KR20160013408A - 2단 발효를 통한 뇌 기능 개선용 미나리 발효액 제조방법 - Google Patents

2단 발효를 통한 뇌 기능 개선용 미나리 발효액 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 이용한 2단 발효를 통한 뇌 기능 개선용 미나리 발효액 제조방법에 관한 것으로서, 혼합 발효 형태인 2단 발효를 수행함으로써 발효액에 GABA 등을 포함하게 되는데, 뇌세포의 산화적 손상에 대한 보호 효과 및 신경세포의 항염증 효과를 가져 뇌 기능을 개선시킬 수 있는 기능성 미나리 발효액을 제조함으로써, 이를 활용하여 기능성 음료 및 식품 개발의 가능성을 높일 수 있다.

Description

2단 발효를 통한 뇌 기능 개선용 미나리 발효액 제조방법{Method for producing fermented solution of Oenanthe javanica DC for improving brain function using serial fermentation}
본 발명은 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 이용한 2단 발효를 통한 뇌 기능 개선용 미나리 발효액 제조방법에 관한 것이다.
미나리(Oenanthe stolonifera DC, Dropwort)는 산형과에 속하는 다년초이며, 물이 충분하게 공급될 수 있는 습지에서 자생하며 농가에서는 특용작물로 재배되고 있다. 미나리는 식품 영양학적으로 볼 때 플라보노이드, 비타민, 칼륨, 칼슘 및 철분을 함유하는 대표적인 알칼리식품이다. 미나리는 수분 95%, 조단백질 2%, 조지질 0.3%, 조회분 0.7%의 일반성분을 포함하고 있으며, 독특한 향기성분인 정유, 미리스티신 등을 함유한다. 한방에서는 해열, 이뇨, 황달, 고혈압의 치료에 이용하거나 음주후의 해독을 위해서 조제에 첨가하는 것으로 알려져 있다. 재배방법에 따라서는 논에서 재배되는 미나리에 비하여 밭에서 재배되는 미나리에서 더 높은 활성이 나타난다고 보고되기도 하였다. 미나리는 주로 채소와 녹즙으로 이용되는데 이 경우 저장성이 문제되므로 장기저장을 위하여 발효가공품으로 이용되기도 한다.
감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA)은 단백질에서 발견되지 않는 비단백질성 아미노산으로 뇌와 척추에 존재하는 신경 전달물질로 혈류를 개선하며 뇌의 산소공급을 증가시켜, 뇌의 대사촉진 및 뇌 기억을 증진시키는 뇌의 영양제로 알려져 있다. GABA는 신경전달물질 중 아미노산계 신경전달물질의 대표억제 물질로서 중풍, 치매예방, 기억력증진, 불면 등에 효과가 있어 수험생 관련 기능성 식품에 응용할 수 있으며, 식욕과 포만감에 영향을 주어 체중을 감소시키는 효과가 있다. GABA의 생성 기작은 세포 내막에서 글루탐산(glutamic acid)이 글루타메이트 디카르복실라제(glutamate decarboxylase; GAD)의 효소에 의하여 탈탄산 반응이 이루어지면서 글루타메이트(glutamate)가 안티포터(antiporter)에 의하여 세포 내로 쉽게 들어가게 하며 결과적으로 GABA가 세포 밖으로 유출되어 나온다. GABA는 아미노산의 전이 반응에 의해 숙시닉 세미알데히드(succinic semialdehyde)로 전환된 다음 산화에 의하여 숙신산(succinate)이 된다. 이와 같이 GABA의 대사는 에너지를 생산하고 TCA 회로에서 산화를 위한 탄소의 제공, 질소 저장화합물 및 아미노산 대사산물 등의 여러 가지 기능이 알려져 있다. GABA의 기능성이 알려지면서 의약품으로써 뿐만 아니라, 기능성 식품소재로써 관심이 높아지고 있다. 현재 GABA는 현미, 녹차, 맥아, 배추 등에 자연적으로 약간 함유되어 있는데, GABA가 일반 곡류에 존재하는 함량은 일반미에 1-40 mg/100g, 현미에 4-8 mg/100g, 발아현미에 10-100 mg/100g으로 자연상태에서의 식물체 GABA 함유량으로는 극히 적어 활용이 어려운 실정이라 미생물을 이용한 연구가 수행되고 있다.
한국공개특허 10-2011-0019566(2011.02.28 공개)
본 발명의 목적은 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 이용한 2단 발효를 통하여 감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA)이 증진된 뇌 기능 개선용 미나리 발효액 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 미나리를 수세 및 세절하여 준비하는 단계; (2) 전체 혼합물 100 중량부에 대해, 상기 준비된 미나리 10 내지 50 중량부, 효모 추출물(yeast extract) 0.1 내지 5 중량부, K2HPO4 0.1 내지 1 중량부 및 수크로스(sucrose) 5 내지 20 중량부를 혼합하는 단계; (3) 상기 혼합된 혼합물을 열처리하는 단계; (4) 상기 열처리된 혼합물에 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides)를 접종하고 배양하는 1차 발효 단계; (5) 전체 1차 발효물 100 중량부에 대해, 모노소듐 글루타메이트(mono sodium glutamate; MSG) 1 내지 5 중량부 및 효모 추출물(yeast extract) 0.1 내지 0.5 중량부를 상기 1차 발효물에 첨가하는 단계; 및 (6) 상기 (5) 단계의 혼합물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 접종하고 배양하는 2차 발효 단계를 포함하는 감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA)이 증진된 뇌 기능 개선용 미나리 발효액 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 뇌 기능 개선용 미나리 발효액을 제공한다.
본 발명은 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 이용한 2단 발효를 통한 뇌 기능 개선용 미나리 발효액 제조방법에 관한 것으로, 혼합 발효 형태인 2단 발효를 수행함으로써 발효액에 GABA 등을 포함하게 되는데, 뇌세포의 산화적 손상에 대한 보호 효과 및 신경세포의 항염증 효과를 가져 뇌 기능을 개선시킬 수 있는 기능성 미나리 발효액을 제조함으로써, 이를 활용하여 기능성 음료 및 식품 개발의 가능성을 높일 수 있다.
도 1은 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) SM을 이용한 미나리 발효과정을 나타낸다.
도 2는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) SM을 이용하여 발효된 미나리의 pH 및 산도를 나타낸다.
도 3은 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) SM을 이용하여 발효된 미나리의 당도 및 점조도를 나타낸다.
도 4는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) SM을 이용하여 발효된 미나리의 색도를 나타낸다.
도 5는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) SM 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K154를 이용한 미나리 발효과정을 나타낸다.
도 6은 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) SM에 의해 발효된 미나리의 pH 및 산도를 나타낸다.
도 7은 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) SM에 의해 발효된 미나리의 점조도를 나타낸다.
도 8은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K154에 의해 발효된 미나리의 pH 및 산도를 나타낸다. non: 비-발효된 미나리, 1차: 류코노스톡에 의해 발효된 미나리.
도 9는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K154에 의해 발효된 미나리의 TLC 플레이트 상 GABA spot을 나타낸다.
도 10은 MSG 농도 조건을 변경한 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) SM 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K154 2단발효를 통한 미나리 발효과정을 나타낸다.
도 11은 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) SM에 의해 발효된 미나리의 pH 및 산도를 나타낸다.
도 12는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) SM에 의해 발효된 미나리의 점조도를 나타낸다.
도 13은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K154에 의해 발효된 미나리의 pH 및 산도를 나타낸다. non: 비-발효된 미나리, 1차: 류코노스톡에 의해 발효된 미나리, 3% (MSG 3%), 5% (MSG 5%).
도 14는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K154에 의해 발효된 미나리의 TLC 플레이트 상 GABA spot을 나타낸다.
도 15는 효모추출물(yeast extract) 농도 조건을 변경한 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) SM 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K154 2단 발효를 통한 미나리 발효과정을 나타낸다.
도 16은 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) SM에 의해 발효된 미나리의 pH 및 산도를 나타낸다.
도 17은 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) SM에 의해 발효된 미나리의 점조도를 나타낸다.
도 18은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K154에 의해 발효된 미나리의 pH 및 산도를 나타낸다. non: 비-발효된 미나리, 1차: 류코노스톡에 의해 발효된 미나리, 0.25% (효모추출물 0.25%), 0.5% (효모추출물 0.5%).
도 19는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K154에 의해 발효된 미나리의 TLC 플레이트 상 GABA spot을 나타낸다.
도 20은 미나리 발효 전, 후 시료의 신경아교세포 C6에 대한 세포 독성을 나타낸다.
도 21은 t-BHP에 의한 신경아교세포 C6의 산화적 손상에 대한 미나리 발효 전, 후 시료의 보호 효과를 나타낸다.
도 22는 H2O2에 의한 신경아교세포 C6의 산화적 손상에 대한 미나리 발효 전, 후 시료의 보호 효과를 나타낸다.
도 23은 미나리 발효추출물의 미세아교세포 BV2에 대한 세포 독성을 나타낸다.
도 24는 미나리 발효추출물의 LPS로 처리한 BV2 세포의 NO 생성 억제 효과를 나타낸다.
본 발명자들은 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) SM 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K154로 2단 발효를 수행하여 GABA 증진 미나리 발효액을 제조하였으며, 발효 후의 독성이 감소하는 것을 확인함과 함께 C6 및 BV2를 이용하여 산화적 손상에 대한 보호효과와 항염증 활성을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 (1) 미나리를 수세 및 세절하여 준비하는 단계; (2) 전체 혼합물 100 중량부에 대해, 상기 준비된 미나리 10 내지 50 중량부, 효모 추출물(yeast extract) 0.1 내지 5 중량부, K2HPO4 0.1 내지 1 중량부 및 수크로스(sucrose) 5 내지 20 중량부를 혼합하는 단계; (3) 상기 혼합된 혼합물을 열처리하는 단계; (4) 상기 열처리된 혼합물에 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides)를 접종하고 배양하는 1차 발효 단계; (5) 전체 1차 발효물 100 중량부에 대해, 모노소듐 글루타메이트(mono sodium glutamate; MSG) 1 내지 5 중량부 및 효모 추출물(yeast extract) 0.1 내지 0.5 중량부를 상기 1차 발효물에 첨가하는 단계; 및 (6) 상기 (5) 단계의 혼합물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 접종하고 배양하는 2차 발효 단계를 포함하는 감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA)이 증진된 뇌 기능 개선용 미나리 발효액 제조방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 1차 발효 단계 후 상기 1차 발효물을 멸균수로 2배 내지 5배 희석하는 단계를 더 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 열처리하는 단계는 65 내지 100℃에서 10 내지 30분 동안 처리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 1차 발효 단계는 20 내지 30℃에서, 1 내지 72시간 동안 발효할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 2차 발효 단계는 20 내지 30℃에서, 1 내지 7일 동안 발효할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 사용된 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) K154 균주(KACC91727P)는 한국식품연구원으로부터 분양받아 사용하였다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 뇌 기능 개선용 미나리 발효액을 제공한다.
상세하게는, 상기 미나리 발효액은 신경세포의 산화적 손상 보호 활성 및 항염증 활성을 가진다.
한편, 본 발명의 미나리 발효액은 비타민 복합제, 건강보조식품, 특수 영양 보충용 식품, 기능성 음료 등으로 제조될 수 있다. 본 발명의 미나리 발효액은 독성 및 부작용이 거의 없어 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1 > 류코노스톡 메센테로이드( Leuconostoc mesenteroides )를 이용한 미나리 1차 발효를 통한 락토바실러스 플란타룸 ( Lactobacillus plantarum ) K154 2차 발효물의 GABA 생성 조건 설정
1. 류코노스톡 메센테로이드( Leuconostoc mesenteroides )를 이용한 미나리 발효액의 덱스트란 ( dextran ) 생성
대구 비슬산 가창면 정대리에서 수확한 청정 밭미나리를 깨끗이 수세, 세절한 후 발효에 사용하였다. 발효 최적 조건 설정을 위하여 미나리 20%, 효모추출물(Yeast Extract; YE) 0.5%, K2HPO4 0.5%, 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) SM 1%, 수크로스(sucrose) 5~20%, 25℃, 0~3day 조건을 검토하였다(도 1).
수크로스(Sucrose) 첨가에 따른 생균수를 비교해 보았을 때 발효가 진행되면서 수크로스(sucrose) 10%에서 1.3×109 CFU/mL로 가장 높은 것을 볼 수 있었다(표 1).
Figure pat00001
수크로스(Sucrose) 첨가에 따른 pH, 산도를 분석해 보았을 때, 초기 pH는 7.4에서 3.9로 감소하는 경향을 보였고 발효가 진행되면서 유지하는 것을 볼 수 있었다. 수크로스(sucrose) 첨가에 따른 변화는 없는 것을 볼 수 있었다. 산도를 보면 초기 0.1에서 1.2로 증가하는 경향을 보였다(도 2).
당도를 측정해 본 결과, 수크로스(sucrose) 20%의 경우 가장 높은 것을 볼 수 있었고, 발효가 진행되면서 당도 변화는 없는 것을 알 수 있었다. 점조도를 분석해 본 결과, 수크로스(sucrose) 20% 첨가한 것에서 점조도 값이 8 Pa·sn로 가장 높은 것을 볼 수 있었다. 그 결과 수크로스(sucrose) 함량이 높을수록 점조도가 높게 나타나는 것을 볼 수 있었다. 그래서 수크로스(sucrose) 20%를 1차 발효의 최적조건으로 나타났다(도 3).
색도를 분석해 본 결과, 수크로스(sucrose) 첨가 함량에 따른 변화는 없는 것을 볼 수 있었다(도 4).
2. 2단 발효 조건 설정
미나리 20%, YE 0.5%, K2HPO4 0.5%, 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) SM 1%, 수크로스(sucrose) 20%, 25℃, 1~3day에서 1차 발효 후, 이를 희석배수(2, 5배), MSG 1.6%, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K154 1%, 30℃, 0-7 days 조건에서 발효를 수행하였다(도 5).
류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) SM을 이용하여 1차 발효를 진행한 경우, 정치배양과 진탕배양을 하였다. 그 결과 정치배양에서 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) SM 생균수를 분석해 본 결과, 발효 3일에서 진탕배양을 했을 때보다 4.3×109 CFU/mL로 높은 값을 보였고, 그 결과 정치배양을 최적조건으로 나타났다(표 2).
Figure pat00002
1차 발효물의 정치배양과 진탕배양의 pH, 산도를 분석해본 결과, pH 7.6에서 3.9로 감소하였고 발효가 진행되면서 유지되는 경향을 볼 수 있었다. 정치배양과 진탕배양의 차이는 없는 것을 알 수 있었다. 산도를 분석해 본 결과 발효가 진행되면서 정치배양과 진탕배양은 차이가 없는 것을 볼 수 있었다(도 6).
정치배양과 진탕배양의 점조도를 분석 해 본 결과 정치배양의 경우 발효가 진행되면서 3일에서 4 Pa·sn의 값을 보였고 진탕배양의 경우 3 Pa·sn의 값으로 정치배양보다 낮은 것을 볼 수 있었다. 그래서 정치배양한 것을 이용하여 2차 발효를 하였다(도 7).
류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) SM과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K154의 생균수를 비교해 본 결과, 1차 발효에서 이용한 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) SM의 경우 2차 발효가 진행되면서 그 수가 7일에서 7.0×106 CFU/mL으로 감소하는 것을 볼 수 있었고, 2차 발효에서는 1차 발효물을 이용하여 희석배수에 따른 2차 발효를 하였다. 2차 발효에서 이용한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K154의 경우 그 수가 108 CFU/mL으로 유지하는 것을 볼 수 있었고, 5배 희석한 것에서 5.3×108 CFU/mL으로 가장 높은 값을 볼 수 있었다(표 3).
Figure pat00003
2차 발효의 pH, 산도를 분석 해 본 결과 pH의 경우 발효가 진행되면서 감소하는 경향을 보였고, 5배 희석한 발효물에서 3.8로 가장 낮은 값을 볼 수 있었다. 산도의 경우 5배 희석한 것에서 2.7로 가장 높은 값이 나타나는 것을 볼 수 있었다(도 8).
TLC를 이용하여 GABA 정량분석을 하였다. 그 결과 1차 발효물을 5배 희석한 발효물에서 GABA spot이 standard 0.5% 정도로 크고 진하게 나타났다. 그래서 최적조건을 1차 발효물을 5배 희석하여 사용하였다(도 9).
3. 발효 시간과 MSG 농도 설정
미나리 20%, YE 0.5%, K2HPO4 0.5%, 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) SM 1%, sucrose 20%, 25℃에서 3일간 1차 발효 후, 이를 MSG 용액(3, 5%)으로 5배 희석하여, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K154 1%, 30℃, 0-7days 조건에서 발효를 수행하였다(도 10).
1차 발효에 사용된 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) SM의 생균수를 보면 발효가 진행되면서 1.9×109 CFU/mL으로 유지되는 것을 볼 수 있었다(표 4).
Figure pat00004
1차 발효물의 pH, 산도를 분석해본 결과 발효 초기 pH 7.6에서 3.8로 감소하는 경향을 볼 수 있었고, 산도의 경우 1.2로 증가하는 경향을 볼 수 있었다(도 11). 한편, 점조도를 분석해 보았을 때 발효가 진행되면서 3일에 6.1 Pa·sn로 나타났다(도 12).
MSG의 농도에 따라 MSG 용액(3, 5%)으로 1차 발효물을 희석하여 2차 발효를 진행하였다. 생균수를 분석해 본 결과 발효가 시간이 지남에 따라 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) SM의 경우 4.5×106 CFU/mL으로 감소하는 것을 볼 수 있었고 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K154의 경우 MSG 3% 용액 첨가 발효물에서 MSG 5% 용액 첨가한 발효물 보다 7×108 CFU/mL으로 더 높은 값을 볼 수 있었다(표 5).
Figure pat00005
2차 발효의 pH, 산도를 분석 해 본 결과 pH의 경우 발효가 진행되면서 3.9에서 4.2로 증가하였고 유지하는 경향을 볼 수 있었다. 그리고 산도의 경우 MSG 3% 용액의 경우 1.4로 나타났고 5% 용액의 경우 1.9로 3%보다 높은 것을 볼 수 있었다(도 13).
TLC를 이용하여 GABA 정량분석을 하였다. 그 결과 MSG 3% 용액을 이용하여 5배 희석한 발효물에서 5% 용액으로 희석한 발효물 보다 MSG 전환율이 높은 것을 볼 수 있었다(도 14). 그러므로 MSG 3% 용액을 이용하여 2차 발효를 진행하였다.
4. 발효시간과 효모추출물( yeast extract ) 농도 설정
상기 1차 발효액을 MSG 3% 용액으로 5배 희석하여, YE 0.25 내지 0.5%, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K154 1%, 30℃, 0-7days의 조건에서 2차 발효하여, 발효 특성을 분석하였다(도 15).
1차 발효에 사용된 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) SM의 생균수를 보면 발효가 진행되면서 2.1×109 CFU/mL으로 유지 되는 것을 볼 수 있었다(표 6).
Figure pat00006
1차 발효물의 pH, 산도를 분석해본 결과 발효 초기 pH 7.6에서 3.9로 감소하는 경향을 볼 수 있었고, 산도의 경우 1로 증가하는 경향을 볼 수 있었다(도 16). 또한, 점조도를 분석해 보았을 때 발효가 진행되면서 3일에 2.9 Pa·sn로 나타났다(도 17).
MSG 3% 용액을 이용한 2차 발효물 희석에서 5% 용액으로 희석한 발효물보다 MSG 소진율이 높아 MSG 3% 용액으로 1차 발효물을 5배희석하여 2차 발효를 진행하였다. 생균수를 분석해 본 결과 발효가 시간이 지남에 따라 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) SM의 경우 4.5×106 CFU/mL으로 감소하는 것을 볼 수 있었고 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K154의 경우 YE 농도에 따라서는 차이가 없는 것을 볼 수 있었다(표 7).
Figure pat00007
2차 발효의 pH, 산도를 분석 해 본 결과 pH의 경우 발효가 진행되면서 3.9에서 4.3으로 증가하였고 유지하는 경향을 볼 수 있었다. 그리고 산도의 경우 YE 농도에 따라서는 차이 없이 유지하는 경향을 볼 수 있었다(도 18).
TLC를 이용하여 GABA 정량분석을 하였다. 그 결과 MSG가 발효 3일째 모두 소진되는 것을 볼 수 있었고, YE 0.25% 첨가한 발효물에서 GABA standard 1%와 비슷한 spot이 나타나는 것을 볼 수 있었다(도 19).
< 실시예 2 > C6 세포를 이용한 발효추출액의 산화적 손상 보호효과
1. 신경아교세포 C6 배양 및 t- BHP 의 처리에 의한 세포 생존율 측정
미나리 젖산발효액의 산화적 손상에 대한 신경 세포 보호 효과를 검토하기 위하여, 발효 전 후의 시료를 70% EtOH로 2회 추출하여 동결건조한 후 -20℃에 보관하면서 본 발명에 사용하였다. 본 발명에 사용된 흰쥐 신경아교세포 C6(astroglioma cells)는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 구입하였으며, 10% FBS 및 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 포함된 DMEM(dulbecco's modified eagle medium) 배지(Gibco-BRL, Rockville, MD, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 터트-부틸하이드로퍼옥사이드(t-BHP)에 의한 산화적 손상에 대한 보호 효과를 알아보기 위하여, C6 세포를 96well plate에 5 x 104/well로 분주하고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 16~24 시간 동안 배양한 후, 농도별로 희석한 시료를 세포에 전처리하여 2~16시간 동안 배양하였다. 그 후 t-BHP(1mM, 2hr)를 처리하고 이에 의해 유도된 C6 세포에 대한 세포독성을 MTT 에세이를 통해 측정하였다. 시료 및 손상 유도된 세포에 MTT 스탁 용액(5mg/mL, 10 μL/well)을 처리하여 37℃에서 4시간 배양시킨 후, DMSO 100 μL로 반응을 종결시켰다. 배양 종료 후 상등액을 제거하고 각 well에 100 μL의 DMSO를 첨가하여 생성된 포르마잔(formazan) 결정을 용해시켜 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 550 nm에서 흡광도를 측정하였고, 세포독성은 시료의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.
그 결과, 도 20과 같이 발효하지 않은 시료의 경우 세포 생존율은 100ug/ml에서 86.5%, 1000ug/ml에서 61.9%, 2000ug/ml에서 68.4%로 독성을 나타냈으나, 발효추출물의 경우는 고농도에서도 생존율에 영향이 없는 것으로 나타났다. 또한, 도 21과 같이, 발효 전후 미나리 추출물 모두 t-BHP에 의한 산화적 손상에 대한 보호효과를 나타냈으나, 특히 발효추출물의 경우 시료 농도가 증가함에 따라 보호 효과가 증가함을 알 수 있다. 시료 농도 2000ug/ml에서 약 93%의 보호 효과가 나타났다.
2. 신경아교세포 C6 배양 및 H 2 O 2 의 처리에 의한 세포 생존율 측정
신경아교세포 C6을 96 well plate에 5 x 104/well로 분주하고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 16~24 시간 동안 배양한 후, 농도별로 희석한 시료를 세포에 전처리하여 2~16 시간 동안 배양하였다. 그 후 H2O2(2mM)를 30분 처리하고 이에 의해 유도된 C6 세포에 대한 세포독성을 MTT 에세이를 실시하여 측정하였다.
그 결과, 도 22와 같이, 발효 전후 미나리 추출물 모두 H2O2에 의한 산화적 손상에 대한 보호효과를 나타냈으나, 특히 발효추출물의 경우 발효전과 비교하여 보호 효과가 크게 증가하는 것을 알 수 있다. 이상의 결과로부터 젖산균을 이용하여 2단 발효를 수행함으로써 뇌기능 향상 유용성분인 GABA가 증진됨과 함께 시료의 독성이 감소하는 것을 확인하였다.
< 실시예 3 > BV2 cell 을 이용한 발효추출액의 항염 효과
C6 세포 독성을 나타내지 않는 미나리 발효추출물을 이용하여, 산화적 뇌손상에 대한 보호효과를 검토하기 위하여 mouse의 microglial cell line인 BV2 cell을 이용하여 항염활성을 측정하였다.
1. 미세아교세포 BV2 배양 및 LPS 처리에 의한 세포 생존율 측정
미세아교세포주인 BV2 세포를 계명대학교 약대로부터 분양 받았으며, 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% 항생제(penicillin/streptomycin)를 첨가한 DMEM 배지를 이용하여 5% CO2가 존재하는 37℃ 배양기에서 1주일에 2~3회 계대 배양하였다. 세포 독성을 MTT 법으로 측정하기 위하여, RAW 264.7 세포 1 x 105 cells/well을 96 well plate에 분주하고, 37℃, 5% CO2인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 배양한 세포를 혈청 프리(serum free) 배지로 교체한 후 LPS(100 ng/mL)와 시료를 각각 처리하여 24시간 배양하여 5 mg/mL의 MTT 용액 10 μL를 각 well에 넣고 인큐베이터에서 4시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후 상등액을 제거하고 각 well에 100 μL의 DMSO를 첨가하여 생성된 포르마잔(formazan) 결정을 용해시켜 마이크로 플레이트 리더(microplate reader)로 550 nm에서 흡광도를 측정하였고, 세포독성은 시료의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다. 그 결과, 도 23과 같이 1~1000ug/ml의 농도 범위에서 BV2 cell에 대한 유의적인 세포 독성은 나타나지 않았다.
2. NO ( Nitric oxide ) 생성량 측정
시료의 NO 생성 억제능을 측정하기 위하여, 시료 또는 LPS를 처리한 상기 BV2 세포주 배양액에서의 나이트라이트(nitrite) 측정을 위해 100 μL를 96 well plate에 취하였다. 여기에 동량의 Griess 시약을 넣어 10분간 반응시킨 후 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 나이트라이트(nitrite)의 농도는 질산나트륨(NaNO2)을 사용하여 얻은 표준 직선과 비교하여 산출하였다. 그 결과, 도 24와 같이 농도 의존적으로 NO 생성 억제 효과를 나타내었으며, 500과 1000 ug/ml에서 각각 약 72와 77%의 억제능을 확인하였다.
이상의 결과로 선별된 젖산균으로 2단 발효를 수행하여 GABA 증진 미나리 발효액을 제조하였으며, 발효 후의 독성이 감소하는 것을 확인함과 함께 C6 및 BV2를 이용하여 산화적 손상에 대한 보호효과와 항염증 활성을 확인하였다. 미나리 발효액이 뇌세포의 산화적 손상에 대한 보호효과와 신경세포의 항염증 효과를 통하여 뇌 기능 향상에 기여할 수 있을 것이라 사료된다.

Claims (7)

  1. (1) 미나리를 수세 및 세절하여 준비하는 단계;
    (2) 전체 혼합물 100 중량부에 대해, 상기 준비된 미나리 10 내지 50 중량부, 효모 추출물(yeast extract) 0.1 내지 5 중량부, K2HPO4 0.1 내지 1 중량부 및 수크로스(sucrose) 5 내지 20 중량부를 혼합하는 단계;
    (3) 상기 혼합된 혼합물을 열처리하는 단계;
    (4) 상기 열처리된 혼합물에 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides)를 접종하고 배양하는 1차 발효 단계;
    (5) 전체 1차 발효물 100 중량부에 대해, 모노소듐 글루타메이트(mono sodium glutamate; MSG) 1 내지 5 중량부 및 효모 추출물(yeast extract) 0.1 내지 0.5 중량부를 상기 1차 발효물에 첨가하는 단계; 및
    (6) 상기 (5) 단계의 혼합물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 접종하고 배양하는 2차 발효 단계를 포함하는 감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA)이 증진된 뇌 기능 개선용 미나리 발효액 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 1차 발효 단계 후 상기 1차 발효물을 멸균수로 2배 내지 5배 희석하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌 기능 개선용 미나리 발효액 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 열처리하는 단계는 65 내지 100℃에서 10 내지 30분 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 뇌 기능 개선용 미나리 발효액 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 1차 발효 단계는 20 내지 30℃에서, 1 내지 72시간 동안 발효하는 것을 특징으로 하는 뇌 기능 개선용 미나리 발효액 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 2차 발효 단계는 20 내지 30℃에서, 1 내지 7일 동안 발효하는 것을 특징으로 하는 뇌 기능 개선용 미나리 발효액 제조방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항의 방법에 의해 제조된 뇌 기능 개선용 미나리 발효액.
  7. 제6항에 있어서, 상기 미나리 발효액은 신경세포의 산화적 손상 보호 활성 및 항염증 활성을 가진 것을 특징으로 하는 뇌 기능 개선용 미나리 발효액.
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