KR20160086483A

KR20160086483A - 야교등(Polygoni Multiflori Caulis) 추출물을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20160086483A
Application number: KR1020150003483A
Authority: KR
Inventors: 노윤화; 이종성; 문성준
Original assignee: 코스맥스 주식회사
Priority date: 2015-01-09
Filing date: 2015-01-09
Publication date: 2016-07-20
Also published as: WO2016111476A1

Abstract

본 발명은 야교등 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 야교등 추출물은 티로시나아제(tyrosinase), TRP-1(tyrosinase related protein-1), TRP-2(tyrosinase related protein-2) 또는 MITF((microphthalmia-associated transcription factor)의 유전자 발현을 억제하고, LXR(Liver X Receptor) 활성을 촉진시킴으로써 멜라닌 생합성을 억제하여, 결론적으로 피부 미백 효과를 나타낼 수 있다.

Description

야교등(Polygoni Multiflori Caulis) 추출물을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물{Cosmetics composition comprising Polygoni Multiflori Caulis extract for shitening skin}

본 발명은 야교등 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 야교등 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부색을 결정하는 요인들에는 멜라닌, 각질층의 두께, 말초혈관과 혈색소, 카로틴 등이 있지만 이들 중 피부 색깔을 결정하는 가장 중요한 요인은 멜라닌이다. 멜라닌 색소를 생성하는 멜라닌생성세포의 수는 민족이나 피부색에 관계없이 일정하지만, 멜라닌화의 정도, 멜라닌 소체의 크기와 수 그리고 분포상태, 각질형성 세포 내에서의 멜라닌 소체의 분해능 등이 달라서 피부색의 차이가 나타난다. 특히 흰 피부에서는 stage Ⅰ과 Ⅱ의 멜라닌소체(melanosome)이 많으며 검은 피부에는 stage Ⅲ와 Ⅳ가 많다. 또한 각직형성세포에서의 분해 정도는 멜라닌 소체의 크기와 관련 있는데, 흰 피부에는 작은 멜라닌소체가 두세 개의 그룹으로 되어있어 빨리 분해되는 반면, 검은 피부에서는 하나의 큰 멜라닌소체로 존재하여 천천히 분해된다. (이승헌 등, 피부 장벽학, 여문각, 2010)

멜라닌의 생성은 멜라닌생성세포에서 세포내의 타이로신(L-tyrosine)이 가수분해 반응으로 도파(L-dopa)로 변하고, 산화반응으로 도파퀴논(L-dopaquinone)으로 변하면서 일련의 산화 중합반응 거쳐 멜라닌으로 합성된다. 이때 중요한 작용을 하는 효소가 티로시나아제(tyrosinase)이다. 일반적으로 티로시나아제의 발현이 증가하면 멜라닌 생성도 증가한다. 그러므로 피부 미백제 연구에서 이 티로시나아제를 억제하는 것이 필수적이다.

세포내에서 티로시나아제의 발현은 MITF(Microphthalmia-associated transcription factor)에 의해 조절되는데, 티로시나아제의 프로모터인 M-BOX에 결합하여 전사 인자로 작용한다. MITF 전사인자는 티로시나아제(tyrosinase) 뿐만 아니라 티로시나아제 관련 단백질 1 (tyrosinase related protein 1, TRP-1), 티로시나아제 관련 단백질 2 (tyrosinase related protein 2, TRP-2)와 같은 멜라닌 합성에 관여하는 일련의 효소들의 전사를 유도한다(Saha B et al., Activation of the Mitf promoter by lipid-stimulated activation of p38-stress signalling to CREB. Pigment Cell Res., 2006). 따라서 MITF의 억제를 통하여 티로시나아제의 억제도 이루어짐을 알 수 있다.

이러한 MITF는 LXR (Liver X Receptor)의 영향을 받는데, 발현 자체의 조절뿐만 아니라 세포외 신호 조절 인산화 효소(extracellular signal-regulated kinase, ERK) 경로의 활성화에도 영향을 받는다. 핵수용체의 일종인 Liver X receptor (LXR)는 리간드에 의해 활성화되는 핵 수용체로서, 지질 대사 및 콜레스테롤 항상성 유지에 중심 역할을 한다고 알려져 있다. 최근 연구에 의하면 LXR의 활성화가 멜라닌생성세포에서 멜라닌 생합성과정을 억제한다는 보고가 있었다(Lee CS et al., Liver X Receptor Activation Inhibits Melanogenesis through the Acceleration of ERK-Mediated MITF. Degradation J Invest Dermatol., 2013). 또한, LXR 활성화제가 멜라닌 생성을 저해하여 뛰어난 미백효과를 나타낸다는 것이 보고되어 있다(10-2012-0078675 : 간 Ｘ 수용체 활성제를 포함하는 피부 미백제).

한편, 야교등(Polygoni Multiflori Caulis)은 마디풀과에 속하는 여러해살이풀인 하수오의 넝쿨 줄기를 건조한 것으로서, 여름과 가을에 채취하여 햇볕에 말려 사용한다. 심장과 간을 안정시켜 경락을 통하게 하고 풍을 제거하기 때문에 불면증, 정신병 등에 사용된다. 야교등은 하수오의 넝쿨 줄기라고 기재되어 있어 하수오와 동일하게 판단하는 경우가 있으나, 하수오와 야교등은 다른 생약 성분이다. <한국본초도감>에는 마디풀과의 여러해살이풀 하수오 Polygonum multiflorum Thunberg의 덩이뿌리로, 생약명으로는 건조한 과근을 '하수오(何首烏)'로, 줄기를 '야교등(夜交藤)'이라고 칭하고 있다. 또한, 생약 '하수오'의 효능에는 1. 간신(肝腎) 기능 부족으로 정혈(精血)이 휴손 되어 어지럽고 눈앞에서 꽃이나 별과 같은 것이 헛보일 때, 머리털이 일찍 희어지고 허리가 아프면서 힘이 없고 다리가 연약해지는 증상과 유정(遺精)등에 유효하다. 2.생것은 학질 치료에 효험이 있으며 3. 약성이 서늘해서 해독 작용이 있고, 종기를 치료하고 4. 결핵성림프선염에도 신통력을 보이며, 5. 장관(腸管)이 건조해서 일어나는 변비증에 통변(通便) 작용을 나타낸다. 라고 기재되어 있다. 이에 반해, 야교등의 효능에는 1. 신경과민으로 인한 불면과 꿈이 많은 것을 치료하고, 2. 거풍 작용이 있어 사지관절의 마비동통을 치료하며 3. 피부 가려움증에도 물을 넣고 달여서 환부를 세척하면 가려움이 가라앉는다. 라고 기재되어 있다. 이와 같이, 하수오와 야교등은 하나의 식물의 뿌리와 줄기지만, 서로 다른 생약명을 가지고 다른 효능을 나타내므로 다른 생약 성분으로 사용되고 있다. 이처럼, 야교등과는 상이한 생약재인 하수오(何首烏)의 경우에는 미백 효능이 알려져 있으나(10-2010-0021088 : 피부 미백용 조성물), 넝쿨 줄기인 야교등에 대한 미백 효과에 대해서는 어디에도 기재되어 있지 않다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 야교등 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물의 경우, 티로시나아제(tyrosinase), TRP-1(tyrosinase related protein-1), TRP-2(tyrosinase related protein-2) 또는 MITF((microphthalmia-associated transcription factor)의 유전자 발현을 억제하고, LXR(Liver X Receptor) 활성을 촉진시킴으로써 멜라닌 생합성을 억제하여, 결론적으로 피부 미백 효과를 나타낼 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

KR

10-2012-0078675

A

KR

10-1052189

B

따라서, 본 발명의 주된 목적은 티로시나아제 및 멜라닌 생합성을 억제함으로써 피부 미백 효과를 갖는 야교등 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 야교등(Caulis Polygoni Multiflori) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 야교등은 마디풀과에 속하는 여러해살이풀인 하수오의 넝쿨 줄기를 건조한 것으로서, 하수오로 불리는 하수오(pleuropterus multiflorus)의 뿌리와는 전혀 다른 생약 성분이다. 종래에 상기 하수오의 뿌리인 하수오의 미백효과에 대해서는 알려져 있으나, 본원발명과 같이 야교등의 미백효능에 대해서는 알려지지 않았다. 이에, 본 발명자들은 야교등이 티로시나아제 및 멜라닌 생합성을 억제함으로써 피부 미백 효과를 나타낸다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에 있어서, 상기 추출물은 종래에 사용되어진 어떠한 용매로도 추출될 수 있으며, 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄 또는 핵산으로 추출하는 것을 특징으로 한다.

상기 추출용매를 이용한 추출방법으로는 통상적인 식물의 추출방법 예를 들면, 열수 추출, 환류냉각 추출, 초음파 추출, 초임계 추출 등의 방법을 사용할 수 있으며, 본 발명의 실시예에서는 에탄올 70% 하에서의 추출물 설명하고 있으나, 그에 한정되지는 않을 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 추출물은 총 조성물에 대하여 0.01 내지 90 중량%로 함유되는 것을 특징으로 한다. 상기의 범위를 벗어나는 경우에는 제형화가 용이하지 않아 바람직하지 않다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 티로시나아제(tyrosinase) 활성 억제 및 멜라닌 생합성을 억제함으로써 피부 미백효과를 나타내는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실험예에 따르면, 야교등 추출물은 쥐의 색소세포 및 인체 멜라닌 세포에서 멜라닌의 양을 농도 의존적으로 감소시켰으며, 티로시나아제 활성 또한 농도 의존적으로 억제하는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과로 볼 때, 본 발명의 야교등 추출물이 티로시나아제 및 멜라닌 합성을 억제함으로써 피부 미백 효과를 나타낼 수 있음을 의미한다(실험예 1-3 참조).

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 티로시나아제, TRP-1(tyrosinase related protein-1), TRP-2(tyrosinase related protein-2) 또는 MITF((microphthalmia-associated transcription factor)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상 단백질의 발현을 저해함으로써 피부 멜라닌 합성을 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실험예에 따르면, 야교등 추출물은 멜라닌 생성에 관여하는 유전자인 티로시나아제, TRP-1, TRP-2 또는 MITF 의 발현을 모두 감소시키는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과로 볼 때, 본 발명의 야교등 추출물은 상기 유전자들의 억제를 통하여 티로시나아제를 억제할 수 있으며 결과적으로 피부 미백 효과를 나타낼 수 있음을 의미한다(실험예 6 참조).

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 LXR(Liver X Receptor) 프로모터 활성을 촉진시킴으로써 멜라닌 생합성을 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실험예에 따르면, 야교등 추출물이 농도의존적으로 LXR의 활성을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로 볼 때, 본 발명의 야교등 추출물은 LXR의 활성을 억제함으로써 멜라닌 생합성을 조절하고, 결과적으로 피부 미백효과를 나타낼 수 있음을 의미한다(실험예 5).

상기 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 제형을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 화장품 조성물은 담체 이외에 다른 보조제를 포함할 수 있는데, 예를 들면 보존제, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료 등을 포함할 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 야교등 추출물이 MITF, 티로시나아제, 티로시나아제 관련 단백질 1, 티로시나아제 관련 단백질 2의 발현을 억제하고 멜라닌 생성세포에서 멜라닌의 생성을 억제함으로써 피부 미백 효과를 나타낸다.

도 1 은 야교등 추출물에 의한 멜라닌 생성 억제 효과를 쥐의 색소세포(B16 melanoma cells)에서 관찰한 결과이다.
도 2 은 야교등 추출물에 의한 멜라닌 생성 억제 효과를 사람 색소세포(Human epidermal melanocyte)에서 관찰한 결과이다.
도 3 은 멜라닌 생성에 관여하는 유전자들의 발현에 대한 야교등 추출물의 억제 효과를 쥐의 색소세포(B16 melanoma cells)에서 관찰한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 야교등 추출물의 제조

야교등은 한의원에 약제를 전문적으로 납품하는 동양허브라는 전문업체에서 구입하여 본 발명의 시료로 사용하였다.

구입한 야교등 건조중량 100g을 분쇄기에 넣고 분말 제조하여, 70% 에탄올이 함유된 용액 1L에 넣어 밀봉한 후, 상온에서 72시간 추출하였다. 추출액은 와트만 종이 여과지로 감압 여과하였으며, 냉각콘덴서가 달린 감압 회전 증류장치를 이용하여 증발되어 나오는 용매를 회수하면서 완전히 감압농축 하여, 건조중량 12g을 얻었다.

실험예 1: 야교등 추출물에 의한 B16 멜라노마 세포의 멜라닌 생성 억제효과 측정

쥐의 색소세포(B16 melanoma cells)를 이용하여 야교등 추출물에 의한 멜라닌 생성 억제효과를 측정하였으며, 이를 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 알려진 H89(10uM)에 의한 멜라닌 생성 억제효과와 비교하였다.

본 실험은 murine melanoma(B16 F10) 세포를 6-well plate에 1×10⁵ cells/well로 접종한 후, DMEM(Dulbecco Minimum Essential Medium)배지에서 세포가 well 바닥에 약 80 % 이상 부착될 때까지 배양하였다. 이후 시료가 적당 농도로 희석된 배지에 처리하여 48시간 더 배양하였다. 야교등 추출물의 농도범위는 세포독성이 없는 10㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖로 결정하였다. 배양한 플레이트는 48시간 후 PBS로 세척하고 트립신으로 세포를 회수하였다. 세포의 수를 hematocytometer로 계수하고 각 처리 그룹별로 동일한 세포수가 되도록 맞추어 1000rpm, 10분간 원심분리하여 세포를 얻었다. 회수된 세포를 60℃에서 건조한 후, 10% DMSO가 함유된 1M 수산화나트륨액 100㎕를 넣어 한 시간 동안 60℃ 항온조에서 반응시켜 세포내 멜라닌을 얻었다. 이 멜라닌액을 490㎚ microplate reader로 흡광도를 측정하여 세포 일정 수당 멜라닌 양을 구하였다.

그 결과를 하기 도 1에 나타내었다. 도 1에서 나타나는 바와 같이, 야교등 추출물에 의해 멜라닌 양이 농도 의존적으로 감소함을 관찰하였다. 특히, 야교등 추출물 100㎍/㎖ 의 경우, H89 10uM에 비해 우수한 미백효능을 보였다. 그러므로, 본 실험을 통해, 야교등 추출물이 미백 효능을 가지고 있음을 증명하였다.

실험예 2: 야교등 추출물에 의한 인체멜라닌 세포의 멜라닌 생성 억제효과 측정

인체 멜라닌세포(melanocyte)를 이용하여 야교등 추출물에 의한 멜라닌 생성 억제효과를 측정하고, 이를 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 알려진 비타민 C에 의한 세포내 티로시나제 활성 억제효과와 비교하였다.

본 실험은 Cascade Biologics사로부터 구입한 Human epidermal melanocyte (신생아유래) 세포를 역시 같은 회사에서 구입한 Human Melanocyte Growth supplement를 포함한 Medium 254배지에서 배양한다. Human epidermal melanocytes를 6-well plate에 well당 1× 10⁵ 개로 접종한 후 5 % CO₂, 37℃ 하에서 세포가 well 바닥에 약 80 % 이상 부착될 때까지 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 시료를 적당 농도로 희석하여 배지에 처리한 후 5% CO₂, 37℃ 하에서 이틀에 한 번 배지를 갈아주면서 5일간 배양하였다. 야교등 추출물의 농도범위는 세포독성이 없는 10㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖로 결정하였다. 처리가 끝난 후 배지를 제거하고 PBS(phosphated buffer saline)로 세척한 후, 트립신으로 처리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 hematocytometer를 이용하여 세포수를 측정한 후 각 처리 그룹별 세포수를 동수로 맞추어 5,000 ~ 10,000 rpm으로 10분간 원심 분리한 다음 상등액을 제거하여 세포를 얻었다. 이 세포를 60℃에서 건조한 후, 10% DMSO가 함유된 1M 수산화나트륨액 100㎕를 넣어 60℃ 항온조에서 세포내 멜라닌을 얻었다. 이 액으로 microplate reader로 490㎚에서 흡광도를 측정하여 세포 일정 수당 멜라닌 양을 구하였다.

그 결과를 하기 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이, B16 멜라노마 세포실험에서와 동일하게, 인체 멜라닌 세포에서도 야교등 추출물 처리에 의한 멜라닌 양이 농도 의존적으로 감소됨을 확인하였다. 그러므로, 야교등 추출물이 인체 세포에도 미백 효능을 나타내고 있음을 확인하였다.

실험예 3: 야교등 추출물에 의한 세포내 티로시나아제 활성억제 효과 측정

쥐의 색소세포(B16 melanoma cells)를 이용하여 야교등 추출물에 의한 멜라닌 생성 억제효과를 측정하고, 이를 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 알려진 알부틴에 의한 세포내 티로시나아제 활성 억제효과와 비교하였다.

본 실험은 뮤라인 멜라노마(murine melanoma)(B-16 F1) 세포를 10%의 FBS (fetal bovine serum)가 함유된 DMEM 배지로 6-well plate에 well 당 1×10⁵ 개로 접종한 후 5% CO₂, 37℃ 하에서 세포가 well 바닥에 약 80 % 이상 부착될 때까지 배양하였다. 그 후 배지를 제거하고 시료를 적당 농도로 희석된 배지에 교체한 후 5% CO₂, 37℃ 하에서 3일간 더 배양하였다. 야교등 추출물의 농도범위는 세포독성이 없는 10㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖ 으로 결정하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 세척하고, 이것을 트립신으로 처리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 헤마토사이토미터(hematocytometer)를 이용하여 세포수를 측정한 후 5,000 ~ 10,000 rpm으로 10분간 원심분리한 다음 상층액을 제거하여 세포를 얻었다. 이 세포를 용해 완충액을 이용하여 분쇄한 후, 12,000rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 수집하였다. 이 효소액을 40㎕ 넣고 2㎍/㎖ 으로 녹인 기질 L-dopa를 100㎕ 첨가하였다. 37℃, 한 시간 반응 후, microplate reader 492㎚에서 흡광도를 측정하여 티로시나아제 활성을 계산하였다. 티로시나아제의 활성도는 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 계산하였으며 양성대조군인 알부틴도 동일하게 적용하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

시료	처리농도(㎍/㎖l)	세포내 타이로시네이즈 활성 억제율(%)
알부틴	10	8
야교등 추출물	10	15
야교등 추출물	50	34
야교등 추출물	100	58

상기 표 1에 기재된 바와 같이, 야교등 추출물이 10㎍/㎖로 처리한 알부틴보다 세포내 티로시나아제 억제율이 높음을 알 수 있었다. 또한, 야교등 추출물의 타이로시네이즈 활성 억제 정도는 농도에 의존적이라는 것을 알 수 있었다.

실험예 4: 야교등 추출물의 세포독성 측정

본 실험은 murine melanoma(B-16 F10) 세포를 10%의 FBS(fetal bovine serum)가 함유된 DMEM 배지로 6-well plate에 well당 1×10⁵ 개로 접종한 후, 5 % CO₂ 및 37℃하에서 세포가 well 바닥에 약 80 % 이상 부착될 때까지 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 야교등 추출물을 10㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖농도로 희석된 배지에 처리하고, 5% CO₂, 37℃하에서 2일간 배양하였다. 세포독성 효과를 MTT(3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide) 평가법으로 측정하였다. MTT는 담황색의 기질로서 생세포의 미토콘드리아 내의 호흡연쇄효소에 의해 개열하고 암청색의 포마잔을 생성한다. 죽은 세포에서는 반응이 일어나지 않으므로 이 포마잔의 생성량은 살아있는 세포수 측정에 이용된다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

시료	처리농도(㎍/㎖l)	세포생존율 (% of control)
알부틴	10	100±4.3
야교등 추출물	10	101.4±3.8
야교등 추출물	50	99.50±5.2
야교등 추출물	100	98.94±3.3

상기 표 2에 기재된 바와 같이, 야교등 추출물에 의한 세포독성은 없음이 확인되었다.

실험예 5: 야교등 추출물의 Liver X Receptor Response Element ( LXRE ) 프로모터 활성 촉진 효과

멜라닌 양을 감소시키는 야교등 추출물의 억제 메카니즘을 규명하기 위한 실험을 수행하였다. Liver X receptor(LXR)가 활성화 되면, 멜라닌 생성이 억제된다고 보고되어 있어, LXR 단백질에 의해 활성화된 LXRE 프로모터를 이용하여, 야교등 추출물이 LXRE 프로모터 리포터(LXRE promoter luciferase reporter)를 활성화 시킬 수 있는지의 여부를 조사하였다. LXRE reporter DNA를 murine melanoma(B-16 F10) 세포에 superfect를 이용하여 삽입함으로써, 형질전환을 유도하였고, 형질전환된지 24시간 후에 야교등 추출물을 처리하였다. 16시간이 경과된 후에, 세포를 수집하고, Luminometer (Berthold, Germany)를 이용하여 450㎚에서 luminescence를 측정하였다. (Planta medica 2005; 71:338-343) 양성대조군으로 LXR의 활성화제로 알려진 TO901317을 사용하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

시료	처리농도	Relative luciferase activity
무처리군		980±23.5
T0901317	20uM	4012±33.2
야교등 추출물	10㎍/㎖	2104±38.1
야교등 추출물	50㎍/㎖	2958±43.5
야교등 추출물	100㎍/㎖	3877±33.3

실험예 6: 멜라닌 생성에 관여하는 유전자의 발현에 미치는 야교등 추출물의 효과 측정

쥐의 색소세포(B16 melanoma cells)를 이용하여 멜라닌 생성에 관여하는 유전자들에 대한 야교등 추출물의 억제효과를 측정하였다.

본 실험은 murine melanoma(B-16 F10) 세포를 10%의 FBS(fetal bovine serum)가 함유된 DMEM 배지로 6-well plate에 well당 1×10⁵ 개로 접종한 후, 세포가 well 바닥에 약 80 % 이상 부착될 때까지 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 시료를 적당 농도로 희석된 배지에 처리하고, 5% CO₂, 37℃하에서 2일간 배양하였다. 야교등 추출물의 농도범위는 세포독성이 없는 100㎍/㎖로 결정하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 세척하고, 이것을 트립신으로 처리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 hematocytometer를 이용하여 세포수를 측정한 후 각 처리 그룹별 세포수를 동수로 맞추어 2㎖ 튜브에 나눠 담은 뒤 5,000 내지 10,000 rpm으로 10분간 원심 분리한 다음 상등액을 제거하여 pellet을 얻었다. 이 세포 pellet으로부터 TRIzol reagent(Carlsbad, CA, USA, Invitrogen)를 사용하여 total RNA를 분리하였고, random primers와 Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase(Carlsbad, CA, USA, Invitrogen)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. ABI7900HT machine(Applied Biosystems)을 사용하여 real-time PCR 분석을 수행하였고, 이 때 Taqman 분석을 사용하였다. 이를 활용하여 각 유전자의 Taqman probe를 사용하여, 유전자들의 발현을 real-time PCR assay로 측정하였다. Taqman probe로는 MITF, Tyrosinase, TRP1, TRP2, GAPDH를 사용하였고, PCR 조건은 50℃ 2분, 60℃ 30분, 95℃５분, PCR cycle: 45회. 비교 정량법은 기존 논문(Langman et al., 2003, J Lipid Res, 44, 968-977)을 참조하여 수행하였다.

실험 결과는 도 3에 나타내었다. 도 3에서 나타나는 바와 같이, 야교등 추출물에 멜라닌 생합성에 관여하는 유전자인 tyrosinase, MITF, TRP1, TRP2 등 유전자들의 발현을 모두 감소시킴을 확인하였다.

이상의 시험 결과에 따라, 야교등 추출물이 미백 개선에 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다.

이상, 본 발명에 관하여 상세히 설명하였으나, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자라면 이로부터 다양한 변화 및 수정이 가능함은 물론이나, 이 또한 본 발명의 영역 내이다.

Claims

야교등(Polygoni Multiflori Caulis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄 또는 핵산으로 추출하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 추출물은 총 조성물에 대하여 0.01 내지 90 중량%로 함유되는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 티로시나아제(tyrosinase) 활성 억제 및 멜라닌 생합성을 억제함으로써 피부 미백효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 티로시나제, TRP-1(tyrosinase related protein-1), TRP-2(tyrosinase related protein-2) 또는 MITF((microphthalmia-associated transcription factor)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상 유전자의 발현을 저해함으로써 피부 멜라닌 합성을 억제하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 LXR(Liver X Receptor) 프로모터 활성을 촉진시킴으로써 멜라닌 생합성을 억제하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물.