KR20160135830A

KR20160135830A - 항-인플루엔자 b 바이러스 혈구응집소 항체 및 사용 방법

Info

Publication number: KR20160135830A
Application number: KR1020167029658A
Authority: KR
Inventors: 리 스웸; 민 쉬; 메르세데즈 발라즈; 닝 차이; 낸시 치앙; 헨리 치우; 중화 린; 제랄드 알. 나카무라; 현주 박
Original assignee: 제넨테크, 인크.
Priority date: 2014-03-27
Filing date: 2015-03-26
Publication date: 2016-11-28
Also published as: IL247870A0; JP2017512471A; SG11201607945UA; EP3122771A1; CA2942820A1; WO2015148806A1; AR099855A1; CL2018002874A1; PH12016501873A1; TW201620932A; BR112016022113A2; CR20160502A; CL2016002413A1; EA201691945A1; US9745365B2; US20170320937A1; CN106132987A; US20150274812A1; MX2016012530A; AU2015235983A1

Abstract

본 발명은 항-인플루엔자 B 바이러스 혈구응집소 항체, 항-인플루엔자 B 바이러스 혈구응집소 항체를 포함하는 조성물, 및 이의 사용 방법을 제공한다.

Description

항-인플루엔자 B 바이러스 혈구응집소 항체 및 사용 방법 {ANTI-INFLUENZA B VIRUS HEMAGGLUTININ ANTIBODIES AND METHODS OF USE}

관련 출원

본 출원은 2014년 3월 27일 출원된 미국 가출원 번호 61/971,123의 우선권을 주장하고, 그 전체가 본원에서 참조로 편입된다.

서열 목록

본 출원은 ASCII 구성방식으로 전자적으로 제출되는 서열 목록을 함유하고 이에 의해 그 전체가 참고로 편입된다. 2014년 3월 18일 생성된 상기 ASCII 사본은 P05794R1-WO_SL.txt로 지칭되고 96,612 바이트 크기이다.

발명의 분야

인플루엔자 바이러스 감염은 전세계적으로 매년 중증 병의 3백만 내지 5백만 사례 그리고 250,000 및 500,000 사망을 초래한다. 미국에서만, 전체 인구의 5% 내지 20%가 매년 인플루엔자 바이러스에 감염되고, 대다수의 이들 감염은 인플루엔자 A 바이러스에 의해 야기된다. (참고, 예를 들면, Dushoff et al., (2006) Am J Epidemiology 163:181-187; Thompson et al., (2004) JAMA 292:1333-1340; Thompson et al., (2003) JAMA 289:179-186). 그러나, 인플루엔자 B 바이러스 감염은 미국에서만 해마다 대략 10,000-100,000 입원된 인플루엔자 사례를 차지하여, 해마다 높은 가변성을 나타낸다 (1%-40%의 모든 입원된 인플루엔자 바이러스 사례는 인플루엔자 B 바이러스 감염이고, 평균 17%이다). (참고: Zhou et al (2012) Clin Inf Dis 54:1427-1436). 건강 관리 비용 및 손실 생산성의 이유로 인플루엔자 바이러스 감염에 관련된 부담이 광범위하다. 입원 및 사망은 주로 고위험 그룹, 예컨대 노인, 소아, 및 만성 환자에게서 발생한다.

뉴라민가수분해효소(neuraminidase) 억제제는 인플루엔자 A 및 B 바이러스 감염의 외래환자 치료 및 예방으로 승인된다. 오셀타미비르 (Tamiflu®)는 인플루엔자 A 및 B 바이러스 감염에 대해 널리 사용된 예방적 및 초기 치료적 처치 옵션이다. (참고, 예를 들면, Kandel and Hartshorn (2001) BioDrugs: Clinical Immunotherapy, Biopharmaceuticals and Gene Therapy 15:303-323; Nicholson et al., (2000) Lancet 355:1845-1850; Treanor et al., (2000) JAMA 283:1016-1024; 및 Welliver et al., (2001) JAMA 285:748-754). 그러나, 오셀타미비르 처치는 유의미한 임상 이득을 제공하기 위해 증상 개시의 48 시간 이내에 시작해야 한다. (참고, 예를 들면, Aoki et al (2003) J Antimicrobial Chemotherapy 51:123-129). 상기 의무는 처치를 찾을 때 최적의 48-시간 처치 기간을 전형적으로 넘어서는 중증 환자를 치료하는 오셀타미비르의 능력을 약화시킨다. 추가로, 오셀타미비르는 인플루엔자 A 바이러스 감염 치료에 비해 인플루엔자 B 바이러스 감염 치료에 덜 효과적이고, 아마 부분적으로 인플루엔자 A 뉴라민가수분해효소에 대한 것에 비해 인플루엔자 B 뉴라민가수분해효소에 대한 그 10-배 높은 IC50 값 때문이다. 따라서, 입원된 인플루엔자 B 바이러스 감염된 환자를 치료하기 위해 인플루엔자 B 바이러스 치료제를 확인하는데 유의미한 중점을 두고 있다.

1988년 - 1989년 동안, 인플루엔자 B 바이러스의 2개의 크게 뚜렷이 다른 항원성 변이체가 선구 인플루엔자 B 바이러스 계통으로부터 출현되었다. 이들 바이러스는 인플루엔자 B 바이러스 B/빅토리아/2/87 또는 B/야마가타/16/88에 항원성으로 관련되었다. (참고, 예를 들면, Rota et al. (1990) Virology 175:59-68). 따라서 인플루엔자 B 바이러스의 선구, 빅토리아, 및 야마가타 계통에 대하여 효과적인 인플루엔자 B 바이러스 감염에 대한 요법을 개발하는 것이 바람직하다.

최근 보고는 혈구응집소에 결합하고 인플루엔자 B 바이러스를 중화시키는 단클론성 항체 (mAb)를 기재하고 있다. (참고: Kubota-Koketsu et al. (2009) Biochem Biophys Res Comm 387:180-185; Yasugi et al. (2013) PLOS Pathogens 9:e1003150, 1-12; Dreyfus et al. (2012) Science Express 337:1343-1348; 국제 출원 공개 번호 WO 2013/007770, WO 2013/132007, WO 2013/114885, WO 2010/073647, 및 미국 출원 공개 번호 US 2009/0092620, US 2011/0319600, 및 US 2011/0319660).

이들 보고에도 불구하고, 선구, 야마가타, 및 빅토리아 계통의 인플루엔자 B 바이러스 감염의 치료 또는 예방에 효과적인 인플루엔자 B 바이러스 요법을 포함하여, 넓은 범위의 인플루엔자 B 바이러스 균주에 대하여 효과적인 신규 인플루엔자 B 바이러스 요법에 대한 필요성이 여전히 당해기술에서 존재한다. 본 발명은 이러한 필요성을 충족시키고 그리고 인플루엔자 B 바이러스 감염의 치료 및 예방을 위한 다른 이점을 제공한다.

본 발명의 요약

본 발명은 항-인플루엔자 B 바이러스 혈구응집소 항체 (즉, 항-혈구응집소 항체, 항-인플루엔자 B 바이러스 항체), 항-인플루엔자 B 바이러스 혈구응집소 항체를 포함하는 조성물, 및 이의 사용 방법을 제공한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 단리된 항-혈구응집소 항체는 3개의 중쇄 초가변 영역 (HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3) 및 3개의 경쇄 초가변 영역 (HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3)을 포함하고, 여기에서,

(a) HVR-H1은 서열 식별 번호:61의 아미노산 서열을 포함하고;

(b) HVR-H2는 서열 식별 번호:64 및 65로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;

(c) HVR-H3은 서열 식별 번호:75의 아미노산 서열을 포함하고;

(d) HVR-L1은 서열 식별 번호:55의 아미노산 서열을 포함하고;

(e) HVR-L2는 서열 식별 번호:57의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고

(f) HVR-L3은 서열 식별 번호:59의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 적어도 1, 2, 3, 4, 5 및/또는 6개의 초가변 영역 (HVR) 서열을 포함하는 단리된 항-혈구응집소 항체를 제공하고, 여기에서,

(a) HVR-H1은 서열 식별 번호:61의 아미노산 서열을 포함하고;

(c) HVR-H3은 서열 식별 번호:75의 아미노산 서열을 포함하고;

(d) HVR-L1은 서열 식별 번호:55의 아미노산 서열을 포함하고;

(f) HVR-L3은 서열 식별 번호:59의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 3개의 경쇄 초가변 영역 (HVR-L1, HVR-L2, 및 LVR-L3)을 포함하는 단리된 항-혈구응집소 항체를 제공하고, 여기에서,

(a) HVR-L1은 서열 식별 번호:55의 아미노산 서열을 포함하고;

(b) HVR-L2는 서열 식별 번호:57의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고

(c) HVR-L3은 서열 식별 번호:59의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 3개의 중쇄 초가변 영역 (HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3)을 포함하는 단리된 항-혈구응집소 항체를 제공하고, 여기에서,

(a) HVR-H1은 서열 식별 번호:61의 아미노산 서열을 포함하고;

(b) HVR-H2는 서열 식별 번호:64 및 65로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고

(c) HVR-H3은 서열 식별 번호:75의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 적어도 1, 2, 및/또는 3개의 경쇄 초가변 영역 (HVR) 서열을 포함하는 단리된 항-혈구응집소 항체를 제공하고, 여기에서,

(a) HVR-L1은 서열 식별 번호:55의 아미노산 서열을 포함하고;

(c) HVR-L3은 서열 식별 번호:59의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 적어도 1, 2, 및/또는 3개의 중쇄 초가변 영역 (HVR) 서열을 포함하는 단리된 항-혈구응집소 항체를 제공하고, 여기에서,

(a) HVR-H1은 서열 식별 번호:61의 아미노산 서열을 포함하고;

(c) HVR-H3은 서열 식별 번호:75의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 단리된 항-혈구응집소 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 상기 중쇄 가변 영역은 서열 식별 번호:79 및 83으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열 식별 번호:78, 82, 및 86으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 단리된 항-혈구응집소 항체는 서열 식별 번호:78, 82, 및 86으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 단리된 항-혈구응집소 항체는 서열 식별 번호:79 및 83으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 단리된 항-혈구응집소 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서 중쇄는 서열 식별 번호:81, 85, 및 88로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열 식별 번호:80, 84, 및 87로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 단리된 항-혈구응집소 항체는 서열 식별 번호:80, 84, 및 87로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 단리된 항-혈구응집소 항체는 서열 식별 번호:81, 85, 및 88로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.

(a) HVR-H1은 서열 식별 번호:62의 아미노산 서열을 포함하고;

(b) HVR-H2는 서열 식별 번호:66의 아미노산 서열을 포함하고;

(c) HVR-H3은 서열 식별 번호:76의 아미노산 서열을 포함하고;

(d) HVR-L1은 서열 식별 번호:55의 아미노산 서열을 포함하고;

(f) HVR-L3은 서열 식별 번호:59의 아미노산 서열을 포함한다.

(a) HVR-H1은 서열 식별 번호:62의 아미노산 서열을 포함하고;

(b) HVR-H2는 서열 식별 번호:66의 아미노산 서열을 포함하고;

(c) HVR-H3은 서열 식별 번호:76의 아미노산 서열을 포함하고;

(d) HVR-L1은 서열 식별 번호:55의 아미노산 서열을 포함하고;

(f) HVR-L3은 서열 식별 번호:59의 아미노산 서열을 포함한다.

(a) HVR-L1은 서열 식별 번호:55의 아미노산 서열을 포함하고;

(c) HVR-L3은 서열 식별 번호:59의 아미노산 서열을 포함한다.

(a) HVR-H1은 서열 식별 번호:62의 아미노산 서열을 포함하고;

(b) HVR-H2는 서열 식별 번호:66의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고

(c) HVR-H3은 서열 식별 번호:76의 아미노산 서열을 포함한다.

(a) HVR-L1은 서열 식별 번호:55의 아미노산 서열을 포함하고;

(c) HVR-L3은 서열 식별 번호:59의 아미노산 서열을 포함한다.

(a) HVR-H1은 서열 식별 번호:62의 아미노산 서열을 포함하고;

(c) HVR-H3은 서열 식별 번호:76의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 단리된 항-혈구응집소 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 중쇄 가변 영역은 서열 식별 번호:89의 아미노산을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열 식별 번호:78의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 단리된 항-혈구응집소 항체는 서열 식별 번호:78의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 단리된 항-혈구응집소 항체는 서열 식별 번호:89의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 단리된 항-혈구응집소 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서 중쇄는 서열 식별 번호:90의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열 식별 번호:80의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 단리된 항-혈구응집소 항체는 서열 식별 번호:80의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 단리된 항-혈구응집소 항체는 서열 식별 번호:90의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.

(a) HVR-H1은 서열 식별 번호:63의 아미노산 서열을 포함하고;

(b) HVR-H2는 서열 식별 번호:67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 및 74로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;

(c) HVR-H3은 서열 식별 번호:77의 아미노산 서열을 포함하고;

(d) HVR-L1은 서열 식별 번호:56의 아미노산 서열을 포함하고;

(e) HVR-L2는 서열 식별 번호:58의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고

(f) HVR-L3은 서열 식별 번호:60의 아미노산 서열을 포함한다.

(a) HVR-H1은 서열 식별 번호:63의 아미노산 서열을 포함하고;

(c) HVR-H3은 서열 식별 번호:77의 아미노산 서열을 포함하고;

(d) HVR-L1은 서열 식별 번호:56의 아미노산 서열을 포함하고;

(f) HVR-L3은 서열 식별 번호:60의 아미노산 서열을 포함한다.

(a) HVR-L1은 서열 식별 번호:56의 아미노산 서열을 포함하고;

(b) HVR-L2는 서열 식별 번호:58의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고

(c) HVR-L3은 서열 식별 번호:60의 아미노산 서열을 포함한다.

(a) HVR-H1은 서열 식별 번호:63의 아미노산 서열을 포함하고;

(b) HVR-H2는 서열 식별 번호:67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 및 74로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고

(c) HVR-H3은 서열 식별 번호:77의 아미노산 서열을 포함한다.

(a) HVR-L1은 서열 식별 번호:56의 아미노산 서열을 포함하고;

(c) HVR-L3은 서열 식별 번호:60의 아미노산 서열을 포함한다.

(a) HVR-H1은 서열 식별 번호:63의 아미노산 서열을 포함하고;

(c) HVR-H3은 서열 식별 번호:77의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 단리된 항-혈구응집소 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 중쇄 가변 영역은 서열 식별 번호:92, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 및 107로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열 식별 번호:91의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 단리된 항-혈구응집소 항체는 서열 식별 번호:91의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 단리된 항-혈구응집소 항체는 서열 식별 번호:92, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 및 107로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 단리된 항-혈구응집소 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서 중쇄는 서열 식별 번호:94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 및 108로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열 식별 번호:93의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 단리된 항-혈구응집소 항체는 서열 식별 번호:93의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 단리된 항-혈구응집소 항체는 서열 식별 번호:94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 및 108로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 단리된 항-혈구응집소 항체는 단클론성 항체이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 단리된 항-혈구응집소 항체는 인플루엔자 B 바이러스 혈구응집소를 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 단리된 항-혈구응집소 항체는 인플루엔자 B 바이러스 혈구응집소에 특이적으로 결합하는 단리된 항-혈구응집소 단클론성 항체이다.

본 발명은 또한 본 발명의 항-혈구응집소 항체를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 항-혈구응집소 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 벡터는 임의의 유형, 예를 들면, 재조합 벡터 예컨대 발현 벡터일 수 있다. 임의의 다양한 숙주 세포가 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 숙주 세포는 원핵 세포, 예를 들면, E. 콜리이다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들면, 포유동물 세포, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다.

본 발명은 추가로, 본 발명의 항-혈구응집소 항체의 제조 방법을 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 항-혈구응집소 항체 (이는, 본원에서 정의된 바와 같이, 전장 항체 및 그 단편을 포함한다)의 제조 방법을 제공하고, 상기 방법은 항-혈구응집소 항체 또는 그 단편을 암호화하는 본 발명의 재조합 벡터를 적합한 숙주 세포에서 발현하여 항체 또는 그 단편이 생산되는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 본 발명의 항-혈구응집소 항체 (또는 그 단편)를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양시켜 핵산이 발현되는 것을 포함한다. 상기 방법은 추가로, 숙주 세포 배양 또는 숙주 세포 배양 배지로부터 항-혈구응집소 항체 또는 그 단편을 회수하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 항-혈구응집소 항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 제형을 제공한다. 약제학적 제형은 추가로, 추가의 치료제 (예를 들면, 뉴라민가수분해효소 억제제, 예컨대 오셀타미비르 또는 자나미비르; 또 다른 항체, 예컨대 또 다른 항-혈구응집소 항체 또는 항-M2 항체; 등)을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 항-혈구응집소 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 추가로, 추가의 치료제 (예를 들면, 뉴라민가수분해효소 억제제, 예컨대 오셀타미비르 또는 자나미비르; 또 다른 항체, 예컨대 또 다른 항-혈구응집소 항체 또는 항-M2 항체; 등)을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 인플루엔자 B 바이러스 감염의 예방에서 사용하기 위한 본 발명의 항-혈구응집소 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 인플루엔자 B 바이러스 감염의 예방에 사용하기 위한 본 발명의 항-혈구응집소 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 추가로, 인플루엔자 B 바이러스 감염의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항-혈구응집소 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 인플루엔자 B 바이러스 감염의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항-혈구응집소 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 추가로, 인플루엔자 B 바이러스 감염의 억제에 사용하기 위한 본 발명의 항-혈구응집소 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 인플루엔자 B 바이러스 감염의 억제에 사용하기 위한 본 발명의 항-혈구응집소 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 항-혈구응집소 항체를 포함하는 조성물은 또한 약제의 제조에서 사용될 수 있다. 약제는 인플루엔자 B 바이러스 감염의 억제, 치료, 또는 예방에서 사용하기 위한 것일 수 있다. 특정 구현예에서, 약제는 추가로, 추가의 치료제 (예를 들면, 뉴라민가수분해효소 억제제, 예컨대 오셀타미비르 또는 자나미비르; 또 다른 항체, 예컨대 또 다른 항-혈구응집소 항체 또는 항-M2 항체; 등)을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 인플루엔자 B 바이러스 감염의 억제 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 항-혈구응집소 항체를 포함하는 조성물의 유효량을 필요한 대상체에게 투여하고, 그렇게 함으로써 인플루엔자 B 바이러스 감염을 억제하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 인플루엔자 B 바이러스 감염의 치료 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 항-혈구응집소 항체를 포함하는 조성물의 유효량을 필요한 대상체에게 투여하고, 그렇게 함으로써 인플루엔자 B 바이러스 감염을 치료하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 인플루엔자 B 바이러스 감염의 예방 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 항-혈구응집소 항체를 포함하는 조성물의 유효량을 필요한 대상체에게 투여하고, 그렇게 함으로써 인플루엔자 B 바이러스 감염을 예방하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 인플루엔자 B 바이러스 감염의 억제, 치료, 또는 예방 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 항-혈구응집소 항체를 포함하는 조성물의 유효량을 필요한 환자에게 투여하고, 그리고 추가의 치료제의 유효량을 환자에게 투여하고, 그렇게 함으로써 인플루엔자 B 바이러스 감염을 억제, 치료, 또는 예방하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 추가의 치료제는 뉴라민가수분해효소 억제제, 예컨대 오셀타미비르 또는 자나미비르이다. 다른 구현예에서, 추가의 치료제는 또 다른 항-혈구응집소 항체이다. 추가의 다른 구현예에서, 추가의 치료제는 항-M2 항체이다. 상기 병용 치료의 다양일 양태에서, 치료제는 거의 동시에 투여되거나, 함께 투여되거나, 또는 순차적으로 또는 연속적으로 투여된다. 특정 구현예에서, 항-뉴라민가수분해효소 억제제는 본 발명의 항-혈구응집소 항체의 투여에 앞서 투여된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-인플루엔자 B 바이러스 혈구응집소 항체는, 선구, 야마가타, 및 빅토리아 계통을 포함하여, 상이한 계통의 인플루엔자 B 바이러스 균주로부터 인플루엔자 B 바이러스 감염의 중화, 억제, 치료, 또는 예방에 효과적이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 약제의 제조에서 본 발명의 항-혈구응집소 항체의 용도를 제공한다. 약제는 인플루엔자 B 바이러스 감염의 억제, 치료, 또는 예방에서 사용하기 위한 것일 수 있다. 특정 구현예에서, 약제는 추가로, 추가의 치료제 (예를 들면, 뉴라민가수분해효소 억제제, 예컨대 오셀타미비르 또는 자나미비르; 또 다른 항체, 예컨대 또 다른 항-혈구응집소 항체 또는 항-M2 항체; 등)를 포함할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 약제의 제조에서 본 발명의 핵산의 용도를 제공한다. 약제는 인플루엔자 B 바이러스 감염의 억제, 치료, 또는 예방에서 사용하기 위한 것일 수 있다. 특정 구현예에서, 약제는 추가로, 추가의 치료제 (예를 들면, 뉴라민가수분해효소 억제제, 예컨대 오셀타미비르 또는 자나미비르; 또 다른 항체, 예컨대 또 다른 항-혈구응집소 항체 또는 항-M2 항체; 등)을 포함할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 약제의 제조에서 본 발명의 발현 벡터의 용도를 제공한다. 약제는 인플루엔자 B 바이러스 감염의 억제, 치료, 또는 예방에서 사용하기 위한 것일 수 있다. 특정 구현예에서, 약제는 추가로, 추가의 치료제 (예를 들면, 뉴라민가수분해효소 억제제, 예컨대 오셀타미비르 또는 자나미비르; 또 다른 항체, 예컨대 또 다른 항-혈구응집소 항체 또는 항-M2 항체; 등)을 포함할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 약제의 제조에서 본 발명의 숙주 세포의 용도를 제공한다. 약제는 인플루엔자 B 바이러스 감염의 억제, 치료, 또는 예방에서 사용하기 위한 것일 수 있다. 특정 구현예에서, 약제는 추가로, 추가의 치료제 (예를 들면, 뉴라민가수분해효소 억제제, 예컨대 오셀타미비르 또는 자나미비르; 또 다른 항체, 예컨대 또 다른 항-혈구응집소 항체 또는 항-M2 항체; 등)을 포함할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 약제의 제조에서 본 발명의 제조 물품의 용도를 제공한다. 약제는 인플루엔자 B 바이러스 감염의 억제, 치료, 또는 예방에서 사용하기 위한 것일 수 있다. 특정 구현예에서, 약제는 추가로, 추가의 치료제 (예를 들면, 뉴라민가수분해효소 억제제, 예컨대 오셀타미비르 또는 자나미비르; 또 다른 항체, 예컨대 또 다른 항-혈구응집소 항체 또는 항-M2 항체; 등)을 포함할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 약제의 제조에서 본 발명의 키트의 용도를 제공한다. 약제는 인플루엔자 B 바이러스 감염의 억제, 치료, 또는 예방에서 사용하기 위한 것일 수 있다. 특정 구현예에서, 약제는 추가로, 추가의 치료제 (예를 들면, 뉴라민가수분해효소 억제제, 예컨대 오셀타미비르 또는 자나미비르; 또 다른 항체, 예컨대 또 다른 항-혈구응집소 항체 또는 항-M2 항체; 등)을 포함할 수 있다.

다양일 양태에서, 본 발명의 항-혈구응집소 항체는 인플루엔자 B 바이러스의 혈구응집소를 결합한다. 다른 측면에서, 본 발명의 항-혈구응집소 항체는 혈구응집소에 결합하고 인플루엔자 B 바이러스를 중화시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-혈구응집소 항체는 인플루엔자 B 바이러스를 시험관내, 생체내, 또는 시험관내 및 생체내 중화시킨다.

도 1 (A 및 B)는 각각 단클론성 항체 34B5A 및 단클론성 항체 33F8에 의해 다양한 인플루엔자 B 바이러스 단리물의 시험관내 중화를 보여주는 데이타를 설명한다.
도 2는 단클론성 항체 46B8A에 의해 다양한 인플루엔자 B 바이러스 단리물의 시험관내 중화를 보여주는 데이타를 설명한다.
도 3은 혈구응집반응 억제에서 단클론성 항체 34B5C 및 단클론성 항체 46B8C의 효과를 보여주는 데이타를 설명한다.
도 4는 시험관내 플라크 억제 검정으로 단클론성 항체 46B8C에 의해 다양한 인플루엔자 B 바이러스 단리물의 중화를 보여주는 데이타를 설명한다.
도 5는 혈구응집소-매개된 세포-세포 융합에서 단클론성 항체 34B5C 및 단클론성 항체 46B8C의 효과를 보여주는 데이타를 설명한다.
도 6a 및 6b는 인플루엔자 B 바이러스 B/빅토리아/2000으로 감염되고 그리고 오셀타미비르 (타미플루) 투여된 마우스의 것 (도 6b)에 비교하여 다양한 양의 단클론성 항체 34B5A (도 6a) 투여된 마우스의 퍼센트 생존을 보여주는 데이타를 설명한다.
도 7a 및 7b는 인플루엔자 B 바이러스 B/위스콘신/2000으로 감염되고 각각 48 시간 후-감염 또는 72　시간 후-감염으로 다양한 양의 단클론성 항체 34B5C 투여된 마우스의 퍼센트 생존을 보여주는 데이타를 설명한다.
도 8a, 8b, 8c, 및 8d는 각각 인플루엔자 B 바이러스 B/위스콘신/2010, B/빅토리아/2000, B/러시아/1969, 및 B/매사추세츠/1966으로 감염되고 24, 48, 또는 72 시간 후-감염으로 단클론성 항체 46B8C 투여된 마우스의 퍼센트 생존을 보여주는 데이타를 설명한다.
도 9a 및 9b는 각각 인플루엔자 B 바이러스 B/위스콘신/2010 및 B/빅토리아/2000으로 감염되고 72 시간 후-감염으로 다양한 양의 단클론성 항체 46B8C 투여된 마우스의 퍼센트 생존을 보여주는 데이타를 설명한다.
도 10a 및 10b는 각각 인플루엔자 B 바이러스 B/빅토리아/2000으로 감염되고 단클론성 항체 46B8C 또는 오셀타미비르 (타미플루) 투여된 마우스의 퍼센트 생존 및 퍼센트 체중 (BW) 변화를 보여주는 데이타를 설명한다.
도 11a 및 11b는 마우스에서 각각 퍼센트 생존 및 바이러스 폐 역가에 단독으로 또는 병용하여 단클론성 항체 46B8C 및 오셀타미비르 (타미플루) 투여의 효과를 보여주는 데이타를 설명한다.
도 12a 및 12b는 단클론성 항체 46B8C 및 오셀타미비르 (타미플루) 공동-투여의 효과를 보여주는 데이타를 설명한다.
도 13은 본 발명의 항-인플루엔자 B 바이러스 항체의 경쇄 및 중쇄 초가변 영역의 아미노산 서열을 설명한다.
도 14는 mAb 34B5A의 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역, 경쇄, 및 중쇄의 아미노산 서열을 설명한다.
도 15는 mAb 34B5B의 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역, 경쇄, 및 중쇄의 아미노산 서열을 설명한다.
도 16은 mAb 34B5C의 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역, 경쇄, 및 중쇄의 아미노산 서열을 설명한다.
도 17은 mAb 33F8의 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역, 경쇄, 및 중쇄의 아미노산 서열을 설명한다.
도 18은 mAb 46B8A의 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역, 경쇄, 및 중쇄의 아미노산 서열을 설명한다.
도 19는 mAb 46B8B의 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역, 경쇄, 및 중쇄의 아미노산 서열을 설명한다.
도 20은 mAb 46B8C의 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역, 경쇄, 및 중쇄의 아미노산 서열을 설명한다.
도 21은 mAb 46B8D의 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역, 경쇄, 및 중쇄의 아미노산 서열을 설명한다.
도 22는 mAb 46B8E의 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역, 경쇄, 및 중쇄의 아미노산 서열을 설명한다.
도 23은 mAb 46B8F의 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역, 경쇄, 및 중쇄의 아미노산 서열을 설명한다.
도 24는 mAb 46B8G의 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역, 경쇄, 및 중쇄의 아미노산 서열을 설명한다.
도 25는 mAb 46B8H의 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역, 경쇄, 및 중쇄의 아미노산 서열을 설명한다.
도 26a 및 26b는 인플루엔자 B 바이러스 B/브리즈번/2008로 감염되고 단클론성 항체 46B8C 투여된 마우스 각각의 퍼센트 생존 및 퍼센트 체중 (BW) 변이를 보여주는 데이타를 설명한다.

I. 정의

본원에서 목적으로 "수용체 인간 프레임워크"는 아래에서 정의된 바와 같이 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유도된 경쇄 가변 도메인 (VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인 (VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크 "로부터 유도된" 수용체 인간 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 아미노산 서열 변이를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 변이의 수는 10 또는 그 미만, 9 또는 그 미만, 8 또는 그 미만, 7 또는 그 미만, 6 또는 그 미만, 5 또는 그 미만, 4 또는 그 미만, 3 또는 그 미만, 또는 2 또는 그 미만이다. 일부 구현예에서, VL 수용체 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 동일한 서열이다.

"친화성"은 분자 (예를 들면, 항체)의 단일 결합 부위와 그 결합 파트너 (예를 들면, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 다르게 명시되지 않으면, 본원에서 사용된 바와 같이, "결합 친화성"은 결합 쌍 (예를 들면, 항체 및 항원)의 구성원 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화성을 지칭한다. 그 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타낼 수 있다. 친화성은 본원에서 기재된 것을 포함하여 당해분야에서 공지된 공통의 방법으로 측정될 수 있다. 결합 친화성 측정을 위한 구체적인 예증적 및 예시적 구현예는 하기에 기재된다.

"친화성 성숙된" 항체는 하기 변경을 갖지 않는 모 항체에 비해 하나 이상의 초가변 영역 (HVRs)에서 하나 이상의 변경을 갖는 항체를 지칭하고, 상기 변경은 항원에 대한 항체의 친화성에서의 개선을 초래한다.

용어들 "항-혈구응집소 항체" 및 "혈구응집소에 결합하는 항체"는 혈구응집소를 충분한 친화성으로 결합하는 항체를 지칭하고, 이로써, 상기 항체는, 인플루엔자 바이러스의 표적 혈구응집소를 포함하여, 표적 혈구응집소에서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하다. 일 구현예에서, 관련없는, 비-혈구응집소 단백질에 항-혈구응집소 항체의 결합 범위는, 예를 들면, 방사선면역검정 (RIA)에 의해, 측정된 바와 같이 혈구응집소에 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 구현예에서, 혈구응집소에 결합하는 항체는 ≤　1μM, ≤　100 nM, ≤　10 nM, ≤　1 nM, ≤　0.1 nM, ≤　0.01 nM, 또는 ≤　0.001 nM (예를 들면, 10^-8M 또는 그 미만, 예를 들면, 10^-8M 내지 10^-13M, 예를 들면, 10^-9M 내지 10^-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 특정 구현예에서, 항-혈구응집소 항체는 상이한 균주, 하위유형, 및 인플루엔자 B 바이러스의 단리물로부터 혈구응집소중에 보존되는 인플루엔자 B 바이러스의 혈구응집소의 에피토프, 예컨대 선구, 빅토리아, 또는 야마가타 계통의 인플루엔자 B 바이러스의 혈구응집소의 것에 결합한다.

본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고 이들이 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 동안, 비제한적으로 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체)를 포함하여, 다양한 항체 구조, 및 항체 단편을 포함한다.

"항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원을 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편은 또한 혈구응집소에 결합하고 인플루엔자 A 바이러스를 중화시키는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 비제한적으로 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; 2중체; 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자 (예를 들면, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.

참조 항체로서 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 검정에서 참조 항체의 그 항원에 결합을 50% 또는 그 초과만큼 차단하는 항체를 지칭하고, 반대로, 참조 항체는 경쟁 검정에서 항체의 그 항원에 결합을 50% 또는 그 초과만큼 차단한다. 예시적인 경쟁 검정이 본원에서 제공된다.

용어 "키메라성" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 공급원 또는 종으로부터 유도되는 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 공급원 또는 종으로부터 유도되는 항체를 지칭한다.

항체의 "부류"는 그 중쇄에 의해 보유되는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 5개의 주요 부류의 항체: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM가 있고, 그리고 몇 개의 이들은 추가로 하위부류 (이소형), 예를 들면, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁, 및 IgA₂로 분할될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 불린다.

본원에서 사용된 바와 같이 용어 "세포독성제"는 세포성 기능을 억제 또는 예방하고/하거나 세포사 또는 파괴를 일으키는 물질을 지칭한다. 세포독성제는, 비제한적으로, 방사성 동위원소 (예를 들면, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학치료제 또는 약물 (예를 들면, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알카로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로르암부실, 다우노루비신 또는 다른 개재 약물); 성장 억제성 제제; 효소 및 그 단편 예컨대 핵산분해 효소; 항생제; 독소 예컨대 소분자 독소 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성 독소, 단편 및/또는 그 변이체 포함; 및 아래 개시된 다양한 항종양 또는 항암제를 포함한다.

"효과기 기능"은, 항체 이소형에 따라 다양한, 항체의 Fc 영역에 기인하는 그 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 효과기 기능의 예는 하기를 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체의 하향 조절 (예를 들면, B 세포 수용체); 및 B 세포 활성화.

제제, 예를 들면, 약제학적 제형의 "효과적인 양"은 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량에서 시간의 기간동안 효과적인 양을 지칭한다.

본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 한정하는데 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226부터, 또는 Pro230부터 중쇄의 카복실-말단까지 확장한다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 라이신 (Lys447)은 존재할 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 다르게 구체화되지 않으면, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에 기재된 바와 같이, EU 넘버링 시스템, 또한 소위 EU 지수에 따른다.

"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3, 및 FR4로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기 서열로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

용어들 "전장 항체," "온전한 항체," 및 "전체의 항체"는 본원에서 상호교환적으로 본원에서 정의된 바와 같이 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 또는 천연 항체 구조에 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 지칭하는데 사용된다.

용어들 "숙주 세포," "숙주 세포주," 및 "숙주 세포 배양"은 상호교환적으로 사용되고, 상기 세포의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 도입되는 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "변형체" 및 "변형된 세포,"를 포함하고, 이는 계대의 수에 상관없이 1차 형질전환된 세포 및 이로부터 유도된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량이 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있지만, 돌연변이를 함유할 수 있다. 본래 변형된 세포에서 스크리닝된 또는 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에서 포함된다.

"인간 항체"는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 이용하는 비인간 공급원으로부터 유도된 혹은 인간 또는 인간 세포에 의해 생산된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의는 특이적으로 비인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다.

"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 통상적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위그룹부터이다. 일반적으로, 서열의 하위그룹은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3에서와 같은 하위그룹이다. 일 구현예에서, VL에 대해, 하위그룹은 Kabat et al, 상기에서와 같이 하위그룹 카파 I이다. 일 구현예에서, VH에 대해, 하위그룹은 Kabat et al., 상기에서와 같이 하위그룹 III이다.

"인간화" 항체는 비인간 HVR로부터 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터 아미노산 잔기를 포함하는 키메라성 항체를 지칭한다. 특정 구현예에서, 인간화 항체는 적어도 1개, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이고, 여기에서 HVR (예를 들면, CDR)의 실질적으로 모두는 비인간 항체의 것에 일치하고, 그리고 FR의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 항체의 것에 일치한다. 인간화 항체는 임의로 인간 항체로부터 유도된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들면, 비인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화처리되는 항체를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열 ("상보성 결정 영역" 또는 "CDR")에서 초가변성이고/이거나 구조적으로 정의된 루프 ("초가변성 루프")를 형성하고/하거나 항원-접촉 잔기 ("항원 접촉부")을 함유하는 항체 가변 도메인의 각각의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR을 포함한다: VH에서 3개 (H1, H2, H3), 및 VL에서 3개 (L1, L2, L3). 본원에서 예시적인 HVR은 하기를 포함한다:

(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3)에서 발생하는 초가변성 루프) (Chothia and Lesk, J. Mol . Biol. 196:901-917 (1987));

(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 및 95-102 (H3)에서 발생하는 CDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));

(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 및 93-101 (H3)에서 발생하는 항원 접촉부 (MacCallum et al. J. Mol . Biol. 262: 732-745 (1996)); 및

(d) HVR 아미노산 잔기 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), 및 94-102 (H3)을 포함하는, (a), (b), 및/또는 (c)의 조합.

다르게 명시되지 않으면, 가변 도메인 (예를 들면, FR 잔기)에서 HVR 잔기 및 다른 잔기는 Kabat et al., 상기에 따라 본원에서 넘버링된다.

"면역접합체"는 비제한적으로 세포독성제를 포함하여 하나 이상의 이형 분자(들)에 접합된 항체이다.

"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은, 비제한적으로, 사육된 동물 (예를 들면, 소, 양, 고양이, 개, 및 말), 영장류 (예를 들면, 인간 및 비인간 영장류 예컨대 원숭이), 토끼, 및 설치류 (예를 들면, 마우스 및 랫트)를 포함한다. 특정 구현예에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.

"단리된" 항체는 그 자연 환경의 성분으로부터 분리되는 것이다. 일부 구현예에서, 항체는, 예를 들면, 전기영동 (예를 들면, SDS-PAGE, 등전점 전기영동 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들면, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정된 바와 같이 95% 초과 또는 99% 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법의 검토를 위해, 다음을 참고한다: 예를 들면, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).

"단리된" 핵산은 그 자연 환경의 성분으로부터 분리되는 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 대개 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체외로 또는 그 천연 염색체 위치로부터 상이한 염색체 위치에 존재한다.

"항-혈구응집소 항체를 암호화하는 단리된 핵산"은, 단일 벡터 또는 별도 벡터에서 핵산 분자(들), 및 숙주 세포에서 하나 이상의 위치에 존재하는 핵산 분자(들)을 포함하여, 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 그 단편)을 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이 용어 "단클론성 항체"는 실질적으로 균질 항체의 모집단으로부터 수득된 항체를 지칭한다, 즉, 모집단을 포함하는 개별 항체는, 예를 들면, 천연 발생 돌연변이를 함유하거나 또는 단클론성 항체 제제의 생산 동안 발생하는 가능한 변이체 항체 (상기 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다)를 제외하고, 동일하고/하거나 동일한 에피토프를 결합한다. 전형적으로 상이한 결정인자 (에피토프)에 대하여 유도된 상이한 항체를 포함하는 다클론성 항체와 대조로, 단클론성 항체 제제의 각각의 단클론성 항체는 항원에서 단일 결정인자에 대해서 유도된다. 따라서, 변형제 "단클론성"은 항체의 실질적으로 균질 모집단으로부터 수득되는 바와 같이 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의해 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용되는 단클론성 항체는, 비제한적으로 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파아지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 형질전환 동물을 이용하는 방법을 포함하여, 다양한 기술에 의해 생산될 수 있고, 단클론성 항체의 상기 방법 및 다른 예시적인 방법은 본원에서 기재된다.

"노출된 항체"는 이형 모이어티 (예를 들면, 세포독성 모이어티) 또는 방사선표지에 접합되지 않은 항체를 지칭한다. 노출된 항체는 약제학적 제형에서 존재할 수 있다.

"천연 항체"는 가변 구조를 갖는 천연 발생 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들면, 천연 IgG 항체는, 이황화-결합되는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된, 약 150,000 달톤의 헤테로사량체성 당단백질이다. N- 부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 영역 (VH), 또한 소위 가변 중 도메인 또는 중쇄 가변 도메인, 그 다음 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2, 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N- 부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 영역 (VL), 또한 소위 가변 경 도메인 또는 경쇄 가변 도메인, 그 다음 불변 경 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 그 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반하여 2개의 유형, 소위 카파 (κ) 및 람다 (λ) 중 하나에 부여될 수 있다.

용어 "포장 삽입물"은 상기 치료 제품의 사용에 관한 지시, 용법, 투여량, 투여, 병용 요법, 사용금지사유 및/또는 경고에 대한 정보를 함유하는, 치료 제품의 상업적 패키지에 관례상 포함된 설명서를 지칭하는데 사용된다.

참조 폴리펩티드 서열에 대한 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은, 필요하면, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해, 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후, 그리고 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고, 참조 폴리펩티드 서열에서 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성 측정의 목적을 위한 정렬은, 예를 들면, 공공연하게 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하는 분야의 기술내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당해분야의 숙련가는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열 정렬을 위해 적절한 파라미터를 측정할 수 있다. 본원에서 목적으로, 그러나, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 발생된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨텍사(Genentech, Inc.)에 의해 저술되었고, 그리고 소스 코드는, 미국 저작권 등록 No. TXU510087로 등록되는, 미국 저작권청, 워싱턴 디.시., 20559에서 사용자 문서화로 파일링된다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아, 남부 샌프란시스코, 제넨텍사로부터 공공연하게 이용가능거나, 또는 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은, 디지털 유닉스 V4.0D를 포함하여, 유닉스 운영 체제에서 사용을 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 변하지 않는다.

ALIGN-2가 아미노산 서열 비교로 이용되는 상황에서, (주어진 아미노산 서열 B에 대한 특정 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 또는 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 대안적으로 표현될 수 있는) 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성은 하기와 같이 계산된다:

분획 X/Y의 100 배

여기에서, X는 A 및 B의 그 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 동일한 매치로서 점수화된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않으면, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성이 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 같지 않을 것임이 인식될 것이다. 다르게 구체적으로 지칭되지 않으면, 본원에서 사용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용한 직전 단락에서 기재된 바와 같이 수득된다.

용어 "약제학적 제형"은 그안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하기 위한 형태인, 그리고 제형이 투여되는 대상체에 허용불가능하게 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.

"약제학적으로 허용가능한 담체"는 대상체에 비독성인, 활성 성분 이외의, 약제학적 제형에서의 성분을 지칭한다. 약제학적으로 허용가능한 담체는, 비제한적으로, 버퍼, 부형제, 안정제, 또는 보존제를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이 용어 "혈구응집소"는 다르게 명시되지 않으면 임의의 인플루엔자 바이러스 공급원으로부터 임의의 천연 혈구응집소를 지칭한다. 상기 용어는 "전장" 미가공된 혈구응집소 뿐만 아니라 인플루엔자 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스-감염된 세포에서의 가공에서 기인하는 혈구응집소의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 혈구응집소의 천연 발생 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 다양한 인플루엔자 B 바이러스 균주 또는 계통으로부터 예시적인 혈구응집소 단백질의 아미노산 서열은 당해기술에서 쉽게 이용가능하다.

본원에서 사용된 바와 같이, "치료" (및 이의 문법적 변화 예컨대 "치료한다" 또는 "치료하는")는 치료받는 개체의 당연한 과정을 변경하기 위한 시도로 임상 처치를 지칭하고, 예방을 위해 또는 임상 병리학의 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는, 비제한적으로, 질환의 발생 또는 재발 예방 (예를 들면, 인플루엔자 B 바이러스 감염의 발생 또는 재발 예방), 증상의 감소 (예를 들면, 감소성) 또는 완화, 질환의 임의의 직접 또는 간접적 병리적 결과의 약화, 질환 진행의 속도 감소, 질환 상태의 완화 또는 일시적 처방, 및 차도 또는 개선된 예측을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 질환의 발달을 지연하기 위해 또는 질환의 진행을 늦추게 하기 위해 사용된다.

용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항원에 항체의 결합에 관여되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄 (VH 및 VL, 각각)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 초가변 영역 (HVR)을 포함한다. (참고, 예를 들면, Kindt et al. Kuby Immunology, 6^th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 더욱이, 특정한 항원을 결합하는 항체는 상보적 VL 또는 VH 도메인, 각각의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원을 결합하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 단리될 수 있다. 참고, 예를 들면, Portolano et al., J. Immunol . 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 연결되는 또 다른 핵산을 전파시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조로서 벡터 뿐만 아니라 도입되는 숙주 세포의 게놈 속으로 편입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 이들이 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 상기 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다.

II. 조성물 및 방법

일 측면에서, 본 발명은, 부분적으로, 항-혈구응집소 항체 및 그 용도에 기반한다. 특정 구현예에서, 혈구응집소에 결합하는 항체가 제공된다. 본 발명의 항체는, 예를 들면, 인플루엔자 A 바이러스 감염의 진단, 치료, 또는 예방에 유용하다.

A. 예시적인 항- 혈구응집소 항체

일 측면에서, 본 발명은 혈구응집소에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항-혈구응집소 항체는 혈구응집소에 결합하거나, 인플루엔자 B 바이러스로부터 혈구응집소에 결합하거나, 인플루엔자 B 바이러스의 야마가타 계통으로부터 혈구응집소에 결합하거나, 인플루엔자 B 바이러스의 빅토리아 계통으로부터 혈구응집소에 결합하거나, 인플루엔자 B 바이러스의 선구 계통으로부터 혈구응집소에 결합하거나, 또는 인플루엔자 B 바이러스의 야마가타 계통, 빅토리아 계통, 및 선구 계통으로부터 혈구응집소를 결합한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항-혈구응집소 항체는 인플루엔자 B 바이러스를 시험관내 중화시킨다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항-혈구응집소 항체는 인플루엔자 B 바이러스를 생체내 중화시킨다. 추가의 다른 구현예에서, 본 발명의 항-혈구응집소 항체는 인플루엔자 B 바이러스 감염을 감소시키거나, 인플루엔자 B 바이러스 감염을 예방하거나, 인플루엔자 B 바이러스 감염을 억제하거나, 또는 인플루엔자 B 바이러스 감염을 치료한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-혈구응집소 항체는 인플루엔자 바이러스 막과 감염된 세포 엔도좀 막 사이에 혈구응집소-매개된 융합을 예방하거나, 억제하거나, 또는 감소시킨다 (따라서 감염된 세포 세포질속으로 바이러스 RNA 진입 예방, 억제, 또는 감소, 따라서 인플루엔자 바이러스 감염의 추가 전파 예방, 억제, 또는 감소).

일 측면에서, 본 발명은 하기로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-혈구응집소 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 식별 번호:75의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 식별 번호:55의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 식별 번호:57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 식별 번호:59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.

일 측면에서, 본 발명은 하기로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-혈구응집소 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:65의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 식별 번호:75의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 식별 번호:55의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 식별 번호:57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 식별 번호:59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.

일 측면에서, 본 발명은 하기로부터 선택되는 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 식별 번호:75의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3.

일 측면에서, 본 발명은 하기로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:65의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 식별 번호:75의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:55의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 식별 번호:57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 식별 번호:59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 식별 번호:75의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 식별 번호:55의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 식별 번호:57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 식별 번호:59로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:65의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 식별 번호:75의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 식별 번호:55의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 식별 번호:57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 식별 번호:59로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.

또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 식별 번호:79 및 83으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 식별 번호:78, 82, 및 86으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 식별 번호:79 및 83으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 식별 번호:78, 82 및 86으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호:79의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 식별 번호:78의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호:83의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 식별 번호:82의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호:83의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 식별 번호:86의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 식별 번호:81, 85, 및 88로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 식별 번호:80, 84, 및 87로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 식별 번호:81, 85, 및 88로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 식별 번호:80, 84, 및 87로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호:81의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 식별 번호:80의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호:85의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 식별 번호:84로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호:88의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 식별 번호:87의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 제공한다.

일 측면에서, 본 발명은 하기로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-혈구응집소 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:66의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 식별 번호:76의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 식별 번호:55의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 식별 번호:57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 식별 번호:59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.

일 측면에서, 본 발명은 하기로부터 선택되는 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:66의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 식별 번호:76의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기로부터 선택되는 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:55의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 식별 번호:57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 식별 번호:59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:66의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 식별 번호:76의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 식별 번호:55의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 식별 번호:57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 식별 번호:59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.

또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 식별 번호:89의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 식별 번호:78의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호:89의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 식별 번호:78의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호:90의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 식별 번호:80의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 제공한다.

일 측면에서, 본 발명은 하기로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-혈구응집소 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 및 74로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 식별 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 식별 번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 식별 번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 식별 번호:60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.

일 측면에서, 본 발명은 하기로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-혈구응집소 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:67의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 식별 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 식별 번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 식별 번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 식별 번호:60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.

일 측면에서, 본 발명은 하기로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-혈구응집소 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:68의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 식별 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 식별 번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 식별 번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 식별 번호:60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.

일 측면에서, 본 발명은 하기로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-혈구응집소 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:69의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 식별 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 식별 번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 식별 번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 식별 번호:60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.

일 측면에서, 본 발명은 하기로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-혈구응집소 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:70의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 식별 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 식별 번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 식별 번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 식별 번호:60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.

일 측면에서, 본 발명은 하기로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-혈구응집소 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:71의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 식별 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 식별 번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 식별 번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 식별 번호:60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.

일 측면에서, 본 발명은 하기로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-혈구응집소 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:72의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 식별 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 식별 번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 식별 번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 식별 번호:60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.

일 측면에서, 본 발명은 하기로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-혈구응집소 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:73의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 식별 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 식별 번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 식별 번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 식별 번호:60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.

일 측면에서, 본 발명은 하기로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-혈구응집소 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 식별 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 식별 번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 식별 번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 식별 번호:60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.

일 측면에서, 본 발명은 하기로부터 선택되는 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:67의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 식별 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3.

일 측면에서, 본 발명은 하기로부터 선택되는 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:68의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 식별 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3.

일 측면에서, 본 발명은 하기로부터 선택되는 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:69의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 식별 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3.

일 측면에서, 본 발명은 하기로부터 선택되는 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:70의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 식별 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3.

일 측면에서, 본 발명은 하기로부터 선택되는 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:71의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 식별 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3.

일 측면에서, 본 발명은 하기로부터 선택되는 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:72의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 식별 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3.

일 측면에서, 본 발명은 하기로부터 선택되는 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:73의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 식별 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3.

일 측면에서, 본 발명은 하기로부터 선택되는 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 식별 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기로부터 선택되는 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 식별 번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 식별 번호:60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:67의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 식별 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 식별 번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 식별 번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 식별 번호:60으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:68의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 식별 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 식별 번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 식별 번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 식별 번호:60으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:69의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 식별 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 식별 번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 식별 번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 식별 번호:60으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:70의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 식별 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 식별 번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 식별 번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 식별 번호:60으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:71의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 식별 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 식별 번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 식별 번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 식별 번호:60으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:72의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 식별 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 식별 번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 식별 번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 식별 번호:60으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:73의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 식별 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 식별 번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 식별 번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 식별 번호:60으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열 식별 번호:63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 식별 번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 식별 번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 식별 번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 식별 번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 식별 번호:60으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.

또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 식별 번호:92, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 및 107로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 식별 번호:91의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 식별 번호:92, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 및 107로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 식별 번호:91의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호:92의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 식별 번호:91의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호:95의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 식별 번호:91의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호:97의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 식별 번호:91의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호:99의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 식별 번호:91의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호:101의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 식별 번호:91의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호:103의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 식별 번호:91의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호:105의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 식별 번호:91의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호:107의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 식별 번호:91의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 식별 번호:94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 및 108로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 식별 번호:93의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 식별 번호:94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 및 108로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 식별 번호:93의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호:94의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 식별 번호:93의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호:96의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 식별 번호:93의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호:98의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 식별 번호:93의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호:100의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 식별 번호:93의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호:102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 식별 번호:93의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호:104의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 식별 번호:93의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호:106의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 식별 번호:93의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호:108의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 식별 번호:93의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 제공한다.

임의의 상기 구현예에서, 본 발명의 항-혈구응집소 항체는 인간화된다. 일 구현예에서, 항-혈구응집소 항체는 임의의 상기 구현예에서와 같이 HVR를 포함하고, 그리고 추가로, 수용체 인간 프레임워크, 예를 들면, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 의 항-혈구응집소 항체는 서열 식별 번호:79, 83, 89, 92, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 및 107로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 관하여 치환 (예를 들면, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-혈구응집소 항체는 혈구응집소에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 구현예에서, 총 1 내지 10 아미노산은 서열 식별 번호:79, 83, 89, 92, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 또는 107에서 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 임의로, 항 혈구응집소 항체는, 그 서열의 번역후 변형을 포함하여, 서열 식별 번호:79, 83, 89, 92, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 또는 107에서 VH 서열을 포함한다.

또 다른 측면에서, 항-혈구응집소 항체가 제공되고, 여기서 상기 항체는 서열 식별 번호:78, 82, 86, 및 91로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 관하여 치환 (예를 들면, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-혈구응집소 항체는 혈구응집소에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 구현예에서, 총 1 내지 10 아미노산은 서열 식별 번호:78, 82, 86, 또는 91에서 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 임의로, 항-혈구응집소 항체는, 그 서열의 번역후 변형을 포함하여, 서열 식별 번호:78, 82, 86, 또는 91에서 VL 서열을 포함한다.

또 다른 측면에서, 항-혈구응집소 항체가 제공되고, 여기서 상기 항체는 상기 제공된 임의의 구현예에서와 같이 VH, 및 상기 제공된 임의의 구현예에서와 같이 VL을 포함한다. 일 구현예에서, 항체는, 그 서열의 번역후 변형을 포함하여, 서열 식별 번호:79, 83, 89, 92, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 또는 107 및 서열 식별 번호:78, 82, 86, 또는 91, 각각에서 VH 및 VL 서열을 포함한다.

추가 양태에서, 본 발명은 본원에서 제공된 항-혈구응집소 항체로서 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 예를 들면, 특정 구현예에서, 하기를 포함하는 항-혈구응집소 항체로서 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다: 서열 식별 번호:79의 VH 서열 및 서열 식별 번호:78의 VL 서열; 서열 식별 번호:83의 VH 서열 및 서열 식별 번호:82의 VL 서열; 서열 식별 번호:83의 VH 서열 및 서열 식별 번호:86의 VL 서열; 서열 식별 번호:89의 VH 서열 및 서열 식별 번호:78의 VL 서열; 서열 식별 번호:92의 VH 서열 및 서열 식별 번호:91의 VL 서열; 서열 식별 번호:95의 VH 서열 및 서열 식별 번호:91의 VL 서열; 서열 식별 번호:97의 VH 서열 및 서열 식별 번호:91의 VL 서열; 서열 식별 번호:99의 VH 서열 및 서열 식별 번호:91의 VL 서열; 서열 식별 번호:101의 VH 서열 및 서열 식별 번호:91의 VL 서열; 서열 식별 번호:103의 VH 서열 및 서열 식별 번호:91의 VL 서열; 서열 식별 번호:105의 VH 서열 및 서열 식별 번호:91의 VL 서열; 서열 식별 번호:107의 VH 서열 및 서열 식별 번호:91의 VL 서열.

본 발명의 추가 양태에서, 임의의 상기 구현예에 따른 항-혈구응집소 항체는, 키메라성, 인간화, 또는 인간 항체를 포함하여, 단클론성 항체이다. 일 구현예에서, 항-혈구응집소 항체는 항체 단편, 예를 들면, Fv, Fab, Fab', scFv, 2중체, 또는 F(ab')₂ 단편이다. 또 다른 구현예에서, 항체는 전장 항체, 예를 들면, 온전한, 예를 들면, IgG1 항체 또는 본원에서 정의된 바와 같이 다른 항체 부류 또는 이소형이다.

추가 양태에서, 임의의 상기 구현예에 따른 항-혈구응집소 항체는 아래 섹션 1-7에 기재된 바와 같이 단독으로 또는 조합으로 임의의 상기 특징을 편입시킬 수 있다.

1. 항체 친화성

특정 구현예에서, 본원에서 제공된 항체는 ≤　1μM, ≤　100 nM, ≤　10 nM, ≤　1 nM, ≤　0.1 nM, ≤　0.01 nM, 또는 ≤　0.001 nM (예를 들면, 10^-8M 또는 그 미만, 예를 들면, 10^-8M 내지 10^-13M, 예를 들면, 10^-9M 내지 10^-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다.

일 구현예에서, Kd는 방사선표지된 항원 결합 검정 (RIA)으로 측정된다. 일 구현예에서, RIA는 관심 항체 및 그 항원의 Fab 버전으로 수행된다. 예를 들면, 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화성은 비표지된 항원의 적정 시리즈의 존재하에 (¹²⁵I)-표지된 항원의 최소 농도로 Fab를 평형화하고, 그 다음 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포집함으로써 측정된다 (참고, 예를 들면, Chen et al., J. Mol . Biol . 293:865-881(1999)). 검정용 조건을 수립하기 위해, MICROTITER^® 다중-웰 플레이트 (Thermo Scientific)는 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6)에서 포집 항-Fab 항체 (Cappel Labs)의 5 μg/ml로 밤새 코팅되고, 그리고 그 뒤에 2 내지 5 시간동안 실온 (대략 23℃)에서 PBS내 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 차단된다. 비-흡착제 플레이트 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [¹²⁵I]-항원은 관심 Fab의 연속 희석으로 혼합된다 (예를 들면, 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치, Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). 그 다음 관심 Fab는 밤새 항온처리되지만; 그러나, 항온처리은 평형이 달성됨을 확인하기 위해 더 오랜 기간 (예를 들면, 약 65 시간)동안 계속할 수 있다. 그 후에, 혼합물은 실온에서 (예를 들면, 1 시간 동안) 항온처리을 위해 포집 플레이트로 이동된다. 그 다음 용액은 제거되고 플레이트는 PBS내 0.1% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20^®)으로 8회 세정된다. 플레이트가 건조된 경우, 150 μl/웰의 섬광제 (MICROSCINT-20^TM; Packard)가 부가되고, 그리고 플레이트는 10 분동안 TOPCOUNT^TM 감마 계수기 (Packard)로 계수된다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각각의 Fab의 농도는 경쟁적 결합 검정에서 사용을 위해 선택된다.

또 다른 구현예에 따르면, Kd는 BIACORE^® 표면 플라즈몬 공명 검정을 이용하여 측정된다. 예를 들면, BIACORE^®-2000 또는 BIACORE^®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 이용한 검정은 ~10 반응 유니트 (RU)에서 고정된 항원 CM5 칩으로 25 ℃에서 수행된다. 일 구현예에서, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIACORE, Inc.)은 공급자의 설명서에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시석신이미드 (NHS)로 활성화된다. 항원은 pH 4.8, 10 mM 아세트산나트륨으로 5 μg/ml (~0.2 μM)까지 희석되고, 그 다음 5 μl/분의 유속으로 주입되어 커플링된 단백질의 대략 10 반응 유니트 (RU)를 달성한다. 항원의 주입 이후, 1 M 에탄올아민이 미반응된 그룹을 차단하기 위해 주입된다. 동력학 측정을 위해, 대략 25 μl/분의 유속으로 25 ℃에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20^TM) 계면활성제 (PBST)를 갖는 PBS에서 Fab의 2-배 연속 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)은 주입된다. 회합 속도 (k_on) 및 해리 속도 (k_off)는 회합 및 해리 센서그램의 동시 핏팅에 의해 단순 일대일 랭뮈어 결합 모델 (BIACORE^® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 계산된다. 평형 해리 상수 (Kd)는 비 k_off/k_on 로서 계산된다. 참고, 예를 들면, Chen et al., J. Mol . Biol . 293:865-881 (1999). 만일 가역속도(on-rate)가 상기 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 10⁶ M^- ¹ s^-1 를 초과하면, 분광기, 예컨대 정지-유동 구비된 분광광도계 (Aviv Instruments) 또는 교반된 큐벳을 갖춘 8000-시리즈 SLM-AMINCO^TM 분광광도계 (ThermoSpectronic)에서 측정된 바와 같이 항원의 증가 농도의 존재하에 25 ℃에서 pH 7.2, PBS내 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 형광 방출 세기 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역통과)에서의 증가 또는 감소를 측정하는 형광성 켄칭 기술을 이용함으로써 가역 속도는 측정될 수 있다.

2. 항체 단편

특정 구현예에서, 본원에서 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은, 비제한적으로, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, Fv, 및 scFv 단편, 및 아래 기재된 다른 단편을 포함한다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, 참고 Hudson et al., Nat. Med . 9:129-134 (2003). scFv 단편의 검토를 위해, 참고, 예를 들면, Pluckthuen, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); 참고 또한 WO 93/16185; 및 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458. 에피토프 잔기에 결합하는 회수 수용체를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')₂ 단편의 논의를 위해, 다음을 참고한다: 미국 특허 번호 5,869,046.

2중체는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 다음을 참고한다: 예를 들면, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med . 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 6444-6448 (1993). 3중체 및 4중체가 또한 Hudson et al., Nat. Med . 9:129-134 (2003)에 기재된다.

단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 혹은 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구현예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체 (Domantis, Inc., Waltham, MA; 참고, 예를 들면, 미국 특허 번호 6,248,516 B1)이다.

항체 단편은, 본원에 기재된 바와 같이, 비제한적으로 온전한 항체의 단백분해 소화 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들면, E. 콜리 또는 파아지)에 의한 생산을 포함하여, 다양한 기술로 생산될 수 있다.

3. 키메라성 및 인간화 항체

특정 구현예에서, 본원에서 제공된 항체는 키메라성 항체이다. 특정 키메라성 항체는, 예를 들면, 미국 특허 번호 4,816,567; 및 Morrison et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 81:6851-6855 (1984))에 기재된다. 일 예에서, 키메라성 항체는 비인간 가변 영역 (예를 들면, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 또는 비인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유도된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가 예에서, 키메라성 항체는 부류 또는 하위부류가 모 항체의 것으로부터 변화되는 "스위칭된 부류" 항체이다. 키메라성 항체는 그 항원-결합 단편을 포함한다.

특정 구현예에서, 키메라성 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비인간 항체는 인간화되어 인간에 대한 면역원성을 감소하지만, 친계 비인간 항체의 특이성 및 친화성을 보유한다. 일반적으로, 인간화 항체는, HVR, 예를 들면, CDR, (또는 그 일부)가 비인간 항체로부터 유도되고, FR (또는 그 일부)가 인간 항체 서열로부터 유도되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 임의로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 또한 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 인간화 항체에서 일부 FR 잔기는 비인간 항체 (예를 들면, HVR 잔기가 유도되는 항체)로부터 상응하는 잔기로 치환되어, 예를 들면, 항체 특이성 또는 친화성을 회복 또는 개선한다.

인간화 항체 및 이의 제조 방법은, 예를 들면, Almagro and Fransson, Front. Biosci . 13:1619-1633 (2008)에서 검토되고, 그리고 추가로 하기에 기재된다: 예를 들면, Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad . Sci . USA 86:10029-10033 (1989); 미국 특허 번호 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (특이성 결정 영역 (SDR) 그라프팅 기재); Padlan, Mol . Immunol . 28:489-498 (1991) ("재표면화" 기재); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) ("FR 셔플링" 기재); 및 Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 셔플링에 대한 "유도된 선택" 접근법 기재).

인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 비제한적으로 하기를 포함한다: "최적화" 방법을 이용하여 선택된 프레임워크 영역 (참고, 예를 들면, Sims et al. J. Immunol . 151:2296 (1993)); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 하위그룹의 인간 항체의 공통 서열로부터 유도된 프레임워크 영역(참고, 예를 들면, Carter et al. Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol ., 151:2623 (1993)); 인간 성숙한 (체세포적으로 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역 (참고, 예를 들면, Almagro and Fransson, Front. Biosci . 13:1619-1633 (2008)); 및 스크리닝 FR 라이브러리로부터 유도된 프레임워크 영역 (참고, 예를 들면, Baca et al., J. Biol . Chem . 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol . Chem . 271:22611-22618 (1996)).

4. 인간 항체

특정 구현예에서, 본원에서 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당해기술에 공지된 다양한 기술을 이용하여 또는 본원에 기재된 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 van Dijk and van de Winkel, Curr . Opin . Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr . Opin . Immunol . 20:450-459 (2008)에 기재된다.

인간 항체는 항원성 유발에 대한 응답에서 온전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 온전한 항체를 생산하기 위해 변형되는 형질전환 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 상기 동물은 전형적으로, 내인성 면역글로불린 유전자좌를 대체하거나, 또는 염색체외로 존재하거나 동물의 염색체속에 무작위로 통합되는, 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유한다. 상기 형질전환 마우스에서, 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화된다. 형질전환 동물로부터 인간 항체를 수득하기 위한 방법의 검토를 위해, 참고 Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). 참고 또한, 예를 들면, XENOMOUSE^TM 기술을 기재하는 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584; HUMAB® 기술을 기재하는 미국 특허 번호 5,770,429; K-M MOUSE® 기술을 기재하는 미국 특허 번호 7,041,870, 및 VELOCIMOUSE® 기술을 기재하는 미국 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900). 상기 동물에 의해 발생된 온전한 항체로부터 인간 가변 영역은, 예를 들면, 상이한 인간 불변 영역과의 조합에 의해, 추가로 변형될 수 있다.

인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법으로 생산될 수 있다. 인간 단클론성 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주가 기재된다. (참고, 예를 들면, Kozbor J. Immunol ., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)). 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 발생된 인간 항체가 또한 Li et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 103:3557-3562 (2006)에 기재된다. 추가의 방법은, 예를 들면, 미국 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터 단클론성 인간 IgM 항체의 생산 기재) 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (인간-인간 하이브리도마 기재)에 기재된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마 기술)은 또한 Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)에 기재된다.

인간 항체는 또한 인간-유도된 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리시킴으로써 발생될 수 있다. 그 다음 상기 가변 도메인 서열은 원하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체 선택 기술은 아래에 기재되어 있다.

5. 라이브러리-유도된 항체

본 발명의 항체는 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체를 위해 조합 라이브러리 스크리닝에 의해 단리될 수 있다. 예를 들면, 파아지 디스플레이 라이브러리를 발생하기 위해 그리고 원하는 결합 특성을 보유하는 항체를 위한 상기 라이브러리를 스크리닝하기 위해 다양한 방법이 당해기술에 공지되어 있다. 상기 방법은, 예를 들면, Hoogenboom et al. Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)에서 검토되고, 추가로, 예를 들면, McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol . Biol . 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol . Biol . 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol . 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol . Methods 284(1-2): 119-132(2004).

특정 파아지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 별도로 클로닝되고 파아지 라이브러리에서 무작위로 재조합되며, 그 다음 Winter et al., Ann. Rev. Immunol ., 12: 433-455 (1994)에 기재된 바와 같이 항원-결합 파아지를 위해 스크리닝될 수 있다. 파아지는 전형적으로 단일-사슬 Fv (scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 나타낸다. 면역화된 공급원으로부터 라이브러리는 하이브리도마 구축의 요건 없이 면역원에 고--친화성 항체를 제공한다. 대안적으로, 단순 레퍼토리는 (예를 들면, 인간으로부터) 클로닝되어 Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)에 기재된 바와 같이 임의의 면역화 없이 광범위한 비자가 및 또한 자가 항원에 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 마지막으로, 단순 라이브러리는 또한 줄기세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 분절의 클로닝, 및 랜덤 서열을 함유하는 PCR 프라이머 이용에 의해 합성으로 생산되어, Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol ., 227: 381-388 (1992)에 의해 기재된 바와 같이, 고 가변 CDR3 영역을 암호화하고 재배열을 시험관내에서 달성할 수 있다. 인간 항체 파아지 라이브러리를 기재하는 특허 공개는 예를 들면 하기를 포함한다: 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 및 2009/0002360.

인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 고려된다.

6. 다중특이적 항체

특정 구현예에서, 본원에서 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들면, 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 단클론성 항체이다. 특정 구현예에서, 결합 특이성의 하나는 혈구응집소에 대한 것이고 다른 것은 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 혈구응집소의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 혈구응집소를 발현하는 세포에 세포독성제를 국소화하는데 사용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.

다중특이적 항체의 제조 기술은, 비제한적으로, 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현을 포함한다 (참고 Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, 및 Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), 및 "크놉-인-홀(knob-in-hole)" 엔지니어링 (참고, 예를 들면, 미국 특허 번호 5,731,168). 다중-특이적 항체는 또한 하기에 의해 제조될 수 있다: 항체 Fc-이종이량체성 분자 제조를 위한 정전기성 스티어링 효과의 조작 (WO　2009/089004A1); 2 또는 그 초과 항체 또는 단편의 가교결합 (참고, 예를 들면, 미국 특허 번호 4,676,980, 및 Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); 이중특이적 항체를 생산하기 위한 류신 지퍼의 이용 (참고, 예를 들면, Kostelny et al., J. Immunol ., 148(5):1547-1553 (1992)); 이중특이적 항체 단편 제조를 위한 "2중체" 기술의 이용 (참고, 예를 들면, Hollinger et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90:6444-6448 (1993)); 및 단일-사슬 Fv (sFv) 2량체의 이용 (참고, 예를 들면 Gruber et al., J. Immunol ., 152:5368 (1994)); 및 예를 들면, Tutt et al. J. Immunol . 147: 60 (1991)에 기재된 바와 같이 삼중특이적 항체의 제조.

"문어형(Octopus) 항체"를 포함하여, 3 또는 그 초과 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체는 또한 본원에서 포함된다 (참고, 예를 들면, US　2006/0025576A1).

본원에서 항체 또는 단편은 또한 혈구응집소 뿐만 아니라 또 다른, 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다 (참고, US　2008/0069820, 예를 들면).

7. 항체 변이체

특정 구현예에서, 본원에서 제공되는 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들면, 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열속으로 적절한 변형의 도입에 의해, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 상기 변형은, 예를 들면, 항체의 아미노산 서열 내에서 잔기의 결실, 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이 만들어져서 최종 작제물에 도달할 수 있다, 단, 최종 작제물은 원하는 특성, 예를 들면, 항원-결합을 보유한다.

a) 치환, 삽입, 및 결실 변이체

특정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환형 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 "바람직한 치환."의 제목하에 표 1에서 보여준다. 더욱 실질적인 변화는 "예시적 치환,"의 제목하에 표 1에서 제공되고, 아미노산 측쇄 부류를 참조로 아래 추가 기재된 바와 같다. 아미노산 치환은 관심 항체에 그리고, 원하는 활성, 예를 들면, 유지된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC를 위해 스크리닝된 생성물에 도입될 수 있다.

표 1

아미노산은 공통의 측쇄 특성에 따라 그룹화될 수 있다:

(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: His, Lys, Arg;

(5) 사슬 방향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

비-보존적 치환은 상기 부류의 하나의 구성원을 또 다른 부류로의 교환을 수반할 것이다.

치환형 변이체의 한 유형은 모 항체 (예를 들면 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기의 치환을 포함한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택되는 수득한 변이체(들)은 모 항체에 대하여 특정 생물학적 특성 (예를 들면, 증가된 친화성, 감소된 면역원성)에서 변형 (예를 들면, 개선)을 가질 것이고/이거나 모 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환형 변이체는, 예를 들면, 파아지 디스플레이-기반 친화성 성숙 기술 예컨대 본원에서 기재된 것을 이용하여 편리하게 발생될 수 있는 친화성 성숙된 항체이다. 간단히, 하나 이상의 HVR 잔기는 돌연변이되고 파아지에서 변이체 항체 표시되고 특정한 생물학적 활성 (예를 들면, 결합 친화성)을 위해 스크리닝된다.

변경 (예를 들면, 치환)은, 예를 들면, 항체 친화성을 개선하기 위해 HVR에서 실시될 수 있다. 상기 변경은 HVR "빈발영역(hotspot)" 즉, 체세포 성숙 공정 동안 높은 빈도로 돌연변이하는 코돈에 의해 암호화된 잔기 (참고, 예를 들면, Chowdhury, Methods Mol . Biol . 207:179-196 (2008)), 및/또는 항원을 접촉하는 잔기에 의해 실시될 수 있고, 수득한 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화성에 대해 시험된다. 작제 및 2차 라이브러리로부터의 재선택에 의한 친화성 성숙은, 예를 들면, Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))에 기재된다. 친화성 성숙의 일부 구현예에서, 다양성은 임의의 다양한 방법 (예를 들면, 오류유발 PCR, 사슬 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-유도된 돌연변이유발)에 의한 성숙화를 위해 선택된 가변 유전자에 다양성이 도입된다. 그 다음 2차 라이브러리가 제작된다. 그 다음 라이브러리는 스크리닝되어 원하는 친화성을 갖는 임의의 항체 변이체를 확인한다. 다양성을 도입하기 위한 또 다른 방법은 HVR-유도된 접근법을 포함하고, 여기에서 몇 개의 HVR 잔기 (예를 들면, 한번에 4-6 잔기)는 무작위화된다. 항원 결합에 관여된 HVR 잔기는, 예를 들면, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 특이적으로 확인될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3이 특히 종종 표적화된다.

특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 상기 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 HVR 내에서 발생할 수 있다. 예를 들면, 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들면, 본원에서 제공된 바와 같은 보존적 치환)은 HVR에서 실시될 수 있다. 상기 변경은, 예를 들면, HVR에서 항원 접촉 잔기의 외부일 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 구현예에서, 각각의 HVR은 미변경되거나, 또는 1, 2 또는 3 이하의 아미노산 치환을 함유한다.

돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 유용한 확인 방법은 Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085에 의해 기재된 바와 같이 소위 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이다. 상기 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기의 그룹 (예를 들면, 충전된 잔기 예컨대 arg, asp, his, lys, 및 glu)은 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들면, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 확인되고 대체되어 항체와 항원의 상호작용이 영향을 받는지 여부를 측정한다. 추가 치환은 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 증명하는 아미노산 위치에서 도입될 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 접촉을 확인하기 위한 항원-항체 복합체의 결정 구조는 항체와 항원 사이를 지적한다. 상기 접촉 잔기 및 인접하는 잔기는 치환용 후보로서 표적화 또는 제거될 수 있다. 변이체는 이들이 원하는 특성을 함유하는지를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.

아미노산 서열 삽입은 길이로 1 잔기 내지 100 또는 그 초과 잔기를 함유하는 폴리펩티드 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열간 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드 또는 효소 (예를 들면, ADEPT용)에 대한 항체의 N- 또는 C-말단에의 융합을 포함한다.

b) 당화 변이체

특정 구현예에서, 본원에서 제공된 항체는 항체가 당화되는 범위를 증가 또는 감소하기 위해 변경된다. 항체에 대한 당화 부위의 부가 또는 결실은 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성될 수 있어서 하나 이상의 당화 부위는 제조 또는 제거된다.

항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 여기에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 대한 N-연결부에 의해 일반적으로 부착되는 분지형, 이분지(biantennary) 올리고당을 포함한다. 참고, 예를 들면, Wright et al., TIBTECH 15:26-32 (1997). 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들면, 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토오스, 및 시알산, 뿐만 아니라 이분지 올리고당 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 부착된 푸코오스를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체에서 올리고당의 변형은 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 제조하기 위해 실시될 수 있다.

일 구현예에서, Fc 영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코오스가 부족한 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들면, 상기 항체에서 푸코오스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코오스의 양은, 예를 들면, WO　2008/077546에 기재된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분광분석법에 의해 측정된 바와 같은 Asn 297 (예를 들면, 복합체, 하이브리드 및 높은 만노스 구조)에 부착된 모든 당구조의 합에 비해, Asn297에서 당 사슬내에 푸코오스의 평균 양을 산출함으로써 측정된다. Asn297은 Fc 영역에서의 약 위치 297 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 배치된 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; 그러나, Asn297은, 항체내 작은 서열 변이로 인해, 위치 297의 약 ± 3 아미노산 업스트림 또는 다운스트림, 즉, 위치 294 와 300 사이에 또한 배치될 수 있다. 상기 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 참고, 예를 들면, 미국 특허 공개 번호 US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). "탈푸코실화된" 또는 "푸코오스-결핍된" 항체 변이체에 관련된 공개의 예는 하기를 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al., J. Mol . Biol . 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng . 87: 614 (2004). 탈푸코실화된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 하기를 포함한다: 단백질 푸코실화에서 결핍된 Lec13 CHO 세포 (Ripka et al., Arch. Biochem . Biophys . 249:533-545 (1986); 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1, Presta, L; 및 WO　2004/056312 A1, Adams et al., 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실전달효소 유전자, FUT8 , 녹아웃 CHO 세포 (참고, 예를 들면, Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng . 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol . Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 및 WO2003/085107).

항체 변이체는 이등분한 올리고당으로 추가 제공되고, 예를 들면, 여기에서 항체의 Fc 영역에 부착된 이분지 올리고당은 GlcNAc에 의해 이등분된다. 상기 항체 변이체는 푸코실화를 감소시킬 수 있고/있거나 ADCC 기능을 개선시킬 수 있다. 상기 항체 변이체의 예는, 예를 들면, WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); 미국 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.)에 기재된다. Fc 영역에 부착된 올리고당에서 적어도 하나의 갈락토오스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 상기 항체 변이체는 CDC 기능을 개선시킬 수 있다. 상기 항체 변이체는, 예를 들면, WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 기재된다.

c) Fc 영역 변이체

특정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 본원에 제공된 항체의 Fc 영역속에 도입될 수 있고, 그렇게 함으로써 Fc 영역 변이체를 발생시킨다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들면 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들면, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명은 모두가 아닌 일부 효과기 기능을 보유하는 항체 변이체를 고려하고, 이는 생체내 항체의 반감기가 중요하지만 특정 효과기 기능 (예컨대 보체 및 ADCC)이 불필요한 또는 유해한 적용에 바람직한 후보로 만든다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정은 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/감손을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들면, Fc 수용체 (FcR) 결합 검정은 항체가 FcγR 결합이 부족하지만 (따라서 유사하게 ADCC 활성 부족), FcRn 결합 능력을 보유하는 것을 확보하기 위해 수행될 수 있다. ADCC, NK 세포 매개용 1차 세포는 FcγRIII 만을 발현하고, 반면에 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포에서 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu . Rev. Immunol . 9:457-492 (1991)의 464페이지의 표 3에 요약된다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비-제한적인 예는 하기에 기재된다: 미국 특허 번호 5,500,362 (참고, 예를 들면 Hellstrom, I. et al. Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 83:7059-7063 (1986)) 및 Hellstrom, I et al., Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (참고 Bruggemann, M. et al., J. Exp . Med . 166:1351-1361 (1987)). 대안적으로, 비-방사성 검정 방법이 이용될 수 있다 (참고, 예를 들면, 유동세포계수법을 위한 ACTI™ 비-방사성 세포독성 검정 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; 및 CytoTox 96^® 비-방사성 세포독성 검정 (Promega, Madison, WI). 상기 검정을 위한 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은, 예를 들면, Clynes et al. Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 95:652-656 (1998)에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 생체내 평가될 수 있다. C1q 결합 검정은 또한 항체가 C1q를 결합할 수 없고 따라서 CDC 활성이 부족한 것을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 참고, 예를 들면, WO　2006/029879 및 WO　2005/100402에서 C1q 및 C3c 결합 ELISA. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다 (참고, 예를 들면, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol . Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). FcRn 결합 및 생체내 청소능/반감기 결정은 또한 당해분야에서 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다 (참고, 예를 들면, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)).

감소된 효과기 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 6,737,056). 상기 Fc 돌연변이체는, 알라닌에 대해 잔기 265 및 297의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하여, 2개 이상의 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581).

FcR에 대한 개선된 또는 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재된다. (참고, 예를 들면, 미국 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).)

특정 구현예에서, 항체 변이체는, ADCC를 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들면, Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링)에서의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.

일부 구현예에서, 변경은, 예를 들면, 미국 특허 번호 6,194,551, WO　99/51642, 및 Idusogie et al. J. Immunol . 164: 4178-4184 (2000)에 기재된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 초래하는 Fc 영역에서 실시된다.

모계 IgG의 태아로의 이동을 책임지는 (Guyer et al., J. Immunol . 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol . 24:249 (1994)), 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 증가된 반감기 및 개선된 결합을 갖는 항체가 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에 기재된다. 상기 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선하는 그안에 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 상기 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434의 하나 이상에서 치환, 예를 들면, Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 7,371,826).

Fc 영역 변이체의 다른 예에 관하여 또한 하기 참고: Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351.

d) 시스테인 조작된 항체 변이체

특정 구현예에서, 시스테인 조작된 항체, 예를 들면, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환되는 "thioMAb"를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 구현예에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 발생한다. 상기 잔기를 시스테인으로 치환시킴으로써, 반응성 티올기는 그렇게 함으로써 항체의 접근가능한 부위에 배치되고, 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 항체를 접합하는데 사용되어, 본원에서 추가로 기재된 바와 같이, 면역접합체를 제조할 수 있다. 특정 구현예에서, 하기 잔기의 임의의 하나 이상의는 하기로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (카밧 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들면, 미국 특허 번호 7,521,541에 기재된 바와 같이 발생될 수 있다.

e) 항체 유도체

특정 구현예에서, 본원에서 제공된 항체는 추가로 개질되어 당해기술에 공지되어 있고 쉽게 이용가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유할 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 비제한적으로 수용성 폴리머를 포함한다. 수용성 폴리머의 비-제한적인 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 코폴리머, 카복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 비닐피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 코폴리머, 폴리아미노산 (호모폴리머 또는 랜덤 코폴리머), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 비닐피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 프롤리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 코-폴리머, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (예를 들면, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이들의 혼합물. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 물에서 그 안정성 때문에 제조시 이점을 가질 수 있다. 폴리머는 임의의 분자량일 수 있고, 그리고 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 폴리머의 수는 다양할 수 있고, 만일 1 초과 폴리머가 부착되면, 이들은 동일 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용된 폴리머의 수 및/또는 유형은, 만일 항체 유도체가 한정된 조건하에서의 요법 등에서 사용된다면, 비제한적으로, 개선되는 항체의 특정한 특성 또는 기능을 포함하는 고려사항에 기반하여 결정될 수 있다.

또 다른 구현예에서, 방사선에 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티 및 항체의 복합체가 제공된다. 일 구현예에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브 (Kam et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 102: 11600-11605 (2005))이다. 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 그리고 비제한적으로 통상적인 세포를 해하지 않는 파장을 포함하지만, 항체-비단백질성 모이어티에 대한 세포 근위부가 사멸되는 온도까지 비단백질성 모이어티를 가열시킨다.

B. 재조합 방법 및 조성물

항체는, 예를 들면, 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 바와 같이 재조합 방법 및 조성물을 이용하여 생산될 수 있다. 일 구현예에서, 본원에서 기재된 항-혈구응집소 항체를 암호화하는 단리된 핵산이 제공된다. 상기 핵산은 항체 (예를 들면, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화할 수 있다. 추가 구현예에서, 상기 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들면, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 구현예에서, 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 한 상기 구현예에서, 숙주 세포는 하기를 포함한다 (예를 들면, 하기로 변형된다): (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 벡터. 일 구현예에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들면 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프모양 세포 (예를 들면, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 일 구현예에서, 항-혈구응집소 항체의 제조 방법이 제공되고, 여기서 상기 방법은, 항체의 발현에 적합한 조건 하에서, 상기 제공된 바와 같이, 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포 배양, 및 임의로 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체 회수를 포함한다.

항-혈구응집소 항체의 재조합 생산을 위해, 예를 들면, 상기에서 기재된 바와 같이, 항체를 암호화하는 핵산은 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 단리 및 삽입된다. 상기 핵산은 쉽게 단리될 수 있고 종래의 절차를 이용하여 (예를 들면, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써) 서열분석될 수 있다.

항체-암호화 벡터의 클로닝 또는 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 본원에서 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들면, 특히 당화 및 Fc 효과기 기능이 필요없는 경우, 항체는 박테리아에서 생산될 수 있다. 박테리아에서 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해, 참고, 예를 들면, 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199, 및 5,840,523. (참고: 또한 Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, E. 콜 리에서 항체 단편의 발현 기재). 발현 이후, 항체는 박테리아 세포 페이스트로부터 가용성 분획으로 단리될 수 있고 추가로 정제될 수 있다.

원핵생물에 더하여, 진핵 미생물 예컨대 사상균 또는 효모는, 당화 경로가 부분적으로 또는 완전히 인간 당화 패턴으로 항체의 생산을 초래하는 "인간화"되는 진균 및 효모 균주를 포함하여, 항체-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 참고: Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).

당화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다중세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유도된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 곤충 세포와 함께, 특히 스포도프테라 프루지페르다 세포의 형질감염에 사용될 수 있는 수많은 바큘로바이러스 균주가 확인된다.

식물 세포 배양물은 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 참고, 예를 들면, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, 및 6,417,429 (형질전환 식물에서 항체 생산용 PLANTIBODIES^TM 기술 기재).

척추동물 세포는 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 현탁제에서 성장하도록 적응되는 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 하기이다: SV40 (COS-7)에 의해 변형된 원숭이 신장 CV1 주; 인간 배아 신장 라인 (예를 들면, Graham et al., J. Gen Virol . 36:59 (1977)에 기재된 바와 같이 293 또는 293 세포); 어린 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들면, Mather, Biol . Reprod . 23:243-251 (1980)에 기재된 바와 같이 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 갯과 신장 세포 (MDCK; 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유선 종양 (MMT 060562); 예를 들면, Mather et al., Annals N.Y . Acad . Sci. 383:44-68 (1982)에 기재된 바와 같이 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR^- CHO 세포 (Urlaub et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77:4216 (1980))를 포함하는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포; 및 골수종 세포주 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 참고, 예를 들면, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003).

C. 검정

본원에서 제공된 항-혈구응집소 항체는 당해기술에서 공지된 다양한 검정에 의해 그 물리적/화학 특성 및/또는 생물학적 활성으로 확인, 스크리닝, 또는 특징화될 수 있다.

1. 결합 검정 및 다른 검정

일 측면에서, 본 발명의 항체는, 예를 들면, 공지된 방법 예컨대 ELISA, 웨스턴 블랏 등에 의해 그 항원 결합 활성에 대해 시험된다.

또 다른 측면에서, 경쟁 검정은 본원에서 기재된 임의의 항-혈구응집소 항체와 혈구응집소의 결합을 위해 경쟁하는 항체를 확인하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 경쟁 항체는 본원에서 기재된 항-혈구응집소 항체 (예를 들면, 하기를 포함하는 항-혈구응집소 항체: 서열 식별 번호:79의 VH 서열 및 서열 식별 번호:78의 VL 서열; 서열 식별 번호:83의 VH 서열 및 서열 식별 번호:82의 VL 서열; 서열 식별 번호:83의 VH 서열 및 서열 식별 번호:86의 VL 서열; 서열 식별 번호:89의 VH 서열 및 서열 식별 번호:78의 VL 서열; 서열 식별 번호:92의 VH 서열 및 서열 식별 번호:91의 VL 서열; 서열 식별 번호:95의 VH 서열 및 서열 식별 번호:91의 VL 서열; 서열 식별 번호:97의 VH 서열 및 서열 식별 번호:91의 VL 서열; 서열 식별 번호:99의 VH 서열 및 서열 식별 번호:91의 VL 서열; 서열 식별 번호:101의 VH 서열 및 서열 식별 번호:91의 VL 서열; 서열 식별 번호:103의 VH 서열 및 서열 식별 번호:91의 VL 서열; 서열 식별 번호:105의 VH 서열 및 서열 식별 번호:91의 VL 서열; 서열 식별 번호:107의 VH 서열 및 서열 식별 번호:91의 VL 서열) 에 의해 결합되는 동일한 에피토프 (예를 들면, 선형 또는 형태적 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프 맵핑을 위한 상세한 예시적인 방법은 Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)에 제공된다.

예시적인 경쟁 검정에서, 고정된 혈구응집소는 혈구응집소에 결합하는 제1 표지된 항체 및 혈구응집소에 결합을 위해 제1 항체와 경쟁하는 그 능력에 대해 시험되는 제2 비표지된 항체를 포함하는 용액에서 항온처리된다. 제2 항체는 하이브리도마 상청액에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정된 혈구응집소는 제2 비표지된 항체가 아닌 제1 표지된 항체를 포함하는 용액에서 항온처리된다. 혈구응집소에 제1 항체의 결합에 허용된 조건 하에서 항온처리 이후, 과잉의 미결합된 항체는 제거되고, 고정된 혈구응집소에 관련된 표지의 양이 측정된다. 만일 고정된 혈구응집소에 관련된 표지의 양이 대조군 샘플에 비하여 시험 샘플에서 실질적으로 감소되면, 그러면 그것은 제2 항체가 혈구응집소에 결합을 위해 제1 항체와 경쟁하는 것을 나타낸다. 참고 Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

2. 활성 검정

일 측면에서, 검정은 생물학적 활성을 갖는 항-혈구응집소 항체 및 그 단편을 확인하기 위해 제공된다. 생물학적 활성은, 예를 들면, 인플루엔자 B 바이러스 혈구응집소, 중화 인플루엔자 B 바이러스 등에 특이적 결합을 포함할 수 있다. 항체 그리고 생체내 및/또는 시험관내 상기 생물학적 활성을 갖는 항체 또는 그 단편을 포함하는 조성물이 또한 제공된다.

특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 상기 생물학적 활성에 대해 시험된다. 다음을 참고한다: 상기 검정의 예시적인 설명을 위한 실시예 3-16.

D. 면역접합체

본 발명은 또한 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학치료제 또는 약물, 성장 억제성 제제, 독소 (예를 들면, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소, 또는 그 단편), 또는 방사성 동위원소에 접합되는 본원에서 항-혈구응집소 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.

일 구현예에서, 면역접합체는, 비제한적으로 하기를 포함하는, 항체가 하나 이상의 약물에 접합되는 항체-약물 콘주게이트 (ADC)이다: 메이탄시노이드 (참고 미국 특허 번호 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1); 아우리스타틴 예컨대 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF) (참고 미국 특허 번호 5,635,483 및 5,780,588, 및 7,498,298); 돌라스타틴; 칼리키아마이신 또는 그 유도체 (참고 미국 특허 번호 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 및 5,877,296; Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); 및 Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); 안트라사이클린 예컨대 다우노마이신 또는 독소루비신 (참고 Kratz et al., Current Med . Chem . 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem . Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj . Chem . 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg . & Med . Chem . Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med . Chem . 45:4336-4343 (2002); 및 미국 특허 번호 6,630,579); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산 예컨대 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀, 및 오르타탁셀; 트리코테센; 및 CC1065.

또 다른 구현예에서, 면역접합체는, 비제한적으로 하기를 포함하는, 효소적 활성 독소 또는 그 단편에 접합된 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다: 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 에어루기노사제), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모덱신 A 사슬, 알파-사르신, 알류라이테스 포르디이 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 차란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 젤로닌, 마이토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센.

또 다른 구현예에서, 면역접합체는 방사접합체를 형성하기 위해 방사성 원자에 접합된 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소는 방사접합체의 생산에 이용가능하다. 그 예는 At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사접합체가 검출을 위해 사용되는 경우, 섬광계수법 연구, 예를 들면 tc99m 또는 I123, 또는 핵자기 공명 (NMR) 이미지화 (또한 자기 공명 이미지화로서 공지됨, mri)를 위한 스핀 표지를 위한 방사성 원자, 예컨대 요오드-123 다시, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.

항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이작용성 단백질 커플링제 예컨대 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체 (예컨대 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디석신이미딜 우베레이트), 알데하이드 (예컨대 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디나이트로벤젠) 을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 리신 면역독소는 Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오티드의 접합을 위한 예시적인 킬레이트제이다. 참고: WO94/11026. 링커는 세포에서 세포독성제의 방출을 촉진시키는 "절단가능 링커"일 수 있다. 예를 들면, 산-불안정한 링커, 펩티다아제-민감성 링커, 광불안정한 링커, 디메틸 링커 또는 디설파이드-함유 링커 (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); 미국 특허 번호 5,208,020)가 사용될 수 있다.

본원에서 면역접합체 또는 ADC는, 비제한적으로, 상업적으로 이용가능한 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB (석신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트) (예를 들면, Pierce Biotechnology, Inc.제, Rockford, IL., U.S.A)를 포함하는 가교제 시약으로 제조되는 상기 접합체를 비제한적으로 고려한다.

E. 진단 및 검출용 방법 및 조성물

특정 구현예에서, 본원에서 제공된 임의의 항-혈구응집소 항체는 생물학적 샘플에서 혈구응집소 또는 인플루엔자 B 바이러스의 존재 검출에 유용하다. 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "검출"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직, 예컨대, 예를 들면, 폐, 상부 기도, 코관, 혈액, 가래를 포함하거나, 또는 코 또는 목 면봉에 의해 수득된 생물학적 샘플을 포함한다.

일 구현예에서, 진단 또는 검출 방법에서 사용하기 위한 항-혈구응집소 항체가 제공된다. 추가 양태에서, 생물학적 샘플에서 혈구응집소 또는 인플루엔자 B 바이러스의 존재 검출의 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 혈구응집소에 항-혈구응집소 항체의 결합을 위해 허용된 조건하에서 본원에서 기재된 바와 같이 항-혈구응집소 항체와 생물학적 샘플의 접촉, 및 항-혈구응집소 항체와 혈구응집소 사이에 복합체가 형성되는지의 탐지를 포함한다. 상기 방법은 시험관내 또는 생체 내 방법일 수 있다. 일 구현예에서, 예를 들면, 혈구응집소가 환자의 선택용 바이오마커인 경우, 항-혈구응집소 항체가 사용되어 항-혈구응집소 항체를 이용한 요법에 자격있는 대상체를 선택한다.

본 발명의 항체를 이용하여 진단될 수 있는 예시적인 장애는, 소아, 영아, 성인, 및 노인에서 인플루엔자 B 바이러스 감염을 포함하여, 인플루엔자 A 바이러스 감염을 포함한다.

특정 구현예에서, 표지된 항-혈구응집소 항체가 제공된다. 표지는, 비제한적으로, 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (예컨대 형광성, 발색단, 전자 치밀, 화학발광, 및 방사성 표지), 뿐만 아니라, 예를 들면, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 모이어티, 예컨대 효소 또는 리간드를 포함한다. 예시적인 표지는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 방사성동위원소 ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H, 및 ¹³¹I, 형광단 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레신 및 그 유도체, 로다민 및 그 유도체, 단실, 엄벨리페론, 루세리페라제, 예를 들면, 개똥벌레 루시퍼라아제 및 박테리아 루시퍼라아제 (미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 서양고추냉이 페록시다아제 (HRP), 알칼리포스파타제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들면, 글루코오스 옥시다제, 갈락토오스 옥시다제, 및 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소, 염료 전구체 예컨대 HRP를 산화하기 위해 과산화수소를 사용하는 효소로 커플링된, 헤테로사이클릭 옥시다제 예컨대 우리카제 및 잔틴 옥시다제, 락토페록시다아제, 또는 마이크로페록시다아제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파아지 표지, 안정한 유리 라디칼, 등.

F. 약제학적 제형

본원에 기재된 바와 같이 항-혈구응집소 항체의 약제학적 제형은 원하는 정도의 순도를 갖는 상기 항체를 하나 이상의 선택적인 약제학적으로 허용가능한 담체 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합시킴으로써 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조된다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 이용된 투여량 및 농도에서 수령체에 일반적으로 비독성이고, 비제한적으로 하기를 포함한다: 버퍼 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코오스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트제 예컨대 EDTA; 당류 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온 예컨대 나트륨; 금속 복합체 (예를 들면 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 본원에서 예시적인 약제학적으로 허용가능한 담체는 추가로 간질(insterstitial) 약물 분산제 예컨대 가용성 중성-활성 하이알로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 하이알로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (HYLENEX^®, Baxter International, Inc.)을 포함한다. rHuPH20을 포함하는, 특정 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법이 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에 기재된다. 일 측면에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.

예시적인 동결건조된 항체 제형이 미국 특허 번호 6,267,958에 기재된다. 수성 항체 제형은 미국 특허 번호 6,171,586 및 WO2006/044908에 기재된 것을 포함하고, 후자 제형은 히스티딘-아세테이트 버퍼를 포함한다.

본원에서 제형은 또한 치료되는 특정한 적응증에 필요시 1 초과 활성 성분, 바람직하게는 서로 부정적으로 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 예를 들면, 추가로, 뉴라민가수분해효소 억제제, 항-혈구응집소 항체, 항-M2 항체 등을 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 활성 성분은 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.

활성 성분은 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼에서, 예를 들면, 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면, 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐에, 각각, 포집될 수 있다. 상기 기술은 하기에서 개시되어 있다: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

서방성 제제는 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 형상화된 물품의 형태, 예를 들면 필름, 또는 마이크로캡슐이다.

생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균된다. 멸균은, 예를 들면, 멸균된 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다.

G. 치료 방법 및 조성물

본원에서 제공된 임의의 항-혈구응집소 항체는 치료 방법에서 사용될 수 있다.

일 양태에서, 약제로서 사용을 위한 항-혈구응집소 항체가 제공된다. 추가 양태에서, 인플루엔자 B 바이러스 감염의 치료, 예방, 또는 억제에서 사용을 위한 항-혈구응집소 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 치료 방법에서 사용을 위한 항-혈구응집소 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 본 발명은, 항-혈구응집소 항체의 유효량을 하기 개체에 투여하는 것을 포함하는, 인플루엔자 B 바이러스 감염을 갖는 개체의 치료 방법에서 사용을 위한 항-혈구응집소 항체를 제공한다. 한 상기 구현예에서, 상기 방법 추가로, 예를 들면, 아래에서 기재된 바와 같이 적어도 하나의 추가 치료제의 유효량을 상기 개체에 투여하는 것을 포함한다. 추가 구현예에서, 본 발명은 인플루엔자 B 바이러스 바이러스 막과 감염된 세포 엔도좀 막 사이에서 혈구응집소-매개된 융합의 예방, 억제, 또는 감소, 따라서 감염된 세포 세포질속으로 바이러스 RNA 진입 예방 및 감염의 추가 전파 예방에서 사용을 위한 항-혈구응집소 항체를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인플루엔자 B 바이러스 감염을 예방, 억제, 또는 치료하기 위해 항-혈구응집소 항체의 유효량을 상기 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체에 인플루엔자 B 바이러스 감염의 예방, 억제, 또는 치료 방법에서 사용을 위한 항-혈구응집소 항체를 제공한다. 임의의 상기 구현예에 있어서 "개체"는 바람직하게는 인간이다.

추가 양태에서, 본 발명은 약제의 제작 또는 제조에서 항-혈구응집소 항체의 용도를 위해 제공한다. 일 구현예에서, 상기 약제는 인플루엔자 B 바이러스 감염의 치료용이다. 추가 구현예에서, 상기 약제는 인플루엔자 B 바이러스 감염을 갖는 개체에 약제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 인플루엔자 B 바이러스 감염의 치료 방법에서 유용하다. 한 상기 구현예에서, 상기 방법은 추가로, 예를 들면, 아래에서 기재된 바와 같이 적어도 하나의 추가 치료제의 유효량을 상기 개체에 투여하는 것을 포함한다. 추가 구현예에서, 상기 약제는 인플루엔자 B 바이러스 바이러스 막과 감염된 세포 엔도좀 막 사이에서 혈구응집소-매개된 융합의 예방, 억제, 또는 감소, 따라서 감염된 세포 세포질 속으로 바이러스 RNA 진입 예방 및 감염의 추가 전파 예방용이다. 추가 구현예에서, 상기 약제는 인플루엔자 B 바이러스 감염을 예방, 억제, 또는 감소하기 위해 약제의 효과적인 양을 상기 개체에 투여하는 것을 포함하는 개체에 인플루엔자 B 바이러스 감염의 예방, 억제, 또는 치료 방법에서 유용하다. 임의의 상기 구현예에 있어서 "개체"는 바람직하게는 인간일 수 있다.

추가 양태에서, 본 발명은 인플루엔자 B 바이러스 감염의 치료 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 항-혈구응집소 항체의 유효량을 상기 인플루엔자 B 바이러스 감염을 갖는 개체에 투여하는 것을 포함한다. 한 상기 구현예에서, 상기 방법은 추가로, 본원에 기재된 바와 같이 적어도 하나의 추가 치료제의 유효량을 상기 개체에 투여하는 것을 포함한다. 임의의 상기 구현예에 있어서 "개체"는 바람직하게는 인간일 수 있다.

본 발명은 개체 (예를 들면, 대상체 또는 환자)에 인플루엔자 B 바이러스 감염의 억제, 예방, 또는 치료에서 효과적인 항-혈구응집소 항체를 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명의 항-혈구응집소 항체는 개체의 인플루엔자 B 바이러스 감염을 예방하기 위해 개체의 예방적 치료에서 효과적이다.

일부 측면에서, 본 발명의 항-혈구응집소 항체를 이용한 치료에 적합한 개체는 인플루엔자 B 바이러스 감염을 갖는 개체 또는 갖는 것으로 의심되는 개체이다. 일부 구현예에서, 상기 개체는 영아, 소아, 성인, 및 노인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 개체는 인플루엔자 B 바이러스 감염으로 입원된다. 다른 구현예에서, 인플루엔자 B 바이러스 감염을 갖는 개체는 하나 이상의 동반이환, 예컨대, 예를 들면, 면역결핍, 임신, 폐 질환, 심장병, 신장 질환, 또는 공동-감염 (예를 들면, 박테리아 감염 또는 바이러스 감염, 예컨대 박테리아 또는 바이러스 폐렴)을 갖는다.

일부 측면에서, 본 발명의 항-혈구응집소 항체를 갖는 개체의 치료는 인플루엔자 B 바이러스 감염 중증도를 감소시키거나, 인플루엔자 B 바이러스 감염의 길이를 감소시키거나, 또는 인플루엔자 B 바이러스 감염성을 감소시킨다. 다른 측면에서, 본 발명의 항-혈구응집소 항체를 이용한 인플루엔자 B 바이러스 감염의 치료는, 병원 체류의 기간 감소, 중환자실 (ICU) 사용에 대한 필요성 감소 또는 예방, 보조적 또는 기계적 환기에 대한 필요성 감소 또는 예방, 보충의 산소 사용에 대한 필요성 감소 또는 예방, 및 사망률의 감소를 포함하여, 추가의 이점을 제공한다. 일부 측면에서, 병원 체류의 기간 감소는 1 일, 2 일, 3 일, 4　일, 5 일, 또는 5 일 초과이다. 일부 측면에서, 중환자실 사용에 대한 필요성 감소는 1 일, 2 일, 3 일, 4　일, 5 일, 또는 5 일 초과이다. 일부 측면에서, 보조적 또는 기계적 환기에 대한 필요성 감소는 1 일, 2 일, 3 일, 4　일, 5 일, 또는 5 일 초과이다. 일부 측면에서, 보충의 산소에 대한 필요성 감소는 1 일, 2 일, 3 일, 4　일, 5 일, 또는 5 일 초과이다. 일부 측면에서, 본 발명의 항-혈구응집소 항체를 이용한 개체의 치료는 인플루엔자 B 바이러스 감염 질환 증상, 예컨대, 예를 들면, 열병, 코리자(coryza), 오한, 목 아픔, 근육 통증, 신체 통증, 두통, 기침, 코 울혈, 약화 또는 피로, 자극된 또는 눈꼽낀 눈, 및 일반적인 불편을 감소시킨다.

일부 측면에서, 본 발명의 항-혈구응집소 항체를 이용한 개체의 치료는, 호흡수의 정규화까지의 시간 감소, 또는 산소 포화의 정규화까지의 시간 감소와 같이, 호흡기 기능의 정규화까지의 시간을 감소시킨다. 일부 측면에서, 본 발명의 항-혈구응집소 항체를 이용한 개체의 치료는 보충의 산소 투여 없이 24 시간을 넘어 측정된 바와 같이 정상적 산소 포화, 예를 들면, 약 92% 또는 그 초과의 산소 포화까지의 복귀 시간을 감소시킨다. 다른 측면에서, 본 발명의 항-혈구응집소 항체를 이용한 개체의 치료는 활력 징후, 예컨대 심박수, 혈압, 호흡수, 및 온도의 정규화까지의 시간을 감소시킨다.

일부 측면에서, 본 발명의 항-혈구응집소 항체를 이용한 개체의 치료는 바이러스 종점, 예컨대, 예를 들면, 인플루엔자 바이러스 역가를 개선시킨다. 바이러스 역가는, 예를 들면, qPCR 또는 조직 배양 감염성 투여량 (TCID50)에 의해 측정된 바와 같이, 당해분야의 숙련가에게 공지된 다양한 방식, 예컨대, 예를 들면, 바이러스 곡선하 면적 (AUC)에 의해 측정될 수 있다. 일부 측면에서, 상기 치료는 qPCR 또는 TCID50에 의해 측정된 바와 같이 바이러스 AUC에서 50% 이상의 감소를 초래한다.

본 발명의 다양일 양태에서, 본원에서 제공된 항-혈구응집소 항체는 증상의 개시 (예를 들면, 병의 개시) 이후 약 12 시간, 약 24　시간, 약 36　시간, 약 48 시간, 약 60 시간, 약 72 시간, 약 84　시간, 및 약 96　시간에서 투여된 경우 인플루엔자 B 바이러스 감염의 치료에 효과적이다. 다른 측면에서, 본원에서 제공된 항-혈구응집소 항체는 증상의 개시 이후 약 24　시간과 48 시간 사이 (예를 들면, 개체가 24와 48시간 사이 동안 증상이 있는) 투여된 경우, 증상의 개시 이후 약 48 시간과 72 시간 사이 투여된 경우, 또는 증상의 개시 이후 약 72 시간과 96 시간 사이 투여된 경우 인플루엔자 B 바이러스 감염 치료에 효과적이다. 본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명의 항-혈구응집소 항체는 인플루엔자 B 바이러스 감염의 치료 또는 감소에 효과적이고 증상의 개시 이후 48 시간 초과의 현재 표준의 치료 기간 (예를 들면, 오셀타미비르)을 확장시킨다.

추가 양태에서, 본 발명은, 예를 들면, 임의의 상기 치료 방법에서 사용을 위해, 본원에서 제공된 임의의 항-혈구응집소 항체를 포함하는 약제학적 제형을 제공한다. 일 구현예에서, 약제학적 제형은 본원에서 제공된 임의의 항-혈구응집소 항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 제형은 본원에서 제공된 임의의 항-혈구응집소 항체 및, 예를 들면, 아래에서 기재된 바와 같이 적어도 하나의 추가 치료제를 포함한다.

본 발명의 항체는 요법에서 단독으로 또는 다른 제제와 병용하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 적어도 하나의 추가 치료제와 공동-투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 추가 치료제는 뉴라민가수분해효소 억제제 (예를 들면, 자나미비르, 오셀타미비르 포스페이트, 아만타딘, 리만타딘), 항-M2 항체, 항-혈구응집소 항체 등이다. 일부 측면에서, 뉴라민가수분해효소 억제제와 공동-투여되는 본 발명의 항-혈구응집소 항체를 이용하여 인플루엔자 B 바이러스 감염을 갖는 개체의 치료는 제제 단독으로 치료와 비교하여 상승작용 치료 효과를 제공한다.

상기 지칭된 상기 병용 요법은 병용 투여 (2 또는 그 초과 치료제가 동일 또는 개별의 제형에 포함되는 경우), 및 개별 투여를 포함하고, 이 경우에, 본 발명의 항체의 투여는 추가 치료제 또는 제제의 투여 이전, 동시, 및/또는 이후 발생할 수 있다. 일 구현예에서, 항-혈구응집소 항체의 투여 및 추가 치료제의 투여는 서로 약 1 개월 이내, 또는 약 1, 2 또는 3 주 이내, 약 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 일 이내, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 또는 24 시간 이내 발생한다.

본 발명의 항체 (및 임의의 추가 치료제)는, 비경구, 폐내, 및 비강내, 그리고, 원한다면 국소 치료를 위해, 병소내 투여를 포함하여, 임의의 적당한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투여가 잠시인지 만성적인지에 부분적으로 의존하여, 투여는 임의의 적합한 경로, 예를 들면 주사로, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사로 될 수 있다. 비제한적으로 다양한 시점에 걸친 단일 또는 다중 투여, 볼러스 투여, 및 펄스 주입을 포함하는 다양한 복용 계획이 본원에서 고려된다.

본 발명의 항체는 양호한 의료 실시와 일치된 방식으로 제형화, 복용, 및 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려 인자는 치료받는 특정한 장애, 치료받는 특정한 포유동물, 개별 환자의 임상적 병태, 장애의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 개업의에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 항체는 문제의 장애를 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 제제와 임의로 제형화될 필요는 없지만, 제형화된다. 유효량의 상기 다른 제제는 제형에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자에 의존한다. 이들은 본원에 기재된 바와 같이 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에서 기재된 약 1 내지 99%의 투여량, 또는 적절하도록 실험적으로/임상적으로 결정된 임의의 투여량 및 임의의 경로로 일반적으로 사용된다.

질환의 예방 또는 치료를 위해, (단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가 치료제와 병용하여 사용될 때) 본 발명의 항체의 적절한 투여량은 치료받는 병태의 유형, 항체의 유형, 중증도 및 질환의 추이, 항체가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는지 여부, 이전의 요법, 항체에 대한 환자의 임상 이력 및 반응, 및 주치의의 재량에 의존할 것이다. 항체는 1회에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 μg/kg 내지 약 45　mg/kg (예를 들면, 약 1.0 mg/kg 내지 약 15 mg/kg)의 항체는, 예를 들면, 하나 이상의 개별의 투여로, 또는 연속 주입으로, 환자에 투여를 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 한 전형적인 1일 투여량은 상기 지칭된 인자에 따라 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 초과 범위일 것이다.

며칠 이상에 걸친 반복된 투여를 위해, 병태에 따라, 질환 증상의 원하는 억제가 발생할 때까지 치료는 일반적으로 지속될 것이다. 항체의 예시적인 투여량은 약 1.0　mg/kg 내지 약 45 mg/kg, 약 1.0　mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 1.0　mg/kg 내지 약 15 mg/kg, 약 1.0　mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 또는 약 1.0　mg/kg 내지 약 5 mg/kg 범위일 것이다. 따라서, 하나 이상의 투여량의 약 1.0 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5.0 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 30 mg/kg, 또는 45 mg/kg (또는 이들의 임의의 조합)이 환자에 투여될 수 있다. 상기 투여량은 간헐적으로, 예를 들면, 매일, 매 2일, 매 3일 등으로 투여될 수 있다. 초기 고 부하 투여량, 그 다음 하나 이상의 소 투여량이 투여될 수 있다. 투여는 또한 고정 투여량, 예컨대, 예를 들면, 200 mg, 400 mg, 600 mg, 800 mg, 1000 mg, 1200 mg, 1400 mg, 1500 mg, 1600 mg, 1800 mg, 2000 mg, 2200 mg, 2400 mg, 2500 mg, 2600 mg, 2800 mg, 3000 mg, 3200 mg, 3400 mg, 3600 mg 등일 수 있다. 상기 요법의 진행은 종래의 기술 및 검정으로 쉽게 모니터링된다.

임의의 상기 제형 또는 치료 방법이 항-혈구응집소 항체 대신 또는 그 이외에 본 발명의 면역접합체를 이용하여 수행될 수 있음이 이해된다.

H. 제조 물품

본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기 및 그 용기에 또는 관련된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 그것만으로 있거나 또는 병태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 조합되고 그리고 멸균된 접근 포트를 가질 수 있는 조성물을 수용한다 (예를 들면 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 스토퍼를 갖춘 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물에서 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 항체이다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택 병태의 치료에 사용됨을 나타낸다. 게다가, 제조 물품은 (a) 그 내부에 함유된 조성물을 갖는 제1 용기 (여기서 상기 조성물은 본 발명의 항체를 포함한다); 및 (b) 그 내부에 함유된 조성물을 갖는 제2 용기 (여기서 상기 조성물은 추가 세포독성 또는 달리 치료제를 포함한다)를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 구현예에서 제조 물품은 추가로, 조성물이 특정 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 포장 삽입물을 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 제조 물품은 추가로, 약제학적으로-허용가능한 버퍼, 예컨대 정균 주사용 물 (BWFI), 포스페이트-완충된 염수, 링거액 및 덱스트로오스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 포함할 수 있다. 다른 버퍼, 희석제, 필터, 바늘, 및 주사기를 포함하여, 상업적 및 사용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.

임의의 상기 제조 물품은 항-혈구응집소 항체 대신 또는 그 이외에 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있음이 이해된다.

III. 실시예

하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기 제공된 일반적인 설명이 주어지면, 다양한 다른 구현예가 실시될 수 있음이 이해된다.

실시예 1. 형질모세포 농축 및 팽창

인플루엔자 B 바이러스 혈구응집소에 대한 희귀 항체를 발견 및 확인하기 위해, 하기 형질모세포 농축 및 팽창 기술이 개발되었다. (참고: 공동계류중 특허 출원 미국 특허 출원 시리즈 번호 14/077,414 및 국제 특허 출원 번호 PCT/US2013/69567, 모두 2013년 11월 12일 출원, 및 Nakamura et al. (2013) Cell Host & Microbe, 14:93-103, 이들 각각은 본원에서 그 전체가 참고로 편입됨).

그 혈액 기증 7일 전에 계절성 인플루엔자 플루비린® 백신 (Novartis Lot #111796P1)을 받은 정상 인간 공여체로부터 류코팍(Leukopac)은 퍼시픽사 (San Francisco, CA)의 혈액 센터(Blood Center)로부터 수득되었다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 류코팍으로부터 표준 방법론을 이용하여 단리되었다. 6- 내지 8-주령 암컷 SCID/베이지색 마우스는 찰스 리버 실험실 (Charles River Laboratories) (Hollister, CA)에서 구매되었고 미국 실험 동물 관리 협회 (American Association of Laboratory Animal Care) 지침에 따라 제넨텍 (Genentech)에서 보관되고 유지되었다. 모든　실험적인 연구는 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 가이드 (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals) 및 적용가능한 법률 및 규정에 따라 AAALACi-인가 시설에서 제넨텍 랩 동물 조사의 동물 실험 윤리 위원회 (Institutional Animal Care and Use Committees of Genentech Lab Animal Research)의 승인하에서 수행되었다. 건강한 인간 공여체로부터 류코팍 또는 혈액은 서면 고지 동의가 제공되고 윤리적 승인이 서부 기관 생명 윤리 위원회 (Western Institutional Review Board)에서 인정된 후에 수득되었다.

생체내 항원-유도된 형질모세포 농축 및 팽창은 하기와 같이 PBMC의 인트라스페닉 (intraspenic) 이식을 이용하여 수행되었다. 단리된 PBMC는 혈구응집소 항원 (아래 참조) (각각의 1 백만 B 세포에 대해 0.1-2 μg 항원)으로 재현탁되었고 30 분 동안 37 ℃에서 항온처리되었다 (PBMC/항원 예비혼합). 상기 항온처리 이후, PBMC는 세정되어 미결합된 항원을 제거하였다. 인플루엔자 B 바이러스에 특이적인 교차-반응성 혈구응집소 항체를 생산한 형질모세포를 강화하기 위해, PBMC/항원 예비혼합 및 단일 세포 분류에 사용된 혈구응집소 항원 변이체는 특이적으로 선택되어 인플루엔자 플루비린® 백신 내에 함유된 혈구응집소 항원 변이체와 상이하였다. 따라서, 상기 연구에 사용된 혈구응집소 항원은 하기 인플루엔자 B 바이러스 단리물로부터 혈구응집소를 포함하였다: B/홍콩/1973 (항원-예비혼합 및 FACS에서 사용됨); B/매릴랜드/1/1959 및 B/위스콘신/2010 (ELISA 스크린에서 사용됨); 및 B/브리즈번/2008 (백신내 그리고 ELISA 스크린에서 사용됨). 혈구응집소 항원은 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 제넨텍에서 생산되었다.

6-8 주령 암컷 SCID/베이지색 마우스 (찰스 리버 실험실, Hollister, CA)는 세슘-137 공급원을 이용하여 350 rads로 아치사적으로 조사되었다. 폴리믹신 (Polymyxin) B (110 mg/L) 및 네오마이신 (1.1 g/L)은 조사 이후 7일 동안 음용수에 부가되었다. 조사 4시간 후, 각 마우스의 왼쪽 옆구리는 면도되고 베타딘® (Purdue Pharma, Stamford, CT) 및 70% 알코올로 준비되었다. 수술 과정은 마취하에서 무균성 수술 과정을 이용하여 수행되었다. 각 마우스의 늑골 경계의 바로 아래에서 1-cm 피부 절개가 실시되고, 그 다음 복벽 및 복막의 절개이었다. 각 마우스의 비장은 주의하여 노출되었고 30 μL PBS에서 재현탁된 50×10⁶ 인간 PBMC로 주입되었다. 절개는 각각 5-O Vicryl® 봉합사 (Ethicon, Somerville, NJ) 및 수술 스테이플을 이용하여 근육층 및 피부에서 마쳤다. 항원-특이적 세포 분류 실험을 위해, 마우스는 8일 후이식에서 희생되었고 그 비장은 수확되었다.

마우스로부터 수득된 비장 세포의 단일 세포 현탁액은, CD38^고/IgG+ 발현으로서 인간 IgG+ 형질모세포를 정의하는 IgG Dylight (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) 및 항-인간 단클론성 항체 CD38 PECy7 (BD Biosciences, San Jose, CA)의 칵테일로 염색되었다. 단리된 비장 세포의 현탁제 내에 인플루엔자 B 바이러스 혈구응집소 교차-반응성 형질모세포를 확인하기 위해, 세포는 인플루엔자 B 바이러스 균주 B/홍콩/1973으로부터 혈구응집소로 염색되었고, 이것은 각각 Lightning-Link® 표지 키트 (Innova Biosciences, Cambridge, UK)를 이용하여 FITC 또는 PE로 미리 접합되었다.

상기 기재된 방법을 이용하여 확인된 대략 2,018 항원-특이적 형질모세포중, 7개의 mAb가 적어도 하나의 인플루엔자 B 바이러스 균주에 대하여 바이러스 중화를 보여주었고, 그리고 3개의 mAb가 선구, 야마가타, 및 빅토리아 계통으로부터 인플루엔자 B 바이러스 균주를 포함하여, 시험된 모든 인플루엔자 B 바이러스 균주에 대하여 바이러스 중화를 나타내었다.

실시예 2. 단일 형질모세포로부터 IgG 클로닝

인플루엔자 B 바이러스 혈구응집소 교차-반응성 인간 형질모세포 (상기 기재)는 단일-세포 분류되어, 대략 2,018 항원-특이적 형질모세포가 되었다. 단일 형질모세포는 5% 낮은 IgG 우태 혈청을 함유하는 50 μl RPMI를 함유하는 U-바닥 96-웰 마이크로-웰 플레이트에 직접적으로 분류되었다. 플레이트는 5 분 동안 600 x g (Beckman Coulter, Brea, CA)에서 원심분리되고 매질은 흡인에 의해 주의하여 제거되었다. 세포는 재-현탁되었고 90 μl 의 PBS에서 2회 세정되고 동일한 절차를 따랐다.

가변 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 cDNA를 발생하기 위해, 각 세포는 하기를 함유하는 6 μl 의 역전사효소 (RT) 반응 혼합물에서 재-현탁되었다: 2 유니트 RNaseout (Invitrogen, Grand Island, NY), 0.5 mM 4dNTP (Perkin Elmer, Waltham, MA), 1.5 mM MgCl₂, 37.5 mM KCl, 10 mM DTT (디티오트레이톨), 0.25% Nonidet P40 (US Biological, Marblehead, MA), 0.1 mg/ml 소 혈청 알부민 (Sigma-Aldrich), 25 mM 트리스 pH 8.3, 0.25 pmol의 IgG₁ _-4 불변, 카파 사슬 불변, 및 람다 사슬 불변 영역 특이적 올리고뉴클레오티드 (아래 보여짐) 및 40 U 상첨자 III (Invitrogen, Grand Island, NY).

IgG₁ _-4 불변: GAAGTAGTCCTTGACCAGGCAG (서열 식별 번호:1)

카파 불변: CTCAGCGTCAGGGTGYTGCTGAG (서열 식별 번호:2)

람다 불변: GGGTKTGGTSGTCTCCAC (서열 식별 번호:3)

반응은 각각 45℃, 50℃, 및 55℃에서 3 x 30-분 간격동안 항온처리되었다. 항온처리 이후, 반응 혼합물은 TE 버퍼 (10 mm 트리스 HCl, 1　mM　EDTA)를 이용하여 15 μl로 희석되었다. 초기 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)은 수행되어 상기 및 어드벤티지-GC 2 폴리머라제 믹스 (Clontech, Mountain View, CA)로부터 2 μl의 희석된 RT 칵테일을 이용한 다음, 제조자에 의해 제공된 프로토콜을 따라 IgG 중쇄, 카파 사슬, 및 람다 사슬을 증폭하였다. PCR 증폭은 가변 중쇄 및 경쇄 생식계열 및 아래 보여진 불변 영역 서열에 기반하여 퇴화된 올리고뉴클레오티드를 이용하여 수행되었다.

중쇄 및 경쇄 PCR 증폭 반응은 하기와 같이 2개의 반응으로 분리되었다: 중쇄 패밀리 VH.1,2,3 (프라이머 IGVH1a, IGVH1b, IGVH2, IGVH3) 및 VH.4,5,6,7 (프라이머 IGVH4, IGVH5, IGVH6, 및 IGVH7); 카파 사슬 패밀리 VK.1,2,3 (프라이머 IGKV1, IGKV2, 및 IGKV3) 및 VK.4,5,6 (프라이머 IGVK4, IGVK5, 및 IGVK6); 및 람다 사슬 패밀리 VL.1,2,3,4,5 (IGLV1, IGLV2, IGLV3, IGLV4, 및 IGLV5) 및 VL.6,7,8,9 (프라이머 IGLV6, IGLV7, IGLV8, 및 IGLV9). 터치다운 PCR 증폭 프로토콜은 온도 사이클링으로 사용되었다.

반응 이후, PCR 증폭 생성물은 엑소뉴클레아제1 (Exo) 및 새우 알칼리포스파타제 (SAP)로 처리되어 각각의 PCR 증폭 반응으로부터 과잉의 뉴클레오티드 및 프라이머를 제거하였다 (U.S. Biologicals, Marblehead, MA). 초기 PCR 증폭 생성물은 직접적으로 서열분석되어 생거 (Sanger) 서열분석을 이용하여 중쇄 및 경쇄 모두의 가변 서열을 결정하였다. 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 포유동물 신호 및 불변 영역 클로닝 서열을 삽입하기 위해 생식계열-매칭된 중쇄 및 경쇄 가변 올리고뉴클레오티드를 이용하여 제2 중첩된 PCR 증폭은 수행되었다.

제조자의 권고에 따라 GC (Takara Bio, Shiga, Japan)를 갖는 PrimeStar HS DNA 폴리머라제를 이용하여 PCR 증폭 반응은 시작되었다. PCR 증폭 반응 이후, 증폭 생성물은 상기에서 기재된 바와 같이 Exo/SAP로 처리되었다. PCR 증폭 생성물을 암호화하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 제한 엔도뉴클레아제가 없는 절차를 이용하여 포유동물 발현 벡터에 삽입되었다. 20 μl의 PCR 증폭 생성물은 쿤켈 (Kunkel) 돌연변이유발 프로토콜을 이용하여 IgG₁, 카파, 및 람다 사슬용 단일가닥 DNA 인간 주형에 어닐링되었다. (참고: 쿤켈 (1985) PNAS 82:488-492). 정확하게 삽입된 작제물은 DNA 서열분석으로 확인되었다. 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산을 함유하는 플라스미드는 일시적 발현을 위해 퓨젠 (Fugene) 형질감염 시약 (Roche Diagnostic, Indianapolis, IN)을 이용하여 293T 인간 배아 신장 세포속에 공동-형질감염되었고, 아래에서 기재된 바와 같이 발현 및 결합에 대해 분석되었다.

실시예 3. 혈구응집소 ELISA 스크리닝 검정

상이한 인플루엔자 B 바이러스 단리물로부터 다양한 혈구응집소 하위유형을 결합하기 위해 상기에 기재된 바와 같이 수득된 각각의 단클론성 항-혈구응집소 항체 (즉, 항-인플루엔자 B 바이러스 항체)의 능력은 하기와 같이 ELISA에 의해 조사되었다. 다양한 혈구응집소-발현 플라스미드는 293T 세포에 형질감염되었고; 이들은 인플루엔자 B 바이러스 균주 B/매릴랜드/1/1959, B/빅토리아/2000, 및 B/브리즈번/2008로부터 혈구응집소를 포함하였다.

2 일후, 세포는 50　mM 트리스, pH 8, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% 트리톤 X-100 플러스 프로테아제 억제제 칵테일 (Roche)에서 용해되었다. 핵은 원심분리로 제거되고 수득한 용해물은 -80 ℃에서 보관되었다.

ELISA 스크리닝을 위해, 384-웰 플레이트 (Nunc MaxiSorp)는 PBS내 5 μg/ml 갈란투스 니발리스 렉틴 (Galanthus nivalis lectin) (Sigma)으로 코팅되었다. 플레이트는 세정되었고 그 다음 다양한 발현된 혈구응집소를 함유하는 세포 용해물의 희석액으로 코팅되었다. 플레이트는 세정되었고 항-혈구응집소 항체의 다양한 희석액 및 차후에 염소-항-인간-HRP 2차 항체 (Jackson)로 항온처리되었다. 플레이트는 세정되었고 TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 기질 검출을 위해 가공되었다.

대략 2,018 형질모세포는 실시예 2에서 상기 기재된 단일-세포 분류로부터 수득되었다. 이들 중, 98 단클론성 항체가 293T 세포에서 일시적으로 발현하였고 인플루엔자 B 바이러스 균주 B/매릴랜드/1/1959, B/빅토리아/2000, 및 B/브리즈번/2008로부터 혈구응집소에 대한 ELISA 디스플레이팅된 결합에 의해 스크리닝되었다.

실시예 4. 시험관내 인플루엔자 B 바이러스 중화

시험관내 인플루엔자 B 바이러스 단리물 집단의 넓은 혈구응집소 하위유형 결합 및 중화를 이끌어내기 위해 본 발명의 항-인플루엔자 B 바이러스 혈구응집소 항체의 능력은 하기와 같이 조사되었다. MDCK 세포는 투명-바닥 이미지화 플레이트를 갖춘 96-웰 흑색-벽에서 25% 융합성 단일층으로서 10% FBS로 보충된 DMEM 배지에서 성장되었다 (Costar 3904). 각 인플루엔자 B 바이러스 하위유형은 MOI 1까지 인플루엔자 배지 (DMEM, Gibco Cat# 15260에서 0.2%BSA, 10 mM HEPES, Gibco Cat# 10378에서 페니실린/스트렙토마이신/글루타민, 시그마 Cat# T1426에서 2　ug/mL TPCK 처리된 트립신)에서 희석되었고 mAb 34B5A 및 mAb 33F8의 가변 농도 0.02 내지 1,600 nM 범위로 1 시간 동안 37 ℃에서 항온처리되었다. 그 다음 각 항체/인플루엔자 바이러스 칵테일은 차가운 100% 에탄올로 세포의 고착에 앞서 5% CO₂ 인큐베이터에서 16 시간 동안 37 ℃에서 MDCK 세포를 감염시키도록 허용되었다. 그 다음 고정된 세포는 Hoechst 33342 (Invitrogen Cat# H3570)로 염색되어 세포 핵을 시각화하였고 총 세포 수를 측정하였다. 세포는 또한 인플루엔자 B 바이러스 핵단백질 (NP)에 특이적인 광범위 반응성 단클론성 항체 (Millipore Cat# MAB8258) 및 알렉사 플루오르 (Alexa Fluor) 488-접합된 염소 항-마우스 2차 항체 (Invitrogen Cat# A11029)로 순차적으로 염색되어 감염된 세포의 수를 결정하였다. 세포는 이미지 익스프레스 마이크로 기기 (분자 장치)를 이용하여 이미지화되었고 데이타 이미지는 메타엑스프레스 (MetaXpress) 3.1 소프트웨어를 이용하여 분석되었다.

감염된 세포의 백분율은 측정되었고 X-축으로 항체 농도 (Log₁₀)에 대하여 Y-축으로 작도되었다. 모든 중화 검정은 3중으로 완료되었고 데이타는 95% 신뢰 구간 (95% CI)으로 nM에서 IC50 값으로서 보고된다. 데이타는 비선형회귀 투여량 반응 곡선으로 맞춰져서 IC50 및 95% CI를 발생하였다.

시험관내 중화 투여량-반응 곡선은 인플루엔자 B 바이러스 균주의 광범위 집단에 대하여 본원에서 기재된 단클론성 항체의 다양한 농도를 이용하여 발생되었다. 도　1A 및 1B는 각각 인플루엔자 B 바이러스 균주의 집단에 대하여 mAb 34B5A 및 mAb 33F8의 중화 곡선을 보여준다. 도 1a 및 1b에서 보여진 바와 같이, mAb 34B5A 및 mAb　33F8는, 선구 인플루엔자 B 바이러스 계통, 뿐만 아니라 야마가타 및 빅토리아 계통으로부터 인플루엔자 B 바이러스에 대하여 시험관내 중화 활성을 포함하여, 인플루엔자 B 바이러스 균주의 광범위 집단의 시험관내 중화에 효과적이었다.

아래 표 2는 mAb 34B5A에 대해 상기 기재된 실험으로부터 시험관내 중화 활성 계산을 보여준다.

표 2

도 2는 인플루엔자 B 바이러스 균주의 집단에 대하여 mAb 46B8A의 시험관내 중화 곡선을 보여준다. 추가로, 도 2에서 보이는 바와 같이, mAb 46B8A는, 선구 인플루엔자 B 바이러스 계통, 뿐만 아니라 야마가타 및 빅토리아 계통으로부터 인플루엔자 B 바이러스에 대하여 시험관내 중화 활성을 포함하여, 인플루엔자 B 바이러스 균주의 광범위 집단의 시험관내 중화에서 효과적이었다.

이들 결과는 본 발명의 단클론성 항체가 투여량-의존 방식으로 시험관내 다양한 인플루엔자 B 바이러스 단리물/균주를 중화시킬 수 있음을 보여주었다. 추가로, 이들 결과는 본 발명의 단클론성 항체가, 인플루엔자 B 바이러스 균주 위스콘신/2010, 브리즈번/2008, 방글라데시/2007, 말레이시아/2004, 빅토리아/2000, 러시아/1969, 메사추세츠/1966, 매릴랜드/1959, 및 리/1940의 중화를 포함하여, 선구 인플루엔자 B 바이러스 단리물 뿐만 아니라 야마가타 및 빅토리아 계통의 후-확산으로부터 인플루엔자 B 바이러스 단리물을 중화시킬 수 있음을 보여주었다.

이들 결과는 본 발명의 단클론성 항체가 인플루엔자 B 바이러스 감염 그리고 선구, 야마가타, 및 빅토리아 계통으로부터 인플루엔자 B 바이러스 균주의 치료 및 예방에서 효과적임을 나타내었다.

실시예 5. 인플루엔자 B 바이러스 혈구응집반응 억제 검정

mAb 46B8C 및 mAb 34B5C에 의한 중화의 기전을 조사하기 위해, 혈구응집반응 억제 (HI) 검정은 2개의 인플루엔자 B 바이러스: B/빅토리아/504/2000 및 B/위스콘신/1/2010를 이용하여 수행되었다. 각 인플루엔자 B 바이러스를 위해, 5-배 단계로 8 연속 희석액은, 1:5로 시작하여, 포스페이트 완충된 염수 (PBS)에서 2중으로 만들었다. 50 μl의 각 희석액은 V-바닥 96-웰 플레이트로 이동되었다 (Costar 3894). 칠면조 적혈구 (TRBC, 람피레 생물학적 실험실 Cat# 7249408에서)는 PBS에서 0.5%로 희석되었고 50 μl는 바이러스를 함유하는 각 웰에 부가되었다. 플레이트는 실온에서 1 시간 동안 항온처리되었다. TRBC 응집을 예방하는 마지막 바이러스 희석액 (최저 바이러스 농도에 상응)은 직접적인 가시화로 측정되었고 혈구응집반응 억제 (HI) 검정에 사용되었다.

HI 검정은, mAb 46B8C 및 mAb 34B5C, 광범위 인플루엔자 B 바이러스 혈구응집소 하위유형 결합을 갖는 2개의 인간 단클론성 항체 (huMab), 및 헤르페스 바이러스 (HSV)의 당단백질 D에 대해 특이적인, 대조군 huMab gD5237로 수행되었다. 0.0032 - 250 μg/ml (3중으로) 범위에서 5-배 단계로 각 항체의 8 연속 희석액은 PBS에서 예정된 양의 B/빅토리아/504/2000 또는 B/위스콘신/1/2010 바이러스와 혼합되었고 상기에서 기재된 바와 같이 37 ℃에서 1 시간 동안 항온처리되었다. 50 μl의 바이러스-항체 혼합물은 V-바닥 96-웰 플레이트로 이동되었다. TRBC는 PBS에서 0.5%로 희석되었고 50 μl는 50 μl 바이러스-항체 혼합물을 함유하는 각 웰에 부가되었다. 각 플레이트는 실온에서 1 시간 동안 항온처리되었고 HI 역가 (즉, 혈구응집반응의 억제에서 효과적인 최저 항체 농도)는 직접적인 가시화에 의해 각 항체에 대해 측정되었다.

도 3에서 보이는 바와 같이, mAb 34B5C는 모든 B/빅토리아/504/2000 및 B/위스콘신/1/2010 인플루엔자 B 바이러스에 의해 칠면조 적혈구 (TRBC)의 혈구응집반응의 억제에서 효과적이었다. 그에 반해서, mAb 46B8C 도 대조군 gD5237 항체도, 심지어 시험된 최고 항체 농도에서, 인플루엔자 B 바이러스에 의해 혈구응집반응의 억제를 보여주지 못했다. 이들 결과는 mAb 34B5C가 인플루엔자 B 바이러스 혈구응집소의 헤드 그룹에서 수용체-결합 도메인에 결합하고 따라서 TRBC에서 시알산 수용체에 대한 바이러스의 결합을 예방하는 것을 제안하였다. 이들 결과는 또한 mAb 46B8C가 수용체-결합 도메인 외부에 있는 인플루엔자 B 바이러스 혈구응집소의 구역 (예를 들면, 대 (또는 줄기) 영역)에 결합하는 것을 제안하였다.

실시예 6. 플라크 억제 검정에 의한 시험관내 인플루엔자 B 바이러스 중화

다양한 인플루엔자 B 바이러스 단리물을 중화시키기 위해 본 발명의 항-인플루엔자 B 바이러스 혈구응집소 항체의 능력은 추가로 하기와 같이 분석되었다. 인플루엔자 B 바이러스 역가는 하기와 같이 플라크 검정에 의해 측정되었다. MDCK 세포는 6-웰 조직 배양 플레이트에서 융합성 단일층으로서 10% FBS가 보충된 DMEM 배지에서 성장되었다 (Costar 3516). 이들 연구에서 사용된 모든 인플루엔자 B 바이러스 균주는 ViraPur (Dan Diego, CA)에서 구매되었다. 바이러스 역가 측정을 위해, 각 바이러스 원액을 인플루엔자 배지 (DMEM, Gibco Cat# 15260에서 0.2%BSA, 10 mM HEPES, Gibco Cat# 10378에서 페니실린/스트렙토마이신/글루타민, 시그마 Cat# T1426에서 트립신 처리된 2 ug/mL TPCK)에서 희석되었다. 10-배 단계로 6 연속 희석액이 각각의 바이러스에 대해 1:10² 내지 1:10⁷ 로 만들어지고 각각의 1 ml가 사용되어 6-웰 플레이트에서 MDCK 세포를 감염시켰다. 감염 2 시간후, 바이러스는 제거되었고 세포는 2X 인플루엔자 배지:2% 아가로스의 1:1 혼합물 2 ml로 중첩되었다. 플레이트는 실온에서 30 분 동안 유지되었고 그 다음 37 ℃에서 5% CO₂ 인큐베이터내 항온처리되었다. 3 일후, 플라크는 불투명 빛아래 직접적인 가시화에 의해 계수되었고, 각 바이러스의 역가는 플라크 형성 단위 (PFU)/ml로 측정되었다.

플라크 억제 검정에 의한 인플루엔자 B 바이러스 중화에서 본 발명의 단클론성 항체의 효과는 그 다음 하기와 같이 조사되었다. MDCK 세포는 6-웰 조직 배양 플레이트에서 융합성 단일층으로서 10% FBS가 보충된 DMEM 배지에서 성장되었다 (Costar 3516). 각 인플루엔자 B 바이러스에 대해, (상기에서 기재된 바와 같이 측정된) 6-웰 플레이트에서 20 내지 200 플라크/웰로 수득한 바이러스의 양은 플라크 억제 검정에서 사용되었다. 0.16 내지 38.4 nM 범위의 3-배 단계로 mAb 46B8C의 6 연속 희석액은 인플루엔자 배지에서 각 바이러스와 혼합되었고, 37 ℃에서 1 시간 동안 항온처리되었다. 1 mL의 바이러스-항체 혼합물은 사용되어 6-웰 플레이트에서 MDCK 세포를 감염시켰고, 각 감염은 3중 플레이트에서 수행되었다. mAb 46B8C의 동일한 연속 희석액은 2X 인플루엔자 배지에서 만들어지고 2% 아가로스와 1:1로 혼합되었다. 감염 2시간 후, 바이러스-항체 혼합물은 제거되었고 세포는 2 mL의 항체-아가로스 혼합물로 중첩되었다. 플레이트는 실온에서 30 분 동안 유지되었고 그 다음 37 ℃에서 5% CO₂ 인큐베이터내 항온처리되었다. 5 내지 6일 후, 플라크는 불투명 빛아래 직접적인 관찰에 의해 계수되었다. 감염의 백분율은 (최저 항체 농도에서) 최고 플라크 수까지 정규화에 의해 측정되었고 X-축에서 Log 10 항체 농도에 대하여 Y-축에서 작도되었다. 데이타는 비선형회귀 투여량 반응 곡선에 맞춰져서 95% 신뢰 구간 (95% CI)을 갖는 IC50 (50% 억제를 제공하였던 농도) 값을 발성하였다.

도 4에서 보이는 바와 같이, mAb 46B8C는 투여량-의존 방식으로 시험된 모든 인플루엔자 B 바이러스 균주에 대하여 시험관내 플라크 형성을 차단하였다. 상기 기재된 mAb 46B8C를 이용한 플라크 형성 검정에서 발생된 데이타로부터 계산된 IC50 값은 아래 표 3에서 보여진다. 표 3에서 보이는 바와 같이, mAb 46B8C는 초저 농도에서 플라크 형성을 차단하였고, 1 nM 미만의 IC50 값을 나타내었다.

표 3

생각해 보면, 이들 데이타는 본 발명의 단클론성 항체가, 선구, 야마가타, 및 빅토리아 계통으로부터 인플루엔자 B 바이러스 단리물을 포함하여, 플라크 중화 검정을 이용한 인플루엔자 B 바이러스 시험관내 플라크 형성에서 억제 및 중화에서 효과적임을 나타내었다. 추가로, 이들 결과는 본 발명의 단클론성 항체가 1 nM 미만의 IC50 값에서 인플루엔자 B 바이러스 시험관내 플라크 형성을 억제함을 보여주었다.

실시예 7. 인플루엔자 B 바이러스 혈구응집소 융합 억제 검정

mAb 46B8C 및 mAb 34B5C에 의한 중화의 기전을 추가 분석하기 위해, 바이러스 진입 동안 초기 수용체 결합 단계를 건너뛰는 혈구응집소-매개된 세포-세포 융합 검정에서 이들 항체의 억제 효과는 하기와 같이 조사되었다. HeLa 세포는 6-웰 조직 배양 플레이트에서 DMEM + 10% FBS에서 ~ 40% 융합성까지 성장되었다 (Costar 3516). 각 웰에서 세포는 B/위스콘신/1/2010 혈구응집소를 발현하는 10 mg의 플라스미드로 형질감염되었다. 17 시간후, 형질감염 믹스는 세포로부터 제거되었고 10　mM 나트륨 부티레이트를 함유하는 새로운 배지는 세포에 부가되었다. 배지는 다시 6 시간후 대체되었고 세포는 밤새 ~ 80% 융합성까지 성장되었고, 그 후 융합 억제 검정은 수행되었다.

세포는 PBS에서 세정되었고 7 분 동안 37 ℃에서 PBS내 5 mg/ml TPCK 트립신 (Sigma Cat# T1426)으로 처리하였다. 트립신은 제거되었고, 50 mg/ml 대두 트립신 억제제를 함유하는 배양 배지 (CalBiochem Cat# 65035)는 부가되었고 세포는 10 분 동안 37 ℃에서 항온처리되었다. 세포는 그 다음 헤르페스 바이러스 (HSV)의 당단백질 D에 특이적인 mAb 46B8C, mAb 34B5C, 또는 대조군 인간 mAb gD5237의 20 mg/ml 또는 200 mg/ml를 함유하는 배양 배지에서 37 ℃에서 항온처리되었다. 1 시간후, 항체는 제거되었고 세포는 5 분 동안 37 ℃에서 인플루엔자 배지 (pH 4.85)에서 항온처리되었다. 낮은-pH 배지는 제거되었고 세포는 37 ℃에서 밤새 성장 배지에서 항온처리되어 다핵질의 최대 형성을 허용하였다. 세포의 상 이미지는 Nikon Eclipse TE2000-E 현미경 및 NIS-Elements AR3.2 소프트웨어를 이용하여 10X 대물렌즈하에 얻어졌다.

인플루엔자 B 바이러스 B/위스콘신/1/2010 혈구응집소를 발현하는 HeLa 세포는 낮은-pH 매질에 대한 노출 전에 20 μg/ml 또는 200　μg/ml의 mAb 46B8C, mAb 34B5C, 또는 대조군 mAb gD5237로 항온처리되었다. 다핵질은 pH 하락의 몇 시간 이내에 나타났고 밤새 배양 이후 완전히 전개되었다. mAb 46B8C는 20 μg/ml 및 200　μg/ml 모두에서 다핵질 형성을 억제하였고; 그에 반해서, mAb 34B5C 도 대조군 mAb gD5237 도 조사된 농도에서 세포-세포 융합을 차단하지 못했다. (참고: 도 5).

실시예 5에서 상기 기재된 혈구응집반응 억제 (HI) 검정에서 수득된 결과와 일치하여, 이들 결과는 mAb 46B8C가 혈구응집소 대-결합 항체이고 따라서 인플루엔자 B 바이러스 막 융합에 필요한 혈구응집소 대에서 pH-유도된 형태적 변화를 차단할 수 있음을 제안하였다. 이들 결과는 또한 mAb 34B5C가 유사하게 혈구응집소의 헤드 그룹에 결합하고, 본원에서 기재된 세포-세포 융합 검정에서 건너뛰는 단계인, 초기 수용체 결합 단계의 차단에 의해 인플루엔자 B 바이러스를 중화함을 제안하였다.

실시예 8. 다양한 인플루엔자 B 바이러스 혈구응집소에 대한 mAb 46B8C의 친화성

다양한 인플루엔자 B 바이러스 혈구응집소에 대한 mAb46B8의 친화성은 하기와 같이 측정되었다.

결합 버퍼 (2%FBS를 갖는 DMEM, 50 mM HEPES, pH 7.2 및 0.1% 나트륨 아자이드)에서 고정된 농도의 요오드화된 항-인플루엔자 B 바이러스 항체 (mAb 46B8C) 및 연속으로 희석된 농도의 비표지된 항-인플루엔자 B 바이러스 항체 (mAb 46B8C)를 함유하는 50　μL의 경쟁 반응 혼합물은 96-웰 플레이트에 배치되었다. 다양한 균주의 인플루엔자 B 바이러스를 일시적으로 발현하는 293 세포는 결합 버퍼에서 0.2 ml 마다 50,000 세포의 밀도에서 경쟁 반응 혼합물에 부가되었다. 세포와의 경쟁 반응은 2 시간 동안 실온에서 항온처리되었다. 2-시간 항온처리 이후, 경쟁 반응은 밀리포어 멀티스크린 필터 플레이트로 이동되고 결합 버퍼로 4회 세정하여 결합된 요오드화된 항체로부터 유리물을 분리하였다. 필터는 Wallac Wizard　1470 감마 계수기 (PerkinElmer Life and Analytical Sciences; Wellesley, MA)에서 계수되었다. 결합 친화성 (Munson and Rodbard (1980) Anal Biochem 7:2239)을 측정하기 위해 문손 및 로드바드의 핏팅 알고리즘을 이용하는 신규 리간드 소프트웨어 (제넨텍)를 이용하여 결합 데이타는 평가되었다.

아래 표 X는 293T 세포의 표면에서 재조합으로 발현된 다양한 인플루엔자 B 바이러스로부터 혈구응집소 3량체에 대한 mAb 46B8C의 스캐차드 (Scatchard) 결합 분석을 보여준다. 아래 표 4에서 보이는 바와 같이, mAb 46B8C는 다양한 인플루엔자 B 바이러스 혈구응집소에 대한 낮은-nM 친화성을 나타내었다.

표 4

실시예 9. B/빅토리아/2000 및 B/위스콘신/2010에 대하여 마우스에서 mAb 34B5A의 생체내 효능

마우스에서 인플루엔자 B 바이러스 감염에 대한 mAb 34B5A의 생체내 효능은 하기와 같이 수행되었다. DBA/2J 마우스 (Jackson Lab, Bar Harbor, ME)는 최소 LD₁₀₀ 투여량 (1 x 10⁴ 바이러스/마우스)으로 인플루엔자 배지 (DMEM, 0.2% BSA, 2　μg/mL TPCK-처리된 트립신)에서 희석된 50 μl의 인플루엔자 B 바이러스 균주 B/빅토리아/2000으로 비강내로 감염되었다. 인플루엔자 바이러스 감염은 mAb 34B5A의 정맥내 투여에 앞서 (B/빅토리아/2000 감염에 대해) 72 시간 동안 진행이 허용되었다.

72 시간 후 인플루엔자 B 바이러스 B/빅토리아/2000 감염 이후, 다양한 양의 mAb　34B5A는 200 μl PBS에서 15 mg/kg, 3 mg/kg, 0.6 mg/kg, 및 0.12　mg/kg의 투여량으로 마우스에 정맥내로 투여되었다. 대조군 처리된 동물은 mAb 34B5A의 최고 시험된 동등 투여량 (즉, 대략 15　mg/kg)으로 mAb gD5237 투여되었다. 마우스는 신체 상태 및 생존에 대해 매일 모니터링되었고 또한 감염 이후 21 일까지 매일 칭량되었다.

도 6a는 인플루엔자 B 바이러스 B/빅토리아/2000을 이용한 감염 72 시간 이후 mAb 34B5A의 다양한 양이 투여된 마우스의 퍼센트 생존 (경시적, 일)을 보여준다. 도　6A에서 보이는 바와 같이, 100% 사망률은 대조군 항체가 투여된 감염된 마우스에서 10 일째에 관측되었다. 그러나, 본 발명의 단클론성 항체가 투여된 감염된 마우스는 증가된 생존을 보여주었다. 특히, 100% 생존은 mAb 34B5A 15 mg/kg의 치료 투여량으로 인플루엔자 B 바이러스 B/빅토리아/2000으로 감염된 마우스에서 관측되었다.

타미플루 (오셀타미비르)의 효능과 mAb 34B5A의 효능을 비교하기 위해 평행 실험은 수행되었다. 타미플루는 72　시간 후-바이러스 감염을 시작으로 10 mg/kg, 30 mg/kg, 또는 100 mg/kg BID로 투여되었다. 타미플루가 비히클 대조군 처리된 동물의 것과 비교된 인플루엔자 B 바이러스 B/빅토리아/2000으로 감염된 마우스에 일부 보호를 제공하는 동안, 100% 사망률은 11일째에, 심지어 투여된 최고 투여량에서 관측되었다. (참고: 도 6b).

이들 결과는 본 발명의 단클론성 항체가 생체내 인플루엔자 B 바이러스 감염 치료에 효과적임을 보여주었다. 추가로, 이들 데이타는 본 발명의 단클론성 항체가 적어도 72 시간 후 인플루엔자 B 바이러스 감염까지 투여된 경우 생체내 인플루엔자 B 바이러스 감염 치료에 효과적이었음을 보여주었다. 생각해 보면, 이들 결과는 추가로 본 발명의 단클론성 항체가 72 시간 후-바이러스 감염 투여된 경우 타미플루의 효능과 비교되는 마우스에서 더 나은 생체내 효능을 표시하였음을 보여주었다.

실시예 10. 인플루엔자 B 바이러스 B/위스콘신/2010에 대한 마우스에서의 mAb 34B5C의 생체내 효능

마우스에서 인플루엔자 B 바이러스 감염에 대한 mAb 34B5C의 생체내 효능은 하기와 같이 수행되었다. DBA/2J 마우스 (Jackson Lab, Bar Harbor, ME)는 최소 LD₁₀₀ 투여량 (1 x 10⁶ 바이러스/마우스)으로 인플루엔자 배지 (DMEM, 0.2% BSA, 2　μg/mL TPCK-처리된 트립신)에서 희석된 50 μl의 인플루엔자 B 바이러스 균주 B/위스콘신/2010으로 비강내로 감염되었다. 인플루엔자 바이러스 감염은 mAb 34B5C의 정맥내 투여에 앞서 48 시간 또는 72 시간 동안 진행이 허용되었다.

48 시간 또는 72 시간 후 인플루엔자 B 바이러스 B/위스콘신/2010 감염 이후, 다양한 양의 mAb 34B5C는 200 μl PBS에서 15 mg/kg, 5 mg/kg, 및 1.7　mg/kg의 투여량으로 마우스에 정맥내로 투여되었다. 대조군 처리된 동물은 mAb 34B5C의 최고 시험된 동등 투여량 (즉, 대략 15　mg/kg)으로 mAb gD5237이 투여되었다. 마우스는 신체 상태 및 생존에 대해 매일 모니터링되었고 또한 감염 이후 21 일까지 매일 칭량되었다.

도 7a 및 7b는 각각 인플루엔자 B 바이러스 B/위스콘신/2010을 이용한 감염후 48 또는 72 시간에서 다양한 양의 mAb 34B5C가 투여된 마우스의 퍼센트 생존 (경시적(over time), 일수(days))을 보여준다. 도 7a 및 7b에서 보이는 바와 같이, 100% 사망률은 대조군 항체가 투여된 감염된 마우스에서 9일째 또는 10 일째에 관측되었다. 그러나, mAb 34B5C가 투여된 감염된 마우스는 증가된 생존을 보여주었다. (참고 도 7a 및 7b.)

이들 결과는 본 발명의 단클론성 항체가 다양한 인플루엔자 B 바이러스 감염의 치료에 효과적임을 보여주었다. 추가로, 이들 데이타는 적어도 72 시간 후 인플루엔자 B 바이러스 감염까지 투여된 경우 본 발명의 단클론성 항체가 인플루엔자 B 바이러스 감염의 치료에 효과적이었음을 나타냈다.

실시예 11. 인플루엔자 B 바이러스 B/위스콘신/2010에 대한 마우스 내의 mAb 46B8C의 생체내 효능

마우스에서 mAb 46B8C의 생체내 효능을 시험하기 위해, 항체는 4개의 상이한 인플루엔자 B 바이러스 균주 (B/위스콘신/2010, B/빅토리아/2000, B/러시아/1969, 및 B/메사추세츠/1966)로 감염된 마우스에 정맥내 투여되었다. DBA/2J 마우스 (Jackson Lab, Bar Harbor, ME)는 1 x LD₁₀₀ 투여량으로 인플루엔자 배지 (DMEM, 0.2% BSA, 2 ug/mL TPCK 처리된 트립신)에서 희석된 50 μl의 상이한 인플루엔자 B 바이러스 균주로 비강내로 감염되었다.

한 세트의 실험에서, 하기 인플루엔자 B 바이러스 단리물이 사용되었다: B/위스콘신/2010, B/빅토리아/2000, B/러시아/1969, 및 B/메사추세츠/1966. 24, 48, 또는 72　시간 후 감염에서, 항-혈구응집소 mAb 46B8C는 200 μl PBS에서 대략 15 mg/kg으로 정맥내로 투여되었다. 대조군 처리된 동물은 mAb　gD5237 (15 mg/kg)이 제공되었다. 마우스는 신체 상태 및 생존에 대해 모니터링되었고, 감염후 21 일까지 칭량되었다.

도 8a 및 8b에서 보이는 바와 같이, 100% 사망률은 각각 인플루엔자 B 바이러스 균주 B/위스콘신/2010 및 B/빅토리아/2000이 투여된 마우스에서 10일째 및 9일째에 대조군 치료 그룹에서 관측되었다. B/빅토리아/2000 또는 B/메사추세츠/1966의 감염 이후 24, 48, 또는 72 시간에서 투여된 15 mg/kg으로 mAb 46B8C의 단회 투여량은 마우스의 100% 생존을 초래하였다. (참고 도 8b 및 8d). B/위스콘신/2010 또는 B/러시아/1969 (뿐만 아니라 B/빅토리아/2000 또는 B/메사추세츠/1966)의 감염 이후 24 또는 48 시간에서 투여된 15 mg/kg으로 mAb 46B8C의 단회 투여량은 마우스의 100% 생존을 초래하였다. (참고　도 8a, 8b, 8c, 및 8d.)

이들 결과는 mAb 46B8C가 생체내 인플루엔자 B 바이러스의 다양한 균주의 감염 치료에 효과적이었음을 보여주었다. 특히, 이들 결과는 mAb 46B8C가 24, 48, 또는 72 시간 후-감염에서 투여된 경우 인플루엔자 B 바이러스 감염의 치료 및 생존의 개선에 효과적이었음을 보여주었다. 생각해 보면, 이들 결과는 본 발명의 단클론성 항체가 심지어 적어도 72 시간 후-감염까지 투여된 경우 선구, 야마가타, 및 빅토리아 계통으로부터 인플루엔자 B 바이러스 단리물의 치료에서 효과적이었음을 보여주었다.

실시예 12. 72 시간 후 인플루엔자 B 바이러스 감염 투여된 경우 마우스에서 mAb 46B8C의 생체내 효능

마우스에서 인플루엔자 B 바이러스 감염에 대한 mAb 46B8C의 다양한 투여량의 생체내 효능은 하기와 같이 수행되었다. DBA/2J 마우스 (Jackson Lab, Bar Harbor, ME)는 최소 LD₁₀₀ 투여량으로 인플루엔자 배지 (DMEM, 0.2% BSA, 2　μg/mL TPCK-처리된 트립신)에서 희석된 50 μl의 인플루엔자 B 바이러스 균주 B/위스콘신/2010 또는 B/빅토리아/2000으로 비강내로 감염되었다. 인플루엔자 바이러스 감염은 다양한 투여량의 mAb 46B8C의 정맥내 투여에 앞서 72 시간 동안 진행이 허용되었다.

72 시간 후 인플루엔자 B 바이러스 감염 이후, 다양한 양의 mAb 46B8C는 200 μl PBS에서 45 mg/kg, 15 mg/kg, 또는 5　mg/kg의 투여량으로 마우스에 정맥내로 투여되었다. 대조군 처리된 동물은 대략 45　mg/kg의 최고 시험된 동등 투여량으로 mAb gD5237이 투여되었다. 마우스는 신체 상태 및 생존에 대해 매일 모니터링되었고 또한 감염 이후 21 일까지 매일 칭량되었다.

도 9a 및 9b에서 보이는 바와 같이, 72 시간 후 인플루엔자 B 바이러스 감염에서 45 mg/kg 또는 15 mg/kg으로 mAb 46B8C의 투여는 각각 B/위스콘신/2010 또는 B/빅토리아/2000으로 감염된 마우스의 100% 생존을 초래하였다. 심지어 5 mg/kg의 투여량으로, mAb 46B8C의 투여는, 대조군-처리된 동물과 비교로, 마우스의 퍼센트 생존에 의해 측정된 바와 같이 인플루엔자 B 바이러스 B/위스콘신/2010 또는 B/빅토리아/2000에 대하여 치료적 처치 효능을 보여주었다. 상기 데이타는 mAb 46B8C가 적어도 72　시간 후 인플루엔자 B 바이러스 감염까지 투여된 경우 인플루엔자 B 바이러스 감염의 치료에 효과적이었음을 나타내었다.

실시예 13. 마우스내 중증 인플루엔자 B 바이러스 감염에서 mAb 46B8C 및 오셀타미비르의 생체내 효능 비교

본 발명의 항-인플루엔자 B 바이러스 혈구응집소 항체의 효능과 마우스내 오셀타미비르 포스페이트 (타미플루®)의 것을 비교하기 위해, 하기 연구가 수행되었다. 6-주령의 Balb/c 마우스 (찰스 리버 실험실, Hollister, CA)는 4x LD₁₀₀로 50 μl 인플루엔자 B 바이러스 균주 B/빅토리아/2000으로 비강내로 감염되었다. 48 시간 후 감염에서, 항-혈구응집소 항체 mAb 46B8C는 200　μl PBS 에서 45 mg/kg의 단회 투여량 또는 대조군 IgG로서 정맥내로 투여되었다. 이들 실험에서, 5 일 동안 1일 2회 투여된 2 mg (BID)으로 이루어진 오셀타미비르 투여 처방은 mAb 46B8C의 ~15 mg/kg의 단일 정맥내 투여량과 비교되었다. (본원에서 기재된 임의의 실시예에서 사용된 오셀타미비르 (즉, 타미플루®)는 Toronto Research Chemicals, Cat. No.　0701000으로부터 수득되었다.)

도 10a에서 보이는 바와 같이, 100% 사망률은 9일째에 대조군-IgG (mAb gD5237) 처리된 동물에서 관측되었고, 그리고 100% 사망률은 11일째에 타미플루-처리된 동물에서 관측되었다. 그러나, mAb 46B8C의 단일 15 mg/kg 투여량은 치명적인 인플루엔자 B 바이러스 유발로부터 감염된 동물의 대략 75%를 보호하였다. 추가로, mAb　46B8C로 처리된 동물은 % 체중 변화로 회복을 보여주었다. (참고: 도 10b).

실시예 14. mAb 46B8C는 타미플루와 조합에서 안전하고 폐 역가를 감소시킨다

마우스에서 오셀타미비르 포스페이트 (타미플루®)의 것에 대한 본 발명의 항-인플루엔자 B 바이러스 혈구응집소 항체의 용도 및 효능을 추가 조사하기 위해, 하기 연구가 수행되었다. 6-주령의 Balb/c 마우스 (찰스 리버 실험실, Hollister, CA)는 1x LD₁₀₀으로 50 μl 인플루엔자 B 바이러스 균주 B/빅토리아/2000으로 비강내로 감염되었다. 48 시간 후 감염에서, 항-혈구응집소 항체 mAb 46B8C는 200　μl PBS 에서 15 mg/kg의 단회 투여량 또는 대조군 IgG로서 정맥내로 투여되었다. 이들 실험에서, 5 일 (100 mg/kg) 동안 1일 2회 투여된 2 mg (BID)으로 이루어진 오셀타미비르 투여 처방은 mAb 46B8C의 ~15 mg/kg의 단일 정맥내 투여량과 비교되었다. 병용 치료가 또한 수행되었다.

도 11a에서 보이는 바와 같이, 100% 사망률은 11일째에 대조군-IgG (mAb gD5237) 처리된 동물에서 관측되었다. 그러나, 단독으로 또는 타미플루와 병용하여 투여된 경우, mAb 46B8C의 단일 15 mg/kg 투여량은 마우스의 100% 생존을 초래하였다. 추가로, mAb 46B8C와 타미플루의 조합을 이용한 동물의 치료는 상기 생체내 인플루엔자 B 바이러스 감염 모델에서 안전하고 효과적이었다.

도 11b에서 보이는 바와 같이, 단독으로 또는 타미플루와 병용하여 mAb 46B8C의 투여는 대조군-처리된 동물 또는 타미플루 단독으로 처리된 동물에서 관측된 것과 비교되는 인플루엔자 B 바이러스 폐 역가의 감소를 보여주었다.

이들 결과는 본 발명의 단클론성 항체가 뉴라민가수분해효소 억제제 (예를 들면, 오셀타미비르)와 조합으로 사용될 때 안전하고 효과적임을 나타내었다.

실시예 15. 마우스내 중증 인플루엔자 B 바이러스 감염 모델에서 mAb 46B8C와 오셀타미비르의 시너지효과

마우스에서 본 발명의 항-인플루엔자 B 바이러스 혈구응집소 항체 및 오셀타미비르 포스페이트 (타미플루®)의 공동-투여의 효능을 추가 조사하기 위해, 하기 연구가 수행되었다. 6-주령의 Balb/c 마우스 (찰스 리버 실험실, Hollister, CA)는 4x LD₁₀₀로 50 μl 인플루엔자 B 바이러스 균주 B/빅토리아/2000으로 비강내로 감염되었다. 48 시간 후 감염에서, 항-혈구응집소 항체 mAb 46B8C는 200　μl PBS 에서 15 mg/kg 또는 5 mg/kg의 단회 투여량, 또는 대조군 IgG로서 정맥내로 투여되었다. 이들 실험에서, 5 일 동안 1일 2회 투여된 2 mg (BID)으로 이루어진 오셀타미비르 투여 처방은 mAb 46B8C의 ~15 mg/kg의 단일 정맥내 투여량과 비교되었다. 이들 실험에서, 5 일 (100 mg/kg) 동안 1일 2회 투여된 2 mg (BID)으로 이루어진 오셀타미비르 투여 처방. 동물은 대조군 항체, mAb 46B8C 단독, 오셀타미비르 단독, 또는 mAb 46B8C와 오셀타미비르의 조합으로 처리되었다.

도 12a 및 12b에서 보이는 바와 같이, 대조군 항체 또는 타미플루 단독으로 투여된 동물은 9일째 또는 10일째에 100% 사망률을 보여주었다. 추가로, 5 mg/kg으로 mAb 46B8C 투여된 동물은 이러한 중증 인플루엔자 B 바이러스 감염 모델에서 9일째에 100% 사망률을 보여주었다. 그러나, mAb 46B8C 및 타미플루의 병용 치료는 5 mg/kg 또는 15 mg/kg의 투여량으로 증가된 생존을 초래하였다.

이들 결과는 본 발명의 항체를 오셀타미비르와 함께 이용하는 병용 치료가 단독 치료와 비교되는 치료 결과에서 어느 정도의 시너지효과를 제공함을 나타내었다.

실시예 16. 경쟁 ELISA

경쟁 ELISA 검정은 혈구응집소 인플루엔자 B 바이러스 (예를 들면, B/빅토리아/2000, B/위스콘신/2010, 등)를 이용하여 개발되었다. 혈구응집소-코팅된 ELISA 플레이트는 본 발명의 비오틴 표지된 단클론성 항체 (예를 들면, mAb 48B8C 등)의 포화 농도의 부가에 앞서 다양한 농도 (X-축)로 시험 항체에 결합하도록 허용된다. 만일 시험 항체가 본 발명의 단클론성 항체의 인플루엔자 B 바이러스 혈구응집소 에피토프에 대해 경쟁했다면, 비오틴 ELISA 신호 (Y-축)는 증가하는 시험 항체 농도의 기능으로서 감소된다. 결합 데이타는 비선형 투여량 반응 곡선에 맞춰져서 nM로 주어진 EC₅₀ 값을 측정한다.

본 발명의 단클론성 항체는 제조자의 권고된 프로토콜　(설포-NHS-LC-LC, Pierce, Rockford, IL)에 따라 아민 커플링을 통해 비오티닐화된다. 비오티닐화된 mAb의 최종 원액 농도는, 예를 들면, 13.2 mM이다. 용법을 위한 최적의 농도를 측정하기 위해, 비오티닐화된 mAb는 인플루엔자 B 바이러스로부터 고정된 혈구응집소에 대하여 연속으로 적정된다. 재조합 혈구응집소 단백질은 포스페이트 완충된 염수 (PBS)에서 2 μg/ml로 희석되고 96-웰 Nunc Maxisorp 플레이트 (Nunc, Rochester, NY)에 분배되었다 (100 μl). 플레이트는 밤새 4 ℃에서 코팅되고, PBS에서 린스되고, 그 다음 1% 소 혈청 알부민 (BSA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 함유하는 PBS로 1-시간 동안 실온에서 차단되었다.

그 다음 각각의 플레이트는 1.0% BSA 및 0.05% 폴리소르베이트 20 (Sigma-Aldrich)을 함유하는 PBS에서 1/3 희석액으로 88　nM의 초기 농도로 시작하는 100 μl의 연속으로 희석된 비오티닐화된 mAb를 받는다. 1 시간 항온처리 이후, 플레이트는 세정되고 그 다음 스트렙타비딘-접합된 서양고추냉이 페록시다아제 (Caltag Laboratories, Carlsbad, CA)의 1:5000 희석액 100　μl로 30 분 동안 실온에서 항온처리되었다. 항온처리 이후, 플레이트는 세정되고 100 μl의 TMB 기질 (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc. Gaithersburg, MD)로 전개되었다. 플레이트는 O.D. 450 nM에서 스펙트라맥스 플레이트 리더 (Molecualar Devices, Sunnyvale, CA.)에서 판독된다. 비오티닐화된 mAb의 최적의 농도는, 예를 들면, 1 nM 인 것으로 측정된다.

실시예 17. 인플루엔자 B 바이러스 B/브리즈번/2008에 대하여 마우스에서 mAb 46B8C의 생체내 효능

인플루엔자 B 바이러스 B/브리즈번/2008, 빅토리아 계통의 인플루엔자 B 바이러스 (Viapur, LLC, San Diego, CA)에 대하여 마우스에서 mAb 46B8C의 생체내 효능을 시험하기 위해, 하기 연구가 수행되었다. DBA/2J 마우스는 인플루엔자 B 바이러스 B/브리즈번/2008의 최소의 1 x LD₁₀₀ 투여량 (1X10⁴ PFU/마우스)으로 비강내로 감염되었다. 24, 48, 및 72 시간 후-감염에서, 8　암컷 마우스/그룹은 0.1 mL PBS에서 15 mg/kg으로 정맥내로 mAb 46B8C 투여되었다. 마우스는 생존에 대해 모니터링되었고, 21 일 후-감염까지 칭량되었다. 대조군으로서, 감염된 마우스의 그룹은 15　mg/kg 72 시간 후-감염으로 인간 IgG1 항체　항-gD (마우스에서 공지된 표적 없음)로 처리되었다.

도 26a에서 보이는 바와 같이, 100% 사망률은 대조군 치료 그룹에서 11일째에 인플루엔자 B 바이러스 B/브리즈번/2008 투여된 마우스에서 관측되었다. 인플루엔자 B 바이러스 B/브리즈번/2008로 감염 이후 24, 48, 또는 72 시간에서 투여된 15 mg/kg으로 mAb 46B8C의 단회 투여량은 마우스의 100% 생존을 초래하였다. (참고 도 26a). 도 26b는 상기 기재된 다양한 조건 및 치료하에서 마우스의 체중 변화를 보여준다.

이들 결과는 mAb 46B8C가 빅토리아 계통으로부터 인플루엔자 B 바이러스 B/브리즈번/2008의 감염 치료에 효과적이었음을 보여주었다.

통계적인 분석

통계는 JMP 버전 9.0.2 소프트웨어 (SAS Institute)를 이용하여 계산되었다. 생존 실험은 로그-순위 시험을 이용하여 비교되었다. P 값<0.05는 유의미한 것으로 고려되었다. IC₅₀ 곡선 및 값은 Graphpad Prism 버전 5.0 소프트웨어를 이용하여 작도되고 계산되었다.

비록 전술한 발명이 명확한 이해의 목적으로 예시 및 실시예의 방식으로 일부 상세하게 기재되어도, 상세한설명 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본원에서 인용된 모든 특허 및 과학적 문헌의 개시내용은 명확히 그 전체가 참고로 편입된다.

SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. ET AL. <120> ANTI-INFLUENZA B VIRUS HEMAGGLUTININ ANTIBODIES AND METHODS OF USE <130> P05794R1-WO <140> <141> <150> 61/971,123 <151> 2014-03-27 <160> 108 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1 gaagtagtcc ttgaccaggc ag 22 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2 ctcagcgtca gggtgytgct gag 23 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 3 gggtktggts gtctccac 18 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 4 caggtgcagc tggtgcagtc tggggc 26 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> 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Claims

3개의 중쇄 초가변 영역 (HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3) 및 3개의 경쇄 초가변 영역 (HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3)을 포함하는 인플루엔자 B 바이러스 혈구응집소에 특이적으로 결합하는, 단리된 항-혈구응집소 단클론성 항체로서,
(a) HVR-H1은 서열 식별 번호:63의 아미노산 서열을 포함하고;
(b) HVR-H2는 서열 식별 번호:67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 및 74로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;
(c) HVR-H3은 서열 식별 번호:77의 아미노산 서열을 포함하고;
(d) HVR-L1은 서열 식별 번호:56의 아미노산 서열을 포함하고;
(e) HVR-L2는 서열 식별 번호:58의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
(f) HVR-L3은 서열 식별 번호:60의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항-혈구응집소 단클론성 항체.
제 1 항에 있어서, 상기 항체가 서열 식별 번호:91의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항-혈구응집소 항체.
제 1 항에 있어서, 상기 항체가 서열 식별 번호:92, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 및 107로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항-혈구응집소 항체.
제 1 항에 있어서, 상기 항체가 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열 식별 번호:91의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역이 서열 식별 번호:92, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 및 107로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항-혈구응집소 항체.
제 1 항에 있어서, 상기 항체가 서열 식별 번호:93의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 단리된 항-혈구응집소 항체.
제 1 항에 있어서, 상기 항체가 서열 식별 번호:94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 및 108로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 단리된 항-혈구응집소 항체.
제 1 항에 있어서, 상기 항체가 경쇄 및 중쇄를 포함하고, 상기 경쇄가 서열 식별 번호:93의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 상기 중쇄가 서열 식별 번호:94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 및 108로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항-혈구응집소 항체.
3개의 중쇄 초가변 영역 (HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3) 및 3개의 경쇄 초가변 영역 (HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3)을 포함하는 인플루엔자 B 바이러스 혈구응집소에 특이적으로 결합하는, 단리된 항-혈구응집소 단클론성 항체로서,
(a) HVR-H1은 서열 식별 번호:61의 아미노산 서열을 포함하고;
(b) HVR-H2는 서열 식별 번호:64 및 65로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;
(c) HVR-H3은 서열 식별 번호:75의 아미노산 서열을 포함하고;
(d) HVR-L1은 서열 식별 번호:55의 아미노산 서열을 포함하고;
(e) HVR-L2는 서열 식별 번호:57의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
(f) HVR-L3은 서열 식별 번호:59의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항-혈구응집소 단클론성 항체.
제 8 항에 있어서, 상기 항체가 서열 식별 번호:78, 82, 및 86으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항-혈구응집소 항체.
제 8 항에 있어서, 상기 항체가 서열 식별 번호:79 및 83으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항-혈구응집소 항체.
제 8 항에 있어서, 상기 항체가 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열 식별 번호:78, 82, 및 86으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 상기 중쇄 가변 영역이 서열 식별 번호:79 및 83으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항-혈구응집소 항체.
제 8 항에 있어서, 상기 항체가 서열 식별 번호:80, 84, 및 87로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 단리된 항-혈구응집소 항체.
제 8 항에 있어서, 상기 항체가 서열 식별 번호:81, 85, 및 88로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 단리된 항-혈구응집소 항체.
제 8 항에 있어서, 상기 항체가 경쇄 및 중쇄를 포함하고, 상기 경쇄가 서열 식별 번호:80, 84, 및 87로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 상기 중쇄가 서열 식별 번호:81, 85, 및 88로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항-혈구응집소 항체.
3개의 중쇄 초가변 영역 (HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3) 및 3개의 경쇄 초가변 영역 (HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3)을 포함하는 인플루엔자 B 바이러스 혈구응집소에 특이적으로 결합하는, 단리된 항-혈구응집소 단클론성 항체로서,
(a) HVR-H1은 서열 식별 번호:62의 아미노산 서열을 포함하고;
(b) HVR-H2는 서열 식별 번호:66의 아미노산 서열을 포함하고;
(c) HVR-H3은 서열 식별 번호:76의 아미노산 서열을 포함하고;
(d) HVR-L1은 서열 식별 번호:55의 아미노산 서열을 포함하고;
(e) HVR-L2는 서열 식별 번호:57의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
(f) HVR-L3은 서열 식별 번호:59의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항-혈구응집소 단클론성 항체.
제 15 항에 있어서, 상기 항체가 서열 식별 번호:78의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항-혈구응집소 항체.
제 15 항에 있어서, 상기 항체가 서열 식별 번호:89의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항-혈구응집소 항체.
제 15 항에 있어서, 상기 항체가 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열 식별 번호:78의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 상기 중쇄 가변 영역이 서열 식별 번호:89의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항-혈구응집소 항체.
제 15 항에 있어서, 상기 항체가 서열 식별 번호:80의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 단리된 항-혈구응집소 항체.
제 15 항에 있어서, 상기 항체가 서열 식별 번호:90의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 단리된 항-혈구응집소 항체.
제 15 항에 있어서, 상기 항체가 경쇄 및 중쇄를 포함하고, 상기 경쇄가 서열 식별 번호:80의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 상기 중쇄가 서열 식별 번호:90의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항-혈구응집소 항체.
인플루엔자 B 바이러스 감염의 치료, 억제 또는 예방을 필요로 하는 개체에서 인플루엔자 B 바이러스 감염의 치료, 억제 또는 예방 방법으로서,
상기 개체에게 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하여, 이로써 인플루엔자 B 바이러스 감염을 치료, 억제, 또는 예방하는 단계를 포함하는, 방법.
제 22 항에 있어서, 상기 방법이 상기 개체에게 추가의 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제 23 항에 있어서, 상기 추가의 치료제가 뉴라민가수분해효소 억제제, 항-혈구응집소 항체 또는 항-M2 항체인, 방법.
제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 조성물.
제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항의 항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항의 항체를 암호화하는, 단리된 핵산.
제 27 항의 핵산을 포함하는, 숙주 세포.
항체의 생산 방법으로서,
제 28 항의 숙주 세포를 배양시켜 상기 항체가 생산되도록 하는 단계를 포함하는, 방법.
약제의 제조에서의, 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항의 항체의 용도.
제 30 항에 있어서, 상기 약제가 인플루엔자 B 바이러스 감염 치료, 억제, 또는 예방을 위한 것인, 용도.