KR100889364B1 - 항생제 대체용 사료조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고구밸리, 골든밸리 및 이들로부터 추출된 감자단백을 유효성분으로 함유하는 항생제 대체용 사료조성물을 제공한다.

본 발명의 사료조성물을 가축에 급식시키는 경우 분과 장내 미생물수치를 감소시켜 영양소 소화율을 개선하며 사양성적을 향상시켜 통상의 화학적 항생제를 대체할 수 있다. 또한 통상의 항균제의 투여를 통해 기대할 수 없는 가축의 증체량, 사료섭취량 및 사료효율의 향상을 도모할 수 있다.

고구밸리, 골든밸리, 사료조성물, 감자단백, 정제감자단백

Description

항생제 대체용 사료조성물{FEED COMPOSITION REPLACEMENT FOR ANTIBIOTICS}

본 발명은 항생제 대체용 사료조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항균효과가 우수하며 성장촉진효과가 있어 항생제를 대체할 수 있는, 골든밸리 또는 고구밸리 감자에서 추출된 감자단백 또는 정제감자단백을 함유한 사료조성물을 제공하는 것이다.

경제발전에 따른 국민 식생활의 서구화 경향으로 인하여 국민들의 축산물 섭취가 증가하고, 이에 따른 동물성 지방의 섭취로 인한 축산식품에 대한 부정적인 견해가 제기되고 있다. 이러한 동물성 지방의 섭취는 순환기계 질병 중 하나인 동맥경화의 발병에 영향을 미치는 요인들로서 지적되고 있으며, 특히 콜레스테롤이 동맥경화의 주요 원인 중 하나로 지목되고 있다. 최근 국민들의 건강에 대한 관심이 높아짐에 따라 비만과 동맥경화 등의 성인병을 예방하고 보다 건강한 생활을 유지하는 목적으로 여러 가지 건강식품들이 개발되어 상용적으로 시판되고 있다. 이러한 추세에 발맞추어 축산농가에서는 사료에 한약재나 항균제 등 다양한 첨가물을 투입하여 건강식 육제품을 생산하기도 한다.

그러나, 사료에 투입된 항생제는 2∼3 달이 지나야 완전히 소화 배출되는데, 이러한 휴약기간 전에 출하 식용될 경우 가축내 잔여 항생제로 인하여 그 육제품을 섭취한 인체의 면역력을 저하시키는 문제점이 있었다. 또한, 항생제에 대한 내성을 갖는 세균에서 내성을 함유한 유전물질인 플라스미드의 접합이라는 전달에 의해 다른 세균으로 전이될 수 있으며, 이는 살모넬라균 등의 발생을 유발하는등 보건 위생에 매우 치명적인 문제로 작용하게 된다. 그 결과 이러한 항생제 내성 세균의 증가는 인체에 전이될 수 있는 위험성이 상존한다.

이러한 이유들로 인하여, 최근에는 육제품 내의 항생제 잔류와 함께 이러한 항생제 내성균에 대한 문제가 제기되면서, 항생제 대체 물질에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 항생제 대체물질로서 가축의 체내 면역기능을 활성화시키는 물질에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

보다 구체적으로, 생균제(Probiotics), 산제(Acidifiers), 효소제(Enzymes), 광물질 첨가제(Mineral supplements) 그리고 올리고당(Oligosaccharides) 등이 대표적이다. 최근에는 동물(Zasloff, 1987; Skerlavaj 등, 1999; Henzler 등, 2003;)과 식물(Taniguchi와 Kubo, 1993; Broekaert 등, 1995;)에서 추출된 천연 항균펩타이드(Antimicrobial peptides, AMPs)가 발견되면서 많은 주목을 받고 있다. 항균펩타이드는 저분자단백질로서 선천적인 면역방어시스템에 작용하고 모든 생명체에서 발견되어지고 있다(Boman과 Hultmark, 1987; Boman 등, 1991; Hoffmann, 1995). 또한 항균펩타이드는 광범위한 항균효과를 나타내어 박테리아(Gazit 등, 1994; Saberwal과 Nagaraj, 1994; Steiner 등, 1998), 바이러스 그리고 진균(Quang 등, 1992; Lee 등, 1995; De Lucca와 Walsh, 1999; Lee 등, 1999;)의 성장을 억제시키고 면역능력을 개선함으로써 새로운 항생제 대체제로서의 가능성을 지니고 있다.

하지만 현재 개발중인 항생제 대체물질의 경우 대체효과가 뛰어나면 제조비용이 비싸거나, 비용이 저렴하면 대체효과가 미미하여 상용화하기 어려운 문제가 있었다.

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 항균효과가 우수하며 성장촉진효과가 있어 항생제를 대체할 수 있는 고구밸리(Solanum tuberosum L cv. Gogu Valley) 또는 고구밸리로부터 추출된 감자단백을 유효성분으로 함유하는 항생제 대체용 사료조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 항균효과가 우수하며 성장촉진효과가 있어 항생제를 대체할 수 있는 골든밸리(Solanum tuberosum L cv. Golden Valley) 또는 골든밸리로부터 추출된 감자단백을 유효성분으로 함유하는 항생제 대체용 사료조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 고구밸리(Solanum tuberosum L cv. Gogu Valley)로부터 정제감자단백을 제조하고, 이를 함유하는 항생제 대체용 사료조성물을 제조하여, 통상의 감자단백에서 아미노산의 일부를 절단함으로써 펩타이드의 길이는 짧으면서 항균 활성이 더욱 우수한 사료조성물을 제공하는 것이다.

상술한 해결하고자 하는 과제를 해결하기 위한 본 발명의 한 특징에 따른 항생제 대체용 사료조성물은, 고구밸리(Solanum tuberosum L cv. Gogu Valley) 또는 고구밸리로부터 추출된 감자단백을 유효성분으로 함유한다.

이 경우 바람직하게는 상기 감자단백은 전체 사료 조성물 100중량%에 대하여 0.075 ~ 15 중량% 함유될 수 있다.

본 발명의 다른 특징에 따른 항생제 대체용 사료조성물은 골든밸리(Solanum tuberosum L cv. Golden Valley) 또는 골든밸리로부터 추출된 감자단백을 유효성분으로 함유한다.

이 경우 바람직하게는 상기 감자단백은 전체 사료 조성물 100중량%에 대하여 0.075 ~ 15 중량% 함유될 수 있다.

본 발명의 사료조성물은 대장균, 포도상구균 또는 살모넬라균에 대하여 항진균 활성을 가진다.

본 발명의 또 다른 특징에 따른 정제감자단백의 제조방법은,

1) 고구밸리(Solanum tuberosum L cv. Gogu Valley)의 괴경을 분말로 분쇄하는 단계, 2) 상기 분말을 1차 원심분리하여 전분을 제거하는 단계, 3) 상기 전분이 제거된 고구밸리를 2차 원심분리하여 수용성 단백질이 용해된 상층액을 회수하는 단계 및 4) 상기 회수된 상층액을 여과한 후, 여과된 용액을 건조하여 정제감자단백을 수득하는 단계를 포함한다.

이 경우 바람직하게는 상기 1차 원심분리는 11,000 ~ 14,000 rpm으로 10 ~ 20분간 진행할 수 있으며, 상기 2차 원심분리는 4,000 ~ 6,000 rpm으로 25 ~ 35분간 진행할 수 있다.

상기 4)단계는 여과막을 이용하여 상기 상층액을 여과할 수 있다.

본 발명의 또 다른 특징에 따른 항생제 대체용 사료조성물은 상술한 방법으로 제조된 정제감자단백을 유효성분으로 함유한다.

이 경우 상기 정제감자단백은 바람직하게는 전체 사료조성물 100중량%에 대하여 0.02 ~ 3 중량%가 함유된다.

본 명세서에서 사용된 용어에 대해 간략히 설명한다.

본 발명에서 사용된 용어 '감자단백'은 항균펩타이드가 함유된 골든밸리 또는 고구밸리를 이용하여 통상의 감자전분 제조과정에서 전분을 제거한 후 감자단백이 용해되어 있는 수용액을 건조하여 획득한 분말을 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어 '정제감자단백'은 항균펩타이드가 함유된 고구밸리를 이용하여 일반적인 감자전분 제조과정에서 전분을 제거한 뒤 감자단백이 용해되어 있는 수용액을 원심분리와 여과의 방법을 통하여 항균활성이 낮은 고분자 단백질을 제거한 후 건조하여 항균활성이 높은 저분자 단백질이 많이 함유된 분말 상태의 물질을 의미한다.

본 발명의 고구밸리 또는 골든밸리에서 추출된 감자단백을 함유한 사료조성물을 자돈 및 육계에 급식시키는 경우 분과 장내 미생물수치를 감소시켜 영양소 소화율을 개선하며 사양성적을 향상시키고 면역개선효과를 가진다. 이를 통해 본 발명의 사료조성물은 자돈 등의 성장을 개선하고 통상의 화학적 항생제를 대체할 수 있다. 또한 통상의 항균제의 투여를 통해 기대할 수 없는 가축의 증체량, 사료섭취량 및 사료효율의 향상을 도모할 수 있다.

나아가, 본 발명의 정제감자단백은 감자단백에서 불필요한 단백질 부분을 배제시킴으로서, 적은 양을 사료에 투여하는 경우에도 병원성 박테리아를 감소시키고 성장개선효과가 있어 비용절감에 매우 효과적이다..

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 현재 개발중인 사료에 첨가할 수 있는 항생제 대체물질의 경우 대체효과가 뛰어나면 제조비용이 비싸거나, 비용이 저렴하면 대체효과가 미미하여 상용화하기 어려운 문제가 있었다.

이에 본 발명의 1실시예에 따른 항생제 대체용 사료조성물은, 고구밸리(Solanum tuberosum L cv. Gogu Valley) 또는 고구밸리로부터 추출된 감자 단백을 유효성분으로 함유하고 이를 섭취한 가축의 분과 장내 미생물 수치를 감소시켜 영양소 소화율 및 사양성적의 향상을 도모할 수 있어, 이를 통해 가축들에게 별도의 화학적 항생제를 투여하지 않고서도, 이와 유사한 효과를 달성할 수 있다.

한편, 본 발명에서 언급된 고구밸리(Solanum tuberosum L cv. Gogu Valley)와 그 유효성분인 항균활성을 가지는 펩타이드(서열목록 포함) 및 그 제조방법은 특허공개공보 제2006-54497호에 상세히 기재되어 있다. 구체적으로 상기 특허공개공보에서는 고구밸리에서 추출된 특정서열의 펩타이드가 단백질분해효소 억제효과가 있는 동시에 여성의 질염균의 원인균인 캔디다 알비칸스 균주 또는 비듬의 원인균인 트리코스포럼 베이젤라이 균주 또는 무좀의 원인균인 트리코파이톤 루브럼 균에 대하여 항진균 활성을 가지므로 이를 기능성 화장품, 기능성 식품원료, 방부제, 의약품 보존제 및 농약에 적용할 수 있음이 기재되어 있다.

이에 본 발명의 연구자들은 고구밸리 및 그 추출물에 대하여 연구를 계속한 결과, 상술한 효과 외에도, 이를 함유한 사료조성물을 가축에게 급여하는 경우 가축의 건강을 해치지 않으면서도 생육을 증진시키고 대장균, 살모넬라균 및 포도상구균에 대한 강한 항균활성을 가지는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 한편, 본 발명의 사료조성물 역시 상기 특허공개공보에 기재된 특정서열의 펩타이드를 포함하나 상기 펩타이드의 아미노산 서열 등에 대한 내용은 상술한 특허공개공보 제2006-54497호에 상세히 기재되어 있으므로 그 기재를 생략한다.

상기 본 발명의 1실시예에 따른 사료조성물은 고구밸리를 적절한 크기로 잘라서 통상의 사료에 적절한 분량을 첨가하여 사용할 수도 있으나, 고구밸리로부터 1차적으로 감자단백을 추출하고 이를 통상의 사료에 배합하여 사료조성물을 제조하는 것이 그 효율이 높으므로 이하에서는 감자단백을 중심으로 설명한다.

상기 감자단백은 항균펩타이드가 함유된 고구밸리를 이용하여 통상의 감자전분 제조과정에서 전분을 제거한 후 감자단백이 용해되어 있는 수용액을 건조하여 획득제조될 수 있으며, 보다 구체적으로 일반적인 감자전분 제조과정을 통하여 부산물로 생성되는 감자단백수를 건조하는 방법을 통하여 얻어지는 것으로, 감자전분을 제조하는 보통의 과정은 감자를 세척하여 분쇄한 후, 원심분리하여 상측액은 부산물로 제거한 후 건조하여 제조되는데 상기 부산물로 생성되는 상측액을 모아 건조하는 방법으로 획득할 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다.

상술한 제조방법을 통해 제조된 고구밸리에서 추출된 감자단백의 조성을 살펴보면 표 1과 같다.

[표 1]

상술한 방법을 통해 제조된 감자단백을 통상의 사료에 첨가하고 이를 가축에 급여하면, 가축의 건강을 해치지 않으면서도 대장균, 살모넬라균 및 포도상구균에 대한 강한 항균활성을 달성할 수 있어, 가축의 면역성 및 생장성(성장능력)이 강화될 뿐 아니라, 각종 질병에 걸리는 확률이 매우 낮아지게 되어, 항생제를 대체할 수 있게 된다(실시예 1 ~ 3 참조).

이 경우 바람직하게는 상기 감자단백은 전체 사료 조성물 100중량%에 대하여 0.075 ~ 15중량% 함유될 수 있다. 만일 0.075중량% 미만으로 첨가되면 항균활성이 미미하고, 15중량%를 초과하면 사료섭취량이 저하되는 문제가 발생할 수 있다.

다음, 본 발명의 2실시예에 따른 사료조성물은 골든밸리(Solanum tuberosum L cv. Golden Valley) 또는 골든밸리로부터 추출된 감자단백을 유효성분으로 함유하고 이를 섭취한 가축의 분과 장내 미생물 수치를 감소시켜 영양소 소화율 및 사양성적의 향상을 도모할 수 있어, 이를 통해 가축들에게 별도의 화학적 항생제를 투여하지 않고서도, 이와 유사한 효과를 달성할 수 있다.

한편, 본 발명에서 언급된 골든밸리(Solanum tuberosum L cv. Gogu Valley)와 그 유효성분인 항균활성을 가지는 펩타이드 및 그 제조방법은 특허공개공보 제2006-57271호에 상세히 상세히 기재되어 있다. 구체적으로 상기 특허공개공보에서는 골든밸리에서 추출된 특정서열의 펩타이드가 단백질분해효소 억제효과가 있는 동시에 여성의 질염균의 원인균인 캔디다 알비칸스 균주 또는 비듬의 원인균인 트리코스포럼 베이젤라이 균주 또는 무좀의 원인균인 트리코파이톤 루브럼 균에 대하여 항진균 활성을 가지므로 이를 기능성 화장품, 기능성 식품원료, 방부제, 의약품 보존제 및 농약에 적용할 수 있음이 기재되어 있다.

이에 본 발명의 연구자들은 골든밸리 및 그 추출물에 대하여 연구를 계속한 결과, 상술한 효과 외에도, 이를 함유한 사료조성물을 가축에게 급여하는 경우 가축의 건강을 해치지 않으면서도 생육을 증진시키고 대장균, 살모넬라균 및 포도상구균에 대한 강한 항균활성을 가지는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 한편, 본 발명의 사료조성물 역시 상기 특허공개공보에 기재된 특정서열의 펩타이드를 포함하나 상기 펩타이드의 아미노산 서열 등에 대한 내용은 상술한 특허공개공보 제2006-57271호에 상세히 기재되어 있으므로 그 기재를 생략한다.

상술한 제조방법을 통해 제조된 골든밸리에서 추출된 감자단백의 조성을 살펴보면 표 2와 같다.

[표 2]

상기 본 발명의 2실시예에 따른 사료조성물은 골든밸리를 적절한 크기로 잘라서 통상의 사료에 적절한 분량을 첨가하여 사용할 수도 있으나, 골든밸리로부터 1차적으로 감자단백을 추출하고 이를 통상의 사료에 배합하여 사료조성물을 제조하는 것이 그 효율이 높으므로 이하에서는 감자단백을 중심으로 설명한다.

골든밸리로부터 감자단백을 추출하는 방법은 제한이 없으나, 바람직하게는 상기 실시예 1의 추출방법을 적용하여 감자단백을 추출할 수 있다.

상술한 방법을 통해 제조된 감자단백을 통상의 사료에 첨가하고 이를 가축에 급여하면, 가축의 건강을 해치지 않으면서도 대장균, 살모넬라균 및 포도상구균에 대한 강한 항균활성을 달성할 수 있어, 가축의 면역성 및 생장성이 강화될 뿐 아니라, 각종 질병에 걸리는 확률이 매우 낮아지게 되어, 항생제를 대체할 수 있게 된 다(실시예 1 ~ 3 참조).

이 경우 바람직하게는 상기 감자단백은 전체 사료 조성물 100중량%에 대하여 0.075 ~ 15중량% 함유될 수 있다. 만일 0.075 중량% 미만으로 첨가되면 항균활성이 미미하고, 15중량%를 초과하면 사료섭취량이 저하되는 문제가 발생할 수 있다.

한편, 상기 1실시예의 감자단백은 항균활성에 불필요한 부분을 많이 포함하고 있기 때문에, 많은 양을 첨가하여야만, 항균제를 대체할 수 있는 단점이 있다.

이에 본 발명의 3실시예에서는 상기 1실시예의 감자단백에서 항균활성에 불필요한 아미노산의 일부를 절단함으로써 펩타이드의 길이는 짧으면서 항균 활성이 더욱 우수한 정제감자단백을 함유한 사료조성물을 제공한다.

구체적을 본 발명의 3실시예에 따른 정제감자단백의 제조방법은,

1) 고구밸리(Solanum tuberosum L cv. Gogu Valley)의 괴경을 분말로 분쇄하는 단계, 2) 상기 분말을 1차 원심분리하여 전분을 제거하는 단계, 3) 상기 전분이 제거된 고구밸리를 2차 원심분리하여 수용성 단백질이 용해된 상층액을 회수하는 단계 및 4) 상기 회수된 상층액을 여과한 후, 여과된 용액을 건조하여 정제감자단백을 수득하는 단계를 포함한다.

먼저, 1)단계로서 고구밸리(Solanum tuberosum L cv. Gogu Valley)의 괴경을 분말로 분쇄한다. 이 때, 분쇄방법 및 분말의 크기는 통상의 방법 및 크기에 준한다.

다음, 2)단계로서 상기 분쇄단 분말을 1차 원심분리하여 전분을 제거한다. 구체적으로 감자의 경우 전분의 함량이 매우 많으며 단백질의 함량이 적다. 한편 본 발명의 사료조성물에 필요한 부분은 상술한 항균 펩타이드 부분이 포함된 단백질 부분이므로, 전분을 제거하여 사용한다. 따라서, 본 발명의 정제감자단백은 식용의 목적으로 감자전분을 생산하는 과정에서 부산물인 상층액 부분을 2번의 원심분리 및 여과단계를 거쳐 제조하는 것이므로, 감자 부산물을 사용할 수 있어, 비용절감에 매우 효과적이다.

고구밸리 역시 통상의 감자와 마찬가지로 다량의 전분을 함유하고 있기 때문에, 1차 원심분리를 통하여 전분을 제거한다.

이 경우 바람직하게는 상기 1차 원심분리는 11,000 ~ 14,000 rpm으로 10 ~ 20분간 진행할 수 있다. 만일 11,000rpm 미만이면 단백질의 분리가 원활하게 되지 않는 문제가 발생할 수 있고, 14,000rpm을 초과하면 감자단백이 파괴될 수 있다.

다음, 3)단계로서 상기 전분이 제거된 고구밸리를 2차 원심분리하여 수용성 단백질이 용해된 상층액을 회수한다. 이 때, 상기 2차 원심분리는 4000 ~ 6000 rpm으로 25 ~ 35분간 1회 내지 수회 반복하여 진행한다. 이 과정은 단백질을 크기별로 절단할 수 있는 과정이며, 이를 통해 항균활성에 불필요한 펩타이드 부분을 제거할 수 있다.

이 경우 바람직하게는 상기 2차 원심분리는 4000 ~ 6000rpm으로 25 ~ 35분간 여러회 반복 진행한다. 만일 4,000 rpm 미만이면 이들이 원하는 크기의 단백질(펩타이드)가 분리되지 않을 수도 있고, 6,000 rpm을 초과하면 이때 사용하는 필터의 멤브레인이 파괴되는 문제가 발생할 수 있다.

마지막으로, 상기 4)단계는 여과막(구체적인 성능)을 이용하여 상기 상층액을 여과한 후, 여과된 용액을 건조하여 정제감자단백을 수득한다. 이 때, 사용가능한 여과막은 바람직하게는 셀룰로오스 성분으로서 공극의 크기가 분자량 10,000까지 통과가 가능한 여과막을 사용할 수 있다. 구체적으로 분자량이 10 Kda 이하의 단백질(펩타이드)만 분리하고 싶다면 필터의 여과막을 10 Kda 이하 분리 가능한 크기의 메쉬 사이즈를 사용하면 된다.

상기 정제감자단백은 전체 사료 조성물 100중량%에 대하여 0.02 ~ 3중량% 함유될 수 있어 결과적으로 상술한 1실시예에 따른 감자단백의 첨가량에 비하여 소량만 첨가하는 경우에도 발명의 목적을 달성할 수 있어 매우 경제적이다(하기 실시예 4 ~ 5 참조). 만일 0.02 중량% 미만으로 첨가되면 항균활성이 미미하고, 3중량%를 초과하면 사료섭취량이 저하되는 문제가 발생할 수 있다.

상술한 제조방법을 통해 제조된 정제감자단백의 조성을 살펴보면 표 3과 같다.

[표 3]

상술한 1 ~ 3 실시예를 통해 제조된 사료조성물은 자돈, 육계 외에 통상의 가축의 항생제 대체용 사료조성물로 사용할 수 있다.

이상 설명한 바와 같은 본 발명의 특징 및 장점은 후술되는 실시예로부터 보다 명백하게 될 것이다. 단, 본 발명은 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 고구밸리로부터 추출된 감자단백사료가 자돈의 항생제 대체에 미치는 효과

1. 감자단백(crude potato protein, CPP)의 추출과 MIC 테스트

고구밸리(Solanum tuberosum L. cv. Gogu valley, (주)포테이토밸리)를 세척후 햄머밀로 분쇄작업을 거치고 13000 rpm에서 15분간 원심분리하여 전분을 제거하고 수용성 단백질이 용해된 상층액을 건조시켜 감자단백을 획득하였다.

감자 단백의 MIC(minimum inhibitory concentration) 테스트를 위하여 감자에서 분리된 단백질 분획을 sterile deionized distilled water(SDDW)에 10,000㎍/㎖(10,000ppm) 농도로 만든 후, 여러 가지 농도로 희석하여 사용하였다. 배양된 4종류의 균주[대장균(E. coli ), 스타필로코쿠스 아우레우스(staphylococus aureus,ATCC 29213), 살모넬라 콜레라에쉬스(salmonella choleraesuis , ATCC 13312) 및 살모넬라 갈리나럼(salmonella gallinarum , ATCC 9184]의 배양액은 MHB를 이용하여 0.5 맥팔랜드 스탠다드(McFarland standard, 1.5×10⁸CFU/㎖)와 비교하여 투명도를 조절하였다. 각 세균액을 5×10⁵CFU/㎖으로 희석한 후(1:300) 앞서 희석한 단백질 1㎖와 희석된 세균 1㎖를 각각 멸균된 15㎖ 유리튜브에 첨가한 후 35℃에서 16～20시간 동안 진탕 배양하였으며, 각 배지(agar)에 균 생장 유무를 확인하여 최소억제농도(MIC)를 결정할 수 있었다.

2. 시험설계, 공시동물 및 사양관리

개시체중이 6.42±0.74kg인 이유자돈(Landrace×Yorkshire×Duroc, 23±3일령) 280두를 공시하여 성별과 체중에 따라 5처리 4반복, 반복당 14두씩 완전임의 배치하였다. 처리내용은 감자단백의 MIC 수준에 근거하여 항생제 투여구(PC, positive control; 통상사료 + 0.15% 아프라미신(apramycin) + 0.10% 콜리스틴 설페이트(colistin sulfate), 통상사료만으로 구성된 대조구(NC, negative control; 기초사료) 그리고 상기 1단계에서 추출된 감자 단백을 전체 사료조성물에 대하여 0.25%, 0.50% 및 0.75%을 함유한 첨가구로 구분하였다. 사양시험은 총 4주간(0~28일) 실시하였고 시험사료는 단계별 영양소 요구량(NRC, 1998)에 맞추어 Phase I(0～14일, 표 4)와 Phase II(14～28일, 표 5)로 구분하여 배합하였으며 사료와 물은 자유 채식시켰다.

자돈의 체중은 Phase I와 Phase II로 나누어 측정하였고 체중 측정시 사료급이통의 잔량을 측정하여 사료섭취량을 기록하였으며 사육일수를 나누어 일당증체량(average daily gain, ADG)과 일당사료섭취량(average daily feed intake, ADFI)을 산출하였다. 사료요구율(feed conversion ratio, FCR)은 일당사료섭취량에서 일당증체량을 나누어 계산하였다.

[표 4] Phase I에서 첨가물질의 화학적 조성

Item	항생제 투여구	대조구	감자단백 투여구, %
			0.25	0.50	0.75
성분, %
옥수수	33.09	33.58	33.28	33.02	32.73
밀	28.00	28.00	28.00	28.00	28.00
락토우즈	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00
대두박, 48% CP	13.84	13.76	13.65	13.51	13.38
농축대두단백	6.00	6.00	6.00	6.00	6.00
분무건조혈장단백	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00
어분	4.25	4.25	4.25	4.25	4.25
대두유	2.20	2.04	2.20	2.35	2.51
석회석	1.02	1.02	1.02	1.02	1.02
제3인산칼슘	0.23	0.23	0.23	0.23	0.23
L-라이신 HCl, 78%	0.16	0.16	0.16	0.16	0.17
m-메티오닌, 100%	0.16	0.16	0.16	0.16	0.16
트립토판, 10%	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15
소금	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10
염화콜린, 25%	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05
비타민	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30
미네랄	0.20	0.20	0.20	0.20	0.20
아프라마이신, 10%	0.15	―	―	―	―
콜리스틴, 1%	0.10	―	―	―	―
감자 단백	―	―	0.25	0.50	0.75
합계	100.00	100.00	100.00	100.00	100.00
ME, kcal/kg	3,400	3,400	3,400	3,400	3,400
CP, %	23.50	23.50	23.50	23.50	23.50
Lys, %	0.80	0.80	0.80	0.80	0.80
Met + Cys, %	0.40	0.40	0.40	0.40	0.40
Ca, %	1.65	1.65	1.65	1.65	1.65
Av. P, %	0.93	0.93	0.93	0.93	0.93

[표 5] Phase II에서 첨가물질의 화학적 조성

Item	항생제 투여구	대조구	감자단백 투여구, %
			0.25	0.50	0.75
성분, %
옥수수	42.00	42.48	42.21	41.92	41.64
밀	25.00	25.00	25.00	25.00	25.00
락토우즈	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00
대두박, 48% CP	19.08	19.00	18.86	18.73	18.58
분무건조혈장단백	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00
어분	2.25	2.25	2.25	2.25	2.25
대두유	1.90	1.75	1.90	2.06	2.22
석회석	0.88	0.88	0.88	0.89	0.89
트리칼슘 포스페이트	0.58	0.58	0.58	0.58	0.58
L-라이신 HCl, 78%	0.13	0.13	0.14	0.14	0.15
m-메티오닌, 100%	0.13	0.13	0.13	0.13	0.14
트립토판, 10%	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15
소금	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10
염화콜린, 25%	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05
비타민	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30
미네랄	0.20	0.20	0.20	0.20	0.20
아프라마이신, 10%	0.15	―	―	―	―
콜리스틴 설페이트, 1%	0.10	―	―	―	―
감자 단백	―	―	0.25	0.50	0.75
합계	100.00	100.00	100.00	100.00	100.00
ME, kcal/kg	3,350	3,350	3,350	3,350	3,350
CP, %	21.0	21.0	21.0	21.0	21.0
Lys, %	1.43	1.43	1.43	1.43	1.43
Met + Cys, %	0.83	0.83	0.83	0.83	0.83
Ca, %	0.80	0.80	0.80	0.80	0.80
Av. P, %	0.40	0.40	0.40	0.40	0.40

3. 시료채취 및 화학분석

(1) 영양소 소화율을 측정하기 위하여 각 단계별로 지시제인 산화크롬(Cr₂O₃)을 시험사료에 첨가하여 급여하였으며 시험사료에 대한 5일간의 적응기간과 3일간의 채취기간을 두었다. 채취한 분 시료는 열풍건조기를 이용하여 65℃에서 72시간 건조시킨 후 1㎜ 망사 윌리 밀(Wiley mill)로 분쇄하여 성분분석에 사용되었다. 외관상 회장아미노산 소화율, 장기무게, 간과 근육의 수분과 조단백질 함량, 장내미생물 그리고 소장의 형태조사를 위하여 실험종료시 반복당 1두씩(총 20두) 전기충 격 후 도살하여 분석에 사용되었다. 도체 직후 소화관은 분리되어 위, 소장 및 대장의 소화내용물을 포함한 무게와 내용물을 제거한 무게 그리고 간의 무게를 기록하였다. 장기무게는 체중으로 나눈 백분율로 표시하였다.

(2) 소장의 십이지장, 공장 그리고 회장을 구분하여 소장 내 융모의 형태학적 변화를 관찰하기 위하여 각 부분(십이지장, 공장 및 회장)은 1㎝크기로 적출되어 식염수로 세척 후 10% 포르말린 용액에 고정시켜 주사현미경으로 관찰할 때까지 상온에서 보관하였다. 회장내용물은 수거되어 즉시 냉동처리 하였으며 냉동시킨 시료는 -80℃의 동결건조기(Samwon Inc., Korea)를 이용하여 동결건조하였다. 건조된 시료는 1㎜ 스크린 윌리 밀(screen wiley mill)로 분쇄한 후 아미노산 함량을 분석하기 전까지 냉장보관하였다. 간과 뒷다리 근육의 조단백질과 수분함량의 측정을 위하여 각각 샘플을 취하였으며 분석하기 전까지 냉장보관하였다. 장내미생물 조사를 위하여 맹장, 결장 및 직장의 내용물은 멸균용기에 채집되어 7℃에서 냉장보관하였다. 분중의 미생물 검사를 위하여 실험개시와 주간단위로(0, 7, 14, 21 및 28일째) 반복당 4두씩(총 80두) 분 샘플을 취하여 분석에 사용하였다.

(3) 모든 샘플의 일반성분분석은 AOAC(1990)의 방법에 따라 분석하였고, 크롬함량은 원자흡광도계(Contron 942, Italy)를 사용하여 측정하였다. 사료와 회장내용물의 아미노산 분석은 시료를 24시간동안 105℃에서 6N HCl용액으로 가수분해 시킨 후 HPLC(Waters 486, USA)를 사용하여 분석하였으며, 황 함유 아미노산은 24 시간 동안 가수분해 시킨 후 냉각 퍼포믹 에시드(cold performic acid)용액으로 산화처리하여 분석하였다(Moore, 1963).

(4) 소장의 융모 높이(villus height), 융와 깊이(crypt depth) 그리고 융모 넓이(villus width)를 측정하기 위하여 10% 포르말린 용액에 보존되어 있던 시료를 파라핀으로 고정시킨 후 6㎛크기로 절단하여 아주레 A(azure A)와 에오신(eosine)으로 염색하였다. 염색된 시료는 40배 비율의 현미경에서 측정하였다(Cera 등, 1988). 융모 높이와 융와 깊이의 비율(villus height: crypt depth)은 융모 높이를 융와 깊이로 나누어 산출하였다. 영양소 소화율은 하기 관계식 1에 의하여 산출하였다.

[관계식 1]

혈액성상을 측정하기 위하여 사양시험의 각 단계별 종료시점(14와 28일)에 반복당 2두의 자돈을 선별하였다. 경정맥으로부터 채혈하여 얻은 혈액은 K₂EDTA로 항응고처리된 튜브에 넣어 아이스 박스에 보관한 다음 자동혈액분석기(Hemacyte^TM, Oxford science, Inc., USA)를 이용하여 백혈구수(white blood cells, WBC), 호중구(neutrophils, NE), 임파구(lymphocytes, LY), 단핵구(monocytes, MO), 호산 구(eosinophils, EO), 호염구(basophils, BA), 적혈구수(red blood cells, RBC), 헤모글로빈(hemoglobin, Hb) 및 헤마토크릿(hemotocrit, Hct) 등을 측정하여 분석하였다.

4. 장 및 분중 미생물과 면역반응 조사

(1) 장 및 분중의 총세균수(total bacterial counts, TBC)와 대장균수(E. coli)를 검사하기 위하여 채취한 샘플 5g을 45㎖의 BPBDW (buffer-field's phosphate-buffered dilution water)에 넣어 잘 혼합하고 혼합물 1㎖를 취하여 다시 9㎖의 BPBDW 희석용액으로 10배 희석한 후 BPBDW 희석용액으로 10^-1부터 10^-7까지 10진씩 희석하였다. 각 희석용액별로 1㎖를 취하여 페트리 접시에 넣고 56℃의 워터 배스에 있는 PCA, VRBA 배지를 2회 분주하였다. 분주한 배지를 37℃ 인큐베이터에서 24시간 배양한 후 콜로니를 계수하여 세균수를 측정하였다. 포도상구균(포도상구균)의 검사는 배지 베어드-파커 아가(Baird-Parker Agar)를 고압멸균 후 56℃때 에그-요크 텔루라이트 에멀젼(Egg-yolk Tellurite Emulsion)을 첨가하고 충분히 혼합하여 페트리 접시에 20㎖씩 분주하였으며 굳은 후 4℃에서 보관하여 실험에 사용하였다. 총세균수 검사방법중에서 이미 10진씩 희석된 샘플용액 100㎕를 배지 베어드-파커 아가에 넓게 퍼뜨리고 37℃ 인큐베이터에서 24～48시간동안 배양하였다. 배양 후 생장된 콜로니를 계수하여 세균수를 측정하였다.

(2) 면역반응조사는 세포매개성면역과 체액성면역으로 구분하여 조사하였으며 세포매개성면역의 경우는 피내지연형과민반응법(cutaneous basophile hypersensitivity)을, 체액성면역에 대해서는 양혈액에 대한 항체반응(antibody response to sheep red blood cells)을 측정하여 조사하였다.

세포매개성면역조사는 실험 종료시 반복당 1두씩(총 20두) 선발하여 다음과 같이 피하(subcutaneous)로 접종하였다. 접종부위는 마지막 젖꼭지에서 5㎝뒤와 중간선(median line)에서 5㎝왼쪽으로 떨어진 지점에 접종을 하였다. 왼쪽의 접종부위에는 PBS(phosphate buffered saline)만을 0.1㎖ 접종하여 대조지점으로 삼았고 오른쪽 부위에는 PBS(0.01M, pH 7.4)에 1.5㎎/㎖의 PHA-P(phytohaemagglutinin-P)를 첨가하여 0.1㎖ 접종하였다. 접종 전(0시간), 접종 후 18과 42시간째에 동일한 지점의 피부두께(skin thickness)를 측정하였다. 측정시 전 과정은 동일한 긴장감(tension정도)을 주어 측정하였다. PHA1은 PHA-P/PBS 접종부위의 시간에 따른 종창정도를 나타내고 PHA2는 접종시간별 PHA-P/PBS 접종부위에서 PBS만을 접종한 부위의 두께를 뺀 숫자로 산출하였다.

(3) 체액성면역조사를 위하여 실험개시 14일째에 반복당 1두씩(총 20두) 선발하여 마리당 농도가 20%인 S-RBC(sheep red blood cells)를 근육에 접종하였다. 접종 후 7일과 14일 후 즉 실험개시 21일과 28일째에 채혈하여 혈청을 분리한 후 56℃에서 30분간 비동화 처리한 후 마지막 채혈할 때까지 -20℃에 보관하였다. 혈구응집반응은 U-바텀 96 마이크로플레이트(U-bottom 96 well microplate)를 사용하 였으며 보관된 혈청을 2진 희석한 후 2% S-RBC용액을 각 well당 50㎕씩 분주한 후 37℃에서 30분간 반응시켜 혈구응집 유무를 관찰하였다. 각 혈청당 최종혈구응집역가는 혈구응집이 일어난 최대 희석배수로 표시하였다(log₂ base).

5. 통계 분석

본 시험에서 얻어진 모든 자료는 SAS(1988)의 GLM (general linear model) 프러시저를 이용하여 감자단백의 첨가수준에 대한 1차적(Linear) 및 2차적(Quadratic) 효과를 분석하였고 PC와 CPP의 두개 평균간 비교는 독립-샘플(Independent-Sample) T-Test를 이용하여 실시하였다.

6. 결과 및 고찰

(1) MIC 측정

본 시험에 사용된 고구밸리(Solanum tuberosum L. cv. Gogu valley) 감자단백의 MIC (Minimum Inhibitory Concentration) 측정결과는 하기 표 6에 나타내었다. 네 가지 균주(포도상구균 aureus , Salmonella choleraesuis , Salmonella gallinarum , E. coli)에 대한 억제 실험에서 감자단백의 농도가 500ppm 이상일 때 균의 성장을 관찰할 수 없었다.

[표 6]

(2) 사양성적과 영양소 소화율

본 시험은 Phase I과 Phase II로 나누어 진행하였으며 사양성적 결과는 표 7와 같다. Phase I에서 항생제와 감자단백급여구의 일당증체량(ADG)과 일당사료섭취량(ADFI)은 차이가 없었으나 사료요구율(FCR)의 경우 항생제 급여구가 감자단백급여구에 비하여 개선되었다(p<0.05). 그러나 감자단백급여구(CPP, 이하 동일)와 대조구를 비교하였을 때 ADG, ADFI 그리고 FCR에서는 차이가 나타나지 않았다(p>0.05). Phase II에서 항생제와 감자 단백급여구의 ADG, ADFI 그리고 FCR에서는 차이가 없었으나 감자 단백급여수준이 높을수록 ADG가 증가하였다(Linear, p<0.05). 전체기간으로 볼 때, 항생제처리구는 감자 단백급여구보다 ADG가 높았으며 감자단백급여구도 대조구에 비하여 일당증체량이 개선되었다(Linear, p<0.05).

[표 7]

단 : ADG는 일당증체량을 의미하고, ADFI는 일당사료섭취량을 의미하며, FCR은 사료요구율을 의미한다.

영양소 소화율 시험결과는 하기 표 8과 같다. 항생제 처리구와 감자단백급여구를 비교할 때 Phase I의 건물 소화율과 Phase II의 건물과 조단백질 소화율은 모두 항생제 처리구가 감자단백급여구에 비하여 높았으며(p<0.01), Phase II의 건물 소화율은 감자단백 급여수준이 높아짐에 따라 대조구에 비하여 개선되었다(p<0.05). 그러나 회장의 외관상 아미노산 소화율(표 9)에서는 항생제처리와 감자 단백급여에 의한 차이가 나타나지 않았다(p>0.05).

[표 8]

[표 9]

자돈은 이유시 각종 스트레스에 인하여 사료섭취량이 저하되고 성장이 지연된다. 이유자돈에게 항생제를 급여하면 일당증체량이 개선된다고 보고하였고(Kendall 등, 2000; Lewis와 Southern, 2001) 본 실험의 결과에서도 비슷한 경향을 나타내었다. 그러나 일당사료섭취량과 사료요구율 측면에서는 차이가 없었으며 대조구와 비교할 때 감자 단백급여수준이 높을수록 일당증체량과 일당사료섭취량이 개선되었다. 락토페린(Lactoferrin)은 항균펩타이드로서 병원성 미생물에 대하여 저항작용이 있으며(Dial 등, 1998; Pyong 등, 2001) 일당증체량과 사료요구율을 개선하는 효과가 있다(Wang 등, 2006). 그러나 Greiner 등(2004)은 항균펩타이드의 급여는 생쥐의 증체량, 사료섭취량 및 사료효율에 영향을 미치지 못하였다고 보고하였다. 본 시험 결과로 미루어보아 항균펩타이드가 포함된 감자단백의 급여는 증체량을 개선하는 것으로 나타났으며 이러한 결과는 사료섭취량 증진효과와 관계가 있는 것으로 판단된다.

(3) 장 및 분중 미생물

감자단백급여에 의한 분중 미생물 수치의 변화는 하기 표 10과 같다. 14일째의 총균수와 대장균(E. coli ) 그리고 28일째의 대장균 수치는 항생제처리구가 감자단백급여구보다 낮았다(p<0.05). 또한 감자단백급여구는 대조구에 비하여 14와 28일째의 총균수와 대장균(E. coli ) 그리고 14, 21 및 28일째의 스타필로코쿠스(포도상구균)의 수치가 유의적으로 나타내었다(p<0.05).

[표 10]

하기 표 11은 감자단백급여가 자돈의 대장내 미생물(28일)에 대한 영향을 나타냈다. 맹장의 총균수와 포도상구균의 수치는 항생제 처리구가 감자단백급여구보다 적었다(p<0.05). 그러나 대장균 수치는 차이가 나타나지 않았다(p>0.05). 또한, 감자단백급여수준이 높을수록 대조구에 비하여 총균수와 포도상구균의 수치가 유의적으로 감소되었다(p<0.05). 직장의 총균수와 결장의 대장균 수치는 항생제 처리구가 감자단백급여구에 비하여 적었지만 감자단백의 급여는 대조구에 비하여 미생물의 성장을 뚜렷이 억제하는 것으로 나타났다(p<0.05).

[표 11]

이상의 결과로부터 감자단백의 급여는 항생제에 비하여 다소 차이를 나타내지만 미생물의 성장을 효과적으로 억제하는 것으로 판단된다. 또한 항생제 처리구는 두 가지 항생제를 사용함으로써 작용이 컸다고 여겨진다.

사료를 통하여 섭취된 에너지의 6%가량은 위와 장내의 미생물발효에 의하여 소실된다(Doyle, 2001). 이러한 관점에서 장내미생물의 성장을 효과적으로 억제할 수 있다면 에너지의 이용효율을 높여줄 것이다. 본 실험의 결과에서도 항균펩타이드가 포함된 감자단백을 자돈에 급여함으로써 장내미생물 성장을 억제하여 에너지와 영양소 이용효율이 제고되었으며 이에 따른 성장성적 개선효과가 나타난 것으로 판단된다.

라. 면역반응과 혈액성상

감자단백급여와 항생제 처리에 따른 면역반응 조사와 혈중 백혈구, 적혈구계 및 혈소판계 조사의 결과는 하기 표 12 및 표 13에 나타냈다. 세포매개성 측정결과에서 PHA-P를 접종한 부위는 빨갛게 홍반을 형성하였으나 PBS접종부위에는 거의 변화가 없는 것이 관찰되었다. PBS를 접종한 다섯 그룹 중에서 대조군을 제외한 나머지 4개 그룹에서 비교적 비슷한 미세한 종창정도를 나타낸 반면 PHA-P를 접종한 5개 그룹에서 모두 18시간째에 거의 모두 300% 이상의 종창정도를 나타내었다. 결과를 보면 접종 후 18시간째가 가장 높은 수치의 종창을 보이며 42시간째에는 종창정도가 18시간에 측정한 것보다 감소하는 경향이 있었다. 또한 감자단백급여구의 종창정도는 대조구에 비하여 수치상으로 높게 나타났지만 급여수준에 따른 효과는 나타나지 않았다(p>0.05). 면양혈액(S-RBC)에 대한 항체형성능과 혈액성상 조사에서는 처리구간에 차이가 나타나지 않았다.

[표 12]

PHA1은 PHA-P/PBS 접종부위의 시간에 따른 종창정도를 나타내고 PHA2는 접종시간별 PHA-P/PBS 접종부위에서 PBS만을 접종한 부위의 두께를 뺀 숫자로 산출하였다.

[표 13]

마. 장기무게, 소장의 형태 및 간과 근육의 단백질과 수분함량

소화장기인 간장, 위, 소장 그리고 대장의 체중에 대한 백분율 퍼센트로 장기무게를 조사하여 그 결과를 표 14에 나타내었다. 하기 표 14를 살펴보면 각 처리구간에는 차이가 없었다(p>0.05). 비슷한 결과로, 소장 각 부분(십이지장, 공장 및 회장)의 융모길이(villus height, VH), 융와높이(crypt depth, CD), 융모길이와 융와높이의 비례(VH/CD) 그리고 융모넓이(villus width, VW)를 조사한 결과(표 15) 처리구간에 변화가 없었다(p>0.05). 또한, 간과 뒷다리 근육의 조단백질과 수분함 량을 조사한 결과(표 16) 항생제 처리와 감자단백급여에 의한 효과는 나타나지 않았다(p>0.05).

[표 14]

이유자돈의 장 점막의 건강은 성장과 면역상태에 매우 중요한 작용을 일으킨다(Bosi 등, 2003). 항생제와 항균펩타이드의 한가지인 락토페린(lactoferrin)을 급여하면 융모의 길이가 길어지고 융와의 깊이는 낮아져 성장을 촉진한다(Wang 등, 2006). 그러나 본 시험에서는 차이가 나타나지 않았으며 성장촉진효과는 주요하게 미생물억제능력에 있다고 판단된다.

본 실험에서 사용된 감자단백은 수용성으로서 가능한 작용기전은 저분자 단백질로부터 병원성미생물의 성장을 억제하는 것으로 판단된다(Plate 등, 1993). 또 한 감자에서 추출된 수용성 단백질로부터 분리하여 항균효과가 검증된 PT-1 (Potamin-1)과 AFP-J(antifungal protein J)와 같은 항균펩타이드는 사료첨가제로서도 작용이 있는 것으로 사료되며 감자단백의 항생제대체 가능성을 보여주고 있다.

[표 15]

[표 16]

본 실험의 결과 높은 수준의 감자단백급여구는 항생제와 유사한 결과가 나타났으며 대조구와 비교할 때 감자단백급여수준이 높을수록 분과 장내 미생물수치를 감소시켜 영양소 소화율을 개선하였으며 사양성적도 좋아졌다. 이를 통해 자돈에서 항균펩타이드(Potamin-1)가 함유된 신품종 감자단백의 급여효과는 확인되었으며 본 실험의 항생제 처리구는 두 가지 항생제(Apramycin과 Colistin)를 사용하였고 감자단백급여수준이 높을 때 항생제와 유사한 촉진효과가 나타난 것으로 보아 항균펩타이드가 포함된 기능성 신품종 감자단백의 급여는 사료용 항생제 대체 가능성을 나타내는 것으로 판단되며 적정첨가수준은 0.075 ~ 15중량%인 것으로 사료된다.

<실시예 2> 고구밸리로부터 추출된 감자단백 사료가 육계의 항생제 대체에 미치는 효과

1. 감자단백의 추출과 MIC 시험

본 시험에서는 상기 실히예 1에서 사용된 고구밸리(Solanum tuberosum L. cv. Gogu valley) 감자품종의 감자단백을 사용하였으며 감자단백의 추출방법과 특성은 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

2. 시험설계, 공시동물 및 사양관리

본 시험을 위해 체중이 44.10±3.59g인 1일령 로스(Ross)종 브로일러 600수를 공시하여 5처리 4반복, 반복당 30수씩 완전임의 배치하였다. 처리내용은 항생제와의 비교와 감자단백의 MIC 수준에 근거하여 항생제 첨가구(PC, positive control; 기초사료+0.05% avilamycin), 대조구(NC, negative control; 기초사료) 그리고 감자단백 0.25, 0.50 및 0.75% 첨가구로 구분하였다. 사양시험은 총 6주간(0～42일) 실시하였고 시험사료는 단계별 영양소 요구량(NRC, 1994)에 맞추어 시작기(0～3주)와 종료기(3～6주)로 구분하여 배합하였으며(표 17, 18) 사료통과 물통은 가장자리에 설치하였으며 시험기간 동안 사료와 물은 자유채식 시켰다. 사육면적은 2.0×2.0m이고 평사하였으며 바닥에는 왕겨를 깔았다.

육계의 체중측정은 시험개시, 중간시점(21일째) 및 종료일(42일째)에 측정하여 증체량, 사료섭취량을 기록하였으며 사료요구율은 사료섭취량에서 증체량을 나누어 산출하였다.

[표 17]

[표 18]

3. 시료채취 및 화학분석

영양소 소화율을 측정하기 위하여 각 단계별로 반복당 2수씩 선별하여 소화율측정 케이지에 수용하고 지시제인 산화크롬(Cr₂O₃, 0.25%)을 시험사료에 첨가하여 급여하였으며 시험사료에 대한 5일간의 적응기간과 3일간의 채취기간을 실시하였다. 채취한 분 시료는 열풍건조기를 이용하여 65℃에서 72시간 건조시킨 후 1㎜ 망사 윌리 밀(Wiley mill)로 분쇄하여 성분분석에 사용되었다.

외관상 회장아미노산 소화율, 장기무게, 간과 근육의 수분과 조단백질 함량, 장내미생물 그리고 소장의 형태조사를 위하여 실험종료시 반복당 2수씩(총 40수씩) 전기충격후 도살하여 분석에 사용되었다. 도체직후 소화관은 분리되어 전위, 위, 소장 및 대장 각 부분의 소화내용물을 포함한 무게와 내용물을 제거한 무게 그리고 간의 무게를 기록하였다. 소장의 십이지장, 공장 그리고 회장을 구분하여 소장내 융모의 형태학적 변화를 관찰하기 위하여 각 부분(십이지장, 공장 및 회장)은 1㎝크기로 적출되어 식염수로 세척 후 10% 포르말린 용액에 고정시켜 주사현미경으로 관찰할 때까지 상온에서 보관하였다. 회장내용물은 수거되어 즉시 냉동처리 하였으며 냉동시킨 시료는 -80℃의 동결건조기(Samwon Inc., Korea)를 이용하여 동결건조 하였다. 건조된 시료는 1㎜ 스크린 윌리 밀(screen wiley mill)로 분쇄한 후 아미노산 함량을 분석하기 전까지 냉장보관 하였다. 간과 뒷다리 근육의 조단백질과 수분함량의 측정을 위하여 각각 샘플을 취하였으며 분석하기 전까지 냉장보관 하였다. 장내미생물 조사를 위하여 맹장과 총배설강의 내용물은 멸균용기에 채집되어 7℃에서 냉장보관 하였다. 분중의 미생물 검사를 위하여 실험개시와 주간단위로(0, 14, 28 및 42일째) 반복당 4수씩(총 80수) 분 샘플을 채집하여 분석에 사용하였다.

모든 샘플의 일반성분분석은 AOAC(1990)의 방법에 따라 분석하였고, 크롬함량은 원자흡광도계(Contron 942, Italy)를 사용하여 측정하였다. 사료와 회장내용물의 아미노산 분석은 시료를 24시간동안 105℃에서 6N HCl용액으로 가수분해 시킨 후 HPLC(Waters 486, USA)를 사용하여 분석하였으며, 황함유아미노산은 24시간동안 가수분해 시킨 후 냉각 과의산(cold performic acid)용액으로 산화처리하여 분석하 였다(Moore, 1963).

소장의 융모 높이(villus height), 융와 깊이(crypt depth) 그리고 융모 넓이(villus width)를 측정하기 위하여 10% 포르말린 용액에 보존되어 있던 시료를 파라핀으로 고정시킨 후 6㎛크기로 절단하여 아주레(azure) A와 에오신(eosine)으로 염색하였다. 염색된 시료는 40배 비율의 현미경에서 측정하였다(Cera 등, 1988). 융모 높이와 융와 깊이의 비율(VH/CD)은 융모 높이를 융와 깊이로 나누어 산출하였다.

혈액성상을 측정하기 위하여 사양시험의 각 단계별 종료시점(21과 42일)에 반복당 두 마리의 육계를 선별하였다 익정맥으로부터 채혈하여 얻은 혈액은 K₂EDTA로 항응고처리된 튜브에 넣어 아이스 박스에 보관한 다음 실험 1과 같은 방법으로 분석하였다.

4. 장 및 분중 미생물과 면역반응 조사

장 및 분중의 총세균수(total bacterial counts, TBC)와 대장균수(E. coli)를 검사하기 위하여 채취한 샘플 5g을 45㎖의 BPBDW (buffer-field's phosphate-buffered dilution water)에 넣어 잘 혼합하고 혼합물 1㎖를 취하여 다시 9㎖의 BPBDW희석용액으로 10배 희석한 후 BPBDW희석용액으로 10^-1부터 10^-7까지 10배씩 희석하였다. 각 희석용액별로 1㎖를 취하여 페트리 접시에 넣고 56℃의 욕조에 있는 PCA, VRBA 배지를 2회 분주하였다. 분주한 배지를 37℃ 인큐베이터에서 24시간 배 양한 후 콜로니를 계수하여 세균수를 측정하였다. 포도상구균(포도상구균)의 검사는 배지 베어드-파커 아가(Baird-Parker Agar)를 고압멸균 후 56℃때 에그-요크 텔루라이트 에멀전(Egg-yolk Tellurite Emulsion)을 첨가하고 충분히 혼합하여 페트리 접시에 20㎖씩 분주하였으며 굳은 후 4℃에서 보관하여 실험에 사용하였다. 총세균수 검사방법중에서 이미 10진씩 희석된 샘플용액 100㎕를 베어드-파커 아가에 넓게 접종하여 37℃ 인큐베이터에서 24～48시간동안 배양하였다. 배양 후 생장된 콜로니를 계수하여 세균수를 측정하였다.

면역반응조사는 세포매개성면역과 체액성면역으로 구분하여 조사하였으며 세포매개성면역의 경우는 피내지연형과민반응법(cutaneous basophile hypersensitivity)을, 체액성면역에 대해서는 양혈액에 대한 항체반응(antibody response to sheep red blood cells)을 측정하여 조사하였다.

세포매개성면역조사는 실험 5주째에 반복당 네 마리씩(총 80수) 선발하여 닭의 양쪽 지간두께(3번째와 4번째 사이의 지간)를 측정하였다. 양쪽의 지간두께의 측정이 끝나면 바로 왼쪽의 지간에는 멸균된 PBS(phosphate buffered saline)만을 0.1㎖ 피내(intradermal)로 접종을 하였다(대조). 오른쪽 지간에는 멸균 PBS에 100㎍/0.1㎖로 희석된 PHA-P(phytohaemagglutinin-P)를 0.1㎖씩 피내로 접종하였다(측정). 접종 전(0시간), 접종 후 12와 24시간째에 동일한 지점의 지간두께를 측정하였다. 측정시 전 과정은 동일한 긴장감(tension정도)을 주어 측정하였다. PHA1은 PHA-P/PBS 접종부위의 시간에 따른 종창정도를 나타내고 PHA2는 접종시간별 PHA-P/PBS 접종부위에서 PBS만을 접종한 부위의 두께를 뺀 숫자로 산출하였다.

체액성면역조사를 위하여 실험개시 3주째에 반복당 1수씩(총 20수) 선발하여 마리당 농도가 20%인 S-RBC(sheep red blood cells) 2.5㎖를 근육에 접종하였다. 접종 후 7일과 14일 후 채혈하여 혈청을 분리한 후 56℃에서 30분간 비동화 처리한 후 마지막 채혈할 때까지 -20℃에 보관하였다. 혈구응집반응은 U-bottom 96 well microplate를 사용하였으며 보관된 혈청을 2진 희석한 후 2% S-RBC용액을 각 well당 50㎕씩 분주한 후 37℃에서 30분간 반응시켜 혈구응집유무를 관찰하였다. 각 혈청당 최종혈구응집역가는 혈구응집이 일어난 최대 희석배수로 표시하였다(log₂ base).

5. 통계적 분석

실시예 1과 동일한 방법으로 통계적 분석을 실시하였다.

6. 결과 및 고찰

가. 사양성적과 영양소 소화율

본 시험은 개시기(전기)와 종료기(후기)로 나누어 진행되었으며 사양성적 결과는 하기 표 19와 같다.

[표 19]

개시기(전기, starter)에는 항생제와 감자단백급여구의 증체량(weight gain)과 사료섭취량(feed intake)에서는 차이가 없었으나 사료요구율(FCR)의 경우 항생제 급여구가 감자단백급여구에 비하여 개선되었다(p<0.05). 또한 감자단백급여구는 대조구에 비하여 증체량, 사료섭취량 및 사료요구율을 개선하는 효과가 나타났다(p<0.05, p<0.01). 종료기(Finisher)에 항생제의 급여는 감자단백급여구에 비하여 증체량이 개선되었으나(p>0.05) 감자단백급여구와 대조구를 비교하였을 때 증체량, 사료섭취량 및 사료요구율에서는 차이가 나타나지 않았다(p>0.05). 전체기간으로 볼 때 항생제처리구는 감자단백급여구보다 증체량과 사료요구율이 개선되었으며 감자단백의 급여는 대조구보다 증체량이 개선되었다(p<0.05).

영양소 소화율 시험결과는 하기 표 20에 나타내었다. 항생제 처리구와 감자단백급여구를 비교할 때 개시기와 종료기의 건물과 조단백질 소화율은 모두 항생제 처리구가 감자단백급여구에 비하여 높았으며(p<0.05); 개시기 기간의 건물과 조단 백질 소화율 그리고 종료기 기간의 조단백질 소화율은 감자단백급여구가 대조구에 비하여 개선되었다(p<0.05).

[표 20]

회장아미노산 소화율에서(표 21) 아르기닌, 알라닌, 아스파라트 산, 시스틴 및 글루타민 산의 소화율은 항생제 처리구가 감자단백급여구보다 높았으며 감자단백급여구는 대조구보다 시스틴의 소화율이 높게 나타났다(p<0.05).

[표 21]

나. 장 및 분중 미생물

감자단백급여에 의한 분중 미생물 수치의 변화는 하기 표 22와 같다. 14일째의 대장균 수치, 28일째의 총균수(total bacteria)와 포도상구균 수치 그리고 42일째의 총균수, 대장균 및 포도상구균의 수치는 항생제처리구가 감자단백급여구보다 뚜렷이 적었다(p<0.01). 또한 감자단백급여수준이 높아질수록 대조구에 비하여 14일째의 대장균 수치 그리고 28과 42일째의 포도상구균의 수치가 유의적으로 적었다(p<0.01).

[표 22]

하기 표 23에서는 감자단백의 급여가 육계의 대장내 미생물(42일)에 미치는 영향을 나타냈다. 맹장과 총배설강의 총균수, 대장균 및 포도상구균 수치는 항생제 처리구가 감자단백급여구에 비하여 적게 나타났다(p<0.05). 그러나 감자단백의 급여수준에 따른 대장내 미생물 억제효과도 유의적으로 나타났다(p<0.05).

[표 23]

다. 면역반응과 혈액성상

육계에서 실시한 지연형 과민반응 결과와 면양혈액에 대한 항체형성능의 결과는 하기 표 24 및 표 25에 나타내었다. PHA2 12시간째의 결과는 항생제가 유의적으로 높게 나타나(p<0.05) 세포매개성 면역력이 상승된 결과를 나타냈으며, 25일령의 항체가에서 감자단백의 급여수준이 높아질수록 역가가 높게 나타나는 것으로(p<0.05) 보아 감자단백의 급여가 체액성면역을 조절하는 것으로 나타났다. 그러나 혈중 백혈구, 적혈구계 및 혈소판계의 조사에서는 항생제 처리와 감자단백급여에 의한 효과가 나타나지 않았다(p>0.05).

[표 24]

[표 25]

라. 장기무게, 소장의 형태 및 간과 근육의 단백질과 수분함량

소화장기인 간장, 전위, 위, 소장 및 대장의 체중에 대한 백분율 퍼센트로 장기무게를 조사하였는데(표 26), 각 처리구간에는 차이가 없었다(p>0.05). 또한, 간과 뒷다리 근육의 조단백질과 수분함량을 조사한 결과(표 27) 항생제 처리와 감자단백급여에 의한 효과는 나타나지 않았다(p>0.05). 비슷한 결과로, 소장 각 부분(십이지장, 공장 및 회장)의 융모길이(villus height, VH), 융와높이(crypt depth, CD), 융모길이와 융와높이의 비례(VH/CD) 그리고 융모넓이(villus width, VW)를 조사한 결과(표 28) 처리구간에 변화는 나타나지 않았다(p>0.05).

[표 26]

[표 27]

[표 28]

6. 결과

자돈의 경우와 마찬가지로 육계에서도 감자단백의 첨가에 의한 성장촉진효과가 뚜렷이 나타난 것으로 판단된다. 비록 항생제의 효과에는 미치지 못하였지만 감자단백급여수준이 높아질수록 미생물에 대한 억제 능력이 향상되었고 이로 인한 영양소 이용효율이 향상될 수 있었으며 또한 성장능력을 개선하는 효과가 나타난 것으로 사료된다. 또한 면역반응조사에서도 감자단백의 급여는 육계의 체액성면역력을 개선하는 것으로 나타났다. 이러한 결과로 미루어 볼 때 항균펩타이드가 함유된 감자단백(고구밸리)의 급여는 미생물성장을 억제하고 면역능력을 개선하며 성장촉진효과가 있어 항생제를 대체하는데 유용할 것으로 판단된다.

<실시예 3> 골든밸리로부터 추출된 감자단백사료가 자돈의 항생제 대체에 미치는 효과

1. 감자단백(crude potato protein, CPP의 추출과 MIC 테스트

본 시험에 사용된 감자(골든밸리, Solanum tuberosum L. cv. Golden valley)는 (주)포테이토밸리에서 제공되었으며 상대습도 90~95%, 4℃ 조건에서 저온보관되었다.

감자단백(crude potato protein, CPP)의 추출을 위하여 선별된 감자를 세척후 햄머밀로 분쇄작업을 거치고 원심분리하여 전분을 제거하였으며 수용성 단백질이 용해된 상층액을 건조시켜 감자단백을 획득하였다.

감자단백의 MIC(minimum inhibitory concentration) 테스트를 위하여 감자에서 분리된 단백질 분획을 sterile deionized distilled water(SDDW)에 10,000㎍/㎖(10,000ppm) 농도로 만든 후 여러 가지 농도로 희석하여 사용하였다. 배양된 네가지 균주[대장균(E. coli), 포도상구균(staphylococus aureus , ATCC 29213), ㅅ사살모넬라 콜레라에쉬스(salmonella choleraesuis (ATCC 13312) 그리고 살모넬라 갈라검(salmonella gallinarum , ATCC 9184)]의 배양액은 MHB를 이용하여 0.5 맥팔랜 드 스탠다드(McFarland standard, 1.5×10⁸CFU/㎖)와 비교하여 투명도를 맞추었다. 각 세균액을 5×10⁵CFU/㎖으로 희석한 후(1:300) 앞서 희석한 단백질 1㎖와 희석된 세균 1㎖를 각각 멸균된 15㎖ 유리 tube에 첨가한 후 35℃에서 16～20시간동안 진탕배양하였으며 각 배지에 균 생장 유무를 확인하여 최소억제농도(MIC)를 결정하였다.

2 시험설계, 공시동물 및 사양관리

본 시험을 위해 개시체중이 7.16±0.88kg인 이유자돈(Landrace×Yorkshire×Duroc, 23±3일령) 280두를 공시하여 성별과 체중에 따라 5처리 4반복, 반복당 14두씩 완전임의 배치하였다. 처리내용은 감자단백의 MIC 수준에 근거하여 항생제(PC, positive control; 기초사료+0.15% apramycin과 0.10% colistin sulfate), 대조구(NC, negative control; 기초사료) 그리고 감자단백을 0.25, 0.50 및 0.75% 첨가구로 구분하였다. 사양시험은 총 4주간(0～28일) 실시하였고 시험사료는 단계별 영양소 요구량(NRC, 1998)에 맞추어 Phase I(0～14일)와 Phase II(14～28일)로 구분하여 배합하였으며 사료배합비 및 기타 조사항목의 재료 및 방법은 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

3. 결과 및 고찰

가. MIC 측정

본 시험에 사용된 골든밸리 감자단백의 최소성장억제농도(MIC)의 측정결과는 표 29와 같다. 네 가지 균주에 대한 실험에서 감자단백의 MIC는 1,250ppm으로 판단되었다. 본 시험에서 감자단백의 사료내 첨가수준은 고구밸리와의 비교를 위하여 같은 수준으로 설정하였다.

[표 29]

나. 사양성적과 영양소 소화율

사양성적 결과를 표 30에 나타내었다. Phase I와 Phase II에서 항생제 처리구와 감자단백급여구의 일당증체량(ADG), 일당사료섭취량(ADFI) 그리고 사료요구율(FCR)은 차이를 나타내지 않았다(p>0.05). 감자단백과 대조구를 비교하였을 때에도 급여수준에 따른 성장촉진효과가 나타나지 않았지만(p>0.05) FCR에서는 개선경향을 나타냈다(p=0.055). 전체기간으로 보았을 때 항생제 처리구는 감자단백급여구에 비하여 ADG와 FCR이 개선되었고 감자단백급여 수준이 높을수록 FCR이 개선되었다(p<0.05).

[표 30]

영양소 소화율시험 결과를 표 31에 나타내었다. Phase I에서 건물의 소화율은 항생제 처리구가 감자단백급여구에 비하여 높았고(p<0.05) 감자단백급여구와 대조구의 비교에서는 개선효과가 나타나지 않았다. Phase II에서는 항생제 처리구의 건물과 조단백질 소화율이 감자단백급여구보다 높았고 감자단백급여 수준이 증가할수록 건물 소화율이 개선되었다(p<0.05). 항생제와 감자단백급여에 의한 회장 외관상 아미노산 소화율에서는(표 32) 처리구간에 차이가 나타나지 않았다(p>0.05).

[표 31]

[표 32]

항생제의 성장촉진효과는 이미 많이 보고되어 있으며(Kendall 등, 2000; Lewis와 Southern, 2001) 본 실험상의 고구밸리 감자단백의 급여는 대조구에 비하여 사료요구율 개선효과를 나타냈다. 본 실험의 결과에서도 골든밸리 감자단백의 급여는 Phase II의 건물 소화율을 개선하였다.

다. 장 및 분중 미생물

표 33에서는 주간단위로 채집한 분중의 미생물 수치를 나타냈다. 총균수(14, 21 및 28일), 대장균(21과 28일) 그리고 포도상구균(14, 21 및 28일)수치는 항생제 처리구가 감자단백급여구에 비하여 적었다(p<0.05). 또한, 21일째의 총균수와 포도상구균수치 그리고 28일째의 총균수, 대장균 및 포도상구균 수치는 감자단백급여 수준이 높을수록 대조구에 비하여 감소되었다(p<0.05).

[표 33]

대장의 각 부분 내용물의 미생물 수치를 측정한 결과는 하기 표 34와 같다. 맹장의 총균수와 포도상구균 수치, 직장의 총균수 및 결장의 대장균 수치는 항생제 처리구가 감자단백급여구보다 낮았고; 맹장에서 감자단백급여구는 대조구에 비하여 결장 및 직장의 총균수와 포도상구균 수치 그리고 결장의 대장균 수치가 감자단백 급여수준이 높아짐에 따라 감소되었다(p<0.05).

[표 34]

이러한 결과는 많이 알려진 항균펩타이드의 항균효과(Wang 등, 2006)에 기인한 것으로 판단되며 미생물 발효에 의한 에너지 손실을 줄인 것으로 사료된다.

라. 면역반응과 혈액성상

항생제 처리와 감자단백의 급여가 자돈의 면역반응과 혈액성상에 미치는 영향은 표 35와 36과 같다. 세포매개성면역반응과 체액성면역반응 시험에서 각 처리구간에 유의적인 차이가 나타나지 않았다(p>0.05). 또한 혈액성상조사에서도 항생제와 감자단백의 첨가효과는 관찰되지 않았다(p>0.05). 이러한 결과는 항균펩타이드가 포함된 감자단백은 주요하게 항균기능을 나타내는 것이다.

[표 35]

[표 36]

마. 장기무게, 소장의 형태 및 간과 근육의 단백질과 수분함량

항생제 처리와 감자단백급여가 간 그리고 위, 소장 및 대장의 내용물을 포함한 무게와 제거한 무게에 미치는 영향에 대하여 조사하였는데(표 37) 각 처리구간에 차이는 관찰되지 않았다(p>0.05). 또한 소장 각 부분(십이지장, 공장 및 회장)의 형태(villus height, crypt depth, villus height:crypt depth ratio 및 villus width; 표 38)와 간과 뒷다리 근육의 수분과 조단백질 함량을 조사한 결과(표 39)에서도 처리구간에 변화는 나타나지 않았다(p>0.05).

이유후 소장점막의 상태는 장의 건강을 나타내는 지표이기도 하다(Bosi 등, 2003). 또한 항생제와 락토페린(lactoferrin)의 첨가는 장 건강을 촉진하여 성장능력을 개선한다는 보고가 있지만(Wang 등, 2006), 본 실험의 결과에서는 항생제 처리와 감자단백급여에 의한 효과가 나타나지 않았다.

[표 37]

[표 38]

[표 39]

따라서 본 연구결과에 의하면, 골든밸리에서 추출된 감자단백은 항균기능을 나타내는 저분자 단백질이 병원성 미생물에 대한 방어력을 조절하는 것으로 판단된다.

4. 결론

본 실험의 결과 이유자돈에서 감자단백(골든밸리)의 급여는 항생제의 효과에는 도달하지 못하였지만 감자단백의 첨가수준이 높을 때에는 항생제와 비슷한 결과를 나타냈다. 또한, 감자단백급여는 대조구에 비하여 미생물성장을 억제하는 것으로 나타났으며 영양소 소화율을 개선하여 사양성적을 향상시키는 것으로 판단된다. 따라서 항균펩타이드(Potide-G)가 함유된 기능성 신품종 감자단백의 급여는 사료용 항생제를 대체할 수 있을 것으로 판단된다.

<실시예 4> 고구밸리로부터 추출된 정제감자단백 사료가 자돈의 항생제 대체에 미치는 효과

1. 서 론

상기 실시예 1 ~ 3에서 살펴보듯 고구밸리와 골든밸리에서 추출된 감자단백을 자돈과 육계에 급여하였을 때 분과 장내 미생물 성장을 억제하는 것으로 나타났으며 소화율 개선과 성장촉진작용도 있는 것으로 사료된다. 그러나 항균활성과 성장촉진효과에 있어서 고구밸리는 골든밸리 보다 더 높은 성적을 기록하였다. 이러한 항균기능과 성장촉진작용은 저분자 단백질인 항균펩타이드(Potamin-1과 Potide-G)의 작용으로 판단되며 고구밸리의 감자단백 항균능력이(MIC test) 골든밸리에 비하여 더 높기 때문에 사양시험결과에서도 더 좋은 성적을 나타낸 것으로 사료된다.

이러한 전제하에서 본 실험에서는 고구밸리를 이용하여 항균활성이 낮은 큰 단백질분자를 제거한 정제감자단백(refined potato protein, RPP)의 급여가 자돈과 육계의 성장능력, 영양소 소화율, 아미노산 회장소화율, 분과 장내 미생물, 면역반응 및 소장의 형태에 미치는 영향을 조사하기 위하여 2차례 사양실험을 실시하였다.

2. 재료 및 방법

가. 정제감자단백의 추출과 MIC 테스트

본 시험에 사용된 감자(고구밸리; Solanum tuberosum L. cv. Gogu valley)는 (주)포테이토밸리에서 제공되었으며 상대습도 90～95%, 4℃ 조건에서 저온보관되었다.

정제감자단백(Refined potato protein, RPP)의 추출을 위하여 우선 감자단백(CPP) 추출과정을 통하여 선별된 감자를 세척 후 햄머밀로 분쇄작업을 거치고 1차 원심분리(13,000 rpm, 15분)하여 전분을 제거하였으며; 수용성 단백질이 용해된 상층액은 다시 2차 원심분리(5,000 rpm, 20분)기를 이용하여 여과지(10,000 MWCO membrane)를 장착하고 큰 분자 단백질을 제거하였으며 수거한 용액은 동결건조하여 정제감자단백을 획득하였다.

나. 시험방법과 시험설계

본 시험에서는 개시체중이 5.96±0.66㎏인 이유자돈(Landrace×Yorkshire×Duroc, 23±3일령) 280두를 공시하여 성별과 체중에 따라 5처리 4반복, 반복당 14두씩 완전임의 배치하였다. 처리내용은 항생제와의 비교와 감자단백의 MIC 수준에 근거하여 항생제(PC, positive control; 기초사료+0.15% apramycin과 0.10% colistin sulfate), 대조구(NC, negative control; 기초사료) 그리고 정제감자단백 200, 400 및 600ppm 첨가구로 구분하였다. 시험사료는 단계별 영양소 요구량(NRC, 1998)에 맞추어 Phase I(0～14일)와 Phase II(14～28일)로 구분하여 배합하였으며(표 47과 48) 기타조사항목의 재료및 방법은 실험 1과 같게 진행되었다.

시료채취와 각 항목 조사방법도 실험1과 같은 방법으로 진행하였으며 면역반 응조사를 위한 세포매개성면역반응시험에서는 PBS와 PHA-P를 접종한 후 6, 24 및 48시간째에 동일한 지점의 피부두께를 측정하여 비교에 사용하였다.

3. 결과 및 고찰

가. MIC 측정

실시예 1과 동일한 균주에 대하여 정제감자단백의 첨가량을 전체 사료조성물에 대하여 200, 400 및 600ppm으로 첨가한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하여 MIC를 측정하여 그 결과를 표 40에 나타내었다. 그 결과 정제감자단백의 농도가 150ppm일 때 4가지 균의 성장을 모두 억제하는 것을 관찰할 수 있었다. 그러므로 정제감자단백은 감자단백의 MIC 500ppm보다 항균활성이 높게 나타났으며 정제과정에서 큰분자 단백질이 제거되어 항균활성이 높은 작은 분자의 단백질 함량이 높은 것으로 판단된다. 따라서 본 시험에서는 MIC 결과에 근거하여 200, 400 및 600ppm 세 수준을 사용하였다

[표 40]

나. 사양성적과 영양소 소화율

사양성적과 영양소 소화율 Phase I과 Phase II로 나누어 진행하여 사양성적 결과를 표 41에 나타내었다.

[표 41]

Phase I에서 항생제 처리구는 정제감자단백급여구에 비하여 사양성적개선효과를 나타냈다(p<0.01). 정제감자단백의 급여는 대조구에 비하여 사료요구율 개선효과를 나타냈다(p<0.05). Phase II 에서도 항생제 처리구는 정제감자단백급여구에 비하여 사양성적이 개선되었으며 전체기간으로 볼 때 항생제의 급여는 뚜렷한 개선효과를 나타냈다(p<0.01). 또한, 정제감자단백의 급여수준이 높을수록 대조구에 비 하여 Phase II의 일당증체량이 유의적으로 개선되었다(p<0.05).

영양소 소화율 시험결과는 표 42와 같다. 항생제 처리구와 정제감자단백급여구를 비교할 때 Phase I과 Phase II의 칼슘(Ca) 소화율은 항생제 처리구가 정제감자단백급여구에 비하여 높았으며(p<0.05) 정제감자단백급여수준에 의한 영양소 소화율 개선효과는 나타나지 않았다(p>0.05). 또한 회장의 외관상 아미노산 소화율(표 43)에서도 항생제 처리와 정제감자단백급여에 의한 차이가 나타나지 않았다(p>0.05).

[표 42]

[표 43]

다. 장 및 분중 미생물

정제감자단백급여에 의한 분중 미생물 수치의 변화는 표 44와 같다. 항생제 처리구와 정제감자단백급여구를 비교할 때 7, 14, 21 그리고 28일째의 총균수, 대장균 및 포도상구균의 수치는 항생제 처리구가 정제감자단백급여구에 비하여 유의하게 적었다(p<0.01). 또한 정제감자단백급여구는 대조구에 비하여 첨가수준이 높아질수록 7, 14, 21 그리고 28일째의 총균수, 대장균 그리고 포도상구균의 수치가 적게 나타났다(p<0.05).

[표 44]

표 45는 항생제 처리와 감자단백의 급여가 자돈의 대장내 미생물(28일째)에 대한 영향을 나타냈다. 맹장, 결장 그리고 직장의 총균수, 대장균 및 포도상구균의 수치는 항생제 처리구가 정제감자단백급여구보다 적었다(p<0.01). 또한 정제감자단백 급여수준이 높을수록 대조구에 비하여 결장의 총균수와 포도상구균수치 그리고 직장의 총균수와 대장균 수치가 유의적으로 감소하였다(p<0.05). 이상의 결과로부터 정제감자단백의 급여는 항생제의 효과에는 미치지 못하였지만 미생물의 성장을 효과적으로 억제하는 것으로 판단된다.

[표 45]

본 실험에서도 항생제의 급여는 사양성적을 개선한다는 보고(Kendall 등, 2000; Lewis와 Southern, 2001)와 일치한 결과를 나타냈지만 영양소 소화율에서는 항생제 효과가 나타나지 않았다. 정제감자단백급여구에서도 Phase I의 사료요구율과 Phase II의 일당증체량 개선효과가 나타났지만 영양소 소화율의 차이는 나타나지 않았다. 이러한 결과는 항생제 처리와 감자단백의 급여는 자돈의 체내 유해미생물의 성장을 유의적으로 억제하여 병원성 미생물에 의한 성장지체가 나타나지 않은 것으로 사료된다. 또한 본시험의 항생제 처리구는 두 가지 항생제를 사용하였고, 정제감자단백의 첨가량은 감자단백의 MIC 측정결과와 사료내 첨가량으로 볼 때 다소 적게 사용된 것으로 판단되며 사용수준을 높여준다면 더 좋은 효과를 기대할 수 있을 것으로 사료된다.

라. 면역반응과 혈액성상

정제감자단백급여와 항생제 처리에 따른 면역반응 조사와 혈중 백혈구, 적혈구계 및 혈소판계 조사의 결과는 표 46 및 47과 같다. 세포매개성 측정결과에서 PHA-P를 접종한 부위는 빨갛게 홍반을 형성하였으나 PBS만 접종한 부위에는 거의 변화가 없는 것이 관찰되었다. 그러나 각 종창정도의 변화에서 항생제 처리와 정제감자단백급여에 따른 효과는 나타나지 않았다(p>0.05).

[표 46]

[표 47]

면양혈액(S-RBC)에 대한 항체형성능과 헐액성상조사에서도 처리구간에 차이가 나타나지 않았다. 항균펩타이드는 면역계에 영향을 준다는 보고(Hunter 등, 2002)와는 달리 본 실험에서는 면역반응에 효과를 나타내지 않는 것으로 나타나 더 깊은 연구가 필요할 것으로 사료된다.

마. 장기무게, 소장의 형태 및 간과 근육의 단백질과 수분함량

소화장기인 간장, 위, 소장 그리고 대장의 체중에 대한 백분율 퍼센트로 장기무게를 조사하였는데(표 48), 각 처리구간에는 차이가 없었다(p>0.05). 비슷한 결과로, 소장 각 부분(십이지장, 공장 및 회장)의 융모길이(villus height, VH), 융와높이(crypt depth, CD), 융모길이와 융와높이의 비례(CH:CD) 그리고 융모넓이(villus width, VW)를 조사한 결과(표 49) 처리구간에 변화가 없었다(p>0.05). 또한, 간과 뒷다리 근육의 조단백질과 수분함량을 조사한 결과(표 50)에서도 항생제 처리와 정제감자단백급여에 의한 효과는 나타나지 않았다(p>0.05).

[표 48]

[표 49]

[표 50]

4. 결과

MIC 결과로부터 보면 정제감자단백은 감자단백에 비하여 항균활성이 3배 이상 높다. 실제로 사양실험에서도 감자단백은 MIC의 5배, 10배, 15배를 첨가한 반면 정제감자단백은 1.3배, 2.6배 4배로 소량 첨가되었지만 병원성미생물의 성장을 억제하는 효과가 나타났다. 따라서 사료에 첨가하여 급여하는 경우에도 정제감자단백의 효과가 감자단백에 비하여 우수하다고 판단된다.

<실시예 5> 정제감자단백을 투여한 육계에서의 살모넬라에 감염에 대한 효과

1. 실험방법

강병원성의 날리딕스산(Nalidixic acid) 저항성이 있는 살모넬라 갈리나럼(Salmonella Gallinarum)을 영양배지(DIFCO, USA)에 넣고 37℃ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 배양액을 OD₆₅₀ 값을 측정하고 배양액을 10^-1부터 10^-10까지 10배씩 희석하여 100㎕씩 각 희석별로 영양배지에 도말한 후 배양하며 CFU를 측정하였다.

부화된 병아리를 군당 10마리씩 대조군, 항생제가 첨가된 사료를 급여한 군, 정제감자단백(정제감자단백, RPP)을 각각 200, 400, 600ppm을 첨가한 사료를 급여한 군 등 모두 5군으로 나눈 뒤 3주 동안 해당 군에 맞게 사료를 급여하였다(표 51). 이때 대조군의 경우 항생제가 첨가되지 않은 사료를 충분히 급여하였고 항생 제 첨가군의 경우 아빌라마이신(avilamycin) 0.05%가 함유된 사료를 급여하였다. 해당 사료를 충분히 급이 시킨 후 병아리 당 3×10⁸CFU/㎖의 살모넬라 갈리나럼을 1.2% NaHCO₃(pH7.8) 영양배지 10㎖에 혼합하여 경구로 접종하였다. 접종 후 매일 임상증상 (설사유무를 중심으로 하여)과 폐사정도를 관찰하였다.

공격접종 후 분변내의 살모넬라 갈리나럼의 집락수의 변화를 관찰하기 위해 접종 후 1, 2, 3주에 각 병아리에서 분변을 채취하여 분변 1g을 테트라티오네이트 배지(TT broth) 10㎖에 넣고 충분히 혼합하여 42℃에서 진탕하면서 24시간 증균 배양하였다. 증균 배양 후 날리딕스산이 첨가된 MacConkey agar, XLT4 agar에 도말하여 37℃에서 16-24시간 동안 배양하였고 집락수를 측정하였다. 배양 후 의심된 콜로니는 API 20E kit로 살모넬라 갈리나럼인지를 확인하였다.

[표 51]

2. 결과 및 고찰

감자단백 또는 항생제를 첨가한 사료 및 대조군은 항생제가 첨가가 되지 않은 동일한 사료를 급여하였다. 3주령의 육계를 5개의 군으로 나눈 뒤 각 군당 S살 모넬라 갈리나럼을 경구로 접종한 후 공격접종 후 3주 동안 매일 임상증상(설사를 중심으로 관찰)의 유무를 관찰하였고 폐사되는 수를 관찰하였다. 또한 공격접종 전. 접종 후 1주. 2주. 3주후에 분변으로부터 살모넬라 갈리나럼의 집락수를 측정하였다. 임상증상의 발현은 항생제를 첨가한 사료를 급여한 군을 제외한고는 모든 군에서 나타났다. 대조군에서는 접종 1일 후부터 설사가 나타나며 공격 접종후 7일째 전부 설사증상이 관찰되고 최종 폐사율이 40%에 달하였다(표 52). 정제감자단백을 첨가한 사료를 급여한 군에서는 접종 후 1일 후부터 설사가 나타나며 7일후에 정제감자단백율 200ppm에서 60%설사 나타나며 400ppm에서 30%. 600ppm에서 10% 설사 나타났다. 항생제를 첨가한 사료를 급여한 군에서는 설사증상은 관찰되지 않았다. 접종 2주 후부터 설사증상을 관찰할 수가 없었다. 접종 3주까지 폐사는 전혀 나타나지 않았다. 폐사가 나타나지 않았으나 감자단백을 첨가한 사료의 비율을 따라서 설사증상은 감소되는 것으로 나타났다.

따라서 본 연구의 결과 감자단백은 예방적인 효과가 있는 것으로 나타났고 경도의 감염시 효과적일 것으로 추측된다.

[표 52]

본 발명의 고구밸리 또는 골든밸리로부터 추출된 감자단백 또는 정제감자단백을 함유한 사료조성물은 가축의 생장성을 높일 뿐 아니라, 강력한 항균활성을 가지므로 항균제 대체용 사료조성물로서 농업분야에 매우 유용한 발명이다.

이상에서 본 발명은 기재된 구체 예에 대해서만 상세히 기술되었지만, 본 발명의 기술상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백 한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연하다.

Claims (11)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 1) 고구밸리(Solanum tuberosum L cv. Gogu Valley)의 괴경을 분말로 분쇄하는 단계;

   2) 상기 분말을 1차 원심분리하여 전분을 제거하는 단계;

   3) 상기 전분이 제거된 고구밸리를 2차 원심분리하여 수용성 단백질이 용해된 상층액을 회수하는 단계;

   4) 상기 회수된 상층액을 여과한 후, 여과된 용액을 건조하여 정제감자단백을 수득하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 정제감자단백의 제조방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 1차 원심분리는 11,000 ~ 14,000 rpm으로 10 ~ 20분간 진행하는 것을 특징으로 하는 상기 정제감자단백의 제조방법.
8. 제6항에 있어서, 상기 2차 원심분리는 4,000 ~ 6,000 rpm으로 25 ~ 35분간 진행하는 것을 특징으로 하는 상기 정제감자단백의 제조방법.
9. 제6항에 있어서, 상기 4)단계는 셀룰로오스 여과막을 이용하여 상기 상층액을 여과하는 것을 특징으로 하는 상기 정제감자단백의 제조방법.
10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 정제감자단백을 유효성분으로 함유한 것을 특징으로 하는 항생제 대체용 사료조성물.
11. 제10항에 있어서, 상기 정제감자단백은 전체 사료조성물 100중량%에 대하여 0.02 ~ 3 중량%가 함유된 것을 특징으로 하는 항생제 대체용 사료조성물.