CN115518015A - 一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法及提取物的应用 - Google Patents

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金恩智
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Abstract

本发明公开了一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法，其中，包含以下步骤：步骤1：清洗白兰瓜表面后进行消毒；步骤2：在所述白兰瓜中接种0.1‑2％(w/w)的混合乳酸菌，在30‑40℃的温度下培养1‑3天进行第一次发酵；步骤3：在第一次发酵后白兰瓜中加入1‑5％(w/w)的培养液，在30‑40℃的温度下培养3‑7天进行第二次发酵；步骤4：将第二次发酵后的白兰瓜破碎、以白兰瓜与水比例为1:5‑1:20进行水提取、膜过滤得到白兰瓜发酵产物；步骤5：将所述白兰瓜发酵产物使用用量为所述白兰瓜发酵产物1‑10％(w/w)澄清剂进行除杂后离心，取上清液；步骤6：对所述上清液进行膜过滤得到白兰瓜发酵产物提取物。

Description

一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法及提取物的应用
技术领域
本发明涉及白兰瓜发酵产物提取物的制备领域，具体涉及一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法及提取物的应用。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，是人体抵御外来伤害的保护屏障，其衰老程度直接反映机体的老化水平。皮肤衰老是内源性因素和外源性因素共同作用的结果，其中内源性老化称为自然老化，由遗传因素决定；外源性老化主要来源于UV辐射，又称为光老化，所谓皮肤光老化，即指由于长期的日光照射导致皮肤衰老或加速衰老的现象，其占到面部老化的80％以上：
(1)光老化在表皮层上主要表现为：①引起角质形成细胞凋亡，皮肤正常结构被破坏，进而导致皮肤屏障功能丧失；②黑素细胞内环境稳态异常，表现为基底层下不规则的黑素分布；③角质细胞IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α等生成量增加；
(2)光老化在真皮层上主要表现为：①影响I型胶原的形成，Ⅲ型胶原相对增加，导致成熟的胶原束减少；②MMP高表达，引起弹性纤维退行性变和扭曲、胶原降解增加；③氨基多糖裂解，从而影响其结构和功能，结合水能力降低，破坏屏障作用；
(3)其它：产生高浓度的活性氧簇，在信号转导过程中通过氧化或交联作用，致细胞微结构如线粒体和DNA的氧化损伤，加速皮肤老化；
因此，如何预防皮肤光氧化或者减缓UV对皮肤造成的损伤，进一步延缓皮肤老化一直备受关注受受到人们的关注，大多数的物理和化学防晒剂存在肤感厚重、安全性差、防护效率有限等问题，因此不能满足消费者在抵抗光老化方面的需求，目前，一些来源天然的植物成分具有广泛的生物活性，通过调节多种信号通路，如抗皮肤光氧化、抑制色素沉着、调节ECM合成与降解、缓解皮肤炎症等，从而降低紫外线对皮肤的有害影响，因其具有安全性能更高、功能性更突出以及更易被皮肤吸收等优点已成为化妆品原料行业开发和研究的热点；
白兰瓜又名兰州蜜瓜，属葫芦科厚皮甜瓜类型，瓜形短椭圆或近椭圆，皮白瓤绿、甜蜜爽嫩、清香扑鼻，有瓜王之美誉，白兰瓜含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物、膳食纤维、维生素、胡萝卜素、维生素B1、维生素B2、尼克酸、钙、磷等，具有清暑解热、解渴利尿、开胃健脾功效；
现有研究表明，白兰瓜中富含具有抗氧化活性的物质，如果皮中富含绿原酸、香豆酸等酚酸类物质，果肉中含有β-胡萝卜素、VC等，种子中含有酚酸、生育酚等。
发明内容
本发明要解决的技术问题是大多数的物理和化学防晒剂存在肤感厚重、安全性差、防护效率有限等问题，不能根本解决光老化防护产品中物理和化学防晒剂存在的肤感、安全性等问题的缺陷，因此不能满足消费者在抵抗光老化方面的需求，本发明提供一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法，本发明还提供一种白兰瓜发酵产物提取物的应用，白兰瓜发酵产物提取物富含SOD，具有显著的抗氧化性，并降低UVB诱导的MMP-1表达量升高和I型胶原蛋白降解，缓解皮肤炎症，多通路协同降低紫外线对皮肤的损害；乳酸菌利用白兰瓜中营养成分为底物，通过发酵将白兰瓜中不易被皮肤吸收的营养成分代谢为易被吸收的小分子物质，利用白兰瓜内部环境进行发酵，无需无菌发酵容器，此操作更为简洁、可实现性高，用以解决现有技术导致的缺陷。
为解决上述技术问题本发明提供以下的技术方案：
一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法，其中，包含以下步骤：
步骤1：清洗白兰瓜表面后进行消毒；
步骤2：在所述白兰瓜中接种0.1-2％(w/w)的混合乳酸菌，在30-40℃的温度下培养1-3天进行第一次发酵；
步骤3：在第一次发酵后白兰瓜中加入1-5％(w/w)的培养液，在30-40℃的温度下培养3-7天进行第二次发酵；
步骤4：将第二次发酵后的白兰瓜破碎、以白兰瓜与水比例为1:5-1:20进行水提取、膜过滤得到白兰瓜发酵产物；
步骤5：将所述白兰瓜发酵产物使用用量为所述白兰瓜发酵产物1-10％(w/w)澄清剂进行除杂后离心，取上清液；
步骤6：对所述上清液进行膜过滤得到白兰瓜发酵产物提取物。
上述的一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法，其中，所述混合乳酸菌包含等比例的植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌。
上述的一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法，其中，所述培养液由灭菌后的葡萄糖、酵母粉、磷酸二氢钾混合制成。
上述的一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法，其中，所述培养液中各组分的质量分数为：所述葡萄糖1-5％、所述酵母粉0.1-3.0％、所述磷酸二氢钾0.01-1.0％。
上述的一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法，其中，所述澄清剂为ZTC-Ⅱ型、ZTC-Ⅲ型、101型中的一种或几种。
上述一种白兰瓜发酵产物提取物在皮肤护理化妆品中的应用，皮肤护理化妆品包括霜剂、乳液、化妆水、凝胶剂、面膜、软膏。
依据上述本发明一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法提供的技术方案具有以下技术效果：
白兰瓜发酵产物提取物富含SOD，具有显著的抗氧化性，并降低UVB诱导的MMP-1表达量升高和I型胶原蛋白降解，缓解皮肤炎症，多通路协同降低紫外线对皮肤的损害；乳酸菌利用白兰瓜中营养成分为底物，通过发酵将白兰瓜中不易被皮肤吸收的营养成分代谢为易被吸收的小分子物质，利用白兰瓜内部环境进行发酵，无需无菌发酵容器，此操作更为简洁、可实现性高。
附图说明
图1为SOD含量测定结果图；
图2为UVB诱导的HDF细胞中MMP-1分泌含量测试结果图；
图3为UVB诱导的HDF细胞中Ⅰ型胶原蛋白分泌含量测试结果图；
图4为LPS诱导的HaCaT细胞中NO抑制率测试结果图。
具体实施方式
为了使发明实现的技术手段、创造特征、达成目的和功效易于明白了解，下结合具体图示，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
实施例1(实施例1-3区别在步骤2中混合乳酸菌接种量)：
一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法，其中，包含以下步骤：
步骤1：清洗白兰瓜表面后进行消毒；
步骤2：在白兰瓜中接种1％(w/w)等比例植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌的混合乳酸菌，在35℃的温度下培养1天进行第一次发酵；
步骤3：在第一次发酵后白兰瓜中加入2％(w/w)由灭菌后的2％葡萄糖、0.5％酵母粉、0.2％磷酸二氢钾混合制成的培养液，在35℃的温度下培养3天进行第二次发酵；
步骤4：将第二次发酵后的白兰瓜破碎、以白兰瓜与水比例为1:10进行水提取、膜过滤得到白兰瓜发酵产物；
步骤5：将白兰瓜发酵产物使用用量为白兰瓜发酵产物2％(w/w)的ZTC-Ⅱ型澄清剂进行除杂，放置30min后离心，取上清液；
步骤6：对上清液进行膜过滤得到白兰瓜发酵产物提取物。
实施例2：
一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法，其中，包含以下步骤：
步骤1：清洗白兰瓜表面后进行消毒；
步骤2：在白兰瓜中接种0.1％(w/w)等比例植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌的混合乳酸菌，在35℃的温度下培养1天进行第一次发酵；
步骤3：在第一次发酵后白兰瓜中加入2％(w/w)由灭菌后的2％葡萄糖、0.5％酵母粉、0.2％磷酸二氢钾混合制成的培养液，在35℃的温度下培养3天进行第二次发酵；
步骤4：将第二次发酵后的白兰瓜破碎、以白兰瓜与水比例为1:10进行水提取、膜过滤得到白兰瓜发酵产物；
步骤5：将白兰瓜发酵产物使用用量为白兰瓜发酵产物2％(w/w)的ZTC-Ⅱ型澄清剂进行除杂，放置30min后离心，取上清液；
步骤6：对上清液进行膜过滤得到白兰瓜发酵产物提取物。
实施例3：
一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法，其中，包含以下步骤：
步骤1：清洗白兰瓜表面后进行消毒；
步骤2：在白兰瓜中接种2％(w/w)等比例植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌的混合乳酸菌，在35℃的温度下培养1天进行第一次发酵；
步骤3：在第一次发酵后白兰瓜中加入2％(w/w)由灭菌后的2％葡萄糖、0.5％酵母粉、0.2％磷酸二氢钾混合制成的培养液，在35℃的温度下培养3天进行第二次发酵；
步骤4：将第二次发酵后的白兰瓜破碎、以白兰瓜与水比例为1:10进行水提取、膜过滤得到白兰瓜发酵产物；
步骤5：将白兰瓜发酵产物使用用量为白兰瓜发酵产物2％(w/w)的ZTC-Ⅱ型澄清剂进行除杂，放置30min后离心，取上清液；
步骤6：对上清液进行膜过滤得到白兰瓜发酵产物提取物。
实施例4(实施例1、4、5区别在葡萄糖比例)：
一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法，其中，包含以下步骤：
步骤1：清洗白兰瓜表面后进行消毒；
步骤2：在白兰瓜中接种1％(w/w)等比例植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌的混合乳酸菌，在35℃的温度下培养1天进行第一次发酵；
步骤3：在第一次发酵后白兰瓜中加入2％(w/w)由灭菌后的1％葡萄糖、0.5％酵母粉、0.2％磷酸二氢钾混合制成的培养液，在35℃的温度下培养3天进行第二次发酵；
步骤4：将第二次发酵后的白兰瓜破碎、以白兰瓜与水比例为1:10进行水提取、膜过滤得到白兰瓜发酵产物；
步骤5：将白兰瓜发酵产物使用用量为白兰瓜发酵产物2％(w/w)的ZTC-Ⅱ型澄清剂进行除杂，放置30min后离心，取上清液；
步骤6：对上清液进行膜过滤得到白兰瓜发酵产物提取物。
实施例5：
一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法，其中，包含以下步骤：
步骤1：清洗白兰瓜表面后进行消毒；
步骤2：在白兰瓜中接种1％(w/w)等比例植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌的混合乳酸菌，在35℃的温度下培养1天进行第一次发酵；
步骤3：在第一次发酵后白兰瓜中加入2％(w/w)由灭菌后的5％葡萄糖、0.5％酵母粉、0.2％磷酸二氢钾混合制成的培养液，在35℃的温度下培养3天进行第二次发酵；
步骤4：将第二次发酵后的白兰瓜破碎、以白兰瓜与水比例为1:10进行水提取、膜过滤得到白兰瓜发酵产物；
步骤5：将白兰瓜发酵产物使用用量为白兰瓜发酵产物2％(w/w)的ZTC-Ⅱ型澄清剂进行除杂，放置30min后离心，取上清液；
步骤6：对上清液进行膜过滤得到白兰瓜发酵产物提取物。
实施例6(实施例1、6、7区别在酵母粉比例)：
一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法，其中，包含以下步骤：
步骤1：清洗白兰瓜表面后进行消毒；
步骤2：在白兰瓜中接种1％(w/w)等比例植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌的混合乳酸菌，在35℃的温度下培养1天进行第一次发酵；
步骤3：在第一次发酵后白兰瓜中加入2％(w/w)由灭菌后的2％葡萄糖、0.1％酵母粉、0.2％磷酸二氢钾混合制成的培养液，在35℃的温度下培养3天进行第二次发酵；
步骤4：将第二次发酵后的白兰瓜破碎、以白兰瓜与水比例为1:10进行水提取、膜过滤得到白兰瓜发酵产物；
步骤5：将白兰瓜发酵产物使用用量为白兰瓜发酵产物2％(w/w)的ZTC-Ⅱ型澄清剂进行除杂，放置30min后离心，取上清液；
步骤6：对上清液进行膜过滤得到白兰瓜发酵产物提取物。
实施例7：
一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法，其中，包含以下步骤：
步骤1：清洗白兰瓜表面后进行消毒；
步骤2：在白兰瓜中接种1％(w/w)等比例植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌的混合乳酸菌，在35℃的温度下培养1天进行第一次发酵；
步骤3：在第一次发酵后白兰瓜中加入2％(w/w)由灭菌后的2％葡萄糖、3.0％酵母粉、0.2％磷酸二氢钾混合制成的培养液，在35℃的温度下培养3天进行第二次发酵；
步骤4：将第二次发酵后的白兰瓜破碎、以白兰瓜与水比例为1:10进行水提取、膜过滤得到白兰瓜发酵产物；
步骤5：将白兰瓜发酵产物使用用量为白兰瓜发酵产物2％(w/w)的ZTC-Ⅱ型澄清剂进行除杂，放置30min后离心，取上清液；
步骤6：对上清液进行膜过滤得到白兰瓜发酵产物提取物。
实施例8(实施例1、8、9区别在磷酸二氢钾比例)：
一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法，其中，包含以下步骤：
步骤1：清洗白兰瓜表面后进行消毒；
步骤2：在白兰瓜中接种1％(w/w)等比例植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌的混合乳酸菌，在35℃的温度下培养1天进行第一次发酵；
步骤3：在第一次发酵后白兰瓜中加入2％(w/w)由灭菌后的2％葡萄糖、0.5％酵母粉、0.01％磷酸二氢钾混合制成的培养液，在35℃的温度下培养3天进行第二次发酵；
步骤4：将第二次发酵后的白兰瓜破碎、以白兰瓜与水比例为1:10进行水提取、膜过滤得到白兰瓜发酵产物；
步骤5：将白兰瓜发酵产物使用用量为白兰瓜发酵产物2％(w/w)的ZTC-Ⅱ型澄清剂进行除杂，放置30min后离心，取上清液；
步骤6：对上清液进行膜过滤得到白兰瓜发酵产物提取物。
实施例9：
一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法，其中，包含以下步骤：
步骤1：清洗白兰瓜表面后进行消毒；
步骤2：在白兰瓜中接种1％(w/w)等比例植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌的混合乳酸菌，在35℃的温度下培养1天进行第一次发酵；
步骤3：在第一次发酵后白兰瓜中加入2％(w/w)由灭菌后的2％葡萄糖、0.5％酵母粉、1.0％磷酸二氢钾混合制成的培养液，在35℃的温度下培养3天进行第二次发酵；
步骤4：将第二次发酵后的白兰瓜破碎、以白兰瓜与水比例为1:10进行水提取、膜过滤得到白兰瓜发酵产物；
步骤5：将白兰瓜发酵产物使用用量为白兰瓜发酵产物2％(w/w)的ZTC-Ⅱ型澄清剂进行除杂，放置30min后离心，取上清液；
步骤6：对上清液进行膜过滤得到白兰瓜发酵产物提取物。
实施例10(实施例1、10、11区别在步骤3中培养液添加比例)：
一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法，其中，包含以下步骤：
步骤1：清洗白兰瓜表面后进行消毒；
步骤2：在白兰瓜中接种1％(w/w)等比例植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌的混合乳酸菌，在35℃的温度下培养1天进行第一次发酵；
步骤3：在第一次发酵后白兰瓜中加入1％(w/w)由灭菌后的2％葡萄糖、0.5％酵母粉、0.2％磷酸二氢钾混合制成的培养液，在35℃的温度下培养3天进行第二次发酵；
步骤4：将第二次发酵后的白兰瓜破碎、以白兰瓜与水比例为1:10进行水提取、膜过滤得到白兰瓜发酵产物；
步骤5：将白兰瓜发酵产物使用用量为白兰瓜发酵产物2％(w/w)的ZTC-Ⅱ型澄清剂进行除杂，放置30min后离心，取上清液；
步骤6：对上清液进行膜过滤得到白兰瓜发酵产物提取物。
实施例11：
一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法，其中，包含以下步骤：
步骤1：清洗白兰瓜表面后进行消毒；
步骤2：在白兰瓜中接种1％(w/w)等比例植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌的混合乳酸菌，在35℃的温度下培养1天进行第一次发酵；
步骤3：在第一次发酵后白兰瓜中加入5％(w/w)由灭菌后的2％葡萄糖、0.5％酵母粉、0.2％磷酸二氢钾混合制成的培养液，在35℃的温度下培养3天进行第二次发酵；
步骤4：将第二次发酵后的白兰瓜破碎、以白兰瓜与水比例为1:10进行水提取、膜过滤得到白兰瓜发酵产物；
步骤5：将白兰瓜发酵产物使用用量为白兰瓜发酵产物2％(w/w)的ZTC-Ⅱ型澄清剂进行除杂，放置30min后离心，取上清液；
步骤6：对上清液进行膜过滤得到白兰瓜发酵产物提取物。
实施例12(与实施例11的区别在于培养温度和天数)：
一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法，其中，包含以下步骤：
步骤1：清洗白兰瓜表面后进行消毒；
步骤2：在白兰瓜中接种1％(w/w)等比例植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌的混合乳酸菌，在30℃的温度下培养2天进行第一次发酵；
步骤3：在第一次发酵后白兰瓜中加入5％(w/w)由灭菌后的2％葡萄糖、0.5％酵母粉、0.2％磷酸二氢钾混合制成的培养液，在30℃的温度下培养5天进行第二次发酵；
步骤4：将第二次发酵后的白兰瓜破碎、以白兰瓜与水比例为1:10进行水提取、膜过滤得到白兰瓜发酵产物；
步骤5：将白兰瓜发酵产物使用用量为白兰瓜发酵产物2％(w/w)的ZTC-Ⅱ型澄清剂进行除杂，放置30min后离心，取上清液；
步骤6：对上清液进行膜过滤得到白兰瓜发酵产物提取物。
实施例13(与实施例11的区别在于培养温度和天数)：
一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法，其中，包含以下步骤：
步骤1：清洗白兰瓜表面后进行消毒；
步骤2：在白兰瓜中接种1％(w/w)等比例植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌的混合乳酸菌，在40℃的温度下培养3天进行第一次发酵；
步骤3：在第一次发酵后白兰瓜中加入5％(w/w)由灭菌后的2％葡萄糖、0.5％酵母粉、0.2％磷酸二氢钾混合制成的培养液，在40℃的温度下培养7天进行第二次发酵；
步骤4：将第二次发酵后的白兰瓜破碎、以白兰瓜与水比例为1:10进行水提取、膜过滤得到白兰瓜发酵产物；
步骤5：将白兰瓜发酵产物使用用量为白兰瓜发酵产物2％(w/w)的ZTC-Ⅱ型澄清剂进行除杂，放置30min后离心，取上清液；
步骤6：对上清液进行膜过滤得到白兰瓜发酵产物提取物。
对比例1：不接种混合乳酸菌，直接破碎提取
对比例2：与实施例1区别在步骤3中二次发酵前不补充培养液
效果验证：
实验方法1，SOD含量测定：
加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔；在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔根据中先加样品稀释液49μl，然后再加1μl实施例1-13及对比例1-2的提取物，以下简称样品(样品最终稀释度为50倍，即2％)，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用；
洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；
温育：37℃温育30分钟；
洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟；
终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)；
测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，测定应在加终止液后15分钟以内进行；
计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
实验结果：
如图1所示，实施例相较于对比例其SOD含量显著提高，显示具有较好的抗氧化性，SOD含量在400-700U/mL为最佳。
实验方法2，UVB诱导的HDF细胞中MMP-1和Ⅰ型胶原蛋白分泌含量测试：
以未处理的HDF细胞作为空白对照(BC)，40mJ/cm2 UVB处理的HDF细胞作为为阴性对照(NC)，具体操作如下：
检测前以MTT法检测细胞活力确定各实施例及对比例提取物在HDF细胞上的安全浓度；
将传代后的HDF细胞以1×104cells/mL的密度接种于96孔板(100μL/孔)，培养24h。HDF细胞经所述实施例和对比例(1％浓度)处理和40mJ/cm2 UVB照射，培养24h，取其上清，在4℃、12000r/min条件下离心10min，根据酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒说明书测定基质金属蛋白酶-1(MMP-1)和I型胶原蛋白的表达水平；
实验结果：
如图2所示，MMP-1含量检测结果中，与空白对照相比，UVB照射显著提高HDF细胞的MMP-1的分泌量。一定浓度的实施例提取物作用HDF细胞24h后，MMP-1含量显著下降，以实施例5和实施例3效果最佳；
如图3所示，I型胶原蛋白含量检测结果中，与空白对照相比，UVB照射显著降低HDF细胞的I型胶原蛋白的分泌量。一定浓度的实施例提取物作用HDF细胞24h后，I型胶原蛋白含量显著提高，以实施例3、实施例11和实施例5效果最佳。
实验方法3，HaCaT细胞上清NO分泌量的检测：
以未做处理的巨噬细胞作为空白对照(BC)，以脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞作为阴性对照(NC)，具体操作如下：
检测前以MTT法检测细胞活力确定实施例1-13及对比例1-2的提取物在HaCaT细胞上的安全浓度；
HaCaT细胞用DMEM培养基(含10％FBS、1％双抗)，在37℃、5％CO2条件下常规培养，取对数生长期细胞，制备细胞悬液，以3×105cells/mL的密度接种于24孔板(500μL)；细胞培养24h后加入1％浓度的实施例1-13及对比例1-2和100ng/mL LPS共处理24h，收取上清液，在4℃、12000r/min条件下离心10min，Griess法检测培养液上清中NO分泌量；
实验结果：
如图4所示，给予一定浓度的实施例提取物很好地抑制了LPS诱导的NO生成量增加，实施例相较于对比例其NO抑制率显著提高，以实施例5和实施例3效果最佳。
综上，本发明的一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法及应用，白兰瓜发酵产物提取物富含SOD，具有显著的抗氧化性，并降低UVB诱导的MMP-1表达量升高和I型胶原蛋白降解，缓解皮肤炎症，多通路协同降低紫外线对皮肤的损害；乳酸菌利用白兰瓜中营养成分为底物，通过发酵将白兰瓜中不易被皮肤吸收的营养成分代谢为易被吸收的小分子物质，利用白兰瓜内部环境进行发酵，无需无菌发酵容器，此操作更为简洁、可实现性高。
以上对发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，发明并不局限于上述特定实施方式，其中未尽详细描述的设备和结构应该理解为用本领域中的普通方式予以实施；本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改做出若干简单推演、变形或替换，这并不影响发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
步骤1：清洗白兰瓜表面后进行消毒；
步骤2：在所述白兰瓜中接种混合乳酸菌，在30-40℃的温度下培养进行第一次发酵；
步骤3：在第一次发酵后白兰瓜中加入培养液，在30-40℃的温度下培养进行第二次发酵；
步骤4：将第二次发酵后的白兰瓜破碎、水提取、膜过滤得到白兰瓜发酵产物；
步骤5：将所述白兰瓜发酵产物使用澄清剂进行除杂后离心，取上清液；
步骤6：对所述上清液进行膜过滤得到白兰瓜发酵产物提取物。
2.如权利要求1所述的一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法，其特征在于，步骤2中所述白兰瓜中接种0.1-2％(w/w)的所述混合乳酸菌后，在30-40℃的温度下培养1-3天进行第一次发酵。
3.如权利要求2所述的一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法，其特征在于，所述混合乳酸菌包含等比例的植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌。
4.如权利要求1所述的一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法，其特征在于，步骤3中所述在第一次发酵后白兰瓜中加入1-5％(w/w)的所述培养液，在30-40℃的温度下培养3-7天进行第二次发酵。
5.如权利要求4所述的一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法，其特征在于，所述培养液由灭菌后的葡萄糖、酵母粉、磷酸二氢钾混合制成。
6.如权利要求5所述的一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法，其特征在于，所述培养液中各组分的质量分数为：所述葡萄糖1-5％、所述酵母粉0.1-3.0％、所述磷酸二氢钾0.01-1.0％。
7.如权利要求1所述的一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法，其特征在于，步骤4第二次发酵后的白兰瓜进行水提取中白兰瓜与水的比例1:5-1:20。
8.如权利要求1所述的一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法，其特征在于，步骤5中所述澄清剂用量为所述白兰瓜发酵产物的1-10％(w/w)。
9.如权利要求8所述的一种白兰瓜发酵产物提取物的制备方法，其特征在于，所述澄清剂为ZTC-Ⅱ型、ZTC-Ⅲ型、101型中的一种或几种。
10.如权利要求1-9任一项所述的一种白兰瓜发酵产物提取物在皮肤护理化妆品中的应用。
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