KR20160044815A - 줄기 신장이 억제된 형질전환 식물체 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 AP2 도메인 전사조절인자 유전자의 마이크로알엔에이(microRNA) 결합부위의 염기서열을 치환하여 식물의 줄기 신장(elongation)을 조절하는 방법 및 이 방법에 의하여 제조된 형질전환 식물체에 관한 것이다.
본 발명의 식물의 줄기 신장을 조절하는 방법에 의하여 제조된 형질전환 식물체는 도복(loading) 피해에 따른 수확량 감소 및 품질 저하 등의 단점을 해소할 수 있으며, 이에 따라 본 발명의 방법에 의하여 작물의 줄기 신장을 조절함으로써, 작물의 생산성 및 품질을 향상시킬 수 있고, 새로운 형태의 왜성 신품종 개발에도 유용하게 활용될 수 있다.

Description

줄기 신장이 억제된 형질전환 식물체 및 이의 제조 방법{Transgenic plant having a short stem by inhibiting stem elongation and method for producing using the same}

본 발명은 AP2 도메인 전사조절인자 유전자의 마이크로알엔에이(microRNA) 결합부위의 염기서열을 치환하여 식물의 줄기 신장(elongation)을 조절하는 방법 및 이 방법에 의하여 제조된 형질전환 식물체에 관한 것이다.

벼(Oryza sativa)는 보리, 옥수수와 함께 세계에서 가장 중요한 식량 작물 중 하나이다. 벼는 인구 증가, 공업화로 인한 농지 부족, 기후 변화 등을 통해 그 수요가 증가되고 있으나, 생산량 증대를 위한 새로운 품종 개발은 미비한 실정이다.

벼농사에서 냉해, 한해, 침관수 피해 등 여러 가지 기상 재해가 문제시되나, 그 중에서도 수량 감소와 미질에 크게 영향을 주는 것이 생육 후기 집중호우나 태풍에 의하여 발생하는 도복(lodging)이다. 벼의 도복은 출수 후 등숙이 어느 정도 진행되고, 생육이 양호한 벼에서 발생하기 쉬우며, 특히 등숙기에 벼가 도복되면 잎의 수광태세 불량, 통도조직의 손상 등에 따라 도복 후 등숙불량을 야기시켜 미숙립 등이 증가함으로서 수확량과 미질의 저하를 가져오고, 수발아를 수반한 경우는 그 피해가 클 뿐만 아니라, 도복상태에 따라서는 콤바인 등 기계수확이 불가능하여 수확작업의 능률 또한 크게 약화시킨다[Kor . J. Intl . Agri ., 2001. Mar; 13(1): 58-63].

벼 도복 피해는 바람과 강우가 주된 원인이 되지만 재배되는 품종 및 재배기술에 따라서도 영향을 크게 받는다. 특히, 품종적으로 줄기가 약하고 키가 크며 이삭이 큰 품종은 도복에 매우 약한 특성을 지닌다.

도복에 의한 벼의 수량 감소 양상을 보면, 이삭이 나온 후 빠르면 빠를수록 도복 피해는 더 커지게 된다. 이러한 수량 감소에 직접적인 영향을 주는 것은 등숙비율과 천립중의 감소이며, 등숙비율은 도복이 늦어질수록 그 감소가 경미하게 되어 도복 피해는 현저하게 낮아지게 된다. 또한, 미질에 미치는 영향은 도복의 발생 시기에 따라 다른데, 호숙기 도복의 경우는 청미비율이 크게 증가되어 결국 양질미 생산이 어려워진다[농업기술회보, 2003. Sep; 40(8): 34-36].

이러한 도복에 대한 대책으로 다양한 품종적, 재배적 조치들이 있으나, 우선적으로 내도복성이 강한 품종을 육성하고 보급하는 것이 절대적으로 요망된다. 내도복성이 강한 품종은 벼의 키가 작으면서 줄기가 강하고 뿌리의 발달이 왕성한 품종적 특성이 요망된다. 내도복성 품종을 육성하기 위해서는 전통적으로 초장이 작은 왜성의 유전자를 가진 왜성벼와 일반품종의 교배육종을 통하여 반왜성벼를 육종하는 방법이 이용되어 왔으나, 유전자를 고정시키기 위하여 많은 세대를 진전시켜야 하는 등의 육종 과정상 여러 난점이 있었다.

이를 해결하기 위하여, 식물의 유전 현상을 분자 수준에서 이해하기 시작한 20세기 중반 이후부터는, 기존의 육종 방법을 벗어나 유용 유전자의 도입을 통한 새로운 품종 개발이 이루어지고 있으며, 실제로 분자 생물학의 발달은 유용유전자의 분리 및 조작을 통해 벼를 포함한 많은 식물에 형질전환하여 새로운 형질전환 식물을 얻고 있다. 이러한 유용 유전자의 발굴과 이를 이용한 새로운 품종 개발을 통해 식량 문제 해결과 더불어 바이오매스, 사료 작물 생산, 왜성 화훼 품종 개발 등 농업 기반 산업 전반에 걸쳐 유용하게 사용하고 있는 실정이다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 과도한 줄기 신장에 의한 도복 피해를 예방하기 위하여, 식물에서 줄기 신장을 조절하는 유전자들을 발굴하고, 이들을 이용하여 줄기 신장을 조절하는 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 짧은목 계통의 SUI4(shortened uppermost internode 4)로 명명한 유전자의 마이크로알엔에이(microRNA) 결합부위의 염기서열을 치환하여 줄기 신장을 억제한 형질전환 벼 식물체를 제조함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 줄기 신장이 두드러지게 억제된, 내도복성이 우수한 왜성(dwarf)의 신품종을 개발하기 위하여, 식물에서 줄기 신장을 조절하는 유전자를 발굴하고, 상기 발굴한 유전자를 이용한 줄기 신장 조절 방법 및 이에 의해 제조된 형질전환 식물체를 제공하기 위한 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 식물의 줄기 신장을 억제시키는, 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 유전자를 포함하는 형질전환용 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서 용어 "식물"이란 생물계를 구성하고 있는 것 중 동물을 제외한 생물로, 세포벽이 있고 엽록소가 있어 독립영양으로 광합성을 하는 생물을 의미한다. 본 발명에 사용될 수 있는 식물은 일반적으로 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물 둘 다를 포함하는 형질전환 기술에 적용 가능한 고등 식물의 부류 및 조류와 같은 특정의 하등 식물과 같이 광범위할 수 있으며, 이는 배수체, 이배체 및 반수체를 포함하는 각종의 배수성 수준의 식물을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "형질전환(transformation)"이란 외부로부터 주어진 유전물질인 DNA에 의해 개체 또는 세포의 형질이 유전적으로 변화하는 것을 의미하는 것으로, 본 발명에서는 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 유전자 도입에 의해 식물의 줄기 신장이 억제되는 변화를 보이는 것이다.

본 발명에서 용어 "벡터(vector)"란 유전자 운반체로, 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 보유하는 DNA 제조물을 의미하고, "재조합 벡터"란 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

상기 재조합 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래하거나, 둘 다의 요소를 포함할 수 있다. 따라서 재조합 벡터는 재조합 DNA 또는 RNA 구축물, 예컨대, 플라스미드, 파지, 재조합 바이러스 또는 적절한 숙주 세포 내 도입시, 클로닝된 DNA의 발현을 초래하는 다른 벡터를 의미한다. 적절한 재조합 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 진핵세포 및/또는 원핵세포 내에서 복제가능한 것들 및 에피솜(episome)으로 남는 것들 또는 숙주 세포 게놈 내에 통합되는 것들을 포함할 수 있다.

상기 통상의 벡터는 본 발명의 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 유전자를 도입할 수 있는 것이면 어떠한 것이든 무방하나, 바람직하게는 pCAMBIA계열 또는 pGA계열의 벡터, 예컨대, pCAMBIA1300, pCAMBIA1381, pCAMBIA1391, pGWB3, pGA3383, pGA3426, pGA3428, pGA3438, pGA2715, pGA2717와 같이 Ti-plasmid에서 파생된 벡터로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 보다 바람직하게는 pCAMBIA1300이 사용된 것일 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기한 바와 같은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 유전자를 포함한 재조합 벡터에 의하여 형질전환된, 줄기 신장이 조절된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명에서 용어 "식물체"란 식물이 지닌 유형의 몸으로, 본 발명의 형질전환 식물체는 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 유전자를 포함한 재조합 벡터를 숙주에 도입함에 의하여 제조된 형질전환 식물의 전체, 식물의 일부, 종자 또는 식물 세포를 포함할 수 있다.

본 발명의 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 유전자를 포함하는 식물의 줄기 신장을 억제하는 기능을 가지는 형질전환용 재조합 벡터를 숙주에 도입하여 형질전환 식물체를 제조할 경우, 상기 형질전환 식물체는 내도복성이 강한 왜성 식물(dwarf plant)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 내도복성이 증진된 왜성 벼(Oryza sativa)일 수 있다.

본 발명에서 용어 "내도복성(lodging tolerance)"이란 농작물이 비바람에 넘어지지 아니하고 견디어 내는 성질을 의미하는 것으로, 작물의 키와 줄기의 굵기가 가장 큰 역할을 한다. 예컨대, 벼는 출수 후 이삭이 무거워지는 등숙기에 많은 비와 강한 바람에 의해 쓰러지는 것을 볼 수 있으며, 동일한 지대에서도 줄기 신장이 과도한 품종은 쓰러지고 줄기 신장이 억제된 왜성의 품종은 쓰러지지 않는, 품종 간의 내도복성 정도 차이를 나타낸다.

본 발명에서 용어 "왜성(Dwarfness)"이란 생물의 크기가 그 종(種)의 표준 크기에 비하여 작게 자라는 형질, 또는 그런 형질을 가진 품종을 의미한다. 왜성 형질은 농업 및 원예업의 다양한 관점에서 중요하다. 예컨대, 식물 높이 또는 줄기 길이를 축소함으로써 관상용 식물을 제조할 수 있고, 채소 또는 과일을 소형화함으로써 먹기에 적당한 크기(bite-sized)를 갖는 등의 새로운 상업적 가치를 갖는 농작물을 제조할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 형질전환 벼 식물체는 원품종인 동진벼 대조군과 비교하여 줄기 신장이 현저하게 단축된 왜성 벼임을 확인할 수 있었다(도 4 및 도 7).

다른 측면에서, 본 발명은 상기 형질전환용 재조합 벡터로 형질전환된 줄기 신장이 억제된 형질전환 식물체를 제공한다.

상기 형질전환 식물체는 왜성이며, 내도복성이 강할 수 있다.

형질전환 식물체는 벼(Oryza sativa)일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 줄기 신장이 억제된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다:

(a) 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;

(b) 상기 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 식물체에 형질전환하는 단계; 및

(c) 상기 형질전환체를 선별하는 단계.

이하 각 단계를 세부적으로 설명한다.

서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 상기 (a) 단계에서, 상기 재조합 벡터는 통상의 벡터에 본 발명의 유전자를 도입한 것일 수 있으며, 본 발명의 유전자를 도입하여 재조합 벡터를 제조하는 것은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 공지의 방법에 따라 용이하게 실시 가능하다.

상기 통상의 벡터는, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 pCAMBIA계열 또는 pGA계열의 벡터, 예컨대, pCAMBIA1300, pCAMBIA1381, pCAMBIA1391, pGWB3, pGA3383, pGA3426, pGA3428, pGA3438, pGA2715, pGA2717와 같이 Ti-plasmid에서 파생된 벡터로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 pCAMBIA1300일 수 있다.

(a) 단계에서 제조한 재조합 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 식물체에 형질전환하여 형질전환 식물체를 제조하는 상기 (b) 단계에서, 형질전환 식물체의 제조는 벡터를 식물에 도입하는 당분야에 공지된 형질전환 방법을 사용할 수 있다.

상기 형질전환 방법은, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 아그로박테리움 속(Agrobacterium spp.) 미생물을 이용한 형질전환법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커법(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리법(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(PolyEthylenGlycol)에 의한 침전법을 사용할 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 아그로박테리움 균주 LBA4404를 이용한 아그로박테리움-매개 형질전환법을 이용한 것일 수 있다.

(b) 단계에서 제조한 형질전환 식물체를 선별하는 상기 (c) 단계에서, 선별된 형질전환 식물체는 상응하는 야생형 식물과 비교하여 줄기 신장이 억제된 식물체로, 이에 제한되지는 않으나, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 공지의 선별 방법, 예컨대, 육안 선별, 선별 마커 도입에 따른 선별, 선별 표지 유전자를 도입하고 선택제(예; 대사 억제제, 항생제 및 제초제)에 노출시켜 선별하는 방법 등에 따라, 용이하게 선별 가능하다.

바람직하게는, 본 발명의 일 실시예에서 제조된 형질전환 벼 식물체들을 온실에서 키운 후, 수확기에 원품종인 동진벼와 절간 신장을 비교하여 육안으로 선별하는 방법을 사용하는 것일 수 있다.

본 발명의 식물의 줄기 신장을 조절하는 방법에 의하여 제조된 형질전환 식물체는 도복(loading) 피해에 따른 수확량 감소 및 품질 저하 등의 단점을 해소할 수 있으며, 이에 따라 본 발명의 방법에 의하여 작물의 줄기 신장을 조절함으로써, 작물의 생산성 및 품질을 향상시킬 수 있고, 새로운 형태의 왜성 신품종 개발에도 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 짧은목(shortened uppermost internode 4; sui4) 돌연변이 계통의 표현형을 보여주는 사진이다.
도 2는 본 발명의 줄기 신장에 영향을 미치는 SUI4 유전자의 분리 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 줄기 신장을 억제한 형질전환 식물체 제조를 위한 SUI4 유전자 형질전환 벡터의 다이어그램을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 SUI4 유전자 형질전환 계통의 표현형을 보여주는 사진이다.
도 5는 본 발명의 SUI4 유전자 및 SUI4 단백질의 개략적 구조(A)와 SUI4 유전자 염기서열(B) 및 SUI4 단백질 아미노산 서열(C)을 나타낸 도이다.
도 6은 목표염기서열돌연변이(Site-directed mutagenesis) 유발에 따른, 줄기 신장에 영향을 미치는 SUI4 유전자의 microRNA172 결합부위의 치환된 염기서열을 나타낸 도이다.
도 7은 목표염기서열돌연변이(Site-directed mutagenesis) 유발에 의해서 변형된, 본 발명의 SUI4 유전자 형질전환 계통의 표현형을 보여주는 사진이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 짧은목 돌연변이 계통 선발 및 표현형의 특성 분석

줄기 신장은 작물에 있어서 중요한 농업적 특성의 하나로, 줄기 신장이 과도하면 도복(lodging) 피해가 발생하여 수확량이 감소하고 품질이 저하된다. 이에, 줄기 신장이 억제된 돌연변이 계통을 찾기 위하여, 국립농업과학원 농업생명자원부에서 개발한 벼 삽입돌연변이집단[Plant J., 2004. Jul; 39(2): 252-263]의 식물체 표현형을 관찰하였다. 이때, 대조군은 원품종인 동진벼를 사용하였다.

그 결과, 도 1의 A에 나타난 바와 같이, 상기 벼 삽입돌연변이집단에서 벼 줄기의 제 1절간 길이가 극히 짧아진 돌연변이 계통이 발견되었으며, 상기 돌연변이 계통을 "짧은목" 계통이라 명명하고, 영문명으로는 sui4(shortened uppermost internode 4)라 명명하였다. 상기 돌연변이 계통은 원품종인 동진벼에 비하여 모든 절간의 길이가 짧았지만 벼 이삭의 아래에 있는 제 1절간의 길이가 가장 많이 짧아짐을 확인할 수 있었다.

또한, 상기 "짧은목" 돌연변이 계통의 제1세대 변이주를 얻어 식물체의 표현형을 관찰해 본 결과, 도 1의 B에 나타난 바와 같이, 상기 돌연변이 계통의 제1세대(T1) 식물체들이 변이형, 중간형, 정상형으로 분리됨을 확인할 수 있었다.

아울러, 상기 변이형과 원품종인 동진벼의 교배 후대 F1 식물체가 중간형을 나타냄을 확인함으로써, 상기 "짧은목" 변이 계통의 절간 신장 조절 유전자가 중간우성(semi-dominance)의 유전적 특성을 가지고 있음도 알 수 있었다.

정상형과 변이형의 벼 줄기세포를 현미경으로 관찰해 본 결과, 도 1의 C에 나타난 바와 같이, 변이형에서 세포 신장이 억제됨을 확인할 수 있었다.

이러한 결과를 통하여, 벼 삽입돌연변이 집단에서 발견된 sui4(shortened uppermost internode 4) 돌연변이 계통의 절간 신장 조절 유전자가 중간우성(semi-dominance)의 유전적 특성을 지니며, 상기 유전자에 의해 세포 신장이 억제됨을 알 수 있었다.

실시예 2: 벼 줄기 신장 조절 SUI 4 유전자 맵핑 ( mapping ), 분리 및 동정

실시예 2-1: 벼 줄기 신장 조절 SUI 4 유전자의 맵핑( mapping )

벼 삽입돌연변이 집단에서 발견된 sui4(shortened uppermost internode 4) 돌연변이 계통에서 줄기 신장을 억제한 원인이 되는 유전자를 변이를 구명하기 위하여, 상기 유전자에 대한 유전지도기반 유전자(map-based gene cloning) 연구를 수행하였다.

구체적으로, 짧은목 돌연변이 계통(sui 4)과 통일형 벼 품종인 밀양23호를 교배하여 후대 F2 집단 273 개체를 전개하고 절간 신장을 조사하였으며, 벼의 12개 염색체에 골고루 분포한 93개의 DNA 마커를 이용하여 집단분리분석(bulked segregant analysis: BSA)을 실시하였다.

우선, 제 1절간 신장이 가장 짧은 30개체를 선발하여 3개의 DNA 풀(pool)을 만들고, 제 1절간 신장이 가장 긴 30개체를 선발하여 3개의 DNA 풀을 만들었다. 짧은목 계통과 밀양23호의 제 1절간 신장이 짧은 DNA 풀 및 긴 DNA 풀 각각 3개를 대상으로 93개의 DNA 마커를 이용하여 유전자형 분석을 하여 제 1절간 신장이 짧은 DNA 풀들과 제 1절간 신장이 긴 DNA들 간에 일관되게 유전자형의 차이를 보이는 마커를 탐색하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 벼 7번 염색체에 위치한 S07012와 S07015 마커에서 일관된 차이를 보여 짧은목 돌연변이 계통(sui 4)의 줄기 신장 억제 유전자인 SUI4 유전자가 7번 염색체에 위치함을 알 수 있었다.

또한, 7번 염색체에 있는 14개 DNA 마커를 이용하여 모든 F2 집단 개체들의 유전자형을 조사하고, 표현형과 연관시켜 유전자지도를 작성해 본 결과, SUI4 유전자가 7번 염색체 S07012와 S07015 마커 사이 약 2.3 Mbp 구간에 위치함을 확인할 수 있었다. 이때, MapDisto 프로그램(Molecular Breeding . 2012. 30(2):1231-1235)을 사용하여 유전자지도를 작성하였다.

아울러, S07012와 S07015 마커 사이 약 2.3 Mbp 구간에 위치한 7개의 DNA 마커를 이용하여 짧은목과 밀양23호 교배 후대 F3 집단 개체들의 유전자형을 조사하고, 표현형과 연관시켜 정밀유전자지도(fine-mapping)를 작성해 본 결과, SUI4 유전자가 7번 염색체 RM1253과 S07015 마커 사이 약 1.1 Mbp 구간에 위치함을 확인할 수 있었다.

실시예 2-2: 벼 줄기 신장 조절 SUI 4 유전자의 분리 및 동정

벼 줄기 신장 조절 SUI4 유전자를 분리 및 동정하기 위하여, 상기 실시예 2-1에서 확인한 SUI4 유전자 위치 구간에서 동진벼와 짧은목(sui4) 계통, 그리고 5개의 벼 품종(화청, 화영, 일품, 기호, 밀양23호)의 유전체 재해석(Re-sequencing) 데이터를 분석하였다. 이때, 유전체 재해석 데이터는 Illumina Hiseq 2000 기종을 이용하여 분석하였다.

구체적으로, 동진벼와 짧은목(sui4) 계통간의 단일염기서열변이(Single nucleotide polymorphism; SNP)를 추출하고, 다른 5개의 벼 품종의 시퀀스 데이터와 비교하여 짧은목(sui4) 계통에만 특이적인 단일염기서열변이(SNP)를 탐색하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 18개의 짧은목(sui4) 계통 고유의 단일염기서열변이(SNP)가 발굴되었고, 이 가운데 6개의 단일염기서열변이(SNP)가 유전자 영역에 존재하고 있음을 확인하였다. 또한, 이들 가운데 5개의 단일염기서열변이(SNP)는 인트론(intron)에 존재하였고, 1개의 단일염기서열변이(SNP)만이 엑손(exon)에 존재하고 있음을 확인하였다.

따라서, 단백질의 구성정보를 담고 있는 부분인 엑손(exon)에 존재하는 단일염기서열변이(SNP)가 짧은목(sui4) 계통의 절간 신장 변화에 원인이 되는 유전변이인 것으로 간주하고, 국제벼유전체해독프로젝트 결과 생성된 벼 유전체 해독 데이터베이스(RAP-DB: http://rapdb.dna.affrc.go.jp)에서 상기 단일염기서열변이(SNP)를 탐색해 본 결과, Os07g0235800 유전자(NCBI sequence data base accession NC_008400.2, GI:4342787)의 10번째 엑손(exon)에 있는 microRNA172 결합부위에 존재하고 있음을 확인하였으며, 상기 단일염기서열변이(SNP)는 microRNA172에 의한 해당 유전자의 제어를 저해할 것으로 예상되었다.

이러한 결과를 통하여, 짧은목(sui4) 계통의 특이적인 단일염기서열변이(SNP)가 Os07g0235800 유전자의 microRNA172 결합부위에 존재하고 있으며, 상기 단일염기서열변이(SNP)이 microRNA172에 의한 해당 유전자의 제어를 저해할 가능성이 있음을 알 수 있었다.

실시예 3: Os07g0235800 유전자를 포함한 형질전환체 분석

짧은목(sui4) 계통의 특이적인 단일염기서열변이(SNP)이 Os07g0235800 유전자의 microRNA172 결합부위에 존재하고 있음을 상기 실시예 2-2에서 확인하였다. 이에, 상기 Os07g0235800 유전자를 SUI4 유전자의 강력한 후보 유전자로 간주하고, Os07g0235800 유전자가 본 발명의 SUI4 유전자와 같은 기능 단위에 속하는지 여부를 조사하기 위하여, 벼 형질전환을 이용한 상보성 검사(complementation test)를 수행하였다.

구체적으로, 짧은목(sui4) 계통의 벼에서 상기 Os07g0235800 유전자 영역은 Long PCR(polymerase chain reaction)로 분리하였으며, Long PCR 수행시, 프라이머는 2358infF2(5'-CGGTACCCGGGGATCCAAATCAGTTCCTACGTGCAACGGGCGCAAAATATC-3':서열번호 3)와 2358infR2(5'-CGACTCTAGAGGATCCGCCCCACTTCCTTGGGAAACTTAAACGATGAGCTC-3':서열번호 4)를 사용하였다. 상기 프라이머는 Os07g0235800 유전자의 엑손(exon), 인트론(intron), 프로모터(promoter, 약 2kb) 및 터미테이터(terminator, 약 1kb)를 포함한 약 7.9kb 구간이 증폭되도록 설계하였으며, Long PCR은 TaKaRa사의 PrimeStarGXL DNA Polymerase를 이용하여 수행하였다. 이때, Long PCR은 PCR 증폭 조건으로 94℃로 3분 가열한 다음, 98℃에서 10초 가열, 68℃에서 9분 가열하는 단계로 구성된 일련의 과정을 총 30회 반복한 후, 이를 72℃에서 10분 더 가열하는 조건으로 진행하였다.

상기와 같은 조건으로 증폭된 짧은목(sui4) 계통의 Os07g0235800 유전자 영역 PCR 산물을 Clontech사의 In-Fusion HD cloning kit를 이용하여, 도 3에 나타난 바와 같이, 벼 형질전환벡터인 pCAMBIA1300 벡터에 삽입하였다. 이후, 상기 짧은목(sui4) 계통의 Os07g0235800 유전자 영역을 포함한 pCAMBIA1300 벡터를 아그로박테리움(Agrobacterium) LBA4404 균주에 freeze-thaw법을 이용하여 도입시키고, Hiei 등에 의해 서술된 방법(Plant Journal, 1994. 6:271-282)으로 상기 형질전환된 아그로박테리움 LBA4404 균주를 이용하여 동진벼를 형질전환시켰다. 상기와 같이 제조된 형질전환 식물체들을 온실에서 키운 후, 수확기에 원품종인 동진벼와 비교하여 절간 신장을 조사하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 초기 세대(T0) 형질전환 식물체들에서 짧은목(sui4) 계통과 유사하게 절간 신장이 단축됨을 확인하였다.

이러한 결과를 통하여, Os07g0235800 유전자가 본 발명의 짧은목(sui4) 계통의 SUI4 유전자임을 알 수 있었다.

실시예 4: 벼 줄기 신장 조절 SUI 4 유전자 분석

Os07g0235800 유전자가 본 발명의 짧은목(sui4) 계통의 SUI4 유전자임이 상기 실시예 3에서 증명되었다. 상기 Os07g0235800 유전자는 AP2 도메인 전사조절인자를 코딩하는 유전자로, 도 5에 나타난 바와 같이, 코딩염기서열의 3' 말단 부위에 마이크로알엔에이(microRNA) 172 결합부위(binding site)를 가지고 있다. 일반적으로 microRNA172는 microRNA172 결합부위를 가진 AP2 도메인 전사조절인자들의 유전자 발현과 기능을 억제하는 것으로 알려져 있다.

이에, 짧은목(sui4) 계통에서는 상기 Os07g0235800 유전자가 microRNA172에 의해 제어되지 않고 정상형에 비하여 기능이 항진된 것으로 판단되어, 유전자 분석(gene analysis)을 수행해 본 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 짧은목(sui4) 계통의 microRNA172 결합부위에서는 정상형에서 코딩되는 아미노산인 세린(serine)이 트레오닌(threonine)으로 변환되어 돌연변이가 일어남을 확인할 수 있었다. 이에 해당하는 서열을 서열번호 1로 표시하고 SUI4-1로 명명하였다.

이러한 결과를 통하여, Os07g0235800 유전자로 증명된 본 발명의 SUI4 유전자의 microRNA172 결합부위의 염기서열 변이에 의한 본 발명에 따른 서열번호 1로 표시되는 유전자가 벼의 줄기 신장 억제에 관여함을 알 수 있다.

실시예 5: 벼 줄기 신장 조절 SUI 4 유전자의 목표염기서열돌연변이( site -directed mutagenesis ) 유발 및 이에 의한 형질전환체 생산

짧은목(sui4) 돌연변이 계통에서의 SUI4 유전자 변이가 세린(serine)을 트레오닌(threonine)으로 변환함을 상기 실시예 4에서 확인하였으나, 절간 신장이 억제되는 원인이 microRNA172 결합의 저해인지, 아니면 아미노산의 변화인지 분명하지 않았다.

이에, 이를 명확하게 파악하여 정상형에 비하여 줄기 신장 억제 기능이 항진된 형질전환 식물체를 생산하기 위하여, 도 3의 벡터를 대상으로 하여, 도 6에 나타난 바와 같이, 목표염기서열돌연변이(site-directed mutagenesis) 유발 방법으로 SUI4 유전자의 microRNA172 결합부위에서 코딩되는 단백질의 아미노산이 원래대로 세린(serine)으로 유지되도록 하면서 3개의 염기서열을 치환하였다. 이를 서열번호 2로 표시하고 SUI4-2로 명명하였다. 이후, 상기 변형된 벡터를 이용하여 아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법으로 동진벼를 형질전환시킨 형질전환 벼 식물체를 제조하였다.

구체적으로, 짧은목(sui4) 계통의 Os07g0235800 유전자의 microRNA 172 결합부위에 생긴 단일염기서열변이(SNP) 부위에서 원품종인 동진벼의 Os07g0235800 유전자와 마찬가지로 아미노산 세린(serine)을 코딩하면서 동진벼에 비해 3개의 염기가 치환된 유전자 형태를 만들기 위해, 짧은목(sui4) 계통의 Os07g0235800 유전자 영역을 포함한 pCAMBIA1300 벡터를 주형으로 하여 목표염기서열돌연변이를 유발하였다. 이때, QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene, La Jolla, CA, USA)를 사용하여 수행하였으며, 돌연변이유발(mutagenic) 프라이머로는 2358MF1(5'-CCATTACTCCCTACTGCAGCAAGTTCAGGATTCTCTACGG-3':서열번호 5)과 2358MR1 (5'-CCGTAGAGAATCCTGAACTTGCTGCAGTAGGGAGTAATGG-3':서열번호 6)을 사용하였다. 상기 목표염기서열돌연변이 유발로 인해 변형된 Os07g0235800 유전자 영역을 포함한 pCAMBIA1300 벡터를 아그로박테리움(Agrobacterium) LBA4404 균주에 도입하고, 상기 형질전환된 아그로박테리움 LBA4404 균주를 이용하여 동진벼를 형질전환시켰다. 상기와 같이 제조된 형질전환 식물체들을 온실에서 키운 후, 수확기에 원품종인 동진벼와 비교하여 절간 신장을 조사하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 초기 세대(T0) 형질전환 식물체들에서 줄기 신장이 두드러지게 단축됨을 확인함으로써, microRNA172 결합부위 염기서열 변이가 절간 신장 억제의 원인임을 알 수 있었다. 즉, 본 발명에 따른 서열번호 2의 유전자가 줄기 신장 억제에 관여함을 알 수 있다.

이러한 일련의 결과들을 통하여, AP2 도메인 전사조절인자를 코딩하는 유전자인 Os07g0235800 유전자가 본 발명의 SUI4 유전자임을 도출해 내고, 상기 유전자의 microRNA172 결합부위 염기서열을 치환함에 의해, 식물의 줄기 신장을 두드러지게 억제할 수 있다는 새로운 기능을 밝혀내었다.

이로써, AP2 도메인 전사조절인자 유전자의 microRNA172 결합부위 염기서열을 치환함으로써 식물의 줄기 신장을 억제할 수 있고, 줄기 신장을 억제함으로써 과도한 줄기 신장에 따른 도복 피해에 대한 내도복성이 강한 식물 생산에 적용할 수 있음을 알 수 있다.

<110> Republic of Korea <120> Transgenic plant having a short stem by inhibiting stem elongation and method for producing using the same <130> P14R12D1206 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 7888 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SUI4-1 <400> 1 aaatcagttc ctacgtgcaa cgggcgcaaa atatcccggg gtcacagatc cgtttccttg 60 tttgtgtaac aagtgtttgg tacttcctgc ccattactgc acgctggtgg tggacagtag 120 cagcacagga gaagacagcc atggggatgg ggcggccaat gggaaactac accggtggat 180 attttgccga caggaaatgc tgcacgcact aaccaatgtt gctcacaaag ttttttttta 240 aaatttttaa tttctccctc gcatcatgtg gtccctgcag atacatcatg tcataaaagt 300 ttttcttaac agtgaagtat tattattatt attgtttgct cctttgatat ttatacttga 360 ttatgaaatc aagtttattg tattatgtag aatatgcagt gccatgcttg ggtgtctctc 420 tcgtccagaa gctgagttag acttcatttt ttttaaaaga ttgtacatta atttaaccac 480 aacctagaaa gtgcttgtct tgtgcatata aaaacatgta tgttatatta tttttttgtg 540 aggaatatta tggaatggtg gaatatattt atctcctttt aaagaagcac cttgtttcta 600 tatttcatat ccataccttt aaaaacatca cgttgtattt tgctccatcg tttgcccgtt 660 agcttatgag tcaaagcaaa atttgaattt ttagacttaa ttctagagtt aattttgagg 720 cattttttta ttatagttta gttttcagca ttggttttta aaattgccaa gagcacatat 780 atacaaattt tatacataaa tcaatttttg ttgcttcatt ctattttaca acttaatggc 840 agagcaaacg atgaaaataa tttatatcgt gtgctctaga aatgttgttt tcactatatc 900 atggatcagt ttaggtagac gtgtagatat ccttactccg taataaaacg agccaacaat 960 gctagcttag agccgttaat tattgttaca agtaaatgca accttaatct atatatgctt 1020 atctgacttc aaaagaagta ctccaaccat gtaaccaaaa tccaaccgtg ttataagtcg 1080 atttaattat tctctagcta cttactaaag tttgatatac tcttatatag agaaaattag 1140 caacatctac aatacaaaat tagttttatt ctaacattca atacattttg ataatacgtt 1200 ttaaacatta gtatataatt ctaaaaaata aattaaagca atgtcgagtg gaaaatacaa 1260 cttttatcac tgtgatgcaa tcctatatac gactaccttt atatactact ctattcattt 1320 caggttacaa gacgttttta ctttggtcaa aatcaaactc tttcaagttt aactaaattt 1380 atagatacat atagtaatat ttataatact aaattagttt gattcaatca ataattgaat 1440 atatattcat aataaatttg tcttgagttg aaaatgttat tattttttta caaacttggt 1500 taaacctgaa gcagtttaac tttgataaaa gtaaaaacgt cttataatct agattagagg 1560 gactagcacc agtagtcggc aaacacattg caactatttg accagagtca agtcaaacaa 1620 agcatagcac actcctcctt aatacaccct acatacacaa aaccatacta ctactactag 1680 taggagtctc caccgttctg aaaaaagaaa aagaaaaaaa aaacctccat ctcccgccca 1740 gtgccgccgc gccacgtcac ccctcccccg ccgcgcgtgt gtgtacgcgt agcctttccg 1800 gcggagacgc agcacaaaaa tggttttact tgcgataccc ttcgtctccc tcacgtccca 1860 tccatccctc cccccccttt tccctcctcc tccacctcca ctgccatggc cgcctccgcc 1920 gctcctctct cccgcgtggt agccgccgcc ggttgccgcc gctaggggag cgcgacgggg 1980 gaacggtagg ggcgacccag ctcgctctgt cgccccgcgg ctggtggggg tgcgcgcggg 2040 ggagagcggt tggttagtat ggtgctggat ctcaatgtgg agtcgccggg tgggtcggcg 2100 gcgacgtcga gctcgtccac gccgccgccg ccgcccgacg gtggcggcgg ggggtacttc 2160 cggttcgacc tgctcggcgg gagccccgac gaggacgggt gctcctcgcc tgtcatgacg 2220 cgccagctct tcccttcgcc gtctgcggtg gtggcgctgg cgggggacgg gtcgtcgacg 2280 ccaccgctga cgatgccgat gccggcggcg gctggggagg ggccgtggcc gcgccgcgcg 2340 gcggatctcg gggtggcgca gagccagagg tcccccgccg gcgggaagaa gagccgccgc 2400 ggcccgaggt ctcggagctc ccagtacagg ggcgtcacct tctacaggag gaccgggcga 2460 tgggagtcgc acatctggtt agcttcgcct tgctcgattt ccctcacgct gacttcctct 2520 gcttgactct gcttgattgg agtagtaatc tcttcgtttg tctcgtccaa ttttggcagg 2580 gactgcggga agcaggtgta cctgggtgag ctcctatttc tagtctccca agctaaattc 2640 gctcgcatga ctgctaaatt tgggtctcta cttagcttga ttccgatttg tttgctcctg 2700 ccttgttttt tttttctgtt ttcaggtggt ttcgatacag ctcatgccgc agcgaggtta 2760 ctataaatgg tcaccaattg tatcttaatt gttgctctgg tttgccctgt gtgctgagat 2820 tgtagaaccc cttgtgcagg gcctatgatc gcgcggcgat caagttcaga ggcctcgacg 2880 cggatatcaa ctttaatctg aatgactatg aggacgactt gaagcaggtt gtttggaata 2940 tagttcaatt gtcatgtgtg attctttagg ttctaagggg aggttcattc accggcctgt 3000 gatggtttat gatggattgg ttcgtgctgt gttgttagat gcgcaattgg accaaggagg 3060 agtttgtgca catacttcgg cgccaaagca caggatttgc aagggggagc tcaaagtacc 3120 ggggtgtgac actgcacaag tgtggccggt gggaagctcg gatgggccag ctgctcggca 3180 agaagtaaga tccctgaaac attgattgtt cttgctagta acttacaata caatacattt 3240 tagattagtt caggaccatt tttcatgcca tgaacgaaaa ctgtgtcaag tttgcttttc 3300 aaaaagggaa agaaaaaaaa tgtgtcacta ccaagctgga gaatggtagg ctacccctgg 3360 agtccacatc cacctgaaga tttgatgttg actcttcaca cactagccat ttactattgg 3420 aacaccacag gtgttcaatg attatagatt gctagcttct ttaggaaaga actaagtgaa 3480 tcggaatggc tcctcggaat taattgaggg gaaatgtttt tgtttccttg gggattgtgt 3540 tttgcatcct aagtcagtga taggtgaaaa gcttcatttc aatgctcttg gttgtttttg 3600 ccactaagaa tgttctgctt atttacgttg aatttttgat tggctgttcg tatcatagtt 3660 gtgcatttcc tatatattac aatctttgtg aactttagat aattctggca tgagctctct 3720 ctgtggtatt gttctattaa cagaagtatc attctgtcaa ttccccactg ataagtgatc 3780 ttttgtgcag gtacatctat ctaggattgt ttgacagtga aattgaggct gcaaggttca 3840 gttagtagta ctttgctctt ctcagtttga tatgtgcttg ctattcctat acttctctca 3900 ctttcatcta ctcttcaact tgtagagcat atgaccgggc agctatccgc ttcaatggaa 3960 gggaagctgt tactaatttt gatcctagtt cttatgatgg agatgttcta cctgaaaccg 4020 acaatgaagg tatttctttt gtactatgta tattgtgctt tatccactag aacgacaaat 4080 ccaaatttta tattaacaaa agcacactgg ggattgtctt agcagtggtt gatggagaca 4140 tcattgactt aaatctgaga atttcacagc ctaacgttca tgagctgaaa agtgatggta 4200 ccctaactgg gttccagttg aattgtgatt ctcctgaagc ttcaagttct gttgttactc 4260 aggtaaatat gctacaatat ttggtgtttg taaccgctat accatttgag atttgaccgt 4320 cttcagattc ttttgatcag gtggttagtc ctttttcata acattatact atcactttca 4380 aaataattag tacactaatt gtatgtgtca ctagaattgt tgtatgaaac catctgggaa 4440 ccatcttatg cagcttattg acaaatgaca actcactgtt gatgtattcc caaatcaaga 4500 aaagccaatc tttttattca atttctccag ttcattgaat tgaaaaagaa attgccgaac 4560 aactaccacc tgaagagact ggctagatat tttgtttatc tgtgtatttt tataacctat 4620 aacagttcca aagccacaaa gctcttttac cttgattctg ataacgttaa ctgaggtatc 4680 attttgtgat tgttttctgt agccaataag tcctcagtgg cctgtgcttc ctcagggcac 4740 atcgatgtcc cagcatccac atttatatgc atctccttgt ccgggcttct ttgtgaacct 4800 cagggtatat ctatcatcaa aacttatatg caatttgaaa agacagttaa acttgtttca 4860 agttaacatt cgattgctaa ttagctacta cttccatgct cctatttctt gagatgacga 4920 accatatgtt tgttccttta attacataat ggtagccgta gatactgttt gccttgtgaa 4980 ctgtcagata tagcaggaag taaatctgtc agcttgcaac tttccatgaa ccacagctgt 5040 ccaactttat acagtggatg atgacttgca tttgatacat cctagtactt tcttgttgca 5100 ctctgcagct ttagctctga agatgctcta tatttccatg aatgctcacg ttagctctga 5160 aatttcgaac tttcactcca taacatgctc acttaggctg tgtttagatc caaacttcag 5220 ttcttttcca tcacatcaac ctgtcataca cacacaactt ttcagtcaca tcatctctaa 5280 tttcaaccaa aatccaaact ttgccatcaa ctaaacacag ccttattcat tgttccacct 5340 tttatttctg ccattgctaa ggtccaatct tgatacctca gagagctgca tgatgtgtag 5400 atagtcctaa cttaggtccg ttggttagaa tcatccattc atgtttagga aaagtgatta 5460 acaacgtgtg ctgcattaac cattaatgtg gtcaactctg atgcttgtgc tatggtcact 5520 gcaggaagta cctatggaga aaagacctga gttgggtccc cagtcgttcc ctacttcgtg 5580 gtcatggcaa atgcagggct cccctttgcc attactccct actgcagcaa catcaggatt 5640 ctctacgggc accgtcgccg acgccgcccg ctcgccttcc tcccgccccc atccatttcc 5700 cggccaccac cagttctact tccccccgac cgcctgactg ccacctattc tggtggaggc 5760 gacacctcac cgtgcatcca ccgccgcttg ccgataacat tcgtcgtttg tccagagagg 5820 gaccttctcc atatgatatc cctctctatg ttccacctgg ttatgatcag aattctcacg 5880 ctcatgattc ttttatcttc atttttgagt gcgaaaccac gaatcgtgac cgtgctacca 5940 ggtaaacacc cttgtacctc tttgactcta caataaaatt aatgtaagat attctggcta 6000 aaagtgattg gccctcccta ctgtattttt acagagttgt aatttgaaca gtgggcacta 6060 aagctggggc ccactcgcac cagtgtctag tggagcgaag ctttgccctt ttcttgctat 6120 ccagcaacta ttcctccgcc tgcctccatt gctgacagtg gagatagctt cccagtggtc 6180 actgttccac tgtactctgt catagtttct gatcacccct attgtgcctt gtctctttca 6240 cctcctccct cacttgtgct gcctctggcc actagagtgg cgccctgcac tgttgccatg 6300 catggctgcc acttcgagag tggagatggg ggttggcctt tgggtgattt ctgtgtgcca 6360 tcttttggct caatgtcgtt ttgggactgg tgcatgtact ggcaataggt gagatgagat 6420 atgaaatgtc ctctgctgct ttttctatct aaggagtagc ttagctatca ccagctgcct 6480 ttctcttctc aaataaggtt gttaaaaggg ggggtcttaa agctacccca actgctgcca 6540 ggggccctct tcaatgccct cccagctgcc gtttctttct ttattggttt gcttctctgc 6600 tgcttctttt gcctggttgg atggatgttt gtttgttcgt atgaattggg ggagctacta 6660 gtatcattca tgagtagagg caggcagggc agagcaggct gctggctggc caggcactga 6720 tgtgccaaca gctatttcca gtgaaacggc tgccattttt ctttgctggg attgtgatag 6780 tggtaggctg gtagtactag ctagcagtgt attgggggaa atactggtgg tccatttgcc 6840 tgttagccaa tctgatgctt gcctttccat ccgctggtga tggtccattt gctttggcat 6900 cttgcttgcc tgttagtact acaaaagttg catacatatg ctattgaggt tagggtgtgt 6960 ttagttcacg caaaaattgg aagtttggtt gaaattggcg atgtgatgga aaagtttgaa 7020 gtttatatgt gtaggaaagg tttgatgtga tggaaaagtt ggaagtttga aaaaaaatgt 7080 ttggaactaa acacggtgtt agagttgatc tgagtacctg acaacttcat ggcaaatgct 7140 ctttacaatg acatcaacag actttagttt tgcagcagtt cttctctgta tctgtgtttc 7200 aatgcatggg tttggattgt gaataacagt attatatttg cctgcccttc cttttttggt 7260 ttaaaaagaa aggcattgtc tatggtggca aggcttttga tgaatagact atgcatcctt 7320 tctttggtac actttgttag aatagtatgt ggaatattag atggaccaaa tctatcaaac 7380 ataataatag tacaattagg atgtttggta gagatttgag atatcctttt ttttgggaga 7440 gtttgggtgg ggttgattta actcccatag ttaaattaat taactaatac aaagaaatat 7500 actgaaagga aaatttccaa ggtaggagtt tttgctaaat ttccttcaaa ttctctacag 7560 gattgttcat ttcatatgaa ttccaagaga taggatagga ttcaatcctt tgttttaaag 7620 atcttcatag gtaattttca tataggatta aaaccctcca aaattccttt gtttttcctc 7680 taaatcaaag gaaccctaaa acacatgaat atgagatgtt ttgtttggat gcttcaaatg 7740 aaaaatacat agaaaagaca tataggaatt tggtagattc atttgagagt agatagatgg 7800 agaagagttg cattggacct ttcaaaaagt gaaagaatga agtttgagca attgagctca 7860 tcgtttaagt ttcccaagga agtggggc 7888 <210> 2 <211> 7888 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SUI4-2 <400> 2 aaatcagttc ctacgtgcaa cgggcgcaaa atatcccggg gtcacagatc cgtttccttg 60 tttgtgtaac aagtgtttgg tacttcctgc ccattactgc acgctggtgg tggacagtag 120 cagcacagga gaagacagcc atggggatgg ggcggccaat gggaaactac accggtggat 180 attttgccga caggaaatgc tgcacgcact aaccaatgtt gctcacaaag ttttttttta 240 aaatttttaa tttctccctc gcatcatgtg gtccctgcag atacatcatg tcataaaagt 300 ttttcttaac agtgaagtat tattattatt attgtttgct cctttgatat ttatacttga 360 ttatgaaatc aagtttattg tattatgtag aatatgcagt gccatgcttg ggtgtctctc 420 tcgtccagaa gctgagttag acttcatttt ttttaaaaga ttgtacatta atttaaccac 480 aacctagaaa gtgcttgtct tgtgcatata aaaacatgta tgttatatta tttttttgtg 540 aggaatatta tggaatggtg gaatatattt atctcctttt aaagaagcac cttgtttcta 600 tatttcatat ccataccttt aaaaacatca cgttgtattt tgctccatcg tttgcccgtt 660 agcttatgag tcaaagcaaa atttgaattt ttagacttaa ttctagagtt aattttgagg 720 cattttttta ttatagttta gttttcagca ttggttttta aaattgccaa gagcacatat 780 atacaaattt tatacataaa tcaatttttg ttgcttcatt ctattttaca acttaatggc 840 agagcaaacg atgaaaataa tttatatcgt gtgctctaga aatgttgttt tcactatatc 900 atggatcagt ttaggtagac gtgtagatat ccttactccg taataaaacg agccaacaat 960 gctagcttag agccgttaat tattgttaca agtaaatgca accttaatct atatatgctt 1020 atctgacttc aaaagaagta ctccaaccat gtaaccaaaa tccaaccgtg ttataagtcg 1080 atttaattat tctctagcta cttactaaag tttgatatac tcttatatag agaaaattag 1140 caacatctac aatacaaaat tagttttatt ctaacattca atacattttg ataatacgtt 1200 ttaaacatta gtatataatt ctaaaaaata aattaaagca atgtcgagtg gaaaatacaa 1260 cttttatcac tgtgatgcaa tcctatatac gactaccttt atatactact ctattcattt 1320 caggttacaa gacgttttta ctttggtcaa aatcaaactc tttcaagttt aactaaattt 1380 atagatacat atagtaatat ttataatact aaattagttt gattcaatca ataattgaat 1440 atatattcat aataaatttg tcttgagttg aaaatgttat tattttttta caaacttggt 1500 taaacctgaa gcagtttaac tttgataaaa gtaaaaacgt cttataatct agattagagg 1560 gactagcacc agtagtcggc aaacacattg caactatttg accagagtca agtcaaacaa 1620 agcatagcac actcctcctt aatacaccct acatacacaa aaccatacta ctactactag 1680 taggagtctc caccgttctg aaaaaagaaa aagaaaaaaa aaacctccat ctcccgccca 1740 gtgccgccgc gccacgtcac ccctcccccg ccgcgcgtgt gtgtacgcgt agcctttccg 1800 gcggagacgc agcacaaaaa tggttttact tgcgataccc ttcgtctccc tcacgtccca 1860 tccatccctc cccccccttt tccctcctcc tccacctcca ctgccatggc cgcctccgcc 1920 gctcctctct cccgcgtggt agccgccgcc ggttgccgcc gctaggggag cgcgacgggg 1980 gaacggtagg ggcgacccag ctcgctctgt cgccccgcgg ctggtggggg tgcgcgcggg 2040 ggagagcggt tggttagtat ggtgctggat ctcaatgtgg agtcgccggg tgggtcggcg 2100 gcgacgtcga gctcgtccac gccgccgccg ccgcccgacg gtggcggcgg ggggtacttc 2160 cggttcgacc tgctcggcgg gagccccgac gaggacgggt gctcctcgcc tgtcatgacg 2220 cgccagctct tcccttcgcc gtctgcggtg gtggcgctgg cgggggacgg gtcgtcgacg 2280 ccaccgctga cgatgccgat gccggcggcg gctggggagg ggccgtggcc gcgccgcgcg 2340 gcggatctcg gggtggcgca gagccagagg tcccccgccg gcgggaagaa gagccgccgc 2400 ggcccgaggt ctcggagctc ccagtacagg ggcgtcacct tctacaggag gaccgggcga 2460 tgggagtcgc acatctggtt agcttcgcct tgctcgattt ccctcacgct gacttcctct 2520 gcttgactct gcttgattgg agtagtaatc tcttcgtttg tctcgtccaa ttttggcagg 2580 gactgcggga agcaggtgta cctgggtgag ctcctatttc tagtctccca agctaaattc 2640 gctcgcatga ctgctaaatt tgggtctcta cttagcttga ttccgatttg tttgctcctg 2700 ccttgttttt tttttctgtt ttcaggtggt ttcgatacag ctcatgccgc agcgaggtta 2760 ctataaatgg tcaccaattg tatcttaatt gttgctctgg tttgccctgt gtgctgagat 2820 tgtagaaccc cttgtgcagg gcctatgatc gcgcggcgat caagttcaga ggcctcgacg 2880 cggatatcaa ctttaatctg aatgactatg aggacgactt gaagcaggtt gtttggaata 2940 tagttcaatt gtcatgtgtg attctttagg ttctaagggg aggttcattc accggcctgt 3000 gatggtttat gatggattgg ttcgtgctgt gttgttagat gcgcaattgg accaaggagg 3060 agtttgtgca catacttcgg cgccaaagca caggatttgc aagggggagc tcaaagtacc 3120 ggggtgtgac actgcacaag tgtggccggt gggaagctcg gatgggccag ctgctcggca 3180 agaagtaaga tccctgaaac attgattgtt cttgctagta acttacaata caatacattt 3240 tagattagtt caggaccatt tttcatgcca tgaacgaaaa ctgtgtcaag tttgcttttc 3300 aaaaagggaa agaaaaaaaa tgtgtcacta ccaagctgga gaatggtagg ctacccctgg 3360 agtccacatc cacctgaaga tttgatgttg actcttcaca cactagccat ttactattgg 3420 aacaccacag gtgttcaatg attatagatt gctagcttct ttaggaaaga actaagtgaa 3480 tcggaatggc tcctcggaat taattgaggg gaaatgtttt tgtttccttg gggattgtgt 3540 tttgcatcct aagtcagtga taggtgaaaa gcttcatttc aatgctcttg gttgtttttg 3600 ccactaagaa tgttctgctt atttacgttg aatttttgat tggctgttcg tatcatagtt 3660 gtgcatttcc tatatattac aatctttgtg aactttagat aattctggca tgagctctct 3720 ctgtggtatt gttctattaa cagaagtatc attctgtcaa ttccccactg ataagtgatc 3780 ttttgtgcag gtacatctat ctaggattgt ttgacagtga aattgaggct gcaaggttca 3840 gttagtagta ctttgctctt ctcagtttga tatgtgcttg ctattcctat acttctctca 3900 ctttcatcta ctcttcaact tgtagagcat atgaccgggc agctatccgc ttcaatggaa 3960 gggaagctgt tactaatttt gatcctagtt cttatgatgg agatgttcta cctgaaaccg 4020 acaatgaagg tatttctttt gtactatgta tattgtgctt tatccactag aacgacaaat 4080 ccaaatttta tattaacaaa agcacactgg ggattgtctt agcagtggtt gatggagaca 4140 tcattgactt aaatctgaga atttcacagc ctaacgttca tgagctgaaa agtgatggta 4200 ccctaactgg gttccagttg aattgtgatt ctcctgaagc ttcaagttct gttgttactc 4260 aggtaaatat gctacaatat ttggtgtttg taaccgctat accatttgag atttgaccgt 4320 cttcagattc ttttgatcag gtggttagtc ctttttcata acattatact atcactttca 4380 aaataattag tacactaatt gtatgtgtca ctagaattgt tgtatgaaac catctgggaa 4440 ccatcttatg cagcttattg acaaatgaca actcactgtt gatgtattcc caaatcaaga 4500 aaagccaatc tttttattca atttctccag ttcattgaat tgaaaaagaa attgccgaac 4560 aactaccacc tgaagagact ggctagatat tttgtttatc tgtgtatttt tataacctat 4620 aacagttcca aagccacaaa gctcttttac cttgattctg ataacgttaa ctgaggtatc 4680 attttgtgat tgttttctgt agccaataag tcctcagtgg cctgtgcttc ctcagggcac 4740 atcgatgtcc cagcatccac atttatatgc atctccttgt ccgggcttct ttgtgaacct 4800 cagggtatat ctatcatcaa aacttatatg caatttgaaa agacagttaa acttgtttca 4860 agttaacatt cgattgctaa ttagctacta cttccatgct cctatttctt gagatgacga 4920 accatatgtt tgttccttta attacataat ggtagccgta gatactgttt gccttgtgaa 4980 ctgtcagata tagcaggaag taaatctgtc agcttgcaac tttccatgaa ccacagctgt 5040 ccaactttat acagtggatg atgacttgca tttgatacat cctagtactt tcttgttgca 5100 ctctgcagct ttagctctga agatgctcta tatttccatg aatgctcacg ttagctctga 5160 aatttcgaac tttcactcca taacatgctc acttaggctg tgtttagatc caaacttcag 5220 ttcttttcca tcacatcaac ctgtcataca cacacaactt ttcagtcaca tcatctctaa 5280 tttcaaccaa aatccaaact ttgccatcaa ctaaacacag ccttattcat tgttccacct 5340 tttatttctg ccattgctaa ggtccaatct tgatacctca gagagctgca tgatgtgtag 5400 atagtcctaa cttaggtccg ttggttagaa tcatccattc atgtttagga aaagtgatta 5460 acaacgtgtg ctgcattaac cattaatgtg gtcaactctg atgcttgtgc tatggtcact 5520 gcaggaagta cctatggaga aaagacctga gttgggtccc cagtcgttcc ctacttcgtg 5580 gtcatggcaa atgcagggct cccctttgcc attactccct actgcagcaa gttcaggatt 5640 ctctacgggc accgtcgccg acgccgcccg ctcgccttcc tcccgccccc atccatttcc 5700 cggccaccac cagttctact tccccccgac cgcctgactg ccacctattc tggtggaggc 5760 gacacctcac cgtgcatcca ccgccgcttg ccgataacat tcgtcgtttg tccagagagg 5820 gaccttctcc atatgatatc cctctctatg ttccacctgg ttatgatcag aattctcacg 5880 ctcatgattc ttttatcttc atttttgagt gcgaaaccac gaatcgtgac cgtgctacca 5940 ggtaaacacc cttgtacctc tttgactcta caataaaatt aatgtaagat attctggcta 6000 aaagtgattg gccctcccta ctgtattttt acagagttgt aatttgaaca gtgggcacta 6060 aagctggggc ccactcgcac cagtgtctag tggagcgaag ctttgccctt ttcttgctat 6120 ccagcaacta ttcctccgcc tgcctccatt gctgacagtg gagatagctt cccagtggtc 6180 actgttccac tgtactctgt catagtttct gatcacccct attgtgcctt gtctctttca 6240 cctcctccct cacttgtgct gcctctggcc actagagtgg cgccctgcac tgttgccatg 6300 catggctgcc acttcgagag tggagatggg ggttggcctt tgggtgattt ctgtgtgcca 6360 tcttttggct caatgtcgtt ttgggactgg tgcatgtact ggcaataggt gagatgagat 6420 atgaaatgtc ctctgctgct ttttctatct aaggagtagc ttagctatca ccagctgcct 6480 ttctcttctc aaataaggtt gttaaaaggg ggggtcttaa agctacccca actgctgcca 6540 ggggccctct tcaatgccct cccagctgcc gtttctttct ttattggttt gcttctctgc 6600 tgcttctttt gcctggttgg atggatgttt gtttgttcgt atgaattggg ggagctacta 6660 gtatcattca tgagtagagg caggcagggc agagcaggct gctggctggc caggcactga 6720 tgtgccaaca gctatttcca gtgaaacggc tgccattttt ctttgctggg attgtgatag 6780 tggtaggctg gtagtactag ctagcagtgt attgggggaa atactggtgg tccatttgcc 6840 tgttagccaa tctgatgctt gcctttccat ccgctggtga tggtccattt gctttggcat 6900 cttgcttgcc tgttagtact acaaaagttg catacatatg ctattgaggt tagggtgtgt 6960 ttagttcacg caaaaattgg aagtttggtt gaaattggcg atgtgatgga aaagtttgaa 7020 gtttatatgt gtaggaaagg tttgatgtga tggaaaagtt ggaagtttga aaaaaaatgt 7080 ttggaactaa acacggtgtt agagttgatc tgagtacctg acaacttcat ggcaaatgct 7140 ctttacaatg acatcaacag actttagttt tgcagcagtt cttctctgta tctgtgtttc 7200 aatgcatggg tttggattgt gaataacagt attatatttg cctgcccttc cttttttggt 7260 ttaaaaagaa aggcattgtc tatggtggca aggcttttga tgaatagact atgcatcctt 7320 tctttggtac actttgttag aatagtatgt ggaatattag atggaccaaa tctatcaaac 7380 ataataatag tacaattagg atgtttggta gagatttgag atatcctttt ttttgggaga 7440 gtttgggtgg ggttgattta actcccatag ttaaattaat taactaatac aaagaaatat 7500 actgaaagga aaatttccaa ggtaggagtt tttgctaaat ttccttcaaa ttctctacag 7560 gattgttcat ttcatatgaa ttccaagaga taggatagga ttcaatcctt tgttttaaag 7620 atcttcatag gtaattttca tataggatta aaaccctcca aaattccttt gtttttcctc 7680 taaatcaaag gaaccctaaa acacatgaat atgagatgtt ttgtttggat gcttcaaatg 7740 aaaaatacat agaaaagaca tataggaatt tggtagattc atttgagagt agatagatgg 7800 agaagagttg cattggacct ttcaaaaagt gaaagaatga agtttgagca attgagctca 7860 tcgtttaagt ttcccaagga agtggggc 7888 <210> 3 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2358infF2 primer <400> 3 cggtacccgg ggatccaaat cagttcctac gtgcaacggg cgcaaaatat c 51 <210> 4 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2358infR2 primer <400> 4 cgactctaga ggatccgccc cacttccttg ggaaacttaa acgatgagct c 51 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2358MF1 primer <400> 5 ccattactcc ctactgcagc aagttcagga ttctctacgg 40 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2358MR1 primer <400> 6 ccgtagagaa tcctgaactt gctgcagtag ggagtaatgg 40

Claims (7)

1. 식물의 줄기 신장을 억제시키는, 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 유전자를 포함하는 형질전환용 재조합 벡터.
   
2. 제1항의 형질전환용 재조합 벡터로 형질전환된 줄기 신장이 억제된 형질전환 식물체.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 형질전환 식물체는 왜성이며, 내도복성이 강한 것인 형질전환 식물체.
   
4. 제2항 내지 제3항 중 어느 한 항의 형질전환 식물체는 벼(Oryza sativa)인 것인 형질전환 식물체.
   
5. (a) 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
   (b) 상기 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 식물체에 형질전환하는 단계; 및
   (c) 상기 형질전환체를 선별하는 단계;
   를 포함하는 줄기 신장이 억제된 형질전환 식물체를 제조하는 방법.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 형질전환 식물체는 내도복성이 증진된 것인 방법.
   
7. 제5항에 있어서, 상기 형질전환 식물체는 벼(Oryza sativa)인 것인 방법.

Images