90%의 특이성은 적어도 4개의 마커를 조합할 때만 얻어지지만, 이것은 적어도 90%의 특이성을 얻는데 충분한다.

Claims (20)

  1. 대상체에서 알츠하이머병(AD)을 진단하거나 또는 알츠하이머병의 발병 위험을 결정하는 방법으로,
    a) 대상체로부터 생물학적 시료 중에 AD 바이오마커의 레벨 또는 양을 측정하는 단계; 및
    b) 상기 바이오마커의 레벨 또는 양을 기준으로 높은 특이성으로 AD의 존재 또는 발병 위험을 결정하거나 진단하는 단계
    를 포함하며,
    여기서 상기 AD 바이오마커는 뇌 유래 신경영양 인자 (BDNF), 인슐린 유사 성장 인자-1 (IGF-1), 종양 성장 인자 베타 1 (TGF-베타 1), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 인터류킨 18 (IL-18), 및 단구 화학주성 단백질 1 (MCP-1)으로부터 선택된 적어도 4개의 바이오마커이며, 또한 IL-18 및/또는 MCP-1의 증가, 및/또는 BDNF, IGF-1, VEGF 및/또는 TGF-베타 1의 감소가 AD의 존재 또는 발병 위험을 나타내는, 방법.
  2. 대상체에서 알츠하이머병(AD)의 상태를 결정하는 방법으로,
    a) 대상체로부터 생물학적 시료 중에 AD 바이오마커의 레벨 또는 양을 측정하는 단계; 및
    b) 상기 바이오마커의 레벨 또는 양을 기준으로 높은 특이성으로 AD의 존재 또는 상태를 결정하는 단계
    를 포함하며,
    여기서 상기 AD 바이오마커는 뇌 유래 신경영양 인자 (BDNF), 인슐린 유사 성장 인자-1 (IGF-1), 종양 성장 인자 베타 1 (TGF-베타 1), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 인터류킨 18 (IL-18), 및 단구 화학주성 단백질 1 (MCP-1)으로부터 선택된 적어도 4개의 바이오마커이며, 또한 IL-18 및/또는 VEGF의 증가, 및/또는 BDNF, IGF-1, MCP-1 및/또는 TGF-베타 1의 감소가 중증 AD의 존재를 나타내는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    대상체로부터 생물학적 시료를 제공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1항에 정의된 바와 같은 적어도 5개의 AD 바이오마커의 레벨 또는 양을 측정하고, 바람직하게는 제1항에 정의된 바와 같은 바이오마커의 전부를 측정하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바이오마커가 단백질 또는 펩타이드 형태인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    하기 바이오마커의 조합을 측정하는 방법:
    a) BDNF, IGF-1, VEGF 및 TGF-베타 1;
    b) BDNF, IGF-1, VEGF, IL-18 및 MCP-1;
    c) BDNF, VEGF, TGF-베타 1, IL-18 및 MCP-1;
    d) IGF-1, VEGF, TGF-베타 1, IL-18, MCP-1
    e) BDNF, IGF-1, VEGF 및 MCP-1
    f) BDNF, IGF-1, TGF-베타 1, MCP-1
    g) BDNF, IGF-1, VEGF, TGF-베타 1, MCP-1
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    AD를 진단하거나 AD의 발병 위험을 예측할 뿐만 아니라 중증 AD의 존재를 결정하는 특이성은 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%의 정확도를 갖는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생물학적 시료가 혈액을 포함하는 체액 또는 조직으로부터 선택되고, 바람직하게는 말초 혈액, 특히 혈청으로부터 선택되는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    측정은 면역 분석, 바람직하게는 ELISA, RIA, 다중 면역 분석 또는 면역 형광 분석, 웨스턴 블롯, 라인 분석 또는 도트 블롯 분석을 이용하여 수행되는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시료 중 AD 바이오마커의 레벨 또는 양을 상기 바이오마커의 기준 레벨 또는 양과 비교하며, 여기서 상기 기준 레벨은
    a) AD를 앓고 있지 않는 집단으로부터 얻어진 평균 레벨; 및/또는
    b) AD 환자를 포함하는 개체의 군으로부터 평균 또는 중간 레벨이고,
    각각 소정의 상대 또는 절대 컷오프 레벨 또는 양 이상 또는 이하에서, 상기 바이오마커의 레벨 또는 양은 AD의 존재 또는 발병 위험 또는 중증 AD의 존재를 나타내는 방법.
  11. 대상체에서, AD의 발병 위험을 진단하거나 결정하거나, 또는 중증 AD의 존재를 결정하는데 사용하기 위한, 뇌 유래 신경영양 인자 (BDNF), 인슐린 유사 성장 인자-1 (IGF-1), 종양 성장 인자성장 인자(TGF-베타 1), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 인터류킨 18 (IL-18) 및 단구 화학주성 단백질 1 (MCP-1)으로부터 선택된 적어도 4개의 바이오마커에 대한 검출 수단을 포함하는 키트로, 임의로, AD의 존재 또는 발병 위험을 진단할 뿐만 아니라 중증 AD의 존재를 결정하기 위한 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 방법에서 상기 키트의 사용방법 설명서를 포함하는 키트.
  12. 제11항에 있어서,
    ELISA, RIA, 다중 면역 분석 또는 면역 형광 분석, 웨스턴 블롯, 라인 분석 또는 도트 블롯 분석인 키트.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 방법에서 사용하기 위한 키트.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 방법에서 사용하거나 제1항에 정의된 바와 같은 바이오마커의 적어도 4개, 바람직하게는 상기 바이오마커의 적어도 5개를 검출하는 수단을 포함하는 어레이.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 검출 수단이 재1항에 정의된 바와 같은 AD 바이오마커에 특이적으로 지향하는 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체인 키트 또는 어레이.
  16. 개체의 생물학적 시료에서 상기 바이오마커의 레벨 또는 양을 결정하고, 상기 AD 바이오마커의 기준 레벨 또는 양에 비하여 상기 바이오마커의 적어도 4개, 적어도 약 5개의 증가 또는 감소를 결정함으로써 AD의 진단, 위험 평가 또는 치료 조절에 사용하기 위한 제1항에 정의된 바와 같은 AD 바이오마커의 적어도 4개, 약 5개의 조합의 시험관내 용도로, 여기서 상기 기준 레벨은
    a) AD를 앓고 있지 않는 집단으로부터 얻어진 평균 레벨; 및/또는
    b) AD 환자를 포함하는 개체의 군으로부터 평균 또는 중간 레벨이고,
    각각 소정의 상대 또는 절대 컷오프 레벨 또는 양 이상 또는 이하에서,
    상기 바이오마커의 레벨 또는 양은 AD의 존재 또는 발병 위험을 나타내는 용도.
  17. 하기 단계를 포함하는 AD를 진단하거나 또는 AD의 발병 위험을 결정하는 컴퓨터 실행 방법:
    a) 대상체 및, 임의로, 대조군의 생물학적 시료 중에 제1항에 따른 AD 바이오마커의 적어도 4개의 측정 레벨 또는 측정량의 데이터를 얻는 단계;
    b) 데이터 베이스로부터 얻어지거나 또는 컷오프 대조군의 측정 레벨 또는 측정량으로서 얻어진 컷오프 값과 상기 시료 중에 AD 바이오마커의 레벨 또는 양을 비교하여 단계 a)의 데이터를 계산하는 단계; 및
    c) 어느 레벨 또는 양이 컷오프 레벨 이상 또는 이하로 증가 또는 감소하는지 AD 바이오마커를 분석 및 동정하는 단계.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 분석이 주요 성분 분석인 컴퓨터 실행 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    d) 출력장치에 대한 AD 마커를 분석하고 확인하는 데이터를 나타내고, 특히 AD의 진단 또는 위험의 결과를 보여주는 단계를 추가로 포함하는 컴퓨터 실행 방법.
  20. 제1항 내지 제10항 또는 제17항 내지 제19항에서 확인된 바와 같은 단계를 수행하기 위한 컴퓨터 실행가능한 명령을 갖는 컴퓨터 해독 매체 또는 컴퓨터 프로그램 제품.
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