JP6117297B2 - 種子生産性が向上したイネの品種とその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、種子生産性が向上したイネ品種およびその製造方法に関し、より具体的には、イネのゲノムＤＮＡに存在するＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子の発現を抑制する工程を含む、イネの種子の生産量を増大させる方法、ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子の発現が抑制されたイネの種子の生産方法および該方法で製造されて種子生産量が増大したイネの種子に関する。

イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）は、大麦、トウモロコシと共に、世界で最も重要な食用作物の一つである。イネは、人口増加、工業化による農地の不足、気候変動などにより、その需要が増加しており、これにより、種々の品種の開発が進められている。最近は、伝統的な育種法ではなく、有用遺伝子の導入方法を用いた品種の開発が行われているが、これらの有用遺伝子の発掘と、これを用いた新品種の開発は、食糧問題を解決するだけでなく、食料産業の全般に影響を及ぼしていると考えられている。

イネは、種子の生産が目的である世界で最も重要な作物の一つであり、ここ数年、遺伝子全体の配列が明らかになることにより、有用遺伝子を大量に確保し、前記有用遺伝子を活用する技術を先取りするための研究が活発に進められている。特に、イネの粒数の増加、イネの身長増大、イネの開花始期の調節などの特徴を調節するのに関与する遺伝子を活用すれば、最終的にはイネの生産量の増大という目的を達成することができると予想されており、これと関連した研究が盛んに行われている。例えば、特許文献１には、酢酸菌体破砕処理物を含む作物成長促進剤並びに該促進剤を施用して作物の生育を促進し、収量を増進させる方法が開示されており、特許文献２には、特定の遺伝子をイネに導入し着粒数が増加した形質転換イネを製造する方法および前記方法で製造され、着粒数が増加した形質転換イネが開示されており、特許文献３には、ＬＯＣ＿Ｏｓ０２ｇ０５８４０遺伝子をイネに導入して種子の収量が向上した形質転換イネを製造する方法および前記方法で製造され、種子の収量が向上した形質転換イネが開示されている。しかし、これまで明らかになったイネの遺伝子のうち、その機能が明確になっているのは、非常に少数であり、通常の生物機能の観点からすると、イネの生産量の増大に関与する遺伝子が多数あると予想されているため、継続的な研究によってイネの生産量の増大に関与する遺伝子が究明されることが期待されているが、まだイネの生産量の増大に関与することが究明された遺伝子は、少数に過ぎないのが現状である。

このような背景の下、本発明者らはイネの生産量の増大に関与する遺伝子を究明するために鋭意努力し研究を重ねた結果、ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子がイネの粒数、身長の長さ、開花始期の調節に関与する遺伝子であることを究明し、前記遺伝子の発現を抑制させると、イネの生産量を増大させ得ることを確認することによって、本発明を完成した。

特開２００６−２４８８９８号公報 特許第４４６２５６６号公報 韓国公開特許第２０１４−００５０１２２号公報

本発明の一目的は、ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子の発現を抑制し、イネの種子の生産量を増大させる方法を提供することである。
本発明の他の目的は、ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子の発現が抑制されたイネの種子の生産方法を提供することである。

発明のさらに他の目的は、前記方法により製造され、種子の生産量が増大したイネの種子を提供することである。

本発明者らは、イネの生産量の増大に関与する遺伝子を究明するために、イネのゲノムＤＮＡにＴ−ＤＮＡを挿入させてランダムに突然変異を作製し、その中から開花始期が遅くなる品種を選抜した。前記選抜された品種のゲノムＤＮＡを分析した結果、ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子にＴ−ＤＮＡが挿入され、前記ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子が不活性化した品種であることを確認し、この表現型を分析した結果、野生型品種と比較して開花始期が遅く、身長の長さが増加し、細胞のサイズが減少し、茎の太さが増加し、穂の数および長さが増加し、種子の収穫量が増大することを確認した。

したがって、イネのゲノムＤＮＡに存在するＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子を不活性化させてイネの生産量を増大させ得ることが分かった。
上述した目的を達成するための一実施態様として、本発明は、イネのゲノムＤＮＡに存在するＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子の発現を抑制する工程を含む、イネの種子の生産量を増大させる方法を提供する。

本発明の用語「ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子」とは、イネの８番染色体に存在する遺伝子を意味するが、その全体のサイズは９２５２ｂｐであり、コード領域（ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０．１）のサイズは１８９３ｂｐであり、３つのエクソンと２つのイントロンで構成され、６３１個のアミノ酸を含むタンパク質を発現させることができる。前記発現したタンパク質は、植物ホメオドメイン（Ｐｌａｎｔ Ｈｏｍｅｏ ｄｏｍａｉｎ、ＰＨＤ ｆｉｎｇｅｒ ｄｏｍａｉｎ）、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ Ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｄｏｍａｉｎ、ＦＮＩＩＩ）およびＶＩＮ３反応ドメイン（ＶＩＮ３ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ、ＶＩＤ）で構成される。前記ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子の塩基配列は知られており、機能はこれまで知られていなかったが、本発明者らは、前記ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子がイネの開花始期の調節、身長の調節および茎の太さの調節を通じて、生産量の増大と関連していることを最初に解明した。

本発明において、前記ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子の塩基配列は、特にそれに限定されるものではないが、好ましくは、配列番号１の塩基配列を有することができる。
前記ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子の発現抑制は、イネのゲノムＤＮＡに内在的に存在するＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子をＤＮＡレベル、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで不活性化させて行うことができるが、イネの種子という特性上、前記ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子の発現抑制は、ＤＮＡレベルおよびｍＲＮＡレベルで不活性化させて行うことが望ましい。例えば、ＤＮＡレベルで不活性化させる方法としては、通常の突然変異誘発方法を用いることができるが、イネのゲノムＤＮＡに内在的に存在するＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子を構成する１つまたはそれ以上のヌクレオチドを他のヌクレオチドに置換または欠失させるか、または、前記ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子を構成するポリヌクレオチドに他のポリヌクレオチドを挿入させるか、またはＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子を構成する１つまたはそれ以上のヌクレオチドを移動（フレームシフト）させて、正常なＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子が発現しないようにする方法を用いることができる。また、ＲＮＡレベルで不活性化させる方法としては、ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子の転写を抑制したり、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを用いてＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子から転写されたｍＲＮＡを不活性化させて、ｍＲＮＡが正常なタンパク質に翻訳されることを抑制する方法を用いることができる。上述したＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子をＤＮＡレベルおよびｍＲＮＡレベルで不活性化させる具体的な方法は、当業界で通常に用いられる突然変異の方法を制限なく使用することができる。例えば、組換えベクターを用いた相同組換え法、単一交叉組換え方法、Ｔ−ＤＮＡの挿入方法などを用いることができる。

本発明では、Ｔ−ＤＮＡ挿入方法を用いて前記ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子のエクソンにＴ−ＤＮＡが挿入された遺伝子（配列番号５）を生成することにより、ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子をＤＮＡレベルで不活性化させ、前記ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子の発現を抑制させた。

上述した目的を達成するための他の実施態様として、本発明は、イネのゲノムＤＮＡに存在するＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子の発現を抑制する工程を含む種子の生産量が増大したイネの種子の生産方法を提供する。

本発明で提供するＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子の発現が抑制され、種子の生産量が増大したイネの種子の生産方法の具体的な例として、（ａ）野生型ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子にＴ−ＤＮＡが挿入され、配列番号５の塩基配列で構成される変異したＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子を合成し、前記変異ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子を含む組換えベクターを得る工程、（ｂ）前記得られた組換えベクターをアグロバクテリウム属微生物に導入して形質転換体を得る工程、（ｃ）前記得られた形質転換体をイネのカルスに接種し、前記変異したＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子がイネのゲノムＤＮＡに導入された形質転換カルスを得る工程、（ｄ）前記得られた形質転換カルスを再分化させ、再分化した植物体を得る工程、および、（ｅ）前記得られた再分した化植物体を栽培し、それより種子を収穫する工程を含む方法を用いることができる。

前記（ａ）工程において、前記変異したＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子は、通常の突然変異によりＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子の機能が不活性化された遺伝子を意味する。通常、機能が不活性化された遺伝子とは、種々の原因により、機能が正常に示されない遺伝子を意味するが、タンパク質をコードする遺伝子の場合には、前記遺伝子の発現が抑制され、前記の遺伝子から合成され得る該当のタンパク質が生産されないか、または生産レベルが顕著に減少する現象や異常なタンパク質が発現される現象を誘発する原因となる変異遺伝子であってもよい。

本発明において、前記変異したＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子は、ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子を構成する塩基配列の一部または全体が他の塩基配列に置換されるか、ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子を構成する塩基配列の一部または全体が欠失するか、又はＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子を構成する塩基配列に他の塩基配列が導入された遺伝子などであってもよい。例えば、本発明では、前記変異したＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子として、ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子のエクソン部位にＴ−ＤＮＡが挿入された配列番号５の塩基配列を有するポリヌクレオチドを使用した。

また、前記組換えベクターは、前記変異したＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子を含むベクターであってもよいが、これに使用されるベクターは、特にそれに限定されないが、好ましくは、アグロバクテリウム属微生物と植物細胞内で元来の機能を維持するシャトルベクターになり得、より好ましくはアグロバクテリウム属微生物を通じてイネの種子に導入された後、相同組換えなどの方法により、イネのゲノムＤＮＡで、前記変異したＬＯＣ＿ＯｓＯ８ｇ１２４３０遺伝子を挿入させる機能を有するシャトルベクターになり得、最も好ましくはｐＧＡ３４２６ベクターであってもよい。

前記組換えベクターは、変異したＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子を発現させるプロモーターを含むことができるが、前記プロモーターは、植物細胞においてその機能を発揮できる限り、特にそれに限定されないが、好ましくは、過発現のためのプロモーター、前記発現のためのプロモーター、ストレス条件下で発現される誘導性プロモーター、目的遺伝子を植物生育期間中の一定時期に発現されるようにするプロモーター、植物組織の特異な部分のみに発現させるプロモーターおよび目的遺伝子の発現を高めるために、「エンハンサー配列（ｅｎｈａｎｃｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」が結合されたハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）プロモーターなどを用いることができる。

併せて、前記組換えベクターに含まれているＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子は、前記ベクターの多クローン部位にそのまま挿入することもでき、リンカー塩基配列と共に多クローン部位に挿入することもできるが、前記リンカー塩基配列は、当業界で通常に使用される配列であってもよい。

前記工程（ｂ）において、前記アグロバクテリウム属微生物は、前記得られた組換えベクターを植物細胞内に導入し、最終的には、前記変異したＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子でイネのゲノムＤＮＡに存在する野生型ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子を置換させる役割をする。この時、用いられるアグロバクテリウム属微生物は、組換えベクターを植物細胞内に導入することができる限り、特にそれに限定されないが、好ましくは、病原性が除去された（ｄｉｓａｒｍｅｄ）ＴｉまたはＲｉプラスミドを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を使用することができ、より好ましくはオクトピン型（ｏｃｔｏｐｉｎｅ−ｔｙｐｅ）またはスクシナモピン型（ｓｕｃｃｉｎａｍｏｐｉｎｅ−ｔｙｐｅ）アグロバクテリウム・ツメファシエンスを使用することができ、最も好ましくはアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌株、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０１菌株、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０５菌株などを単独、または組み合わせて使用することができる。

前記工程（ｃ）において、前記カルスは、実験室的環境でイネの全部または一部を培養して生成される培養生成物であり、前記カルスを生成するのに用いられる部位は、イネの茎、根、葉などが制限なく使用することができる。また、前記カルスの培養は、当業界に公知となった方法を用いて行うことができる。

また、カルスの形質転換も当業界に公知となった方法を用いて行うことができる。例えば、前記形質転換体をカルスに加え、常温および暗条件で培養し、形質転換体に導入された組換えベクターをカルス細胞内に導入し、前記組換えベクターが導入されたカルスを光条件で培養することにより、組換えベクターに導入された変異したＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子を相同組換えによりカルス細胞のゲノムＤＮＡに存在する野生型ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子に置換して挿入し、変異したＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子が導入した形質転換カルスを得る方法を用いることができる。

前記形質転換カルスを選別する方法は、当業界に公知となった植物形質転換マーカーであるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｍｙｃｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＮＰＴ ＩＩ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＨＰＴ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ、ＣＡＴ）、ハイグロマイシンなどの抗生剤耐性遺伝子；ｂａｒ遺伝子などの除草剤抵抗性遺伝子；ＧＵＳ、緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ、ＬＵＸ）などの標識遺伝子などを用いてもよい。

前記工程（ｄ）において、前記カルスの再分化は、当業界において公知となった方法を用いて行うことができる。例えば、前記形質転換カルスをＭＳＲ固体培地に接種し、常温で光条件で培養してカルスの再分化を誘導する方法を使用することができる。

上述した目的を達成するためのさらに他の実施態様として、本発明は、前記方法で製造され、種子の生産量が増大したイネの種子を提供する。
本発明において提供するイネの種子は、ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子の発現が抑制された種子であって、イネの種子の生産に直接影響を及ぼす穂の数と長さだけでなく、身長の長さや茎の太さを増大させ、全体的にイネの種子の生産量を約２０％増大させることができる。

本発明の一実施例によれば、Ｔ−ＤＮＡの突然変異集団から開花始期を基準にスクリーニングし、開花始期が最も遅れた３Ａ−００１３６系統のイネを選抜し（実施例１）、その遺伝型を分析した結果、ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子にＴ−ＤＮＡが挿入され、ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子が正常に発現されない品種であることが分かった（図２ａ〜２ｃ）。併せて、前記３Ａ−００１３６系統のイネの表現型を対照群のものと比較した結果、対照群に比べて身長が約１５％増加し（図３ａ）、対照群に比べて細胞のサイズが約３２％減少し（図３ｂ）、対照群に比べて茎の太さが約３４％増加することを確認した（図３ｃ）。また、種子の生産量を比較した結果、前記３Ａ−００１３６系統のイネは、対照群に比べて種子収穫量が約２０％増加することを確認した（図４ｂ）。

本発明において提供するＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子の発現を抑制して、種子の生産量を増大させる方法を用いると、外来遺伝子を導入しなくても、イネの種子の生産量を増大させるため、外来遺伝子の導入に伴う危険性を排除することができ、より安全なイネの種子の大量生産に広く活用されるであろう。

変異した３Ａ−００１３６系統のイネ（ＨＯ）の開花表現型（Ａ）と光周期の条件に応じた開花始期（Ｂ）を対照群（ドンジン品種のイネ、ＷＴ）と比較した写真およびグラフである。 ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子にＴ−ＤＮＡが挿入された位置を示す概略図であり、１はＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子のエクソン（配列番号５の塩基配列において６３６０〜７０３０番に相当）を示し、２はＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子のエクソン（配列番号５の塩基配列において７３６５〜７６９４番に相当）を示し、３はＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子のエクソン（配列番号５の塩基配列において７８６３〜８４６１番に相当）を示し、Ｔ−ＤＮＡ挿入位置（３Ａ−００１３６）は、配列番号５の塩基配列の６４６８番である。 ３Ａ−００１３６系統のイネに存在する変異したＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子をＰＣＲ増幅した結果を示す写真であり、左側は変異したＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子を増幅して得られた産物を示し、右側は変異したＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子に挿入されたＴ−ＤＮＡのＲＢ上のＮＧＵＳ１を増幅して得られた産物を示す。 野生型イネの種子と３Ａ−００１３６系統のイネの種子において正常なＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子の発現の有無を確認した結果を示す電気泳動写真であり、左側は野生型イネの種子（ＷＴ）を示し、右側は３Ａ−００１３６系統のイネの種子（ＨＯ）を示す。 対照群と３Ａ−００１３６系統のイネの平均身長を比較した結果を示すグラフであり、（■）は対照群を示し、（□）は３Ａ−００１３６系統のイネを示す。 対照群と３Ａ−００１３６系統のイネの節間組織に含まれている細胞を示す顕微鏡写真であり、ＷＯは対照群を表し、ＨＯは３Ａ−００１３６系統のイネを示す。 対照群と３Ａ−００１３６系統のイネの平均茎の太さを比較した結果を示すグラフであり、（■）は対照群を示し、（□）は３Ａ−００１３６系統のイネを示す。 対照群と３Ａ−００１３６系統のイネの節間組織に含まれている茎の断面を示す顕微鏡写真であり、ＷＯは対照群を表し、ＨＯは３Ａ−００１３６系統のイネを示す。 ３Ａ−００１３６系統のイネから生成された穂を対照群のものと比較観察した結果を示す写真であり、ＷＯは対照群を表し、ＨＯは３Ａ−００１３６系統のイネを示す。 ３Ａ−００１３６系統のイネから収穫された種子の数を対照群のものと比較した結果を示すグラフであり、ＷＯは対照群を表し、ＨＯは３Ａ−００１３６系統のイネを示す。

以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例により限定されるものではない。

実施例１：変異したイネの品種の選抜および特性の解析
イネの収量を増大させて、生産量を向上させるのに影響を与える形質である穂、茎、開花始期を調節する遺伝子を見出すために、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いた形質転換法により作出された１０万系統のイネ突然変異集団において粒数、身長の長さ、開花始期に変化がある突然変異体を観察した。それぞれの突然変異植物体は、アグロバクテリウムによりＴ−ＤＮＡがイネのゲノムＤＮＡに挿入され、挿入された区域の遺伝子が機能し得ない植物体である。Ｔ−ＤＮＡ挿入位置は、ゲノムＤＮＡ ＰＣＲと塩基配列分析によって確認することができ、データベースにおいて遺伝子のｌｏｃｕｓ ｉｄを検索することにより、Ｔ−ＤＮＡが挿入された遺伝子を検索することができる。前記方法を用いて、１０万系統のＴ−ＤＮＡの突然変異集団の植物体の表現型を観察し、このうち開花始期が遅くなる３Ａ−００１３６系統のイネを選抜した。前記選抜されたイネを１２時間の光周期／１２時間の暗周期（短日条件、ＳＤ）、１４時間の光周期／１０時間の暗周期（長日条件、ＬＤ）と水田条件（ｐａｄｄｙ）で生育し、対照群と開花始期を比較した（図１）。この時、対照群としては、変異していないドンジン品種のイネを使用した。

図１は、変異した３Ａ−００１３６系統のイネ（ＨＯ）の開花表現型（ａ）および光周期の条件に応じた開花始期（ｂ）を対照群（ドンジン品種のイネ、ＷＴ）と比較した写真およびグラフである。図１で見られるように、３Ａ−００１３６系統のイネは、対照群と比較し、開花の表現型の茎の長さが比較的長く、すべての光周期の条件で開花始期が対照群より遅れることを確認した。

実施例２：変異したイネ品種の遺伝子型の分析
実施例２−１：ゲノムＤＮＡの分析
前記実施例１で選抜した３Ａ−００１３６系統のイネの種子をＭＳＯ培地に接種し、２８℃で１０日間培養した。培養された固体から葉１００ｍｇを採取し、前記採取した葉を液体窒素に浸漬して凍結させた後、これを物理的に粉砕して粉砕物を得た。得られた前記粉砕物に緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ５ｍｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ１ｍｌ、ＫＣｌ ３．７３ｇおよび水５０ｍｌ、ｐＨ９．５）を加え、懸濁させた後、それからイネのゲノムＤＮＡを抽出した。前記抽出されたイネのゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子の最初のエクソンにＴ−ＤＮＡが挿入された系統でＴ−ＤＮＡ挿入位置の前後で作られたプライマー（配列番号２および配列番号３）とＴ−ＤＮＡの右境界配列（ｒｉｇｈｔ ｂｏｒｄｅｒ、ＲＢ）上のＮＧＵＳ１を認識することができるＮＧＵＳ１プライマー（配列番号４）を用いたＰＣＲを行い、前記イネに存在するＴ−ＤＮＡが挿入されたＤＮＡ断片を得た（図２ｂ）。この時、ＰＣＲ反応は、９５℃で５分；９５℃で３０秒、５３℃で３０秒および７２℃で１分１０秒を１サイクルとして３８回反復；７２℃で７分の条件で行った。
３Ａ−００１３６ Ｆ：５’−ｔａｃｇｃａｔｃｔｃｃａｇａｇｔｔｃａａ−３’（配列番号２）
３Ａ−００１３６ Ｒ：５’−ＴＴＴＴＡＣＴＣＴＧＴＣＣＧＴＴＧＣＡＧ−３’（配列番号３）
ＮＧＵＳ１：５’−ＡＡＣＧＣＴＧＡＴＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＧ−３’（配列番号４）
図２ｂは、３Ａ−００１３６系統のイネに存在する変異したＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子をＰＣＲ増幅した結果を示す写真であり、左側は変異したＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子を増幅して得た産物を示し、右側は変異したＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子に挿入されたＴ−ＤＮＡのＲＢ上のＮＧＵＳ１を増幅して得た産物を示す。図２ｂに示されるように、３Ａ−００１３６系統のイネのゲノムＤＮＡから変異したＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子とＴ−ＤＮＡが検出されることを確認した。

したがって、前記の３Ａ−００１３６系統のイネに含まれているゲノムＤＮＡには、変異したＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子とＴ−ＤＮＡが含まれていることが分かった。

実施例２−２：ｍＲＮＡ分析
前記実施例２−１で得られた３Ａ−００１３６系統のイネの種子の粉砕物にＲＮＡ抽出用緩衝液（ＲＮＡ ｉｓｏ ｂｕｆｆｅｒ、ｔａｋａｒａ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｋａｒａ−ｂｉｏ．ｃｏｍ）を加え、これから総ＲＮＡを得た。前記得られた総ＲＮＡ２μｇとマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ／Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いた逆転写ＰＣＲを行い、それぞれのｃＤＮＡを得た。前記得られたｃＤＮＡを鋳型とし、ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子を増幅し得るプライマー（配列番号６および７）を用いたＰＣＲを行い、前記３Ａ−００１３６系統のイネからＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子が正常に発現されるかどうかを確認した（図２ｃ）。この時、対照群の試料としては、変異していないドンジン品種のイネの種子を使用し、内部の対照群としては、イネのユビキチン遺伝子を増幅させるプライマー（配列番号８および９）を用いてＰＣＲを行った結果を使用した。
ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０ Ｆ：５’−ＴＧＴＴＴＧＧＴＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号６）
ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０ Ｒ：５’−ＧＣＴＧＧＡＴＡＧＴＴＧＧＣＣＡＴＧＴＴ−３’（配列番号７）
ｕｂｉ Ｆ：５’−ＡＡＣＣＡＧＣＴＧＡＧＧＣＣＣＡＡＧＡ−３’（配列番号８）
ｕｂｉ Ｆ：５’−ＡＣＧＡＴＴＧＡＴＴＴＡＡＣＣＡＧＴＣＣＡＴＧＡ−３’（配列番号９）
図２ｃは、野生型イネの種子と３Ａ−００１３６系統のイネの種子において正常なＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子の発現有無を確認した結果を示す電気泳動の写真であり、左側は野生型イネの種子（ＷＴ）を示し、右側は３Ａ−００１３６系統のイネの種子（ＨＯ）を示す。図２ｃに示されるように、野生型イネの種子ではＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子とユビキチン遺伝子が正常に発現されたが、３Ａ−００１３６系統のイネの種子ではＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子は発現されず、ユビキチン遺伝子のみが正常に発現されることを確認した。

したがって、３Ａ−００１３６系統のイネの種子は、ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子が変異した変異品種であることが分かった。
前記実施例２−１および２−２の結果をまとめると、前記実施例１で得られた３ａ００１３６系統のイネはＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子にＴ−ＤＮＡが挿入され、ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子が正常に発現されない品種であることが分かった（図２ａ）。

図２ａは、ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子にＴ−ＤＮＡが挿入された位置を示す概略図であり、１はＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子のエクソン（配列番号５の塩基配列において６３６０〜７０３０番に相当）を示し、２はＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子のエクソン（配列番号５の塩基配列において７３６５〜７６９４番に相当）を示し、３はＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子のエクソン（配列番号５の塩基配列において７８６３〜８４６１番に相当）を示し、Ｔ−ＤＮＡ挿入位置（３Ａ−００１３６）は、配列番号５の塩基配列の６４６８番である。

実施例３：３Ａ−００１３６系統のイネの表現型の分析
前記実施例１で得られた３Ａ−００１３６系統のイネの外形を変化していないドンジンイネ（対照群）の外形と比較観察し、その表現型を分析した。

第一に、各イネの茎の先端から穂の先端までの身長の長さを測定し、比較した（図３ａ）。
図３ａは、対照群と３Ａ−００１３６系統のイネの平均身長を比較した結果を示すグラフであり、（■）は対照群を示し、（□）は３Ａ−００１３６系統のイネを示す。図３ａに示されるように、対照群の平均身長は約９０ｃｍであるのに対し、３Ａ−００１３６系統のイネの平均身長は約１１０ｃｍであることを確認した。したがって、３Ａ−００１３６系統のイネは、対照群に比べて身長が約１５％増加することが分かった。

第二に、各イネに含まれている細胞のサイズと数を観察するために、開花してから、３０日が経過した各イネの第３節間組織（ｉｎｔｅｒｎｏｄｅ）を得、前記得られた節間組織をＦＡＡ ｆｉｘ溶液（ホルマリン（ｆｏｒｍａｌｉｎ）（３５％）：酢酸（ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）：アルコール（ａｌｃｏｈｏｌ）（７０％）＝１：１：１８）に浸漬し、各節間組織に含まれた細胞を固定した。前記固定された節間組織をＬＥＩＣＡ ＲＭ２２６５ｓｅｃｔｉｏｎ機器を使用し、約１μｍの厚さで細切し、細切された節間組織を０．０５％のトルイジンブルー（ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｂｌｕｅ）溶液で染色した後、２０〜４０倍率の光学顕微鏡で観察した（図３ｂ）。

図３ｂは、対照群と３Ａ−００１３６系統のイネの節間組織に含まれている細胞を示す顕微鏡写真であり、ＷＯは対照群を表し、ＨＯは３Ａ−００１３６系統のイネを示す。図３ｂに示されるように、対照群の節間組織で観察された細胞に比べて、３Ａ−００１３６系統のイネの節間組織で観察された細胞はサイズが小さく、同じ範囲に含まれている細胞の数が増加することを確認し、これを数値化した結果、対照群の細胞に比べて約３２％が減少したことを確認した。

第三に、バーニアキャリパーを用い、各イネの節間組織の１〜６番目の節の上側４ｃｍの位置で、それぞれの茎の太さを測定し、比較した（図３ｃ）。
図３ｃは、対照群と３Ａ−００１３６系統のイネの平均茎の太さを比較した結果を示すグラフであり、（■）は対照群を示し、（□）は３Ａ−００１３６系統のイネを示す。図３ｃに示されるように、概ね対照群よりは３Ａ−００１３６系統のイネの平均茎の太さが増加することを確認し、これを数値化した結果、対照群の茎の太さに比べて約３４％増加していることを確認した。

第四に、各イネの茎の断面を観察するために、開花してから３０日が経過した各イネの第三節間組織を得、得られた前記節間組織をＦＡＡ ｆｉｘ溶液に浸漬し、各節間組織に含まれた細胞を固定した。固定された前記節間組織をＬＥＩＣＡ ＲＭ２２６５ ｓｅｃｔｉｏｎ機器を使用して、約１μｍの厚さで横断切断し、切断された節間組織を０．０５％のトルイジンブルー溶液で染色した後、２０〜４０倍率の光学顕微鏡で観察した（図３ｄ）。

図３ｄは、対照群と３Ａ−００１３６系統のイネの節間組織に含まれている茎の断面を示す顕微鏡写真であり、ＷＯは対照群を表し、ＨＯは３Ａ−００１３６系統のイネを示す。図３ｄに示されるように、対照群の節間組織で観察された茎の断面の面積に比べて、３Ａ−００１３６系統のイネの節間組織で観察された茎の断面の面積が広いことを確認した。

前記図３ａ〜３ｄの結果をまとめると、ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子の機能が抑制されると、茎の長さだけでなく、厚さの発達が加速するため、全体的な茎の発達が促進されることが分析された。

実施例４：３Ａ−００１３６系統のイネの種子生産性の分析
まず、前記実施例１で得られた３Ａ−００１３６系統のイネに実る穂と粒を対照群のものと比較観察した（図４ａ）。

図４ａは、３Ａ−００１３６系統のイネで生成された穂を対照群のものと比較観察した結果を示す写真であり、ＷＯは対照群を表し、ＨＯは３Ａ−００１３６系統のイネを示す。図４ａに示されるように、３Ａ−００１３６系統のイネは、対照群に比べて穂の長さと数が増加することを確認した。

また、前記３Ａ−００１３６系統のイネから収穫された種子の数を対照群のものと比較した（図４ｂ）。
図４ｂは、３Ａ−００１３６系統のイネから収穫された種子の数を対照群のものと比較した結果を示すグラフであり、ＷＯは対照群を表し、ＨＯは３Ａ−００１３６系統のイネを示す。図４ｂに示されるように、３Ａ−００１３６系統のイネは、対照群に比べて収穫された種子の数が約２０％増加することを確認した。

前記図４ａおよび４ｂの結果をまとめると、ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子の機能が抑制されると、穂の長さ、数だけでなく、種子の数が増加すると分析することができる。

Claims (9)

1. イネのゲノムＤＮＡに存在する配列番号１の塩基配列を含むＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子の発現を抑制する工程を含む、イネの種子の生産量を増大させる方法。
2. 前記ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子の発現抑制が、ＤＮＡレベルまたはｍＲＮＡレベルで行われる、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＤＮＡレベルにおいて、ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子の発現抑制が、
   イネのゲノムＤＮＡに内在的に存在するＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子を構成する１つまたはそれ以上のヌクレオチドを別のヌクレオチドに置換するか、または欠失させる方法、
   前記ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子を構成するポリヌクレオチドに別のポリヌクレオチドを挿入させる方法、
   ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子を構成する１つまたはそれ以上のヌクレオチドを移動（ｆｒａｍｅ ｓｈｉｆｔ）させる方法、および
   それらの組み合わせで構成された群から選択される方法によって行われるものである、請求項２に記載の方法。
4. 前記ＲＮＡレベルにおいて、ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子の発現抑制が、
   ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子の転写を抑制する方法、
   ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを用いてＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子から転写されたｍＲＮＡを不活性化させる方法、および
   それらの組み合わせで構成された群から選択される方法によって行われるものである、請求項２に記載の方法。
5. 前記ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子の発現抑制が、イネのゲノムＤＮＡに存在する野生型ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子を、配列番号５の塩基配列で構成される、変異したＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子に置換して行われるものである、請求項１に記載の方法。
6. 前記置換が、アグロバクテリウム属微生物を用いて、変異したＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子をイネのカルスに導入して行われるものである、請求項５に記載の方法。
7. 前記アグロバクテリウム属微生物が、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢ４４０４（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢ４４０４）菌株、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０１（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＥＨＡ１０１）菌株、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０５（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＥＨＡ１０５）菌株、およびこれらの組み合わせで構成された群から選択される菌株である請求項６に記載の方法。
8. イネのゲノムＤＮＡに存在する配列番号１の塩基配列を含むＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子の発現を抑制する工程を含む、種子生産量が増大したイネの種子の生産方法。
9. 請求項８に記載の方法により製造され、配列番号１の塩基配列を含むＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ１２４３０遺伝子の発現が抑制されて、種子生産量が増大したイネの種子。