KR20160135096A

KR20160135096A - 과채류 발효물 제조방법 및 과채류 발효물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20160135096A
Application number: KR1020160057373A
Authority: KR
Inventors: 배수정; 송민현; 오정영; 배준태; 김진화; 이근수; 표형배
Original assignee: 한불화장품주식회사
Priority date: 2015-05-14
Filing date: 2016-05-11
Publication date: 2016-11-24
Also published as: KR101905517B1

Abstract

본 발명은 가공하지 않은 신선한 토마토, 레몬, 멜론, 감귤, 자몽, 파프리카 등의 파쇄하지 않은 신선한 과일 및 야채류에 유산균 배양액을 첨가, 배양하여 수득한 과채류 발효물 제조방법 및 이들 유효성분을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로는 유산균 전 배양액을 멸균된 주사기로 신선한 과육 및 야채류에 접종하여 정치배양을 통해 발효한 과채류 발효물과 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화장료 조성물은 과채류 발효물을 유효성분으로 함유하며 항산화 효과, 콜라겐 합성 촉진 효과, 주름개선효과, 미백효과, 보습효과, 피부자극 완화효과 등이 우수하다.

Description

과채류 발효물 제조방법 및 과채류 발효물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 {Methods for manufacturing of fermented products of fruits and vegetables and cosmetic composition containing the fermented products}

본 발명은 가공하지 않은 신선한 토마토, 레몬, 멜론, 감귤, 자몽, 사과, 바나나, 파프리카, 피망, 당근, 오이, 알로에, 고구마, 감자 등의 과채류에 유산균 배양액을 첨가, 배양하여 수득한 과채류 발효물 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 분쇄하지 않은 신선한 생(生) 과일 또는 야채류에 주사기로 유산균을 접종하는 공정, 유산균이 접종된 과일 또는 야채류를 정치 배양하는 공정, 배양된 과일 또는 야채류를 파쇄, 압착, 원심분리하여 비타민 또는 펩타이드 등 발효과정에서 생성된 활성성분을 함유하는 과채류 발효물을 제조하는 방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

과채류라 함은 과일과 채소를 통칭하는 말이다. 과채류는 대부분 겉 표면에는 섬유질을 함유하고 있으나 내부에는 수분을 다량 함유하고 있고, 당질, 비타민, 유기산, 폴리페놀 등 인체에 유효한 성분을 많이 함유하고 있다. 과채류는 생으로 섭취하거나 이용하는 방법 외에도 즙을 내어 섭취하거나 피부에 적용하는 방법, 열수나 유기용매를 이용하여 활성성분을 추출하여 식품, 화장료 등으로 이용하는 방법 등이 있다.

최근에는 과채류에 유산균을 접종하여 발효시켜 가공식품을 제조하는 방법이 개발되고 있다. 한국특허 제319377호에는 채소와 한약재의 착즙액을 락토바실러스 플라타룸으로 발효시켜 제조한 발효음료가 개시되어 있고, 한국특허 제778886호에는 과일, 야채 또는 이의 혼합물에 효모와 유산균을 단계적으로 접종하여 발효시킨 과채 발효물 제조방법 및 이 과채 발효물을 포함하는 기능성 조성물이 개시되어 있다. 그러나, 위 발명들은 과채류를 신선한 상태로 이용하는 것이 아니라 착즙하거나 분쇄하여 균을 접종하여 발효하는 방법을 채택하였다.

또한, 멜론의 경우 플라보노이드 함량이 높아 항산화 능력이 뛰어난 천연 멜론 과육 농축물을 함유하는 동시에 과육 농축물 제조시 폐기되는 과피로부터 천연 멜론향 및 비타민과 같은 유효성분을 비가열 방식으로 농축하여 첨가하는, 천연의 멜론 향을 보유하면서도 천연 플라보노이드 및 비타민이 한층 강화된 멜론과 비타민을 함유하는 건강기능성 식품 (공개특허공보 10-2012-0003602)이나 순수과즙 100%로 이루어진 무가당, 무첨가 유산균 과즙 발효액을 제공하고자, 일반적인 과즙 농축액의 산성조건 (pH 3.0~5.0)에서도 생존 및 발육이 우수한 유산균을 과즙에 접종한 과즙 음료 (공개특허 10-2015-0041519) 등과 같이 대부분 식음료 및 건강 기능 식품으로만 이용되고 있다. 하지만, 앞에서 언급한 바와 같이 과일 및 야채류의 풍부한 유기산과 비타민을 추출을 이용할 경우 물리적 및 화학적 변성으로 인해 대부분 체내 흡수가 불가한 상태가 된다. 과채류의 경우 유산균을 이용하여 발효 배양할 경우, 항산화 활성이 20% 증가하며, 폴리페놀 및 플라보노이드의 함량도 미량 증가한다는 것을 확인하였다 (The Korean Society for Applied Microbiology Vol.43 No.3, 291-295 (2015)).

또한, 대한민국 공개특허공보 제10-2010-0095137호에는 과채를 분쇄하여 발효조에서 발효하여 원심분리하여 얻은 과채 발효수를 함유하는 화장품 조성물이 개시되어 있다.

이와 같은 종래의 방법들은 과육을 단순히 식음료로 이용하거나 미생물 발효 배양을 이용하더라도 추출 단계에서 베타카로틴 또는 레티놀 등 지용성 비타민 A 그리고 수용성 비타민 C 등이 열이나 유기용매를 이용한 추출로 인하여 구조가 쉽게 파괴되는 단점, 그리고 과채류를 분쇄하여 발효함으로써 발효공정에서 오염 가능성이 높다는 문제점이 있다.

대한민국 등록특허 제778886호 대한민국 공개특허공보 제10-2010-0095137호 대한민국 등록특허 제319377호 대한민국 공개특허공보 제10-2012-0003602호

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하고 가공되지 않은 과채류의 생(生) 과육에 직접 유산균 발효액을 접종하여 배양한 과채류 발효물 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목표로 한다.

또한, 본 발명은 자외선에 의한 피부 광손상 방어, 보습, 피부 주름의 개선, 피부 탄력 개선효과 및 미백효과가 우수한 과채류 발효물을 제공함으로써, 화장품 원료로서 상용성이 우수한 화장료 조성물을 제공하는 것을 목표로 한다.

위와 같은 과제를 해결하기 위하여 본 발명자들은 과일 및 야채류에 함유되어 있는 비타민, 무기질, 폴리페놀, 플라보노이드 성분 등 유효성분의 손실을 최소화하고, 유산균 발효 배양을 통하여 저분자화된 펩타이드, 플라보노이드 등의 유효성분이 좀 더 효과적으로 피부로 다량 흡수되는 과채류 발효물의 제조방법을 발명하였으며, 이를 통해 얻어진 과채류 발효물에 대하여 피부 주름 개선효과, 피부 탄력 개선효과, 피부세포 광손상 방어 효과 및 피부 자극완화 효과를 실험하여 바람직한 결과를 얻고, 화장품 원료로서 상용성이 우수한 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 다양한 종류의 과일 및 야채를 가공하지 않은 상태로 유산균을 이용하여 발효 배양하여 화장품 원료로서 상용성이 우수하고, 피부 개선 효능효과를 나타내는 과채류 발효물을 제공한다.

좀 더 구체적으로 본 발명은

1단계: 수세한 신선한 생과일 또는 생채소에 유산균을 접종하는 공정,

2단계: 유산균이 접종된 생과일 또는 생채소를 온도 25~37℃ 조건에서 3~5일 동안 발효 상태를 확인하면서 배양하는 공정,

3단계: 상기 발효된 과일 또는 채소를 파쇄 및/또는 압착하고 원심분리하여 침전물과 유산균체가 제거된 과채류 발효액을 회수하는 공정 및

4단계: 상기 과채류 발효액을 감압농축 및 동결건조하는 공정을 포함하는 과채류 발효물의 제조 방법에 관한 것이다.

상기 유산균으로는 락토바실러스속 (Lactobacillus sp .), 스트렙토코커스속 (Streptococcus sp.), 류코노스톡속 (Leuconostoc sp.) 또는 비피도박테리아속 (Bifidobacteria sp.) 등의 미생물을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 발효물의 함량이 화장료 조성물 전체에 대해 0.001~80.0중량%인 것을 특징으로 하는 과채류 발효물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 상기 발효물 함량이 0.001중량% 미만으로 포함되는 경우에는 피부개선효과가 거의 없으며, 80.0중량%를 초과하는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하여 경제적이지 못하다.

또한, 본 발명은 유효성분으로 함유되는 과채류 발효물이 항산화 효과, 세포 내 활성산소 제거 효과, 기질 금속단백질분해효소(MMP-1) 활성 저해효과, 기질 금속단백질 분해효소(MMP-1) 발현 억제효과, 프로콜라겐 생합성 촉진효과, 엘라스틴 생성 촉진효과, 미백효과, 염증유발관련 효소인 히알루로니다제(hyaluronidase) 활성 억제효과, 자외선 조사에 의한 세포독성 완화효과 등이 우수한 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 과채류 발효물을 함유하는 피부 미백 효능을 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 과채류 발효물을 함유하는 노화 방지 효능을 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 과채류 발효물을 함유하는 피부자극 완화 효능을 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 과채류 발효물을 함유하는 화장료 조성물은 항산화, 콜라겐 합성 촉진, 미백효과, 피부자극 완화 및 항염증의 효과를 나타내어 우수한 피부 개선효과를 발휘한다.

또한, 본 발명의 과채류 발효물 제조방법은 과채류를 파쇄, 분쇄 또는 착즙하여 발효하는 종래의 방법과 달리 생과일 또는 생야채에 직접 유산균을 접종하기 때문에 발효 공정에서 오염 가능성이 낮고, 공정이 간편하다.

도 1은 가공되지 않은 생(生) 파프리카에 유산균 배양액을 직접 접종한 후, 발효 배양하여 수득한 파프리카 발효물의 제조 방법을 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1: 과채류 발효물 제조

토마토, 레몬, 멜론, 감귤, 자몽, 파프리카 중 한 가지를 선택하여 수세한 신선한 생과일 또는 생채소에 멸균 주사기를 이용하여 종균으로 순수 배양한 유산균 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillius plantarum)을 10⁷ cell/ml로 과채류 내부에 직접 3%(w/w)를 접종하고 접종된 부위는 멸균 테이프로 봉합한 후, 온도 35℃ 조건에서 3일 동안 정치배양하였다.

상기 발효된 과육을 파쇄 및 압착하여 즙으로 짜내어 10,000 × g에서 20분간 원심분리하여 침전물과 유산균체가 제거된 발효액을 얻고, 이를 감압농축 및 동결건조하여 분말상의 발효물을 얻었다.

비교예 1: 일반 추출물을 발효하여 추출 발효물 제조

수세한 토마토, 레몬, 멜론, 감귤, 자몽, 파프리카 중 1종을 선택하여 50g을 파쇄하여 증류수 50g을 혼합한 수용액으로 80℃에서 6시간 환류 추출하고 냉각한 후, 배양을 위해 121℃에서 15분간 멸균하였다. 멸균이 끝난 추출물에 종균배양 배지로부터 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillius plantarum)을 10⁷ cell/ml로 3%(w/w) 접종하여 온도 35℃, 회전수 120rpm, 통기량 0.5vvm의 조건으로 2일간 배양하였다.

상기 발효액을 10,000 × g에서 20분간 원심분리하여 침전물과 유산균체가 제거된 일반 추출물 발효액을 감압농축 및 동결건조하여 분말을 얻었다. 이를 상기 실시예 1에서 수득한 과채류 발효물 시료의 대조 시료로 사용하였다.

실험예 1: 본 발명의 과채류 발효물에 함유된 성분 분석 및 함량 측정

본 실험예 1에서는 상기 비교예 1에서 제조된 발효물과 실시예 1에서 제조된 발효물의 주요성분 중 총 폴리페놀, 총 플라보노이드, 베타카로틴, 비타민 C 및 펩타이드 생성 정도를 측정하기 위해서 티로신 함량을 비교하였다.

(1) 총 페놀 함량 측정

비교예 1과 실시예 1의 시료 1㎖에 각각 증류수 10㎖을 첨가한 후, 2㎖의 Folin-Ciocalteu phenol reagent (Sigma)를 첨가하여 혼합한 다음, 실온에서 5분간 반응시켰다. 이 반응물에 20% 소듐 카보네이트를 2㎖ 첨가하여 혼합한 다음, 상온에서 1시간 반응시킨 후 680nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 지표물질로 갈릭산 (gallic acid)을 사용하였다.

(2) 총 플라보노이드 함량 측정

비교예 1과 실시예 1의 시료 각 1.5㎖에 동량의 메탄올에 용해된 2% AlCl₃H₂O를 혼합한 다음, 상온에서 10분간 반응시킨 후 367nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 지표물질로 카테킨 (catechin)을 사용하였다.

(3) 펩타이드 생성 함량 측정

비교예 1과 실시예 1에서 얻은 시료 1mg과 지표물질 일정량을 각각 정제수 10㎖과 혼합, 여과한 후 0.7㎖를 취하여 1.44M TCA 용액 0.7㎖를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 회수된 상등액 1㎖에 0.55M Na₂CO₃ 2.5㎖과 Folin phenol 시약 0.5㎖을 혼합한 후 37℃ 항온수조에서 30분간 반응시켜 냉각 후 UV 흡광광도계를 이용하여 660nm 흡광도를 측정하였다. 이때 지표물질로 티로신 (Tyrosine)을 사용하였다.

(4) 베타카로틴 함량 측정

비교예 1과 실시예 1에서 얻은 시료 1g과 지표물질 일정량을 각각 환저 플라스크에 정밀하게 달아 넣은 후 10% 피로갈롤/에탄올 용액 1㎖, 15% 수산화칼륨/메탄올 용액 30-40㎖를 가한 후, 석유에테르(특급)로 2회 반복추출, 탈수, 농축하여 HPLC 분석용 시험용액으로 하였다. HPLC 분석 방법은 Waters (USA)사의 2695 시스템을 이용하였으며, 컬럼은 Waters (USA)사의 Symmetry C18 (4.6mm ID X 250mm)을 사용하였다. 이동상은 에틸아세테이트/아세트니트릴/초산완충액을 이용하였다. 컬럼 온도 30℃, 1.0 ml/min의 등용매 조건으로 전개, PDA (Photodiode array) 탐지기로 455nm 흡광도를 측정하였다. 이때 지표물질로 베타카로틴 (Beta-Carotene)을 사용하였다.

(5) 비타민 C 함량 측정

비교예 1과 실시예 1에서 얻은 시료 1mg과 지표물질 일정량을 각각 메타인산-초산용액 100㎖과 혼합, 여과한 후 DNP(2,4-dinitrophenylhydrzine) 법으로 UV 흡광광도계를 이용하여 520nm 흡광도를 측정하였다. 이때 지표물질로 비타민 C를 사용하였다.

시료명		총 폴리페놀 함량 (ug/g of powder)	총 플라보노이드 함량 (ug/g of powder)	티로신 함량 (mg/100g of powder)
비교예 1	토마토	124.6	42.3	18.1
	레몬	251.4	71.8	22.3
	멜론	302.6	33.3	8.8
	감귤	131.5	39.6	24.8
	자몽	301.8	88.2	27.6
실시예 1	토마토	142.8	71.2	25.5
	레몬	311.3	100.3	40.9
	멜론	404.8	60.9	18.3
	감귤	305.1	64.4	36.6
	자몽	552.7	102.2	44.5

시료명	베타카로틴 함량 (ug/100g of powder)	비타민 C 함량 (mg/100g of powder)	티로신 함량 (mg/100g of powder)
비교예 1 파프리카	204.6	42.3	18.1
실시예 1 파프리카	3,764.5	128.6	74.8

총 폴리페놀류, 총 플라보노이드 및 티로신 함량 측정 결과 (표 1), 실시예 1에 의해 얻은 시료가 비교예 1의 시료보다 총 폴리페놀류와 총 플라보노이드류 함량이 높은 것을 확인할 수 있었는데, 특히 유산균 발효배양 후 펩타이드 생성 정도를 티로신 함량으로 확인한 결과 실시예 1이 비교예 1에 비해 약 2배 증가한 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 가공되지 않은 과채류 생과육에 유산균 발효액을 직접 접종하여 발효시킴으로써 과육 본연의 비타민 손실을 최소화시킬 수 있다는 사실을 확인하였고, 유산균 발효배양으로 인한 펩타이드 생성이 증가한다는 것을 확인할 수 있었다.

파프리카 발효물의 베타카로틴 함량 및 비타민 C 함량 측정 결과 (표 2), 실시예 1의 방법으로 얻은 시료가 비교예 1의 방법으로 얻은 시료보다 베타카로틴 함량 및 비타민 C 함량이 높은 것을 확인할 수 있었는데, 특히 유산균 발효배양 후 펩타이드 생성 정도를 티로신 함량으로 확인한 결과 실시예 1 시료가 비교예 1 시료에 비해 4배 이상 증가한 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 가공되지 않은 생(生) 파프리카에 유산균 발효액을 직접 접종하여 발효시킴으로써 파프리카 본연의 비타민 손실을 최소화시킬 수 있다는 사실을 확인하였고, 유산균 발효배양으로 인한 펩타이드 생성이 증가한다는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 2: 세포 내 활성산소 소거 효과 측정

본 비교예 1과 실시예 1에서 얻은 발효물에 대하여 자외선에 의해 세포 내에서 생성되는 활성산소의 소거 효과를 측정하기 위해 EGCG(epigallocatechin gallate)를 비교시료로 사용하였고, 형광물질을 이용하여 아래와 같은 실험을 수행하였다.

본 실험예 2에서 사용한 세포주는 독일 암연구센터의 퓌세니그 박사 (Dr. Fusenig)로부터 분양받은 인간 각질세포 HaCaT 세포주 (Human keratinocytes HaCaT cell line)로서 이를 형광측정용 96-웰 블랙 플레이트 (well black plate)에 웰당 2.0 × 10⁴개로 분주하고 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM (Dulbeccos Modification of Eagles Medium, FBS 10%, Gibco, USA) 배지를 사용하여 37, 5% CO₂조건에서 1일간 배양한 후, 각각의 시료를 0.01% 농도로 처리하였다.

시험 시료를 넣고 24시간 배양한 후, HCSS (HEPES-buffered control salt solution)로 세척하여 남아있는 배지를 제거하고 HCSS에 20μM로 준비된 DCFH-DA (2',7'- dichlorodihydro-fluorescein diacetate, Molecular Probes, USA)를 100㎕ 가하고 37℃, 5% CO₂조건에서 20분간 배양한 후, HCSS로 세척하였다. 이후 농도별로 처리된 HCSS를 100㎕ 가한 후, 초기에 활성산소로 산화된 DCF (dichlorofluorescein)의 형광도를 형광플레이트 판독기 (Ex;485 nm, Em;530nm)로 측정하였다. 이후 UVB (20mJ/cm²)를 조사하고 각 시료를 처리한 후, 형광도를 형광플레이트 판독기 (Ex;485 nm, Em;530nm)로 측정하였다.

시료명		활성산소 소거 효과(%)
비교예 1 (0.01 중량%)	토마토	31
	레몬	38
	멜론	29
	감귤	31
	자몽	34
	파프리카	31
실시예 1 (0.01 중량%)	토마토	45
	레몬	55
	멜론	42
	감귤	44
	자몽	52
	파프리카	52
EGCG 0.01 중량%		44

활성산소 소거 효과를 측정한 결과 (표 3), 본 발명의 과채류 발효물은 EGCG와 동일한 농도에서 EGCG와 유사하거나 다소 높은 활성산소 소거율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 위 결과로부터 본 발명에 의한 과채류 발효물의 우수한 활성산소 소거 효과를 확인할 수 있었다.

실험예 3: 자외선 조사 후 금속단백질분해효소 ( MMP -1) 발현억제 정도 측정

콜라겐을 분해하여 피부의 탄력 저하 및 주름 형성에 영향을 미치는 금속단백질분해효소 (MMP-1)는 자외선 조사에 의해 활성화되기도 한다. 본 실험예 3에서는 비교예 1과 실시예 1에서 수득한 발효물에 대하여 자외선 조사 후 금속단백질분해효소 (MMP-1) 발현억제 정도를 측정하기 위해 레티놀을 비교시료로 사용하였다.

UV 조사 및 시료 첨가 후, 금속단백질분해효소 (MMP-1) 농도를 측정하기 위해서 효소면역 시험법 (ELISA)을 수행하였다. UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 6.3J/㎠의 에너지로 조사하였고, 자외선 조사량과 배양시간은 예비 실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP-1 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 시간 유지하였고, UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고, UVA를 조사한 후 시료가 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양하고, 배지를 회수하여 96-웰 플레이트에 코팅하였다. 일차항체 (MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체)를 처리하고 37℃에서 60분 반응시켰다. 이차항체인 항마우스 IgG (whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질 용액 (1mg/㎖ ρ-nitrophenyl phosphate in diethanolamine 완충용액)으로 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 판독기로 405㎚에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용하였다.

시험군		MMP-1 발현 억제율(%)
대조군		-
비교예 1 (0.01 중량%)	토마토	12
	레몬	28
	멜론	11
	감귤	16
	자몽	20
	파프리카	15
실시예 1 (0.01 중량%)	토마토	35
	레몬	45
	멜론	42
	감귤	44
	자몽	42
	파프리카	53
레티놀 (0.01 중량%)		32

자외선 조사 후 금속단백질분해효소 발현억제 정도를 측정한 결과 (표 4), 시료를 처리하지 않은 대조군에 비해 본 발명의 과채류 발효물은 최대 53% 이상의 억제율을 보였는데, 이는 비교시료로 사용한 레티놀의 억제율과 비교해도 상당히 우수한 결과였다.

위의 결과로부터 본 발명에 의한 과채류 발효물은 일반 발효물보다 금속단백질분해효소 발현 억제효과가 우수하다는 사실을 확인할 수 있었고, 이를 바탕으로 본 발명의 피부 외용제 조성물은 금속단백질분해효소의 발현을 효과적으로 억제함으로써 피부의 탄력 저하 및 주름 형성을 예방할 수 있음을 추론할 수 있었다.

실험예 4: 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진효과 측정

본 실험예 4에서는 비교예 1과 실시예 1에서 수득한 발효물의 피부기질 성분인 타입 1 프로콜라겐의 생합성을 촉진하는 효과를 확인하기 위하여 TGF-β를 양성대조군으로 사용하였고, 프로콜라겐 분석을 아래와 같이 수행하였다.

신생아의 포피조직에서 분리한 사람진피섬유아세포 (human dermal fibroblast)는 Modern Tissue Technology (MTT, Korea)로부터 분양받아 DMEM/F-12(3:1) 배지에 10% 우태아혈청 (FBS)을 첨가하여 1×10⁴cell/㎠ 농도로 배양하였다. 70-80% 정도 자라면 1:3의 비율로 분주하여 계대 배양하였고, 3~4차 계대배양된 세포를 실험에 이용하였다.

프로콜라겐의 양을 측정하는 실험을 위해서 섬유아세포를 48 웰 플레이트에 90% 이상 배양한 후, 각각의 시료를 0.02% 농도로 가하고, 24시간 후에 배지 중에 유리된 프로콜라겐의 양을 프로콜라겐타입-1C-펩타이드 EIA 키트 (procollagen type-1 C-peptide EIA kit)(MK101, Takara, Japan)를 사용하여 측정하였다.

시료명		프로콜라겐 생합성 촉진효과(%)
비교예 1 (0.02 중량%)	토마토	11
	레몬	14
	멜론	12
	감귤	14
	자몽	16
	파프리카	12
실시예 1 (0.02 중량%)	토마토	31
	레몬	36
	멜론	29
	감귤	33
	자몽	33
	파프리카	37
TGF-β (0.001 중량%)		38

프로콜라겐 생합성 촉진효과를 측정한 결과 (표 5), 실시예 1의 과채류 발효물을 0.02% 처리한 경우 프로콜라겐의 생합성은 파프리카 발효물에서 최대 37% 촉진되었으며, 세포신호전달 물질 TGF-β와 유사한 효과를 나타내었다.

위 결과로부터 본 발명에 의한 과채류 발효물은 일반 발효물보다 프로콜라겐 생합성 촉진효과가 우수함을 확인할 수 있었고, 본 발명 과채류 발효물의 피부 개선효과를 추론할 수 있었다.

실험예 5: 티로시나제 활성 억제효과 측정

상기 비교예 1과 실시예 1에서 수득한 발효물의 티로시나제 활성 저해효과를 확인하기 위해 미백제로 잘 알려진 알부틴을 비교시료로 사용하였다.

티로시나제는 생체 내에서 티로신 (tyrosine)이라는 물질의 산화과정을 촉진하여 멜라닌이 생성되도록 하는 효소이다. 티로시나제는 버섯에서 분리 및 정제된 것으로 Sigma사에서 구입하여 사용하였다. 기질인 L-티로신 (Sigma)은 0.05M 인산나트륨 완충용액 (pH 6.8)에 용해하여 0.1㎎/㎖ 용액으로 만들어 사용하였다. 각각의 시료는 0.05M 인산나트륨 완충용액 (pH 6.8)에 적당한 농도로 조절하여 용해한 후 사용하였다. L-티로신 용액 0.5㎖를 시험관에 넣고 여기에 시료액 0.5㎖를 가하고 37℃ 항온기에서 10분간 방치하였다. 그 후, 시료액에 200unit/㎖ 티로시나제 0.5㎖를 첨가하고 37℃에서 10분간 반응시켰다. 이 반응액이 든 시험관을 얼음 위에 놓아 급냉하여 반응을 중지한 후, 분광광도계로 파장 475nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 상기 시료 대신 완충용액 0.5㎖를 넣은 것을 사용하였다.

상기 각 시료의 티로시나아제 활성 저해율은 수학식 1에 따라 계산하였다.

<수학식 1>

티로시나제 활성 저해율(%) = 100-[(비교군흡광도/대조군흡광도)]X100

시료명		티로시나제 활성 저해율(%)
대조군		-
비교예 1 (0.02 중량%)	토마토	22
	레몬	28
	멜론	19
	감귤	21
	자몽	20
	파프리카	21
실시예 1 (0.02 중량%)	토마토	45
	레몬	49
	멜론	42
	감귤	54
	자몽	52
	파프리카	54
알부틴 (0.2 중량%)		55

티로시나제 활성 저해효과를 측정한 결과 (표 6), 과채류 발효물 0.02중량% 처리시 알부틴 0.2중량%와 유사한 티로시나제 활성 저해율이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

위 결과로부터 일반 발효물보다 본 발명의 방법에 의해 제조되는 과채류 발효물의 티로시나제 활성 저해효과가 우수함을 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명에 의한 과채류 발효물의 우수한 미백효과를 추론할 수 있었다.

실험예 6: B16F1 멜라닌 세포를 이용하여 멜라닌 합성 억제효과 측정

비교예 1과 실시예 1에서 수득한 발효물의 멜라닌 합성 억제효과를 확인하기 위해 미백제로 알려진 알부틴을 비교시료로 사용하였고, B16F1 멜라노싸이트를 이용하였다.

실험에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 합성 억제효과 측정은 다음과 같이 수행하였다. B16F1 멜라노싸이트를 6-웰 플레이트에 각 웰당 2×10⁶농도로 분주하고 세포를 부착한 후, 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신-EDTA로 떼어낸 후, 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포 내 멜라닌의 정량은 로탄 (R. Lotan and D. Lotan, Cancer Res, 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 세포 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후, 균질화 완충액 (50mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2mM PMSF) 1㎖를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리 (3,000rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1N NaOH (10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후, 마이크로 플레이트 판독기로 405㎚에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음, 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다.

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 저해율(%)은 수학식 2에 의하여 계산하였다.

<수학식 2>

멜라민 생성 저해율(%) = [(A-B)/A] × 100

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

시료명		멜라닌 활성 저해율(%)
대조군		-
비교예 1 (0.02 중량%)	토마토	12
	레몬	18
	멜론	13
	감귤	16
	자몽	16
	파프리카	17
실시예 1 (0.02 중량%)	토마토	25
	레몬	32
	멜론	32
	감귤	34
	자몽	32
	파프리카	35
알부틴 (0.2 중량%)		35

B16F1 멜라닌 세포를 이용하여 멜라닌 합성 억제효과를 측정한 결과 (표 7), 본 발명의 과채류 발효물 0.02 중량%는 알부틴 0.2 중량%일 때와 유사한 멜라닌 합성 저해율을 나타내었다.

위의 결과로부터 본 발명에 의한 과채류 발효물이 일반 발효물보다 멜라닌 생성 저해율이 우수함을 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명에 의한 과채류 발효물의 우수한 미백효과를 추론할 수 있었다.

실험예 7: 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과 측정

비교예 1과 실시예 1에서 수득한 발효물의 항염증 효과를 측정하기 위해 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제 정도를 측정하였다.

사람의 표피조직에서 분리한 섬유아세포 (Fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5X10⁴개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선B (UVB) 램프 (Model : F15T8, UVB 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10mJ/㎠를 조사한 후, PBS를 덜어내고 세포배양 배지 (DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350㎕를 첨가하였다. 여기에 평가대상 발효물 시료를 처리한 후, 5시간 동안 배양하였다. 배양 후 배양 상층액을 150㎕ 취하여 IL-1α를 정량함으로써 발효물 시료의 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 판단하였다. IL-1α의 양은 효소면역분석법(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)을 이용하여 정량하였으며, IL-1α의 생성율은 수학식 4에 의해 계산하였다.

<수학식 4>

염증성 사이토카인 발현 억제율(%) =1-(St-Bo)/(Bt-Bo)X 100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1α 생성량

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1α 생성량

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 IL-1α 생성량

시료명		염증성 사이토카인 발현 억제율(%)
UVB 조사(10 mJ/cm²)		100
실시예 1 (0.02 중량%)	토마토	38.2
	레몬	40.5
	멜론	31.4
	감귤	34.2
	자몽	39.7
비교예 1 (0.02 중량%)	토마토	19.4
	레몬	27.4
	멜론	10.2
	감귤	24.6
	자몽	21.0

자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 측정한 결과 (표 8), 0.02% 농도에서 최대 40.5% 억제하여 본 발명의 과채류 발효물이 일반 발효물에 비해 자외선에 의한 염증 발생을 효과적으로 방어함을 확인할 수 있었다. 위의 결과로부터 본 발명 과채류 발효물의 항염증 효과를 추론할 수 있었다.

실시예 2: 과채류 발효물을 함유하는 화장료 제조

본 실시예 2에서는 실시예 1에서 수득한 파프리카 발효물을 함유하는 화장료를 제조하였다. 제조된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 9에 나타내었다. 우선 표 9에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존하였고, 나)상에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 서서히 냉각하여 크림 (실시예 2, 비교예 2)을 제조하였다.

원료		실시예 2	비교예 2
가	스테아릴 알콜	8	8
	스테아린산	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2
	스쿠알란	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부가)알콜에스테르	3	3
	글리세릴모노스테아린산 아스테르	2	2
나	파프리카 발효물	1	-
	프로필렌글리콜	5	5
	적량	100에 대한 나머지	100에 대한 나머지

(단위: 중량%)

실험예 8: 화장료의 피부 탄력 개선효과 측정

상기 실시예 2 및 비교예 2의 피부 탄력 개선효과를 측정하기 위해 실험자 (20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 2 크림을 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 2 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

피부 탄력 개선효과를 확인하기 위해 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부탄력측정기 (cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 측정하였다. 실험결과는 아래 표 10에 Cutometer SEM 575의 R7 값으로 기재하였는데 R7 값은 피부의 점탄성 (viscoelasticity)을 나타낸다.

실험제품	피부탄력효과(R7)
실시예 2	0.23
비교예 2	0.10

n=20, p<0.05

화장료의 피부 탄력 개선효과를 측정한 결과 (표 10), 파프리카 발효물을 함유하는 실시예 2의 크림을 도포한 실험자의 피부 탄력개선효과가 비교예 2보다 우수한 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터 본 발명의 과채류 발효물 함유 화장료 조성물의 우수한 피부 탄력 개선효과를 확인할 수 있었다.

실험예 9: 화장료의 피부 주름 개선효과 측정

상기 실시예 2 및 비교예 2의 피부 주름 개선효과를 측정하기 위해 실험자 (20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 2의 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 2의 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

피부의 주름개선효과를 알아보기 위하여 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 실리콘 재질의 모사판 (replica)을 제작하여 지정 부위의 주름의 상태를 화상분석기인 비지오미터 (visiometer: SV60, C+K Electronic Co., Germany)로 측정하였다. 그 결과를 아래 표 11에서 나타내었으며, 표 11은 2개월 후의 각각의 파라미터 (parameter) 값에서 2개월 전 파라미터 값을 뺀 것의 평균을 나타낸 것이다. 즉, 값이 음수가 나올수록 주름 개선효과가 높다는 것을 의미한다.

실험제품	R1	R2	R3	R4	R5
실시예 2	-0.21	-0.17	-0.13	-0.08	-0.06
비교예 2	-0.11	-0.08	-0.06	-0.04	-0.02
R1: 주름 등고선의최고치와 최저치의 차이값 R2: 주름 등고선을 임의로 5칸씩 나눈 후 그 중 R1값 들의 평균 R3: 5개씩 나눈 R1값 중 최고치 R4: 주름 등고선의 기선(baseline)에서 각각의 꼭대기와 계곡의 값을 뺀 평균값 R5: 주름 등고선의 기선에서 각각의 주름 윤곽을 뺀 값의 평균값

화장료의 피부 주름 개선효과를 측정한 결과(표 11), 본 발명의 파프리카 발효물을 함유한 실시예 2 크림의 피부 주름 개선효과가 비교예 2 크림보다 우수함을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터 본 발명의 과채류 발효물 함유 화장료 조성물의 우수한 주름 개선효과를 확인할 수 있었다.

실험예 10: 화장료의 미백효과 측정

본 실험예에서는 실시예 2 및 비교예 2의 미백 효과를 측정하기 위해 실험자 (20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 2의 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 2의 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

2개월 후, 얼굴 좌우 양편의 도포 부위 피부를 화상분석기 및 피부색의 변화를 크로마미터 (Minolta CR300)를 이용하여 색의 밝기변화 (L)를 측정하고, 복수의 숙련자에 의한 객관적 육안 관찰과 피검자에 의한 주관적 육안관찰을 실시하여 하기 등급 분류에 따라 효과를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 12에 나타내었고, 미백효능 정도를 7등급으로 분류하여 평가하였다 (-3: 매우 악화, -2: 악화, -1: 약간 악화, 0: 변화 없음, 1: 약간 개선, 2: 개선, 3: 매우 개선).

	피부색의 밝기 변화(L)		숙련자의 객관적 평가		피검자의 주관적 평가
	실시예 2	비교예 3	실시예 2	비교예 3	실시예 2	비교예 3
평균값	4.42	1.81	3.6	2.0	2.6	1.6

화장료의 미백효과를 측정한 결과 (표 12), 본 발명의 파프리카 발효물을 함유하는 실시예 2가 비교예 2보다 미백효과가 우수함을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터 본 발명의 과채류 발효물 함유 화장료 조성물의 우수한 미백효과를 확인할 수 있었다.

실험예 11: SLS에 의한 피부 자극 완화효과 측정

실시예 1에서 수득한 파프리카 발효물을 함유한 화장료의 자극 완화 효과를 인체 첩포 실험으로 평가하였다.

일반적 화장품 처방 (크림, 로션, 스킨, 에센스)에 자극을 일으키는 SLS (sodium lauryl sulfate) 1%와 실시예 2의 크림을 혼용하여 24시간, 48시간, 72시간 동안 첩포한 후, 자극 유발지수를 바탕으로 자극완화 효과를 평가한 것이다.

20-50세의 건강한 남녀 50명의 팔 상박 부위에 FINN CHAMBER (FINLAND)를 이용하여 제품을 0.3mg씩 첩포하고, 24시간 후 급성 자극 지수를 평가하였다. 평가 후 재차 동일한 부위에 동량의 제품을 첩포하고 48시간 및 72시간 후의 지연성 자극 지수를 평가하였다.

SLS에 의한 피부 자극 완화효과를 측정한 결과, SLS를 단독으로 첩포한 부분은 24시간 후부터 피부에 붉게 자극이 나타났으나, 파프리카 발효물을 함유하는 실시예 2는 첩포하고 24시간, 48시간, 72시간 경과 후에도 아무런 피부 발작을 일으키지 않았다.

상기 결과로부터 파프리카 발효물이 화장료에 혼용되었을 때 자극을 유발시키는 기재 (계면 활성제, 향, 알콜 등)에 의한 피부 자극을 감소시킬 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 과채류 발효물을 함유하는 화장수 제조

95% 에탄올 8g에 폴리피로리돈 0.05g, 올레일알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합 용해하였다. 실시예 1에서 수득한 파프리카 발효물 0.05g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 과채류 발효물을 함유하는 화장수를 제조하였다.

실시예 4: 과채류 발효물을 함유하는 유액 제조

세틸알콜 1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아레이드 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰 부가)모노올레이트 1g 및 향료 0.1g을 70℃에서 가열, 혼합, 용해하고, 실시예 1에서 수득한 파프리카 발효물 0.5g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜-1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75℃로 가열해서 용해시켰다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수중유(O/W)형 유액을 제조하였다.

실시예 5: 과채류 발효물을 함유하는 미용액 제조

95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히알루론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.1g, 실시예 1에서 수득한 파프리카 발효물 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 미용액을 제조하였다.

Claims

(가) 파쇄하지 않은 신선한 과채류에 유산균을 접종하는 공정,
(나) 유산균이 접종된 과채류를 온도 25~37℃ 조건에서 3~5일 동안 배양·발효하는 공정 및
(다) 상기 발효된 과채류를 파쇄 또는 압착 후 원심분리하여 침전물과 유산균체가 제거된 과채류 발효물을 회수하는 공정;을 포함하는 과채류 발효물 제조방법.
청구항 1에 있어서,
상기 (다)의 과채류 발효물 회수 공정 이후
(라) 상기 과채류 발효물을 농축 및 건조 중 한 가지 이상의 방법으로 처리하는 공정;을 부가하는 것을 특징으로 하는 과채류 발효물 제조방법.
청구항 1에 있어서,
상기 (가) 공정은 과채류 중량 대비 2~5%(w/w)의 유산균을 접종함을 특징으로 하는 과채류 발효물 제조방법.
청구항 1에 있어서,
상기 (가) 공정의 유산균으로는 락토바실러스속 (Lactobacillus sp .), 스트렙토코커스속 (Streptococcus sp .), 류코노스톡속 (Leuconostoc sp.) 및 비피도박테리아속 (Bifidobacteria sp.)으로 이루어진 군 중 1종 이상을 선택함을 특징으로 하는 과채류 발효물 제조방법.
청구항 1에 있어서,
상기 과채류는 토마토, 레몬, 멜론, 감귤, 자몽, 사과, 바나나, 파프리카, 피망, 당근, 오이, 알로에, 고구마 및 감자 중 선택된 1종임을 특징으로 하는 과채류 발효물 제조방법.
청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조된 과채류 발효물.
청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조된 과채류 발효물을 함유하는 화장료 조성물.
청구항 7에 있어서,
상기 화장료 조성물은 주름개선 기능성 화장료임을 특징으로 하는 과채류 발효물을 함유하는 화장료 조성물.
청구항 7에 있어서,
상기 화장료 조성물은 미백 기능성 화장료임을 특징으로 하는 과채류 발효물을 함유하는 화장료 조성물.
청구항 7에 있어서,
상기 화장료 조성물은 염증 개선 및 피부자극 완화효과를 특징으로 하는 과채류 발효물을 함유하는 화장료 조성물.
청구항 7에 있어서,
상기 화장료 조성물은 항노화 기능성 화장료임을 특징으로 하는 과채류 발효물을 함유하는 화장료 조성물.