KR100795372B1

KR100795372B1 - 벼의 신규 기능성 유전자 ｒａｐ7을 이용하여 형질전환된내도복성 벼 식물

Info

Publication number: KR100795372B1
Application number: KR1020060121552A
Authority: KR
Inventors: 강상구
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2006-12-04
Filing date: 2006-12-04
Publication date: 2008-01-17

Abstract

본 발명은 벼의 초장 신장을 조절하는 신규 기능성 유전자 RAP7을 이용하여 형질전환된 내도복성 벼 신규 식물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 벼의 초장의 신장을 조절하는 서열번호 1의 신규 기능성 유전자를 포함하는 벼 내도복성 형질전환체에 관한 것이다.

본 발명에 따른 기능성 유전자 RAP7은 벼 유전자 데이터베이스에 등록된 기능성이 밝혀진 어떤 유전자와도 상동성이 없었으며, 다른 농업형질과는 무관하게 특이적으로 벼의 초장을 왜성화하는 벼의 신규 기능성 유전자인 것으로 확인되었다. 또한, 벼의 내도복성 개선을 위한 중단간형 육성에 효과적으로 활용될 수 있을 것으로 평가되었다.

벼, 기능성 유전자, 내도복성, 왜성벼, 중단간, 형질전환

Description

벼의 신규 기능성 유전자 ＲＡＰ7을 이용하여 형질전환된 내도복성 벼 식물{Lodging-Resistant Rice Plant Transformed Using Novel Rice Functional Gene RAP7}

도 1은 본 발명의 벼 유전자 RAP7의 cDNA sequence의 서열목록이다.

도 2는 본 발명의 벼 유전자 RAP7의 Southern blot analysis의 결과도이다.

도 3은 본 발명의 벼 유전자 RAP7의 Northern blot analysis의 결과도이다.

도 4는 본 발명의 벼 유전자 RAP7의 초장 신장 조절 기능을 보여주는 사진이다(A: 분얼기의 초장, B: 유숙기의 초장 (wt: 화영벼, LR2: 형질전환체)).

도 5는 본 발명의 벼 유전자 RAP7를 이용한 형질전환 벼의 선발 결과를 보여주는 사진이다(A: Agrobacterium LBA4404만을 형질전환시킨 캘러스, B: RAP7 유전자가 형질전환된 캘러스, C: RAP7 유전자가 도입된 벼).

도 6은 본 발명의 실시를 위한 pMJ101 + RAP7 벡터의 결합 구성도이다.

도 7은 본 발명의 Genomic DNA의 PCR을 통한 Bar Gene의 증폭 결과를 보여주는 사진이다.

벼농사에서 냉해, 한해, 침관수 피해 등 여러 가지 기상재해가 문제시되나, 그 중에서도 수량감소와 미질에 크게 영향을 주는 것이 생육 후기 집중호우나 태풍에 의하여 발생하는 도복이다. 벼 도복피해는 바람과 강우가 주된 원인이 되지만 재배되는 품종 및 재배기술에 따라서도 영향을 크게 받는다. 특히, 품종적으로 줄기가 약하고 키가 크며 이삭이 큰 품종은 도복에 매우 약한 특성을 지닌다.

도복에 의한 벼의 수량감소 양상을 보면, 이삭이 나온 후 빠르면 빠를수록 도복피해는 더 커지게 된다. 이러한 수량감소에 직접적인 영향을 주는 것은 등숙비율과 천립중의 감소이며, 등숙비율은 도복이 늦어질수록 그 감소가 경미하게 되어 도복피해는 현저하게 낮아지게 된다. 또한, 미질에 미치는 영향은 도복의 발생 시기에 따라 다른데, 호숙기도복의 경우는 청미비율이 크게 증가되어 결국 양질미 생산이 어려워진다고 한다.

이러한 도복에 대한 대책으로는 다양한 품종적, 재배적 조치들이 있으나, 우선적으로 내도복성이 강한 품종을 육성하고 보급하는 것이 절대적으로 요망된다. 내도복성이 강한 품종은 벼의 키가 작으면서 줄기가 강하고 뿌리의 발달이 왕성한 품종적 특성이 요망된다.

이러한 내도복성 품종을 육성하기 위해서는 전통적으로 초장이 작은 왜성의 유전자를 가진 왜성벼와 일반품종의 교배육종을 통하여 반왜성벼를 육종하는 방법이 이용되어 왔으나, 유전자를 고정시키기 위하여 많은 세대를 진전시켜야 하는 등의 육종 과정상 여러 난점이 있었다.

본 발명은 벼에서 신규로 클로닝된 RAP7 유전자가 벼의 초장 신장의 조절과 관련되어 있음을 확인하고 이 유전자를 과발현시킴으로써 당대에 키가 작은 중단간형(semi dwarf) 벼를 분자육종학적으로 작성할 수 있다는데 그 의의가 있는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 벼의 초장 신장을 조절하는 신규 기능성 유전자 RAP7을 포함하는 벼 내도복성 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 벼의 초장 신장을 조절하는 신규 기능성 유전자 RAP7을 이용하여 형질전환된 내도복성 벼 신규 식물을 제공하는 것이다.

이와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은 벼의 내도복성 개선에 유용한 서열번호 1의 신규 기능성 유전자 RAP7을 포함하는 벼 내도복성 형질전환체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 벼의 내도복성 개선에 유용한 서열번호 1의 신규 기능성 유전자 RAP7을 이용하여 형질전환된 내도복성 벼 신규 식물에 관한 것이다.

본 발명의 상기 기능성 유전자 RAP7은 벼의 초장의 신장을 조절하는 기능성을 갖는 유전자임을 특징으로 한다.

이하 본 발명의 구성을 보다 상세히 설명한다.

벼 화기 형성 시기와 수분 후 3~5일에 작성된 cDNA 라이브러리(library)로부터 기능 미확인 유전자인 RAP7 유전자를 클로닝하였다. RAP7 유전자는 잎에서 특이적 발현이 되며 벼의 게놈에서 한 개만 존재하는 단일유전자이다. 상기 RAP7 유전자는 2692개의 염기서열을 갖고 있으며, 701개의 아미노산으로 구성된 단백질을 암호화한다.

상기 RAP7 유전자의 기능성을 동정하기 위하여 유전자의 데이터베이스에서 상동성 연구를 하였으나, RAP7과 높은 상동성을 가진 단백질들의 기능이 밝혀져 있지 않았다. 그러므로 벼 혹은 식물체에서 혹은 식물에서 아직 그 기능이 명확히 규명되지 않은 신규 유전자(novel gene)이므로 RAP7 gene의 기능성을 탐색하기 위한 실험을 수행하였다. 그 결과 RAP7의 과발현(overexpression) 도입형질전환체의 초장이 정상모본 벼에 비하여 작아졌다. 그러나 벼의 다른 농업형질은 모본과 동일 하였다. 그러므로 RAP7은 벼의 초장 신장과 직접적인 관계가 있는 유전자임을 확인하였다.

이하, 본 발명의 구성을 바람직한 실시예를 통하여 보다 상세히 설명할 것이나, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 예시하기 위한 것으로서 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 범위는 오직 특허청구범위에 기재된 바에 의해 한정되어야 할 것이다.

<실시예 1> 벼의 Genomic DNA 추출과 southern blot analysis

온실에서 생육시킨 일품벼의 잎 5g을 CTAB (Gawel, N. J and Jarret, R. L, 1991) 방법을 사용하여 벼 Genomic DNA를 추출하였다. 벼 genomic DNA 30㎍을 제한효소 (BamHI, EcoRI, HindIII)를 이용하여 16∼18시간 동안 37℃에서 절단하였다. 제한효소로 절단된 genomic DNA와 size marker (lamda phage marker and 1kb ladder marker)를 0.8 % 아가로즈 겔에 전기영동하였다. 전기영동한 아가로즈 겔을 0.25N HCl에 5분간 담그고, 변성(denaturation) 용액에 30분간 담근 후, 중화용액(neutralization solution)에 30분간 담궜다. 이 아가로즈 겔을 25 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0)로 나일론 멤브레인(nylon membrane) (Schleicher & Schuell, 2002)에 옮기고, DNA가 블라팅된 나일론 멤브레인을 UV-크로스링크(UV-crosslink)시켰다.

상기 멤브레인을 혼성화 용액(hybridization solution) [6×SSPE (1×SSPE : 0.15 M NaCl, 0.25 M NaH2PO4, 25 mM Na2EDTA), 5×DH (denhardts solution), 50 % formamide, 0.5 % SDS, 0.1㎎/㎖ denatured salmon sperm DNA]으로 42℃에서 3시간 동안 전교잡반응(prehybridization)시켰다. 프로브는 유전자의 cDNA 단편을 (α-32P) dCTP와 함께 random primer labeling system (Promega Co., Madison, WI) 방법으로 합성하고, 전교잡반응(prehybridization)시킨 멤브레인을 방사능으로 표지된 변성시킨 프로브를 넣고 42℃에서 16~18시간 동안 반응시켰다. 멤브레인을 와싱(washing) (2×SSC, 0.1%SDS for 5min-twice/1×SSC, 0.1%SDS for 10min/0.1×SSC, 0.1%SDS for 20 min/ 0.1×SSC, 0.1%SDS at 55℃ for 5 mim)한 후, X-ray 필름에 노출시켰다 (Sambrook et al.,1989).

cDNA 라이브러리로부터 확보한 RAP7 유전자의 염기서열을 Blast search 한 결과, 이 유전자가 전혀 알려지지 않은 유전자임을 확인하였다. RAP7 cDNA의 유전자(서열번호 1)는 2692bp로 29개의 poly A tail을 가지고 있으며, 701개의 아미노산으로 구성된 단백질을 암호화한다. 유전자의 데이터베이스에서 상동성 연구를 하였으나 RAP7과 높은 상동성을 가진 단백질들의 기능이 동정되지 않았다.

한편, Southern 분석 결과, RAP 7유전자는 제한효소 (BamHI, EcoRI, Hind III)로 절단하여 각각 하나의 밴드를 보였으며, 1개의 카피(copy)를 갖고 있는 단일유전자 (Single gene)로 판명되었다 (도 1).

<실시예 2> Total RNA 추출과 northern blot analysis

벼의 뿌리, 잎, 수분전 화서, 수분후 화서에서 total RNA를 추출하였다. 액체질소를 이용해서 고정을 하고, 조직 각각 5g씩 phenol-chloroform 방법으로 추출, 정제하였다. 벼로부터 얻은 뿌리, 잎, 수분전 화서, 수분후 화서의 total RNA (20㎍)를 1.4% 포름알데하이드 아가로즈 겔에 전기영동하고, 0.5M ammonium acetate 용액에 0.5㎍/㎖의 ethidium bromide가 든 염색용액에 5분간 담그고, 증류수로 1시간 동안 씻어내었다. 멤브레인(membrane)에 RNA를 옮기는 방법은 southern blot과 동일한 방법으로 실시하였다. 준비된 RNA blot membrane을 65℃에서 2시간 동안 전교잡반응(prehybridization) [50 % formamide, 0.5 % SDS, 1.0M NaCl, 0.1㎎/㎖ denatured salmon sperm DNA]시켰다. (α-32P)UTP labeled Riboprobe를 사용하여 62℃에서 16시간 동안 혼성화시켰다. 멤브레인을 와싱(washing)한 후, X-ray 필름에 노출시켰다.

Northern blot analysis 결과, RAP7은 성숙한 잎에서 특이적으로 높게 발현되었으며, 감수 분열시기의 화서와 수분 후 5일, 15일 종자에서 약하게 발현되었으고, 뿌리에서는 거의 발현되지 않았다. 이것은 RAP7 유전자의 발현은 잎에서 특이적으로 발현됨을 알 수 있다 (도 2).

<실시예 3> RAP7 유전자를 이용한 벼 형질전환

3-1. 식물 재료

화영벼(Oryza sativa)를 식물재료로 하여 종자에서 유도된 캘러스(callus)를 형질전환에 이용하였다. 종자를 70% Et-OH에 1분간 표면소독 후, 0.5% NaOCl용액에 1시간 동안 흔들어 씻어준 뒤 증류수로 5회 세척하였다. 캘러스는 2㎎/L 2.4-D, 1g/L Casein, 30g/L sucrose가 첨가된 N6(Chu 1978) 기본배지에서 유도하였다.

3-2. 형질전환 벡터

식물체의 발현을 위한 binary vector는 T-DNA 내부에 선발 표지로 항생제 저항성 유전자인 bar gene을 포함하고 있는 pMJ101을 이용하였다. 이것을 Agrobacterium tumerfaciens LBA4404(Stratagene Co.)에 도입하여 벼 형질전환에 이용하였다.

3-3. 식물 형질전환 및 재분화

RAP7 유전자가 포함된 pMJ101 백터를 포함한 Agrobacterium tumefaciens LBA4404는 항생제 (50㎍/㎖ spectinomycin, 10㎍/㎖ tetracycline)가 첨가된 AB배지에서 28℃, 3일간 배양하였다. 이 아그로박테리아를 모아 0.1M acetocylingone을 포함한 AAM 배지에 녹였다. 벼 형질 전환을 위하여 아그로박테리아는 벼 캘러스 유도 배지(N6, 2㎎/L 2.4-D, 30g/L sucrose)와 함께 섞어주었다. 벼 캘러스를 박테리아 용액에 30분간 침지시킨 후, 필터페이퍼에 물기를 잘 닦아 주었다. 그런 다음 벼 캘러스는 0.1M acetycylingone을 포함하고 항생제를 첨가되지 않은 벼 캘러스 유도 배지(N6, 2㎎/L 2.4-D, 30g/L sucrose)에 3일 동안 암 상태에서 공동 배양하였다. 아그로박테리아가 접종된 캘러스는 250㎎/L cefotaxime이 첨가된 멸균수로 깨끗이 씻어주었다. 이 캘러스는 항생제(250mg/L cefotaxime, 4㎍/㎖ PPT)가 첨가된 벼 선발 배지(N6, 2㎎/L 2.4-D, 30g/L sucrose )에서 2주간 2번 암 상태에서 선발하였다. 4㎍/㎖ 농도의 PPT에서 선발된 벼 캘러스를 벼 재분화 배지(MS, 0.1㎎/L NAA, 2㎎/L Kinetin, 50g/L sucrose, 50g/L sorbitol)에서 16시간 광조건과 25±2℃에서 배양하였다. 줄기가 유도된 식물체는 뿌리 유도와 식물체의 생장을 위해 벼 뿌리 유도 배지(MS, 30g/L sucrose, 250mg/L cefotaxime)에서 배양하였다. 줄기와 뿌리가 발생된 완전한 벼 식물체는 미네랄이 포함된 멸균된 물에서 외부 공기와 접촉시켜 순화시킨 다음 흙에 심어 온실에서 생장시켰다.

3-4. DNA 추출

선발된 형질 전환체 벼(HW-RAP7) 잎으로부터 Genomic DNA 분리는 CTAB을 이용한 방 법으로 수행하였다. 약 0.2g의 잎을 유발과 유봉을 이용하여 갈아 CATB DNA extraction buffer(1% CTAB, 100mM Tris-HCl, 1.4M NaCl, 20mM EDTA, 1% Mercaptoetanol) 500㎕를 넣고 65℃ 항온수조에 1시간 반응시킨 후, chloroform: isoamyl alcohol (24:1)을 500㎕ 넣고 잘 섞어 준 다음, 5,000g에서 5분간 원심 분리하여 상층액 부분만 수거하였다. 상층액을 새로운 E-tube에 넣은 후 2배 부피량의 100% cold Et-OH 넣고 후크(Hook)로 DNA만을 수거하였다. 회수한 DNA는 70% Et-OH에 씻은 후 잘 말려 TE buffer에 녹이고 0.2㎕ RNase와 함께 37℃에서 1시간 반응시켰다. 그리고 2배 부피량의 100% cold Et-OH와 1/10배 부피량의 3M NaOAc를 넣고 후크(Hook)로 DNA만을 수거하였다. 회수한 DNA는 70% Et-OH에 씻은 후 잘 말려 ddH₂O에 녹였다.

3-5. Polymer Chain Reaction( PCR )

선발된 벼의 형질전환 여부를 확인하기 위해 Bar 유전자 부위에 특이적인 2개의 프라이머 세트(primer set)와 RAP7 유전자 부위에 특이적인 프라이머 세트(primer set)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 증폭 반응은 95℃에서 2분간 전 변성 단계를 거친 후, 95℃에서 50초간 DNA 변성, 65℃에서 1분 30초간 primer 결합, 그리고 72℃에서 2분간 DNA 합성을 29 싸이클(cycle) 처리하였고, 마지막으로 72℃에서 5분간 DNA 합성시켰다. 이후 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하였다.

RAP7 유전자는 벼에서 발견된 기능미확인 유전자로서 유전자 데이타베이스에 등록된 기능이 밝혀진 어떤 유전자와도 상동성이 없었다. 본 발명에서 RAP7 유전자의 과발현(over expression)을 통하여 형질전환체를 작성한 후 그 식물체의 형질 특성을 조사하였다. 그 결과 RAP7 유전자가 형질전환된 식물체의 초장은 64㎝로 정상모본인 화영벼의 87㎝에 비해 초장이 1/4 수준으로 신장이 조절됨을 확인할 수 있었다 (도 3). 그리고 기타 농업형질의 특이적인 변화는 없었다. 그러므로 기능미확인 유전자 RAP7은 벼의 초장의 신장을 조절하는 유전자인 것으로 판단되었다. 또한, 이 유전자를 과발현시켜 당대에 키가 작은 중단간형(semi dwarf) 벼의 작성이 가능할 것으로 평가되었다.

캘러스를 PPT가 첨가된 N6배지에서 선발한 결과, plasmid pMJ109-RAP7의 T-DNA 유전자가 도입되지 Wild type 벼 캘러스는 4㎍/㎖ PPT가 첨가된 배지에서 모두 고사하였다. 캘러스 중 plasmid pMJ109-RAP7의 T-DNA 유전자가 도입된 벼 캘러스는 4㎍/㎖ PPT가 첨가된 N6 배지에서 생장을 계속하였다. 형질 전환된 캘러스는 벼 재분화 배지에서 16시간 광조건에서 배양하는 동안 1주가 지나기 시작하면서 캘러스 표면에 초록색 점이 나타나기 시작하였고, 2주가 지나면서 줄기가 유도되었다 (도 4). 줄기가 유도된 후 1주가 지나면서 뿌리도 함께 벼 재분화 배지에서 보이기 시작했다. 이렇게 재분화시킨 식물체는 자연환경에서 모본식물체와 비교하여 분얼수가 다소 많았다. 일반 정상인 벼의 분얼 전개수는 10~12개 정도인데 반하여, RAP7 유전자가 도입된 형질전환체 벼(HW-RAP7)의 분얼 전개수는 12~17개였다. RAP7 유전 자가 도입된 형질전환체 벼(HW-RAP7)는 정상에 비하여 분얼수가 다소 많았으며 초장이 25% 감소하였다 (도 5).

선발된 식물체(HW-RAP7)에 유전자가 도입되었는지를 확인하기 위하여, Bar 유전자에 특이 forward primer(BAR 67U; 5'-ACC ATC GTC AAC CAC TAC ATC-3')와 reverse primer(BAR 485L; 5'-GAA ATC CAG CTG CCA GAA AC-3')를 이용하여 PCR 분석을 수행한 결과, 화영벼 wild type에서는 밴드가 확인되지 않았으나 선발된 식물체(HW-RAP7-1, HW-RAP7-2, HW-RAP7-3)와 pMJ101+RAP7 벡터에서는 420bp에서 강한 밴드를 확인할 수 있었다 (도 6). 이는 RAP7을 포함한 T-DNA가 식물체에 형질전환 되었음을 입증하는 것이다.

한편, 본 발명의 형질전환체 벼‘HW-RAP7’의 주요 특성을 조사한 결과, 잎은 표 1에서 보는 바와 같이 잎은 녹색이며 길이와 너비가 중정도이고 직립성 초형이었다. 또한, 줄기의 굵기와 분얼개도는 보통이며 간장은 64cm로 정상모본인‘화영’에 비해 23cm가 작았다.

[표 1] 형질전환체 벼의 잎, 줄기 특성

구분	지엽(flag leaf)				줄기
구분	색	길이	너비	초형	길이	굵기	분얼개도
화영	녹색	중간	중간	직립	87	중간	중간
HW-RAP7	녹색	중간	중간	직립	64	중간	중간

또한, 형질전환체 벼‘HW-RAP7’의 이삭길이는 16cm로 정상모본인‘화영’에 비해 짧았으며, 착립밀도는 약간 조밀하고 이삭추출은 양호한 편이다. 벼알은 까락이 없거나 적으며 탈립은 잘 안되는 편이고, 부선색과 영색은 황백색이고 숙색은 아주 양호하였다 (표 2).

[표 2] 형질전환체 벼의 잎, 줄기 특성

구분	이삭길이(㎝)	착립밀도	탈립정도	이삭추출	까락	영색
화영	22	약간 조밀	잘 안됨	양호	드뭄	황백색
HW-RAP7	16	약간 조밀	잘 안됨	양호	드뭄	황백색

이상에서 상술한 바와 같이 본 발명에 따른 벼의 초장 신장을 조절하는 신규 기능성 유전자 RAP7을 포함하는 형질전환 벡터는 대상 식물체에 효과적으로 도입되어 정상적으로 분화되었으며, 다른 농업형질과는 무관하게 특이적으로 벼의 초장을 왜성화하여 내도복성을 개선된 유망한 벼 형질전환체인 것으로 확인되었다.

또한, 본 발명에 따른 벼의 초장 신장을 조절하는 신규 기능성 유전자 RAP7을 이용하여 형질전환된 신규 벼 식물은 내도복성 관련 형질이 효과적으로 개선된 중단간형 형질전된 벼 식물인 것으로 평가되었다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 벼의 신규 기능성 유전자 RAP7(Rice After Pollination clone 7)을 포함하는 형질전환용 재조합 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 기능성 유전자 RAP7(Rice After Pollination clone 7)은 벼의 초장의 신장을 조절하는 기능성을 갖는 유전자임을 특징으로 하는 형질전환용 재조합 벡터.
제 2항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 pMJ101을 이용하여 작성된 것을 특징으로 하는 형질전환용 재조합 벡터.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 형질전환용 재조합 벡터를 포함하는 내도복성 벼(Oryza sativa) 형질전환체.
제 4항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 Agrobacterium tumerfaciens LBA4404를 이용하여 도입된 것을 특징으로 하는 내도복성 벼(Oryza sativa) 형질전환체.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 형질전환용 재조합 벡터를 이용하여 형질전환된 내도복성 벼(Oryza sativa) 식물.
제 6항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 Agrobacterium tumerfaciens LBA4404를 이용하여 형질전환된 것을 특징으로 하는 내도복성 벼(Oryza sativa) 식물.
서열번호 1의 벼의 신규 기능성 유전자 RAP7(Rice After Pollination clone 7)을 포함하는 내도복성 벼(Oryza sativa) 형질전환체.
서열번호 1의 벼의 신규 기능성 유전자 RAP7(Rice After Pollination clone 7)을 이용하여 형질전환된 내도복성 벼(Oryza sativa) 식물.