KR20160101593A

KR20160101593A - 2-(4-hydroxyphenyl)ethanol을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20160101593A
Application number: KR1020150024502A
Authority: KR
Inventors: 김상현; 제인규
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2015-02-17
Filing date: 2015-02-17
Publication date: 2016-08-25

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 Tyrosol을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 Tyrosol은 알레르기 반응과 관련 있는 비만세포로부터의 히스타민 유리를 억제하고, 염증 유발 사이토카인 유전자들인 TNF-α 및 IL-1β, IL-4의 발현 및 전사인자인 NF-ĸB 활성을 억제하는 효과가 우수하여, 알레르기 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
[화학식 1]

Description

2-(4-hydroxyphenyl)ethanol을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical Composition Comprising 2-(4-hydroxyphenyl)ethanol for Preventing or Treating Allergic Disease}

본 발명은 알레르기 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 2-(4-hydroxyphenyl)ethanol을 포함하는 약학적 조성물, 식품 조성물, 약학적 제제 및 피부 외용제에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 조성물은 비만세포로부터 히스타민의 방출을 억제하며, 알레르기를 유발하는 사이토카인의 발현을 억제하여 알레르기 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.

알레르기란 광범위하고 복잡한 병리적 현상의 총화로 면역반응에 근거한 생체의 전신적 또는 국소적인 장애이다. 인체에 나타나는 알레르기는 면역 기전에 따라 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ형으로 분류되며, 이 중에서 즉시형 과민반응에 속하는 Ⅰ형 알레르기가 임상에 있어서 중요한 부분을 차지하고 있으며, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 기관지 천식, 고초열 및 화분증 등이 여기에 속한다.

1953년경 Ⅰ형 알레르기는 비만세포의 활성화에 의해 일어나며, 이러한 비만세포의 과립에는 염증반응의 매개체인 히스타민(histamine)이 다량 함유되어 있음이 알려졌다. 알레르기 반응이 일어날 때 비만세포에서 히스타민이 방출되는 현상이 발견된 후에 이 기전을 규명하던 중, 이시자까(Ishizaka)의 immunoglobulin E(IgE)의 발견은 비만세포가 즉시형 알레르기 반응에 관여함을 밝히는 중요한 계기가 되었다. 즉, 비만세포 표면에는 IgE 고친화성 수용체가 있으며, 이 수용체에 IgE가 결합한 후 다시 항원이 결합하여 가교가 형성되면 탈과립반응이 유발되어 과립 내용물인 히스타민, 세로토닌(serotonin), 브라드키닌(bradykinin) 등과 같은 합성되어 저장되어 있던 매개물질(preformed mediator)과, 프로테아제(protease), 프로테오글리칸(proteoglycan) 등이 동시에 방출되는 것이다(Ishizaka, Hosp Pract.; 12(1):57-67, 1977).

1970년대 이후 새로운 지질성의 염증 매개체에 대한 연구 결과가 보고되기 시작하였으며, 이들은 세포의 활성화에 동반하여 세포막 인지질로부터 생산된 프로스타그란딘류(prostaglandins), 류코트리엔류(leukotriens), 트롬복산(thromboxane), 글리세로포스포리피드(glycerophospholipids) 유도체인 PAF(platelet activating factor) 등으로 다양한 생리활성을 나타내는 신생 매개체들로서 Ⅰ형 알레르기 반응을 포함한 각종의 염증 반응에 관여함이 밝혀졌다. 이러한 지질성 매개체는 IgE 수용체가 가교를 형성할 때 비만세포에서 탈과립반응과 병행해서 생산, 방출된다.

Ⅰ형 알레르기는 비만세포의 활성화에 의해 방출되는 과립내용물인 활성아민류와 프로테아제(protease)류, 세포막 인지질에서 생성되는 지질성 매개체, 면역반응의 조절인자로 잘 알려진 IL-3(비만세포 증식인자), IL-4, IL-5과 같은 사이토카인(cytokine)인 등이 관련되어 일어나는 생체의 자연스러운 현상이라고 종합할 수 있다(Galli SJ et al., Curr Opin Immunol.; 3(6):865-872, 1991; Bradding P et al., J Immunol.;151(7):3853-3865, 1993).

Ⅰ형 알레르기의 대표적 질환으로 알려진 천식(asthma)은 대부분 알레르기성 질환으로 기도의 광범위한 협착에 의해 발생하는 천명(喘鳴), 호흡곤란, 기침 등의 임상 증세들은 자연히 혹은 치료에 의해 가역적으로 호전될 수 있다(Adachi M et al., Arerugi.;48(7):683-685, 1999). 천식으로 인한 사망자 수가 세계적으로 증가하고 있으며, 개발국에서는 3~10％가 천식을 앓고 있다(Martin C, Nisa M, Aust Fam Physician.;26(9):1049-1054, 1997).

일부 천식 치료에 대한 치료제가 존재하나 부작용이 있다. 알레르기 질병에 대한 치료제로 이용되는 것은 부신피질 호르몬 성분을 이용한 덱사메타손, 코티손 등이 있다. 천식 치료에 있어 부신피질 호르몬 성분은 호산성구의 침식을 억제하고 기관지의 점막으로의 호산성구와 림프구의 이동을 억제하고 Th2 사이토카인의 발현을 억제시킨다(Trigg CJ et al., Am J Respir Crit Care Med.;150(1):17-22, 1994; Caramori G et al., Monaldi Arch Chest Dis.;63(2):84-87, 2005). 그러나 이들은 염증 치료제로서 작용을 하나, 독성이 강하며, 부작용으로 부종 같은 증상을 일으키기도 한다. 또한, 염증 원인에 대하여 선택적으로 작용하지 못하여 심한 면역억제를 유발하는 문제가 생기는 경우도 있다(Check WA, Kaliner MA, Am Rev Respir Dis.;141(2 Pt 2):S44-S51, 1990).

또한, 알레르기 항원에 피부가 노출되면 랑게르한스 세포의 표면에 있는 IgE 수용체에 항원 특이 IgE가 결합하고, 이 항원의 표면에 있는 T세포에 전달되어 T세포가 활성화 된다. 이 경우 정상과 달리 알레르기성 피부질환, 특히, 아토피 피부염에서는 Th2가 활성화되어 IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10 및 IL-13 등의 사이토카인이 분비되고, 그 결과 B 세포에서 IgE의 생성이 촉진되고, 활성화되어있는 비만세포의 탈과립을 촉진시켜 사이토카인과 히스타민이 유리된다(Baruah C. C. et al.,Pharmacol Res.;38(6):487-92, 1998; Karadag C. H. et al.,Braz J Med Biol Res.;33(3):327-330, 2000; Paolini R. et al., Nature.;353(6347):855-858, 1991).

현재 임상적으로 사용되고 있는 알레르기 치료 약물은 작용기전에 따라 탈과립저해제, 화학전달물질 작용억제제, 화학전달물질 합성저해제 등으로 대별할 수 있다. 이들 약물들 중 화학전달물질 작용억제제와 화학전달물질 합성저해제의 경우 약물작용점이 비교적 확실하지만, 탈과립저해제의 경우 그 작용기전이 불분명한 상태이며, 또한 이들 약물들은 장기간 투여에 의해 여러 가지 부작용을 초래할 수 있다. 이에 따라Ⅰ형 알레르기의 치료를 위해 비만세포에서 이들 생리활성 물질의 생산 및 유리에 대한 작용기전을 밝히고, 장기복용에 따른 부작용을 최소화할 수 있는 물질의 개발이 대단히 중요하다고 할 수 있다. 따라서 비만세포에서 작용기전이 확실한 생리활성 물질의 생산 및 유리를 조절하는 약물을 개발한다면 유용한 알레르기의 예방 및 치료제가 될 것이다.

이에 본 발명자들은 2-(4-hydroxyphenyl)?ethanol(이하 Tyrosol)의 알레르기 질환에 대한 연구를 수행한 결과, 상기 화합물이 알레르기 반응과 관련 있는 비만세포로부터의 히스타민 유리를 억제하고, 염증 유발 사이토카인 유전자들인 종양괴사인자(TNF)-α, IL-1β 및 IL-4의 발현 및 전사인자인 NF-ĸB 활성을 억제하는 효과가 우수함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 Tyrosol을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 Tyrosol을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 Tyrosol을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 개선용 피부 외용제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 Tyrosol을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 제제를 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 Tyrosol을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 Tyrosol을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 Tyrosol을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 개선용 피부 외용제를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 Tyrosol을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 제제를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 Tyrosol을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식1의 Tyrosol은 천연물로부터 분리할 수도 있으며, 상업적으로도 구입 가능하다. 천연물 중에서는 이에 한정하지는 않지만, 사인 열매(Amomum xanthioides)에서 추출 가능하다.

추출 용매로는 추출공정에서 일반적으로 사용할 수 있는 용매를 사용할 수 있으며, 둘 이상의 서로 다른 용매를 순차적으로 사용하여 추출할 수도 있다. 바람직하게는, 물, 알코올, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 추출 용매를 사용하여 얻을 수 있다. 보다 바람직하게는, 건조시킨 분말 형태의 사인 열매 9.5 kg에 메탄올 45 L를 가하고 실온에서 추출한 후, 잔류물 440 g을 진공 여과하며 다양한 용매로 추출하여, 물(275.1 g), n-헥산(120 g), 메틸렌클로라이드(32.7 g), 에틸아세테이트(9.8 g) 추출액을 얻는다. 그 후, 메틸렌클로라이드 추출액을 크로마토그래피하여 7개의 구획(AF1-AF7)을 얻고, AF3(101.2 mg)로부터 tyrosol 이 분리될 수 있다.

본 발명에서 상기 알레르기 질환은 바람직하게는 비만세포를 매개로 발생되는 알레르기성 질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 화학식 I의 Tyrosol은 비만세포에서 종양괴사인자 알파(TNF-α), 인터류킨-1β(IL-1β) 및 인터류킨-4(IL-4)의 발현을 억제하며, 전사인자인 NF-ĸB 활성을 억제하는 효과가 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 화학식 I으로 표시되는 Tyrosol이 활성화된 비만세포에서 히스타민의 유리를 억제하고(실시예 2-3), 세포 내 칼슘의 양을 감소시켜 비만세포의 탈과립을 억제하며(실시예 2-4), 염증 유발 사이토카인 유전자들인 TNF-α 및 IL-1β, IL-4의 발현 및 전사인자인 NF-ĸB 활성을 억제하는 것을(실시예 3) 확인하였다.

또한, 생쥐의 복강에 오브발부민(ovalbumin)과 알럼보조제(alum adjuvant)를 2회 투여하여 감작시킨 후, Tyrosol을 경구 투여하고, 오브발부민을 추가로 복강 내 투여하여 능동형 전신성 알레르기 반응(active systemic anaphylaxis)을 유발한 쥐에서 체온 감소와 혈청 내 히스타민 농도를 측정한 결과 Tyrosol에 의해 각각이 억제됨을 확인하였다(실시예 4).

아울러, 항알레르기 효과를 갖는 약물을 개발할 때 많이 사용되는 수동형 국소 피부 알레르기 반응(passive cutaneous anaphylaxis, PCA)을 이용하여 Tyrosol의 피부 알레르기에 대한 효과를 실험한 결과, Tyrosol이 농도 의존적으로 국소 피부 알레르기 반응을 억제함을 알 수 있었다(실시예 5).

상기의 결과로부터 Tyrosol이 알레르기 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였으며, 바람직하게는 염증성 알레르기 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

또한, 상기 알레르기 질환은 비만세포를 매개로 하는 알레르기 질환일 수 있으며, 구체적으로는, 상기 화학식 I으로 표현되는 Tyrosol은 비만세포에서 탈과립을 억제함으로써 알레르기 질환에 그 효과를 발휘할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 “알레르기”는 어떤 외래성 물질과 접한 생체가 그 물질에 대하여 정상과는 다른 반응을 나타내는 현상을 의미한다. 알레르기란 광범위하고 복잡한 병리적 현상의 총화로 면역반응에 근거한 생체의 전신적 또는 국소적인 장애이다. 인체에 나타나는 알레르기는 면역 기전에 따라 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ형으로 분류되며, 이 중에서 즉시형 과민반응에 속하는 Ⅰ형 알레르기가 임상에 있어서 중요한 부분을 차지하고 있으며, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 기관지 천식, 고초열 및 화분증 등이 여기에 속한다. 상기 알레르기 질환은 바람직하게는 염증성 알레르기 질환일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 “예방”은 본 발명의 조성물의 투여로 알레르기 질환을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 “치료”는 본 발명의 조성물의 투여로 알레르기 질환의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1~90 중량부로 포함되는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 Tyrosol에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올 레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용 될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

한편, 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 치료용 조성물은 임의의 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, l9th Edition, Alfonso, R., ed, Mack Publishing Co.(Easton, PA: 1995))를 추가로 포함할 수 있다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충용액, 예를 들어 인산, 시트르산 및 다른 유기산; 아스코르브산을 비롯한 항산화제; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA; 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예를 들어 나트륨; 및(또는) 비이온성 계면활성제, 예를 들어 트윈, 플루로닉스 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함된다.

본 발명의 약학적 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 0.01 - 100mg/kg/day이며, 바람직하게는 0.1 - 20mg/kg/day이며, 더욱 바람직하게는 1 - 5mg/kg/day일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 간격으로 분할 투여할 수도 있다.

본 발명은 또한 상기 알레르기 질환은 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 천식, 알레르기성 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 아나필락틱 쇼크(anaphylactic shock), 다발성 경화증, 급성 염증, 만성 염증질환, 두드러기, 고초열, 소화관 알레르기, 약제 알레르기, 식품 알레르기 및 화분증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 Tyrosol을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

구체적으로 상기 알레르기 질환은 염증성 알레르기 질환일 수 있으며, 상기 알레르기 질환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 화학식 1의 Tyrosol을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 “식품”은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.

본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다.

또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 항염증제 또는 항알레르기제 등의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

또한, 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 식품 조성물 100 중량부당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 식품 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100mL당 일반적으로 약 0.01~0.04g, 바람직하게는 약 0.02~0.03g 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 Tyrosol을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 개선용 피부외용제를 제공한다.

본 발명의 조성물이 피부 외용제로 제조되는 경우, 본 발명의 조성물은 상술한 Tyrosol 조성물 뿐만 아니라, 피부 외용제에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 또한, 본 발명의 조성물은 Tyrosol 이외에, 그 작용을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용되어오던 피부 습윤제, 피부 밀폐제 및 세라마이드 함유 보습제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 피부 외용제는 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액,현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린징, 오일, 분말 파운데이션,유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제,에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트가 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 Tyrosol을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 제제를 제공한다.

상기 Tyrosol을 포함하는 약학적 제제는 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 첨가제나 매개체와 결합될 수 있다. 습윤제나 유화제, pH 완충제 같은 보조물질은 첨가제나 매개체 안에 존재할 수 있다. 이 첨가제, 매개체와 보조물질은 일반적으로 조성물을 받은 개체 안에서 면역 반응을 유도하지 않는 제약물질이고 이것은 유독한 독성효과 없이 투여된다. 약학적으로 허용가능한 첨가제는 수분, 염분, 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol), 히알루론산(hyaluronic acid), 글리세롤(glycerol), 싸이오글리세롤(thioglycerol), 에탄올(ethanol)같은 액체를 포함하지만 그것으로 제한되지는 않는다. 약학적으로 허용가능한 염은 또한 예를 들어 그 안에 하이드로클로라이드 (hydrochloride), 하이드로브로마이드(hydrobromide), 인산염(phosphate), 황산염(sulfate) 같은 무기산염이 포함된다. 그리고 아세테이트(acetate), 프로피온 에스테르(propionate), 말론산(malonate), 벤조산염(benzoate) 같은 유기산염이 포함된다. 약학적으로 허용가능한 첨가제, 매개체 그리고 보조물질의 철저한 논의는 Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.1991)에서 담고 있다.

본 발명의 화학식 1의 Tyrosol을 알레르기 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 약학적 제제에 첨가할 경우, 상기 화학식 1의 Tyrosol을 그대로 첨가하거나 다른 약학 제제와 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.

따라서 본 발명의 Tyrosol은 알레르기 반응과 관련 있는 비만세포로부터의 히스타민 유리를 억제하고, 염증 유발 사이토카인 유전자들인 TNF-α 및 IL-1β, IL-4의 발현 및 전사인자인 NF-ĸB 활성을 억제하는 효과가 우수하여 알레르기 질환, 특히 비만세포를 매개로 하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1A는 RBL-2H3 세포에서 히스타민 유리 억제에 대한 사인으로부터 추출한 약물들의 효과를 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 1B는 도 1A에 사용된 사인 추출물들의 명칭을 나타내는 표이다.
도 2A는 RBL-2H3 세포에서 히스타민 유리 억제에 대한 Tyrosol의 효과를 보여주는 그래프이다(GA: gallic acid, Dexa : dexamathasone).
도 2B는 랫트 복강 비만세포(rat peritoneal mast cells, RPMCs)에서 히스타민 유리 억제에 대한 Tyrosol의 효과를 보여주는 그래프이다(GA: gallic acid, Dexa : dexamathasone).
도 3은 RBL-2H3 세포에서 세포 내 칼슘 감소에 대한 Tyrosol의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 RBL-2H3 세포에서 Tyrosol의 농도별 TNF-α 및 IL-1β, IL-4 mRNA의 발현양 감소를 확인한 그래프이다.
도 5는 Tyrosol의 IκBα 분해 및 NF-ĸB 활성 억제 효과를 보여주는 도이다.
도 6A는 전신성 알레르기 반응(active systemic anaphylaxis)에서 Tyrosol의 체온 감소 억제 효과를 보여주는 그래프이다(OVA: ovalbumin, GA: gallic acid, Dexa : dexamathasone).
도 6B는 전신성 알레르기 반응(active systemic anaphylaxis)에서 Tyrosol의 생쥐 혈청 내 히스타민 농도 감소 효과를 보여주는 그래프이다(OVA: ovalbumin, GA: gallic acid, Dexa : dexamathasone).
도 7A는 수동형 국소 피부 알레르기 반응(passive cutaneous anaphylaxis, PCA)을 통해 Tyrosol의 농도별 피부 알레르기에 대한 효과를 확인한 사진이다(GA: gallic acid, Dexa : dexamathasone).
도 7B는 수동형 국소 피부 알레르기 반응(passive cutaneous anaphylaxis, PCA)을 통해 Tyrosol의 농도별 피부 알레르기에 대한 귀의 색 변화를 나타낸 그래프이다(GA: gallic acid, Dexa : dexamathasone).
도 7C는 수동형 국소 피부 알레르기 반응(passive cutaneous anaphylaxis, PCA)을 통해 Tyrosol의 농도별 피부 알레르기에 대한 귀 두께 변화를 나타낸 그래프이다(GA: gallic acid, Dexa : dexamathasone).
도 8은 RBL-2H3 세포에서 Tyrosol의 세포독성을 확인한 그래프이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

사인으로부터 Tyrosol의 분리

건조시킨 분말 형태의 사인 열매 9.5kg에 메탄올 45L를 가하고 실온에서 추출한 후 진공 상태에서 농축하여 잔류물 440g을 얻었다. 이를 다양한 용매로 추출하여 물(275.1g), n-헥산(120g), 메틸렌클로라이드(32.7g), 에틸아세테이트(9.8g) 추출액을 얻은 후, 메틸렌클로라이드 추출액을 실리카 젤 액체 크로마토그래피를 통해 7개의 구획(AF1-AF7)을 얻었다. 도 1B의 화합물 6종(4-hydroxy-benzaldehyde, 3,4-dihydroxy-benzaldehyde, Tyrosol, Hydroxytyrosol, o-vanillic acid, pyrocatechol)은 AF3(101.2mg)로부터 preparative HPLC(C18,250×21.2mm, 유량 6mL/분)를 이용하여 분리하였고, 메탄올:물(농도구배 30:70~60:40) 혼합액으로 용리되었다. 컬럼 크로마토그래피는 Merck사의 실리카 젤(70-230mesh)와 Lichroprep RP-18 젤(40-63μm)을 이용하여 진행하였으며, HPLC 분리에는 Gilson 시스템, 자외선 측정기, Luna C18 컬럼(250×21.20mm, 10마이크론)이 사용되었다. 얇은 층 크로마토그래피는 Merck사의 실리카 젤 60 F254 와 RP-18 F254로 코팅된 알루미늄 플레이트를 사용하여 진행하였으며, 화합물은 자외선 하에 바닐린-황산 혼합액(1% 에탄올릭 바닐린 용액, 10% 에탄올릭 황산)과 10% 황산으로 110℃에서 1분간 가열함으로써 분산시켜 측정되었다. 1H (250MHz), 13C(63MHz) 핵자기공명 스펙트럼은 Bruker 250MHz (DMX 250)을 사용하여, 1H (500MHz), 13C(125MHz) 핵자기공명 스펙트럼은 JEOL ECA-500을 사용하여 각각 기록되었다. 모든 핵자기공명 실험은 294K에서 시행되었다.

<실시예 2>

비만세포에서 Tyrosol의 히스타민 유리 억제 효과

<2-1> 시약 및 세포 배양

항-dinitrophenyl(DNP)-IgE(Cat No. D8406), DNP-human serum albumin(HSA)(Cat No. A6661)은 Sigma사(미국)에서 구입하였다. 인간 비만세포주인 RBL-2H3 세포(한국세포주은행에서 구입)는 열에 의해 불활성화한 10% FBS가 첨가된 Gibco사(미국)의 Dulbecco’s modified eagle medium(Cat No. 12800-017)에서 배양하였다.

<2-2> 랫트의 복강 비만세포의 분리 및 배양

랫트 복강 비만세포(rat peritoneal mast cells, RPMCs)를 분리하기 위하여 랫트를 이산화탄소로 안락사한 후 20mL의 완충용액(Tyrode’s buffer: 137mM NaCl, 5.6mM glucose, 12mM NaHCO3, 2.7mM KCl, 0.3mM NaH2PO4, 0.1% gelatin)을 복강 내에 주사하고 약 90초 동안 복부의 좌우측을 약하게 마사지하였다. 랫트의 복강 외피를 절개한 후 복강 내의 완충용액을 파스퇴르 피펫을 사용하여 회수한 후 실온에서 원심분리(150g, 10분)하여 침전시켰다. 침전물을 다시 1mL의 완충용액에 섞은 후 2mL의 Histodenz 용액(0.235g/mL) 위에 조심히 띄우고 실온에서 원심분리(400g, 10분)하였다. 상층액을 제거한 후 남은 침전물에 1mL의 완충용액을 가하여 세척하고 톨루이딘 블루(toluidine blue) 염색을 통해 비만세포를 확인하였으며, 트리판 블루(trypan blue) 염색을 통해 세포의 생존 여부를 확인하였다. RPMCs는 열에 의해 불활성화한 10% FBS가 첨가된 Gibco사(미국)의 Alpha minimum essential media(Cat No. 11900-024)에서 배양하였다.

<2-3> 비만세포로부터 Tyrosol의 히스타민의 유리 억제 측정

비만세포로부터 히스타민 유리에 대한 억제효과를 확인하기 위하여 RBL-2H3 세포와 RPMCs를 항-DNP-IgE로 감작시킨 후, DNP-HSA를 처리하여 활성화시킴으로써 세포 내 과립의 주 함유물질이자 알레르기 유발물질인 히스타민을 유리시켰다. 활성화에 앞서 각각의 비만세포들에는 다양한 농도의 Tyrosol을 전 처리하였다. 활성화된 비만세포의 배양액을 회수하여 실험에 사용하였다. 즉, 에펜돌프 튜브에 시료 200μL를 취하여 0.1N 염산 80μL와 60％ 과염소산 용액 20μL를 혼합한 후에 원심분리(13,000g, 20분, 5415R, Eppendorf사)를 하였다. 그 상등액 200μL를 취해 5N NaOH 용액 100μL, n-부탄올(n-butanol) 800μL, 5M NaCl 200μL를 혼합한 시험관에 넣고 이를 진탕한 후 원심분리(13,000g, 20분)를 수행하였다. 상기 시험관에서 부탄올(butanol)층 500μL를 취해 0.1N 염산 200μL, n-헵탄(n-heptane) 500μL를 가하여 진탕하고 다시 원심분리(13,000g, 20분)를 수행하여 얻어진 수층 150μL에 1N NaOH 40μL, 1％ o-프탈디알데하이드(o-phthaldialdehyde)용액(Sigma사, Cat No. P1378) 10μL를 가하여 혼합하고 5분 동안 방치한 다음, 3N 염산 20μL을 추가하여 방출파장(emission wavelength) 440nm, 여기파장(excitation wavelength) 360nm에서 형광강도를 형광분석기(GEMINIEM, Molecular Devices 사)를 이용하여 측정하였다.

측정한 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 활성화된 비만세포에서 많은 양의 히스타민이 유리되는 결과로부터 Tyrosol의 처리에 의해 농도 의존적으로 히스타민의 유리가 억제됨을 알 수 있었다(도 2A: RBL-2H3 세포, 도 2B: RPMCs 세포).

특히, 본 발명의 Tyrosol은 비교예로 사용된 갈산(gallic acid)과 덱사메타손(dexamethasone)에 비해 낮은 농도에서 비슷한 수준의 히스타민의 유리 억제 효과를 가짐을 알 수 있었다. 이를 통해, 본 발명의 Tyrosol이 알레르기 질환에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

<2-4> 비만세포에서 세포 내 칼슘에 대한 Tyrosol의 효과

칼슘은 세포 내 2차 전달물질로서 생리활성의 조절에 중요한 역할을 하고, 비만세포의 탈과립을 조절하는 신호전달 물질로 잘 알려져 있다. 따라서 세포 내 칼슘의 양이 증가하면 비만세포가 탈과립되고, 반대로 칼슘의 양이 감소하면 비만세포의 탈과립이 억제된다. 따라서 세포 내 칼슘에 대한 Tyrosol 효과의 관찰을 통해 Tyrosol의 비만세포에서 히스타민 유리 작용기전을 확인할 수 있다.

RBL-2H3 세포에 항-DNP-IgE와 DNP-HSA를 각각 처리함으로써 활성화된 비만세포에서 세포 내 칼슘 양과 Tyrosol을 처리한 후 세포 내 칼슘의 양은 Fluo-3, AM(Invitrogen사, Cat No. F1242)을 이용하여 형광염색한 후 형광분석기로 측정하였다.

측정한 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 활성화된 비만세포는 급격한 세포 내 칼슘의 증가를 나타내었다. 그러나 Tyrosol을 처리한 군에서 유의적으로 세포 내 칼슘의 양 증가가 현저하게 감소하는 결과로부터 Tyrosol이 칼슘의 양을 감소시켜 비만세포의 탈과립을 억제함으로써 알레르기 치료에 효과가 있음을 알 수 있었다.

특히, 본 본 발명의 Tyrosol은 비교예로 사용된 세포내 칼슘 저해제인 BAPTA-AM(1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrakis(acetoxymethyl ester))에 비해 낮은 농도에서 비슷한 수준으로 비만세포의 탈과립을 억제함을 알 수 있었다.

<실시예 3>

비만세포에서 Tyrosol의 염증 유발 저해 효과

<3-1> 비만세포에서 염증 유발성 사이토카인의 유전자 발현에 대한 Tyrosol의 효과

비만세포에서 유리되거나 새로 합성되어 분비됨으로써 염증성 알레르기를 일으키는 생리활성물질인 TNF-α, IL-1β 및 IL-4와 같은 염증 유발성 사이토카인의 발현에 대한 Tyrosol의 효과를 확인하기 위해, 비만세포를 항-DNP-IgE로 감작시킨 후, DNP-HSA로 활성화하여 염증 유발성 사이토카인의 분비를 촉진시킨 다음 실시간 연쇄중합반응을 이용하여 각각의 mRNA 발현양을 측정하였다.

<3-2> 실시간 연쇄중합반응(Real-time polymerase chain reaction)을 이용한 유전자 발현 분석

RNA 분리 kit를 사용하여 세포로부터 total RNA를 분리하고, 분리된 total RNA의 흡광도를 측정하여 정량한 후, 2μg RNA로 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 주형으로 표 1에 기재된 다양한 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하였다(PCR 조건: 변성 -94℃, 30초, 프라이머 결합 -60℃, 30초, 신장 -72℃, 30초). 이때, 대조군으로 β-actin에 대한 PCR을 함께 실시하며 얻어진 흡광도로 각각의 사이토카인 발현을 비교하였다.

각 프라이머 서열

유전자	프라이머		Amplified
(Gene)			size(bp)
β-actin	forward	5'-GAA GCT GTG CTA TGT TGC CCT AGA -3'	445
	(서열번호1)
	reverse	5'-GTA CTC CTG CTT GCT GAT CCA CAT -3'
	(서열번호2)
TNF-α	forward	5'-CAA GGA GCA GAA GTT CCC AA-3'	500
	(서열번호3)
	reverse	5'-CGG ACT CCG TGA TGT CTA AG-3'
	(서열번호4)
IL-1β	forward	5'-GCT GTG GCA GCT ACC TAT GTC TTG-3'	120
	(서열번호5)
	reverse	5'-AGG TCG TCA TCA TCC CAC GAG-3'
	(서열번호6)
IL-4	forward	5'-ACC TTG CTG TCA CCC TGT TC-3'	291
	(서열번호7)
	reverse	5'-TTG TGA GCG TGG ACT CAT TC-3'
	(서열번호8)

측정한 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에서 나타낸 바와 같이, 항-DNP-IgE와 DNP-HSA로 활성화시킨 RBL-2H3 세포에서 TNF-α,IL-1β 및 IL-4 mRNA의 발현양이 증가하였으며, Tyrosol을 농도별로 전 처리한 결과 Tyrosol이 농도 의존적으로 이들 사이토카인의 mRNA 발현양을 감소시킴을 확인하였다. 또한, 대조군인 갈산(gallic acid)과 덱사메타손(dexamethasone)에 비해 더 낮은 농도에서 효과적으로 염증 유발성 사이토카인의 mRNA 발현양을 감소시킴을 확인함으로써 Tyrosol이 갈산과 덱사메타손에 비해 더 효과적으로 염증 유발을 저해시킴을 알 수 있었다.

<3-3> NF-ĸB에 대한 Tyrosol의 효과

Tyrosol이 염증 유발성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 및 IL-4의 발현을 억제하는 과정에 관여하는 보다 정확한 신호전달 기전을 밝히기 위해, 염증성 사이토카인의 전사를 조절하는 인자로서 면역반응과 염증반응을 매개하는 중요한 신호 전달 물질인 NF-ĸB의 활성화에 대해 측정하였다. 비활성 상태의 NF-ĸB는 내인성 억제 단백질인 IĸBα에 결합하여 비활성화 상태를 유지하다가 활성화되면 IĸBα가 인산화 되어 분해되면서 이들로부터 유리되어 핵으로 이동하여 전사인자로써 활동하므로 IĸBα에 대한 분해 영향도 아울러 측정하였다. NF-ĸB에 대한 Tyrosol의 효과를 확인하기 위해, 비만세포를 항-DNP-IgE로 감작시킨 후, DNP-HSA로 활성화하여 NF-ĸB를 활성화시킨 다음 웨스턴블랏을 이용하여 핵과 세포질에서 각각의 단백질량을 측정하였다.

<3-4> 웨스턴블랏(Western blot)을 이용한 단백질 발현 분석

RBL-2H3 세포를 0.5mM 페닐메탄에설포닐 플루오라이드(Phenylmethanesulfonyl fluoride, Sigma사, Cat No. P7626)와 5μg/mL의 류펩틴(leupeptin, Sigma 사, Cat No. L2884)을 함유한 추출완충액(0.5% triton X-100, 1mM Na3VO4등을 함유한 PBS용액)으로 용해시킨 후, 소니케이션(sonication)하여 DNA를 조각내었다. 단백질량은 소혈청알부민(bovine serum albumin)을 표준으로 하여 Bio-Rad 사의 protein assay kit(Cat No. 500-0002)를 이용해서 측정하였다. 세포 총 단백 10~50μg을 0.1％ SDS를 함유한 8~12％(w/v) 폴리아크릴아마이드겔(polyacrylamide gel)에서 전기영동한 후에 겔에 존재하는 단백질을 일렉트로블로팅(electroblotting) 방법으로 니트로셀룰로오스(nitrocellulose, NC) 필터에 옮긴 후, 비특이적인 결합을 차단하기 위하여 니트로셀룰로오스 필터를 5％ 탈지분유를 함유한 tris-buffered saline-tween(TBS-tween, Sigma 사) 용액에 넣고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 필터를 타겟 단백질에 대한 항체를 함유한 TBS-tween 용액에 넣고 4℃에서 12시간 동안 방치한 후에 HRP(horseradish peroxidase, Sigma 사, Cat No. P0889)로 표지된 2차 항체로 표지하였으며, ECL(Enhanced chemiluminescence, Thermo scientific 사, Cat No. 34080)을 이용하여 밴드들을 측정하였다.

측정한 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에서 나타낸 바와 같이, RBL-2H3 세포를 항-DNP-IgE로 감작시킨 후, DNP-HSA로 활성화하면 IĸBα가 분해되고, 핵 내의 NF-κB가 증가한다. 여기에 Tyrosol을 처리할 경우 항-DNP-IgE와 DNP-HSA 결합에 의한 IκBα의 분해를 억제하고 핵 내의 NF-ĸB가 감소함을 확인하였다. 이를 통해 Tyrosol은 NF-ĸB의 활성에 대한 억제 효과가 있으며 이는 핵 내에서 염증 유발성 사이토카인의 유전자 발현에 관여함을 알 수 있었다. 즉, Tyrosol이 염증 질환에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

덧붙여, PP2는 Lyn과 같은 src family 인산화효소 억제제로써 비교 약물로 사용하였다.

<실시예 4>

전신성 알레르기 반응에 대한 Tyrosol의 효과

Tyrosol의 농도에 따른 전신성 알레르기 반응에 미치는 영향을 확인하기 위하여 능동형 전신성 알레르기 모델(active systemic anaphylaxis)이 사용되었다. 전신성 알레르기 반응의 유도를 위해 오브발부민(ovalbumin, OVA)과 알럼보조제(alum adjuvant)를 2회 복강 내 투여하여 생쥐를 감작시키고, 2차 감작 후 4일차부터 6일차까지 Tyrosol을 10mg/kg 용량으로 3회 경구 투여한 후 7일차에 오브발부민을 추가로 복강 내 투여하여 아나필락시스(anaphylaxis)를 유발하였다. 1시간 동안 생쥐의 체온 변화를 관찰하고 혈청 내 히스타민 농도를 측정하였다.

이에 대한 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6A에서 나타낸 바와 같이, 오브발부민만 투여한 대조군은 최대 7.47℃의 체온 감소를 보였지만, Tyrosol을 10mg/kg의 농도로 투여한 경우 4.92℃의 체온 감소를 보여 감소폭이 현저하게 줄어듦을 확인할 수 있었다. 또한 도 6B에서 나타낸 바와 같이, 대조군에서 338.57ng/mL 농도의 높은 혈청 히스타민 분비를 보였지만, Tyrosol을 투여하였을 때는 평균 148.04ng/mL로 혈청 내 히스타민 농도가 감소함을 확인하였다. 따라서 이러한 결과로부터 Tyrosol은 전신성 알레르기 반응에 치료 효과가 있음을 알 수 있었다.

<실시예 5>

국소 피부 알레르기 반응에 대한 Tyrosol의 효과

항알레르기 효과를 갖는 약물을 개발할 때 많이 사용되는 수동형 국소 피부 알레르기 반응(passive cutaneous anaphylaxis, PCA)을 이용하여 Tyrosol의 피부 알레르기에 대한 효과를 실험하였다. PCA는 IgE에 의해 매개되는 알레르기 반응으로 항체를 국소 피부에 피내주사하고 48시간 후 항원을 생쥐의 꼬리 정맥으로 투여하여 인위적으로 알레르기 반응을 일으키는 실험 방법이다. 이 경우 항체 주사부위에서 항원-항체 반응이 일어나 그 주변에 존재하는 비만세포가 활성화되어 히스타민이 분비되고 국소적으로 알레르기 반응이 일어난다. 따라서 이에 대해 Tyrosol의 농도를 달리하여 경구 투여한 후 생쥐의 발적 정도와 귀의 부종 정도를 관찰하였다.

상기의 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이 Tyrosol을 처리한 결과, 농도가 높을수록 발적 부위가 작아지고(도 7B), 부종이 감소하는 결과(도 7C)로부터 Tyrosol이 농도 의존적으로 국소 피부 알레르기 반응을 억제함을 알 수 있었다.

<실시예 6>

비만세포 내에서 Tyrosol의 세포독성 실험

Tyrosol의 세포독성을 확인하기 위하여 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 실험을 하기와 같이 실시하였다. MTT 용액은 살아있는 세포에서 미토콘드리아의 디하이드로게나아제(dehydrogenases)에 의해서 포르마잔(formazan)을 형성하여 세포의 생존 여부를 확인할 수 있다. 세포독성 확인을 위해 RBL-2H3 세포를 96 웰 플레이트에 3×10⁴세포/웰로 37℃에서 배양한 후 Tyrosol을 각각 1~1000μM로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 각 웰에 20μL의 MTT 용액을 첨가하고 2시간 동안 추가로 배양한 후 배양액을 제거하고 100μL의 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)를 첨가한 후 570nm에서 흡광도를 측정하였다.

상기의 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, Tyrosol은 100μM의 농도까지 세포독성을 나타내지 않아, 인체에 전혀 무해함을 확인하였다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제조예를 예시한다.

<제조예 1>

약학적 제제의 제조

<1-1> 정제의 제조

하기의 조성에 따라 통상의 정제 제조방법으로 제조하였다.

Tyrosol 10.0mg

유당 500.0mg

탈크 5.0mg

마그네슘 스테아레이트 1.0mg

<1-2> 캡슐제의 제조

하기와 같은 방법에 따라 다음과 같은 조성으로 캡슐제를 제조하였다. 이때, Tyrosol을 체질하여 부형제와 혼합한 후 젤라틴 캡슐 중에 충전하여 캡슐을 제조하였다.

Tyrosol 10.0mg

전분 10.0mg

스테아르산마그네슘 100.0mg

<1-3> 과립제의 제조

하기의 성분을 통상의 과립제의 제조방법으로 과립제를 제조하였다.

Tyrosol 10.0mg

유당 100.0mg

탈크 5.0mg

<1-4> 주사제의 제조

하기의 성분을 통상의 주사제의 제조방법으로 10.0mL의 앰플에 충전하고 멸균시켜 근육주사제를 제조하였다.

Tyrosol 10.0mg

산성아황산나트륨 10.0mg

메틸파라벤 6.0mg

푸로펜파라벤 4.0mg

제일인산나트륨 12.0mg

제이인산나트륨 8.0mg

수산화나트륨 10.0mg

주사용 수 10.0mL

<제조예 2>

식품의 제조

<2-1> 밀가루 식품의 제조

본 발명의 Tyrosol 0.5~5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하였다.

<2-2> 스프 및 육즙(gravies)의 제조

본 발명의 Tyrosol 0.1~5.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

<2-3> 그라운드 비프(ground beef)의 제조

본 발명의 Tyrosol 10 중량부를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

<2-4> 유제품(dairy products)의 제조

본 발명의 Tyrosol 5~10 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

<2-5> 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 본 발명의 Tyrosol을 진공 농축기에서 감압농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다. 상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 Tyrosol을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다. 곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부), 종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부), ECDK(3 중량부), 영지(0.5 중량부), 지황(0.5 중량부), Tyrosol (5-9 중량부).

<제조예 3>

음료의 제조

<3-1> 건강음료의 제조

액상과당(0.5％), 올리고당(2％), 설탕(2％), 식염(0.5％), 물(75％)과 같은 부재료와 본 발명의 Tyrosol 5g을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 제조하였다.

<3-2> 야채 주스의 제조

본 발명의 Tyrosol 5g을 토마토 또는 당근 주스 1,000mL에 가하여 야채 주스를 제조하였다.

<3-3> 과일 주스의 제조

본 발명의 Tyrosol 1g을 사과 또는 포도 주스 1,000mL에 가하여 과일 주스를 제조하였다.

<제조예 4>

피부 외용제제의 제조

<4-1> 연고의 제조

연고는 당분야에서 통상적으로 수행되는 방법에 따라 하기에 제시된 제제의 재료를 혼합함으로써 제조된다.

Tyrosol 5.00 중량％

카프린/카프릴트리글리세리드 10.00 중량％

액상 파라핀 10.00 중량％

소르비탄세스퀴놀리에이트 6.00 중량％

옥틸도데세스-25 9.00 중량％

세틸에틸헥사노에이트 10.00 중량％

스쿠알란 1.00 중량％

살리실산 1.00 중량％

글리세린 15.00 중량％

소르비톨 10.00 중량％

정제수 잔량 중량％

<4-2> 로션의 제조

Tyrosol을 함유한 로션의 성분과 함량은 하기에 나타내었다. 수상인 정제수, 트리에탄올아민, 부틸렌 글리콜을 70℃로 가열하여 용해시키고, 여기에 유상인 지방산, 유성성분, 유화제 및 방부제를 70℃로 가열하여 용해한 액을 첨가하여 유화시켰다. 유화가 완료된 후 친수성 증점제인 잔탄검 2％ 용액을 첨가하여 전체에 대해 0.05 중량％가 되도록 조절하였다. 상기 용액을 45℃로 냉각시킨 후, Tyrosol, 향 및 색소를 첨가하고 혼합한 다음 30℃로 냉각하였다.

Tyrosol 0.10 중량％

글리세린 3.00 중량％

카보머 0.10 중량％

잔탄검 0.05 중량％

1,3-부틸렌 글리콜 3.00 중량％

폴리글리세릴-3 메틸글루코스 디스테아레이트 1.50 중량％

글리세릴 스테아레이트 0.50 중량％

세틸아릴 알콜 0.30 중량％

호호바 오일 3.00 중량％

유동 파라핀 2.00 중량％

스쿠알란 3.00 중량％

디메치콘 0.50 중량％

토코페릴아세테이트 0.20 중량％

트리에탄올아민 0.10 중량％

방부제, 향, 색소 미량

정제수 잔량 중량％

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명에 따른 Tyrosol은 알레르기 반응과 관련 있는 비만세포로부터의 히스타민 유리를 억제하고, 염증 유발 사이토카인 유전자들인 TNF-α, IL-1β 및 IL-4의 발현 및 전사인자인 NF-ĸB 활성을 억제하는 효과가 우수하여, 알레르기 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있어 산업상 이용가능성이 높다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 2-(4-hydroxyphenyl)ethanol을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서, 상기 알레르기 질환은 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 천식, 알레르기성 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 아나필락틱 쇼크(anaphylactic shock), 다발성 경화증, 급성 염증, 만성 염증질환, 두드러기, 고초열, 소화관 알레르기, 약제 알레르기, 식품 알레르기 및 화분증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 2-(4-hydroxyphenyl)ethanol을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
[화학식 1]
제3항에 있어서, 상기 알레르기 질환은 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 천식, 알레르기성 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 아나필락틱 쇼크(anaphylactic shock), 다발성 경화증, 급성 염증, 만성 염증질환, 두드러기, 고초열, 소화관 알레르기, 약제 알레르기, 식품 알레르기 및 화분증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 2-(4-hydroxyphenyl)ethanol을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 개선용 피부 외용제.
[화학식 1]
하기 화학식 1로 표시되는 2-(4-hydroxyphenyl)ethanol을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 제제.
[화학식 1]