KR20160070393A

KR20160070393A - 항균 및 항산화 효과를 갖는 아로니아 발효 주정 추출물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20160070393A
Application number: KR1020140177261A
Authority: KR
Inventors: 김은중; 김주영; 김남형
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2014-12-10
Filing date: 2014-12-10
Publication date: 2016-06-20
Also published as: KR102323299B1

Abstract

본 발명은 항균 및 항산화 효과를 갖는 아로니아 발효물 또는 이의 주정 추출물로서, 더욱 자세하게는 아로니아 열매에 루코노스톡(Leuconostoc) 균주를 접종하여 발효시킨 발효물 또는 이의 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균 또는 항산화 활성을 갖는 조성물, 사료첨가제 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 아로니아 발효물 또는 이의 주정 추출물은 높은 항산화 활성과 더불어 리스테리아균, 살모넬라균 및 맨하이미아균과 같은 다양한 병원균에 대한 항균활성을 가짐에 따라, 의약품 소재, 사료/사료첨가제 소재 및 식품 소재와 같이 다양한 기능성 소재로서 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 아로니아 발효물 또는 이의 주정 추출물은 우수한 항균 활성 및 항산화 활성을 가짐에 따라 항생제를 대체할 수 있는 천연 사료첨가제로서 가축의 생산성 향상에 크게 도움을 줄 수 있다. 뿐만 아니라, 아로니아 열매를 이용한 사료첨가제 개발에 있어 루코노스톡 메센테로이드 KCCM35046 또는 루코노스톡 메센테로이드 KACC12315 균주들을 스타터 균주로 사용하여 아로니아를 발효한 후에 이의 주정 추출물을 이용할 경우 생리활성이 크게 향상되는 효과를 도출할 수 있다.

Description

항균 및 항산화 효과를 갖는 아로니아 발효 주정 추출물 및 이의 용도{Aronia melanocarpa fermented ethanol extracts having anti-oxidative and antimicrobial activity and use thereof}

본 발명은 항균 및 항산화 효과를 갖는 아로니아 발효물 또는 이의 주정 추출물로서, 더욱 자세하게는 아로니아 열매에 루코노스톡(Leuconostoc) 균주를 접종하여 발효시킨 발효물 또는 이의 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균 또는 항산화 활성을 갖는 조성물, 사료첨가제 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

우리나라 축산업에 있어 항생제는 가축의 생산성 및 성장촉진을 위해 사용되어 왔으며, 모넨신과 같은 ionophore계 항생제, 클로로포름 및 할로겐 화합물(halogenated analogues) 등이 대표적인 항생물질로 이용되었다(Odongo 등, 2007 Journal of Dairy Science. 90: 1781-1788; McAllister와 Newbold, 2008 Animal Production Science. 48: 7-13). ‘항생물질(항생제)’란 미생물에 의해 생성되는 가용성 유기물질로서 다른 미생물의 성장을 억제하거나 그 생명을 파괴하는 화학물질로서 병원균을 억제하기 위하여 의학 및 수의학적 목적으로 개발되었으나, 많은 연구자들에 의해 동물의 성장촉진 및 사료효율 개선효과도 인정되어 사료첨가제로서 사용되어왔다.

그러나 최근 질병의 복합발생 및 병원체의 내성증가에 따른 동물용의약품의 종류 및 사용량 증가문제와 동물에서의 항생제 오남용과 배합사료 첨가용 약제의 과다사용 문제점 대두 및 소비자의 축산물 안정성 확보 요구의 증가로 인해 항생제의 사용이 제한되는 실정이다. 따라서 이러한 항생제를 대체할 수 있는 물질의 개발은 친환경 축산에 있어 매우 중요한 과제이다.

가축은 생산성 향상을 위한 목적으로 상당히 농축된 고에너지 사료를 공급받는다. 따라서 많은 량의 영양소들을 대사시켜 축산물로 전환시키는 과정을 연속적으로 수행하게 된다. 이러한 과정 중에 많은 가축 체내에는 활성산소가 발생되어 세포 및 조직의 약화가 촉진되어 다양한 질병에 노출되게 된다. 이에 우수한 활성의 항산화물질은 가축 생산성 향상 뿐 만 아니라 가축의 건강 유지에도 매우 큰 도움이 된다.

식용 가능한 식물들에 함유된 페놀계 화합물들은 일반적으로 벤젠고리구조의 화합물을 함유하고 있다. 이러한 페놀계 화합물들은 다양하게 분류되는데, 이러한 분류는 벤젠고리와 같은 페놀고리의 개수 그리고 페놀고리에 연결된 분자들의 구조적 특성에 따라서 이루어진다(Manach 등 2004: American Journal of Clinical Nutrition, 79: 727747). 불과 얼마 전까지 이러한 페놀계 화합물들은 영양학적으로 바람직하지 않은 물질로 간주되었다. 그 이유는 페놀계 화합물이 가지고 있는 항영양소 기능에서 찾아볼 수 있다. 즉 페놀계 화합물들은 영양소 소화에 부정적인 효과를 미치며, 비타민과 무기물 흡수에 지장을 주는 것으로 알려져 왔다. 그러나 최근 페놀계 화합물들이 가진 우수한 항산화능력으로 인하여 그 가치에 대한 재평가가 이루어지고 있다(Rodriguez 등 2009: International Journal of Food Microbiology, 132: 7990). 항산화활성이란 체내 활성산소를 제거하는 과정을 말한다. 가축의 경우, 위에서 언급한 것과 같이 끊임없이 상당히 많은 양의 영양소를 분해하기 때문에 체내 활성산소의 축적을 피할 수 없게 된다. 수퍼옥사이드 라디칼, 하이드록시 라디칼 그리고 과산화수소 등이 체내에 축적되는 대표적인 활성산소의 종류들이다. 이들이 만약 체내에 소량으로 존재할 경우, 가축 성장에 있어 오히려 도움이 되는 것으로 알려져 있으나, 반대로 그 양이 많아질 경우에는 가축이 산화적 스트레스에 놓이게 된다(Atmani 등 2009: Food Chemistry, 112: 303309).

그리고 이러한 산화적 스트레스는 가축의 생산성 감소를 초래한다. 일예로서 활성산소는 비육우의 근육에서 matrix metalloproteinase-2 (MMP2)라고 하는 효소의 활성을 증가시키고, 증가된 효소활성은 근육내 콜라겐 합성을 저해하게 된다. 결국 산화적 스트레스는 근내 섬유아세포네 콜라겐 합성저하시켜 질긴 고기를 생산하도록 한다(Archile-Contreras 및 Purslow, 2011: Food Research International, 44: 582588). 따라서 식물에서 유래한 항산화활성이 우수한 페놀계 화합물의 개발은 유기 축산업의 발전과 축산물의 품질 향상에 있어 매우 중요하다.

페놀계 화합물은 항산화활성과 함께 항균활성을 나타낸다. 식용식물의 자연적인 발효에는 다양한 젖산균들이 관여하는 것으로 알려져 있다. 항균활성이 있는 페놀계 화합물을 다량 함유하고 있는 식용 식물의 자연발효에는 젖산균이 관여하는 것으로 알려져 있으며, 젖산균들은 그 성장을 위해서 항균활성이 있는 페놀계 화합물들의 구조를 변화시켜 항균활성을 감소시키게 된다. 이러한 페놀계 화합물의 구조변경에는 다양한 효소들이 관여하는 것으로 알려져 있으며, 대표적으로 베타글루코시다아제, 탄닌아제, 페놀산 디카르복실라아제 및 에스터라아제 등이 알려져 있다(Rodriguez, 등 2009: International Journal of Food Microbiology, 132: 7990). 따라서 식용 식물에 함유된 페놀계 화합물들을 그 생리활성이 향상되는 방향으로 구조를 변경하는 것은 위와 같은 효소의 처리 혹은 효소를 생산하는 젖산균을 이용한 발효를 통해서 얻을 있다.

한편, 아로니아(Aronia melanocarpa)는 블랙 초크베리로 알려져 있으며 페놀계 화합물을 다량 함유하고 있는 것으로 알려져 있다. 또한 아로니아 추출물의 건강에 대한 효과로는 심혈관계 질환 예방, 당뇨예방 및 간 보호기능 등이 보고된바 있다.

이에 본 발명자는 항생제를 대체할 수 있는 천연유래의 사료첨가제 소재를 발굴하고자 노력하였으며, 그 결과 아로니아 열매에 루코노스톡 균주를 접종하여 발효시킨 발효물의 경우 리스테리아균, 살모넬라균 및 맨하이미아균과 같은 다양한 병원균에 대한 항균활성과 더불어 높은 항산화 활성이 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국공개특허 제10-2011-0067308호 한국등록특허 제10-0889364호

따라서 본 발명의 목적은 우수한 항균 또는 항산화 활성을 바탕으로 의약품 소재, 사료/사료첨가제 소재 및 식품 소재와 같이 다양한 기능성 소재로 이용 가능한 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 우수한 항균 또는 항산화 활성을 통해 가축의 면역력을 증진시킬 수 있는 항생제 대체 가능한 사료첨가제 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 우수한 항균 또는 항산화 활성을 갖는 소재로서 아로니아 발효물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 우수한 항균 또는 항산화 활성을 갖는 소재로서 아로니아 발효 주정 추출물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 아로니아 발효물 또는 아로니아 발효 주정 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균용 또는 항산화용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 아로니아 발효물은 아로니아 열매에 루코노스톡(Leuconostoc) 균주를 접종하여 발효시킨 발효물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 아로니아 발효 주정 추출물은 아로니아 열매에 루코노스톡(Leuconostoc) 균주를 접종하여 발효시킨 발효물에 에탄올 가하여 추출한 추출물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 루코노스톡 균주는 루코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 루코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides)는 루코노스톡 메센테로이드 KCCM35046, 루코노스톡 메센테로이드 KCTC3100, 루코노스톡 메센테로이드 KACC12312, 루코노스톡 메센테로이드 KACC12313 및 루코노스톡 메센테로이드 KACC12315 균주로 이루어진 군으로부터 선택된 1종일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 리스테리아균, 살모넬라균 및 맨하이미아균으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 병원균에 대한 항균활성을 가질 수 있다.

또한, 본 발명은 아로니아 발효물 또는 아로니아 발효 주정 추출물을 유효성분으로 포함하는 가축 사료첨가제 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 가축은 소, 돼지, 닭, 오리, 염소, 양 및 말로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종의 가축일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 발효물 또는 추출물은 항균활성 및 항산화 활성을 통해 가축의 면역력을 증진시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항균활성은 리스테리아균, 살모넬라균 및 맨하이미아균으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 병원균에 대한 항균활성일 수 있다

또한, 본 발명은 (a) 아로니아 열매를 분쇄하는 단계; (b) 상기 분쇄된 아로니아 열매즙을 MRS 배지용액과 혼합하는 단계; 및 (c) 상기 혼합액에 루코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 균주를 접종한 후 발효시키는 단계를 포함하는 항균활성 및 항산화 활성을 갖는 아로니아 발효물 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (ⅰ) 아로니아 열매즙을 MRS 배지용액과 혼합하는 단계; (ⅱ) 상기 혼합액에 루코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 균주를 접종한 후 발효시키는 단계; 및 (ⅲ) 상기 발효물을 건조시킨 후 발효 건조물에 에탄올을 가하여 추출하는 단계를 포함하는, 항균활성 및 항산화 활성을 갖는 아로니아 발효 주정 추출물 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 아로니아 발효물 또는 이의 주정 추출물은 높은 항산화 활성과 더불어 리스테리아균, 살모넬라균 및 맨하이미아균과 같은 다양한 병원균에 대한 항균활성을 가짐에 따라, 의약품 소재, 사료/사료첨가제 소재 및 식품 소재와 같이 다양한 기능성 소재로서 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 아로니아 발효물 또는 이의 주정 추출물은 우수한 항균 활성 및 항산화 활성을 가짐에 따라 항생제를 대체할 수 있는 천연 사료첨가제로서 가축의 생산성 향상에 크게 도움을 줄 수 있다. 뿐만 아니라, 아로니아 열매를 이용한 사료첨가제 개발에 있어 루코노스톡 메센테로이드 KCCM35046 또는 루코노스톡 메센테로이드 KACC12315 균주들을 스타터 균주로 사용하여 아로니아를 발효한 후에 이의 주정 추출물을 이용할 경우 생리활성이 크게 향상되는 효과를 도출할 수 있다.

도 1은 루코노스톡 메센테로이드 균주(KCCM35046, KCTC3100, KACC12312, KACC12313, KACC12315)를 이용하여 발효시킨 각 시험구별(대조군[무처리구]: CON, 처리구 1[KCCM35046 균주 접종 발효]: Tr1, 처리구 2[KCTC3100 균주 접종 발효]: Tr2, 처리구 3[KACC12312 균주 접종 발효]: Tr3, 처리구 4[KACC12313 균주 접종 발효]: Tr4, 처리구 5[KACC12315 균주 접종 발효]: Tr5, 아로니아 발효액의 베타글루코시다아제 효소활성을 흡광도 평가법을 활용하여 측정한 결과이다.
도 2는 루코노스톡 메센테로이드 균주를 이용하여 발효시킨 각 시험구별 아로니아 발효액에 포함된 젖산균의 농도를 측정한 결과이다.
도 3은 루코노스톡 메센테로이드 균주를 이용하여 발효시킨 각 시험구별 아로니아 발효 주정 추출물에 포함된 총 폴리페놀 농도를 측정한 결과이다.
도 4는 루코노스톡 메센테로이드 균주를 이용하여 발효시킨 각 시험구별 아로니아 발효 주정 추출물의 항산화활성을 측정한 결과이다.
도 5는 루코노스톡 메센테로이드 균주를 이용하여 발효시킨 각 시험구별 아로니아 발효 주정 추출물에 포함된 물질들을 박층크로마토그라피를 이용하여 분리한 결과이다. 플래이트 A, B, C는 DPPH를 이용하여 항산화관련 물질의 평가한 결과이며, 플래이트 D, E, F는 자외선 조사를 통한 물질 검출 결과이다. 레인 1: 균주 접종 없이 자연발효를 유도한 아로니아 발효액의 주정 추출물(대조군), 레인 2: 루코노스톡 메센테로이드 KCCM35046 균주로 발효시킨 아로니아 발효액의 주정 추출물, 레인 3: 루코노스톡 메센테로이드 KCTC3100 균주로 발효시킨 아로니아 발효액의 주정 추출물, 레인 4: 루코노스톡 메센테로이드 KACC12312 균주로 발효시킨 아로니아 발효액의 주정 추출물, 레인 5: 루코노스톡 메센테로이드 KACC12313 균주로 발효시킨 아로니아 발효액의 주정 추출물, 레인 6: 루코노스톡 메센테로이드 KACC12315 균주로 발효시킨 아로니아 발효액의 주정 추출물.
도 6은 루코노스톡 메센테로이드 균주를 이용하여 발효시킨 아로니아 주정 추출물에 포함된 총 폴리페놀 물질 변화를 고속액체크로마토그래피를 이용하여 크로마토 그램상 각 물질들의 면적비율을 산출한 결과이다.
도 7은 루코노스톡 메센테로이드 균주를 이용하여 발효시킨 각 시험구별 아로니아 발효 주정 추출물에 포함된 카페익산(caffeic acid), 클로로제닉산(chlorogenic acid) 및 페룰릭산(trans-ferulic acids)의 함량을 나타낸 것이다(A: caffeic acid, B: chlorogenic acid, C: trans-ferulic acid).

하나의 양태로서, 본 발명은 아로니아 발효물 또는 아로니아 발효 주정 추출물의 항균/항산화 용도에 관한 것이다.

본 발명에서 ‘아로니아(aronia)’란 아로니아 나무의 열매를 의미하며, 초크베리(choke-berry)라고도 불린다.

이러한 아로니아는 많은 안토시아닌 색소를 포함하고 있어 노화를 방지할 뿐만 아니라 항암효과도 상당히 좋은 것으로 알려져 있다. 또 시력의 개선효과, 심장 및 혈관질환, 뇌졸증 등 혈액과 관련한 질병의 치료에 상당한 도움이 되는 것으로 알려져 있다.

이에 본 발명자는 다양한 기능성을 갖는 천연소재를 연구하던 중, 아로니아 열매에 초점을 맞추어 실험을 진행하였으며, 그 결과 아로니아에 루코노스톡(Leuconostoc) 균주를 접종하여 발효시킨 발효물이 높은 항산화 활성과 더불어 리스테리아균, 살모넬라균 및 맨하이미아균과 같은 다양한 병원균에 대한 항균활성을 가짐에 따라, 의약품 소재, 사료/사료첨가제 소재 및 식품 소재와 같이 다양한 기능성 소재로 사용할 수 있는 가능성을 입증하였다.

본 발명에서는 아로니아 열매에 루코노스톡(Leuconostoc) 균주를 접종하여 발효시킨 발효물을 간략하게 ‘아로니아 발효물’로 명명하며, 아로니아 발효물은 아로니아 발효액과 동일한 의미이다.

본 발명의 아로니아 발효물은 본 기술 분야에서 적용되는 일반적인 방법으로 제조할 수 있으나, 바람직하게는 아로니아 열매를 분쇄하여 얻은 열매즙에 MSR 배지용액을 혼합한 다음 루코노스톡(Leuconostoc) 균주를 스타터로 사용하여 접종한 후 발효시키는 과정을 통해 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 아로니아 발효물은 상기 과정 이외에, 발효물을 건조시킨 후 건조된 발효물에 에탄올 추출용매를 가하여 추출하는 과정을 추가적으로 진행할 수 있다.

본 발명에서는 이러한 추가 과정을 통해 제조된 물질을 간략하게 ‘아로니아 발효 주정 추출물’이라 명명한다.

따라서 본 발명은 아로니아 발효물 또는 아로니아 발효 주정 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균용 또는 항산화용 조성물을 그 특징으로 한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 루코노스톡(Leuconostoc) 균주는 루코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides)일 수 있으며, 바람직하게는 루코노스톡 메센테로이드 KCCM35046, 루코노스톡 메센테로이드 KCTC3100, 루코노스톡 메센테로이드 KACC12312, 루코노스톡 메센테로이드 KACC12313 및 루코노스톡 메센테로이드 KACC12315 균주로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 아로니아 발효물 또는 아로니아 발효 주정 추출물을 유효성분으로 포함하는 가축 사료첨가제 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 ‘사료첨가제’란 영양적 또는 특정 목적을 위하여 사료에 미량으로 첨가되는 물질의 의미하며, 상기 특정 목적이란 가축의 면역증진, 성장촉진, 세균 또는 바이러스로부터 방어, 질병개선, 스트레스 완화와 같은 기능성 부여를 의미한다.

본 발명의 사료첨가제 조성물의 급여 대상이 되는 가축의 종류는 소, 돼지, 닭, 오리, 염소, 양 및 말로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종의 가축을 예시할 수 있으나, 특별히 그 종류를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 사료첨가제 조성물은 유효성분으로 아로니아 발효물 또는 아로니아 발효 주정 추출물을 포함함에 따라 항균활성(리스테리아균, 살모넬라균 및 맨하이미아균으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 병원균에 대한 항균활성) 및 항산화 활성을 통해 가축의 면역력을 증진시키는 기능성을 부여할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 아로니아 열매를 분쇄하는 단계; (b) 상기 분쇄된 아로니아 열매즙을 MRS 배지용액과 혼합하는 단계; 및 (c) 상기 혼합액에 루코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 균주를 접종한 후 발효시키는 단계를 포함하는 항균활성 및 항산화 활성을 갖는 아로니아 발효물 제조방법에 관한 것이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 (ⅰ) 아로니아 열매즙을 MRS 배지용액과 혼합하는 단계; (ⅱ) 상기 혼합액에 루코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 균주를 접종한 후 발효시키는 단계; 및 (ⅲ) 상기 발효물을 건조시킨 후 발효 건조물에 에탄올을 가하여 추출하는 단계를 포함하는, 항균활성 및 항산화 활성을 갖는 아로니아 발효 주정 추출물 제조방법에 관한 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

아로니아 발효 및 주정 추출물 제조

<1-1> 재료 준비

실험에 사용된 아로니아 열매는 경상북도 상주시 농협에서 구매하였다. 실험에 사용된 루코노스톡 메센테로이드 균주들은 한국미생물보존센터(KCCM), 미생물자원센터(KCTC) 그리고 농업유전자원정보센터(KACC)에서 분양받아 사용하였다(아래 표 1 참조). 한편, 항균활성평가를 위한 병원균들로는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus(wild type)), 리스테리아균(Listeria monocytogenes , KACC0550), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum , ATCC9184) 그리고 맨하이미아 해모리티카(Mannheimia haemolytica (wild type)) 균주를 사용하였다.

아로니아 발효에 사용된 루코노스톡 메센테로이드 균주

순번	루코노스톡 메센테로이드 균주 종류
1	Leuconstoc mesenteroides KCCM35046 균주
2	Leuconstoc mesenteroides KCTC3100 균주
3	Leuconstoc mesenteroides KACC12312 균주
4	Leuconstoc mesenteroides KACC12313 균주
5	Leuconstoc mesenteroides KACC12315 균주

<1-2> 아로니아 발효액 제조

먼저, 분쇄기로 마쇄된 아로니아 열매와 MRS 배지를 혼합하여 발효액을 제조하였다. 자세하게는, 아로니아 열매는 칼날분쇄기를 이용하여 분쇄하였고, 분쇄된 열매즙 10 g을 멸균된 50% MRS 배지용액 90 mL와 혼합하여 아로니아 발효액을 준비하였다. 접종을 위한 젖산균 배양액은 MRS 배지를 이용하여 30℃에서 150 rpm의 속도로 교반하며 준비하였다. 상기 표 1에서 나타낸 각각의 루코노스톡 메센테로이드 균주를 스타터 접종균으로 하여 최종적으로 아로니아 발효액에 10%의 비율(v/v)로 접종하였고, 30℃에서 80 rpm의 속도로 48시간동안 발효를 진행하였다.

이때, 총 6개의 시험구를 설정하였다. 대조구는 아무런 균주도 접종하지 않은 시험구로서 아로니아 발효액의 자연적인 발효를 유도하였다. 처리구들은 사용한 루코노스톡 메센테로이드 균주들에 따라서 처리구 1은 KCCM35046 균주, 처리구 2은 KCTC3100 균주, 처리구 3은 KACC12312 균주, 처리구 4은 KACC12313 균주 그리고 처리구 5는 KACC12315 균주를 사용하여 발효시킨 시험구로 설정하였다.

시험구 설정

종류	조건	약어
대조군	무처리구	CON
처리구 1	KCCM35046 균주 발효	Tr1
처리구 2	KCTC3100 균주 발효	Tr2
처리구 3	KACC12312 균주 발효	Tr3
처리구 4	KACC12313 균주 발효	Tr4
처리구 5	KACC12315 균주 발효	Tr5

<1-3> 아로니아 발효액의 주정 추출물 제조

발효가 완료된 후에 각 시험구별 발효액에서 1 mL의 시료를 채취하여 생균수측정과 유기산 측정에 사용하였다. 그리고 남은 발효액은 전량 유리 비이커에 옮긴 후 60℃에서 하루 동안 건조하였다. 건조가 완료된 후에는 막자사발을 이용하여 건조된 발효액을 분쇄하였고, 다시 10배의 부피에 해당하는 에탄올을 가하여 80 rpm의 속도로 하루 동안 추출하였다. 추출이 완료된 후, 남은 고형물들은 여과지(whatman no 1)를 이용하여 분리하였고, 남은 여과액은 진공감압농축기로 농축하였다. 최종적으로 농축된 시료들을 하기 실험 분석에 사용하였다.

< 실시예 2>

아로니아 발효 주정 추출물의 생리활성 분석 및 발효용 균주 개발

<2-1> 베타글루코시다아제 효소활성 측정

본 실험에서는 상기 실시예<1-2>를 통해 제조된 각 시험구별 아로니아 발효 액의 베타글루코시다아제 효소활성을 흡광도 평가법을 활용하여 측정하였다. 각 종균배양액을 효소액으로, 그리고 PNPG (p-nitrophenyl-β-D-glucoside) 용액을 기질용액으로 하여 효소활성을 평가하였다. 효소활성 측정방법은 Kim 등 (2007: Journal of Microbiology and Biotechnology. 17: 905912)의 방법에 따라서 수행하였다. 효소활성을 나타내는 unit (U)는 배양액의 탁도 1에 해당하는 효소가 1분 동안 기질을 분해하여 생성된 p-nitrophenyl 1 mM을 나타내도록 정의하였다. 기질에서 유리된 p-nitrophenyl의 농도는 600 nm에서 흡광도를 측정하여 평가하였다. 참고로, 식물에 함유된 페놀계 화합물의 변화는 다양한 미생물 혹은 그들이 분비한 효소들에 의하여 일어나며, 이러한 효소들에는 디카르복실라아제(decarboxylase), 탄닌아제(tannase), 리덕테이즈(reductase), 벤질 알코올 디하이드로게나아제(benzyl alcohol dehydrogenase) 및 베타글루코시다아제(β-glycosidase) 등이 있는 것으로 알려져 있다.

그 결과 하기 도 1에서 나타낸 바와 같이, 처리구 4(L. mesenteroide KACC12313)와 처리구 5(L. mesenteroide KACC12315)에서 베타글루코시다아제 효소활성이 유의하게 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

<2-2> 유기산분석

본 실험에서는 상기 실시예<1-2>를 통해 제조된 각 시험구별 아로니아 발효 액내 유기산 함량을 DAD 검출기와 자동시료주입기가 장착된 HPLC (Agilent 1100 series, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. 젖산, 초산, 프로피온산 그리고 낙산 등의 유기산들은 유기산분석용 컬럼(Rezex TM ROA-Organic Acid H+)으로 분리하였고, 정량하였다. 분석조건으로 이동상은 0.005 N의 황산용액을 사용하였고, 이동상은 분당 0.6 mL의 속도로 흘려보내 주었다. 유기산의 검출은 220 nm에서 수행하였다.

아로니아 열매 발효과정에서 생성된 유기산들의 조성은 하기 표 3에서 자세히 나타내었다.

본 시험에서는 젖산, 초산, 프로피온산 그리고 낙산을 조사하였고, 분석결과에는 오직 젖산과 초산만이 검출되었다. 유의적으로 높은 젖산의 생산은 대조구와 처리구 1(L. mesenteroide KCCM35046)에서 나타났다. 반대로 처리구 2(L. mesenteroide KCTC3100)에서는 유의적으로 가장 낮은 젖산 생산을 나타내었다. 하지만 초산 생산량은 처리구 2에서 유의적으로 높게 나타났다. 비록 동일한 속의 젖산균을 사용하였다고 하여도, 본 결과에서 보는 것과 같이, 젖산균의 대사산물인 유기산 생성량을 매우 다르게 나타났다. 즉 동일한 속의 젖산균일지라도 대사특성은 서로 다를 수 있다. 따라서 사용목적에 따라서 가장 적합한 특징을 지닌 젖산균의 선발은 큰 의미를 가지며, 중요하다고 볼 수 있다. 또한 하나의 젖산균을 젖산균이라는 이유만으로 다양한 응용분야에 적용하는 것은 바람직한 일이 아닐 것이다. 덧붙여서 젖산은 식물 발효에 있어 발효 안정화에 관여하는 유기산으로 알려져 있으며, 초산은 젖산에 비하여 항균활성이 우수하여 발효 후 저장성 확보에 도움이 되는 유기산으로 알려져 있다(Keles, G., & Demirci, 2011: Animal Feed Science and Technology. 164:21-28). 따라서 각 젖산균이 동일한 기질을 이용하여 생산하는 유기산 정보는 사용목적에 맞는 균주 선발에 있어 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

각 시험구별 아로니아 발효액 내 유기산 생성량 분석 결과

유기산조성	시험구¹						SEM	P-value
대조구	Tr 1	Tr 2	Tr 3	Tr 4	Tr 5		SEM	P-value
젖산, mg/mL	27.45^c	28.06^c	21.39^a	22.76^b	27.39^c	23.44^b	0.64	<0.001
초산, mg/mL	4.38^b	4.13^a	5.14^d	5.20^d	5.24^d	4.93^c	0.11	<0.001
젖산/초산 비율	6.27^e	6.80^f	4.17^a	4.38^b	5.22^d	4.76^c	0.24	<0.001
¹Treatment: CON, control (non-inoculated Aronia); Tr 1, fermented by L. mesenteroides KCCM 35046; Tr 2, fermented by L. mesenteroides KCTC3100; Tr 3, fermented by L. mesenteroides KACC12312; Tr 4, fermented by L. mesenteroides KACC12313; Tr 5, fermented by L. mesenteroides KACC12315. ^abcdefDifferent superscripts in same row mean significantly different (P<0.05).

<2-3> 균체성장 측정

본 실험에서는 상기 실시예<1-2>를 통해 제조된 각 시험구별 아로니아 발효 액내 젖산균들의 농도를 생균수 측정 방법으로 평가하였다. 발효액은 발효가 종료된 후에 멸균된 0.8% 소금용액을 이용하여 연속적으로 희석하였고, 각 희석액을 MRS 평판배지에 도말하였다. 희석액이 도말된 MRS 평판배지를 30℃ 배양기에서 24시간동안 배양하였고, 형성된 콜로니의 수를 개수하여 균체농도를 평가하였다.

그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, 모든 시험구에서 10⁸ CFU/mL 이상의 균체성장을 나타내었다. 유의적으로 높은 균체성장은 처리구 2(L. mesenteroide KCTC3100)에서 나타났다. 흥미롭게도 대조구(아무런 균주도 접종하지 않은 시험구)에서도 높은 균체 성장을 나타내었다. 본문 앞에 서술된 시험방법에 관한 내용에서 언급한 것과 같이, 본 시험에서는 분쇄된 아로니아 열매에 대한 멸균처리를 하지 않았다. 즉 아로니아 열매에 존재하는 젖산균들의 성장을 인위적으로 배제하지 않았다. 따라서 아로니아 열매에 존재하는 젖산균의 자연적인 성장이 유도된 결과로 판단된다.

<2-4> 항균활성 측정

본 실험에서는 상기 실시예<1-3>을 통해 제조된 각 시험구별 아로니아 발효 주정 추출물에 대한 항균활성을 생육저지환 평가방법으로 측정하였다. LB 평판배지에 준비된 병원균을 도말하였다. 이 후 아로니아 발효 추출물을 지름 6 mm의 페이퍼디스크(paper disk)에 50μl씩 주입하였다. 상기 실시예<1-3>을 통해 제조된 각 시험구별 아로니아 발효 주정 추출물이 주입된 페이퍼디스크(paper disk)를 병원균이 도말된 평판배지에 올려놓은 후에 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 평판배지에 형성된 생육저지 투명대의 지름을 측정하였다.

자세한 결과는 하기 표 4에서 나타내었다.

각 시험구별 아로니아 발효 주정 추출액의 항균활성 분석

병원균	시험구¹
병원균	CON	Tr 1	Tr 2	Tr 3	Tr 4	Tr 5
황색포도상구균 (Staphylococcus aureus)	ND	ND	ND	ND	ND	ND
리스테리아균 (Listeria monocytogenes)	ND	10	10	ND	11	12
맨하이미아 해모리티카 (Mannheimia haemolytica)	15	14	ND	ND	ND	ND
살모넬라 갈리나룸 (Salmonella gallinarum)	ND	ND	ND	ND	ND	ND
¹Treatment: CON, control (non-inoculated Aronia); Tr 1, fermented by L. mesenteroides KCCM 35046; Tr 2, fermented by L. mesenteroides KCTC3100; Tr 3, fermented by L. mesenteroides KACC12312; Tr 4, fermented by L. mesenteroides KACC12313; Tr 5, fermented by L. mesenteroides KACC12315.

상기 실시예<1-3>을 통해 제조된 각 시험구별 아로니아 발효 주정 추출물들의 항균활성은 상기 표 4에서 나타내내 바와 같이, 포도상 구균에 대한 항균활성은 모든 시험구에서 관찰되지 않았다. 반면 리스테리아균 및 맨하이미아균의 경우 항균활성이 관찰되었다. 리스테리아균에 대한 항균활성은 대조구에서는 관찰되지 않았으나, 처리구 1(L. mesenteroides KCCM35046), 처리구 2(L. mesenteroides KCTC3100), 처리구 4(L. mesenteroides KACC12312) 그리고 처리구 5(L. mesenteroides KACC12315)에서 관찰되었다. 맨하이미아 해모리티카(Mannheimia haemolytica)의 경우 대조구와 처리구 1에서만 항균활성이 관찰되었다. 이상의 결과를 통하여 발효를 통하여 항균활성 및 항균활성 스팩트럼이 변화한 것을 확인할 수 있었다.

<2-5> 총 폴리페놀함량 분석 및 항산화활성 측정

본 실험에서는 상기 실시예<1-3>을 통해 제조된 각 시험구별 아로니아 발효 주정 추출물에 함유된 총 폴리페놀 함량을 Juan과 Chou (2010: Food Microbiology, 27: 586591)의 방법에 따라서 평가하였고, 이때 표준물질로는 갈산(gallic acid)을 사용하였다. 항산화활성은 DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 시약을 자유기로 하고 발효액에 의하여 소거되는 자유기 농도를 평가하여 항산화활성을 측정하였다. 항산화활성 평가는 Brand-Williams 등 (1995: Food Science and Technology, 28: 2530)의 방법에 따라서 수행하였으며, 항산화활성 평가에 사용된 수식은 다음과 같다.

자유 라디칼 소거 활성(Free radical scavenging activity), % = (Black OD525 - Sample OD525)/Blank OD525×100

항산화활성 관련 물질의 변화는 박층크로마토그라피와 DPPH 염색방법으로 평가하였으며, 시험방법은 Masoko와 Eloff (2007: African Journal of Traditional, Complementary and Alternative Medicine, 4: 231239)의 방법에 따라서 수행하였다. 상세하게는 총 3가지의 이동상 조건을 사용하였다. 각 이동상 용매조성은 EMW (polar/neutral), ethyl acetate/methanol/water = 40/5.4/5 (80 mL/10.8 mL/10 mL); CEF (intermediate polarity/acidic), chloroform/ethyl acetate/formic acid = 5/4/1; BEA (non-polar/basic): benzene/ethanol = 90/10/1 이었다. 각 이동상 조건으로 분리된 발효 추출물(상기 실시예<1-3>을 통해 제조된 각 시험구별 아로니아 발효 주정 추출물)의 물질점들은 0.2% DPPH용액으로 염색하여 나타내었다.

그 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, 유의적으로 높은 폴리페놀 생산은 처리구 1(L. mesenteroide KCCM35046)과 처리구 5(L. mesenteroide KACC12315)에서 나타났다. 아로니아 열매에 함유된 폴리페놀함량은 약 7mg/L로 알려져 있다(Kim 등. 2013: Nitric Oxide, 35: 5464; Malinowska 등., 2012: Nutrition, 28: 793798). 본 실험에서는 발효액에 약 10%를 아로니아 열매 분쇄액을 사용하였고, 분석결과 0.6 mg/L 수준의 폴리페놀이 나타났다. 따라서 기존에 보고된 연구들의 내용과 일치하는 결과를 얻을 수 있었다.

한편, 각 시험구들의 항산화활성 결과는 도면 4에서 보는 것과 같다. 가장 우수한 항산화활성은 처리구 5(L. mesenteroide KACC12315)에서 나타났다. 흥미롭게도 처리구 4(L. mesenteroide KACC12313)의 경우, 총 폴리페놀 함량은 낮게 나타났으나, 항산화활성을 매우 우수하게 나타났음을 볼 수 있었다. 또한 몇몇 처리구에서는 대조구에 비하여 총 폴리페놀 함량과 항산화활성이 크게 개선되었음을 알 수 있었다. 이러한 결과를 통하여 시험에 사용한 젖산균에 의하여 아로니아에 포함된 유용물질들의 변화가 일어난 것을 알 수 있었다. 그러나 두드러진 물질변화는 DPPH로 염색된 박층크로마토그라피 결과에서 찾아볼 수는 없었다(도 5A~5C 참조). 그러나 자외선으로 확인된 물질들은 대조구에 비하여 다른 결과를 보여주었다. EMW 이동상으로 분리된 물질의 경우 Rf 0.4, 0.5 및 0.8에서 새로운 물질로 보여지는 결과가 나타났다(도 5D 참조). 이러한 새로운 물질로 여겨지는 결과는 CEF 이동상 조건에서도 관찰되었으며, 그 결과는 Rf 0.25에서 찾아 볼 수 있었다(도 5E 참조).

<2-6> 페놀계 화합물 프로파일링

본 실험에서는 상기 실시예<1-3>을 통해 제조된 각 시험구별 아로니아 발효 주정 추출물에 총 폴리페놀 물질 변화를 고속액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 이용하여 크로마토 그램상 각 물질들의 면적비율을 산출하여 발효에 의한 변화를 조사하였다. 분석은 Ghasemzadeh와 Jaafar (2013: BMC Complementary and Alternative Medicine, 13: 341350)이 보고한 방법에 따라서 수행하였다. 상세하게는 두 가지의 서로 다른 이동상을 이용하였다. 이동상(A)는 0.2% 초산용액을 사용하였고 이동상(B)는 0.5% 초산용액과 acetonitrile을 1:1의 비율로 혼합한 용액을 사용하였다. 분석조건으로 각 이동상들은 분석시간에 따라서 서로 다른 비율로 혼합하여 사용하였으며, 혼합조건은 다음과 같다. 0분 95(A): 5(B), 10분까지는 90:10, 40분까지는 60:40, 55분까지는 45:55 그리고 65분까지는 0:100으로 하였다.

그 결과는 도 7에서 나타낸 바와 같이, 카페익산(caffeic acid), 클로로제닉산(chlorogenic acid) 그리고 페룰릭산(trans-ferulic acids) 등에 대한 정량분석을 수행한 결과 처리구 1(L. mesenteroide KCCM35046)에서 유의적으로 높은 카페익산 함량을 나타내었다. 클로로네닉산의 경우 처리구 1(L. mesenteroide KCCM35046)과 처리구 5(L. mesenteroide KACC12315)에서 유의적으로 높게 나타났다. 마지막으로 페룰릭산의 경우, 처리구 5(L. mesenteroide KACC12315)에서 유의적으로 높게 나타났다.

<2-7> 상대적 성능지수 분석

상기 실시예<1-3>을 통해 제조된 각 시험구별 아로니아 발효 주정 추출물의 생리활성으로 항균활성, 항산화활성, 총 폴리페놀함량 등 다양한 활성을 분석하였다. 따라서 서로 다른 활성들을 종합적으로 계산하여 통합적인 결론을 도출할 필요가 있다. 이에 본 실험에서는 표준화방법을 적용하여 상대적 성능지수를 계산하였고, 최종적으로 아로니아의 생리활성을 향상시킬 수 있는 가장 우수한 균주를 선발하였다. 상대적 성능지수 계산은 다음과 같은 수식을 이용하여 산출하였다.

RPI (상대적 성능지수) = (A μ)/ σ + 3 (N ∼ 3,1)

위 수식에서 A는 관측된 처리구의 활성이며, μ는 해당 활성의 평균값 그리고 σ 는 해당 활성에 대한 표준편차이다. 상수값 3은 음수가 발생하는 것을 방지하기 위하여 표준정규분포를 양의 정수 3만큼 이동시키는데 사용된 상수 값이다.

그 결과 하기 표 5에서 나타낸 바와 같이, 처리구 1(L. mesenteroides KCCM35046)과 처리구 5(L. mesenteroides KACC12315)에서 유의적으로 높은 상대적 성능지수를 나타내었다.

각 시험구별 아로니아 발효 주정 추출액의 생리활성에 대한 상대적 성능지수 합계 결과

	시험구¹					SEM	P value
	Tr 1	Tr 2	Tr 3	Tr 4	Tr 5	SEM	P value
RPI²	10.48^c	8.60^b	7.09^a	7.36^a	11.11^c	0.46	<0.001
¹Treatment: Tr 1, fermented by L. mesenteroides KCCM 35046; Tr 2, fermented by L. mesenteroides KCTC3100; Tr 3, fermented by L. mesenteroides KACC12312; Tr 4, fermented by L. mesenteroides KACC12313; Tr 5, fermented by L. mesenteroides KACC12315 ²RPI: relative performance index was calculated with standardized values of antioxidant activity, antibacterial activity and total polyphenol content from each treatment. ^abcDifferent superscripts in same row mean significantly different (P<0.05).

<2-8> 통계분석

처리의 효과를 분석하기 위하여 모든 관측치들은 일반선형모형에 따라서 분산분석을 수행하여 가설검정을 수행하였고, 가설검정은 유의수준 95%에서 수행하였다. 처리간 유의성 검정은 Duncan's 다중비교분석 방법을 수행하였으며, 유의수준 95%에서 처리간 유의성을 검정하였다. 모든 통계분석은 SPSS 프로그램(version 18, IBM, USA)을 이용하여 수행하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

아로니아 발효물 또는 아로니아 발효 주정 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균용 또는 항산화용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 아로니아 발효물은 아로니아 열매에 루코노스톡(Leuconostoc) 균주를 접종하여 발효시킨 발효물인 것을 특징으로 하는 항균용 또는 항산화용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 아로니아 발효 주정 추출물은 아로니아 열매에 루코노스톡(Leuconostoc) 균주를 접종하여 발효시킨 발효물에 에탄올 가하여 추출한 추출물인 것을 특징으로 하는 항균용 또는 항산화용 조성물.
제2항 또는 제3항에 있어서,
상기 루코노스톡(Leuconostoc) 균주는 루코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides)인 것을 특징으로 하는 항균용 또는 항산화용 조성물.
제4항에 있어서,
상기 루코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides)는 루코노스톡 메센테로이드 KCCM35046, 루코노스톡 메센테로이드 KCTC3100, 루코노스톡 메센테로이드 KACC12312, 루코노스톡 메센테로이드 KACC12313 및 루코노스톡 메센테로이드 KACC12315 균주로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 항균용 또는 항산화용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 리스테리아균, 살모넬라균 및 맨하이미아균으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 병원균에 대한 항균활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항균용 또는 항산화용 조성물.
아로니아 발효물 또는 아로니아 발효 주정 추출물을 유효성분으로 포함하는 가축 사료첨가제 조성물.
제7항에 있어서,
상기 가축은 소, 돼지, 닭, 오리, 염소, 양 및 말로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종의 가축인 것을 특징으로 하는 가축 사료첨가제 조성물.
제7항에 있어서,
상기 발효물 또는 추출물은 항균활성 및 항산화 활성을 통해 가축의 면역력을 증진시키는 것을 특징으로 하는 가축 사료첨가제 조성물.
제9항에 있어서,
상기 항균활성은 리스테리아균, 살모넬라균 및 맨하이미아균으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 병원균에 대한 항균활성인 것을 특징으로 하는 가축 사료첨가제 조성물.
(a) 아로니아 열매를 분쇄하는 단계;
(b) 상기 분쇄된 아로니아 열매즙을 MRS 배지용액과 혼합하는 단계; 및
(c) 상기 혼합액에 루코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 균주를 접종한 후 발효시키는 단계를 포함하는, 항균활성 및 항산화 활성을 갖는 아로니아 발효물 제조방법.
(ⅰ) 아로니아 열매즙을 MRS 배지용액과 혼합하는 단계;
(ⅱ) 상기 혼합액에 루코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 균주를 접종한 후 발효시키는 단계; 및
(ⅲ) 상기 발효물을 건조시킨 후 발효 건조물에 에탄올을 가하여 추출하는 단계를 포함하는, 항균활성 및 항산화 활성을 갖는 아로니아 발효 주정 추출물 제조방법.