KR20160050406A

KR20160050406A - 발효소재를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물의 제조 방법 및 상기 방법으로 제조된 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20160050406A
Application number: KR1020140148465A
Authority: KR
Inventors: 박지수
Original assignee: 박지수
Priority date: 2014-10-29
Filing date: 2014-10-29
Publication date: 2016-05-11
Also published as: KR101668034B1

Abstract

본 발명은 발효소재를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물의 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 뽕잎, 작약, 두충 및 연잎을 멸균하는 단계; 상기 멸균한 소재들을 각각 20~70℃에서 1~10일 동안 1차 발효하는 단계; 상기 1차 발효 후 20~70℃에서 1~10일 동안 2차 발효하는 단계; 상기 2차 발효 후 발효물을 건조하고 혼합하여 열수 추출하는 단계; 및 상기 추출물을 여과 및 감압 농축하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, 발효소재를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은, 세포 독성이 없으면서, 항노화 및 항염 효능을 보유하여 피부의 건강을 유지 또는 개선하는 것을 특징으로 한다.

Description

발효소재를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물의 제조 방법 및 상기 방법으로 제조된 화장료 조성물{A METHOD OF PRODUCING COSMETIC COMPOSITION COMPRISING FERMENTED MATERIALS AND COSMETIC COMPOSITION PRODUCED BY THE METHOD}

본 발명은 발효소재를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물의 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 뽕잎, 작약, 두충 및 연잎을 멸균하는 단계; 상기 멸균한 소재들을 각각 20~70℃에서 1~10일 동안 1차 발효하는 단계; 상기 1차 발효 후 20~70℃에서 1~10일 동안 2차 발효하는 단계; 상기 2차 발효 후 발효물을 건조하고 혼합하여 열수 추출하는 단계; 및 상기 추출물을 여과 및 감압 농축하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, 발효소재를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은, 세포 독성이 없으면서, 항노화 및 항염 효능을 보유하여 피부의 건강을 유지 또는 개선하는 것을 특징으로 한다.

최근 들어, 발효소재를 이용한 식품 및 화장품 개발이 활기를 띠면서, 천연 식물 또는 한약재를 발효시킨 소재에 대한 관심이 증가되고 있다.

천연 식물이나 한약재는 다양한 생리활성 물질과 항산화 물질을 함유하고 있으나, 추출된 이후에는 인체에서, 불안정하거나 자극적인 성질로 인하여 독성을 유발하는 경우가 종종 있다.

따라서, 최근에는 천연 추출물을 안정화시키거나, 독성을 줄이거나, 안정한 유도체로 전환시켜 효과를 높이려는 시도가 진행되고 있으며, 그 일환으로 미생물이나 효소를 이용한 생물학적 전환(Biological transformation) 방법이 개발되고 있으며, 대표적인 방법으로 발효기술을 예로 들 수 있다.

미생물이 가지고 있는 효소로, 복잡한 유기화합물이 분해되어 간단한 유기물로 되는 일련의 과정을 발효라고 할 수 있다.

발효반응과 부패반응은 비슷한 과정에 의해 진행되지만, 발효는 일정한 온도, 습도, 산도, 영양 성분을 조절하여 원하는 미생물을 다량 자라게 하는 과정에서 일어나는 것이며, 인간에게 좋은 면을 주는 미생물 작용이라고 할 수 있으므로, 비슷한 과정을 겪는 부패와는 구분된다.

발효에 사용되는 균주로 대표적으로는, 누룩균(Aspergillus, Rhizopus), 황국균(Aspergillus oryzae), 백국균(Aspergillus kawachii), 메주균(황곡균/황균/Nattobacillus), 고초균(Bacillus), 젖산균(Lactic Acid Bacteria), 효모균(Yeast) 또는 방선균 등이 있으며, 이 외에도 복잡한 유기물을 분해시키는 효소를 내는 미생물은 발효 균주가 될 수 있다.

한편, 산업의 급격한 발달로 대기가 오염되고, 오존층이 심하게 파괴됨에 따라 지표면에 강한 자외선이 조사되어 현대인들의 피부가 심한 스트레스를 받아 쉽게 노화되며 염증을 동반하는 피부 질환이 빈번하게 유발되고 있다.

이러한 피부 질환의 예방과 자외선으로부터 피부를 보호하기 위한 다양한 종류의 피부 기능성 화장품들이 개발되고 있으며, 피부의 자극을 최대한 줄이기 위한 방법으로서, 각종 천연 식물 또는 한약재들을 소재로 한 기능성 화장품이 개발되고 있다.

또한, 피부에 영향을 미치는 요인 중 하나로, 활성산소가 있다.

체내 효소계, 환원대사, 화학약품, 공해물질 및 광화학반응 등의 각종 물리적, 화학적 및 환경적 요인 등에 의하여 생성되는 활성산소는, 세포구성 성분들인 지질, 단백질, 당 및 DNA 등에 대하여 비선택적, 비가역적인 파괴작용을 함으로써 세포노화 또는 암을 비롯한 각종 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다.

또한 이들 활성산소에 의한 지질과산화물을 비롯한 여러 가지 체내 과산화물도, 세포에 대한 산화적 파괴를 일으켜 각종 기능장애를 야기함으로써 여러 가지 질병의 원인이 되기도 한다.

자외선 노출 또는 노화가 진행됨에 따라, 피부를 구성하는 대부분의 세포에서는, 염증을 일으킨다고 알려져 있는 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)이 증가하고, 이들 염증성 인자에 의해 피부조직을 분해하는 효소인 매트릭스 메탈로 프로테아제(MMP, Matrix metalloproteinase)의 생합성이 증가하며, iNOS(inducible nitric oxide synthase)에 의한 NO(nitric oxide)생성이 증가하는 것으로 알려져 있다.

따라서, 노화 및 각종 질환의 억제 또는 치료제로서, 상기와 같은 과산화물 생성 억제물질과 같은 항산화제들의 연구가 진행되고 있다.

현재, 피부에 항산화 또는 항염 작용을 가지는 화장품으로, 화학성분 또는 천연물을 이용한 제품들이 개발되고, 시중에 판매되고 있으나, 화학성분으로 인한 부작용에 대한 문제점이 보고된 바 있다.

또한 천연물을 이용한 화장품에서는, 천연물의 혼합물을 단순 추출하여 화장품에 사용함으로써, 몇몇 천연 물질은 항산화 및 항염 활성이 미약하거나 또는 부작용 있을 수 있다는 문제점이 있다.

한편, 본 발명의 소재로 사용되는 뽕잎은, 쌍떡잎식물 쐐기풀목 뽕나무과의 식물인 뽕나무에서 자라 나온 잎으로, 떫고 약간의 쓴맛을 가지고 있으며, 어린 순은 그대로 쌈을 싸서 먹을 수 있다.

뽕잎에는 글루타민, 알라닌, 아스파라긴산, 티로신, 세린, 글루타치온, 미네랄, 식이섬유 및 비타민 등이 함유되어 있다. 뽕잎의 효능으로는, 혈관을 강화시켜주고 혈압을 안정시켜주며, 혈액 정화 작용, 당뇨병 예방, 중금속 제거 또는 노화 억제 등이 있다.

작약(芍藥, Paeonia lactiflora)은, 쌍떡잎식물 작약과 작약속의 여러해살이풀로서, 높이는 1m 내외이고, 꽃 색깔에 따라 백작약 또는 적작약으로 나누기도 한다.

작약에는 아스파라긴산과 안식향산등의 성분이 함유되어 있어, 두통이나 치통을 가라앉혀준다. 또한 체내의 어혈을 제거하고 혈액순환을 원활하게 하여 피를 맑게 해주고 여성질환의 개선에도 효과가 있으며, 작약을 꾸준히 복용하면 위산의 분비를 억제시키면서 위장을 이완시켜 위경련이나 위궤양을 완화시키고, 신경통 또는 복통 등에도 효과가 있다.

두충(杜仲)은, 두충나무과의 두충나무(Eucommia ulmoides Oliver)의 나무껍질을 말린 약재이다.

다른 명칭으로는, 두중(杜仲), 사중(思仲), 사선(思仙), 목면(木棉), 석사선(石思仙), 사운피(絲運皮)등이 있으며, 맛은 달고 매우며, 따듯한 성질을 가지고 있다.

간신(肝腎)기능 부족으로 인한 요통, 무릎통, 몸이 차서 생기는 양위(陽萎), 하복냉감, 소변 자주 보는 증, 태동불안, 자궁출혈 등을 치료하며 혈압강하 효과가 있으며, 약리작용으로 혈압강하, 항노화, 콜레스테롤강하, 항염, 진정, 진통, 면역 조절, 혈액응고, 자궁수축, 항알레르기, 항균작용 등이 보고되었다.

연잎은, 쌍떡잎식물의 미나리아재비목 연(Nelumbo nucifera)의 잎을 말하며, 연잎에는 비타민, 식이섬유소, 미네랄, 플라보노이드 및 항산화물질인 쿼세틴 등이 풍부하다고 알려져 있다.

이러한 연잎은, 혈압강하, 항산화 작용으로 인한 노화 억제 또는 성인병 예방, 어지럼증 완화 또는 피부 미용 등에 효능이 있다.

한편, 본 발명과 관련하여 대한민국 등록특허공보 제10-0786733호에는 생약 추출물을 포함하는 문제성 피부 개선용 조성물에 관해 기재되어 있다. 이는 인삼, 천궁, 삼백초, 당귀, 어성초, 감초, 박하, 뽕잎, 녹차, 구기자, 진피, 검정콩, 검은깨, 누에고치 및 하수오 추출물을 포함하여, 항노화 및 항염 효능을 보유한 여드름, 아토피 개선용 화장품으로 사용될 수 있는 조성물에 관해 기재되어 있다.

그러나 상기 선행기술은 본 발명의 소재 중 뽕잎만을 포함하고 있으며, 항노화 및 항염 효능에 대하여 육안으로 치료 효과를 확인하였을 뿐 세포 단위의 실험을 통하여 입증한 것은 아니므로, 상기 조성물을 이용한 화장품을 사용한 사람 모두에게 효능이 있을지는 알 수 없다는 문제점이 있다.

따라서, 발효소재의 유효성분을 최대한으로 함유하며, 세포 독성이 없고, 항노화 및 항염 효능을 보유하는 화장료 조성물의 개발이 요구된다.

대한민국 등록특허공보 제10-0786733호 (2007.12.11)

본 발명은 발효소재를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물의 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 뽕잎, 작약, 두충 및 연잎을 멸균하는 단계; 상기 멸균한 소재들을 각각 20~70℃에서 1~10일 동안 1차 발효하는 단계; 상기 1차 발효 후 20~70℃에서 1~10일 동안 2차 발효하는 단계; 상기 2차 발효 후 발효물을 건조하고 혼합하여 열수 추출하는 단계; 및 상기 추출물을 여과 및 감압 농축하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, 발효소재를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물의 제조 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 목적은, 상기 방법으로 제조된 화장료 조성물로서, 세포 독성이 없고, 항노화 및 항염 효능을 보유하여 피부의 건강을 유지 또는 개선하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은, 뽕잎, 작약, 두충 및 연잎을 멸균하는 단계; 상기 멸균한 소재들을 각각 20~70℃에서 1~10일 동안 1차 발효하는 단계; 상기 1차 발효 후 20~70℃에서 1~10일 동안 2차 발효하는 단계; 상기 2차 발효 후 발효물을 건조하고 혼합하여 열수 추출하는 단계; 및 상기 추출물을 여과 및 감압 농축하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, 발효소재를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물의 제조 방법을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명은, 1차 발효 및 2차 발효 단계 시, 누룩균(Aspergillus, Rhizopus), 황국균(Aspergillus oryzae), 백국균(Aspergillus kawachii), 메주균(황곡균/황균/Nattobacillus), 고초균(Bacillus), 젖산균(Lactic Acid Bacteria), 효모균(Yeast) 또는 방선균으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 균주를 사용하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물의 제조 방법을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명은, 2차 발효 후 뽕잎, 작약, 두충 및 연잎 발효물의 혼합비가 0.5~1.5 : 0.5~1.5 : 0.5~1.5 : 0.5~1.5인 것을 특징으로 하는, 발효소재를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물의 제조 방법을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명은, 상기 방법으로 제조된, 세포 독성이 없으면서, 항노화 및 항염 효능을 보유하여 피부의 건강을 유지 또는 개선하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물의 제조 방법은, 소재를 1차 발효 및 2차 발효 후 추출함으로써, 소재의 추출 수율이 증가한 효능을 보유하고 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은, 인체에 독성이 없으며 항노화 및 항염 효능을 보유함으로써 피부의 건강을 유지 또는 개선하는 효능을 보유하고 있다.

도 1은 RAW 264.7 cell에서 소재별 발효에 따른 세포생존율 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 RAW 264.7 cell에 LPS 10 ug/ml, 천연물 추출물 및 발효추출물을 각각 200 ㎍/ml씩 처리하고 48시간 후 세포에서의 NO 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 RAW 264.7 cell에 LPS 10 ug/ml, 천연물 추출물 및 발효추출물을 각각 200 ㎍/ml씩 처리하고 48시간 후 Control에 대한 NO 생성량을 %농도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 천연물 추출물의 총 페놀 함량을 나타낸 그래프이다.
도 5는 천연물 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 그래프이다.
도 6은 HPLC 분석을 통해 검출한 루틴과 이소퀘르세틴 및 퀘르세틴의 분자식을 나타낸 그림이다.
도 7은 발효 전과 발효 후 소재의 HPLC 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 발효 전과 발효 후 소재의 HPLC 분석 결과를 정량적으로 나타낸 그래프이다.

본 명세서 및 청구 범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

따라서 본 명세서에 기재된 실시예, 제조예, 실험예 및 도면에 기술된 사항은 본 발명의 가장 바람직한 일 예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

실시예 1. 발효소재를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물의 제조 방법

(1) 발효소재 멸균 단계

뽕잎, 작약, 두충 및 연잎을 세척한 후 멸균한다.

뽕잎, 작약, 두충 및 연잎은 어떠한 전처리를 가하지 않은 것을 사용할 수 있으며, 절단 또는 분쇄 등의 전처리를 가한 것을 사용할 수도 있다. 절단 또는 분쇄 등의 전처리 방법 또한 여러 가지 방법 중에서 선택될 수 있다.

바람직하게는 깨끗이 세척하여 이물질을 제거한 후 어떠한 전처리도 가하지 않은 뽕잎, 작약, 두충 및 연잎을 사용할 수 있다.

멸균 방법으로는 크게 열, 자외선, 방사선 또는 고주파 등을 이용하는 물리적 방법과 약액 또는 가스를 이용하는 화학적 방법이 있으며, 뽕잎, 작약, 두충 및 연잎의 유효성분을 최대한으로 손상시키지 않으면서 멸균하는 방법이 선택될 수 있다.

(2) 1차 발효 단계

상기 멸균 단계를 거친 뽕잎, 작약, 두충 및 연잎에 발효 균주를 첨가하고 1차 발효시킨다. 발효 균주에 의해 발효된 뽕잎, 작약, 두충 및 연잎은 약용성분의 추출률이 증가하며, 피부에 흡수가 용이해질 수 있다.

발효란, 미생물이 가지고 있는 효소를 이용하여, 복잡한 유기화합물이 분해되어 간단한 유기물로 되는 일련의 과정을 말하며, 이때 사용되는 균주로, 누룩균(Aspergillus, Rhizopus), 황국균(Aspergillus oryzae), 백국균(Aspergillus kawachii), 메주균(황곡균/황균/Nattobacillus), 고초균(Bacillus), 젖산균(Lactic Acid Bacteria), 효모균(Yeast) 또는 방선균 등이 선택될 수 있다.

본 발명에서 바람직하게는 누룩균(Aspergillus, Rhizopus) 또는 백국균(Aspergillus kawachii)을 각각 사용하거나 이들의 혼합균이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

발효는 뽕잎, 작약, 두충 및 연잎이 각각 수행될 수 있으며, 뽕잎, 작약, 두충 및 연잎을 혼합하여 발효시킬 수도 있으나, 바람직하게는 뽕잎, 작약, 두충 및 연잎을 각각 발효시킬 수 있다.

설계 조건에 따라 뽕잎, 작약, 두충 및 연잎과 발효 균주의 중량비가 다르게 설정될 수 있으며, 발효 균주의 첨가량은 뽕잎, 작약, 두충 및 연잎 100 중량부 기준으로 0.01 내지 10 중량부를 첨가하여 발효시킬 수 있다.

1차 발효 시 온도 및 기간은, 바람직하게는 20 ~ 70℃에서 1 ~ 10일 동안 1차 발효시킬 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 발효 균주의 특성을 고려하여 발효 균주의 배양에 적합한 조건이면 충분하다.

(3) 2차 발효 단계

1차 발효 단계를 거친 뽕잎, 작약, 두충 및 연잎을 2차 발효시킨다.

2차 발효 시 사용되는 발효 균주, 온도 및 기간은 상기 1차 발효 단계의 설계 조건과 동일할 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다.

바람직하게는 1차 발효 시 백국균을 사용하고, 2차 발효 시 누룩균을 사용할 수 있다.

(4) 추출 단계

1차 및 2차 발효 단계를 거친 뽕잎, 작약, 두충 및 연잎의 발효물을 건조하고 혼합하여 열수 추출시킨다.

건조 방법에는 자연 건조, 열풍 건조, 저온 건조, 동결 건조, 원적외선 건조, 일광 건조, 진공 건조, 폴리에틸렌 하우스(polyethylene (PE) house)건조 등이 있다.

바람직하게는 자연 건조 방법을 이용할 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 뽕잎, 작약, 두충 및 연잎의 수분이 제거될 정도면 충분하다.

이때, 건조된 뽕잎, 작약, 두충 및 연잎은 분말기 (powder machine)를 이용하여 분말화된 후, 사용될 수도 있다.

건조된 뽕잎, 작약, 두충 및 연잎의 발효물을 혼합하여 열수 추출시켜 혼합추출물을 제조한다.

이때 중량비는 다양하게 설정될 수 있으나, 바람직하게는 뽕잎, 작약, 두충 및 연잎의 발효물이 0.5~1.5 : 0.5~1.5 : 0.5~1.5 : 0.5~1.5의 중량비로 혼합될 수 있다.

뽕잎, 작약, 두충 및 연잎의 발효물을 혼합하여 추출하는 방법에는 열수 추출법, 용매 추출법, 수증기 증류법, 이산화탄소 초임계 추출법, 수증기 증류법, 마이크로 웨이브 공정 추출법, 퍼콜레이션 추출법 등의 다양한 추출 방법이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 열수 추출법을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다

또한, 열수 추출의 온도 및 시간은 상기 발효물의 상태에 적합하게 설계될 수 있으며, 바람직하게는 90~120℃에서 1~3시간 동안 가열 추출할 수 있다.

이때 열수 추출 조건이, 상기에서 한정한 범위 미만이 될 경우에는 상기 발효물에 함유되어 있는 각 유효성분들이 충분하게 추출되지 않을 우려가 있고, 열수 추출 조건이 상기에서 한정한 범위를 초과할 경우에는 상기 발효물에 함유되어 있는 각각의 유효성분들이 파괴되어 그 효능들이 상실될 우려가 있다.

(5) 여과 및 농축 단계

상기 혼합추출물을 여과 및 농축시킨다.

여과 방법에는 상압 여과, 흡인 여과, 감압 여과, 한외 여과, 정밀 여과 및 역삼투압 여과 등이 있으며, 다양하게 선택될 수 있다.

여과 시간, 온도 및 횟수 또한 다양하게 설정될 수 있다.

여과는 상기 나열한 방법 또는 그 외의 방법을 사용하여 수행될 수 있으며, 2종 이상의 방법을 사용하여 여과할 수도 있다.

정밀 여과 또는 한외 여과를 수행하여 여과할 시 바람직하게는 여과막 구멍 크기가 3 um일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

농축 방법에는 냉동 농축, 감압 농축, 막 농축, 진공 농축, 가열 농축 및 증발 농축 등이 있으며, 다양하게 선택될 수 있다. 바람직하게는 감압 농축을 수행할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

농축 방법은 2종 이상을 사용할 수도 있다.

농축 온도는 다양하게 설정될 수 있다. 바람직하게는 40~50℃로 설정될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 농축 시간 및 횟수 역시 다양하게 설정될 수 있다.

이상의 단계를 통해, 발효소재를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제조할 수 있다.

화장료 조성물은 액상, 분말, 젤 등 다양한 형태로 제조될 수 있다.

실시예 2. 발효소재를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물의 제조 방법

(1) 발효소재 멸균 단계

실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 수행되었다.

(2) 1차 발효 단계

실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 수행되었다.

(3) 숙성 단계

1차 발효 단계를 거친 뽕잎, 작약, 두충 및 연잎의 발효물을 각각 숙성시킨다.

설계 조건에 따라 숙성 시 온도 및 기간은, 바람직하게는 15 ~ 35℃에서 10 ~ 90일 동안 숙성시킬 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이때 숙성 단계는 1차 발효 후 수행될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 1차 발효 및 2차 발효 단계를 모두 거친 후에 숙성 단계가 수행되어도 무방하다.

(4) 2차 발효 단계

실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 수행되었다.

(5) 초음파 파쇄 및 추출 단계

2차 발효 단계를 거친 뽕잎, 작약, 두충 및 연잎의 발효물을 초음파 파쇄한다.

초음파 파쇄기는 초음파 특유의 공동 효과(cavitation)로 인하여 분자운동을 유발시키며, 상기 분자 운동이 활성화 에너지로 작용하여 추출, 농축 등의 공정 수행시 반응성을 향상시키는 효과를 보유하고 있다.

상기와 같은 초음파 파쇄기의 특성을 이용하여 뽕잎, 작약, 두충 및 연잎의 발효물 성분을 효율적으로 추출하기 위하여 뽕잎, 작약, 두충 및 연잎의 발효물에 초음파 파쇄를 수행한다.

발효물은 건조하여 분쇄될 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 파쇄 시간은 15 ~ 60분 동안 수행될 수 있고, 조건에 따라 파쇄 시간은 다양하게 설정될 수 있다.

초음파 파쇄 후 추출은, 실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 수행되었다.

(6) 여과 및 농축 단계

실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 수행되었다.

실험예 1. 발효소재의 세포 독성 확인

1-1. 실험 준비

세포생존율을 측정하기 위해, RAW 264.7 cell을 배양시켜 실험에 이용하였다. RAW cell은 적당한 혈청을 첨가한 배지에서 성장, 분화할 수 있도록 안정화시킨 세포주로, Rat, Mouse 등의 쥐과 실험동물에서 추출한다. RAW Cell에 속하는 RAW 264.7 cell은 Mouse의 대식 세포주이다.

세포의 배양에 사용된 배지는 10 % FBS, penicillin (100 U/ml) 및 streptomycin (100 ug/ml)을 첨가한 DMEM (high glucose) 배지이며, 4일마다 계대배양하였다.

1-2. 실험 과정

MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) assay 방법을 이용하여 세포 생존율을 측정함으로써, 천연물 추출물의 독성 여부를 판단하였다.

MTT 방법은 살아있는 세포의 미토콘드리아에 함유된 탈수소효소(dehydrogenase)에 의해 MTT가 포르마잔(formazan)으로 전환되는 양을 측정함으로써, 세포 생존율을 구할 수 있다.

① 96-well plate를 6개 준비하여 각 plate에 상기 배지를 주입하고 RAW 264.7 cell을 5×10⁴cell/well이 되도록 100 uL 접종한 후, 5% CO₂ _,37℃ incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 6개의 plate 중 1개를 대조군으로 설정하여 다른 plate와 분리하였다.

② 배양된 배지 plate 중에서 대조군으로 설정된 plate를 제외한 5개의 plate에 천연물 추출물(200 ㎍/㎖)을 첨가하여 24시간 동안 배양하였다.

③ MTT solution을 모든 well에 15 μL씩 첨가하고 37℃ 배양기에서 반응시켰다.

④ 4시간 후 solubilizing solution 을 넣고, 수분이 증발하지 않도록 밀봉하여 37℃에서 12시간 방치한 후, 570 nm와 630 nm를 각각 test, reference wavelength로 하여 microplate spectrophotometer (Molecular dynamics, USA)로 흡광도를 측정하였다.

⑤ 대조군과 실험군의 O.D.를 비교하여 세포생존율을 측정하였다. 세포생존율은 하기의 [수학식 1]에 의거하여 산출하였다.

1-3. 실험 결과

도 1은 RAW 264.7 cell에서 소재별 발효에 따른 세포생존율 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

측정 결과, 세포생존율이 대조군과 비교하여 같거나 높은 것을 확인할 수 있었다.

이로써 천연물 추출물 및 발효추출물 모두 세포독성이 없으므로, 피부에서의 독성 또한 없다는 결론을 도출할 수 있다.

실험예 2. 발효 소재의 항염 효능 측정

대식 세포(Macrophage)는 혈액 단핵세포로부터 분화한 조직 세포로, 염증 반응에서 방어적 역할을 담당한다. 대식 세포는 면역 항상성 유지에 관여하며, 염증반응시에 nitric oxide(NO)와 tumor necrosis factor-(TNF-), interleukin (IL-6) 등의 cytokine을 생산하여 초기 감염 방어에 중요한 역할을 한다.

본 실험예에서는 LPS로 염증반응을 유도한 마우스 대식세포에서 NO 생성량을 측정함으로써, 발효소재의 항염 효능을 알아보았다.

2-1. 실험 과정

① 96-well plate를 16개 준비하여 각 plate에 실험예 1-1의 배지를 주입하고 RAW 264.7 cell을 5×10⁴cell/well이 되도록 100 uL 접종한 후, 5% CO₂ _,37℃ incubator에서 48시간 동안 배양하였다. 16개의 plate 중 2개를 대조군으로 설정하여 다른 plate와 분리하였다.

② 배양된 배지 plate 중에서 2개를 대조군으로 설정하여, 하나는 LPS를 처리하지 않고, 또 하나는 LPS 10 ug/ml를 처리하여 control로 정하였다.

대조군으로 설정된 2개의 plate를 제외한 14개의 plate에 각각 LPS 10 ug/ml와 시료를 200 ug/ml씩 첨가하여 48시간 동안 배양하였다.

이때, 시료는 발효 전 후의 백출, 뽕잎, 두충, 천궁, 작약, 연잎 및 이들의 혼합물을 각각 열수 추출한 추출물이다.

③ 배양 상층액 50 ul와 Griess 시약 50 ul를 섞어 흡광도 540 nm에서 측정하였다.

Griess 시약은 0.2% N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride와 5% Phosphoric acid에 녹인 2% sulfanilamide를 섞어 조제하였다. 정량은 nitrite standard (0.5 um, 10.0 um, 25.0 um, 50 um, 100 um) y=0.012x + 0.0495 R²= 0.9995에 의하여 정량하였다.

2-2. 실험 결과

도 2 및 3은 RAW 264.7 cell에 LPS 10 ug/ml 및 시료를 각각 200 ㎍/ml씩 처리하고 48시간 후 세포에서의 NO 농도를, NO 생성량 및 Control에 대한 %농도로 나타낸 그래프이다.

측정 결과, control과 비교할 때 모든 군에서, 세포에서의 NO 농도가 약 절반 가량 감소한 것을 확인할 수 있었다.

이로써, 천연물 추출물 및 발효추출물 모두 세포에서의 염증을 저해하므로, 피부에서 항염 효능이 있다는 결론을 도출할 수 있다.

실험예 3. 발효소재의 항산화 효능 측정

3-1. 총 페놀 함량 측정

발효 조성물의 총 페놀 함량을 측정함으로써, 발효 조성물의 항산화 효능을 확인하였다.

1) 실험 과정

페놀성 물질이 phosphomolybic acid와 반응하여 청색을 나타내는 현상을 이용한 방법으로 Folin-Denis법에 의해 측정하였다.

① 천연물 추출물 100 mg당 1 mL PBS Buffer를 첨가하여 100 mg/mL 농도의 추출물 용액을 제조하여 시료 용액으로 사용하였다.

② 증류수 2.5 mL에 시료 0.33 mL, Folin- Denis 0.16 mL, NO2CO3 0.3 mL을넣고 암실에서 30분 발색시킨 후 760 nm에서 흡광도를 측정하였으며 standard는tannic acid를 사용하였다.

2) 실험 결과

도 4는 천연물 추출물의 총 페놀 함량을 나타낸 그래프이다.

실험 결과, 열수 추출물에서는 뽕잎, 연잎, 작약, 두충 등의 순으로 총 페놀 함량이 높았으며, 주정 추출물에서는 작약, 연잎, 두충, 뽕잎 등의 순으로 총 페놀 함량이 높게 나타났다.

또한 발효하지 않은 군(RAW)에 비해 백국, 백국+누룩 또는 누룩으로 발효한 군에서 총 페놀 함량이 증가한 것을 알 수 있다.

3-2. DPPH 라디칼 소거능 측정

발효 조성물 처리 후 DPPH 라디칼 소거능을 측정함으로써, 발효 조성물의 항산화 효능을 확인하였다.

1) 실험 과정

① 천연물 추출물 100 mg 당 1 mL 메탄올을 첨가하여 100 mg/mL 농도의 추출물 용액을 제조하여 시료 용액으로 사용하였다.

② 시료 용액 50 μL에 1.5×10^-4 mM DPPH용액 150 μL을 가한 후 30분 후에 515 nm에서 흡광도를 측정하였다.

③ 라디칼 소거능(%)을 다음의 식으로 계산하였다

Free radical scavenging effect ＝ (Abs_DPPH－Abs_sample) / Abs_DPPH ×100

2) 실험 결과

도 5는 천연물 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 그래프이다.

실험 결과, 열수 추출물에서는 작약, 연잎 두충, 뽕잎, 천궁의 순으로 항산화 활성이 강한 것으로 나타났으며, 특히 연잎과 작약은 대조군으로 사용된 아스코빅산(ascorbic acid)보다 항산화능이 뛰어남을 알 수 있다. 주정 추출물에서도 작약이 가장 항산화능이 뛰어난 것으로 나타났다.

실험예 4. 발효에 따른 배당체 분해 효능 측정

고속 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC 을 이용해 발효에 따른 배당체 분해 효능을 확인하였다.

4-1. 실험 과정

① 각 천연물 추출물에 10 mL의 증류수를 더하고 0.45 um로 여과하여 HPLC(Agilent 1260, Agilent Technologies, USA)를 이용하여 측정하였다.

② HPLC 분석은 Agilent poroshell 120EC-C18(3.0 mm × 50 mm, 2.7 ㎛) column을 사용하여, 이동상의 유속과 컬럼 온도는 각각 0.8 ml/min, 35℃로 하고, 0.2 uL injection, UV 검출기의 검출 파장은 203 nm로 하여 분석하였다.

4-2. 실험 결과

플라보노이드 성분 중 하나인 루틴, 이소퀘르세틴 및 퀘르세틴의 분석 결과, 발효를 통해 배당체 분해 효과를 확인하였다. 여기서 퀘르세틴 성분은 체내 활성산소를 제거해주어 피부의 노화를 방지한다고 알려져 있다.

도 6은 HPLC 분석을 통해 검출한 루틴과 이소퀘르세틴 및 퀘르세틴의 분자식을 나타낸 그림이다.

도 7은 발효 전과 발효 후 소재의 HPLC 분석 결과를 나타낸 그래프이다.

도 8은 발효 전과 발효 후 소재의 HPLC 분석 결과를 정량적으로 나타낸 그래프이다.

실험 결과, 발효 전에 비해 발효 후 소재에 함유된 루틴 및 이소퀘르세틴의 양이 줄고, 퀘르세틴의 함량이 증가하는 것을 확인하였다.

이는 루틴 및 이소퀘르세틴이 퀘르세틴으로 전환된 것으로, 발효를 통해 소재의 배당체 성분이 분해된 것을 의미한다.

따라서 발효소재는 플라보노이드 성분의 크기가 작아져 흡수가 용이해짐을 예측할 수 있다.

실험예 5. 추출물의 수율 측정

실시예 1 및 2에 따른 발효소재를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물의 수율을 계산함으로써, 제조 방법에 따른 추출 효율을 알아보았다.

5-1. 실험 준비

실험에 사용한 시료는 실시예 1 및 2에 따른 추출물 및 비교예로써 발효하지 않고 식물소재를 바로 추출한 추출물을 사용하였다.

5-2. 실험 과정

각 추출물을 감압 여과장치로 여과하여 농축 후 동결건조한 뒤에 분말의 무게를 측정하여 수율을 계산하였다.

수율은 다음의 수학식을 이용하여 계산되었다.

5-3. 실험 결과

표 1은 제조 방법에 따른 추출물의 수율을 나타낸 표이다.

	실시예 1	실시예 2	비교예
수율(%. w/w)	11.34	17.81	7.07

실험 결과, 실시예 1에 따른 추출물은 수율이 11.34%, 실시예 2에 따른 추출물은 17.81%, 비교예로 실시한 추출물은 7.07%의 수율을 나타내었다.

즉, 1차 발효와 2차 발효 사이에 숙성단계를 거치고, 초음파 파쇄 후 추출함으로써, 소재의 추출 수율이 증가함을 알 수 있다.

이상의 실험 결과를 정리해 보면, 본 발명에 따른 화장료 조성물은, 1차 발효 및 2차 발효를 통해 추출 수율이 높고 인체에 독성이 없는 효능을 보유하고 있다.

또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은, 피부조직에서의 일산화질소(NO) 저해 활성을 통한 항염 효능을 보유하고 있다.

Claims

뽕잎, 작약, 두충 및 연잎을 멸균하는 단계;
상기 멸균한 소재들을 각각 20~70℃에서 1~10일 동안 1차 발효하는 단계;
상기 1차 발효 후 각각 20~70℃에서 1~10일 동안 2차 발효하는 단계;
상기 2차 발효 후 각 발효물을 건조하고 혼합하여 열수 추출하는 단계;
상기 추출물을 여과 및 감압 농축하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, 발효소재를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물의 제조 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 1차 발효하는 단계와 2차 발효하는 단계 사이에 15~35℃에서 10~90일간 숙성하는 단계를 추가로 포함하고,
상기 열수 추출하는 단계에서 발효물은 건조 후 초음파 파쇄되어 추출되는 것을 특징으로 하는, 발효소재를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물의 제조 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 1차 발효 및 2차 발효하는 단계에서 사용된 균주는 누룩균(Aspergillus, Rhizopus), 황국균(Aspergillus oryzae), 백국균(Aspergillus kawachii), 메주균(황곡균/황균/Nattobacillus), 고초균(Bacillus), 젖산균(Lactic Acid Bacteria), 효모균(Yeast) 또는 방선균으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 발효소재를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물의 제조 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 2차 발효 후 뽕잎, 작약, 두충 및 연잎의 발효물은 0.5~1.5 : 0.5~1.5 : 0.5~1.5 : 0.5~1.5의 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는, 발효소재를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물의 제조 방법.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 기재된 방법을 이용하여 제조된, 발효소재를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
청구항 5에 있어서,
상기 화장료 조성물은 세포 독성이 없으면서, 항노화 및 항염 효능을 보유하여 피부의 건강을 유지 또는 개선하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.