KR20160055825A - 인플루엔자 백신 및 치료 - Google Patents

Abstract

본 발명은 일반적으로, 인플루엔자 바이러스에 의한 감염에 영향을 받기 쉬운 개인의 예방을 위한 치료를 위한 항-M1 폴리펩티드 항체의 발생에 대한 항원 및/또는 백신으로서 사용될 수 있는 M1 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 항-M1 폴리펩티드 항체는, 인플루엔자 바이러스에 감염된 개인의 치료를 위해 유용하거나, 효과적인 항체 반응을 발생할 수 없는 면역-억제된 개인(immune-suppressed individuals)에 대해, 또는 인플루엔자 바이러스에 의한 감염에 영향을 받기 쉬운 개인의 예방을 위한 치료를 위해 유용하다.

Description

인플루엔자 백신 및 치료{INFLUENZA VACCINE AND THERAPY}

관련된 출원에 대한 상호 참조

본 출원은, 이의 전체로 참고문헌으로 본원에 포함된 내용인, 2013년 9월 23일에 출원된 US 가출원 일련번호 61/881,325의 이익을 청구한다.

염기 서열, 표 또는 컴퓨터 프로그램에 대한 참고

염기 서열의 공식적인 복사본은, 11 킬로바이트의 크기 및 2014년 9월 21일의 생성 날짜, "Engn0005_25.txt"의 파일명으로, EFS-Web을 통해 ASCII 형식화된 텍스트 파일로서 명세서와 동시에 제출된다. EFS-Web을 통해 제출된 염기 서열은 명세서의 일부이고, 이의 전체가 본원의 참고문헌으로 본원에 포함된다.

기술 분야

본 발명은, M1 폴리펩티드, 상기 M1 폴리펩티드를 함유하는 백신, 상기 M1 폴리펩티드에 결합하는 항체, 및 상기 항체를 사용한 인플루엔자 치료에 관한 것이다. 본 발명의 상기 항체 및 폴리펩티드는 진단 방법으로 또한 사용될 수 있다.

본 발명의 배경

인플루엔자는, 호흡기관의 비말 전파(respiratory droplet transmission)를 통해 확산되는 인플루엔자 바이러스에 의해 야기되는 급성, 전염성의 호흡기 질환이다. 복잡하지 않은 인플루엔자는, 일주일 내에 일반적으로 해결하는 체질상의 및 호흡기 증상의 갑작스러운 발병에 의해 특징지어진다. 특정한 사람에게, 인플루엔자는, 존재하는 의학적 증상을 악화시킬 수 있고, 생명을 위협하는 합병증을 유도할 수 있다. 인플루엔자 바이러스는, 인간, 개, 새, 박쥐 및 가축에 영향을 미치는, 전세계적으로 가장 흔히 볼 수 있는 바이러스 중의 하나이다. 인플루엔자는 또한, 중장년층 및 어린 사람들에게 현저한 영향을 미친다. 인플루엔자는 경제적인 부담, 사망률 및 현저한 사망률을 결과적으로 야기한다.

인플루엔자 바이러스는 오르토믹소바이러스 패밀리(Orthomyxoviridae family)에 속하는 분할된 게놈을 가지는, 감싸진, 네거티브 센스(negative-sense), RNA 바이러스이다. 이들은, 세 가지 뚜렷한 타입으로 이들의 코어 단백질을 기반으로 분류된다: A, B, 및 C (Cox, N. J. and Fukuda K., Influenza. Infect. Dis. Clin. North Am. 12:27-38, 1998, 이의 전체로 참고문헌에 의해 본원에 포함됨). 인플루엔자 A 바이러스는 포유동물 및 조류 종의 범위에 영향을 미칠 수 있는 반면에, 타입 B[숙주는 인간 및 물개(seals)를 포함한다] 및 C는 인간으로 기본적으로 제한된다. 인플루엔자 A 및 B 바이러스는, 대부분 병원성인 타입 A를 가지는 인간 질환에 대해 주로 책임이 있다. 인플루엔자 A 및 B 바이러스의 주요한 항원 결정기(antigenic determinants)는 두 가지의 표면 당단백질이다: 뉴라미니다아제(neuraminidase, NA) 및 혈구응집소(HA)이고, 둘 다 인간에서 면역 반응을 유도할 수 있다. HA는 수용체 결합 및 막 융합을 포함한다. NA는 감염된 세포로부터 바이러스 자손(virus progeny)의 분열을 용이하게 하고, 바이러스성 집합(viral aggregation)을 예방하고, 상기 점막의 호흡기 상피를 통한 이동을 돕는다.

독감 바이러스의 세 가지 타입(A, B 및 C)은 현재 알려져 있고, 상기 타입 A 바이러스는 동물 및 인간 상태에 책임이 있는 반면에, 타입 B 및 타입 C 바이러스는 특히 인간에 대한 병원성이 있는 것이다. 상기 타입 A 바이러스는, 상기 바이러스 막(viral envelope)의 주요한 당단백질인, 혈구응집소(HA) 및 뉴라미니다아제(NA)의 항원 구조에 따른 서브타입(subtype)으로 세분화된다. HA의 18가지 서브타입(H1 내지 H18) 및 NA의 9가지 서브타입(N1 내지 N11)가 두드러진다. 따라서, 타입 A 바이러스의 서브타입은, 상기 바이러스 막에 존재하는 상기 HA 서브타입 및 상기 NA 서브타입에 의해 정의된다. 야생의 새 및 박쥐는 모든 인플루엔자 A 서브타입의 보균자(reservoir)를 구성한다. 인플루엔자 바이러스 타입 A의 특정한 서브타입은, 풍토적으로 또는 유행성으로(매년 전염병) 국내 조류(H5N1 및 H9N2를 포함하는 다양한 서브타입), 말(주로 H3N8), 돼지(주로 H1N1, H3N2 및 H1N2) 및 또한 인간(주로 H1N1 및 H3N2)를 감염시킨다. 개, 고양이 및 그 밖의 야생종은 또한, 특정한 서브타입(개에서 H3N8 및 H5N1; 고양이에서 H5N1)으로 때때로 감염될 수 있다.

대유행 기간의 인플루엔자 백신은, 번식력 있는 암탉의 달걀에서 성장되고, 비활성된 또는 살아있는 약화된 인플리엔자 백신(live attenuated influenza vaccines)인 바이러스로부터 제조된다. 비활성된 독감 백신은 항원 조제의 세 가지 가능한 형태로 구성되어 있다: 비활성된 전체 바이러스, 정제된 바이러스 입자가 상기 지질막(소위 "스플리트(split)" 백신) 또는 정제된 HA 및 NA[서브유닛 백신(subunit vaccine)]을 가용화하기 위해 세제 또는 그 밖의 시약으로 붕괴되는 서브-비리온(sub-virions). 이러한 비활성화된 백신은, 근육내(i.m.), 피하(s.c), 또는 비강내(i.n.)로 현재 제공된다. 세계 보건 기구(WHO) 권고에 따르면, 계절에 따른 인플루엔자 백신은 세 가지의 공동-순환하는 인간 스트레인(co-circulating human strains)으로부터의 45 ㎍의 HA 항원을 일반적으로 함유한다(단순 방사 면역확산법(SRD)에 의해 측정된 바와 같은)(Wood, J.M. et al., "An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza hemagglutinin antigen: adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines," J. Biol. Stand. 5:237-247, 1977; Wood, J.M. et al., "International collaborative study of single radial diffusion and immunoelectrophoresis techniques for the assay of hemagglutinin antigen of influenza virus," J. Biol. Stand. 9:317-330, 1981; both publications incorporated herein by reference in their entirety). 이들은 일반적으로, 두 가지의 인플루엔자 A 바이러스 스트레인 및 하나의 인플루엔자 B 스트레인(예를 들어, H1N1, H3N2 및 B)으로부터 유도된 항원을 함유한다. 대부분의 경우에서 표준 0.5 ml 주사가능한 투여량은, 각각의 스트레인으로부터 (적어도) 15 ㎍의 혈구응집소 항원 구성성분을 함유한다. 백신 접종은 매년 인플루엔자 전염병을 조절하는데 중요한 역할을 한다. 게다가, 전 세계적인 유행 동안에, 항바이러스성 약물은 필요성을 포함하기에 충분하거나 효과적이지 않을 수도 있고, 인플루엔자의 위험에서 개인의 수가 대유행기 기간에서보다 더 클 것이다. 보다 큰 양으로 생산될 가능성 및 효율적인 분포 및 투여 가능성을 가지는 보다 긴 지속성, 폭넓게 보호하는 백신의 개발은, 본 발명의 목적이다.

인플루엔자 바이러스는 US에서 200,000 일 이상의 입원 기간 및 20,000 명의 사망을 유도하는, 매년 수백만 명을 감염시킨다. 게다가, 인플루엔자의 치명적인 스트레인(lethal strains)은, 치료의 약간의 효과적인 수단으로, 기회(occasion)(예를 들어, 1918년의 스페인 독감)로 발생한다. 계절에 따른 인플루엔자 백신은, 원인이 되는 스트레인이 상기 백신 제형의 시간으로부터 변화되지 않는다면, 몇몇의 보호를 제공한다. 혈구응집소 및 뉴라미니다아제의 상기 표면-발현된 바이러스성 단백질에서의 높은 가변성은 매년 재공식화를 지시한다. 상기 사람들(population)은, 효과적인 보호를 위해 매년 재-면역화되어야 한다. 이러한 필요성은 생산의 비용이 높고, 유효성은 상기 백신의 각각의 바이러스성 구성요소에 대한 역가에 따라 달라진다(4 가지까지의 상이한 바이러스가 상기 현재 백신을 포함한다).

달걀보다는 항원 생산의 재조합 세포 배양 방법이 현재 사용되고 있고, 두 가지의 백신 생산물은 최근에 FDA 승인을 받았다. 플루셀박스(Flucelvax)는 포유동물의 세포 배양에 의해 제조된 재조합 바이러스 제제(3 가지의 불활성 바이러스)이다. Flubloc®은 곤충 세포 배양에 의해 제조된 재조합 HA 백신(3 가지의 상이한 HA 단백질)이다. 이러한 생산물은, HA 기초된 백신과 연관된 항원 변이(antigenic drift)의 쟁점을 다루지 않지만, 백신 공급의 문제점을 해결하도록 시도한다.

매년 효능을 유지할 새로운 인플루엔자 백신을 제공함으로써 매년 인플루엔자 백신 개발에 대한 비용 및 필요성을 극복하는 것이 본 발명의 목적이다. 새로운 인플루엔자 스트레인에 대항하는 보호를 제공할 인플루엔자 백신을 제공하는 것이 또한, 본 발명의 목적이다. 인플루엔자로 이미 감염된 개인을 치료하거나 또는 개인의 예방학적인 처리를 위한 인플루엔자 치료를 제공하는 것이 본 발명의 추가적인 목적이다.

M1 폴리펩티드에 결합된 항체 또는 항체 단편(antibody fragment)을 포함하는 조성물을 사용하여 인플루엔자로 감염된 환자에서 독감 증상의 지속 기간을 감소시키고, 및/또는 감염된 환자에서 인플루엔자 감염의 엄격함(severity)을 감소시키는 것이 또한, 본 발명의 목적이다.

본 발명의 요약

본 발명은, 인플루엔자의 M1 단백질의 일부에 부합하는 폴리펩티드에 관한 것이다(The invention relates to polypeptides corresponding to a portion of an M1 protein of influenza). 이러한 폴리펩티드는 상기 M1 단백질의 C-말단 영역으로부터의 M1 서열에 부합한다. 실시형태에서, 인플루엔자 바이러스에 노출된 표면인 상기 M1 폴리펩티드 서열의 C-말단 부분은 면역 보호를 위한 타겟(target)이다. 실시형태에서, 상기 폴리펩티드는, 상기 M1 단백질의 C-말단 부분의 아미노산 잔기 215 내지 252의 범위 내에 있다. 실시형태에서, 상기 폴리펩티드는, 상기 M1 단백질의 아미노산 잔기 215 내지 241의 범위 내에 있다. 다른 실시형태에서, 상기 M1 폴리펩티드는 상기 M1 단백질의 아미노산 잔기 220 내지 238의 범위 내에 있다. 실시형태에서, 상기 M1 폴리펩티드는, 상기 M1 단백질의 잔기 215 내지 252의 범위에서 발견된 상기 M1 폴리펩티드의 7 내지 37 개의 인접한 아미노산을 포함한다(the M1 polypeptide comprises 7-37 contiguous amino acids of the M1 polypeptide found in the span of residues 215-252 of the M1 protein). 실시형태에서, 상기 M1 폴리펩티드는 적어도 15 내지 50 개의 아미노산을 포함한다. 실시형태에서, 상기 M1 폴리펩티드는, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 및/또는 50 개의 아미노산들을 포함한다. 실시형태에서, M1 폴리펩티드는, 인플루엔자에 걸리기 쉬운 유기체에서 보호하는/치료상의 면역 반응을 생산하기 위해 사용된다. 실시형태에서, 상기 유기체는 인간, 개, 또는 상업적으로 가치가 큰 가축이다. 실시형태에서, 상기 유기체는 인간이다. 실시형태에서, 상기 M1 폴리펩티드 구성(composition)은, 상기 M1 폴리펩티드에 대항하는 B 세포 기억 면역 반응(B cell memory response), CD4 T-세포 면역 반응과 같은 T-세포 면역 반응 및 체액의 면역 반응 중의 적어도 하나를 유도할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 상기 M1 폴리펩티드 서열에 특이적인 항체에 관한 것이다. 실시형태에서, 상기 항-M1 폴리펩티드 항체는, 인플루엔자 바이러스에 의해 감염되거나 또는 감염될 수도 있는 유기체에서 인플루엔자의 예방 및 또는 치료를 위해 사용된 것이다. 실시형태에서, 상기 유기체는 인간, 개, 또는 상업적으로 가치가 큰 가축이다. 실시형태에서, 상기 유기체는 인간이다. 실시형태에서, 항-M1 폴리펩티드 항체 또는 항체들로의 상기 유기체의 치료는 인플루엔자 증상의 기간 및/또는 인플루엔자 증상의 심각성(severity)을 감소시킨다.

실시형태에서, 상기 항-M1 폴리펩티드 항체는, 인플루엔자로 감염을 예방하거나, 또는 인플루엔자로 향후의 감염을 개선하기 위해, 유기체의 치료에 사용된다. 실시형태에서, 상기 유기체는 인간, 개, 또는 상업적으로 가치가 큰 가축이다. 실시형태에서, 상기 유기체는 인간이다. 실시형태에서, 상기 항-M1 폴리펩티드 항체는 유기체에서 수동 면역(passive immunity)을 발생하도록 예방적으로 사용된다.

실시형태에서, 상기 항-M1 폴리펩티드 항체는 유기체에서 1 내지 4 주 또는 그 이상의 반감기를 가진다. 실시형태에서, 상기 항-M1 폴리펩티드 항체는 유기체에서 2 주의 반감기를 가진다. 실시형태에서, 상기 항-M1 폴리펩티드 항체로부터의 유기체에서 발생된 수동 면역은, 적어도 2 내지 3 의 반감기 동안에 지속된다. 실시형태에서, 상기 항-M1 폴리펩티드 항체로부터의 유기체에서 발생된 상기 수동 면역은, 1 내지 6 주, 또는 2, 3, 4, 5 또는 6 개월 동안 지속한다.

실시형태에서, 상기 항-M1 폴리펩티드 항체는, 4 내지 12 주의 반감기를 가지도록 설계된 것이다. 실시형태에서, 상기 항-M1 폴리펩티드 항체는 키메라(chimeric), 인간화된(humanized), 또는 humaneered®이거나, 또는 인간 항체이다. 실시형태에서, 상기 항-M1 폴리펩티드 항체는 유기체에서 반감기를 증가시키는 분자와 결합된 것이다. 실시형태에서, 상기 항-M1 폴리펩티드 항체는 상기 항체의 반감기를 증가시키기 위해, 폴리에틸렌 글리콜 또는 또 다른 적절한 중합체와 결합된 것이다.

도 1은, 2B-B10-G9에 의한 PR/8의 플라크 저해 검정(plaque inhibition assay)을 나타낸 것이다.
도 2는, 2B-B10-G9에 의한 추가적인 인플루엔자 스트레인(influenza strains)의 플라크 저해 검정을 나타낸 것이다.

본 발명의 상세한 설명

본 발명은 이로 제한하는 방식이 아닌, 하나의 예의 방식으로 설명된 것이다.

정의

본원에 사용된 바와 같이, "항체"는, 결합 단백질로서 기능적으로 정의되고, 면역글로불린 인코딩하는 유전자(immunoglobulin encoding gene)의 상기 프레임워크 영역(framework region)으로부터 유도된 것으로서 인식되는, 아미노산 서열을 포함하는 것으로서 구조적으로 정의된 단백질을 나타낸다. 항체는 면역글로불린 유전자의 단편 또는 면역글로불린 유전자에 의해 실질적으로 인코딩된 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드로 구성될 수 있다. 상기 인식된 면역글로불린 유전자는, 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤(mu) 불변 영역 유전자(constant region genes), 뿐만 아니라 무수히 많은 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는, 카파 또는 람다로서 분류된다. 중쇄는, 차례로 면역글로불린 클래스, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 각각으로 정의된, 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류된다.

전형적인 감마 면역글로불린(항체) 구초적인 단위는, 사합체(tetramer)로서 알려져 있다. 각각의 사합체는 두 개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 사슬로 구성되어 있고, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kD) 및 하나의 "중쇄"(약 50 내지 70 kD)을 가진다. 각각의 사슬의 N-말단은, 항원 인식에 주로 책임이 있는 약 100 내지 110 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 정의한다. 상기 용어 가변 경쇄(V_L) 및 가변 중쇄(V_H)는 각각 이러한 경쇄 및 중쇄를 나타낸다.

항체는 온전한 면역글로불린으로서 또는 약간의 잘-특징지어진 단편으로서 존재한다. 따라서, 예를 들어, 펩신은, 이 자체로 이황화결합에 의해 VH-CH1-Hinge에 연결된 자연적인(naturally) 경쇄인, F(ab)'₂, Fab'의 이합체를 생산하기 위한 상기 경첩 영역에서의 상기 이황화물 결합 아래의 항체를 소화한다. 상기 F(ab)'₂는, 상기 경첩 부위에서 상기 이황화물 결합/들이 끊기고 이로 인하여 상기 (Fab')₂ 이합체가 Fab' 단량체로 전환되도록 온화한 조건(mild condition) 하에서 감소될 수도 있다. 상기 Fab' 단량체는 기본적으로, 상기 경첩 영역의 일부를 가지는 Fab이다(그 밖의 항체 단편의 보다 상세한 설명에 대해, Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993)를 참고하라). 다양한 항체 단편이 온전한 항체의 소화(digestion)의 면에서 정의되면서, 본 분야의 통상의 기술자는, 재조합 DNA 방법을 이용함으로써 또는 화학적으로 처음부터 합성될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 항체는 또한 재조합 DNA 방법을 사용하여 합성되거나 또는 전체 항체의 변형에 의해 생산된 항체 단편을 포함한다. 바람직한 항체는, 연속적인 폴리펩티드(continuous polypeptide)를 형성하기 위해, 가변 중쇄 및 경쇄 영역이 함께 연결된[펩티드 링커(peptide linker)를 통해 또는 직접적으로] 단일 사슬 Fv 항체(sFv 또는 scFv)와 같은, 단일 사슬 항체(단일 폴리펩티드 사슬로서 존재하는 항체)를 포함하는, V_H-V_L 이합체를 포함한다. 상기 단일 사슬 Fv 항체는 펩티드-인코딩하는 링커에 의해 결합되거나 또는 직접적으로 결합된 V_H- 및 V_L-인코딩 서열을 포함하는 핵산으로부터 발현될 수도 있는 공유적으로 결합된 V_H-V_L 헤테로다이머(heterodimer)이다(예를 들어, Huston et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 85:5879-5883, 1988, 이의 전체로 참고문헌으로 본원에 의해 포함됨). 상기 V_H 및 V_L 는 단일 폴리펩티드 사슬로서 각각 연결되면서, V_H 및 V_L 도메인은 비-공유적으로 연결된 것이다. 대안적으로, 상기 항체는 또 다른 단편일 수 있다. 다른 단편은 또한, 재조합 기술을 사용하여 함유하여, 발생될 수 있다. 예를 들어, Fab 분자는, 상기 사슬(중쇄 또는 경쇄)이 가용성 분자(soluble molecule)로서 주변세포질로 이출된 상기 상보적인 사슬(complementary chain) 및 g3 캡시드 단백질에 결합된다면, 파지(phage)에 전시될 수 있다. 상기 두 개의 사슬은 동일한 또는 상이한 리플리콘(replicon)에서 인코딩될 수 있다; 각각의 Fab 분자에서의 상기 두 개의 항체 사슬은 번역 후에 조립되고, 상기 이합체는 g3p에 대한 사슬 중의 하나의 연결을 통해 상기 파지 입자 내로 포함된다(예를 들어, U.S. Pat. No: 5,733,743, 이의 전체로 참고문헌에 의해 본원에 포함됨). 자연적으로 결집되었지만, 항체 V 영역으로부터 화학적으로 분리된 라이트 및 헤비 폴리펩티드 사슬이 항원-결합 부위의 구조와 실질적으로 유사한 삼차원적인 구조로 접히는 분자로 전환하는 수많은 그 밖의 구조 및 상기 scFv 항체는 본 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다(예를 들어, U.S. Pat. Nos. 5,091,513; 5,132,405; and 4,956,778; 이의 모두가 이의 전체로 참고문헌으로 본원에 의해 포함됨). 특히 바람직한 항체는, 상기 사슬이 가용성 단백질, 예를 들어 scFv, Fv, Fab, (Fab')₂로서 분비되는 벡터를 사용하여 재조합 기술에 의해 발생되거나, 파지에 전시되는 모두를 포함한다. 항체는 디아바디(diabodies) 및 미니바디(minibodies)를 또한 포함할 수 있다.

본 발명의 항체는, 카멜리드(camelids)로부터의 항체와 같은, 중쇄 이합체를 또한 포함한다. 카멜리드에서 중쇄 이합체 IgG의 V_H 영역이 경쇄와 소수성 상호작용을 하지 않기 때문에, 경쇄와 정상적으로 접촉하는 중쇄에서의 영역은 카멜리드에서 소수성 아미노산 잔기로 변경된다. 중쇄 이합체 IgGs의 V_H 도메인은 V_HH 도메인으로 불린다.

카멜리드에서, 항체 레퍼토리(antibody repertoire)의 다양성은 V_H 또는 V_HH 영역에서 상보성 결정 영역(CDR) 1, 2, 및 3에 의해 결정된다. 상기 낙타 V_HH 영역에서 CDR3은 16 개의 아미노산을 평균으로 하는 이의 상대적으로 긴 길이에 의해 특징지어 진다(Muyldermans et al., Protein Engineering 7(9):1129, 1994, 이의 전체로 참고문헌에 의해 본원에 포함됨). 이는 많은 다른 종의 항체의 CDR3 영역과 대조적인 것이다. 예를 들어, 마우스 V_H 의 CDR3은 평균 9 개의 아미노산을 가진다.

카멜리드의 가변 영역의 생체내(in vivo) 다양성을 유지하는, 카멜리드-유도된 항체 가변 영역의 라이브러리는, 예를 들어, 이의 전체로 참고문헌으로 본원에 의해 포함된, 2005년 2월 17일에 발행된 U.S. 특허 출원 공개 번호 US20050037421에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다.

항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC)은 항체의 작용의 중요한 매커니즘이다. ADCC는 개선된 Fc-수용체 결합을 가지는 최종 생산물 항체를 포함하는 다수의, 몇몇의 방법에 의해 증진될 수도 있다. 항체 Fc 영역에서의 아미노산 치환은, ADCC 활성도를 향상시키고, NK 세포에서 FcγRIIIa 수용체에 대한 Fc 결합 친화도를 증가시키도록 나타낸 것이다(Natsume et al., Drug Design, Development and Therapy, 2009, vol. 3, pp. 7-16, 이의 전체로 참고문헌에 의해 본원에 의해 포함됨). ADCC를 향상하기 위한 또 다른 방법은, 상기 항체 글리코실화반응의 상기 당 조성을 변경하는 것이다. 이러한 것은, 푸코스 잔기가 결여된 항체, 다시 말하자면, 'a-푸코실화(a-fucosylated)' 또는 'de-푸코실화(de-fucosylated)' 항체를 제조함으로써 실행된다. 하나의 방법은, 푸코스가 상기 항체에 첨가되지 않을 수 있도록, 상기 항체의 상기 글리코실화반응 부위를 변화시키고/변경하는 것을 포함한다(U.S. Pat. No. 6,194,551, February 27, 2001). 또 다른 방법은, 예를 들어, 또 다른 수단에 의해 상기 푸코스의 제거 또는 효소적 분해(enzymatic degradation)에 의해 항체에서 이미-존재하는 푸코스(pre-existing fucose)를 제거하는 것이다. 또 다른 방법은, 예를 들어, 푸코실 전이효소 활성도를 억제 또는 삭제함으로써, 푸코스가 상기 항체에 첨가되거나 이동될 수 없도록, 상기 숙주 발현 시스템의 유전공학을 포함한다(U.S. 특허 출원 공개 Nos.: 20070134759, June 14, 2007; 및 20080166756, July 10, 2008, 이들 둘 다는 이의 전체로 참고문헌에 의해 본원에 포함됨).

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "자연적으로 발생하는(naturally occurring)"은, 항원에 노출된 세포 또는 노출되지 않은 세포로부터 생성된 예를 들어, 항체 라이브러리에서 유기체에 이미-존재하고, 재조합 수단에 의해 변하지 않는 단일 유전자에 의해 인코딩되는 것을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 "항원"은, 적절한 조건 하에서, 특정한 항체 또는 특정하게 민감하게 된 T-림프구, 또는 둘 다와 같은 반응의 생산물과 반응하고, 특정한 면역 반응을 유도할 수 있는 물질을 나타낸다. 항원은, 박테리아 및 조직 세포와 같은 입자성 물질 또는 이질 단백질(foreign proteins) 및 독소와 같은, 가용성 물질일 수도 있다; 그러나, 상기 항원의 결정요인(에피토프)으로서 알려진 상기 단백질 또는 다당류 분자의 일부만이 항체 또는 림프구에서의 특정한 수용체와 결합한다. 보다 대략적으로, 상기 용어 "항원"은, 상기 물질이 면역성인지에 상관없이, 항체가 원하거나, 상기 항체가 결합하는 어떠한 물질을 나타내기 위해 사용될 수도 있다. 이러한 항원에 대해, 항체는 어떠한 면역 반응에 독립적으로, 재조합 방법에 의해 확인될 수도 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 "에피토프"는, 특정한 B 세포 및/또는 T 세포 반응에 대한 합텐(hapten) 또는 항원에서의 부위를 나타낸다. 상기 용어는 또한, "항원 결정기" 또는 "항원 결정 부위"와 교환가능하게 사용된다. 에피토프는, 항체의 가변 영역 결합 포켓(variable region binding pocket)과 상호작용하는 결합 상호작용을 형성할 수 있는 항원 또는 그 밖의 거대분자의 일부를 함유한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 항원의 "결합 특이성(binding specificity)"은, 상기 항체가 결합하는 항원의 고유성(identity), 바람직하게는 상기 항체가 결합하는 상기 에피토프의 고유성을 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 "키메라 폴리뉴클레오티드(chimeric polynucleotide)"는, 야생형인 영역 및 돌연변이된 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 이는 또한, 상기 폴리뉴클레오티드가 하나의 폴리뉴클레오티드로부터의 야생형 영역 및 다른 관련된 폴리뉴클레오티드로부터의 야생형 영역을 포함하는 것을 의미할 수도 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상보성-결정 영역(complementarity-determining region)" 또는 "CDR"은, Kabat 및 Chothia에 의해 전형적인 예로서 본 분야에서 인식된 용어를 나타낸다. CDRs는 초가변영역(hypervariable regions) 또는 초가변영역 루프(hypervariable loops)로서 일반적으로 알려져 있다(Chothia and Lesk, J Mol. Biol. 196:901, 1987; Chothia et al., Nature 342: 877, 1989; E. A. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md.) (1987); 및 Tramontano et al., J Mol. Biol. 215:175, 1990; 모든 간행물은 이의 전체로 참고문헌에 의해 본원에 포함됨). "프레임워크 영역(Framework region)" 또는 "FR"은, CDRs의 측면에 있는 V 도메인의 영역을 나타낸다. 상기 CDRs 및 프레임워크 영역의 위치는 본 분야에서 잘 알려진 다양한 정의, 예를 들어, Kabat, Chothia, 국제적인 ImMunoGeneTics 데이터베이스(IMGT), 및 AbM을 사용하여 결정될 수 있다(예를 들어, Johnson et al., supra; Chothia and Lesk, "Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins," J. Mol. Biol. 196, 901-917, 1987; Chothia C. et al., "Conformations of immunoglobulin hypervariable regions," Nature 342:877-883, 1989; Chothia C. et al., "Structural repertoire of the human VH segments," J. Mol. Biol. 227:799-817, 1992; Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol 273(4):927-48, 1997를 참고하라). 항원 결합 부위의 정의는 하기에 또한 기재되어 있다: Ruiz et al., "IMGT, the international ImMunoGeneTics database," Nucleic Acids Res., 28:219-221, 2000; Lefranc, M.-P., "IMGT, the international ImMunoGeneTics database," Nucleic Acids Res. 29(1):207-9, 2001; MacCallum et al., "Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography," J. Mol. Biol., 262(5):732-745, 1996; Martin et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:9268-72, 1989; Martin et al., Methods Enzymol., 203:121-153, 1991; Pedersen et al, Immunomethods, 1:126, 1992; and Rees et al., In Sternberg M. J. E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, pg 141-172 (1996); 모든 발행물은 이의 전체로 참고문헌에 의해 본원에 포함됨).

본원에 사용된 바와 같은, 상기 용어 "합텐"은, 단백질과 같은 보다 큰 캐리어(larger carrier)에 부착된 경우에, 예를 들어, 이에 특이적으로 결합하는[프리 또는 결합된 상태로(in either the free or combined state)] 항체의 생산과 같은 유기체에서의 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 작은 분자이다. "합텐"은 미리형성된 항체에 결합할 수 있지만, 그 자체로 항체 발생을 촉진하는데 실패할 수도 있다. 이러한 발명의 내용에서, 상기 용어 "합텐"은 자연적으로 발생하거나 비-자연적으로 발생하는, 변형된 아미노산을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 상기 용어 "합텐"은, 포스포티로신, 포스포트레오닌, 포스포세린과 같은 자연적으로 발생하는 변형된 아미노산, 또는 황산화된 티로신[술포티로신(sulphotyrosine)], 황산화된 세린(술포세린), 또는 황산화된 티로신(술포티로신)과 같은 황산화된 잔기(sulphated residues)를 포함하고; 또한, p-니트로-페닐알라닌과 같은 비-자연적으로 발생하는 변형된 아미노산을 또한 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같은, 상기 용어 "숙주 세포"는, 본 발명의 벡터가 도입되고, 발현되고 및/또는 번식할 수도 있는 원핵세포 또는 진핵세포를 나타낸다. 미생물의 숙주 세포는, 진균 및 점균류(slime mold)의 라이프-사이클에서 박테리아, 효모, 미시적 진균 및 미시적 상태(microscopic phases)를 포함하는 원핵 또는 진핵 미생물의 세포이다. 전형적인 원핵 숙주 세포는 E. coli의 다양한 스트레인을 포함한다. 전형적인 진핵 숙주 세포는, 효모 또는 곰팡이, 또는 중국 햄스터 난소 세포, 쥐과 NIH 3T3 섬유아세포, 인간 배아의 신장 193 세포, 또는 설치류 골수종 또는 하이브리도마 세포와 같은 포유동물 세포이다.

본원에 사용된 바와 같은, 조성물 또는 백신에 대한 상기 용어 "면역학적 반응(immunological response)"은, 흥미있는 조성물 또는 백신에 대한 항체-매개된 면역 반응 및/또는 세포의 숙주에서의 발달이다. 보통, "면역학적 반응"은 하나 또는 그 이상의 하기의 효과를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다: 항원 또는 항원들에 특이적으로 향하는, 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 및/또는 세포독성 T 세포의 생산은 관심 조성물 또는 백신에 포함된다. 바람직하게, 상기 숙주는, 새로운 감염에 대한 저항이 향상될 것이고 및/또는 상기 질병의 임상의 심각성이 감소되도록, 치료학적 또는 보호적인 면역학적 반응을 나타낼 것이다. 이러한 보호는, 상기 감염된 숙주에 의해 정상적으로 나타낸 증상의 결핍 또는 감소, 상기 감염된 숙주에서의 보다 빠른 회복 시간 및/또는 더 낮은 바이러스성 적정 농도에 의해 입증될 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 "분리된(isolated)"은, 상기 핵산 또는 폴리펩티드의 자연 근원(natural source)에 존재하는 그 밖의 핵산 또는 폴리펩티드로부터 뿐만 아니라, 폴리펩티드로부터 분리된 핵산 또는 폴리펩티드를 나타내고, 바람직하게는 (어느 쪽이라도) 용매, 완충용액, 이온, 또는 이와 같은 용액에 정상적으로 존재하는 그 밖의 구성요소의 존재에서 발견된 핵산 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 상기 용어 "분리된" 및 "정제된"은, 이들의 자연 근원에 존재하는 핵산 또는 폴리펩티드를 포함하지 않는다.

본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 "정제된"은, 상기 표시된 핵산 또는 폴리펩티드가 그 밖의 생물학적 거대 분자, 예를 들어 폴리뉴클레오티드, 단백질 등의 실질적인 결핍에 존재하는 것을 의미한다. 하나의 실시형태에서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는, 이는 존재하는 상기 나타낸 생물학적 거대분자의, 적어도 95 중량%, 보다 바람직하게는 적어도 99.8 중량%를 구성하도록 정제된다(그러나, 물, 완충용액, 및 그 밖의 작은 분자, 특히 1000 돌턴 미만의 분자량을 가지는 분자가 존재할 수 있다).

본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 "재조합 핵산"은, 자연에서 정상적으로 발견되지 않는 형태의 핵산을 나타낸다. 즉, 재조합 핵산은, 상기 핵산 측면에 자연적으로 있지 않는 뉴클레오티드 서열 측면에 있거나, 자연에서 정상적으로 발견되지 서열을 가진다. 재조합 핵산은, 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonucleases)에 의한 핵산의 조작에 의해 또는 대안적으로 중합효소 연쇄 반응으로서 이러한 기술을 사용하여 생체외에서 독창적으로 형성될 수 있다. 재조합 핵산이 제조되고, 숙주 세포 또는 유기체 내로 다시 도입되는 경우에, 이는 즉, 생체외 조작 보다는 상기 숙주 세포의 생체내 세포의 조직을 사용하여, 비-재조합적으로 복제될 것임을 이해할 것이다; 그러나, 재조합적으로 생성된 경우에, 이러한 핵산이, 차후에 비-재조합적으로 복제될지라도, 본 발명의 목적을 위해 재조합을 여전히 고려된다.

본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 "재조합 폴리펩티드"는, 생체외에서 화학적으로 합성된 폴리펩티드 또는 재조합 핵산으로부터 발현된 폴리펩티드를 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 "재조합 변이체(recombinant variant)"는, 재조합 DNA 기술을 사용하여 형성된, 아미노산 삽입, 결실, 및 치환에 의해 자연적으로 발생하는 폴리펩티드와 상이한 어떠한 폴리펩티드를 나타낸다. 아미노산 잔기가 대체되거나, 첨가되거나, 효소적 또는 결합 활성도와 같은 관심의 활성도를 폐지하는 것 없이 결실될 수도 있음을 결정하는데 있어서의 안내(Guidance)는, 높은 상동관계의 영역에서 제조된 아미노산 서열 변화의 수를 최소화하고, 상동의 펩티드의 것들과 상기 특정한 폴리펩티드의 서열을 비교함으로써 발견될 수도 있다.

바람직하게, 아미노산 "치환"은, 하나의 아미노산이 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성을 가지는 다른 아미노산으로 대처하는 결과, 즉 보존적 아미노산 치환이다. 아미노산 치환은, 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 포함된 상기 잔기의 양친매성 성질에서의 유사성을 기초로 제조될 수도 있다. 예를 들어, 비극성(소수성) 아미노산은, 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프로필, 페닐알리닌, 트립토판, 및 메티오닌을 포함한다; 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함한다; 양전하로 전하된(염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신, 및 히스티딘을 포함한다; 및 음전하로 전하된 (산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 "레퍼토리(repertoire)" 또는 "라이브러리(library)"는, 항체 또는 Fab, scFv, Fd, LC, V_H, or V_L와 같은 항체 단편, 또는 비장 및 말초 혈액의 세포로부터의 주로 수득된, 및 예를 들어 인간 기증자에, 존재하는 항체 유전자의, "레퍼토리", 또는 자연적인 전체적인 효과로부터 수득된, 가변 영역의 서브단편(subfragment), 예를 들어 교환 카세트(exchange cassette)를 인코딩하는 유전자의 라이브러리를 나타낸다. 몇몇 실시형태에서, 상기 인간 기증자는, "비-면역(non-immune)", 즉 감염의 증상을 나타내지 않는다. 현재 발명에서, 라이브러리 또는 레퍼토리는 자주, V 영역의 제공된 부분의 교환 카세트인 멤버(members)를 포함한다. 상기 용어 Fd는, 상기 Fab 단편에 포함된 상기 중쇄의 일부를 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 "합성의 항체 라이브러리"는, 하나 또는 그 이상의 항체 또는 Fab, scFv, Fd, LC, V_H, 또는 V_L와 같은 항체 단편, 또는 가변 영역의 서브단편, 예를 들어 교환 카세트를 인코딩하는 유전자의 라이브러리를 나타내고, 상기 상보성-결정 영역(CDR)의 하나 또는 그 이상은, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이(oligonucleotide-directed mutagenesis)에 의해 부분적으로 또는 완전하게 변경된다. "임의 추출된(Randomized)"은, 상기 CDR을 인코딩하는 서열의 부분 또는 모두가 상기 아미노산의 몇몇의 부분집합 또는 모두 20개의 아미노산을 임의적으로 인코딩하는 서열에 의해 대체됨을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 "다가의(multivalent)"는, 상기 백신이 상이한 아미노산 서열을 가지는 적어도 두 개의 인플루엔자 분리물로부터의 M1 폴리펩티드를 함유하거나, 또는 상기 백신이 상기 M1 폴리펩티드 분리물과 상이한 또 다른 인플루엔자 분리물로부터의 항원의 조제물 및 하나의 인플루엔자 분리물로부터의 M1 폴리펩티드를 함유하는 것을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은, 상기 용어 "포유동물"은, 털을 가지고 이들의 새끼에게 젖을 먹이는 모두 온혈 척추동물을 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 "단백질", "펩티드", "폴리펩티드" 및 "폴리펩티드 단편"은, 어떠한 길이의 아미노산 잔기의 중합체를 나타내기 위해 본원에 교대로 사용된다. 상기 중합체는 선형 또는 가지형일 수도 있고, 이는, 아미노산 또는 아미노산 아날로그를 포함할 수도 있고, 이는 아미노산 외에 화학적 모이어티(chemical moieties)에 의해 차단될 수도 있다. 상기 용어는 또한 개입(intervention)에 의해 또는 자연적으로 변형되는 아미노산 중합체를 포함한다: 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화반응, 지질화(lipidation), 아세틸화, 인산화반응, 또는 표지하는(labeling) 또는 생활성 구성요소(bioactive component)와의 결합과 같은, 어떠한 다른 처리 또는 변형.

본원에 사용된 바와 같이, 폴리뉴클레오티드의 일부와 관련하여 사용된 경우에 상기 용어 "이종기원(heterologous)"은, 상기 핵산이 자연에서 서로 동일한 관계에서 보통 발견되지 않는, 둘 또는 그 이상의 서브서열(subsequences)을 포함하는 것을 나타낸다. 예를 들어, 상기 핵산은, 예를 들어, 새로운 기능적인 핵산을 제조하기 위해 배열된 관련되지 않는 유전자로부터, 둘 또는 그 이상의 서열을 가지는, 통상적으로 재조합적으로 생산된 것이다. 유사하게, "이종기원" 폴리펩티드 또는 단백질은, 자연에 서로 동일한 관계에서 발견되지 않는 둘 또는 그 이상의 서브서열을 나타낸다.

단수형 용어 "a", "an", 및 "상기(the)"는, 다른 방식으로 문맥에서 명확하게 나타내지 않는 한 복수형 지시대상물을 포함한다. 유사하게, 단어 "또는"은, 다른 방식으로 문맥에서 명확하게 나타내지 않는 한 "및"을 포함하는 것을 의도한다. 항원과 같은 물질의 레벨 또는 농도에 대하여 제공된 수치 한정은 근사치인 것을 의도한다. 따라서, 농도가 적어도(예를 들어) 200 ㎍인 것으로 나타낸 경우에, 이는 상기 농도가 적어도 대략 "약" 또는 "약" 200 ㎍인 것으로 이해됨을 의도한다.

M1 폴리펩티드

본 발명은, 인간 개인 또는 집단에서의 인플루엔자 바이러스에 대항하는, 면역 반응, 특히 일차 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은, 본 발명의 M1 폴리펩티드를 포함하는 M1 폴리펩티드의 투여 또는 이의 항원성 제조(antigenic preparation)를 포함하는 M1 폴리펩티드 조성물의 투여를 포함한다. 실시형태에서, 상기 면역 반응은, 투약받은 적이 없는, 면역 무방비된(immuno-compromised), 또는 이전에 간염된 인간 개인 또는 집단에서 수득된 것이다.

M-단백질, 또는 매트릭스 단백질, M1은 상기 인플루엔자 바이러스의 주요한 구조상의 구성요소이다(Zhang et al., "Dissection of Influenza A Virus M1 Protein: pH-Dependent Oligomerization of N-Terminal Domain and Dimerization of C-Terminal Domain," PLoS ONE 7(5): e37786, 2012, doi: 10.1371/journal.pone.0037786, 이의 전체로 참고문헌으로 본원에 의해 포함됨). 상기 M 유전자는 두 가지 단백질, M1 및 M2를 인코딩한다. M1 단백질은, 보다 임상적으로 관련된 인플루엔자 서브타입인, 인플루엔자 바이러스의 모든 타입 A 서브타입에 걸쳐서 고도로 보존된다. 상기 M1 단백질의 C-말단의 부분이 상기 바이러스에 세포 외에 노출되고, 이의 높은 서열 보존을 고려하여, 전 세계적인 백신 면역원에 대한 탁월한 타겟을 나타낸다.

실시형태에서, 상기 타겟 M1 폴리펩티드는 상기 M1 단백질의 C-말단에서의 잔기, 특이적으로 상기 M1 단백질의 아미노산 잔기 215-252, 또는 215-240, 또는 220-238에 걸쳐있다. 실시형태에서, 상기 M1 폴리펩티드는, GTHPSSSAGLKNDLLENLQ (SEQ ID NO:1), AMRTIGTHPSSSAGLKNDLLENLQAYQKRMGVQMQRFK (SEQ ID NO:2) 또는 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 및/또는 38 아미노산의 이러한 서열로부터의 인접한 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드이다. 실시형태에서, 본 발명의 M1 폴리펩티드는, 예를 들어, A/Bangkok/163/2000 (GTHPSSSTGLKNDLLENLQ) (SEQ ID NO:3); A/PR/8/34 (GTHPSSSAGLKNDLLENLQ) (SEQ ID NO:1); A/AA/Huston/1945 (GTHPSSSAGLKDDLLENLQ) (SEQ ID NO:4); A/Berlin/6/2006 (GTHPSSSTGLKNDLLDNLQ) (SEQ ID NO:5); A/Brandenburg/1/2006 (GTHPNSSTGLKNDLLENLQ) (SEQ ID NO:6); A/Brevig Mission/1/1918 (GTHPSSSAGLKDDLIENLQ) (SEQ ID NO:7); A/Chile/8885/2001 (GTHPSSSTGLKDDLLENLQ) (SEQ ID NO:8); A/DaNang/DN311/2008 (GTHPSSSTGLRDDLLENLQ) (SEQ ID NO:9); A/FLW/1951 (GTRPSSSAGLKDDLLENLQ) (SEQ ID NO:10); A/FW/1/1950 (GTHPRSSAGLKDDLLENLQ) (SEQ ID NO:11); A/Fiji/15899/83 (GTHPSSSAGLKNDLFENLQ) (SEQ ID NO:12); A/Fort Monmouth/1-MA/1947 (GTHPSSSAGLKDNLLENLQ) (SEQ ID NO:13); A/HaNoi/TX233/2008 (GTHPSSSTGLKSDLLENLQ) (SEQ ID NO:14); A/Iowa/CEID23/2005 (GTHPNSSTGLKDDLLENLQ) (SEQ ID NO:15); A/Malaysia/35164/2006 (GTHPSSSTGLKKDLLDN) (SEQ ID NO:16); A/Managua/4086.04/2008 (GTHPSSSNGLKNDLLEN) (SEQ ID NO:17); A/Texas/VR06-0502/2007 (GTHPSSSTGLRNDLLENLQ) (SEQ ID NO:18); A/WSN/1933 (GTHPSSSAGLKSDLLENLQ) (SEQ ID NO:19); A/Colorado/18/2011 (GTHPSSSAGLRDDLLENLQ) (SEQ ID NO:20); A/Kentucky/04/2010 (GTHPNSSAGLKDDLLENLQ) (SEQ ID NO:21); A/Maryland/28/2009 (GTHPSSSAGLKDDLLGNLQ) (SEQ ID NO:22); A/New Mexico/05/2012 (GTHPSSSSGLRNDLLENLQ) (SEQ ID NO:23); A/Philippines/TMC10-135/2010 (GTHPSSSAGLRDDLLDNLQ) (SEQ ID NO:24); A/Singapore/GP4307/2010 (GTHPSSSAGLKDDLLDNLQ) (SEQ ID NO:25); A/Singapore/GP489/2010 (GTHPSSSAGLKDALLENLQ) (SEQ ID NO:26); A/Boston/14/2007 (GTHPSSSTGLRDDLLEKLQ) (SEQ ID NO:27); A/Brisbane/09/2006 (GTHPSSSTGLRDNLLENLQ) (SEQ ID NO:28); A/Hong Kong/CUH34175/2002 (GTHPSSSNGLRDDLLENLQ) (SEQ ID NO:29); A/Kyrgyzstan/WRAIR1256P/2008 (GTHPSSSTGLRDDLLGNLQ) (SEQ ID NO:30); A/Malaysia/12550/1997 (GTHPSSSTGLRDDLLDNLQ) (SEQ ID NO:31); A/Nanjing/1663/2010 (GTHPSSSTGLRGDLLENLQ) (SEQ ID NO:32); A/Wyoming/08/2010 (GTHPSSSTGLRDDLLINLQ) (SEQ ID NO:33); A/Berkeley/1/1968 (GTPPSSSAGLKNDLLENLQ) (SEQ ID NO:34); A/Korea/426/1968 (GTPPSSSAGLKDDLLENLQ) (SEQ ID NO:35)와 같은, 자연적으로 발생하는 스트레인 변이체를 포함한다.

실시형태에서, 본 발명의 상기 M1 폴리펩티드는, 상기 M1 단백질의 220 내지 238으로부터의 서열, GTHPSSSAGLKNDLLENLQ (SEQ ID NO:1), 또는 하나 또는 그 이상의 하기의 치환을 가지는 변이체를 포함한다: 222에서 H가 R 또는 N으로 변화됨(H at 222 changed to R or N), 224에서 S가 R 또는 N으로 변화됨, 227에서 A가 T 또는 N으로 변화됨, 230에서 K가 R로 변화됨, 231에서 N이 D, S, 또는 K로 변화됨, 232에서 D가 N 또는 G로 변화됨, 234에서 L이 F 또는 I로 변화됨, 235에서 E가 D, H, 또는 K로 변화됨, 236에서 N이 H 또는 K로 변화됨.

실시형태에서, 본 발명의 상기 M1 폴리펩티드는 하기의 서열 변이체를 포함한다:

여기서 X = 어떠한 아미노산.

본 발명의 상기 M1 폴리펩티드는 인플루엔자에 대항하여 보호할 수 있다. 즉, 이들은 동물에서 면역 반응을 자극할 수 있다. 상기 항원은 스캐폴드에 존재하거나 캐리어에 결합되거나 M1 폴리펩티드 만; 면역성 특성을 가지는 삽입물(insert)을 함유하는 재조합 벡터; 에피토프, 합텐, 또는 이의 어떠한 조합;을 포함할 수도 있다.

본 발명의 M1 폴리펩티드는, 상기 M1 폴리펩티드의 면역원성 단편 및 변이체를 포함한다. 따라서, 상기 용어 "면역원성 또는 항원의 폴리펩티드"는 추가적으로, 본원에 정의된 바와 같은 면역원성 반응을 생산하도록 상기 폴리펩티드가 기능하는 동안에, 상기 서열에 대한 결실, 추가 및 치환을 고려한다. 실시형태에서, 상기 단편 및 변이체는, 상기 서열에 대한 하나 또는 그 이상의 결실, 추가 및 치환을 가질 수 있다. 실시형태에서, 상기 단편 및 변이체는 상기 서열에 대해 1, 2, 3 또는 그 이상의 결실, 추가 및/또는 치환을 가질 수 있다. 실시형태에서, 상기 추가 및 결실은 상기 서열의 내부의, 카르복시, 및/또는 아미노 말단일 수 있고, 상기 변이체는 본원에 정의된 바와 같은 면역원성 반응을 생산하는 능력을 유지한다. 상기 용어 "보존적 변화"는, 상기 인코딩된 아미노산 잔기는 변하지 않거나, 다른 구조적으로, 화학적으로 또는 기능적으로 유사한 잔기로 변하지 않도록, 핵산 서열에서 뉴클레오티드의 교체, 또는 아미노산 잔기가 다른 생물학적으로 유사한 잔기로 교체를 나타낸다. 이러한 것과 관련하여, 특히 바람직한 치환은 일반적으로, 자연에서 보존적, 즉, 아미노산의 패밀리 내에 일어나는 이러한 치환일 것이다. 예를 들어, 아미노산은, 4 가지의 패밀리로 일반적으로 나눠진다: (1) 산성--아스파르테이트 및 글루타메이트; (2) 염기성--리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비-극성--알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비전하된 극성--글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 및 티로신. 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신은 때때로 방향족 아미노산으로서 분류된다. 보존적 변화의 예는, 다른 소수성 잔기를 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌과 같은 하나의 소수성 잔기로 치환, 또는 리신을 아르기닌으로 치환(the substitution of arginine for lysine), 아스파르트산을 글루탐산으로 치환, 아스파라긴을 글루타민으로 치환 등과 같은 다른 극성 잔기를 하나의 극성 잔기로 치환; 또는 상기 생물학적 활성에서의 주요한 효과를 가지지 않을 구조적으로 관련된 아미노산을 가지는 아미노산의 유사한 보존적 치환을 포함한다. 따라서, 상기 단백질의 면역원성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 작은 아미노산 치환을 보유하지만, 상기 기준 분자(reference molecule)로서 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 단백질은, 상기 기준 폴리펩티드의 정의 내에 있다. 이러한 변형에 의해 생산된 상기 폴리펩티드 모두는, 본원에 포함된다. 상기 용어 "보존적 변화(conservative variation)"는 또한, 상기 치환된 폴리펩티드로 일으켜진 항체가 또한 상기 치환되지 않는 폴리펩티드와 면역반응한다면, 치환되지 않는 모 아미노산을 대신에 치환된 아미노산의 사용을 포함한다.

"변이체" M1 폴리펩티드는, 실질적으로 유사한 서열을 의미하는 것을 의도한다. 폴리뉴클레오티드에 대해, 변이체는, 상기 선천적인 폴리뉴클레오티드(native polynucleotide)에서 하나 또는 그 이상의 부위에서 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 치환 및/또는 상기 선천적인 폴리뉴클레오티드 내의 하나 또는 그 이상의 부위에서의 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 결실 및/또는 추가를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "선천적인" 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는, 각각 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 특정한 폴리뉴클레오티드의 변이체(즉, 기준 폴리뉴클레오티드)는 또한, 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 상기 폴리펩티드와 상기 기준 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 상기 폴리펩티드 사이의 퍼센트 서열 동일성의 비교에 의해 평가될 수 있다. "변이체" 단백질은, 선천적인 단백질에서 하나 또는 그 이상의 부위에서 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환 및/또는 상기 선천적인 단백질에서 하나 또는 그 이상의 부위에서 하나 또는 그 이상의 아미노산의 결실 또는 첨가에 의해 상기 선천적인 단백질로부터 유도된 단백질을 의미하는 것을 의도한다. 본 발명에 의해 포함된 변이체 단백질은, 이들이 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 능력을 가지는, 생물학적으로 활성된 것이다.

그 밖의 인플루엔자 스트레인 및 서브타입으로부터의 M1 폴리펩티드의 상동체는, 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 "상동체(homologs)"는 아날로그(analogs) 및 파라로그(paralogs)를 포함한다. 상기 용어 "아날로그"는, 동일한 또는 유사한 기능을 가지지만, 관련되지 않는 숙주 유기체에서 별도로 진화된 것인, 두 가지의 폴리뉴클레오티드들 또는 폴리펩티드들을 나타낸다. 상기 용어 "파라로그"는, 게놈 내의 이중에 의해 관련된 두 개의 폴리뉴클레오티드들 또는 폴리펩티드들을 나타낸다. 파라로그는 일반적으로 상이한 기능을 가지지만, 이러한 기능은 관련될 수도 있다. 야생형 인플루엔자 폴리펩티드의 아날로그 및 파라로그는, 번역 후 변형에 의해, 아미노산 서열 차이에 의해, 또는 둘 다에 의해 야생형 인플루엔자 폴리펩티드와 상이할 수 있다. 특히, 본 발명의 동족체는, 상기 야생형 인플루엔자 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 모두 또는 부분과, 적어도 80-85%, 85-90%, 90-95%, 또는 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 일반적으로 나타낼 것이고, 유사한 기능을 나타낼 것이다. 변이체는 대립형질 변이체(allelic variants)를 포함한다. 상기 용어 "대립형질 변이체"는, 자연의 집단(예를 들어, 바이러스 종 또는 다양성) 내에 존재하고, 단백질의 상기 아미노산 서열에서의 변화를 유도하는, 동질이상을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 이러한 자연의 대립형질 변이체는, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에서 1 내지 5 %의 변화를 통상적으로 야기할 수 있다. 대립형질 변이체는, 이러한 종에서 동일한 유전자 좌(genetic locus)를 확인하기 위해, 혼성화 프로브(hybridization probes)를 사용함으로써 쉽게 수행될 수 있는, 다수의 상이한 종의 상기 핵산 서열을 서열화함으로써(by sequencing) 확인될 수 있다. 이러한 핵산 변이체의 어떠한 것 및 모두 자연의 대립형질 변이체의 결과이고, 관심 유전자의 상기 기능적인 활성도를 변경하지 않는, 결과적으로 형성된 아미노산 동질이상(polymorphisms) 또는 변형은, 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "유도체" 또는 "변이체"는, (1) 이에 부합하는 폴리펩티드는 상기 야생형 폴리펩티드와 비교된 경우에 실질적으로 동일한 기능을 가지거나 (2) 상기 항체는 상기 야생형 폴리펩티드로 면역반응성이 있는 상기 폴리펩티드에 대항하여 증가되도록, 하나 또는 그 이상의 보존적 아미노산 변이체 또는 다른 작은 변형을 가지는, M1 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 또는 M1 폴리펩티드를 나타낸다. 이러한 변이체 또는 유도체는, 상기 변형되지 않는 대응 관계 폴리펩티드와 비교된 바와 같이, 실질적으로 동일한 활성도를 가지는 폴리펩티드를 결과적으로 야기할 수 있는 상기 인플루엔자 폴리펩티드 주요한 아미노산 서열의 작은 변형을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 변형은, 부위 특이적인 돌연변이에 의해 계획될 수도 있거나, 자별적인 것일 수도 있다. 상기 용어 "변이체"는 추가적으로, 상기 폴리펩티드가 본원에 정의된 바와 같은 면역학적 반응을 생산하기 위해 작용하는 동안에, 상기 서열에 대한 결실, 추가 및 치환을 포함한다. 상기 용어 "변이체"는 또한, 숙주 종으로부터 상기 폴리펩티드의 분비 또는 발현을 용이하게 하도록, 상기 선천적인 단일 펩티드가 이종기원 단일 펩티드로 대체되는 폴리펩티드의 변형을 포함한다. 상기 용어 "변이체"는, 교차-반응성 면역력을 또한 유도하는 유사한 구조를 가지지만 완전하게 상이한 단백질 서열인, '미미토프(mimitopes)'를 또한 포함할 수도 있다.

본 발명의 M1 폴리펩티드는 또한, 상기 M1 폴리펩티드의 변형 또는 유도체화에 대한 글리코실화 부위 또는 그 밖의 부위를 도입하기 위한 아미노산 서열을 포함할 수도 있다. 실시형태에서, 상기에 기재된 본 발명의 상기 M1 폴리펩티드는, 글리코실화 부위로서 작용할 수 있는 아미노산 서열 N-X-S 또는 N-X-T를 함유할 수도 있다. 글리코실화 동안에, 올리고당 사슬이 트리펩티드(tripeptide) 서열 N-X-S 또는 N-X-T에서 발생하는 아스파라긴(N)에 부착되고, 여기서 X 는 Pro를 제외한 어떠한 아미노산일 수도 있다. 이러한 서열은 글리코실화 서열로서 지칭된다. 이러한 글리코실화 부위는, 상기 M1 폴리펩티드에 대해 사용된 상기 M1 단백질 서열의 내부 서열 내에 또는 상기 N-말단, C-말단에 배치될 수도 있다.

본 발명의 어떠한 상기 M1 폴리펩티드는, 합텐 접합체(hapten conjugate)에 또한 사용될 수도 있다. 이러한 접합체는, 상기 유기체의 면역 시스템에 대한 상기 M1 폴리펩티드 에피토프(들)을 나타내기 위한 적절한 캐리어 폴리펩티드 및/또는 스캐폴드 폴리펩티드를 사용할 수도 있다. 예를 들어, 상기 M1-폴리펩티드는, 모노클로날 항체의, CDR3를 완전하게 교체하거나 CDR3 내로 삽입될 수도 있다. 이러한 경우에, 최대의 보조가 되는 효과(the greatest adjuvanting effect)는, 면역을 위해 상기 대상으로부터 상이한 종의 모노클로날 항체 스캐폴드를 사용함으로써 획득될 것이다. 이러한 M1-폴리펩티드 합텐은, 상기 M1 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 증가시키거나 형성할 수도 있다. 적절한 캐리어 분자는 본 분야에서 잘 알려져 있고, 예를 들어, KLH, 오브알부민(ovalbumin), 콜레라독소, 디프테리아 독소 및 파상풍독소를 포함한다.

DNA 구조물을 제조하고 정제하기 위한 분자 생물학의 표준 기술은, 발명의 상기 M1 폴리펩티드와 상기 합텐 접합체의 제조를 가능하게 한다. 이러한 분자 생물학 기술은, 상기 합텐 접합체를 인코딩하는 유전자 구조물을 제조하고, 적절한 숙주 세포에 상기 합텐의 제조를 위한 발현 구조물을 제조하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 합텐은, 캐리어 또는 스캐폴드 폴리펩티드에 대한 본 발명의 M1 폴리펩티드를 접합하기 위한 표준 폴리펩티드 기술을 사용하여 제조될 수도 있다. 따라서, 분자 생물학의 표준 기술은 본 발명의 합텐의 생산을 위해 충분하고, 기재된 특정한 합텐은 신규한 치료법을 제공한다.

본 발명의 측면에서, M1폴리펩티드(들)을 포함하는 1가 또는 다가, 예를 들어 2가, 3가 또는 4가 조성물을 제공하고, 상기 주요한 면역원성 조성물에 존재하는 상기 스트레인의 항원성 변이체인, 인플루엔자 스트레인에 의해 야기되는 인플루엔자 감염의 예방 또는 심각성(severity)의 감소에서 용도에 대한, 비활성된 또는 약화된 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원의 제조를 포함할 수도 있다. 본 발명의 실시형태에서, 다가 조성물의 상기 비활성된 또는 약화된 인플루엔자 바이러스는 혈청형(serotype) B 인플루엔자에 대한 것이다.

면역 반응 및 효능

실시형태에서, 본 발명의 상기 M1 폴리펩티드는, 항체 반응을 중성화하기 위한 혈청 항체양전율(seroconversion rates, SCR) 및 중성화하는 항체 역가(the neutralizing antibody titers)의 기하 평균 값(Geometric Mean Titers, GMT)으로서 측정된 바와 같은, 인플루엔자에 대항하는 항체를 중성화하는 면에서 체액 반응을 유도하는 것을 가능하게 한다(Day 0에서의 검출가능한 항체 없이 및 1:28의 역가(titer)에 대한 증가 또는 백신 접종 후에 중성화하는 항체 역가에서의 4 배 또는 그 이상을 가지는 백신의 퍼센트로서 정의됨).

또 다른 특정한 실시형태에서, 상기 백신접종은 또한 또는 추가적으로, 인플루엔자에 대항하는 CD4 T 세포 면역 반응 및/또는 B 세포 기억 반응을 발생시킨다. 특정한 실시형태에서, 상기 인간 환자는, 백신 스트레인에 대한 혈청반응 음성(seronegative) 또는 면역학적으로 경험이 없다(즉, 이미-존재하는 면역력을 가지고 있지 않다). 실시형태에서, 상기 M1 폴리펩티드 조성물의 투여는 대체적으로 또는 추가적으로, 항원 충돌(antigen encounter) 상에서 항체-분비 플라즈마 세포 내로 분화할 수 있는 말초 혈액 B 림프구의 빈도에 의해 측정된 바와 같은, B-기억 반응을 유도한다.

본 발명의 인플루엔자 약제는 적절하게, 백신에 대한 특정한 국제적인 기준을 충족한다. 기준은, 인플루엔자 백신의 효능을 측정하기 위해 국제적으로 적용된다. 혈청학상의 변수는, 인플루엔자 백신의 연간 허가 절차와 관련된 임상 시험을 위한, 인간 사용을 위한 유럽 의약품 평가청의 기준(CHMP/BWP/214/96, Committee for Proprietary Medicinal Products (CPMP). Note for harmonization of requirements for influenza vaccines, 1997. CHMP/BWP/214/96 circular N^o 96-0666:1-22)에 따라 평가된다(표 1A). 상기 필요조건은 성인 집단(18 내지 60 세) 및 나이든 집단(60 세 초과)에 대해 상이하다(표 1A). 대유행기의 인플루엔자 백신에 대해서, 적어도 하나의 평가[혈청 항체양전 인자(seroconversion factor), 혈청 항체양전율, 방어항체가 생성율(seroprotection rate)]가, 상기 백신에 포함된 인플루엔자의 모든 스트레인에 대한, 유럽 필요조건을 충족하여야한다. 1:40과 동일하거나 큰 역가의 비율은, 이러한 역가가 보호의 가장 좋은 현재 이용가능한 연관성인 것으로 예측되기 때문에, 가장 관련된 것으로 여겨진다(Beyer W et al., Clin Drug Invest.; 15:1-12, 1998).

70 %의 방어항체가 생성율은, CHMP가 또한, 충족되기 위해 전국적으로 유행하는 후보물질 백신을 예상하고, 매년의 게절적인 인플루엔자 백신에 대해 충족하기 위해 정상적으로 필요로 하는 세 가지의 기준 중의 하나로서, 유럽 건강 규제하는 권한(CHMP-인간 사용을 위한 약물 사용 자문위원회)에 의해 정의된다.

그러나, 항원과 관련하여 백신(항원적으로 퇴적된 하나 또는 그 이상의 이종기원 스트레인(들)에 대항하여 오직 30 % 효율적인)이 또한 전 세계적인 유행병의 규모를 감소시키기 위해 필요로 하는 이익일 수도 있고, 상기 전 세계적인 유행병의 스트레인에 대항하는 30 % 효율(30 %의 교차-보호)을 가지는 [전 세계적인 유행 전(pre-pandemic)] 백신을 사용하여 전 세계적인 백신접종 캠페인이 75 %로 상기 임상적인 발병률 및 그 결과로 상기 집단 내에 사망률/사망자 수를 효율적으로 감소시킬 수 있음을, 수학적 모델링은 나타내고 있다. 이에 따라서, 본 발명의 가속된 1차 면역은, 상기 소스(source)에서 출현하는 인플루엔자 스트레인의 억제 또는 인플루엔자 전 세계적인 유행병의 조기 경감을 달성하기 위한 방법이다.

FDA는, 전 세계적인 유행병 인플루엔자 백신의 면허 교부를 뒷받침하기 위해 필요로 하는 임상적인 데이터에서 초안 가이드(draft guidance)(CBER draft criteria)이 발생되었고(the Office of Communication, Training and Manufacturers Assistance로부터 입수가능한 (HFM-40), 1401 Rockville Pike, Suite 200N, Rockville, Md. 20852-1448, or by calling 1-800-835-4709 or 301-827-1800, or from the Internet at www.fda.gov/cber/guidelines.htm), 상기 제안된 기준은 또한, 상기 CHMP 기준을 기초로 한 것이다. 상기 FDA는 약간 상이한 나이 컷-오프 포인트를 사용한다(The FDA uses slightly different age cut-off points). 적절한 종점은, 백신 접종 후의 HI 항체 역가에서 4-배 증가로서 정의된, 1) HI 항체 역가 1:40을 달성하는 대상의 퍼센트, 및 2) 혈청 항체양전율을 유사하게 포함한다. 기하학적 평균 역가(GMT)는 결과를 포함하여야 하지만, 상기 데이터는 추정치(point estimate) 뿐만 아니라, 방어항체가 생성율의 발생율의 95 % 신뢰 구간의 하한가를 포함하여야 하고, 1:40의 HI 역가의 day 42 발생률은 상기 타겟 수치를 충족하거나 초과하여야 한다. 따라서, 이러한 평가의 추정치의 이러한 데이터 및 상기 95 % 신뢰 구간(CI)은 제공되어야 한다. FDA 초안 가이드는 둘 다의 타겟을 충족하는 것을 필요로 한다.

이에 따라서, 본 발명의 하나의 측면에서, 본원에 청구된 바와 같은 조성물, 방법 또는 용도에 대해 제공되고, 상기 M1 폴리펩티드 조성물의 투여에 의해 유도된 상기 면역 반응 또는 보호는 인플루엔자 백신 효능에 대한 모두 세 가지의 EU 규정 기준을 충족한다. 하기의 기준의 적합하게 적어도 하나, 적합하게 두 가지, 또는 세 가지가 상기 조성물의 상기 인플루엔자 스트레인에 대해 충족된다: 혈청반응 음성의 집단에서 >30%, >40%, >50%의 혈청 항체양전율; 혈청반응 음성의 집단에서 >60%, >70%, >80%의 방어혈청가 생성율; 혈청반응 음성의 집단에서 >2.0, >2.5, >3.0, >4.0의 혈청항체양전 인자.

인플루엔자 바이러스

인플루엔자 A 바이러스는 지속적으로 진화하고, 결과로서, 항원 변이를 겪는다(Johnson N P. and Mueller J., "Updating the accounts: global mortality of the 1918-1920 "Spanish" influenza pandemic," Bull. Hist. Med. 76:105-115, 2002, 이의 전체로 참고문헌으로 본원에 포함됨). 전 세계적인 유행기 동안에, 유포되는 인플루엔자 바이러스는 그 이전의 전 세계적인 유행기로부터의 바이러스와 관련된 것이다. 상기 바이러스는, 수명에서 예상보다 일찍 감염으로부터 면역력의 다양한 레벨을 가지는 사람들 중에 확산된다. 보통 2 내지 3 년의 기간 이상의 이러한 순환, 및 상기 바이러스성 RNA 중합효소에 의한 효과적인 교정(proofreading)의 결핍은, 표면 당단백질에서의 아미노산 치환을 결과적으로 야기할 수 있고, 일반적인 집단 중에서 또 다시 유행성을 일으키기에 충분하게 변하는 새로운 스트레인의 선택을 촉진하는, 높은 비율의 번역 오류(transcription error)를 유도한다; 이러한 과정은 '항원 변이(antigenic drift)'로 불린다.

상기 나눠진 바이러스성 게놈(segmented viral genome)은, 항원 변이의 2차 타입(second type)을 가능하게 한다. 예측할 수 없는 간격에서, 둘 또는 그 이상의 인플루엔자 바이러스는 숙주 세포에 동시에 감염되면서, 유전의 재배열은 신규한 인플루엔자 바이러스를 결과적으로 야기할 것이다. 여기서, 상기 결과적으로 생성된 항원은, 인간에서 이전에 유도된 스트레인의 이에 부합하는 단백질로부터 20 내지 50 %로 다양할 수 있다. "항원 대변이(antigenic shift)"로 불리는 이러한 현상은, '집단 면역(herd immunity)'에서 벗어나고, 전세계적인 유행병을 설정하는, 새로운 표면 또는 내부의 단백질을 가지는 신규한 바이러스를 발생할 수도 있다.

이러한 항원성 변화, '대변이(drifts)' 및 '변이(shifts)' 둘 다는 예측불가능하고, 이들은, 상기 바이러스가 잘-알려진, 거의 매년의 전염병을 일으키는 상기 면역 시스템을 벗어날 수 있는, 새로운 인플루엔자 스트레인의 출현을 결국 유도하는 것과 같은, 견해의 면역학적 시점으로부터의 극적인 영향(dramatic impact)을 가질 수도 있다.

매년의 전염병에 추가하여, 효율적인 인간-대-인간 전염될 수 있는 새롭게 출현하는 인플루엔자 바이러스는, 과거에서의 전 세계적인 유행병, 즉, 보다 높은 전염력 및 사망자 수 비율을 가지는 모든 연령 그룹에서의 갑작스러운, 세계적인 유행병을 일으키고 있다. 지난 세기는, 세 가지의 인플루엔자 유행병, 전세계적으로 20 내지 50 백만 사람의 사망에 책임이 있는, 1918 내지 1919 에서의 "스페인 독감", 1957년의 "아시아 독감" 및 1968년의 "홍콩 독감"을 나타내었다.

전국적인 유행병의 인플루엔자 바이러스 스트레인의 특징은 하기이다: 이는 뉴라미니다아제 서브타입에서의 변화에 의해 동반될 수도 있거나 동반되지 않을 수도 있는, 현재 유포되는 스트레인에서 혈구응집소와 비교된 신규한 혈구응집소를 포함한다; 이는 상기 인간 집단에서 수평으로 전염될 수 있다; 및 이는 인간에 대해 발병시킨다. 신규한 혈구응집소는, 확장된 기간 동안, 아마도 1957년에 마지막으로 유포된 H2와 같은 적어도 10 년 동안 인간의 집단에서 분명하지 않는 하나일 수 있거나, 이는 새에서 일반적으로 발견되는, 이전의 인간 집단에서 유포된 적인 없는 혈구응집소, 예를 들어 H5, H9, H7 또는 H6일 수도 있다. 이러한 경우에서, 큰 집단(예를 들어 H2의 경우에) 또는 전체의 (H5, H7, H6 또는 H9) 집단은, 상기 전 세계적인 유행병 인플루엔자 바이러스 스트레인에 대해 면역학적으로 경험이 없다. 현재에, 인간에서 인플루엔자 전 세계적인 유행병을 잠재적으로 일으킬 수 있는 것으로서 WHO에 의해 확인된 인플루엔자 A 바이러스는, 고도로 병원성의 H5N1 조류의 인플루엔자 바이러스이다. 따라서, 본 발명에 따른 사용을 위한 상기 전 세계적인 백신은, 적합하게 H5N1 바이러스를 포함할 것이다. 상기 청구된 조성물 내로 포함을 위한 그 밖의 적합한 스트레인은, H9N2, H7N1, H7N7 또는 H2N2이다.

본 발명의 M1 폴리펩티드는, (1) 본 발명의 M1 폴리펩티드를 인코딩하는 상기 선택된 영역 인플루엔자 게놈이 상기 M2 단백질의 일부를 인코딩하고; (2) 인플루엔자 M1 및 M2 단백질이, 상기 바이러스 입자에 대체로 끼워진 구조적인 단백질이기 때문에, 이러한 항원 변이에 영향을 덜 받기 쉽다. 둘 다의 이러한 이유에 대해, 상기 M1 단백질은 인플루엔자 스트레인 중에서 서열 변화(sequence variation)를 덜 가지고, 아마도(likely) 혈구응집소와 같은 상기 표면 노출된 항원에 나타낸 빠른 항원 변이를 지원하기 위한 능력이 적을 것이다.

DNA 및 RNA 백신

본 발명의 M1 폴리펩티드는 또한, DNA 또는 RNA 백신으로서 유기체로 도입될 수도 있다. 본 발명의 DNA 또는 RNA 백신은, 본 발명의 M1 폴리펩티드를 인코딩할 것이다. 이러한 인코딩된 M1 폴리펩티드는, 스캐폴드 폴리펩티드 내로 융합되거나 캐리어 폴리펩티드를 가지는 인코딩된 융합 단백질에 존재할 수도 있다.

DNA 또는 RNA 구조물을 제조하고 정제하기 위한 분자 생물학의 표준 기술은 본 발명의 DNA 또는 RNA 치료법의 제조를 가능하게 한다. 분자 생물학의 표준 기술이 이러한 발명의 생산물의 생산을 위해 충분하면서, 본원에 기재된 특정한 구조물은 신규한 치료법을 제공한다.

백신 받은 사람(vaccine recipient)에 도입될 발현가능한 DNA 또는 RNA의 양은, DNA 또는 RNA 구조물에서, 및 상기 발현된 유전자 생산물의 면역원성에서 사용된 전사 및 번역 프로모터의 강도에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 약 1 ㎍ 내지 1 mg의 면역학적으로 또는 예방학적으로 유효한 투여량 및 바람직하게는 약 10 ㎍ 내지 300 ㎍은 근육 조직 내로 직접적으로 투여된다. 피하 주사, 피내 도입, 피부를 통한 자국(impression), 및 복강내, 정맥내, 또는 흡입 전달과 같은 투여의 그 밖의 방식이 또한 포함된다. 부스터 백신 접종(booster vaccinations)이 제공될 수도 있음을 또한 예상된다.

DNA 또는 RNA는 있는 그대로 일 수도 있다(The DNA or RNA may be naked), 즉 받은 사람의 면역계에 영향을 주는, 어떠한 단백질, 아쥬반트 또는 그 밖의 제제와 연관되지 않는 것이다. 이러한 경우에, DNA 또는 RNA가, 이로 제한되지 않는, 멸균의 염분 또는 멸균의 완충된 염분과 같은 생리학적으로 허용가능한 용액에 있는 것이 바람직하다. 대안적으로, 상기 DNA 또는 RNA는, DNA-리포솜 혼합물 또는 RNA-리포솜 혼합물로서 본원에 알려진 레시틴 리포솜 또는 그 밖의 리포솜과 같은 리포솜과 연관될 수도 있거나(예를 들어, WO93/24640를 참고하라), 상기 DNA 또는 RNA는 단백질 또는 그 밖의 캐리어와 같은 면역 반응을 부스트하기 위해 본 분야에서 알려진 아쥬반트와 연관될 수도 있다. 이로 제한되지 않는, 칼슘 이온, 바이러스성 단백질 및 그 밖의 형질주입 촉진하는 제제와 같은, DNA 또는 RNA의 세포의 흡수에 도움이 되는 제제는 또한, 유리하게 하도록 사용될 수도 있다. 이러한 제제는 일반적으로, 형질주입 촉진하는 제제로서 및 약제학적으로 허용가능한 캐리어로서 나타낸 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 유전자는, 별개의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 세그먼트(segment)를 나타낸다. 상기 용어 약제학적 및 백신은, 면역 반응을 유도하기 위해 유용한 조성물을 나타내기 위해 교체가능하게 사용된다. 상기 용어 구조물 및 플라스미드는 교체가능하게 사용된다. 상기 용어 벡터는, 유전자가 본 발명의 방법에 따라 사용을 위해 클로닝될 수도 있는 DNA 또는 RNA를 나타내는데 사용된다.

유리 라디칼 스캐빈저 에탄올(free radical scavenger ethanol)(약 3 % 까지의 범위에서) 및 멸균 유리 바이알에서 가장 높은 적절한 DNA 농축물과, 약 8.0 내지 약 적어도 9.5의 pH 범위 내의 생리학적으로 허용가능한 완충용액, 약 300 mM 까지의 범위에서의 염(NaCl, KCl 또는 LiCl을 포함하지만 이로 제한되지 않음), 및 상기 금속 이온 킬레이트제 EDTA(약 5 mM 까지의 범위에서)을 함유하는 데멜탈레이티드 용액(demetalated solution)을 포함하는 DNA 백신 제형은, 생리학적으로 허용가능한 완충용액에 및 빛으로부터 높게 정제된, 뉴클레아제 프리 DNA를 보호하기 위해 포장된다. 본 발명의 특정한 측면에서, 상기 DNA 백신 제형은, EDTA 및 에탄올의 조합, 약 100 mM 내지 약 200 mM의 농도에서의 NaCl, 약 1 μM 내지 약 1 mM의 범위에서의 EDTA, 약 2 %까지 존재하는 에탄올, 생리학적으로 허용가능한 완충용액 및 빛으로부터 매우 정제된, 뉴클레아제 프리 DNA를 보호하기 위해 포장된, 멸균 유리 바이알에서 가장 높은 적절한 DNA 농축물에서의 모두를 포함한다.

상기 내용의 DNA 또는 RNA 백신은, 예를 들어, 특정한 숙주에 대한 최적화된 코돈 사용, 유전자 코드(genetic code)의 결과로서 변형된 서열을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, "최적화된"은, 주어진 종에서 이의 발현을 증가시키기 위해 유전적으로 설계된 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 인플루엔자 폴리펩티드를 위해 코딩하는(coding) 최적화된 폴리뉴클레오티드를 제공하기 위해, 상기 인플루엔자 단백질 유전자의 DNA 또는 RNA 서열은, 1) 특정한 종에서 잘 발현된 유전자에 의해 선호되는 코돈을 포함하거나; 2) 상기 종에서 실질적으로 발견되도록, 뉴클레오티드 염기 조성에서 A+T 또는 G+C 함량을 포함하거나; 3) 상기 종의 개시 서열을 형성하거나; 또는 4) RNA의 불안정화, 부적절한 아데닐산중합반응, 저하(degradation) 및 종료를 일으키거나, 2차 구조 헤어핀 또는 RNA 스플라이스 부위(splice sites)를 형성하는 서열을 제거하도록, 변형될 수 있다. 상기 종에서 인플루엔자 단백질의 증가된 발현은, 진핵생물 또는 원핵생물, 또는 특정한 종에서의 코돈 사용의 분포 빈도를 사용함으로써 달성될 수 있다. 상기 용어 "바람직한 코돈 사용의 빈도(frequency of preferred codon usage)"는, 제공된 아미노산을 명시하기 위해 뉴클레오티드 코돈의 사용에서 특정한 숙주 세포에 의해 나타낸 선호도(preference)를 나타낸 것이다. 대부분 하나 이상의 코돈에 의해 특정된, 20 개의 천연 아미노산(natural amino acids)이 있다. 따라서, 모든 변성된 뉴클레오티드 서열은, 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 상기 인플루엔자 폴리펩티드의 아미노산 서열이 기능적으로 변화지 않는 동안에 나타낸 내용으로 포함된다.

혼성화 반응은, 상이한 "엄격성(stringency)"의 조건 하에서 실행될 수 있다. 혼성화 반응의 엄격성을 증가시키는 조건은 알려져 있다. 예를 들어, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd Ed., Sambrook et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)를 참고하라.

본 발명의 DNA 백신을 제조하고 투여하는데 있어서의 추가적인 상세한 사항은, 참고문헌으로 본원에 포함된 U.S. Pat. No. 7,927,870에서 발견된다. RNA 백신을 제조하고 사용하는데 있어서의 추가적인 상세한 사항은, 참고문헌에 의해 본원에 의해 포함된, Ulmer et al., "RNA-based vaccines", Vaccine 30:4414-4418, 2012에서 발견된다.

백신 제조

M1 폴리펩티드의 제조는 본 분야에서 잘 알려져 있다. 면역 반응을 유도하기 위한 충분한 농도에서 순도의 원하는 정도에서의 M1 폴리펩티드는, 생리학적으로 허용가능한 캐리어와 혼합된다. 생리학적으로 허용가능한 캐리어는 상기 백신에서 사용된 투여량 및 농도에서의 받는 사람에 대해 비독성이다. 일반적으로, 상기 백신은, 주사, 일반적으로 근육내 또는 피하 주사를 위해 제형화된다. 주사를 위한 적절한 캐리어는 멸균수를 포함하지만 바람직하게는, 인산 완충 식염수 또는 링거의 락테이트와 같은 완충 염 용액과 같은 생리학적 염 용액이다. 상기 백신은 일반적으로 아쥬반트를 함유한다. 유용한 아쥬반트는, 세포독성 T-세포, 및 alum(수산화알루미늄 아쥬반트)를 자극하는, QS21(Quillaja saponaria, commercially available from Cambridge Biotech, Worcester, Mass.)을 포함한다. 세포의 또는 국소의 면역력을 향상시키는 상이한 아쥬반트를 가지는 제형이 또한 사용될 수도 있다. 특히, 사이토카인과 같은 면역강화제(immunopotentiators)는 상기 백신에 포함될 수 있다. 적절한 면역강화제 사이토카인의 예는, 인터류킨-2(IL-2) 및 인터류킨-12(IL-12)과 같은 인터류민, 및 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)를 포함한다.

상기 백신에 존재할 수 있는 추가적인 부형제는, 저분자량 폴리펩티드(약 10 개의 잔기 미만), 단백질, 아미노산, 글루코스 또는 덱스트란을 포함하는 탄수화물, EDTA와 같은 킬레이트제, 및 미생물의 성장을 저해하거나 단백질을 멸균하는 그 밖의 부형제를 포함한다.

본 발명에 따른 백신은 또한, 세포독성의 T-세포 반응을 유도하는 단백질을 발현하기 위해 특이적으로 설계된 하나 또는 그 이상의 조작된 바이러스를 함유할 수 있다. 적절하게 조작된 바이러스는, 예를 들어, 카나리아두바이러스(Canary Pox virus), 종두 바이러스(vaccinia viruses), 아데노바이러스(Adenovirus), 약화된 인간 헤르페스 바이러스(attenuated human herpes viruses)(예를 들어, 헤르페스 바이러스와 같은) 및 수두 대상포진(Varicella Zoster)로부터 유도된다. 대표적으로 조작된 바이러스는, 세포독성 T-세포 반응을 유도할 수 있는 M1 폴리펩티드를 발현하기 위해 변형된다. 상기 M1 폴리펩티드의 백신을 가지는 면역법은, 상기 면역 반응을 부스트하기 위해 상기 M1 폴리펩티드 서열(들)의 하나 또는 그 이상의 투여량의 투여 후에 될 수 있다.

하나의 실시형태에서, 본 발명에 따른 사용을 위한 1차 조성물이 보조가 된다. 특정한 실시형태에서, 상기 아쥬반트는 수중 유적형 에멀젼-기초된 아쥬반트(oil-in-water emulsion-based adjuvant) 또는 아쥬반트 시스템이다. 하나의 실시형태에서, 상기 수중 유적형 에멀젼은, 대사작용 가능한 오일 및 유화제, 및 임의적으로 스테롤 및/또는 알파-토코페롤과 같은 토콜을 포함한다. 다른 특정한 실시형태에서, 상기 수중 유적형 에멀젼 아쥬반트는 전체 부피의 0.5 % 내지 20 %의 양으로 적어도 하나의 대사가능한 오일을 포함하고, 강도에 의한 적어도 70 %가 1 ㎛ 미만의 직경을 가지는 오일 액적(oil droplets)을 가진다.

상기 용어 대사가능한 오일의 의미는 본 분야에서 널리 알려져 있다. 대사가능하다는 것은 '물질대사에 의해 변형될 수 있는 것'으로서 정의될 수 있다(Dorland's Illustrated Medical Dictionary, 25th Ed., W.B. Sanders Company (1974)). 상기 오일은, 받는 사람에게 독성을 나타내지 않고, 물질대사에 의해 변형될 수 있는, 어떠한 식물성 오일, 어류 오일, 동물 오일 또는 합성 오일일 수도 있다. 견과류, 씨앗, 및 곡물은 식물성 오일의 공통의 근원이다. 합성 오일은 또한 본 발명의 일부이고, NEOBEE™ 및 그 밖의 것들과 같은 상업적으로 상업적으로 이용가능한 오일을 포함할 수 있다. 특히 적절한 대사가능한 오일은 스쿠알렌이다. 스쿠알렌[(2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥사엔(tetracosahexaene)]은, 상어 간유에서 다량으로 및 올리브 오일, 밀배아유(wheat germ oil), 미강 오일(rice bran oil) 및 효모에서 작은 양으로 발견되는 불포화 오일이고, 본 발명에서 사용을 위한 특히 적합한 오일이다. 스쿠알렌은 콜레스테롤의 생합성 동안에 효소적으로 변형되는 사실 때문에 대사가능한 오일이다(Merck Index, 10th Edition, entry no. 8619). 하나의 실시형태에서, 상기 대사가능한 오일은, 상기 면역원성 조성물의 전체 부피의 0.5 % 내지 20 %(최종 농도)의 양, 적합하게 전체 부피의 1.0 % 내지 10 %의 양, 적합하게 전체 부피의 2.0 % 내지 6.0 %의 양으로 존재한다. 특정한 실시형태에서, 상기 대사가능한 오일은, 상기 면역원성 조성물의 전체 부피의 약 0.25 내지 1.25 %(v/v)의 양으로 존재한다.

적합하게 본 발명의 수중 유적 에멀젼 시스템은, 서브-미크론 범위(sub-micron range)에서 작은 오일 액적 크기를 가진다. 적합하게, 상기 액적 크기는 범위 120 내지 750 nm, 적합하게 직경에서 120 내지 600 nm의 크기일 것이다. 전형적으로, 상기 수중 유적 에멀젼은, 강도에 의해 적어도 70 %가 직경에서 500 nm 미만이고(at least 70% by intensity are less than 500 nm in diameter), 특히 강도에 의해 적어도 80 %가 직경에서 300 nm 미만이고, 적절하게 강도에 의해 적어도 90 %가 직경에서 120 내지 200 nm의 범위에 있는 오일 액적을 함유한다.

본 발명에 따른 수중유적 에멀젼은 또한 스테롤 및/또는 토코페롤, 특히 알파 토코페롤과 같은 토콜을 포함할 수도 있다. 스테롤은 본 분야에서 널리 알려져 있고, 예를 들어 콜레스테롤은 동물 지방에서 발견된 자연적으로 발생하는 스테롤로서 Merck Index, 11th Ed., page 341로 기재되어 있다. 그 밖의 적절한 스테롤은, β-시토스테롤, 스티그마스테롤, 에르고스테롤 및 에르고칼시페롤을 포함한다. 상기 스테롤은, 상기 면역원성 조성물의 전체 부피의 약 0.01 % 내지 약 20 %(w/v)의 양, 적절하게 약 0.1 % 내지 약 5 % (w/v)의 양으로 적절하게 존재한다. 적절하게, 상기 스테롤이 콜레스테롤이라면, 이는 전형적으로 0.5 ml 백신 투여 부피에서 약 0.02 %(w/v)의 양으로, 상기 면역원성 조성물의 전체 부피의 약 0.02% 내지 약 0.2 %(w/v) 사이의 양으로 존재한다.

토콜(예를 들어, 비타민 E)는 또한, 오일 에멀젼 아쥬반트로 종종 사용된다(EP 0 382 271 B1; U.S. Pat. No. 5,667,784; WO 95/17210). 본 발명의 상기 오일 에멀젼(임의적으로 수중유적형)에서 사용된 토콜은 EP 0 382 271 B1에 기재된 바와 같이 제형화될 수도 있고, 상기 토콜은, 직경에서 임의적으로 1 미크론 미만의, 임의적으로 유화제를 포함하는, 토콜 액적의 분산일 수도 있다. 대안적으로, 상기 토콜은, 오일 에멀젼의 오일 상을 형성하기 위해, 또 다른 오일과 함께 사용될 수도 있다. 토콜과 함께 사용될 수 있는 오일 에멀젼의 예는, 상기에 기재된 대사가능한 오일과 같은, 본원에 기재된 것이다.

수중유적 에멀젼은 유화제를 포함한다. 상기 유화제는 상기 면역원성 조성물의 약 0.01 내지 약 5.0 중량%(w/w)의 양으로 존재하고, 적합하게 약 0.1 내지 약 2.0 중량%의 양(w/w)으로 존재할 수도 있다. 적합한 농도는 상기 전체 조성물의 약 0.5 내지 약 1.5 중량%(w/w)이다.

유화제는 적합하게 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트일 수도 있다(폴리소르베이트 80 또는 Tween 80). 특정한 실시형태에서, 0.5 ml 백신 투여 부피는 1% (w/w) Tween 80을 함유하고, 0.7 ml 백신 투여 부피는 약 0.7% (w/w) Tween 80을 함유한다. 다른 특정한 실시형태에서, Tween 80의 농도는 약 0.1% 또는 약 0.2% (w/w)이다. 하나의 측면에서, 폴리소르베이트 80의 양은, 백신 투여량 당 약 4.9 mg이고, 적절하게 백신 투여량 당 약 4.6 내지 약 5.2 mg이다. 다른 측면에서, 폴리소르베이트 80의 양은 백신 투여량 당 약 2.4 mg, 적절하게 백신 투여량 당 약 2.0 내지 약 2.8 mg이다. 다른 측면에서, 폴리소르베이트 80의 양은 백신 투여량 당 약 1.2 mg이고, 적절하게 백신 투여량 당 약 1.0 내지 약 1.5 mg이다. 다른 측면에서, 폴리소르베이트 80의 양은 백신 투여량 당 약 0.6 mg, 적절하게 백신 투여량 당 약 0.4 내지 0.8 mg이다.

수중유형 에멀젼 아쥬반트는 다른 아쥬반트 또는 면역-자극제로 이용될 수도 있고, 따라서, 본 발명의 중요한 실시형태는, 스쿠알렌 또는 또 다른 대사가능한 오일, 알파 토코페롤과 같은 토코페롤, 및 Tween 80을 포함하는 수중유형 제형이다. 수중유형 에멀젼은 또한, Span 85(폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리올레이트) 및/또는 레시틴을 함유할 수도 있다. 전형적인 수중유형은 상기 면역원성 조성물의 전체 부피의 약 2 내지 약 10 % 스쿠알렌, 2 내지 10 %의 알파 토코페롤 및 약 0.3 내지 약 3 % Tween 80을 포함할 것이고, WO 95/17210에 기재된 절차에 따라 생산될 수도 있다. 적합하게, 스쿠알렌:알파 토코페롤의 비율은 이러한 것은 보다 안정적인 에멀젼을 제공하는 것과 같이 1 이하이다. Span 85는 또한, 예를 들어 약 1 %의 레벨로 존재할 수도 있다.

상기 인플루엔자 백신 제조는, 티오메르살(thiomersal)과 같은 보존제의 존재에서 제조될 수도 있다. 적절하게, 상기 보존제, 특히 티오메르살은, 약(around) 100 g/ml의 농도로 존재한다. 대안적으로, 상기 인플루엔자 백신 제조는, 20 ㎍/ml을 초과하지 않거나, 적절하게 5 ㎍/ml 미만의 농도와 같은, 보존제, 특히 티오메르살의 낮은 레벨의 존재로 제조된다. 또 다른 적절한 대안적인 실시형태에서, 상기 인플루엔자 백신 제조는 티오메르살의 존재에서 제조된다. 적절하게 상기 결과적으로 생성된 인플루엔자 백신 제조는, 유기수은화합물 보존제(organomercurial preservatives)의 부재에서 안정적이고; 특히 상기 제제는 어떠한 잔류하는 티오메르살을 함유하지 않는다. 특히, 상기 인플루엔자 백신 제제는, 티오메르살의 부재 또는 낮은 레벨(일반적으로 5 ㎍/ml 이하)의 티오메르살에서 안정화된 M1 폴리펩티드 항원을 포함한다. 명확하게, B 인플루엔자 스트레인의 안정화는, 알파 토코페롤 숙시네이트(alpha tocopherol succinate)(또한 비타민 E 숙시네이트, 즉 VES로서 알려짐)와 같은, 알파 토코페롤의 유도체의 의해 실행된다. 이러한 제제 및 이들을 제조하는 방법은, 이의 전체로 참고문헌에 의해 본원에 의해 포함된 WO 02/097072에 기재되어 있다.

상기 아쥬반트된 M1 폴리펩티드의 하나의 투여량의 부피는, 약 0.25-1 ml 일 수도 있고, 일반적으로, 성인 제형에 대해 약 0.5 ml에 해당한다. 적절하게 0.5 ml 성인 투여량은, 약 0.25 ml 아쥬반트 플러스 약 0.25 ml 항원에 해당한다. 각각의 백신은 약 15 ㎍ M1 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 대안적인 실시형태에서, 각각의 백신 투여량은 약 15 ㎍ 미만, 적절하게 약 10 ㎍ 미만의 양과 같은 낮은 양의 M1 폴리펩티드를 함유한다. 상기 백신 조성물이 본원에 정의된 바와 같은 효능 기준 중의 적어도 하나를 충족하도록, 적절한 양은 약 2 ㎍, 약 4 ㎍, 약 5 ㎍, 약 7.5 ㎍, 또는 약 10 ㎍ M1 폴리펩티드 또는 약 15 ㎍ 보다 낮은 M1 폴리펩티드의 어떠한 적절한 양이다. 유리하게, 규정 기준을 충족하는 것을 가능하게 하는 약 0.5 ㎍ 미만과 같은 약 1 ㎍ 이하의 M1 폴리펩티드 투여량은, 상기에 정의된 것이다. 약 1 ml의 백신 투여량(약 0.5 ml 아쥬반트 플러스 약 0.5 ml 항원 제조)는 또한 적절하다. 약 0.25 ml의 백신 투여량(예를 들어, 약 0.125 ml 아쥬반트 플러스 약 0.125 ml 항원 제제)은 또한 특히 상기 소아 집단에서 적합하다. 상기 M1 폴리펩티드 백신의 하나의 투여량의 부피는 약 0.25-1 ml 사이일 수 있고, 일반적으로 성인 제형에 대해 약 0.5 ml에 대응한다. 적합하게 0.5 ml 성인 투여량은 약 0.25 ml 아쥬반트 플러스 약 0.25 ml 항원에 대응한다. 약 1 ml의 백신 투여량(약 0.5 ml 아쥬반트 플러스 약 0.5 ml 항원 제제)은 또한 적절하다. 약 0.25 ml의 백신 투여량(예를 들어, 약 0.125 ml 아쥬반트 플러스 약 0.125 ml 항원 제제)은 또한 특히, 소아 집단에서 적합하다.

면역 자극제

다른 실시형태에서, 상기 조성물은, 추가적인 아쥬반트, 특히 TLR-4 리간드 아쥬반트, 적합하게 지질 A의 비-독성 유도체를 포함할 수도 있다. 적합하게 TLR-4 리간드는 3 de-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)이다. 그 밖의 적절한 TLR-4 리간드는 지질단당류(LPS) 및 유도체, MDP(무라밀 디펩티드) 및 RSV의 F 단백질이다.

하나의 실시형태에서, 상기 조성물은, 지질 A의 비-독성 유도체와 같은 톨 유사 수용체(TLR) 4 리간드(Toll like receptor 4 ligand), 특히 모노포스포릴 지질 A 또는 보다 특히 3-디아실된 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)을 추가적으로 함유할 수도 있다.

바람직하게는 3D-MPL인, 상기 지질다당류는, 상기 면역원성 조성물의 인간 투여량 당 1 내지 50 ㎍ 사이의 양으로 사용될 수 있다. 유리하게, 3D-MPL은 약 25 ㎍, 예를 들어, 20-30 ㎍, 적합하게 21-29 ㎍ 또는 22 내지 28 ㎍, 또는 23 내지 27 ㎍, 또는 24 내지 26 ㎍, 또는 25 ㎍의 레벨로 사용된다. 다른 실시형태에서, 상기 면역원성 조성물의 상기 인간 투여량은, 약 10 ㎍, 예를 들어 5 내지 15 ㎍, 적합하게 6 내지 14 ㎍, 예를 들어 7 내지 13 ㎍ 또는 8 내지 12 ㎍ 또는 9 내지 11 ㎍, 또는 10 ㎍의 레벨로 3D-MPL을 포함한다. 추가적인 실시형태에서, 상기 면역원성 조성물의 인간 투여량은, 약 5 ㎍, 예를 들어 1 내지 9 ㎍, 2 내지 8 ㎍ 또는 적합하게 3 내지 7 ㎍ 또는 4 내지 6 ㎍, 또는 5 ㎍의 레벨로 3D-MPL을 포함한다.

MPL의 투여량은 적합하게, 인간에서 항원에 대한 면역 반응을 증진시킬 수 있다. 특히, 적합한 MPL 양은, 상기 보조되지 않은 조성물(unadjuvanted composition)과 비교된, 또는 반응원성 프로파일로부터 허용가능하면서, 또 다른 MPL 양과 보조된 상기 조성물과 비교된 상기 조성물의 면역원성 가능성을 향상시키는 것이다.

지질 A의 합성 유도체는 알려져 있고, 몇몇은 TLR-4 작용물질로서 기재되어 있고, 하기를 포함하지만 이로 제한되지 않는다: OM174 (2-데옥시-6-o-[2-데옥시-2-[(R)-3-도데카노일옥시테트라-데카노일아미노]-4-o-포스-포노-.베타.-D-글루코피라노실]-2-[(R)-3-히드록시테트라데카노일아미노]-.알파.-D-글루코피라노실디히드로겐포스페이트), (WO 95/14026) OM 294 DP (3S,9R)-3-[(R)-도데카노일옥시테트라데카노일아미노]-4-옥소-5-아자-9(R)-[(R)-3-h-y드록시테트라데카노일아미노]데칸-1,10-디올,1,10-비스(디히드로게노포스페이트)(예를 들어, WO99/64301 및 WO 00/0462를 참고하라) OM 197 MP-Ac DP (3S-,9R)-3-[(R)-도데카노일옥시테트라데카노일아미노]-4-옥소-5-아자-9-[(R)-3-히드록시테트라데카노일아미노]데칸-1,10-디올, 1-디히드로게노포스페이트 10-(6-아미노헥사노에이트)(WO 01/46127을 참고하라)

사용될 수도 있는 그 밖의 TLR4 리간드는 WO9850399 또는 U.S. Pat. No. 6,303,347에 기재된 것들과 같은, 알킬 글루코사미나이드 포스페이트(Alkyl Glucosaminide Phosphates, AGPs), 또는 U.S. Pat. No. 6,764,840에 기재된 바와 같은 AGPs의 약제학적으로 허용가능한 염이고, 모든 세 가지 특허 문서는 이의 전체로 참고문헌으로 본원에 의해 포함된다. 몇몇의 AGPs는 TLR4 작용물질(agonists)이고, 몇몇은 TLR4 작용물질이다. 둘 다는 아쥬반트로서 유용할 것으로 생각된다.

TLR-4를 통해 신호전달 반응을 일으킬 수 있는 그 밖의 적합한 TLR-4 리간드(Sabroe et al, J Immunol. 171(4):1630-5, 2003, 이의 전체로 참고문헌에 의해 본원에 의해 포함됨)은, 예를 들어, 그람-음성 박테리아 및 이의 유도체로부터의 지질다당류, 또는 이의 단편, 특히 LPS(3D-MPL와 같은)의 비-독성 유도체이다. 그 밖의 적절한 TLR 작용물질은 하기이다: 열충격 단백질 (HSP) 10, 60, 65, 70, 75 또는 90; 계면활성 단백질 A, 히알루로난 올리고당, 헤어핀 술페이트 단편(heparin sulphate fragments), 피브로넥틴 단편, 피브로노겐 펩티드 및 b-디펜신-2, 무라밀 디펩티드(MDP) 또는 호흡 기관의 합포체 바이러스의 F 단백질. 하나의 실시형태에서, 상기 TLR 작용물질은 HSP 60, 70 또는 90이다.

톨-유사 수용체(TLRs)는 곤충과 인간 사이에 진화론적으로 보존된, 타입 I 트랜스멤브레인 수용체이다. 10 가지의 TLRs는 어느 정도로 잘 설정되어 있다(TLRs 1-10)(Sabroe et al, J Immunol. 171(4):1630-5, 2003, 이의 전체로 참고문헌에 의해 본원에 의해 포함됨). 상기 TLR 패밀리의 멤버는 유사한 세포외 및 세포내 도메인을 가지고; 이들의 세포외 도메인은 류신--리치 반복 서열(rich repeating sequences)을 가지는 것으로 나타났고, 이들의 세포내 도메인은 상기 인터류킨-1 수용체(IL-1R)의 상기 세포내 영역과 유사하다. TLR 세포는 면역 세포 및 그 밖의 세포 중에서 구별하여 발현된다(맥관의 상피 세포, 지방세포, 심장의 미오사이트(cardiac myocytes) 및 장의 상피 세포를 포함함). 상기 TLRs의 세포내 도메인은, 사이토카인의 NF-KB 활성화를 유도하는, 이의 세포질의 영역에서 IL-1R 도메인을 또한 포함하는, 아답터 단백질(adaptor protein) Myd88와 상호작용할 수 있다; 이러한 Myd88 경로는, 사이토카인이 TLR 활성화에 의해 영향을 받는 하나의 방식이다. TLRs의 주요한 발현은, 항원 제시 세포(예를 들어, 수지상 세포, 대식 세포 등)와 같은 세포 타입에 있다.

다른 실시형태에서, 상기 아쥬반트 및 면역원성 조성물은 추가적으로 사포닌 아쥬반트를 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위해 특히 적절한 사포닌은, Quil A 및 이의 유도체이다. Quil A는, 남 아메리카 나무 퀄라야 사포나리아 몰리나로부터 분리된 것이고, 아쥬반트 활성도를 가지기 위해, 이의 전체로 참고문헌으로 본원에 포함되는, Dalsgaard et al., In "Saponin adjuvants," Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, pg 243-254, Springer Verlag, Berlin (1974)에 의해 첫 번째로 기재되어 있다. Quil A의 정제된 단편은, 예를 들어, QS7 및 QS21(또한 QA7 및 QA21로서 알려짐), Quil A (EP 0 362 278)와 연관된 독성 없이 아쥬반트 활성도를 유지하는 HPLC에 의해 분리된다. QS-21은, CD8+ 세포독성의 T 세포(CTLs), Th1 세포 및 지배적인 IgG2a 항체 반응을 유도하고, 본 발명의 내용에서 바람직한 사포린인, 퀄라야 사포나리아 몰리나의 나무껍질로부터 유도된 천연의 사포닌이다. 본 발명의 적합한 형태에서, 상기 면역원성 조성물에서 상기 사포닌 아쥬반트는, 사포나리아 몰리나 quil A의 유도체, 바람직하게, QS-17 또는 QS-21, 적합하게 QS-21와 같은 Quil A의 면역학적으로 유효한 부분이다. 하나의 실시형태에서, 본 발명의 조성물은, 실질적으로 순수한 형태에서 면역학적으로 유효한 사포닌을 함유한다. 바람직하게, 본 발명의 조성물은 실질적으로 순수한 형태로 QS21을 함유하고, 다시 말해서, QS21이 적어도 90 % 순수한, 예를 들어, 적어도 95 % 순수한, 또는 적어도 98 % 순수한 것이다.

다른 유용한 사포닌은, 식물 아에스큘루스 히프포카스타늄(Aesculus hippocastanum) 또는 지요필라 스트류티움(Gyophilla struthium)으로부터 유도된 것이다. 문헌에 기재된 그 밖의 사포닌은, 아에스큘루스 히프포카스타늄, 홀스 체스트넛 트리의 씨앗에서 발생하는 사포닌의 혼합물로서 Merck Index (12th Ed: entry 3737)에 기재된, Escin을 포함한다. 이의 분리는, 이온-교환 수지(Erbring et al., U.S. Pat. No. 3,238,190, 이의 전체로 참고문헌에 의해 본원에 의해 포함됨) 및 크로마토그래피 및 정제(Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953), 이의 전체로 참고문헌에 의해 본원에 의해 포함됨)에 의해 기재된다. 스시온(scion)의 분획은 생물학적으로 활성화되기 위해 정제되고 나타낸 것이다(Yoshikawa M. et al., Chem Pharm Bull (Tokyo) 44(8):1454-1464, 1996, 이의 전체로 참고문헌에 의해 본원에 의해 포함됨). 지요필라 스트류티움으로부터의 사포알빈(Sapoalbin)(Vochten et al., J. Pharm. Belg. 42:213-226, 1968, 이의 전체로 참고문헌에 의해 본원에 의해 포함됨)은 또한 선택이다.

3D-MPL 및/또는 QS21의 투여량은 적합하게, 인간에서 항체에 대한 면역 반응을 증진시킬 수 있다. 특히, 적절한 3D-MPL 및/또는 QS21 양은, 상기 보조되지 않은 조성물과 비교되거나, 또는 반응원성 프로파일로부터 허용가능하면서, 또 다른 3D-MPL 또는 QS21 양으로 보조되는 조성물과 비교된, 상기 조성물의 면역학적 가능성을 개선하는 것이다. 인간 투여를 위해 전형적으로, 상기 사포닌(예를 들어, QS21) 및/또는 LPS 유도체(예를 들어, 3D-MPL)은, 투여 당 10-50 ㎍, 또는 1 ㎍-25 ㎍와 같은, 1 ㎍-200 ㎍의 범위에서 면역원성 조성물의 인간 투여량에 존재할 것이다.

추가적인 면역자극제가 임의적으로 포함된 아쥬반트는 유아 및/또는 나이든 사람들에 대한 백신 제형으로 특히 적합하다.

백신 접종

본 발명의 조성물은, 피내, 점막, 예를 들어, 비강내, 구강, 근육내, 피하내, 경막내, 정맥내, 점막, 또는 폐와 같은 어떠한 적절한 수송 경로에 의해 투여될 수도 있다. 다른 수송 경로는 본 분야에서 널리 알려져 있다.

근육내 수송 경로는, 본 발명의 M1 폴리펩티드 조성물에 대해 특히 적합하다. 본 발명에 따른 상기 조성물은, 특히 전 세계적인 유행의 백신에 대해 적합한, 단일투여 용기(monodose container), 대안적으로, 다중투여 용기(multidose container)에 존재할 수도 있다. 이러한 경우에, 티오메르살과 같은 항균성 보존제는 전형적으로 사용 동안에 오염을 방지하기 위해 존재하는 것이다. 티오메르살 농도는 25 ㎍/0.5 ml 투여량(즉, 50 ㎍/mL)일 수도 있다. 5 ㎍/0.5 ml 투여량(즉, 10 ㎍/ml) 또는 10 ㎍/0.5 ml 투여량(즉, 20 ㎍/ml)의 티오메르살 농도가 적합하게 존재한다. 적합한 IM 전달 디바이스는, 바늘-프리 액체 제트 주입 디바이스(needle-free liquid jet injection device), 예를 들어, Biojector 2000 (Bioject, Portland, Oregon)과 같이 사용될 수 있다. 대안적으로, 펜-인젝터 디바이스(pen-injector device)가 사용될 수 있다. 이러한 전달 디바이스의 용도는 유행시기(pandemic) 동안에 필요로 하는 것과 같은 대규모의 면역 캠페인에 대해 특히 받아들여질 수도 있다.

피내의 수송은 또 다른 적합한 경로이다. 어떠한 적합한 디바이스는, 이의 전체로 참고문헌에 의해 본원에 포함된, WO99/34850 및 EP1092444에 기재된 것과 같은, 피부 내로 바늘의 효과적인 침투 길이를 한정하는 디바이스와 같은, 예를 들어, 바늘-프리 또는 짧은 바늘 디바이스 및 이의 기능적인 등가물이 피내 수송을 위해 사용될 수도 있다. 또한, 피부에 도달하는 제트(jet)를 생산하고, 각질층(stratum corneum)을 찌르는 바늘을 통해 또는 액체 제트 주입기를 통해 피부로 액체 백신을 전달하는 제트 주입 디바이스가 또한 적절하다. 또한, 피부(dermis)에 상기 피부(skin)의 외층을 통해 분말 형태로 백신을 가속화하기 위한 압축된 가스를 사용하는 탄도의 분말/입자 전달 디바이스(ballistic powder/particle delivery devices)가 또한 적절하다. 추가적으로, 통상적인 주사기는 피내 투여의 고전적인 망투 방법(classical mantoux method)으로 사용될 수도 있다.

또 다른 적합한 투여 경로는 피하 경로이다. 어떠한 적합한 디바이스는 고전적인 바늘 또는 바늘-프리 제트 주입기 서비스(needle-free jet injector service)로, 피하 수송에 대해 사용될 수도 있다. 적합하게 상기 디바이스는 상기 액체 백신 제형으로 미리-충진된다(pre-filled).

대안적으로, 상기 백신은 비강 내로 투여된다. 전형적으로, 상기 백신은, 적합하게 폐 내로 흡입 없이 비인두 영역(nasopharyngeal area)으로 국소적으로 투여된다. 이는 폐에 들어가는 것 없이 또는 실질적으로 없는 비인두 영역으로 상기 백신 제형을 전달하는 비인두 전달 디바이스를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 상기 백신의 비강내 투여를 위한 적합한 디바이스는, 본 분야에서 널리 알려진 분무 디바이스이다.

대안적으로, 상기 상피 또는 트랜스더말(transdermal) 백신 접종 경로는 본 발명에서 또한 포함된다.

항체

본 발명의 항체는, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 M1 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 가질 것이다. 본 발명의 항체는 상기에 기재된 바와 같은 모든 형태를 포함한다. 실시형태에서, 상기 항체는 특정한 유기체를 위해 조작될 것이다. 상기 유기체는, 인간, 개, 또는 예를 들어 돼지, 말, 개, 고양이, 닭, 또는 그 밖의 새와 같은 상업적으로 가치가 큰 가축일 수 있다. 상기 항체의 이러한 조작은, 본 분야에서 알려진 레퍼토리 기술 또는 모노클로날 기술 중의 어떠한 것을 사용한, 예를 들어 인간화(humanization), 휴마네어링(humaneering), 키메리제이션(chimerization), 또는 인간(또는 그 밖의 유기체) 항체를 분리하는 것을 포함한다.

항원-특이적인 인간 항체의 분리를 위한 설정된 방법은, 인간 면역글로불린 위치(human immunoglobulin loci)에 대한 유전자이식(transgenic)인 마우스로부터의 하이브리도마의 스크리닝을 포함하고(예를 들어, Jakobavits, Adv Drug Deliv Rev. 31:33-42, 1998, 이의 전체로 참고문헌으로 본원에 의해 포함됨), 인간 항체 단편의 재조합 라이브러리가, 실모양의 박테리오파지(filamentous bacteriophage)(예를 들어, McCafferty et al., Nature 348:552-4, 1990, 이의 전체로 참고문헌에 의해 본원에 의해 포함됨), 효모 세포(예를 들어, Boder and Wittrup, Nat Biotechnol 15:553-7, 1997, 이의 전체로 참고문헌에 의해 본원에 의해 포함됨) 및 리보솜(예를 들어, Hanes and Pluckthun, Proc Natl Acad Sci USA 94:4937-42, 1997, 이의 전체로 참고문헌에 의해 본원에 의해 포함됨)에 인코딩되고 전시되는, 생체외 방법은 고정된 항원에 대항하는 것을 보여준다. 이러한 방법은 많은 유용한 인간 항체를 수득하고 있다.

인간 면역글로불린 자리에 대한 마우스 유전자 이식은 일반적으로 인간 다양성의 완전한 보체를 발현하지 않지만, 이러한 형질전환 동물에서 발현된 인간 항체는 친화성 성숙을 받을 수 있다. 원하는 높은 친화도 및 특이성의 항체는 이러한 형질전환 마우스로부터 수득될 수도 있는 반면에, 전시 기술(display technologies)로부터 수득된 인간 항체는, 이러한 전시 항체가 상기 전시 시스템에서 자연발생적인 친화도 성숙을 겪지 않는 것과 같이 사용된 상기 항체 레퍼토리에 의해 제한될 것이다.

특이성 및 친화도를 유지하면서 비-인간 항체의 면역원성을 최소화하기 위해 가장 널리 사용된 방법은, 상기 비-인간 프레임워크에 대한 이들의 구조적인 상동에 대해 전형적으로 선택된 인간 프레임워크로 상기 비-인간 항체의 CDRs를 이식(grafting)하는 것을 포함한다(Jones et al., Nature 321:522-5, 1986; U.S. Pat. No. 5,225,539, 이들 둘 다는 이의 전체로 참고문헌에 의해 본원에 포함됨). 본래 이러한 방법은 친화도의 급격한 손실을 결과적으로 야기한다. 그러나, 몇몇의 친화도는, 비-인간 CDRs 1 및 2 의 표준이 되는 구조를 유지하기 위해 필요로 하는 상기 프레임워크에서 중요한 위치에서의 상기 비-인간 잔기를 회복함으로써 회복될 수 있음을 나타내고 있다(Bajorath et al., J Biol Chem. 270:22081-4, 1995; Martin et al., Methods Enzymol. 203:121-53, 1991; Al-Lazikani, J Mol Biol. 273:927-48, 1997; all of which are hereby incorporated by reference in their entirety). CDR3s의 자연발생적인 입체구조를 회복하는 것은, 이러한 구조가 보다 가변적이기 때문에 보다 불확실한 엔터프라이즈(more uncertain enterprise)이다. 따라서, 비-인간 잔기가 기능적인 CDR3 입체구조를 회복하기 위해 회복하는 것을 결정하는 것은, 대체로 가능한 시행착오가 결합되는 모델링(modeling)의 상황이다. CDR 이식에 의한 항체의 인간화를 위한 대표적인 방법은, 예를 들어, 이의 전체로 참고문헌에 의해 본원에 의해 포함된, U.S. Pat. No. 6,180,370에 기재되어 있다.

전통적인 CDR-이식 접근에 대한 개선은 다양한 잡종 선택 접근을 사용하고, 상기 비-인간 항체의 일부가, 비-인간 서열의 대부분이 서서히 인간 서열로 대체되는 동안에, 항원 결합에 대한 선택의 연속적인 라운드(successive rounds)에서 상보적인 인간 항체 서열의 라이브러리와 결합된다. 예를 들어, 체인-셔플링 기술(chain-shuffling technique)(Marks, et al., Biotechnology 10:779-83, 1992, 이의 전체로 참고문헌에 의해 본원에 의해 포함됨)에서, 상기 비-인간 항체의 하나의 사슬은, 상기 비-인간 사슬의 친화도가 상기 항원에서 동일한 에피토프에 대한 인간 파트너의 선택을 하게 하는데 충분한 이유에서 상기 다른 사슬의 선천적인 인간 레퍼토리(naive human repertoire)와 결합된다. 그리고 난 다음에, 선택된 인간 파트너는, 유지하는 비-인간 사슬에 대한 인간 대응관계에 있는 것의 선택을 안내하는데 사용된다.

다른 방법은 사슬 교체 기술(chain replacement techniques)을 포함하고, 상기 비-인간 CDR3s는 유지되었고, 상기 프레임워크 및 CDRs 1 및 2를 포함하는, V-영역의 나머지만이 연속적으로 실행된 단계에서 개별적으로 교체된다(예를 들어, U.S. 특허 출원 No. 20030166871; Rader, et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:8910-15, 1998; Steinberger et al., J. Biol. Chem. 275:36073-36078, 2000; Rader et al., J. Biol. Chem. 275:13668-13676, 2000, 이의 모두는 이의 전체로 참고문헌에 의해 본원에 의해 포함됨).

상기 기재된 방법은, 상기 적절한 항체 서열의 기부자(donor)로서 원하는 숙주를 사용함으로써 항-M1 폴리펩티드 항체의 상기 숙주 범위를 변화시키기 위해, 본 발명의 항-M1 폴리펩티드 항체와 사용될 수 있다.

실시형태에서, 본 발명의 항-M1 폴리펩티드 항체는, 유기체의 바디(body)에서 상기 항체의 반감기를 개선하는 분자로 변형된다. 이러한 변형은, 예를 들어, PEGylation, 또는 덱스트란과 같은 다른 친수성 중합체와 유도체화, 또는 그 밖의 다당류, PVP(폴리비닐피롤리돈), PVA(폴리비닐 알코올), 등을 포함한다. 이러한 유도체에 대한 이러한 중합체는 본 분야에서 널리 알려져 있다.

실시형태에서, 본 발명의 항체는, 아미노산 220 내지 238에 걸쳐 있는 인플루엔자 바이러스 매트릭스(M1) 단백질의 C-말단 영역에 결합하는 모노클로날 항체 2B-B10-G9를 포함한다. 상기 하이브리도마는 상기 PR/8 M 단백질에 대항하여 증가되었고, 이의 결합은 서열 GTHPSSSAGLKNDLLENLQ (SEQ ID NO:1)로 지도가 만들어졌다[its binding has been mapped to the sequence GTHPSSSAGLKNDLLENLQ (SEQ ID NO:1)].

항체와 치료의 방법

본 발명은, 독감 바이러스에 의한 차후의 감염이 심각함에서 감소되고, 및/또는 상기 감염이 독감 증상의 지속에서 감소되도록, 항-M1 폴리펩티드 항체의 유효량을 동물에게 투여하는 것을 포함하는 치료의 방법을 제공한다. 실시형태에서, 항-M1 폴리펩티드 항체의 유효량은, 상기 동물이 독감 바이러스로 감염된 후에 동물에 투여된다. 실시형태에서, 항-M1 폴리펩티드 항체의 유효량은 상기 동물이 독감 바이러스에 감염되기 전에 동물에 투여된다. 실시형태에서, 독감 바이러스로 감염된 동물에서 항-M1 폴리펩티드 항체의 유효량의 투여는, 상기 인플루엔자 감염의 심각성을 감소시키고 및/또는 동물에서의 독감 증후군의 지속기간을 감소시킨다. 실시형태에서, 항-M1 폴리펩티드 항체 치료로 치료된 동물은 인간 환자이다.

질병의 타입 및 심각성에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg(예를 들어, 0.1-20 mg/kg)의 항-M1 폴리펩티드 항체는 상기 환자에 대한 투여, 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 분리된 투여에 의해, 또는 지속적인 주입에 대한 초기 투여량이다. 전형적인 일일 투여량은, 환자의 필요에 따라서, 약 1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위로 있을 수도 있다. 특히 바람직한 투여량은, 예를 들어 5 mg/kg, 7.5 mg/kg, 10 mg/kg, 및 15 mg/kg를 포함한다. 며칠 또는 그 이상 동안에 반복된 투여에 대해서, 증상에 따라, 상기 치료는 인플루엔자 감염이 본 분야에서 알려진 방법에 의해 측정된 바와 같이 치료될 때까지 지속된다. 실시형태에서, 그 밖의 투여 요법(dosage regimens)이 유용할 수도 있다. 예를 들어, 만약 본 발명의 상기 항-M1 폴리펩티드 항체가 매주 한 번, 2 주에 마다, 3 주마다, 4 주마다, 또는 더 긴 기간 동안 투여된다면, 투여에서 5 mg/kg, 7.5 mg/kg, 10 mg/kg 또는 15 mg/kg를 포함하지만 이로 제한되지 않는 것을 포함하는 약 5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg의 범위이다. 본 발명의 치료의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 쉽게 모니터링된다.

본 발명에 따라 사용된 항-M1 폴리펩티드 항체의 치료학적 제형은, 일반적으로 동결 건조된 제형 또는 수용액의 형태로, 임의적으로 약제학적으로 허용가능한 캐리어, 부형제 또는 안정화제와 순도의 원하는 정도를 가지는 항체를 혼합함으로써 저장을 위해 제조된다(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th Ed., Osol, A., ed. (1980)). 항체 결정은 또한 포함된다(US 특허 공개 No. 2002/0136719, 이의 전체로 참고문헌에 의해 본원에 의해 포함됨). 허용가능한 캐리어, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 받은 사람(recipients)에 대해 비 독성이고, 인산염, 구연산염, 및 그 밖의 유기 산과 같은 완충용액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화물질; (옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜타놀; 및 m-크레졸과 같은) 보존제; 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴과 같은 단백질, 또는 면역글로불린; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노오스, 또는 덱스트린을 포함하는 그 밖의 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨과 같은 당; 소듐과 같은 염-형성하는 반대-이온(salt-forming counter-ions); 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 Tween, 플루로닉(Pluronic) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비-이온성 계면활성제;를 포함한다.

본원의 제형은, 치료에 대한 필요로, 하나 이상의 활성 화합물, 바람직하게 서로 반대적으로 영향을 주지 않는 상보적인 활성도를 가지는 것들을 함유할 수도 있다. 상기 유효 성분은 또한, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼에서, 예를 들어, 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해, 예를 들어, 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐, 각각 제조된 마이크로 캡슐에 포함될(entrapped) 수도 있다. 이러한 기술은 이의 전체로 참고문헌에 의해 본원에 의해 포함된, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th Ed., Osol, A., ed. (1980)에 기재되어 있다.

지속-방출된 제제가 제조될 수도 있다. 지속-방출된 제제의 적절한 예는, 매트릭스가 성형품(article), 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태로 있는, 항체를 함유하는 고체의 소수성 중합체의 반투성의 매트릭스를 포함한다. 지속-방출 매트릭스의 예는, 폴리에스테르, 히드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드(polylactides)(U.S. Pat. No. 3,773,919, 이의 전체로 참고문헌에 의해 본원에 의해 포함됨), L-글루탐산 및 감마 에틸-L-글루타메이트, 비-분해할 수 있는 에틸렌-비닐 아세테이트, LUPRON DEPOT™와 같은 분해할 수 있는 젖산-글리콜산 공중합체. (젖산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주입가능한 마이크로스페어(microsphere)), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.

폴리펩티드의 제조

본 발명의 상기 M1 폴리펩티드 및/또는 항체의 제조를 위한 재조합 기술은 본 분야에서 널리 알려져 있다. 본 발명의 M1 폴리펩티드 또는 항체는, 다양한 숙주 세포 타입, 예를 들어 포유동물 세포, 진균 세포, 효모 세포, 박테리아 세포, 곤충 세포 등으로 제조될 수 있다. 효모 또는 곰팡이와 같은 특정한 숙주 세포, 또는 중국 햄스터 난소 세포, 쥐과 NIH 3T3 섬유아세포, 인간 배아의 신장 193 세포, 또는 설치류 골수종 또는 하이브리도마 세포, E. coli, 특정한 곤충 세포 및 그 밖의 상업적으로 입수가능한 숙주 세포 시스템에서 사용을 위한 재조합 발현 구성물 또는 벡터를 제조하기 위한 기술은, 본 분야에서 널리 알려져 있다. 이러한 숙주 세포로부터의 상기 재조합 폴리펩티드를 수득하고, 이러한 숙주 세포에서 재조합 폴리펩티드를 발현하기 위한 것은 본 분야에서 또한 널리 알려져 있다. 실시형태에서, 본 발명의 전장 항체(full length antibodies)는 상기 항체에서 글리코실화할 수 있는 숙주 세포 시스템에서 제조될 것이다. 실시형태에서, 상기 글리코실화는 상기 항체로 치리되도록 상기 타겟 유기체의 것일 것이다. 실시형태에서, 상기 글리코실화는 상기 항체로 처리될 상기 유기체의 글리코실화와 유사할 것이다. 대안적인 실시형태에서, 상기 글리코실화는, 상기 글리코실화가 아쥬반트 효과를 제공하지만 상기 항체의 실질적인 반응기 기능을 손상시키기 않도록, 처리될 유기체와 상이할 것이다.

본 발명의 M1 폴리펩티드는, 폴리펩티드 합성 장치(예를 들어, 테스트 튜브에서)를 사용하여 화학적 합성에 의해 또한 제조될 수 있다.

본 명세서에 인용된 모든 발행물 및 특허는, 각각의 개별적인 발행물 또는 특허가 참고문헌에 의해 포함되도록 개별적으로 및 특정하게 표시된 바와 같이 참고문헌에 의해 본원에 포함되고, 상기 발행물이 인용된 것과 연관되어 방법 및/또는 물질을 개시하고 나타내도록 참고문헌에 의해 본원에 포함된다.

실시예

실시예 1. 항 -M1 폴리펩티드 항체에 의한 인플루엔자 감염의 억제

상기 모노클로날 항체 2B-B10-G9는 인플루엔자 스트레인의 패널에 결합하기 위해 및 플라크 저항 검정에서 활성도를 중성화하기 위해 조사되었다. 모노클로날 항체 2B-B10-G9는, 아미노산 220 내지 236에 걸쳐있는 인플루엔자 바이러스 매트릭스(M1) 단백질의 C-말단 영역에 결합한다. 2B-B10-G9는, 220-237, 220-238, 220-239, 220-240, 또는 220-241에 걸쳐있는 아미노산에서 M1 단백질에 또한 결합할 수도 있다.

2B-B10-G9는 MDCK 세포의 부분적으로 감염된 론에 아가 오버레이에 첨가되었고(2B-B10-G9 was added in agar overlays to a partially infected lawn of MDCK cells), CO₂으로 37 ℃에서 3 일 동안 배양되었다(도 1). 결과는 15 g의 항체가 완전하게 플라크 형성을 저해함을 나타내었다. 2B-B10-G9가 바이러스 또는 감염된 세포에서 M 단백질의 노출된 부분에만 접촉(access)을 가지기 때문에, 플라크의 예방은, PR/8로부터의 매트릭스 단백질의 C-말단 영역이 표면-접근가능(surface-accessible)해야 함을 나타낸다. MDCK 세포의 론에서 바이러스성 플라크의 억제는 추가적으로 두 가지의 분리 방법에 의해 분석되었다. 세포는 바이러스와 감염되었고, 2B-B10-G9 항체를 함유하는 아가 오버레이(agar overlay)의 첨가 전에 30 분 동안 배양되었다. 대안적으로, 바이러스 및 항체는 혼합되었고, 세포를 감염하기 전에 30 분 동안 배양되었다. 감염 및 추가적인 30 분 배양 후에, 항체 없이 아가 오버레이가 첨가되었다. 결과는 억제된 전체 플라크에서 두 가지의 실험 사이에 차이가 없음을 나타내었다. 이러한 결과는, 바이러스성 감염의 억제가 감염된 세포로부터의 발생하는 바이러스성의 예방 없이 및 상기 바이러스에 대한 2B-B10-G9의 결합에 의해 야기됨을 제시한다(These results suggest that inhibition of viral infection is caused by binding of 2B-B10-G9 to the virus and not prevention of viral budding from infected cells). 추가적인 테스트는, 2B-B10-G9가 플라크 검정에서 A/South Dakota (H1N1)의 플라크 형성을 억제하고, A/Uruguay (H3N2)을 부분적으로 억제함을 나타내었다(도 2). 위치 231에서 아미노산 변화는 항체의 감소된 효능에 대해 책임이 있을 수도 있다. 그러나, 부분적인 저해는 심지어, M 단백질의 상기 확장된 C-말단(아미노산 잔기 215-252에서)가 표면-노출되고, 면역화를 위한 실행가능한 타겟임을 나타낸다. 위치 231에서 아스파라긴 또는 아스파라르트산으로 바이러스를 테스트하는 것이 실행되었다. PR/8 및 A/South Dakota로부터의 M 단백질은 위치 231에서 아스파라긴을 함유하는 반면에, A/Uruguay는 이러한 위치에서 아스파라트산을 함유한다. 게다가, PR/8 및 South Dakota는 H1N1 표면 당단백질을 가지는 반면에, Uruguay는 H3N2 표면 당단백질을 가진다. 2B-B10-G9가 대체로 중성화하는 활성도를 가지는지 결정하기 위해, 일련의 중성화 실험은, H1N1 세팅에서 위치 231에서 아스파라긴 및 아스파르트산 변화에 대항하는 및 H3N2 세팅에서 아스파르트산 세팅에 대항하는 테스트 유효성을 수행하였다. 위치 231에서 아스파라긴을 함유하는 M 단백질은, 이러한 변화가 야생형 바이러스에서 발생하도록 나타내지 않는 것과 같이, H3N2 바이러스에서 테스트 될 수 없다. 두 가지의 바이러스, A/WSN/33 및 A/Port Chalmers/1/73은 상기 플라크 억제 검정에서 테스트되었다. A/WSN/33은 H1N1 바이러스 이지만, PR/8와 다르고, M1 단백질에서 위치 231에서 아스파르트산을 함유한다. A/Port Chalmers/1/73은 위치 231에서 아스파르트산을 함유하는 H3N2 바이러스이다. 동시에, 두 개의 조절 바이러스는 또한 테스트되었다: A/PR/8 및 A/USSR/90/77. PR/8 및 USSR/90은 AA 220 내지 AA 236로 동일한 아미노산 서열을 가지지만, 상이한 H1N1 단백질을 가진다. 결과는, 모든 바이러스가 투여량 의존적인 방식으로 2B-B10-G9에 의해 억제됨을 나타낸다. 2B-B10-G9에 의해 플라크(plaquing)의 저해는, 위치 231에서 아미노산 변화에 의해 영향을 받지 않고, H3N2 또는 H1N1 당단백질에 의해 영향을 받지 않는다. 조합된, 야생형 M 단백질의 서열 분석 및 상기 데이터는 NCBI 데이터베이스에 포함되어 있고, 이는 2B-B10-G9가 M1의 모든 알려진 변이체에 결합한다는 결론을 내리는 것이 타당하다. 백신 세팅에서 C-말단 펩티드 215-252의 제시는, 열렬한 항체 반응에 의해 부여된 잘-기록된 효능을 이용하고, 모노클로날 항체와는 대조적으로 상기 백신에 의해 부여된 보호에서의 비-선형 증가를 유도하는, 폴리클로날 반응(polyclonal response)을 발생할 것이다. 이러한 폴리클로날 항체 반응은, A 타입 매트릭스 단백질을 보유하는 어떠한 독감에 대항하는 백신 접종된 유기체 일반적인 보호를 제공할 것이다.

실시예 2. 신규한 항-M1 폴리펩티드 항체

A/PR/8/38 인플루엔자 바이러스로부터 M1 단백질의 220-236의 아미노산 서열을 포함하는 M1 폴리펩티드는, 면역성 캐리어 단백질(KLH, Ovalbumin, and BSA)과 접합되었고, 10-12 주 나이든 암컷 BALB/c 마우스 내로 주입되었다. 이러한 M1 폴리펩티드는 아미노산 서열 GTHPSSSAGLKNDLLEN (SEQ ID NO:38)을 가진다. 두 번의 차후의 부스트(boost), 한 번은 초기 주입 후에 24일에, 그 다음은 28일에 제공되었다. 혈청 출혈은 접종 전에 바로 수집되었고, 각각의 세 번의 주입 후 7일에 수집되었다. 수집된 혈청의 분석은, 상기 M1 폴리펩티드에 대한 및 상기 두 번째 부스트 후에 이 자체로 전체 M1 단백질에 대해 강한 반응을 나타내었다.

상기 펩티드, GTHPSSSAGLKNDLLEN (SEQ ID NO:38)는 A/PR/8 매트릭스 단백질의 220-236의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 펩티드는 KLH, Ovalbumin, or BSA과 화학적으로 접합되었다.

10 내지 12 주 나이든 암컷 BALB/c 마우스는, 접종에 대한 세 가지 그룹으로 임의적으로 나뉘었다: 그룹 A - 대조군(마우스 77-81), 그룹 B - 펩티드 접합물(Peptide conjugate)(마우스 82-86), 그룹 C - 펩티드만(마우스 87-91). 모든 마우스는 Day 1, Day 15 및 Day29에 주입되었다. Day 1 주사는 Freund's 완전한 아쥬반트를 함유하고, 차후의 부스트는 Freund's 불완전한 아쥬반트를 함유한다. 그룹 A 마우스(대조군)은 초기에 50 g KLH로 주사되었고, 50g 난백알부민으로 두 번 부스트되었다(days 15 및 29). 그룹 B 마우스는 50g KLH-펩티드 접합물로 접종되었고(Day1), 50g 난백알부민-펩티드 접합물로 두 번 부스트되었다(days 15 및 29). 그룹 C 마우스는 주사되었고, 그룹 B와 동일한 몰랄 등가물을 나타내는 양으로 펩티드[접합 없음(no conjugate)]으로 부스트되었다.

마우스의 세 가지의 그룹은, BSA 만(그룹 A, 마우스 77-81), M1 폴리펩티드-BSA 접합물(그룹 B, 마우스 82-86), 또는 M1 폴리펩티드 만(그룹 C, 마우스 87-91)로 접종되었다. 마우스는 BSA 만(그룹 A), M1 폴리펩티드 접합물(그룹 B), 또는 M1 폴리펩티드만(그룹 C)으로 두 번 부스트되었다. 그룹 A(BSA 만)으로부터 수집된 혈청은, BSA, M1 폴리펩티드-BSA 접합물, 및 M1 단백질에 대한 어떠한 결합을 나타내지 않았다(도 1). 그룹 B(M1 폴리펩티드-BSA 접합물)로부터 수집된 혈청은, M 단백질에 대한 결합 뿐만 아니라 M1 폴리펩티드-BSA 접합물에 대한 결합을 나타낸다. BSA에 대한 어떠한 결합도 상기 M1 폴리펩티드에 대한 결합이 특이적임을 나타냄이 관찰되지 않았다. M1 폴리펩티드만로부터 수집된 혈청(그룹 C)는, BSA, M1 폴리펩티드-BSA 접합체, 또는 M 단백질에 대한 어떠한 결합도 나타내지 않았다.

실시예 3. 글리코실화를 가지는 M1 폴리펩티드

M1 폴리펩티드의 글리코실화된 및 a-글리코실화된 형태를 사용하여 면역학적 반응 및 보호의 비교는 마우스 모델을 사용하여 평가되었다. 위치 231에서 주요한 변이체는 이러한 항원 부위에 대한 항체의 결합에 영향을 줄 수도 있고, 위치 231에서 돌연변이를 가지는 M1 폴리펩티드에 대한 혈청학적 반응은 또한 테스트될 것이다.

정제된 a-글리코실화된 M1 폴리펩티드 및 돌연변이 231 M1 폴리펩티드는 동일한 비율로 결합되었고, 50 g이 마우스의 그룹(10 마리의 마우스/그룹) 내로 Freunds 아쥬반트와 투여되었다. 동시에, 글리코실화된 M1 폴리펩티드는 Freunds 아쥬반트와 마우스의 추가적인 그룹에 투여되었다. 각각의 그룹은, 2 주 후에 10 μg의 이들의 관련된 M1 폴리펩티드로 부스트되었다. 대략 100 μl의 혈액은 초기의 주사 하루 전, 부스트 전 하루, 및 부스트 후 7일에 각각의 마우스로부터 채취되었다. 각각의 마우스로부터의 혈청은, 대조 비특이적인 펩티드(control nonspecific peptide)에 대항하고, 및 M1 폴리펩티드(플러스 및 마이너스 글리코실화반응), M1 단백질에 대한 결합에 대해 분석되었다. 2 주 후에, 하나의 추가적인 부스트가 투여되었고, 부스트 후 7일에 혈청이 수집되었다. M1 폴리펩티드의 변이체에 대한 혈청 반응은 또한, 글리코실화된 및 a-글리코실환된 형태에 대한 상기 반응의 수량화가 상기 바이러스 챌린지 실험에 대한 면역법 스케쥴을 결정하는 것을 가능하게 한다.

마우스의 6 개의 그룹(10 마우스/그룹)은 면역화되고, M1 폴리펩티드 및 돌연변이 231 M1 폴리펩티드로 부스트되었다. 세 가지의 그룹은 결합된 글리코실화된 M1 폴리펩티드(그룹 1-3)을 받을 것이고, 3 그룹은 아쥬반트와 a-글리코실화된 형태(그룹 4-6)을 받을 것이다. 마우스는 인플루엔자 바이러스의 치사량으로 최종 부스트 후 3 일에 실험되었다. 그룹은 M 단백질의 세 가지의 확인된 변이체를 나타내는 바이러스로 실험되었다: A/PR/8 (그룹 1, 4), A/WSN 또는 등가물(그룹 2, 5), 및 A/South Dakota 또는 등가물(그룹 3, 6). 세 개의 추가적인 그룹은, 비-면역화된 대조군(non-immunized controls)으로서 각각의 바이러스로 실험되었다. 체온 및 생존은 7 일이 지나서 측정되었다.

실시예 4 : 항-M1 폴리펩티드 항체에 의한 인플루엔자 바이러스의 억제

생체외 항체 중성화가 바이러스성 감염을 차단하는 효과가 입증되었기 때문에, 살아있는 유기체에서의 바이러스성 감염을 차단하기 위한 2B-B10-G9의 능력이 테스트되었다. 전체의, 살아있는 달걀이, 살아있는 달걀에서 바이러스성 복제를 차단하기 위한 상기 항체의 능력을 기초로 하는 살아있는 동물에 대해 대용물(proxy)로서 사용되었다. 전통적으로, 알(ovo)에서, 독감 바이러스를 가지는 감염은 하기에 대해 사용되었다; (1) 백신 생산을 위한 씨드 스트레인(seed strains)으로서 높은 생산성을 가지는 재조합체 바이러스(high yielding reassortant viruses)의 선택 및 (2) 백신 생산을 위한 독감 스트레인의 제조. 독감 바이러스의 달걀-기초된 제조는, 독감 바이러스를 제조하기 위해 가장 강력하고 최고의 방법으로 간주된다. 따라서, 이러한 숙주에서 바이러스성 복제를 차단하는 것은 치료학적 효능의 강한 지표이다. 이러한 실험에서, 상기 바이러스의 알 복제(ovo replication)의 예방은, 2B-B10-G9 항체의 치료학적 효능을 결정하기 위한 검정으로서 사용된다. 200 가지의 감염성 바이러스성 입자(A/PR/8/34)가 750 g/ml의 2B-B10-G9 항체로 혼합되었다. A/PR/8/34은, 극단적으로 높은 양의 바이러스를 빠르게 복제하기 위한 이의 능력으로 인하여, 재조합체 씨드 바이러스(reassortant seed viruses)의 생산을 위해 통상적으로 사용된다. 실온에서 30 분 배양 후에, 100 μl의 상기 항체 바이러스 혼합물은, 10 일 수정된 달걀 내로 주입되었다. 항체 없이 바이러스로 이루어진 대조군은 또한, 10 일 수정된 달걀 내로 주입되었다. 상기 달걀은 파라핀으로 밀봉되었고, 40 hrs 동안 35 ℃에서 배양되었고, 요막액(allantoic fluid)이 채취되었다. 그리고 난 다음에, 상기 요막액은 표준 적혈구 응집반응 검정에 의해 바이러스에 대해 테스트되었다. 샘플은 연속적으로 2 배 희석되었고(Samples were serially diluted 2 fold), 0.5 % 닭 적혈구 세포가 첨가되었다. 샘플은 실온에서 30 분 배양 후에 적혈구응집반응에 대해 기록되었다. 두 번의 분리된, 동일한 실험이 실행되었다.

[표 1]

대조군 1,2: PR/8/34 만, PR/8 +Ab1,2 : PR/8 + 750 ㎍/ml 2B-B10-G9. 결과는, 2B-B10-G9 항체의 첨가가 알에서 바이러스성 복제를 완전하게 차단함을 나타내었다(표 1). 10 일 수정된 달걀에서의 요막액의 부피는 10 mls이고, 따라서 알에서 항체의 최종 농도는 7.5 ㎍/ml이었다.

본 명세서에 인용된 모든 발행물 및 특허는, 각각의 개별적인 발행물 또는 특허가 참고문헌에 의해 포함되도록 개별적으로 및 특정하게 표시된 바와 같이 참고문헌에 의해 본원에 포함되고, 상기 발행물이 인용된 것과 연관되어 방법 및/또는 물질을 개시하고 나타내도록 참고문헌에 의해 본원에 포함된다.

본 분야의 통상의 기술자는, 본원에 기재된 발명의 특정한 실시형태에 대한 많은 등가물을 단지 통상적인 실험을 사용하여 확인할 수 있거나 인식할 수 있다. 이러한 등가물은 하기의 청구범위에 의해 포함되는 것을 의도한다.

SEQUENCE LISTING <110> ENGEN BIO, INC. <120> INFLUENZA VACCINE AND THERAPY <130> ENGN.0005 <150> 61/881,325 <151> 2013-09-23 <160> 38 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 1 Gly Thr His Pro Ser Ser Ser Ala Gly Leu Lys Asn Asp Leu Leu Glu 1 5 10 15 Asn Leu Gln <210> 2 <211> 38 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 2 Ala Met Arg Thr Ile Gly Thr His Pro Ser Ser Ser Ala Gly Leu Lys 1 5 10 15 Asn Asp Leu Leu Glu Asn Leu Gln Ala Tyr Gln Lys Arg Met Gly Val 20 25 30 Gln Met Gln Arg Phe Lys 35 <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 3 Gly Thr His Pro Ser Ser Ser Thr Gly Leu Lys Asn Asp Leu Leu Glu 1 5 10 15 Asn Leu Gln <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 4 Gly Thr His Pro Ser Ser Ser Ala Gly Leu Lys Asp Asp Leu Leu Glu 1 5 10 15 Asn Leu Gln <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 5 Gly Thr His Pro Ser Ser Ser Thr Gly Leu Lys Asn Asp Leu Leu Asp 1 5 10 15 Asn Leu Gln <210> 6 <211> 19 <212> PRT 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Claims (24)

1. 폴리펩티드를 포함하는 인플루엔자 백신으로서, 상기 폴리펩티드는 M1 단백질의 C-말단의 일부로부터의 서열을 포함하는 것인, 인플루엔자 백신.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 폴리펩티드는 M1 단백질의 위치 220 내지 238에서 발견된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 인플루엔자 백신.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 폴리펩티드는, M1 단백질의 위치 215 내지 241에서 발견된 적어도 7 개의 인접한 아미노산을 포함하는 것인, 인플루엔자 백신.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 폴리펩티드는, M1 단백질의 위치 215 내지 252에서 발견된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 인플루엔자 백신.
   
5. 제3항에 있어서,
   상기 폴리펩티드는 캐리어(carrier)와 결합된 것인, 인플루엔자 백신.
   
6. 제3항에 있어서,
   상기 폴리펩티드는 스캐폴드(scaffold)에 존재하는 것인, 인플루엔자 백신.
   
7. 제1항에 있어서,
   아쥬반트(adjuvant)를 더 포함하는 것인, 인플루엔자 백신.
   
8. 제1항에 있어서,
   상기 폴리펩티드는 글리코실화된 아미노산을 더 포함하는 것인, 인플루엔자 백신.
   
9. 제1항의 M1 폴리펩티드를 포함하는 백신 제제의 유효량을 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 동물에서의 M1 타입 A 인플루엔자 바이러스 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
   
10. 제1항의 백신의 유효량을 동물에 투여하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염에 대항하는 동물을 백신 접종하는 방법.
    
11. 제10항에 있어서,
    상기 동물은 인간인 것인, 방법.
    
12. 제11항에 있어서,
    상기 백신은 면역 반응을 발생시키는 것인, 방법.
    
13. 제12항에 있어서,
    상기 면역 반응은 B-세포 반응(B-cell response)을 함유하는 것인, 방법.
    
14. 제12항에 있어서,
    상기 면역 반응은 기억 면역 반응(memory immune response)을 함유하는 것인, 방법.
    
15. 제11항에 있어서,
    상기 투여하는 단계는, 경막내 주사, 피하 주사, 정맥내 주사, 경구 투여, 점막 투여, 비강내 투여, 또는 폐의 투여에 의해 수행되는 것인, 방법.
    
16. 동물에 항체를 투여하는 단계를 포함하는 동물을 치료하는 방법으로서, 상기 항체는 M1 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 것인, 방법.
    
17. 제16항에 있어서,
    상기 항체는 다수의 인플루엔자 타입 A 스트레인에서 발견되는 M1 단백질에 결합하는 것인, 방법.
    
18. 제16항에 있어서,
    상기 항체는, M1 폴리펩티드의 215 내지 241의 아미노산 서열에서 발견되는 에피토프에 결합하는 것인, 방법.
    
19. 제16항에 있어서,
    상기 동물은 인간이고, 상기 항체는 IgG1 또는 IgG3 이소타입(isotype)인 것인, 방법.
    
20. 제19항에 있어서,
    상기 인간은 인플루엔자 바이러스로 감염된 것인, 방법.
    
21. 제16항에 있어서,
    상기 투여하는 단계는, 경막내 주사, 피하 주사, 정맥내 주사, 경구 투여, 점막 투여, 비강내 투여, 또는 폐의 투여에 의해 수행되는 것인, 방법.
    
22. 타입 A 인플루엔자 바이러스로부터 적어도 하나의 M1 폴리펩티드에 특이적인 항체를 포함하는 조성물로서,
    상기 항체에 결합된 에피토프는 상기 M1 폴리펩티드의 215 내지 241의 아미노산 서열에서 발견되는 것인, 조성물.
    
23. 제22항에 있어서,
    상기 항체는 상이한 타입 A 인플루엔자 바이러스로부터 적어도 두 개의 상이한 M1 폴리펩티드에 결합하고, 상기 항체에 결합된 에피토프는 상기 M1 폴리펩티드의 215 내지 241의 아미노산 서열에서 발견되는 것인, 조성물.
    
24. 제22항에 있어서,
    타입 A 인플루엔자 바이러스로부터의 적어도 하나의 M1 폴리펩티드에 특이적인 최소한의 2차 항체를 더 포함하고, 상기 2차 항체에 결합된 에피토프는 상기 M1 폴리펩티드의 215 내지 241의 아미노산 서열에서 발견되는 것인, 조성물.

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