KR20160013201A

KR20160013201A - 비타민 d를 이용한 화학요법 유발 탈모증의 예방 또는 완화

Info

Publication number: KR20160013201A
Application number: KR1020157036839A
Authority: KR
Inventors: 니븐 라진 나레인; 존 패트릭 맥쿡; 호아킨 제이. 히메네스
Original assignee: 버그 엘엘씨
Priority date: 2013-05-29
Filing date: 2014-05-29
Publication date: 2016-02-03
Also published as: AU2023270234A1; HK1222819A1; JP2020023563A; AU2014274099A1; WO2014194133A1; AU2019222786A1; JP6608810B2; AU2021203977A1; EP3003497B1; CN112156097A; SG10201709894RA; US20200113918A1; NZ714801A; EP3003497A4; CN105492081A; WO2014194133A8; JP2016523226A; EP3003497A1; CA2913543C; US20160228458A1

Abstract

본 발명은 화학요법-유발 탈모증(CIA)를 예방하거나 완화하기 위한 방법 및 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학 조성물은 유효한 양의 국소 제형의 비타민 D 화합물을 포함한다. 본 발명은 탈모증을 유발하는 화학요법, 예를 들면, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 난소암, 난관암, 1차 복막 암종, 연조직 육종, 또는 골 육종을 위한 탁산 계열 화학요법에서 광범위하게 응용된다. 본 발명의 약학 조성물은 유리하게는 화학요법 전에 및/또는 이와 동시에 투여될 수 있다.

Description

비타민 D를 이용한 화학요법 유발 탈모증의 예방 또는 완화{PREVENTING OR MITIGATING CHEMOTHERAPY INDUCED ALOPECIA USING VITAMIN D}

관련 출원

본 출원은 2013년 5월 29일자로 출원된 미국 가출원 번호 제 61/828,448호의 “비타민 D를 이용한 화학요법 유발 탈모증의 예방 또는 완화”에 대한 우선권을 주장하며, 이의 전체 내용은 참조로서 본원에 명백하게 병합된다.

발명의 배경

탈모증은 많은 화학요법제에서 공통적이고 괴로운 부작용이고, 현재 이에 대한 효과적인 예방책은 거의 없다. 최근의 연구에서, 화학요법을 받은 46명의 환자 중 35명이 더 불안감을 주는 부작용으로서 구토보다는 탈모증을 꼽았다 (Tierney et al, B. J. Cancer, 62:527-528, 1990).

현재, 탈모증을 앓고 있는 환자들은 국소 스테로이드를 반복 적용하여 손실된 모발을 재성장시키려고만 하거나 미녹시딜을 국소 적용하여 모발 성장을 유지시키려 할 수 있다. 또한, 몇몇의 유망한 연구가 있었지만, 화학요법 치료 동안 부작용으로 일어나는 탈모증을 예방하거나 완화하는 능력을 갖는 치료제로 승인된 것은 현재 없다. 예를 들어, 새끼 래트 모델을 사용하여, 박테리아 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)로부터 제조된 생물학적 반응 개질제인 ImuVert이 시토신 아라비노사이드 또는 아드리아마이신이 유발한 탈모증으로부터 동물을 보호한다는 것이 입증되었다(Hussein et al., Science 249: 1564-1566, 1990). 후속 연구에서, ARA-C-유발 탈모증으로부터의 유사한 보호가 재조합 인터류킨-1(IL-1) 베타에서 관찰되었다(Jimenez et al., FASEB J. 1991). 이러한 유망한 결과에도 불구하고, 이러한 장애를 앓고 있는 환자의 탈모증을 치료하고, 나아가 암 치료를 받고 있는 환자에서 화학요법-유발 탈모증을 예방하는, 안전하고 효과적인 치료제가 여전히 필요하다.

본 발명의 목적은 화학요법 유발 탈모증의 예방 또는 완화를 제공하는 것이다.

발명의 요약

본 발명은 화학요법-유발 탈모증(chemotherapy-induced alopecia, CIA)을 예방하거나 완화하기 위하여, 비타민 D 화합물, 예를 들어, 비타민 D3 또는 칼시트리올 및 이의 유사체 또는 이의 대사산물의 국소 용도, 이의 용량 및 제형에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 화학요법-유발 탈모증(CIA)을 예방하거나 완화하기 위한 방법 및 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학 조성물은 유효한 양의 국소 제형의 비타민 D 화합물을 포함한다. 본 발명은, 탈모증을 유발하는 화학요법, 예컨대, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 난소암, 난관암, 1차 복막 암종, 연조직 육종, 골 육종과 같은 고형 종양의 치료용 탁산 계열 화학요법에서 광범위하게 응용된다. 본 발명의 약학 조성물은 유리하게는 화학요법 전에 및/또는 이와 동시에 투여될 수 있다.

따라서, 한 양태에서, 본 발명은 인간 대상체에서 화학요법-유발 탈모증을 예방하거나 완화하는 방법으로서, (1) 암이 있으며, 화학요법을 받을 예정이거나 받고 있는 인간 대상체를 선택하는 단계; 및 (2) 치료학적으로 유효한 양의 비타민 D 화합물을 포함하는 약학 조성물을 상기 대상체의 두피에 국소적으로 투여하는 단계를 포함하며, 상기 단계 (2)는 상기 화학요법 전에 및/또는 이와 동시에 실시하여, 상기 대상체에서 화학요법-유발 탈모증을 예방하거나 완화하는 방법을 제공한다.

일부 구체예에서, 상술된 방법에서 단계 (2)는 상기 화학요법의 개시 전에 실시한다. 한 구체예에서, 단계 (2)는, 상기 대상체의 치료 영역에 모낭의 퇴행기가 유도되도록, 상기 화학요법 개시 전에 충분한 시간 동안 실시한다. 바람직하게는, 단계 (2)는 상기 화학요법의 개시의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13일 전에 실시한다. 더 바람직하게는, 단계 (2)는 상기 화학요법의 개시의 적어도 2주 전에 실시한다.

일부 구체예에서, 상술된 방법 및 이의 구체예에서 사용된 상기 약학 조성물은 상기 비타민 D 화합물 1일 총 투여량 약 10~40 ㎍으로 투여한다. 바람직하게는, 상기 약학 조성물은 상기 비타민 D 화합물 1일 총 투여량 약 20 ㎍ 또는 약 40 ㎍으로 투여한다.

일부 구체예에서, 상술된 방법 및 이의 구체예에서 사용된 상기 약학 조성물은 약 1.0 mL 투여량으로 투여한다. 바람직하게는 상기 두피의 사분면 각각에 약 0.25 mL 투여한다.

일부 구체예에서, 상술된 방법 및 이의 구체예에서 사용된 상기 약학 조성물은 상기 비타민 D를 약 5, 10, 또는 20 ㎍/mL의 농도로 포함한다.

일부 구체예에서, 상술된 방법 및 이의 구체예에서, 단계 (2)는 하루에 2회 실시한다. 한 구체예에서, 상기 1일 2회 투여는 약 10~14 시간 간격을 가진다.

일부 구체예에서, 상기 대상체는 고형 종양이 있다. 한 구체예에서, 상기 대상체는 진행성 또는 재발성 암이 있다. 한 구체예에서, 상기 대상체는 자궁 경부암, 자궁 내막암, 난소암, 난관암, 1차 복막 암종, 연조직 육종, 또는 골 육종이 있다. 한 구체예에서, 상기 대상체는 유방암이 있다.

일부 구체예에서, 상기 대상체를 다음의 추가 기준 중 하나 이상에 기반하여 선택한다: 상기 대상체는 적어도 18세인 인간일 것; 상기 대상체는 탈모증 또는 경도 탈모증의 흔적이 없을 것; 상기 대상체는 세포 자멸적이지 않은 모낭을 가질 것; 상기 대상체는 국소 투여 시작 전 14일 이내에 Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) 기능 점수가 0 또는 1점일 것; 상기 대상체는 국소 투여 시작 전 72시간 이내에 1500 세포/mm³ 초과의 기준 호중구 수(baseline neutrophil count)를 가질 것; 및 상기 대상체는 국소 투여 시작 전 72시간 이내에 정상치 상한(upper limit of normal, ULN) 이하의 혈청 칼슘 레벨을 가질 것.

일부 구체예에서, 상기 대상체를 다음의 추가 기준 중 하나 이상에 기반하여 선택한다: 상기 대상체가 국소 투여 시작 전 3개월 이상 동안 비스포스포네이트 또는 칼슘 저하 요법으로 관리되고 칼슘 대사 안정성에 대하여 증명하지 않는다면, 상기 대상체는 국소 투여 시작 4주 이내에 칼슘 저하 요법, 또는 칼슘 레벨에 영향을 줄 수 있는 약물을 받지 않을 것; 상기 대상체는 국소 투여 시작 30일 이내에 고칼슘혈증 또는 비타민 D 독성의 이력이 없을 것; 상기 대상체는, 국소 투여 시작 30일 이내에 협심증, 심근 경색, 또는 울혈성 심부전 또는 정신 질환의 치료를 위하여 입원한 이력이 없을 것; 상기 대상체가 국소 투여 시작 전 30일 이상 동안 비타민 D 보충제를 섭취하고 국소 투여에 걸쳐 동일한 투여량을 유지하지 않는다면, 상기 대상체는 국소 투여 동안 비타민 D 보충제를 섭취하지 않을 것; 6개월 초과 동안 안정적 치료를 받은 대상체를 제외하고, 상기 대상체는 국소 투여 시작 4주 이내에 칼슘 레벨에 영향을 주는 것으로 알려진 약물로 치료받고 있지 않을 것; 6 개월 초과 동안 안정적인 투여량을 받고 치료 중에 있는 대상체를 제외하고, 티아지드 또는 푸로세미드 이뇨제를 받고 있지 않을 것; 상기 대상체는 고칼슘혈증 또는 신장 결석이 없을 것; 및 상기 대상체는 National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events(NCU-CTCAE) v4.0에 따른 탈모증 등급이 2 이상이 아니거나 유의한 모발 손실 또는 모발 파손이 없을 것.

일부 구체예에서, 상술된 방법 또는 이의 구체예에서 예정된 화학요법은 탁산 계열 항암 화학요법을 포함한다. 한 구체예에서, 파클리탁셀, 나노입자 알부민-결합 파클리탁셀, 및 도세탁셀 항암 화학요법으로 구성되는 군에서 선택된 하나 이상의 탁산 화학요법을 포함한다. 한 구체예에서, 탁산 계열 항암 화학요법은 파클리탁셀, 도세탁셀, 폴리글루타메이트 폴리머에 결합된 파클리탁셀, 도코사헥사에논산에 결합된 파클리탁셀, 종양-활성 탁솔 전구 약물, 파클리탁셀-안지오펩(Angiopep)-2 접합체 (ANG1005), 파클리탁셀 폴리글루멕스(polyglumex), 코폴리머 복합 파클리탁셀, 리포좀 캡슐화 파클리탁셀, 비타민 E 에멀젼 내 탁솔, 및 이들의 등가물로 구성되는 군에서 선택된 하나 이상의 탁산 화학요법을 포함한다. 한 구체예에서, 탁산 계열 항암 화학요법은, 안트라사이클린(아드리아마이신/독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 이다루비신, 발루비신), 5-FU, 타목시펜, 이리노테칸, 카르보플라틴, 에토포시드, 사이톡산/사이클로포스파미드, 시스플라틴, 에를로티니브(타르세바), 겜시타빈, 스타우로스포린, 빈크리스틴, 이마티니브(글리벡), 게피티니브(이레사), 소라페니브, 다사티니브, 닥티노마이신, 헥사메타멜라민(HMM, 알트레타민), 이포스파미드, 블레오마이신, 메토트렉세이트, 빈데신, 비노렐빈, 토포테칸, 암사크린, 시타라빈, 부설판, 멜팔란, 빈블라스틴, 로무스틴(CCNU), 티오테파, 겜시타빈, 카르무스틴(BCNU), 미트록산트론, 미토마이신 C, 프로카바진, 6-머캅토푸린, 스렙토조토신, 플루다라빈, 랄티트렉세이트(토무덱스), 카페시타빈, 및 이들의 등가물로 구성되는 군에서 선택된 하나 이상의 추가 요법을 포함한다.

일부 구체예에서, 탁산 계열 항암 화학요법은 파클리탁셀 또는 도세탁셀이 아니다. 일부 구체예에서, 탁산 계열 항암 화학요법은 파클리탁셀이 아니다. 다른 구체예에서, 탁산 계열 항암 화학요법은 도세탁셀이 아니다.

일부 구체예에서, 암은 전이성 유방암을 포함하며, 화학요법은 파클리탁셀계, nab-파클리탁셀 (즉, 알부민 결합 파클리탁셀), 또는 도세탁셀 계열 화학요법을 포함하는데, 각각은 선택적으로 카르보플라틴과 병용한다.

일부 구체예에서, 암은 난소암을 포함하며, 화학요법은 파클리탁셀 계열 및/또는 도세탁셀 계열 화학요법을 포함하는데, 선택적으로 카르보플라틴과 병용한다.

일부 구체예에서, 암은 자궁암을 포함하며, 화학요법은 도세탁셀 계열 화학요법을 포함하는데, 선택적으로 겜시타빈과 병용한다.

일부 구체예에서, 암은 자궁경부암을 포함하며, 화학요법은 파클리탁셀 계열 화학요법을 포함하는데, 선택적으로 시스플라틴 및/또는 토포테칸과 병용한다.

일부 구체예에서, 암은 고형 종양이며, 화학요법은 겜시타빈, 5-플루오로우라실(5-FU), 및 도세탁셀을 포함한다. 한 구체예에서, 암은 고형 종양이며, 화학요법은 5-FU 및 레우코보린의 병용이다.

일부 구체예에서, 상술한 방법 및 이의 구체예에서 단계 (2)는 상기 화학요법의 개시 후 적어도 3 개월 동안 실시한다. 일부 구체예에서, 상술한 방법 및 이의 구체예에서 단계 (2)는 상기 화학요법의 완료 후 적어도 3 개월 동안 실시한다. 일부 구체예에서, 상술한 방법 및 이의 구체예에서 단계 (2)는 상기 화학요법의 기간 중에 실시한다.

일부 구체예에서, 상기 약학 조성물은, 비타민 D 화합물이 실질적으로 피부 전달을 회피하면서 피부에 전달되도록, 제형화한다.

일부 구체예에서, 상기 약학 조성물은 무수이다. 한 구체예에서, 상기 약학 조성물은 약 40%(w/w)의 프로필렌 글리콜 및 약 60%(w/w)의 무수 에탄올의 비이클(vehicle)을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 약학 조성물은 약 30%(w/w)의 프로필렌 글리콜, 약 10%(w/w)의 에톡시디글리콜 또는 트랜스큐톨, 및 약 60%(w/w)의 무수 절대 에탄올(200 proof, U.S.)의 비이클을 포함한다.

일부 구체예에서, 상술한 방법 및 이의 구체예에서 단계 (2)를 실시하는 것은 화학요법의 효능을 실질적으로 감소시키지 않는다.

일부 구체예에서, 상기 비타민 D 화합물은 칼시트리올이다.

일부 구체예에서, 상기 비타민 D 화합물은 식 (I)으로 표현되거나 이의 약학적으로 허용되는 염이다:

(I)

여기에서,

a 및 b는 각각 독립적으로 단일 또는 이중 결합이고;

X는, a가 이중 결합일 경우, -CH₂이거나, X는, a가 단일 결합일 경우, 수소 또는 하이드록실 치환 알킬이고;

R¹은 수소, 하이드록실, 알콕실, 트리-알킬 실릴, 또는 1 내지 3개의 할로겐, 하이드록실, 시아노 또는 -NR'R" 부분으로 선택적으로 치환된 알킬이고;

R²은 수소, 하이드록실, -O-트리알킬 실릴, 또는 1 내지 3개의 할로겐, 하이드록실, 시아노 또는 -NR'R" 부분으로 선택적으로 치환된 알킬, 알콕실, 또는 알케닐이고;

R³은, b가 이중 결합일 경우, 부재하거나, b가 단일 결합일 경우, R³은, 수소, 하이드록실 또는 알킬이거나, R³ 및 R¹은 이들이 부착된 탄소원자들과 함께 결합하여 5- 내지 7-원 카르보사이클릭 고리를 형성할 수 있고;

R⁴는, b가 이중 결합일 경우, 부재하거나, b가 단일 결합일 경우, 수소, 할로겐 또는 하이드록실이고;

R⁵는, a가 이중 결합일 경우, 부재하거나, R⁵는, a가 단일 결합일 경우, 수소, 할로겐, 또는 하이드록실이고;

R⁶은 1 내지 5개의 하이드록실, 옥소, 할로겐, 알콕실, 아릴, 헤테로아릴, 시아노, 니트로, 또는 -NR'R" 부분으로 선택적으로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클리실(heterocyclicyl), 알킬-O-알킬, 알킬-CO₂-알킬이고;

R⁷은 1 내지 3개의 하이드록실, 할로겐, 알콕실, 아릴, 헤테로아릴, 시아노, 니트로, 또는 -NR'R" 부분으로 선택적으로 치환된 알킬이고; 및

R' 및 R"는 각각 독립적으로 수소, 하이드록실, 할로겐, 알킬 또는 알콕실이다.

일부 구체예에서, 상기 비타민 D 화합물은 식 (II)로 표현되거나, 이의 약학적으로 허용가능한 염이다:

(II)

여기에서,

c는 단일 결합 또는 이중 결합이고;

R^1a은 수소, 트리-알킬 실릴, 또는 1 내지 3개의 할로겐, 하이드록실, 시아노 또는 -NR'R" 부분으로 선택적으로 치환된 알킬이고;

R^2a은 수소, 하이드록실, -O-트리알킬 실릴, 또는 1 내지 3개의 할로겐, 하이드록실, 시아노 또는 -NR'R" 부분으로 선택적으로 치환된 알킬, 알콕실, 또는 알케닐이고;

R^3a 및 R^4a는, c가 이중 결합일 경우, 부재하거나, c가 단일 결합일 경우, 각각 독립적으로 수소, 하이드록실, 할로겐, 알콕실, 또는 1 내지 3개의 하이드록실 또는 할로겐 부분으로 선택적으로 치환된 알킬이고;

R^3b, R^4b, R^5a, R^6a, R^7a 및 R^8a는 각각 독립적으로 수소, 하이드록실, 할로겐, 알콕실, 또는 1 내지 3개의 하이드록실 또는 할로겐 부분으로 선택적으로 치환된 알킬이거나, R^6a, R^7a 및 R^8a 중의 임의의 두 개는 결합하여 3- 내지 7-원 카르보사이클릭 고리를 형성할 수 있다.

일부 구체예에서, 상기 비타민 D 화합물은 1,25-디하이드록시비타민 D3; 1,25-디하이드록시-16-엔-23-인-콜레칼시페롤; 1,25-디하이드록시-16-엔-인-콜레칼시페롤; 1α-하이드록시비타민 D3; 1α,24-디하이드록시비타민 D3, 또는 MC 903이다.

일부 구체예에서, 상기 비타민 D 화합물은 1,25-디하이드록시비타민 D3; 1,25-디하이드록시-16-엔-23-인-콜레칼시페롤; 1,25-디하이드록시-16-엔-인-콜레칼시페롤; 1α-하이드록시비타민 D3; 1α,24-디하이드록시비타민 D3, 또는 MC 903이 아니다.

일부 구체예에서, 상기 약학 조성물을 계량 스프레이 기구를 이용하여 투여한다.

본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 국소 투여용으로 적합하고, 상술된 방법 및 이의 구체예에서 사용된 치료학적으로 유효한 양의 비타민 D 화합물을 포함하는 약학 조성물을 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 국소 투여용으로 적합한 약학 조성물을 포함하는 키트로서, 화학요법 유발 탈모증을 예방하거나 완화하기 위한 치료학적으로 유효한 양의 비타민 D 화합물; 및 상술된 방법 및 이의 구체예 중 하나를 실시하기 위한 설명서를 포함하는 키트를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 비타민 D 화합물을 0.1-400 ㎍/mL의 농도로 포함하는 약학 조성물을 포함하는 계량 스프레이 기구를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 계량 스프레이 기구는 4회 중 1회 또는 다수회 동안 약 0.25-ml 투여량을 분주하도록 설계된다. 다른 구체예에서, 상기 계량 스프레이 기구는 112회 동안 약 0.25-ml 투여량을 분주하도록 설계된다.

다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 화학요법 유발 탈모증을 예방하거나 완화하는 방법을 제공하는데, 이는 (1) 화학요법을 받기로 예정되거나 받고 있는 중인 대상체를 선택하고; (2) 상기 화학요법 전에 및/또는 이와 동시에 상기 대상체의 두피에 치료학적으로 유효한 양의 비타민 D 화합물을 포함하는 약학 조성물을 국소적으로 투여함으로써, 이루어진다.

일부 구체예에서, 상기 대상체를 선택하는 것은 자궁 경부암, 자궁 내막암, 난소암, 난관암, 1차 복막 암종, 연조직 육종, 또는 골 육종이 있는 대상체를 선택하는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 대상체를 선택하는 것은 유방암이 있는 대상체를 선택하는 것을 포함한다. 또는, 상기 대상체를 선택하는 것은 유방암이 없는 대상체를 선택하는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 대상체를 선택하는 것은 진행성 또는 재발성 암이 있는 대상체를 선택하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 암은 전이성, 국부 진행성, 또는 절제불가능성이다. 일부 구체예에서, 암은 단계에 의하여 선택할 수 있다(예컨대, 상기 대상체를 특정 단계 또는 단계의 범위에 있는 특정 암에 대하여 선택할 수 있음).

일부 구체예에서, 상기 대상체를 선택하는 것은 다음 중 하나 이상을 포함한다: 적어도 18세인 인간인 대상체를 선택하는 것; 탈모증 또는 경도 탈모증의 흔적이 없는 대상체를 선택하는 것; 세포자멸적이지 않은 모낭을 가지는 대상체를 선택하는 것; 국소 투여 시작 전 14일 이내에 Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) 기능 점수가 0 또는 1점을 가지는 대상체를 선택하는 것; 국소 투여 시작 전 72시간 내에 1500 세포/mm³ 초과의 기준 호중구 수(baseline neutrophil count)를 가지는 대상체를 선택하는 것; 및 국소 투여 시작 전 72시간 내에 정상치 상한(upper limit of normal, ULN) 이하의 혈청 칼슘 레벨을 가지는 대상체를 선택하는 것.

일부 구체예에서, 상기 대상체를 선택하는 것은 다음 중 하나 이상을 포함한다: 국소 투여 시작 전 3개월 이상 동안 비스포스포네이트 또는 칼슘 저하 요법으로 관리되고 칼슘 대사 안정성에 대하여 증명하지 않는다면, 국소 투여 시작 4주 이내에 칼슘 저하 요법, 또는 칼슘 레벨에 영향을 줄 수 있는 약물을 받지 않은 대상체를 선택하는 것; 국소 투여 시작 30일 이내에 고칼슘혈증 또는 비타민 D 독성의 이력이 없는 대상체를 선택하는 것; 국소 투여 시작 30일 이내에 협심증, 심근 경색, 또는 울혈성 심부전 또는 정신 질환의 치료를 위하여 입원한 이력이 없는 대상체를 선택하는 것; 국소 투여 시작 전 30일 이상 동안 비타민 D 보충제를 섭취하고 국소 투여에 걸쳐 동일한 투여량을 유지하지 않는다면, 국소 투여 동안 비타민 D 보충제를 섭취하지 않은 대상체를 선택하는 것; 6개월 초과 동안 안정적 치료를 받은 대상체를 제외하고, 국소 투여 시작 4주 이내에 칼슘 레벨에 영향을 주는 것으로 알려진 약물로 치료받고 있지 않은 대상체를 선택하는 것; 6 개월 초과 동안 안정적인 투여량을 받고 치료 중에 있는 대상체를 제외하고, 티아지드 또는 푸로세미드 이뇨제를 받고 있지 않은 대상체를 선택하는 것; 고칼슘혈증 또는 신장 결석이 없는 대상체를 선택하는 것; 및 National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events(NCU-CTCAE) v4.0에 따른 탈모증 등급이 2 이상이 아니거나 유의한 모발 손실 또는 모발 파손이 없는 대상체를 선택하는 것.

일부 구체예에서, 상기 화학요법은 탁산 계열 항암 화학요법으로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상의 탁산 화학요법을 포함한다. 일부 구체예에서, 탁산 계열 항암 화학요법은 파클리탁셀, 나노입자 알부민 결합 파클리탁셀, 및/또는 도세탁셀 항암 화학요법을 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 탁산 계열 항암 화학요법은 파클리탁셀, 도세탁셀, 폴리글루타메이트 폴리머에 결합된 파클리탁셀, 도코사헥사에논산에 결합된 파클리탁셀, 종양-활성 탁솔 전구 약물, 파클리탁셀-안지오펩-2 접합체 (ANG1005), 파클리탁셀 폴리글루멕스(polyglumex), 코폴리머 복합 파클리탁셀, 리포좀 캡슐화 파클리탁셀, 비타민 E 에멀젼 내 탁솔, 및 이들의 등가물로 구성되는 군에서 선택된 하나 이상의 탁산 화학요법을 포함한다.

일부 구체예에서, 탁산 계열 항암 화학요법은, 안트라사이클린(아드리아마이신/독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 이다루비신, 발루비신), 5-FU, 타목시펜, 이리노테칸, 카르보플라틴, 에토포시드, 사이톡산/사이클로포스파미드, 시스플라틴, 에를로티니브(타르세바), 겜시타빈, 스타우로스포린, 빈크리스틴, 이마티니브(글리벡), 게피티니브(이레사), 소라페니브, 다사티니브, 닥티노마이신, 헥사메타멜라민(HMM, 알트레타민), 이포스파미드, 블레오마이신, 메토트렉세이트, 빈데신, 비노렐빈, 토포테칸, 암사크린, 시타라빈, 부설판, 멜팔란, 빈블라스틴, 로무스틴(CCNU), 티오테파, 겜시타빈, 카르무스틴(BCNU), 미트록산트론, 미토마이신 C, 프로카바진, 6-머캅토푸린, 스렙토조토신, 플루다라빈, 랄티트렉세이트(토무덱스), 카페시타빈, 및 이들의 등가물로 구성되는 군에서 선택된 하나 이상의 추가 치료제를 포함한다.

일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법 전에 및/또는 이와 동시에 대상체에 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 4-7일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 적어도 2주 (즉, 14일) 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 시작 또는 완료 후 적어도 3 개월 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 후 화학요법 유발 탈모증의 개시 전에, 대상체에 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 1일 2회 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 1일 2회 투여는 약 10-14 시간 간격을 가진다.

일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 약학 조성물을 약 1.0 mL 투여량으로 투여하는 것으로, 두피의 사분면 각각에 약 0.25 mL을 계량 스프레이 기구를 이용하여 투여한다.

일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 비타민 D 화합물을 5, 10, 또는 20 ㎍/mL의 농도로 투여하는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 두피에 비타민 D 화합물을 하루에 약 10-40 ㎍ 투여하는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 실질적으로 비타민 D 화합물의 피부 전달을 회피하는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 약학 조성물은 수계 제형이 아니다.

일부 구체예에서, 약학 조성물은 약 40%(w/w)의 프로필렌 글리콜 및 약 60%(w/w)의 무수 에탄올의 비이클 내 비타민 D 화합물을 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 약학 조성물은 약 40%(w/w)의 프로필렌 글리콜 및 약 60%(w/w)의 무수 절대 에탄올 (200 proof, U.S.)의 비이클; 또는 약 30%(w/w)의 프로필렌 글리콜, 약 10%(w/w)의 에톡시디글리콜 또는 트랜스큐톨, 및 약 60%(w/w)의 무수 절대 에탄올(200 proof, U.S.)의 비이클을 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 약학 조성물을 국소적으로 투여하는 것이 상기 화학요법의 효능을 실질적으로 감소시키지 않는다.

일부 구체예에서, 상기 비타민 D 화합물을 칼시트리올이다.

(I)

여기에서,

a 및 b는 각각 독립적으로 단일 또는 이중 결합이고;

R²은 수소, 하이드록실, -O-트리알킬 실릴, 또는 1 내지 3개의 할로겐, 하이드록실, 시아노 또는 -N R'R" 부분으로 선택적으로 치환된 알킬, 알콕실, 또는 알케닐이고;

R' 및 R"는 각각 독립적으로 수소, 하이드록실, 할로겐, 알킬 또는 알콕실 이다.

(II)

여기에서,

c는 단일 결합 또는 이중 결합이고;

한 양태에서, 본 발명은 국소 투여용으로 적합하고, 상기 양태 중 하나 이상 및 상기 구체예에 따른, 화학요법 유발 탈모증을 예방하거나 완화하기 위한 치료학적으로 유효한 양의 비타민 D 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

한 양태에서, 본 발명은 국소 투여용으로 적합한 약학 조성물을 포함하는 키트로서, 화학요법 유발 탈모증을 예방하거나 완화하기 위한 치료학적으로 유효한 양의 비타민 D 화합물; 및 상기 양태 중 하나 이상 및 상기 구체예에 따른, 화학요법 유발 탈모증을 예방하거나 완화하기 위한 방법을 실시하기 위한 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.

본원에서 (상기 및 하기) 기술된 모든 구체예는, 해당 사항이 있을 경우, 본 발명의 양태 중 하나에서만 기술된 구체예 및 본 발명의 상이한 양태에서 기술된 구체예를 포함하여, 임의의 기타 구체예와 함께 결합될 수 있음을 알아야 한다.

본 발명에 따르면 화학요법 유발 탈모증의 예방 또는 완화가 제공된다.

도면의 간단한 설명
도 1은 3명의 피부 공여자에 전체에 걸쳐 총 흡수 및 질량 수지(mass balance) 결과, 및 단일 적용으로부터 48시간 동안 온전한 인간 사체 피부로부터의 칼시트리올의 분포를 나타낸다. 결과는 총 질량(ng/cm²)으로 평균±SE로서 로그 단위(log scale)로 나타낸다.
도 2는 성장 배지 중에 존재하는 칼시트리올의 상이한 농도에 대한 HEKa 세포의 예시적 성장 곡선을 도시한다. 칼시트리올 농도의 로그 스케일임을 주의한다.
도 3은 췌장 암종 세포주 PaCa2에 의한 예시적 성장 곡선을 나타낸 것인데, 이 성장 곡선은 0.1㎍/mL의 칼시트리올의 존재에 반응하지 않는다.
도 4a 및 4b는 증가하는 농도의 칼시트리올의 존재하에, Hep-G2 세포 및 MCF-7 세포 각각의 성장을 나타낸다.
도 5는 칼시트리올의 부재(◆) 또는 0.1㎍/mL의 칼시트리올의 존재(x) 하에서, EGFR Tyr 키나제 억제제인 에를로티니브(타르세바)의 투여) 곡선을 나타낸다.
도 6은 칼시트리올의 부재(◆) 또는 0.1㎍/mL의 칼시트리올의 존재(x) 하에서, 다른 EGFR Tyr 키나제 억제제인 게피티니브(이레사)의 투여 곡선을 나타낸다.
도 7은 칼시트리올의 부재(◆) 또는 0.1㎍/mL의 칼시트리올의 존재(x) 하에서, 소라피니브의 투여 곡선을 나타낸다. 소라피니브는 몇몇 키나제(Raf, VEGF-R2, c-kit, PDGR-R)를 억제하는 것으로 알려졌다.
도 8은 칼시트리올의 부재(◆) 또는 0.1㎍/mL의 칼시트리올의 존재(x) 하에서, 다사티니브의 투여 곡선을 나타낸다. 다사티니브는 BCR/ABL Tyr 키나제를 억제한다.
도 9는 칼시트리올의 부재(◆) 또는 0.1㎍/mL의 칼시트리올의 존재(x) 하에서, 스타우로스포린의 투여 곡선을 나타낸다. 스타우로스포린은 상대적으로 비특이적 키나제 억제제이다.
도 10은 칼시트리올의 부재(◆) 또는 0.1㎍/mL의 칼시트리올의 존재(x) 하에서, 시스플라틴의 투여 곡선을 나타낸다. 시스플라틴은 DNA 알킬화제이다.
도 11은 칼시트리올의 부재(◆) 또는 0.1㎍/mL의 칼시트리올의 존재(x) 하에서, 카르보플라틴의 투여 곡선을 나타낸다. 카보플라틴 또한 DNA 알킬화제이다.
도 12는 칼시트리올의 부재(◆) 또는 0.1㎍/mL의 칼시트리올의 존재(x) 하에서, 이리노테칸의 투여 곡선을 나타낸다.
도 13은 칼시트리올의 부재(◆) 또는 0.1㎍/mL의 칼시트리올의 존재(x) 하에서, 파클리탁솔의 투여 곡선을 나타낸다.
도 14는 칼시트리올의 부재(◆) 또는 0.1㎍/mL의 칼시트리올의 존재(x) 하에서, 5-FU의 투여 곡선을 나타낸다.
도 15는 칼시트리올의 부재(◆) 또는 0.1㎍/mL의 칼시트리올의 존재(x) 하에서, 겜시타빈의 투여 곡선을 나타낸다.
도 16은 칼시트리올의 부재(◆) 또는 0.1㎍/mL의 칼시트리올의 존재(x) 하에서, 독소루비신의 투여 곡선을 나타낸다.
도 17은 칼시트리올의 부재(◆) 또는 0.1㎍/mL의 칼시트리올의 존재(x) 하에서, 타목시펜의 투여 곡선을 나타낸다.
도 18은 0.1㎍/mL 칼시트리올이 5-FU으로부터 정상 케라티노사이트 HEKa를 보호하는 반면, 암 세포에 대한 5- FU의 ED₅₀ 값에 뚜렷하게 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
도 19는 칼시트리올이 암 세포주 SkBr-3에 대한 독소루비신의 세포독성 효과를 뚜렷하게 변경시키지 않음을 나타낸다.
도 20a는 에토포시드를 받은 스프라그 다울리(Sprague Dawley) 래트에서, 칼시트리올의 국소 제형이 투여량-의존 방식으로 화학요법-유발된 탈모증(CIA)으로부터 보호한다는 것을 나타낸다. 좌측 패널: 에토포시드만 받는 래트; 중간 패널: 에토포시드를 받고 국소 제형의 0.1㎍ 칼시트리올을 국소 투여 받은 래트; 우측 패널: 에토포시드를 받고 국소 제형의 0.3 mg 칼시트리올을 국소 투여받은 래트. 도 20b는 착색된 롱 에반스(Long Evans) 래트에서 유사한 결과를 나타낸다.
도 21은 칼시트리올 국소 제형(총 투여량 0.2㎍)이 롱 에반스 래트를 사이클로포스파미드(CTX)-유발 탈모증으로부터 보호한다는 것을 나타낸다.
도 22a는 칼시트리올 국소 제형(총 용량 0.2㎍)이 롱 에반스 래트를 CTX-독소루비신 병용 화학요법-유발 탈모증으로부터 보호한다는 것을 나타낸다. 도 22b는 시타라빈-독소루비신 병용 화학요법-유발 탈모증 래트에서 칼시트리올 국소 제형으로 처리한 유사한 보호 결과를 나타낸다. 시타라빈 단독으로 처리된 래트에서 칼시트리올 국소 제형의 보호 효과는 도 22c에 나타낸다.
도 23은 국소 칼시트리올 국소 제형(총 투여량 0.2㎍)이 MIAC51(녹색백혈병 세포)가 주입된 롱 에반스 래트를 CTX-유발 탈모증으로부터 보호한다는 것을 나타낸다.
도 24는 MIAC51(녹색백혈병 세포)가 주입된 롱 에반스 래트에서 수행된 생체내 실험에서, 칼시트리올 국소 제형이 암 세포를 화학요법으로부터 보호하지 않는다는 것을 나타낸다.
도 25a 및 25b는 미니피그 표피의 각질층 및 표피의 나머지로부터 회수된 칼시트리올(ng/mg)의 추정 수준을 나타낸다. 양은 회수된 칼시트리올의 평균±SD로서 표현된다. nd= 전혀 검출되지 않음, na= 적용불가.
도 26은 표피 중 회수된 칼시트리올 조직 수준과 3 내지 100㎍/mL 칼시트리올 농도 범위로 적용된 칼시트리올 농도 사이의 근사 선형 상관관계를 나타낸다.
도 27은 사이클로포스파미드를 받은 녹색백혈병 래트의 제1 성장기 과정에 대한 칼시트리올의 효과를 나타낸다. 도 27a는 사이클로포스파미드 단독으로 받은 래트를 나타내고, 도 27b는 사이클로포스파미드와 비이클을 받은 래트를 나타내고, 도 27c는 사이클로포스파미드 및 칼시트리올을 받은 래트를 나타낸다.
도 28은 사이클로포스파미드를 받은 녹색백혈병 래트의 제2 성장기 과정에 대한 칼시트리올의 효과를 나타낸다. 좌측에서 우측으로, 사이클로포스파미드 단독으로 처리된 래트, 사이클로포스파미드 및 비이클로 처리된 래트, 및 사이클로포스파미드 및 칼시트리올로 처리된 래트.
도 29는 독소루비신과 병용된 사이클로포스파미드를 받은 녹색백혈병 래트의 제1 성장기 과정에 대한 칼시트리올의 효과를 나타낸다. 도 29a는 사이클로포스파미드와 독소루비신 단독을 받은 래트를 나타내고, 도 29b는 사이클로포스파미드, 독소루비신, 및 비이클을 받은 래트를 나타내고, 도 29c는 사이클로포스파미드, 독소루비신, 및 칼시트리올을 받은 래트를 나타낸다.
도 30은 독소루비신과 병용된 사이클로포스파미드를 받은 녹색백혈병 래트의 제2 성장기 과정에 대한 칼시트리올의 효과를 도시한다. 좌측에서 우측으로, 사이클로포스파미드와 독소루비신 단독으로 처리된 래트, 사이클로포스파미드, 독소루비신, 및 비이클로 처리된 래트, 및 사이클로포스파미드, 독소루비신, 및 칼시트리올로 처리된 래트.
도 31은 독소루비신 및 시타라빈과 병용된 사이클로포스파미드를 받은 녹색백혈병 래트의 제1 성장기 과정에 대한 칼시트리올의 효과를 나타낸다. 도 31a는 사이클로포스파미드, 독소루비신, 및 시타라빈 단독을 투여한 래트를 나타내고, 도 31b는 사이클로포스파미드, 독소루비신, 시타라빈, 및 비이클을 투여한 래트를 나타내고, 도 31c는 사이클로포스파미드, 독소루비신, 시타라빈, 및 칼시트리올을 받은 래트를 나타낸다.
도 32는 독소루비신 및 시타라빈과 병용된 사이클로포스파미드를 투여한 녹색백혈병 래트의 제2 성장기 과정에대한 칼시트리올의 효과를 도시한다. 좌측에서 우측으로, 사이클로포스파미드, 독소루비신 및 시타라빈 단독으로 처리된 래트, 사이클로포스파미드, 독소루비신, 시타라빈 및 비히클로 처리된 래트 및 사이클로포스파미드, 독소루비신, 시타라빈 및 칼시트리올로 처리된 래트.
도 33은 파클리탁셀 및 에토포시드와 병용된 사이클로포스파미드를 받은 녹색백혈병 래트의 제1 성장기 과정에 대한 칼시트리올의 효과를 나타낸다. 도 33a는 사이클로포스파미드, 파클리탁셀 및 에토포시드 단독을 받은 래트를 나타내고, 도 33b는 사이클로포스파미드, 파클리탁셀, 에토포시드 및 비이클을 받은 래트를 나타내고, 도 33c는 사이클로포스파미드, 파클리탁셀, 에토포시드 및 칼시트리올을 받은 래트를 나타낸다.
도 34는 파클리탁셀 및 에토포시드와 병용된 사이클로포스파미드를 투여한 녹색백혈병 래트의 제2 성장기 과정에 대한 칼시트리올의 효과를 나타낸다. 좌측에서 우측으로, 사이클로포스파미드, 파클리탁셀 및 에토포시드 단독으로 처리된 래트, 사이클로포스파미드, 파클리탁셀, 에토포시드 및 비이클로 처리된 래트, 및 사이클로포스파미드, 파클리탁셀, 에토포시드 및 칼시트리올로 처리된 래트.
도 35는 파클리탁셀 및 에토포시드와 병용된 독소루비신을 받은 녹색백혈병 래트의 제1 성장기 과정에 대한 칼시트리올의 효과를 나타낸다. 도 35a는 독소루비신, 파클리탁셀, 및 에토포시드 단독을 받은 래트를 나타내고, 도 35b는 독소루비신, 파클리탁셀, 에토포시드 및 비이클을 받은 래트를 나타내고, 도 35c는 독소루비신, 파클리탁셀, 에토포시드 및 칼시트리올을 받은 래트를 나타낸다.
도 36은 파클리탁셀 및 에토포시드와 병용된 독소루비신을 받은 녹색백혈병 래트의 제2 성장기 과정에 대한 칼시트리올의 효과를 나타낸다. 좌측에서 우측으로, 독소루비신, 파클리탁셀, 및 에토포시드 단독으로 처리된 래트, 독소루비신, 파클리탁셀, 에토포시드 및 비이클로 처리된 래트, 및 독소루비신, 파클리탁셀, 에토포시드 및 칼시트리올로 처리된 래트.

발명의 상세한 설명

본원에 기술된 발명은, 화학요법-유발 탈모증을 예방하거나 완화할 수 있는 비타민 D 화합물의 국소 제형의 발견에 부분적으로 기초한다. 일부 구체예에서, 상기 제형은 보다 깊은 진피층으로 전달 및/또는 이에 축적되는 것을 실질적으로 회피하면서, 선택적으로 피부의 표피층으로 전달되거나 이에 축적될 수 있다. 이는 화학요법 치료를 경험한 소정 환자에게서 유리할 수 있는데, 비타민 D 화합물의 보다 깊은 축적은 화학요법 용법의 효능을 감소시킬 수 있다. 이러한 국소 제형은 또한 과량의 비타민 D 화합물의 존재에 의해 부정적으로 영향을 받을 수 있는 의학적 상태를 갖는 환자, 예를 들어, 신장 결석을 앓고 있는 환자에게서 유리할 수 있으며, 이 상태는 소정 비타민 D 화합물에 의한 칼슘 동원시에 악화될 수 있다. 따라서, 이러한 환자에서, 비타민 D 화합물의 이상적인 전달은 혈관이 풍부한 진피층 보다는 피부의 표피 층으로의 최소 유효 투여량의 국소 전달이어야 한다.

본 발명은 또한, 비타민 D 화합물이 비교적 낮은 농도/용량에서 정상 케라티노사이트에 대한 완만한 성장 촉진 효과를 나타내는 반면, 비교적 고농도/용량에서 동일 세포 상에서 성장 억제 효과를 나타낸다는 결과에 부분적으로 기초한다. 따라서, 본 발명은 바람직하지 않은 성장 억제 효과를 야기하지 않고 탈모증에 대한 최적의 보호 효과를 나타내는 방법 및 약제학적 조성물을 제공한다. 따라서, 다양한 구체예에서, 본 발명은 화학요법 이전에 또는/및 이와 동시에, 바람직하지 않은 성장 억제 효과를 야기하지 않고 탈모증에 대한 최적의 보호 효과를 제공하는 투여량으로 비타민 D 화합물을 국소적으로 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 추가로, 비타민 D 화합물이 정상 케라티노사이트에서 다수의 표적 유전자의 발현을 활성화하거나 저해하여, 특정 치료학적 적용에 가장 적합한 비타민 D 화합물을 선택하고 유사한 생물학적 활성을 갖는 추가의 비타민 D 유사체를 동정하기 위한 기준을 제공한다는 결과에 기초한다. 따라서 다양한 실시예에서, 본 발명은 화학요법 전 또는 동시에 비타민 D 화합물을 국소적으로 투여하는 것을 포함한다.

임의의 특정 이론에 결부됨이 없이, 본 발명의 제형은 화학요법 시약에 대한 약물 간섭을 최소화함에 있어서, 유리할 수 있다. 피부의 진피층은 혈관이 풍부하고, 이 층으로의 국소적 약물 침투는 전신적으로 전달된 화학요법 시약에 대해 약물 간섭을 일으켜 바람직하지 않은 암 세포 보호 효과를 일으킬 수 있다.

따라서, 한 양태에서, 본 발명은 대상체에서 화학요법 유발 탈모증을 예방하거나 완화하는 방법을 제공하는데, 이는 (1) 화학요법을 받을 예정이거나 받고 있는 대상체를 선택하고; 상기 화학요법 전에 및/또는 이와 동시에, 치료학적으로 유효한 양의 비타민 D 화합물을 포함하는 약학 조성물을 상기 대상체의 두피에 투여여, 상기 대상체에서 화학요법-유발 탈모증을 예방하거나 완화하는 것에 의하여 이루어진다.

용어 "탈모증"은 개체의 머리 또는 신체로부터 비의지적인 완전한 또는 부분적인 모발 손실을 포함하고, 원형 탈모증(AA), 완전 탈모증(AT), 전신성 탈모증(AU), 또는 화학요법-유발 탈모증(CIA)을 포함한다. 원형 탈모증은 확산 원형 탈모증, 단발성 원형 탈모증, 다발성 원형 탈모증 및 수발 원형 탈모증을 포함한다. 일부 구체예에서, 탈모증은 남성형 탈모증(남성형 대머리(alopecia androgenetica) 또는 남성 대머리 (male baldness)) 또는 화학요법 후 탈모증(PCA)은 포함하지 않는다.

탈모증은 머리 또는 신체로부터, 때로는 대머리 정도까지의 모발 손실에 대한 의학적 기술이다. 체모의 공통적인 심미적 탈모와 달리, 탈모증, 예를 들어, 남성형 탈모증은 비의지적이고 달갑지 않다. 그러나, 이는 또한 자기 자신의 머리를 뽑는 정신적인 충동(발모증(Trichotillomania)) 또는 자발적인 일상적 헤어 스타일링의 예상치 못한 결과(과도하게 단단하게 묶은 머리 또는 땋은 머리로부터 오는 기계적 "견인성 탈모증" 또는 가성(caustic) 모발 릴렉서 용액 또는 뜨거운 헤어 고데기로 인한 두피 화상)에 의해 유발될 수 있다. 일부 경우에, 탈모증은 철 결핍과 같은, 기본적인 의학적 우려의 징후이다.

모발 손실이 한 영역에서만 일어날 경우, "원형 탈모증"이 된다. 사람 원형 탈모증에서, 모발은 신체의 일부 또는 모든 영역으로부터, 보통은 두피로부터 손실된다. 이는 특히 초기 단계에 두피에 대머리 스폿(bald spots)을 유도하기 때문에, 때래로 스폿 대머리라고 한다. 1% 내지 2%의 경우에, 상태는 전체 두피(완전탈모증) 또는 전체 표피(전신성 탈모증)로 확산될 수 있다.

AA와 유사하고 유사한 원인을 갖는 상태가 기타 종에서도 발생한다. 가장 통상적인 형태의 원형 탈모증은 두피에 하나 이상의 원형 스폿의 모발 손실을 포함한다. 모발은 또한 전체 두피에 걸쳐 더욱 확산적으로 손실될 수 있고, 이러한 경우, 이 상태를 확산 원형 탈모증이라 한다. 단발성 원형 탈모증은 머리 어디에서든 발생할 수 있는 단지 하나의 스폿 대머리를 나타낸다. 다발성 원형 탈모증은 다수의 모발 손실 영역을 일컫는다. 이 질환은 턱수염에만 제한될 수 있는데, 이러한 경우, 수발 원형 탈모증이라 한다. 개체가 그/그녀의 두피에서 모발을 모두 손실할 경우, 전체 원형 탈모증이라 한다.

"전신성 탈모증"은 신체에서 완전한 모발 손실이 일어나는 경우이고, 이는 화학요법과 관련된 모발 손실이 때때로 전체 신체에 어떻게 영향을 미치는 지와 유사하다.

"남성형 탈모증"(또한 안드로겐성 탈모증 또는 남성형 대머리(alopecia androgenetica)라고도 알려짐)은 여성 및 남성 모두, 침팬지 및 오랑우탄에서 존재하는 모발 손실의 일반적인 형태이다. 특히 남성에게서, 이 상태는 또한 남성 패턴 대머리라고 통상적으로 알려져 있다. 두 관자놀이 위로부터 시작하여 명확한 패턴으로 모발이 손실된다. 경시적으로, 헤어라인이 후퇴하여 독특한 "M" 형상을 형성한다. 또한, 모발은 머리의 정수리에서는 적어진다. 흔히, 머리의 측면 및 후부 주위의 모발의 가장자리가 남거나, 상태가 완전한 대머리로 진행할 수 있다. 여성의 모발 손실 패턴은 남성 패턴 대머리와는 다르다. 여성에게 있어서, 모발은 머리 전반에 걸쳐 모두 더 얇아지고, 헤어라인은 후퇴하지 않는다. 여성에게 있어서 남성형 탈모증은 좀처럼 전체 대머리를 일으키지 않는다.

용어 "탈모증을 예방하는"은 탈모증 발생 전에 탈모증과 관련된 모발 손실을 저지시키거나 억제하는 것을 포함한다.

용어 "탈모증을 완화하는" 또는 "탈모증을 치료하는"은 탈모증과 관련된 모발 손실의 중증도를 감소시키거나 탈모증과 관련된 모발 손실 정도를 감소시킴을 포함한다. 일부 양태에서, 탈모증을 완화하거나 치료하는 것은 탈모증의 경감을 포함한다.

용어 "투여하는"은 개체에게 하나 이상의 투여량의 비타민 D 화합물을 탈모증을 예방하거나 치료하기에 유효한 양으로 제공하는 것을 포함한다. 비타민 D 화합물의 투여를 위한 주어진 프로토콜에서 최적인 투여율은, 이용된 특정 화합물, 제형화된 특정 조성물, 적용 방식, 특정 투여 위치 등과 관련하여, 수행된 통상적인 용량 측정 시험을 이용하여 당업자에 의해 확인할 수 있다.

용어 "국소적으로 투여하는"은 개체의 피부에 하나 이상의 투여량의 비타민 D 화합물을 탈모증을 치료하거나 예방하기에 효과적인 양으로 전달하는 것을 포함한다.

피부는 많은 전문화된 세포 및 구조를 함유하고 있으며, 환경과 접하여 보호 장벽으로 기능, 적절한 체온을 유지, 환경으로부터 지각 정보를 수집, 면역계에서의 활성과 같은, 각종 중요한 기능을 갖는다.

피부는 3개의 층- 표피, 진피 및 피하 조직을 갖는다.

표피는 피부의 외각층이다. 두께는 상이한 형태의 피부에서 다양하다. 눈꺼풀에서 약 0.05mm로 가장 얇고, 손바닥 및 발바닥에서 약 1.5mm로 가장 두껍다. 하단에서 상단으로, 표피는 5개의 층: 기저층, 유극층, 과립층, 투명층(일부 피부에서 선택적임) 및 각질층을 함유한다.

기저층은 표피 중의 케라티노사이트의 바닥층이고, 끊임없이 표피 세포를 재생키는 책임이 있다. 이 층은 아주 빈번하게 분할하는 1줄의 미분화 원주 줄기 세포를 포함한다. 세포의 반은 분화하고, 다음 층으로 이동하여 숙성 과정을 시작한다. 나머지 반은 기저 층에 머무르고, 반복적으로 분할하여 기저층을 보충한다. 유극층(유극 세포층이라고도 함)으로 이동하는 세포는 원주형에서 다각형으로 변한다. 이 층에서, 세포는 케라틴을 합성하기 시작한다. 과립층, 또는 입자층의 세포는 이들의 핵을 잃고, 세포질 물질의 짙은 클럼프(clump)를 특징으로 한다. 케라틴 단백질로서의 이 층에는 많은 활성이 있고, 방수 지질이 생산되고 조직화된다. 투명층은 단지 두꺼운 피부에 존재하여 각질층과 과립층 사이의 마찰 및 전단력을 감소시키는 것을 돕는다. 각질층 중의 세포는 코르네오사이트(각질 세포)로 알려져 있다. 이들 세포는 평평하고, 층에 강도를 제공할 뿐만 아니라 물의 흡수를 허용하는 케라틴 단백질로 주로 구성된다. 각질층의 구조는 단순하게 보이지만, 이층은 매우 중요한 기능인 피부의 완전성 및 수화도를 유지시키는데 책임이 있다.

또한, 진피는 피부의 위치에 따라 두께가 다양하다. 이는 눈꺼풀에서 약 0.3mm이고 등에서 약 3.0mm이다. 진피는 층에서가 아니라 전반에 걸쳐 존재하는 3가지 유형의 조직; 콜라겐, 탄성 조직, 및 망상 섬유로 구성된다. 진피의 두 층은 유두층 및 망상층이다. 상부 유두층은 콜라겐 섬유의 얇은 배열을 함유한다. 하부 망상층은 보다 두껍고, 피부 표면에 평행하게 배열된 두꺼운 콜라겐 섬유로 이루어진다. 진피는 다수의 전문화된 세포 및 구조를 함유한다. 예를 들어, 혈관 및 신경은 이 층을 통과한다. 모낭도 각 소낭에 부착된 기모근과 함께 이 층에 위치한다. 모낭의 일부도 손상된 표피를 재생시킬 수 있는 줄기 세포를 함유한다. 줄기 세포는 진피-표피 접합부(dermal-epidermal junction, DEG)에 존재할 수 있다. 피지(오일) 선 및 아포크린(냄새) 선은 소낭과 관련이 있다. 이 층은 또한 에크린(땀) 선을 함유하지만, 이들은 모낭과 관련되지 않다. 피하 조직은 더 큰 혈관 및 신경을 수용하는 지방 및 결합 조직의 층이다. 이 층은 피부 자체 및 신체의 온도를 조절하는데 중요하다. 이 층의 크기는 신체 전반에 걸쳐, 그리고 사람마다 다양하다.

따라서, 본원에서 사용된 "표피"는 표피와 진피 사이의 접합층(예를 들면, 진피-표피 접합부, 즉 DEJ) 및 표피층을 재생하는 줄기 세포(예를 들면, 소포 줄기 세포 및 표피 줄기 세포)를 포함하는, 층 5개 모두(존재하는 경우)를 포함한다.

본원에서 사용된, 구 "화학요법을 받을 예정이거나 받고 있는 대상체를 선택하는"은 의사에 의하여 화학요법이 처방되었거나 의사의 관리 하에 화학요법을 받고 있는 환자를 선택하는 것을 포함하거나, 본원에 기술된 하나 이상의 기준을 만족하는 환자를 선택하는 것을 더 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 상기 대상체를 선택하는 것은 유방암이 있는 대상체를 선택하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 고형 종양은 암종, 흑색종, 육종, 및 림프종으로 구성되는 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 고형 종양은 유방암, 방광암, 결장암, 직장암, 자궁 내막암, 난소암, 난관암, 1차 복막 암종, 신장(신장 세포) 암, 폐암, 췌장암, 전립선 암, 갑상선암, 피부암, 골암 , 뇌암, 자궁 경부암, 간암, 위암, 입 및 경구 암, 신경 아세포종, 고환암, 자궁암, 연조직 육종, 골 육종, 및 외음부 암으로 구성되는 군에서 선택된다. 소정 구체예에서, 고형 종양은 삼중 음성형 유방암을 포함하여, 유방암이다. 소정 구체예에서, 고형 종양은 흑색종, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 및 피부 T 세포 림프종(CTCL)으로 구성되는 군에서 선택된다. 한 구체예에서, 고형 종양은 자궁 경부암, 자궁 내막암, 난소암, 난관암, 1차 복막 암종, 연조직 육종, 또는 골 육종으로 구성되는 군에서 선택된다.

일부 구체예에서, 상기 대상체를 선택하는 것은 자궁 경부암이 있는 대상체를 선택하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 대상체를 선택하는 것은 자궁 내막암이 있는 대상체를 선택하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 대상체를 선택하는 것은 난소암이 있는 대상체를 선택하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 대상체를 선택하는 것은 난관암이 있는 대상체를 선택하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 대상체를 선택하는 것은 1차 복막 암종이 있는 대상체를 선택하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 대상체를 선택하는 것은 연조직 육종이 있는 대상체를 선택하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 대상체를 선택하는 것은 골 육종이 있는 대상체를 선택하는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 대상체를 선택하는 것은 진행성 또는 재발성 암이 있는 대상체를 선택하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 암, 예컨대, 진행성 암은 전이성, 국부 진행성, 또는 절제불가능성일 수 있다. 일부 구체예에서, 암은 단계에 의하여 선택할 수 있다(예컨대, 상기 대상체를 특정 단계 또는 단계의 범위에 있는 특정 암에 대하여 선택할 수 있음).

일부 구체예에서, 암은 로마 숫자로 단계화할 수 있는데, 예를 들면: 0 단계: 전암상태(carcinoma in situ); I 단계: 암이 신체의 한 부분에 국소화되어 있음(I 단계 암은 충분히 작다면 수술로 제거할 수 있음); II 단계: 암이 국소적으로 진행성임(II 단계 암은 화학 요법, 방사선, 또는 수술로 치료할 수 있음); III 단계: 암이 국소적으로 진행성임(암이 II 단계 또는 III 단계로 지정되는지는 암의 특정 형태에 달려 있음; 예컨대, 호지킨 질환에서, II 단계는 격막의 한쪽에서만 림프절이 발생됨을 나타내는 반면에, III 단계는 격막의 위와 아래에서 림프절이 발생됨을 나타냄. 그러므로 II 단계 및 III 단계의 특별한 기준은 진단에 따라 다름. IIII 단계는 화학 요법, 방사선, 또는 수술로 치료할 수 있음); IV 단계: 암이 종종 전이되거나, 다른 기관으로 또는 신체 전체에 걸쳐 확산됨(IV 단계 암은 화학 요법, 방사선, 수술, 또는 임상 시험으로 치료할 수 있음).

일부 구체예에서, Union for International Cancer Control (UICC)와 American Joint Committee on Cancer (AJCC)에서 승인된, 암은 종양, 절, 전이(Tumer, Node, Metastasis; TNM)에 의하여 단계화될 수 있다. TNM 시스템은 1차 종양(T)의 크기 및/또는 정도(도달), 근처 림프절(N)에 확산되는 양, 및 전이(M) 또는 암 세포의 신체의 다른 부분으로 확산됨으로써 형성된 2차 종양의 존재에 기초한다. 숫자는 각 문자에 첨가되어 1차 종양의 크기 및/또는 정도 및 확산된 암의 정도를 나타낸다. 1차 종양(T) - TX: 1차 종양을 측정할 수 없음; T0: 1차 종양의 흔적 없음; Tis: 전암 상태(CIS; 비정상적인 세포가 존재하나 이웃 조직으로 확산되어 있지 않음; 암이 아니라도, CIS는 암이 될 수 있거나 종종 전지 전이 암(preinvasive cancer)이라 함); T1, T2, T3, T4: 1차 종양의 크기 및/또는 정도. 국소 림프절(N) - NX: 국소 림프절을 측정할 수 없음; N0: 국소 림프절을 포함하지 않음; N1, N2, N3: 국소 림프절의 정도(림프절의 수와 위치). 원격 전이(M) - MX: 원격 전이를 측정할 수 없음; M0: 원격 전이가 없음; M1: 원격 전이가 존재함.

한 구체예에서, 상기 대상체는 적어도 18세인 인간이다. 한 구체예에서, 상기 대상체는 탈모증 또는 경도 탈모증의 흔적이 없다. 한 구체예에서, 상기 대상체는 세포자멸적이지 않은 모낭을 가진다. 한 구체예에서, 상기 대상체는 국소 투여 시작 전 14일 이내에 Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) 기능 점수가 0 또는 1점이다. 한 구체예에서, 상기 대상체는 국소 투여 시작 전 72시간 내에 1500 세포/mm³ 초과의 기준 호중구 수(baseline neutrophil count)를 가진다. 한 구체예에서, 상기 대상체는 국소 투여 시작 전 72시간 내에 정상치 상한(upper limit of normal, ULN) 이하의 혈청 칼슘 레벨을 가진다. 한 구체예에서, 상기 대상체는 국소 투여 시작 전 3개월 이상 동안 비스포스포네이트 또는 칼슘 저하 요법으로 관리되고 칼슘 대사 안정성에 대한 증거를 보여주지 못한다면, 상기 대상체는 국소 투여 시작 4주 이내에 칼슘 저하 요법, 또는 칼슘 레벨에 영향을 줄 수 있는 약물을 받지 않는다. 한 구체예에서, 상기 대상체는 국소 투여 시작 30일 이내에 고칼슘혈증 또는 비타민 D 독성의 이력이 없디. 한 구체예에서, 상기 대상체는, 국소 투여 시작 30일 이내에 협심증, 심근 경색, 또는 울혈성 심부전 또는 정신 질환의 치료를 위하여 입원한 이력이 없다. 한 구체예에서, 상기 대상체가 국소 투여 시작 전 30일 이상 동안 비타민 D 보충제를 섭취하고 국소 투여에 걸쳐 동일한 투여량을 유지하지 않는다면, 상기 대상체는 국소 투여 동안 비타민 D 보충제를 섭취하지 않는다. 한 구체예에서, 상기 대상체는 6개월 초과 동안 안정적 치료를 받은 대상체를 제외하고, 국소 투여 시작 4주 이내에 칼슘 레벨에 영향을 주는 것으로 알려진 약물로 치료받고 있지 않다. 한 구체예에서, 상기 대상체는, 6 개월 초과 동안 안정적인 투여량을 받고 치료받은 대상체를 제외하고는, 티아지드 또는 푸로세미드 이뇨제를 받고 있지 않다. 한 구체예에서, 상기 대상체는 고칼슘혈증 또는 신장 결성이 없다. 한 구체예에서, National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events (NCU-CTCAE) v4.0 당 탈모증 등급이 2 이상이 아니거나 유의한 모발 손실 또는 모발 손상이 없다.

한 구체예에서, 대상체는 상기 열거된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. 9, 10. 11, 12, 13, 또는 14 개 기준 중 어느 하나의 조합에 기반한다.

용어 "개체" 또는 “대상체”는 탈모증을 나타낼 수 있는 동물을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 개체는 포유동물, 예를 들어, 고양이, 개, 영장류, 마우스, 래트, 래빗, 소, 말, 염소, 양, 돼지 등이다. 일부 양태에서, 포유동물은 영장류, 예를 들어, 침팬지, 사람, 고릴라, 보노보, 오랑우탄, 원숭이 등이다. 또 다른 양태에서, 포유동물은 사람이다. 일부 양태에서, 개체 또는 대상체는 성 및/또는 연령에 의하여 더 카테고리화한다.

본원에서 사용되는 용어 “화학요법”은 화학 수단에 의한 치료적 처리를 포함한다. 화학요법은 탈모증, 또는 이의 특정 클래스, 카테고리, 타입, 서브-타입, 또는 변형을 일으킬 수 있는 임의의 화학요법을 본질적으로 포함할 수 있다. 다양한 구체예에서, 화학요법은 항암 화학요법이다.

일부 구체예에서, 화학요법은 탁산 계열 항암 화학요법을 포함한다. "탁산 계열 화학요법"은 특정 비이클, 둘 이상의 탁산 요법의 조합, 탁산 요법 및 추가 요법의 조합, 등등을 이용하는 탁산 요법을 포함할 수 있다. 비슷하게, "파클리탁셀 계열 화학요법" "nab-파클리탁셀 계열 화학요법", 및 "도세탁셀 계열 화학요법"과 같은 용어는 파클리탁셀/nab-파클리탁셀/도세탁셀 요법, 특정 비이클을 이용하는 파클리탁셀/nab-파클리탁셀/도세탁셀 요법, 둘 이상의 파클리탁셀/nab-파클리탁셀/도세탁셀 치료법의 조합, 및 파클리탁셀/nab-파클리탁셀/도세탁셀 요법과 추가 요법의 조합 등을 나타내는데 사용될 수 있다.

일부 구체예에서, 탁산 계열 항암 화학요법은 파클리탁셀, 나노입자 알부민-결합 (“nab”) 파클리탁셀, 및/또는 도세탁셀 항암 화학요법을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 탁산 계열 항암 화학요법은 탁산 치료법 (예, 항암 화학요법) 및 추가 치료법 (예, 항암 화학요법)의 조합이다.

한 구체예에서, 탁산 계열 항암 화학요법은 파클리탁셀을 포함하지 않는다. 한 구체예에서, 탁산 계열 항암 화학요법은 도세탁셀을 포함하지 않는다. 한 구체예에서, 탁산 계열 항암 화학요법은 파클리탁셀 또는 도세탁셀을 포함하지 않는다.

일부 구체예에서, 탁산 계열 암 요법은, 탁산 치료법이 다음 중 하나 이상을 포함하는 탁산 치료법을 포함한다: 파클리탁셀, 도세탁셀, 나노입자 알부민-결합 nab 파클리탁셀, 폴리글루메이트 폴리머에 결합된 파클리탁셀, 도코사헥사논산에 결합된 파클리탁셀, 종양-활성 탁솔 전구 약물, 파클리탁셀-안지오펩-2 접합체 (ANG1005), 파클리탁셀 폴리글루멕스, 코폴리머 조합 파클리탁셀, 리포좀 캡슐화 파클리탁셀, 비타민 E 에멀젼 내 탁솔, 및 이의 등가물.

일부 구체예에서, 탁산 계열 항암 화학요법은 파클리탁셀을 포함한다. 일부 구체예에서, 탁산 계열 항암 화학요법은 도세탁셀을 포함한다. 일부 구체예에서, 탁산 계열 항암 화학요법은 나노입자 알부민-결합 nab 파클리탁셀을 포함한다. 일부 구체예에서, 탁산 계열 항암 화학요법은 폴리글루타메이트 폴리머에 결합된 파클리탁셀을 포함한다. 일부 구체예에서, 탁산 계열 항암 화학요법은 도코사헥사논산에 결합된 파클리탁셀을 포함한다. 일부 구체예에서, 탁산 계열 항암 화학요법은 종양-활성 탁솔 전구 약물을 포함한다. 일부 구체예에서, 탁산 계열 항암 화학요법은 파클리탁셀-안지오펩-2 접합체(ANG1005)를 포함한다. 일부 구체예에서, 탁산 계열 항암 화학요법은 파클리탁셀 폴리글루멕스를 포함한다. 일부 구체예에서, 탁산 계열 항암 화학요법은 코폴리머 조합 파클리탁셀을 포함한다. 일부 구체예에서, 탁산 계열 항암 화학요법은 리포좀 캡슐화 파클리탁셀을 포함한다. 일부 구체예에서, 탁산 계열 항암 화학요법은 비타민 E 에멀젼 내 탁솔 및 이의 등가물을 포함한다.

일부 구체예에서, 탁산 계열 항암 화학요법은 추가의 화학요법을 포함한다. 예를 들면, 추가의 화학요법은 다음 중 적어도 하나를 포함할 수 있다: 안트라사이클린(아드리아마이신/독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 이다루비신, 발루비신), 5-FU, 타목시펜, 이리노테칸, 카르보플라틴, 에토포시드, 사이톡산/사이클로포스파미드, 시스플라틴, 에를로티니브(타르세바), 겜시타빈, 스타우로스포린, 빈크리스틴, 이마티니브(글리벡), 게피티니브(이레사), 소라페니브, 다사티니브, 닥티노마이신, 헥사메타멜라민(HMM, 알트레타민), 이포스파미드, 블레오마이신, 메토트렉세이트, 빈데신, 비노렐빈, 토포테칸, 암사크린, 시타라빈, 부설판, 멜팔란, 빈블라스틴, 로무스틴(CCNU), 티오테파, 겜시타빈, 카르무스틴(BCNU), 미트록산트론, 미토마이신 C, 프로카바진, 6-머캅토푸린, 스렙토조토신, 플루다라빈, 랄티트렉세이트(토무덱스), 카페시타빈, 및 이들의 등가물.

일부 구체예에서, 암은 전이성 유방암을 포함하며, 화학요법은 파클리탁셀 계열, nab-파클리탁셀, 또는 도세탁셀 계열 화학요법을 포함하는데, 각각은 선택적으로 카르보플라틴과 병용한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 방법 및 약학 조성물은 실질적으로 화학요법, 특히 전신 화학요법의 효능을 감소시키지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 방법 및 약학 조성물은 화학요법의 효능을 향상시킨다. 용어 "공투여된 화학요법제의 효능을 간섭하지 않고"는 비타민 D 화합물이, 하나 이상의 화학요법제와 함께 투여될 경우, 하나 이상의 화학요법제의 생물학적 또는 치료학적 활성을 방해하거나 하나 이상의 화학요법제가 그의 원하는 생물학적 또는 치료학적 활성을 수행하는 것을 방해하지 않는 상황을 포함한다. 용어 "공투여되는 화학요법제의 효능을 감소시키지 않고"는 비타민 D 화합물이, 하나 이상의 화학요법제와 함께 투여될 경우, 하나 이상의 화학요법제의 생물학적 또는 치료학적 활성을 감소시키지 않는 상황을 포함한다.

본 발명의 방법 및 약학 조성물은 모낭 또는 진피 유두에 대한 세포독성 효과를 갖거나, 그렇지 않으면, 탈모증을 유도할 수 있는 임의의 화학요법제 또는 화학요법제들의 조합과 함께 사용될 수 있다. 용어 "화학요법 제", "화학요법" 및 "화학요법 용법"은 안트라사이클린(아드리아마이신/독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 이다루비신, 발루비신), 5-FU, 타목시펜, 이리노테칸, 파클리탁셀(탁솔), 카르보플라틴, 에토포시드, 사이톡산/ 사이클로포스파미드, 시스플라틴, 에를로티니브(타르세바), 베바시주마브, 겜시타빈, 스타우로스포린, 빈크리스틴, 이마티니브(글리벡), 게피티니브(이레사), 소라페니브, 다사티니브, 닥티노마이신, 헥사메타멜라민(HMM, 알트레타민), 이포스파미드, 블레오마이신, 메토트렉세이트, 도세탁셀(탁소테르), 빈데신, 비노렐빈, 토포테칸, 암사크린, 시타라빈, 부설판, 멜팔란, 빈블라스틴, 로무스틴(CCNU), 티오테파, 겜시타빈, 카르무스틴(BCNU), 미트록산트론, 미토마이신 C, 프로카바진, 6-머캅토푸린, 스렙토조토신, 플루다라빈, 랄티트렉세이트(토무덱스), 카페시타빈, 및 이의 등가물들을 포함한다.

일부 구체예에서, 화학요법은 전신 화학요법이다.

바람직하게는 본 발명의 방법 및 약학 조성물은 실질적으로 화학요법, 특히 전신 화학요법의 효능을 감소시키지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 방법 및 약학 조성물은 화학요법의 효능을 향상시킨다.

또한, 본 발명의 방법 및 약학 조성물은 모발 감소(thinning)를 일으킬 수 있는 임의의 화학요법 호르몬 치료 또는 생물학적 치료와 함께 사용될 수 있다.

일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법 전에 및/또는 이와 동시에 대상체에 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법과 동시에 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법 개시 전에 및/또는 이와 동시에 대상체에 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 비타민 D 화합물은 화학요법제와 공투여한다. 용어 "화학요법제와 공투여되는"은 화학요법제와 실질적으로 동시에 비타민 D 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 비타민 D 화합물은 화학요법제와 함께 공투여될 수 있는데; 비타민 D 화합물을 먼저 투여한 직후에 화학요법제를 투여하거나, 화학요법제를 먼저 투여한 직후에 비타민 D 화합물을 투여할 수 있다.

일부 기타 양태에서, 비타민 D 화합물은 탈모증 발생 전(예, 모발 손실 전)에 개체에게 투여된다. 소정 구체예에서, 비타민 D 화합물은 화학요법 개시 후, 탈모증 개시 전에 개체에게 투여된다. 기타 구체예에서, 개체는 아직 탈모증 증상을 나타내지 않았다(예, 탈모증은 개시되지 않음). 용어 "치료학적을 유효한 양"은 개체에서 탈모증을 예방하거나 치료하는데 필요하거나 충분한 비타민 D 화합물의 양을 포함한다. 유효한 양은 대상체의 크기 및 무게, 질병의 유형 등과 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 당업자는 상술한 인자를 연구할 수 있었고, 과도한 실험 없이 유효한 양의 비타민 D 화합물에 대한 측정을 수행할 수 있다.

일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 시작 (즉, 개시) 전 4-7일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21, 28, 35, 40, 또는 52일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21, 28, 35, 40, 또는 52일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 5±2 일, 즉, 3~7일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 7±2일, 즉, 5~9일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 7~14일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 8~14일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 9~14일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 10~14일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 11~14일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 12~14일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 13~14일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 예를 들면, 한 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 적어도 4일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 적어도 5일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 적어도 6일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 적어도 7일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 적어도 8일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 적어도 9일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 적어도 10일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 적어도 11일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 적어도 12일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 적어도 13일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 적어도 14일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

예를 들면, 한 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 적어도 15일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 적어도 16일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 적어도 17일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 적어도 18일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 적어도 19일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 적어도 20일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 적어도 21일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

한 구체예에서, 약학 조성물은 화학요법의 개시의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일 전에 국소적으로 투여한다. 한 구체예에서, 약학 조성물은 화학요법의 개시 적어도 9일 전에 국소적으로 투여한다. 한 구체예에서, 약학 조성물은 화학요법의 개시 적어도 18일 전에 국소적으로 투여한다. 한 구체예에서, 약학 조성물은 화학요법의 개시 적어도 11일 전에 국소적으로 투여한다. 한 구체예에서, 약학 조성물은 화학요법의 개시 적어도 12일 전에 국소적으로 투여한다. 한 구체예에서, 약학 조성물은 화학요법의 개시 적어도 13일 전에 국소적으로 투여한다. 한 구체예에서, 약학 조성물은 화학요법의 개시 적어도 14일 전에 국소적으로 투여한다.

임의의 특정 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 두피 또는 모발이 있는 피부의 임의의 다른 영역에 비타민 D를 적용하면, 모발 성장기에서 복잡한 퇴행기로의 모발 단계 전환에서 요구되는, 모낭 분화를 유도한다고 여겨진다. 모낭이 화학요법의 세포독성에 내성을 갖도록, 두피 모낭에서 요구되는 분화 및 퇴행기로의 전환을 완료하는 데에 칼시트리올 최소 치료 기간이 요구된다는 것을, 출원인이 동물 모델(예, 래트)에서 실시한 실험에서 알아냈다. 특히, 화학요법의 개시 적어도 4일 전에 매일 칼시트리올을 적용하는 것이 임의의 보호 효과를 얻는데 필요하며, 화학요법 5일전에 중등 정도의 보호 효과를, 1주일까지는 보호 효과가 증가한다는 것을, 출원인이 래트 모델을 이용하여 알아냈다. 인간에 있어서, 두피의 모낭은 동물의 모낭보다 실질적으로 더 긴 성장기를 갖는다. 실제로, 언제라도, 인간 두피에서 모낭의 적어도 90%는 성장기에 있다. 짧은 치료 기간은, 모낭을 화학요법의 세포독성에 더 민감하게 하는, 두피 모낭에서 퇴행기를 유도하는데 충분하지 않는 것으로 여겨진다. 성장기에서 퇴행기로의 전환을 완료하고 화학요법-유발 탈모증을 적절히 예방하기 위하여, 본 발명의 방법에 따라 화학요법 시작하기 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일 전, 바람직하게는 적어도 2주 이상 전에, 국소적 트리올 적용을 시작하며, 이는 퇴행기를 유도하여 CIA으로부터 보호할 것이다. 매일 지속적으로 적용하면, 퇴행기기 유지되고, 다중 투여량의 화학요법 (예, 탄산을 함유하는) 용법의 투여를 통하여 보호를 연장할 것이다.

따라서, 일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 적어도 2주 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 적어도 5~7일 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 전 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8주 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 기간 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 시작 또는 완료 후 적어도 3 개월 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 화학요법의 개시 또는 완료 후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개월 동안 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 약학 조성물을 국소적으로 투여하는 것은 1일 2회 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 1일 2회 투여는 약 10~14 시간 간격을 가진다. 일부 구체예에서, 1일 2회 투여는 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16 시간의 간격을 가진다.

소정 구체예에서, 본 발명의 비타민 D 화합물은 개체에게 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 6주, 약 8주, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 7개월, 약 8개월, 약 9개월, 약 10개월, 약 11개월 또는 약 1년 동안 투여된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 비타민 D 화합물은 치료 기간 동안 매일 또는 격일로 또는 3 일마다 한번씩 투여될 수 있다.

소정 구체예에서, 본 발명의 비타민 D 화합물은 각 치료 날에 하루에 1번, 하루에 2번, 하루에 3번 투여된다.

소정 구체예에서, 본 발명의 비타민 D 화합물의 각 투여를 개체의 동일 위치에 또는 여러 상이한 위치에 적용한다. 상이한 위치에 적용될 경우, 각 위치에 대한 투여량은 동일하거나, 피부 두께 및 약물 침투 차이(만약에 있다면)와 같은, 인자에 기초하여 조절될 수 있다.

소정 구체예에서, 화학요법 개시 때에 발생할 수 있는 임의의 CIA를 예방하거나 이의 중증도를 감소시키기 위하여, 화학 요법 개시 전 연속하여 2주 동안 매일 하루에 2번 두피에 국소적으로 투여한다.

일부 구체예에서, 상술된 방법에서 투여용 약학 조성물의 부피는 0.5~1.5 mL 또는 0.5~2 mL이다. 한 구체예에서, 상기 부피는 0.5, 1.0, 1.5, 또는 2 mL이다. 한 구체예에서, 상기 부피는 1 mL이다.

일부 구체예에서, 약학 조성물을 계량 스프레이 도구를 이용하여 투여된다.

일부 구체예에서, 국소 제형의 비타민 D 화합물의 농도는 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 또는 400 ㎍/mL로 구성되는 군에서 선택된다. 소정 구체예에서, 국소 제형의 비타민 D 화합물의 농도는 약 0.1~25, 0.1~15, 0.1~10, 1~50, 1~45, 1~35, 1~30, 1~25, 1~10, 5~20, 5~15, 15~25, 25~35, 또는 35~45 ㎍/mL이다. 한 구체예에서, 국소 제형의 비타민 D 화합물의 농도는 약 1~20 ㎍/mL이다. 한 구체예에서, 국소 제형의 비타민 D 화합물의 농도는 약 5 ㎍/mL이다. 한 구체예에서, 국소 제형의 비타민 D 화합물의 농도는 약 10 ㎍/mL이다. 한 구체예에서, 국소 제형의 비타민 D 화합물의 농도는 약 20 ㎍/mL이다.

일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은, 계량 스프레이 도구를 이용하여, 1.0 mL 투여량의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 약학 조성물을 국소적으로 투여하는 것은 약학 조성물을 약 1.0 mL 투여량으로 투여하는 것으로, 두피의 사분면 각각에 약 0.25 mL을 계량 스프레이 기구를 이용하여 투여한다.

일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 비타민 D 화합물을 5, 10, 또는 20 ㎍/mL의 농도로 투여하는 것을 포함한다. 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 비타민 D 화합물을 약학 조성물에서 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 또는 400 ㎍/mL의 농도로 투여하는 것을 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 두피에 비타민 D 화합물을 하루에 약 10~40 ㎍의 1일 총 투여량으로 투여하는 것을 포함한다. 소정 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 두피에 비타민 D 화합물을 하루에 약 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 80, 100, 1~100, 10~20, 10~30, 10~50, 20~30, 20~40, 20~50, 또는 40~50 ㎍의 1일 총 투여량으로 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 두피에 비타민 D 화합물을 하루에 약 1~100, 10~90, 20~80, 30~70, 1~20, 10~20, 10~30, 10~40, 10~50, 10~60, 20~30, 20~40, 20~50, 20~60, 20~70, 30~40, 30~50, 30~60, 40~50, 40~60, 40~70, 40~80, 50~60, 50~70, 50~80, 50~90, 60~70, 60~80, 60~90, 60~100, 70~80, 70~90 또는 70~100 ㎍의 1일 총 투여량으로 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 두피에 비타민 D 화합물을 하루에 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 ㎍의 1일 총 투여량으로 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 두피에 비타민 D 화합물을 하루에 약 10 ㎍의 1일 총 투여량으로 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 두피에 비타민 D 화합물을 하루에 약 20 ㎍의 1일 총 투여량으로 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 두피에 비타민 D 화합물을 하루에 약 40 ㎍의 1일 총 투여량으로 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 두피에 비타민 D 화합물을 하루에 약 60 ㎍의 1일 총 투여량으로 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 두피에 비타민 D 화합물을 하루에 약 80 ㎍의 1일 총 투여량으로 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 두피에 비타민 D 화합물을 하루에 약 100 ㎍의 1일 총 투여량으로 투여하는 것을 포함한다.

한 구체예에서, 상기 1일 총 투여량은 단일 투여량으로 투여된다. 한 구체예에서, 상기 1일 총 투여량은 2회의 개별 투여량으로 투여된다. 한 구체예에서, 1일 총 투여량으로 투여하는 것은 3회의 개별 투여량으로 투여된다. 한 구체예에서, 상기 1일 총 투여량은 4회의 개별 투여량으로 투여된다.

한 구체예에서, 약학 조성물은 비타민 D 화합물을 1일 총 투여량 10~40 ㎍으로 하루에 2회 투여되며, 하루 2회의 개별 투여량 각각은 5~20 ㎍이다. 한 구체예에서, 약학 조성물은 비타민 D 화합물을 1일 총 투여량 10㎍으로 하루에 2회 투여되며, 하루 2회의 개별 투여량 각각은 5㎍이다. 한 구체예에서, 약학 조성물은 비타민 D 화합물을 1일 총 투여량 20㎍으로 하루에 2회 투여되며, 하루 2회의 개별 투여량 각각은10㎍이다. 한 구체예에서, 약학 조성물은 비타민 D 화합물을 1일 총 투여량 40㎍으로 하루에 2회 투여되며, 하루 2회의 개별 투여량 각각은 20 ㎍이다. 한 구체예에서, 약학 조성물은 비타민 D 화합물을 1일 총 투여량 60㎍으로 하루에 2회 투여되며, 하루 2회의 개별 투여량 각각은 30 ㎍이다. 한 구체예에서, 약학 조성물은 비타민 D 화합물을 1일 총 투여량 80㎍으로 하루에 2회 투여되며, 하루 2회의 개별 투여량 각각은 40 ㎍이다. 한 구체예에서, 약학 조성물은 비타민 D 화합물을 1일 총 투여량 100㎍으로 하루에 2회 투여되며, 하루 2회의 개별 투여량 각각은50 ㎍이다.

본 발명의 비타민 D 화합물은 이를 필요로 하는 개체에게 약 0.001㎍ 내지 5㎍의 칼시트리올/cm²에 등가인 용량 부피로 국소적으로 투여될 수 있다. 소정 구체예에서, 그 범위는 약 0.01㎍ 내지 0.5㎍의 칼시트리올/cm² 또는 약 0.1 ㎍ 내지 0.5㎍의 칼시트리올/cm²이다.

용어 "칼시트리올에 등가인 용량 부피"는 0.001㎍ 내지 5㎍ 칼시트리올/cm²로서의 생물학적 및/또는 치료학적 활성과 실질적으로 유사한 생물학적 및/또는 치료학적 활성을 갖는 비타민 D 화합물의 양을 포함한다.

용어 "유효한 농도"는 개체에서 탈모증을 예방하거나 치료하는데 필요하거나 충분한, 국소 제형의 비타민 D 화합물의 농도를 포함한다. 소정 구체예에서, 국소 제형의 비타민 D 화합물의 농도는 약 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 또는 400 ㎍/mL이다. 소정 구체예에서, 국소 제형의 비타민 D 화합물의 농도는 약 0.1~25, 0.1~15, 0.1~10, 1~50, 1~45, 1~35, 1~30, 1~25, 1~10, 5~20, 5~15, 15~25, 25~35, 또는 35~45 ㎍/mL이다. 한 구체예에서, 국소 제형의 비타민 D 화합물의 농도는 약 1~20 ㎍/mL이다. 한 구체예에서, 국소 제형의 비타민 D 화합물의 농도는 약 5 ㎍/mL이다. 한 구체예에서, 국소 제형의 비타민 D 화합물의 농도는 약 10 ㎍/mL이다. 한 구체예에서, 국소 제형의 비타민 D 화합물의 농도는 약 20 ㎍/mL이다.

소정 구체예에서, 비타민 D 화합물의 총 투여량은 약 0.025~400 ㎍의 칼시트리올/75kg체중에 등가이다. 소정 구체예에서, 상기 범위는 약 0.1~100 ㎍의 칼시트리올/75kg체중; 약 0.4~25 ㎍의 칼시트리올/75kg체중; 또는 약 1, 2, 3, 5, 또는 10㎍의 칼시트리올/75kg체중이다. 소정 구체예에서, 상기 총 투여량의 하한 범위는 약 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.5, 1, 2, 5, 10, 15, 또는 20 ㎍의 칼시트리올/75kg체중에 등가이다. 소정 구체예에서, 상기 총 투여량의 하한 범위는 약 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 25, 10, 5, 4, 3, 2, 또는 1 ㎍의 칼시트리올/75kg체중에 등가이다. 소정 구체예에서, 칼시트리올의 총 투여량은 약 11~24㎍/75kg체중, 약 26~49㎍/75kg체중, 약 51~74㎍/75kg체중, 또는 약 76~99㎍/75kg체중이다. 한 구체예에서, 칼시트리올의 총 투여량은 약 15~25 ㎍/75kg체중, 16~24 ㎍/75kg체중, 17~23 ㎍/75kg체중, 18~22 ㎍/75kg체중, 19~21 ㎍/75kg체중, 31~49 ㎍/75kg체중, 32~48 ㎍/75kg체중, 33~47 ㎍/75kg체중, 34~46 ㎍/75kg체중, 35~45 ㎍/75kg체중, 36~44 ㎍/75kg체중, 37~43 ㎍/75kg체중, 38~42 ㎍/75kg체중, 39~41 ㎍/75kg체중, 51~69 ㎍/75kg체중, 52~68 ㎍/75kg체중, 53~67 ㎍/75kg체중, 54~66 ㎍/75kg체중, 55~65 ㎍/75kg체중, 56~64 ㎍/75kg체중, 57~63 ㎍/75kg체중, 58~62 ㎍/75kg체중, 59~61 ㎍/75kg체중, 65~74 ㎍/75kg체중, 66~73 ㎍/75kg체중, 67~72 ㎍/75kg체중, 68~71 ㎍/75kg체중, 69~70 ㎍/75kg체중, 76~85 ㎍/75kg체중, 77~84 ㎍/75kg체중, 78~83 ㎍/75kg체중, 79~82 ㎍/75kg체중, 80~81 ㎍/75kg체중, 81~99 ㎍/75kg체중, 82~98 ㎍/75kg체중, 83~97 ㎍/75kg체중, 84~96 ㎍/75kg체중, 85~95 ㎍/75kg체중, 86~94 ㎍/75kg체중, 87~93 ㎍/75kg체중, 88~92 ㎍/75kg체중, 또는 89~91 ㎍/75kg체중이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 개체에게 치료학적으로 유효한 양의 비타민 D 화합물을 포함하는 약학 조성물을 국소적으로 투여함으로써 개체에서 탈모증을 예방하거나 치료하는 방법을 제공하는데, 상기 비타민 D 화합물은, 개체에게 (1) 약 50㎍/mL의 유효한 농도로 국소 투여될 경우, 적어도 약 25일 연속으로 약물 투여 후 독성을 야기하지 않거나; (2) 약 100㎍/mL의 유효한 농도로 국소 투여될 경우, 적어도 약 7일 연속으로 약물 투여 후 독성을 야기하지 않는다.

일부 구체예에서, 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것은 비타민 D 화합물의 진피로의 전달을 실질적으로 회피하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 비타민 D 화합물은 진피에서의 전달 및/또는 축적을 회피하면서, 표피로 국소적으로 전달 및/또는 축적된다.

본원에서 사용된 용어 "실질적으로 진피 전달 및/또는 축적을 회피하는"은, 진피에 비타민 D 화합물의 전달 및/또는 축적에 비교하여, 약 25% 미만의 비타민 D 화합물의 전달 및/또는 축적을 포함하는데, 예를 들면, 진피에 전달되는 양에 비교하여, 약 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만의 비타민 D 화합물의 전달 및/또는 축적 또는 이것이 없음을 포함한다. 일부 구체예에서, 표피로의 전달 및/또는 축적에 비교하여, 약 1% 내지 25%, 예를 들면, 약 1% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 15%, 약 1% 내지 약 10%, 또는 약 1% 내지 약 5%의 비타민 D 화합물이 진피로 전달 및/또는 축적된다. 일부 구체예에서, 비타민 D 화합물은 진피에 전달 및/또는 축적되지 않는다. 일부 구체예에서, 진피에 전달되거나 축적되는 비타민 D 화합물의 양은 약 0.3 ng/cm²미만, 약 0.2 ng/cm² 미만, 또는 약 0.1 ng/cm²미만이다.

일부 구체예에서, 비타민 D 화합물은, 진피에 전달 및/또는 축적되는 것을 회피하면서, 인간 표피, 특히 두피 또는 목 부분의 표피에 전달/축적되도록 제형화된다. 당업자는 실시예 1을 이용하여 진피 및/또는 표피에 전달/축적되는, 비타민 D 화합물의 양 또는 이의 부족을 용이하게 결정할 수 있을 것이다.

용어 “비타민 D 화합물”은 식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다:

(I)

여기에서,

a 및 b는 각각 독립적으로 단일 또는 이중 결합이고;

일부 구체예에서, R¹는 하이드록실, R²는 수소 또는 하이드록실, a는 이중 결합, R⁵는 부존재, X는 -CH₂, b는 이중 결합, R³ 및 R⁴는 부존재, R⁶는 알킬(예, 메틸), 및 R⁷는 알킬(예, 치환된 또는 비치환된 알킬, 예컨대, a 하이드록실 치환된 알킬 또는 사이클로알킬 치환된 알킬, 예컨대 -(CH₂)₃CH(CH₃)₂ 또는 -(CH₂)₃COH(CH₃)₂) 또는 알케닐(예, -CH=CHCH(CH₃)CH(CH₃)₂)이다.

(II)

여기에서,

c는 단일 결합 또는 이중 결합이고;

구체예에서, 상기 화합물은 식(II)로 표현되며, 여기서 R^1a, R^3a, 및 R^4a은 각각 수소이다.

다른 구체예에서, 상기 화합물은 식(II)로 표현되며, 여기서 c는 단일 결합이다.

또 다른 구체예에서, 상기 화합물은 식(II)로 표현되며, 여기서 R^6a 및 R^8a는 둘 다 메틸이다.

한 구체예에서, 상기 화합물은 식(II)로 표현되며, 여기서 R^1a는 수소이다.

다른 구체예에서, 상기 화합물은 식(II)로 표현되며, 여기서 R^2a는 하이드록실이다.

다른 구체예에서, 상기 화합물은 식(II)로 표현되며, 여기서 R^7a는 하이드록실이다.

또 다른 구체예에서, 상기 화합물은 식(II)로 표현되며, 여기서 R^5a는 하이드록실이다.

한 구체예에서, R^1a는 수소, R^2a는 수소 또는 하이드록실, c는 단일 결합, R^3a, R^3b, R^4a, R^4b 및 R^5a는 각각 수소, R^6a 및 R^7a는 각각 알킬(예, 메틸) 및 R^8a는 수소 또는 하이드록실이다.

다른 구체예에서, R^1a는 수소, R^2a는 수소 또는 하이드록실, c는 이중 결합, R^3a 및 R^3b는 부재, R^3b 및 R^4b는 수소, R^5a는 알킬(예, 메틸), R^6a 및 R^7a는 각각 알킬(예, 메틸) 및 R^8a는 수소 또는 하이드록실이다.

한 구체예에서, 비타민 D 화합물은 다음 구조물 또는 이의 입체 이성질체 또는 약학적으로 허용되는 염에서 선택된다:

소정 구체예에서, 비타민 D 화합물은 1,25-디하이드록시비타민 D3; 1,25-디하이드록시-16-엔-23-인-콜레칼시페롤; 1,25-디하이드록시-16-엔-인-콜레칼시페롤; 1α-하이드록시비타민 D3; 1α,24-디하이드록시비타민 D3, 또는 MC 903이다.

다른 구체예에서, 비타민 D 화합물은 1,25-디하이드록시비타민 D3; 1,25-디하이드록시-16-엔-23-인-콜레칼시페롤; 1,25-디하이드록시-16-엔-인-콜레칼시페롤; 1α-하이드록시비타민 D3; 1α,24-디하이드록시비타민 D3, 또는 MC 903이 아니다.

일부 구체예에서, 비타민 D 화합물은 칼시트리올이다.

비타민 D 화합물의 기타 적합한 유사체, 대사산물, 유도체 및/또는 모방체는, 예를 들어, 1,25-디하이드록시비타민 D3(칼시트리올이라고도 알려짐), 1,25-디하이드록시-16-엔-23-인-콜레칼시페롤, 및 다음 특허에 기재된 것들 것 같은, 비타민 D 화합물의 기타 비타민 D 유사체, 상동체, 유사체, 및 유도체를 포함하는데, 특허 각각은 참조로서 전체가 병합되어 있다: 미국 특허 제4,391,802호(1α-하이드록시비타민 D 유도체); 제4,717,721호(콜레스테롤 또는 에르고스테롤 측쇄보다 길이가 더 긴 17개의 측쇄를 갖는 1α-하이드록시 유도체); 제4,851,401호(사이클로펜타노-비타민 D 유사체); 제4,866,048호 및 제5,145,846호(알키닐, 알케닐, 및 알카닐 측쇄를 갖는 비타민 D3 유사체); 제5,120,722호(트리하이드록시칼시페롤); 제5,547,947호(플루오로-콜레칼시페롤 화합물); 제5,446,035호(메틸 치환된 비타민 D); 제5,411,949호(23-옥사-유도체); 제5,237,110호(l9-노르-비타민 D 화합물); 제4,857,518호(하이드록시화된 24-호모-비타민 D 유도체). 기타 적합한 예는, ROCALTROL(Roche Laboratories); CALCIJEX 주사가능한 칼시트리올; EB 1089 (24a,26a,27a,트리호모-22,24-디엔-1α,25-(OH)2-D3, KH 1060 (20-에피-22-옥사-24a,26a,27a-트리호몰라, 25-(OH)2-D3), MC 1288 (1,25-(OH)2-20-에피-D3) 및 MC 903 (칼시포트리올, 1a,24s(OH)2-22-엔-26,27-데하이드로-D3)을 포함하는, Leo Pharmaceuticals의 연구 약물; 1,25-(OH)2-16-엔-D3, 1,25-(OH)2-16-엔-23-인-D3, 및 25-(OH)2-16-엔-23-인-D3을 포함하는 Roche Pharmaceutical의 약물; Chugai Pharmaceuticals의 22-옥사칼시트리올(University of Illinois의 22-옥사-1α,25-(OH)2-D3; 1α-(OH)-D5); 및 ZK 161422 (20-메틸-1,25-(OH)2-D3) 및 ZK 157202 (20-메틸-23-엔-1,25-(OH)2-D3)을 포함하는 Institute of Medical Chemistry-Schering AG의 약물; 1α-(OH)-D2; 1α-(OH)-D3, 1α-(OH)-D4, 25-(OH)-D2; 25-(OH)-D3; 및 25- (OH)-D4을 포함한다. 추가의 예는 lα,25-(OH)2-26,27-d6-D3; lα,25-(OH)2-22-엔-D3; 1α,25-(OH)2-D3; 1α,25-(OH)2-D2; 1α,25-(OH)2-D4; 1α,24,25-(OH)3-D3; 1α,24,25-(OH)3-D2; 1α,24,25-(OH)3-D4; 1α-(OH)-25-FD3; 1α-(OH)-25-FD4; 1α-(OH)-25-FD2; lα,24-(OH)2-D4; lα,24-(OH)2-D3; lα,24-(OH)2-D2; lα,24-(OH)2-25-FD4; lα,24-(OH)2-25-FD3; 1α,24-(OH)2-25-FD2; 1α,25-(OH)2-26,27-F6-22-엔-D3; 1α,25(OH)2-26,27-F6-D3; lα,25S-(OH)2-26-F3-D3; lα,25-(OH)2-24-F2-D3; lα,25S,26-(OH)2-22-엔-D3; lα,25R,26-(OH)2-22-엔-D3; 1α,25-(OH)2-D2; 1α,25-(OH)2-24-에피-D3; lα,25-(OH)2-23-인-D3; lα,25-(OH)2-24R-F-D3; lα,25S,26-(OH)2-D3; lα,24R-(OH)2-25F-D3; 1α,25-(OH)2-26,27-F6-23-인-D3; 1α,25R-(OH)2-26-F3-D3; 1α,25,28-(OH)3-D2; 1α,25-(OH)2-16-엔-23-인-D3; 1α,24R,25-(OH)3-D3; 1α,25-(OH)2-26,27-F6-23-엔-D3; 1α,25R-(OH)2-22-엔-26-F3-D3; lα,25S-(OH)2-22-엔-26-F3-D3; 1α,25R-(OH)2-D3-26,26,26-d3; lα,25S-(OH)2-D3-26,26,26-d3; 및 1α,25R-(OH)2-22-엔-D3-26,26,26-d3을 포함한다. 추가적인 예는 미국 특허 제6,521,608호에서 찾을 수 있는데, 이의 전문은 본원에 참조로서 인용된다. 예컨대, S.S. 특허 제6,503,893호, 제6,482,812호, 제6,441,207호, 제6,410,523호, 제6,399,797호, 제6,392,071호, 제6,376,480호, 제6,372,926호, 제6,372,731호, 제6,359,152호, 제6,329,357호, 제6,326,503호, 제6,310,226호, 제6,288,249호, 제6,281,249호, 제6,277,837호, 제6,218,430호, 제6,207,656호, 제6,197,982호, 제6,127,559호, 제6,103,709호, 제6,080,878호, 제6,075,015호, 제6,072,062호, 제6,043,385호, 제6,017,908호, 제6,017,907호, 제6,013,814호, 제5,994,332호, 제5,976,784호, 제5,972,917호, 제5,945,410호, 제5,939,406호, 제5,936,105호, 제5,932,565호, 제5,929,056호, 제5,919,986호, 제5,905,074호, 제5,883,271호, 제5,880,113호, 제5,877,168호, 제5,872,140호, 제5,847,173호, 제5,843,927호, 제5,840,938호, 제5,830,885호, 제5,824,811호, 제5,811,562호, 제5,786,347호, 제5,767,111호, 제5,756,733호, 제5,716,945호, 제5,710,142호, 제5,700,791호, 제5,665,716호, 제5,663,157호, 제5,637,742호, 제5,612,325호, 제5,589,471호, 제5,585,368호, 제5,583,125호, 제5,565,589호, 제5,565,442호, 제5,554,599호, 제5,545,633호, 제5,532,228호, 제5,508,392호, 제5,508,274호, 제5,478,955호, 제5,457,217호, 제5,447,924호, 제5,446,034호, 제5,414,098호, 제5,403,940호, 제5,384,313호, 제5,374,629호, 제5,373,004호, 제5,371,249호, 제5,430,196호, 제5,260,290호, 제5,393,749호, 제5,395,830호, 제5,250,523호, 제5,247,104호, 제5,397,775호, 제5,194,431호, 제5,281,731호, 제5,254,538호, 제5,232,836호, 제5,185,150호, 제5,321,018호, 제5,086,191호, 제5,036,061호, 제5,030,772호, 제5,246,925호, 제4,973,584호, 제5,354,744호, 제4,927,815호, 제4,804,502호, 제4,857,518호, 제4,851,401호, 제4,851,400호, 제4,847,012호, 제4,755,329호, 제4,940,700호, 제4,619,920호, 제4,594,192호, 제4,588,716호, 제4,564,474호, 제4,552,698호, 제4,588,528호, 제4,719,204호, 제4,719,205호, 제4,689,180호, 제4,505,906호, 제4,769,181호, 제4,502,991호, 제4,481,198호, 제4,448,726호, 제4,448,721호, 제4,428,946호, 제4,411,833호, 제4,367,177호, 제4,336,193호, 제4,360,472호, 제4,360,471호, 제4,307,231호, 제4,307,025호, 제4,358,406호, 제4,305,880호, 제4,279,826, 및 제4,248,791을 참조, 이들 각각의 전체 내용은 참조로서 본원에 병합됨.

이용될 수 있는 또 다른 화합물은 비타민 D 모방체, 예를 들어, 미국 특허 제6,218,430호 및 WO 공보 제2005/037755호에 의해 개시된 비스-아릴 유도체를 포함하는데, 이들 각각의 전체 내용은 참조로서 본원에 병합된다. 본 발명에 적합한 비-세코스테로이드성 비타민 D 모방체 화합물의 추가적인 예는 미국 특허 제6,831,106호; 제6,706,725호; 제6,689,922호; 제6,548,715호; 제6,288,249호; 제6,184,422 호; 제6,017,907호; 제6,858,595호; 및 제6,358,939호에서 찾을 수 있는데, 이들 각각의 전체 내용은 참조로서 본원에 병합된다.

이용될 수 있는 또 다른 적합한 비타민 D3 유사체, 대사산물, 및/또는 유도체는 미국 특허 출원 공보 제2006/0177374호에서 확인된 것들을 포함하는데, 이의 전체 내용은 참조로서 본원에 병합된다.

용어 "비타민 D 유사체"는 구조 및 기능에서 비타민 D와 유사한 화합물을 포함한다. 한 구체예에서, 비타민 D 유사체는 비타민 D3 유사체(예, 구조 및 기능에서 비타민 D3와 유사한 화합물)이다.

용어 "비타민 D 대사산물"은 비타민 D의 대사와 연관된 중간체 및 생성물인 화합물을 포함한다. 한 구체예에서, 비타민 D 대사산물은 비타민 D3 대사산물(예, 비타민 D3의 대사와 연관된 중간체 또는 생성물인 화 합물)이다.

용어 "비타민 D 유도체"는 하나의 원자를 다른 원자 또는 원자들의 그룹으로 치환하여 모 화합물(예, 비타민 D)로부터 발생될 수 있는 화합물을 포함한다. 한 구체예에서, 비타민 D 유도체는 비타민 D3 유도체(예를 들면, 하나의 원자를 다른 원자 또는 원자들의 그룹으로 치환하여 비타민 D3으로부터 발생할 수 있는 화합물)이다

용어 "비타민 D 모방체"는 생물학적 과정에서 비타민 D를 화학적으로 모방할 수 있는 화합물을 포함한다. 한 구체예에서, 비타민 D 모방체는 비타민 D3 모방체(예, 생물학적 과정에서 비타민 D3을 화학적으로 모방할 수 있는 화합물)이다.

비타민 D3은 어간유(fish liver oil) 또는 조사 효모(irradiated yeast)의 섭취 후에 흡수된다. 식물 및 동물 공급원은 단지 불활성 비타민 D 전구체, 7-디하이드로콜레스테롤 또는 에르고스테롤을 함유한다. 7-디하이드로콜레스테롤은 피부에 저장되고, 일광에 의해 비타민 D3으로 전환될 수 있다. 그러나, 비타민 D는, 자외선 조사에 의해 피부에 섭취되든지 형성되든지, 활성 대사산물로 변형되어야 한다. 비타민 D3은 간 효소에 의해 25-하이드록시콜레칼시페롤로 전환된다. 이어서, 신장에서, 두 화합물 1,25-디하이드록시콜레칼시페롤 및 24,25-디하이드록시콜레칼시페롤이 형성된다. 비타민 D 활성 대사산물은 장관으로부터의 칼슘의 흡수, 골 침착, 및 골 재흡수에 중요한 역할을 한다.

본 발명의 비타민 D 화합물은 소정의 공통의 생물학적 활성, 예를 들어, 정상 케라티노사이트(예, HEKa)에서 소정의 표적 유전자 발현을 상향- 또는 하향-조절하는 능력을 통해 부분적으로 케라티노사이트에서 세포자멸을 예방하는 능력을 공유한다. 따라서, 특정 양태에서, 본 발명의 비타민 D 화합물은, 예를 들어, 정상 케라티노사이트(예, HEKa)에서 등가량의 칼시트리올과 유사하거나 동일한 유전자 조절 프로파일을 나타낼 수 있다.

본원에 사용된 "등가량"은 비타민 D 화합물이, 실질적으로 동일한 몰량으로 동일하거나 동등한 생물학적 또는 치료학적 활성을 실질적으로 갖는다면, 동일 몰량을 포함한다. 그러나, 상이한 비타민 D 화합물이 실질적으로 동일하거나 동등한 생물학적 또는 치료학적 활성이 없는 경우, 용어 "등가량"은 기준 비타민 D 화합물(예, 칼시트리올)과 비교할 때 동일한 양의 생물학적 또는 치료학적 활성을 실질적으로 일으키는 비타민 D 화합물을 양을 포함한다.

용어 "유전자 조절 프로파일"은 적합한 대조군과 비교할 때 통계학적으로 유의하게(예를 들면, p<0.05) 조절되는(예를 들면, 상향 또는 하향 조절되는) 유전자의 목록 또는 스펙트럼을 포함한다. 예를 들어, 세포와 비타민 D 화합물을 소정의 시간 동안(예를 들면, 24시간) 접촉하며, 표적 세포는, mRNA 또는 단백질 발현 수준이 모조품/비이클-처리 대조군과 비교하여 조절되는(예를 들면, 상향 또는 하향 조절되는), 유전자의 스펙트럼을 나타낼 수 있다. 검출시에 조절되는(예를 들면, 상향 또는 하향 조절되는) 유전자 목록은 그 특정 순간에 세포의 유전자 발현 프로파일의 스냅샷(snapshot)을 구성한다.

용어 "유사한 유전자 조절 프로파일"은 시험된 표적 유전자 총 수의 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상, 또는 그 이상이 동일한 유전 발현 방향을 실질적으로 나타내는 상황을 포함한다(예를 들어, 각 유전자 중의 상향 또는 하향 조절의 정도 또는 크기가 상이할 수 있지만, 모두 상향 조절되거나 모두 하향 조절됨).

용어 "동일한 유전자 조절 프로파일"은 시험된 거의 모든 표적 유전자가 동일한 유전자 발현 방향을 나타내는 상황을 포함한다(예를 들어, 각 유전자 중의 상향 또는 하향 조절의 정도 또는 크기가 상이할 수 있지만, 모두 상향 조절되거나 모두 하향 조절됨).

한 구체예에서, 본 발명의 비타민 D 화합물은, 발현 수준이 등가량의 기준 비타민 D 화합물(예를 들면, 칼시트리올)에 의해 촉진되는, 하나 이상의 표적 유전자의 발현을 촉진시킨다. 다른 구체예에서, 본 발명의 비타민 D 화합물은, 발현 수준이 등가량의 기준 비타민 D 화합물(예를 들면, 칼시트리올)에 의해 저해되는, 하나 이상의 표적 유전자의 발현을 저해한다.

소정 구체예에서, 본 발명의 비타민 D 화합물은 정상 케라티노사이트에서 단백질의 발현을 조절할 수 있다. 용어 "단백질의 발현을 조절하는"은 정상 케라티노사이트에서 단백질의 상향 조절 및 하향 조절을 포함한다. 일부 구체예에서, 비타민 D 화합물은 HSPA2, HSF4 mRNA, HSPB1 또는 DNAJC6 mRNA의 발현을 조절한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 비타민 D 화합물은 정상 케라티노사이트(예를 들면, HEKa)에서 HSPA2 또는 HSF4 mRNA의 발현을 상향 조절 및/또는 HSPB1 또는 DNAJC6 mRNA의 발현을 하향 조절한다.

소정 구체예에서, 본 발명의 비타민 D 화합물은 정상 케라티노사이트에서 SLC1A1, KCNB2, KCNN4 단백질 또는 SLC1A3 단백질의 발현을 조절한다. 일부 구체예에서, 비타민 D 화합물은 정상 케라티노사이트(예를 들면, HEKa) 에서 SLC1A1, KCNB2, 또는 KCNN4 단백질의 발현을 상향 조절 및/또는 SLC1A3 단백질의 발현을 하향 조절한다.

소정 구체예에서, 본 발명의 비타민 D 화합물은 표 6 및 표 7 중의 하나 이상의 단백질을 조절할 수 있다. 예를 들어, 한 구체예에서, 비타민 D 화합물은, 예를 들어, 정상 케라티노사이트(예, HEKa)에서 표 6 중의 하나 이상의 단백질의 발현을 적어도 약 2배 상향 조절 및/또는 표 7 중의 하나 이상의 단백질의 발현을 적어도 약 2배 하향 조절할 수 있다.

소정 구체예에서, 본 발명의 비타민 D 화합물은 정상 케라티노사이트(예, HEKa)를 비타민 D 화합물에 약 24시간 노출 후, 표 8, 9, 10, 또는 1 중의 어느 것의 하나 이상의 단백질의 과발현을 유도할 수 있다.

소정 구체예에서, 본 발명의 비타민 D 화합물은 정상 케라티노사이트(예를 들면, HEKa)에서 GST, 케라틴 1, 케라 틴 17, 갈렉틴 1, S100 A9(칼프로텍틴), 또는 S100 A13 중의 하나 이상의 과발현을 야기할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "알킬"은 1 내지 20개의 탄소 원자, 예를 들어, 1 내지 7개의 탄소 원자 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 포함하는, 완전히 포화된 분지되거나 비분지된(예, 직쇄 또는 선형) 탄화수소 부분을 포함한다. 알킬 잔기의 대표적인 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, n-헥실, 3-메틸헥실, 2,2-디메틸펜틸, 2,3-디메틸펜틸, n-헵틸을 포함한다.

또한, 용어 "알킬"은 "비치환된 알킬" 및 "치환된 알킬" 모두를 포함한다. 알킬 부분에 대한 치환기의 대표적인 예는 하이드록시, 할로겐, 시아노, 니트로, 사이클로알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 할로겐 또는 아미노(알킬아미노, 디-알킬아미노, 아릴아미노, 디-아릴아미노를 포함함)이다.

본원에서 사용된 용어 "알콕시"는 알킬-O-을 포함하는데, 여기서, 알킬은 상기 정의된 바와 같다. 알콕시 부분의 대표적인 예는, 이에 제한되지 않지만, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 2-프로폭시, 부톡시, tert-부톡시, 펜틸옥시, 헥실옥시, 사이클로프로필옥시-, 사이클로헥실옥시- 등을 포함한다. 일부 구체예에서, 알콕시기는 약 1 내지 7개의 탄소, 예를 들어, 1 내지 4개의 탄소를 갖는다. 용어 알콕시는 치환된 알콕시를 포함한다. 치환된 알콕시기의 예는 할로겐화된 알콕시기를 포함한다. 할로겐 치환된 알콕시 그룹의 예는 플루오로메톡시, 디플루오로메톡시, 트리플루오로메톡시, 클로로메톡시, 디클로로메톡시, 및 트리클로로메톡시이다.

용어 "알콕시알킬"은. 상기 정의된 바와 같은, 알킬기를 포함하는데, 여기서, 알킬기는 알콕시로 치환된다. 더욱이, 용어 "알콕시알킬"은 "비치환된 알콕시알킬" 및 "치환된 알콕시알킬" 모두를 포함한다. 알콕시알킬 부분에 대한 치환기의 대표적인 예는, 이에 제한되지 않지만, 하이드록시, 할로겐, 시아노, 니트로, 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 할로겐 또는 아미노(알킬아미노, 디-알킬아미노, 아릴아미노, 디-아릴아미노를 포함함)를 포함한다.

용어 "알케닐"은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 분지되거나 비분지된 탄화수소를 포함한다. 알케닐 부분의 대표적인 예는, 이에 제한되지 않지만, 비닐, 프로프-1-에닐, 알릴, 부테닐, 이소프로페닐 또는 이소부테닐을 포함한다. 더욱이, 용어 "알케닐"은 "비치환된 알케닐" 및 "치환된 알케닐" 모두를 포함한다. 알케닐 부분에 대한 치환기의 대표적인 예는, 이에 제한되지 않지만, 하이드록시, 할로겐, 시아노, 니트로, 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 할로겐 또는 아미노(알킬아미노, 디-알킬아미 노, 아릴아미노, 디-아릴아미노를 포함함)를 포함한다.

용어 "알키닐"은 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중결합을 갖는 분지되거나 비분지된 탄화수소를 포함한다. 알키닐 부분의 대표적인 예는, 이에 제한되지 않지만, 에티닐, 프로프-1-이닐(프로파길), 부티닐, 이소프로피닐 또는 이소부티닐을 포함한다. 더욱이, 용어 "알키닐"은 "비치환된 알키닐" 및 "치환된 알키닐" 모두를 포함한다. 알키닐 부분에 대한 치환기의 대표적인 예는, 이에 제한되지 않지만, 하이드록시, 할로겐, 시아노, 니트로, 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 할로겐 또는 아미노(알킬아미노, 디-알킬 아미노, 아릴아미노, 디-아릴아미노를 포함함)를 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "사이클로알킬"은 3 내지 12개의 탄소 원자, 예를 들어, 3 내지 8개, 또는 3 내지 7개의 탄소 원자의 포화 또는 불포화 모노사이클릭, 비사이클릭, 또는 트리사이클릭 탄화수소기를 포함한다. 예시적인 모노사이클릭 탄화수소기는, 예를 들어, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로펜테닐, 사이클로헥실 및 사이클로헥세닐을 포함한다. 예시적인 비사이클릭 탄화수소기는, 예를들어, 보르닐, 인딜, 헥사하이드로인딜, 테트라하이드로나프틸, 데카하이드로나프틸, 비사이클로[2.1.1]헥실, 비사이클로[2.2.1]헵틸, 비사이클로[2.2.1]헵테닐, 6,6-디메틸비사이클로[3.1.1]헵틸, 및 2,6,6-트리메틸비사이클로[3.1.1]헵틸, 비사이클로[2.2.2]옥틸을 포함한다. 트리사이클릭 탄화수소기의 예는 예를 들어, 아다만틸을 포함한다.

용어 "사이클로알킬"은 "비치환된 사이클로알킬" 및 "치환된 사이클로알킬" 모두를 포함한다. 사이클로알킬 부분에 대한 치환기의 대표적인 예는, 이에 제한되지 않지만, 하이드록시, 할로겐, 시아노, 니트로, 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 할로겐 또는 아미노(알킬아미노, 디-알킬아미노, 아릴아미노, 디-아릴아미노를 포함함)를 포함한다.

용어 "아릴"은 고리 부분에서 6 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 모노사이클릭 또는 비사이클릭 방향족 탄화수소기를 포함한다. 아릴 부분의 대표적인 예는, 이에 제한되지 않지만, 페닐, 나프틸, 안트라실, 펜안트릴 또는 테트라하이드로나프틸을 포함한다. 더욱이, 용어 아릴은 "비치환된 아릴" 및 "치환된 아릴" 모두를 포함한다. 아릴 부분에 대한 치환기의 대표적인 예는, 이에 제한되지 않지만, 하이드록시, 할로겐, 시아노, 니트로, 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 할로겐 또는 아미노(알킬아미노, 디-알킬아미 노, 아릴아미노, 디-아릴아미노를 포함함)를 포함한다.

용어 "헤테로아릴"은 탄소 원자, 및 O, N 또는 S로부터 선택된 1 내지 5개의 헤테로원자로부터 선택된 5 내지 10 개의 고리 원을 함유하는 모노사이클릭 또는 비사이클릭 헤테로아릴 부분을 포함한다. 헤테로아릴기의 예는, 이에 제한되지 않지만, 티에닐, 푸릴, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 옥사- 2,3-디아졸릴, 옥사-2,4-디아졸릴, 옥사-2,5-디아졸릴, 옥사-3,4-디아졸릴, 티아-2,3-디아졸릴, 티아-2,4-디아졸릴, 티아-2,5-디아졸릴, 티아-3,4-디아졸릴, 3-, 4-, 또는 5-이소티아졸릴, 2-, 4-, 또는 5-옥사졸릴, 3-, 5-, 또는 5-이속사졸릴, 3- 또는 5-1,2,4-트리아졸릴, 4- 또는 5-1,2,3-트리아졸릴, 테트라졸릴, 2-, 3- 또는 4-피리딜, 3- 또는 4-피리다지닐, 3-, 4- 또는 5-피라지닐, 2-피라지닐, 2-, 4- 또는 5-피리미디닐을 포함한다. 헤테로아릴기는 모노-, 비-, 트리- 또는 폴리사이클릭일 수 있다.

용어 "헤테로아릴"은 헤테로방향족 고리가 하나 이상의 아릴, 지환족 또는 헤테로사이클릴 고리에 융합된 기를 추가로 포함하는데, 여기서, 부착 라디칼 또는 부착점은 헤테로방향족 고리 또는 융합된 아릴 고리 상이다. 그러한 헤테로아릴 부분의 대표적인 예는, 이에 제한되지 않지만, 인돌릴, 이소인돌릴, 인다졸릴, 인돌리지닐, 푸리닐, 퀴놀리지닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 신놀리닐, 프탈라지닐, 나프티리디닐, 퀴나졸리닐, 퀴낙살리닐, 페난트리디닐, 페나트롤리닐, 페나지닐, 페노티아지닐, 페녹사지닐, 벤즈이소퀴놀리닐, 티에노[2,3-b]푸라닐, 푸로[3,2- b]-피라닐, 5H-피리도[2,3-d]-o-옥사지닐, 1H-피라졸로[4,3-d]-옥사졸릴, 4H-이미다조[4,5-d] 티아졸릴, 피라지노[2,3-d]피리다지닐, 이미다조[2,1-b] 티아졸릴, 이미다조[1,2-b][1,2,4]트리아지닐, 7-벤조[b]티에닐, 벤족사졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조티아졸릴, 벤족사피닐, 벤족사지닐, 1H-피롤로[1,2-b][2]벤즈아자피닐, 벤조푸릴, 벤조티오페닐, 벤조트리아졸릴, 피롤로[2,3-b]피리디닐, 피롤로[3,2-c]피리디닐, 피롤로[3,2-c]피리디닐, 피롤로[3,2-b]피리디닐, 이미다조[4,5-b]피리디닐, 이미다조[4,5-c]피리디닐, 피라졸로[4,3-d]피리디닐, 피라졸로[4,3-c]피리디닐, 피라졸로[3,4-c]피리디닐, 피라졸로[3,4-d]피리디닐, 피라졸로[3,4-b]피리디닐, 이미다조[1,2-a]피리디닐, 피라졸로[1,5-a]피리디닐, 피롤로[1,2-b]피리다지닐, 이미다조[1,2-c]피리미디닐, 피리도[3,2-d]피리미디닐, 피리도[4,3-d]피리미디닐, 피리도[3,4-d]피리미디닐, 피리도[2,3-d]피리미디닐, 피리도[2,3-b]피라지닐, 피리도[3,4-b]피라지닐, 피리미도[5,4-d]피리미디닐, 피라지노[2,3-b]피라지닐, 또는 피리미도[4,5-d]피리미디닐을 포함한다. 더욱이, 용어 "헤테로아릴"은 "비치환된 헤테로아릴" 및 "치환된 헤테로아릴" 모두를 포함한다.

"아릴" 또는 "헤테로아릴" 기의 방향족 고리는 비치환되거나, 예를 들어, 할로겐, 하이드록시, 시아노, 니트로, 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 알콕시, 사이클로알킬옥시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 아릴옥시, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클릴옥시, 아릴알킬옥시, 헤테로아릴알킬옥시, 헤테로사이클릴알킬옥시, 케톤(알킬카르보닐, 사이클로알킬카르보닐, 알케닐카르보닐, 알키닐카르보닐, 아로일, 아릴알킬카르보닐, 헤테로아릴카르보닐, 헤테로사이클릴카르보닐을 포함함), 에스테르(알콕시카르보닐, 사이클로알킬옥시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, 헤테로아릴옥시카르보닐, 헤테로사이클릴옥시카르보닐, 알킬카르보닐옥시, 사이클로알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 헤테로아릴카르보닐옥시, 헤테로사이클릴카르보닐옥시를 포함함), 카보네이트(알콕시카르보닐옥시, 아릴옥시카르보닐옥시, 헤테로아릴옥시카르보닐옥시를 포함함), 카바메이트(알콕시카르복실아미노, 아릴옥시카르보닐아미노, 알케닐옥시카르보닐아미노, 알키닐옥시카르보닐아미노, 아릴옥시카르보닐아미노, 아미노카르보닐옥시, 알킬아미노카르보닐옥시, 디-알킬아미노카르보닐옥시, 아릴아미노카르보닐옥시를 포함함), 카바모일(알킬아미노카르보닐, 디-알킬아미노카르보닐, 아릴아미노카르보닐, 아릴알킬아미노카르보닐, 알케닐아미노카르보닐을 포함함), 아미도(알킬카르보닐아미노, 알킬카르보닐알킬아미노, 아릴카르보닐아미노, 헤테로아릴카르보닐아미노를 포함함), 아릴알킬, 헤테로아릴알킬, 헤테로사이클로알킬, 아미노(알킬아미노, 디-알킬아미노, 아릴아미노, 디-아릴아미노, 및 알킬아릴아미노를 포함함), 설포닐(알킬설포닐, 아릴설포닐, 아릴알킬설포닐, 헤테로아릴설포닐, 알콕시설포닐, 아릴옥시설포닐, 헤테로아릴옥시설포닐, 사이클로알킬설포닐, 헤테로사이클릴설포닐을 포함함), 설파모일, 설폰아미도, 포스페이트, 포스포네이토, 포스피네이토, 티오에테르(알킬티오, 아릴티오, 헤테로아릴티오를 포함함), 우레이도, 이미노, 아미디노, 티오카르복실(알킬티오카르보닐, 아릴티오카르보닐을 포함함), 설피닐(알킬설피닐, 아릴설피닐을 포함함), 카르복실을 포함하는 치환기로 하나 이상의 고리 위치에서 치환될 수 있고, 여기서, 각각의 상기 탄화수소기는 하나 이상의 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 할로겐, 하이드록시 또는 알콕시기로 선택적으로 치환될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "헤테로사이클릴" 또는 "헤테로사이클로"는 비치환 또는 치환된, 포화 또는 불포화 비-방향족 고리 또는 환 시스템을 포함하고, 예를 들어, 4-, 제5-, 6- 또는 7원 모노사이클릭, 7-, 8-, 9-, 10-, 11- 또는 12-원 비사이클릭, 또는 10-, 11-, 12-, 13-, 14- 또는 15-원 트리사이클릭 고리 시스템이고, O, S 및 N으로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하고, 여기서, N 및 S는 또한 다양한 산화 상태로 선택적으로 산화될 수 있다. 일 구체예에서, 헤테로사이클릴 부분은 5~7개의 고리 원자를 함유하고 O, S 또는 N으로부터 선택된 추가의 헤테로원자를 선택적으로 함유하는 포화된 모노사이클릭 고리를 나타낸다. 헤테로사이클릭 기는 헤테로원자 또는 탄소 원자에 부착될 수 있다. 헤테로사이클릴은 융합되거나 브릿지된 고리뿐만 아니라 스피로사이클릭 고리를 포함할 수 있다. 헤테로사이클릴 부분의 예는, 예를 들어, 디하이드로푸라닐, 디옥솔라닐, 디옥사닐, 디티아닐, 피페라지닐, 피롤리딘, 디하이드로피라닐, 옥사티올라닐, 디티올란, 옥사티아닐, 티오모르폴리노, 옥시라닐, 아지리디닐, 옥세타닐, 옥세파닐, 아제티디닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로티오페닐, 피롤리디닐, 테트라하이드로피라닐, 피페리디닐, 모르폴리노, 피페라지닐, 아제피닐, 옥사피닐, 옥사아제파닐, 옥사티아닐, 티에파닐, 아제파닐, 디옥세파닐 및 디아제파닐을 포함한다.

용어 "헤테로사이클릴"은 1, 2 또는 3개의 치환기, 예를 들어, =O, =S, 할로겐, 하이드록시, 시아노, 니트로, 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 알콕시, 사이클로알킬옥시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 아릴옥시, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클릴옥시, 아릴알킬옥시, 헤테로아릴알킬옥시, 헤테로사이클릴알킬옥시, 케톤(알킬카르보닐, 사이클로알킬카르보닐, 알케닐카르보닐, 알키닐카르보닐, 아로일, 아릴알킬카르보닐, 헤테로아릴카르보닐, 헤테로사이클릴카르보닐을 포함함), 에스테르(알콕시카르보닐, 사이클로알킬옥시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, 헤테로아릴옥시카르보닐, 헤테로사이클릴옥시카르보닐, 알킬카르보닐옥시, 사이클로알킬카르보닐옥시, 아릴카보닐옥시, 헤테로아릴카르보닐옥시, 헤테로사이클릴카르보닐옥시를 포함함), 카보네이트(알콕시카르보닐옥시, 아릴옥시카르보닐옥시, 헤테로아릴옥시카르보닐옥시를 포함함), 카바메이트(알콕시카르복실아미노, 아릴옥시카르보닐아미노, 알케닐옥시카르보닐아미노, 알키닐옥시카르보닐아미노, 아릴옥시카르보닐아미노, 아미노카르보닐옥시, 알킬아미노카르보닐옥시, 디알킬아미노카르보닐옥시, 아릴아미노카르보닐옥시를 포함함), 카바모일(알킬아미노카르보닐, 디알킬아미노카르보닐, 아릴아미노카르보닐, 아릴알킬아미노카르보닐, 알케닐아미노카르보닐을 포함함), 아미도(알킬카르보닐아미노, 알킬카르보닐알킬아미노, 아릴카르보닐아미노, 헤테로아릴카르보닐아미노를 포함함), 아릴알킬, 헤테로아릴알킬, 헤테로사이클릴알킬, 아미노(알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 디아릴아미노, 및 알킬아릴아미노를 포함함), 설포닐(알킬설포닐, 아릴설포닐, 아릴알킬설포닐, 헤테로아릴설포닐, 알콕시설포닐, 아릴옥시설포닐, 헤테로아릴옥시설포닐, 사이클로알킬설포닐, 헤테로사이클릴설포닐을 포함함), 설파모일, 설폰아미도, 포스페이트, 포스포네이토, 포스피네이토, 티오에테르(알킬티오, 아릴티오, 헤테로아릴티오를 포함함), 우레이도, 이미노, 아미디노, 티오카르복실(알킬티오카르보닐, 아릴티오카르보닐), 설피닐(알킬설피닐, 아릴설피닐을 포함함), 카르복실로 치환될 수 있는 본원에서 정의된 바와 같은 헤테로사이클릭기를 포함하고, 여기서, 각각의 상기 탄화수소 그룹은 하나 이상의 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 할로겐, 하이드록시 또는 알콕시기로 선택적으로 치환될 수 있다.

용어 "헤테로사이클릴알킬"은 헤테로사이클릴로 치환된 알킬이다. 용어는 비치환된 및, 하나 이상의 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 할로겐, 하이드록시 또는 알콕시기로 치환될 수 있는 치환된 헤테로사이클릴 알킬 부분을 포함한다.

용어 "카르보닐" 또는 "카르복시"는 산소 원자에 이중결합으로 연결된 탄소(C=O)를 함유하는 화합물 및 부분을 포함한다. 카르보닐은, 본 발명의 화합물이 이의 의도된 기능을 수행하도록 하는 임의의 잔기로 추가로 치환될 수 있다. 예를 들어, 카르보닐 부분은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알콕시, 아미노 등으로 치환될 수 있다. 카르보닐을 함유하는 부분의 예는 알데히드, 케톤, 카르복실산, 아미드, 에스테르, 우레아, 무수물 등을 포함한다.

용어 "하이드록시" 또는 "하이드록실"은 -OH 또는 -O^-를 갖는 기를 포함한다.

용어 "할로겐"은 불소, 브롬, 염소, 요오드 등을 포함한다.

용어 "과할로겐화된"은 모든 수소가 할로겐 원자로 치환된 부분을 포함한다.

본 발명의 비타민 D 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염들, 용매화물들 또는 전구 약물들은 하나 이상의 비대칭 중심을 함유할 수 있고, 따라서 에난티오머, 부분입체이성체, 및 절대 입체화학의 관점에서, (R)- 또는 (S)- 또는, 아미노산에 대해 (D)- 또는 (L)-로서 정의될 수 있는 다른 입체이성체 형태를 생성할 수 있다. 본 발명은 모든 이러한 가능한 이성체, 뿐만 아니라 이의 라세미 및 광학적으로 순수한 형태를 포함하는 것을 의미한다. 광학적 활성 (+) 및 (-), (R)- 및 (S)-, 또는 (D)- 및 (L)-이성체는 키랄 합성 단위체(synthon) 또는 키랄 시약을 사용하여 제조될 수 있고, 또는 종래 기술, 예를 들어, 키랄 칼럼을 사용하는 HPLC을 사용하여 분할될 수 있다. 본원에 기재된 화합물이 올레핀성 이중 결합 또는 기하학적 비대칭의 다른 중심을 함유할 경우, 달리 특정되지 않는 한, 화합물은 E 및 Z 기하 이성체 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, 모든 호변이성체 형태도 또한 포함되는 것으로 의도된다.

용어 "입체이성체"는 동일한 결합에 의해 결합된 동일 원자로 구성되지만 상호교환가능하지 않는 상이한 3차원 구조를 갖는 화합물을 포함한다. 본 발명은 다양한 입체이성체 및 이들의 혼합물을 고려하고, 분자가 서로 포 개질 수 없는 거울상인 서로 다른 2개의 입체이성체를 의미하는 에난티오머를 포함한다.

본 발명은 모든 약학적으로 허용가능한 동위원소-표지된 비타민 D 화합물을 포함하고, 여기서, 하나 이상의 원자는 동일한 원자 수를 갖지만 자연에서 통상 발견된 원자량 또는 질량 수와 상이한 원자량 또는 질량 수를 갖는 원자로 대체된다.

본 발명의 화합물 내에 포함하기에 적당한 동위원소의 예는 수소의 동위원소, 예를 들어, ²H 및 ³H, 탄소의 동위원소, 예를 들어, ¹¹C, ¹³C 및 ¹⁴C, 염소의 동위원소, 예를 들어, ³⁶Cl, 불소의 동위원소, 예를 들어, ¹⁸F, 요오드의 동위원소, 예를 들어, ¹²³I 및 ¹²⁵I, 질소의 동위원소, 예를 들어, ¹³N 및 ¹⁵N, 산소의 동위원소, 예를 들어, ¹⁵O, ¹⁷O 및 ¹⁸O, 인의 동위원소, 예를 들어, ³²P, 및 황의 동위원소, 예를 들어, ³⁵S를 포함한다. 더 무거운 동위원소, 예를 들어, 중수소, 즉 ²H에 의한 치환은 더 큰 대사 안정성, 예를 들어, 증가된 생체 내 반감기 또는 감소된 용량 요건으로부터 기인하는 특정의 치료 이점을 부여할 수 있다. 동위원소-표지된 비타민 D 화합물은 일반적으로 당업자에게 공지된 종래 기술에 의해 이전에 사용된 비-표지된 시약 대신에 적절한 동위원소-표지된 시약을 사용하여 제조할 수 있다.

용어 "전구 약물"은 생리학적 조건하에서 또는 가용매분해에 의해 본 발명의 생물학적 활성 화합물로 전환될 수 있는 화합물을 포함한다. 따라서, 용어 "전구 약물"은 약학적으로 허용되는 본 발명의 화합물의 대사산물 전구체를 의미한다. 전구 약물은 이를 필요로 하는 대상에게 투여될 때 불활성일 수 있지만, 생체내에서 본 발명의 활성 화합물로 전환된다. 전구 약물은 전형적으로 생체내에서 신속히 전환되어, 예를 들어, 혈액에서의 가수분해 또는 소화관 또는 간에서의 전환에 의해 본 발명의 모 화합물을 수득한다. 전구 약물 화합물은 종종 포유동물 유기체에 용해도, 조직 적합성 또는 지연 방출의 이점을 제공한다 (Bundgard, H., Design of Prodrugs (1985), pp. 7~9, 21~24 (Elsevier, Amsterdam)을 참조).

전구 약물의 논의가, Higuchi, T., et al., "Pro-drugs as Novel Delivery Systems," A.C.S. Symposium Series, Vol. 14, and in Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, Anglican Pharmaceutical Association arid Pergamon Press, 1987에 제공되어 있다.

"약학적으로 허용가능한 염"은 산 및 염기 부가 염 모두를 포함한다. "약학적으로 허용가능한 산 부가염"은 유리 염기의 생물학적 유효성 및 특성을 보유하고, 생물학적으로 또는 그 외에도 바람직하고, 무기산, 예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등, 및 유기산, 예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 아세트산, 2,2-디클로로아세트산, 아디프산, 알긴산, 아스코르브산, 아스파르트산, 벤젠설폰산, 벤조산, 4-아세트아미도벤조산, 캄포르산, 캄포르-10-설폰산, 카프르산, 카프로산, 카프릴산, 카르본산, 신남산, 시트르산, 사이클람산, 도데실황산, 에탄-1,2-디설폰산, 에탄설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 포름산, 푸마르산, 갈락타르산, 젠티스산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루쿠론산, 글루탐산, 글루타르산, 2-옥소-글루타르산, 글리세로인산, 글리콜산, 히푸르산, 이소부티르산, 락트산, 락토비온산, 라우르산, 말레산, 말산, 말론산, 만델산, 메탄설폰산, 무크산, 나프탈렌-1,5-디설폰산, 나프탈렌-2-설폰산, 1-하이드록시-2-나프토산, 니코틴산, 올레산, 오로트산, 옥살산, 팔미트산, 파모산, 프로피온산, 피로글루탐산, 피루브산, 살리실산, 4-아미노살리실산, 세박산, 스테아르산, 석신산, 타르타르산, 티오시안산, p-톨루엔설폰산, 트리플루오로아세트산, 운데실렌산 등과 형성되는 염들을 지칭한다.

용어 "약학적으로 허용가능한 염기 부가 염"은 유리 산의 생물학적 유효성 및 특성을 보유하고, 생물학적으로 또는 바람직한 염들을 포함한다. 이들 염은 무기 염기 또는 유기 염기를 유리 산에 첨가하여 제조된다. 무기 염기로부터 유래된 염은, 이에 제한되지 않지만, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄 염 등을 포함한다. 바람직한 무기 염은 암모늄, 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 마그네슘 염이다. 유기 염기로부터 유래된 염은, 이에 제한되지 않지만, 1급, 2급 및 3급 아민, 천연의 치환된 아민, 사이클릭 아민 및 염기성 이온 교환 수지를 포함하는 치환된 아민, 예를 들어, 암모니아, 이소프로필아민, 트리메틸 아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 디에탄올아민, 에탄올아민, 데아놀, 2-디메틸아미노에탄올, 2-디에틸아미노에탄올, 디사이클로헥실아민, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 하이드라바민, 콜린, 베타인, 벤에타민, 벤자틴, 에틸렌디아민, 글루코사민, 메틸글루카민, 테오브로민, 트리에탄올아민, 트로메타민, 퓨린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘, 폴리아민 수지 등의 염을 포함하다.

종종, 결정화는 본 발명의 화합물의 용매화물을 생성한다. 본원에서 사용된 용어 "용매화물"은 본 발명의 화합물의 하나 이상의 분자를 용매의 하나 이상의 분자와 함께 포함하는 응집물을 의미한다. 용매는 물일 수 있고, 이 경우에, 용매화물은 수화물일 수 있다. 또는, 용매는 유기 용매일 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 일수화물, 이수화물, 반수화물, 세스퀴수화물, 삼수화물, 사수화물 등을 포함하는 수화물뿐만 아니라, 상응하는 용매화된 형태로서 존재할 수 있다. 본 발명의 화합물은 진정한 용매화물일 수 있고, 한편, 다른 경우에, 본 발명의 화합물은 단지 우발적인 물을 보유하거나, 물 + 일부 우발적인 용매의 혼합물일 수 있다.

한 양태에서, 본 발명은 국소 투여에 적합하고, 본 발명의 하나 이상의 양태 및 구체예에 따른 화학요법 유발 탈모증을 예방하거나 완화하는 비타민 D 화합물을 치료학적으로 유효한 양을 포함하는, 약학 조성물을 제공한다.

용어 "약학적 조성물"은 비타민 D 화합물을 개체에게 전달하기 위한, 본 발명의 화합물(예, 비타민 D 화합물) 및 본 기술 분야에서 일반적으로 허용되는 매질의 제형을 포함한다. 그러한 매질은 이의 모든 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 비이클을 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 임의의 상피 표면에 국소적으로 투여될 수 있다. "상피 표면"은, 신체의 외부 표면을 덮거나, 비제한적으로, 피부 및 점막 표면을 포함하는 중공 구조를 정렬시킨 조직의 영역을 포함한다. 그러한 상피 표면은 경구, 인두, 식도, 폐, 눈, 귀, 코, 구강, 혀, 질, 경부, 비뇨생식기, 소화기 및 항문직장 표면을 포함한다.

조성물은 국소 투여에 사용되는 다양한 종래 형태로 제형화될 수 있다. 이들은, 예를 들어, 반-고체 및 액체 용량 형태, 예를 들어, 액체 용액 또는 현탁액, 겔, 크림, 에멀젼, 로션, 슬러리, 파우더, 스프레이, 폼(foam), 페 이스트, 연고, 고약, 밤(balm) 또는 점적제를 포함한다.

국소 적용용으로 통상적으로 사용되는 담체는 펙틴, 젤라틴 및 이의 유도체, 폴리락트산 또는 폴리글리콜산 폴리머 또는 이의 코폴리머, 셀룰로스 유도체, 예를 들어, 메틸 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 또는 산화된 셀룰로스, 구아 검, 아카시아 검, 카라야 검, 트라가간트 검, 벤토나이트, 한천, 카르보머, 블래더랙(bladderwrack), 세라토니아(ceratonia), 덱스트란 및 이의 유도체, 가티 검, 헥토라이트, 차전자피(ispaghula husk), 폴리비닐피롤리돈, 실리카 및 이의 유도체, 크산탄 검, 카올린, 탈크, 전분 및 이의 유도체, 파라핀, 물, 식물성 및 동물성 오일, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 글리세롤, 에탄올, 프로판올, 프로필렌 글리콜(글리콜, 알콜), 고정유, 나트륨, 칼륨, 알루미늄, 마그네슘 또는 칼슘 염(예를 들면, 클로라이드, 카보네이트, 비카보네이트, 시트레이트, 글루코네이트, 락테이트, 아세테이트, 글루셉테이트 또는 타르트레이트)을 포함한다.

국소용 제제에 대한 표준 조성물 전략은 약물의 지속성 및 체류 시간을 향상시키고 달성된 예방적 효능을 향상시키기 위해 비타민 D 화합물에 적용될 수 있다.

국소 경피 패치가 또한 사용될 수 있다. 경피 패치는 본 발명의 조성물의 신체에의 조절 전달을 제공하는 추가 이점을 갖는다. 이러한 용량형은 적당한 매질에 제제를 용해시키거나 분산시켜 제조할 수 있다.

파우더 및 스프레이는 비타민 D 화합물 이외에, 담체, 예를 들어, 락토스, 탈크, 수산화알루미늄, 규산칼슘 및

폴리아미드 파우더, 또는 이들 물질의 혼합물을 함유할 수 있다. 스프레이는 종래의 추진제, 예를 들어, 클로로플루오로탄화수소, 및 휘발성 비치환된 탄화수소, 예를 들어, 부탄 및 프로판을 추가로 함유할 수 있다. 스프레이는 계량화된 스프레이 병의 사용을 통하여 저장, 판매, 및/또는 투여될 수 있다.

통상, 수성 에어로졸은 종래의 약학적으로 허용되는 담체 및 안정화제와 함께 비타민 D 화합물의 수용액 또는 현탁액을 제형화함으로써 제조된다. 담체 및 안정화제는 특정 화합물의 요건에 따라 다양하지만, 전형적으로 비이온성 계면활성제(예, Tweens, Pluronics, 폴리에틸렌 글리콜 등), 혈청 알부민과 같은 단백질, 소르비탄 에스테르, 올레산, 레시틴, 글리신과 같은 아미노산, 완충제, 염, 당, 또는 당 알콜을 포함한다. 에어로졸은 일반적으로 등장성 용액으로부터 제조된다. 본 발명의 에어로졸 또는 임의의 기타 전달 수단은 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 방법에 의하여 생성할 수 있다. 예를 들면, 에어로졸 전달의 경우, 화합물은 추진제를 갖는 임의의 담제와 함께 미세하게 분해된 형태로 공급된다.

액화된 추진제는 전형적으로 주위 조건하에서 가스이고, 압력하에서 압축된다. 프로판 및 부탄, 또는 기타 저급 알칸, 예를 들어, 탄소 5개 이하의 것들을 포함하는 추진체가 임의로 허용 가능하고 당해 분야에 공지될 수 있다. 조성물은 적당한 추진제 및 밸브를 갖는 용기 내에 보유되고, 밸브의 작용으로 방출될 때까지 고압에서 유지된다.

한 구체예에서, 비타민 D 화합물은 예방적으로 투여될 수 있다. 예방적 적용을 위해, 비타민 D 화합물은 잠재적인 탈모증 전에 적용될 수 있다. 적용 시점은 비타민 D 화합물의 예방적 유효성을 최대화하기 위해 최적화할 수 있다. 적용 시점은 조성물의 투여 방식, 용량, 안정성 및 유효성, 용량 빈도, 예를 들어, 단일 적용 또는 다중 용량에 따라 변화될 것이다. 당업자는 비타민 D 화합물의 예방적 유효성을 최대화하기 위해 필요한 가장 적절한 시간 간격을 결정할 수 있을 것이다.

비타민 D 화합물은 조성물 내에 존재할 때, 일반적으로, 총 중량의 약 0.000001% 내지 약 100%, 더 바람직하게는 약 0.001% 내지 약 50%, 가장 바람직하게는 약 0.01% 내지 약 25%의 양으로 존재할 것이다.

담체를 포함하는 본 발명의 조성물에 있어서, 상기 조성물은 적어도 하나의 담체를, 예를 들어, 약 1 내지 약 99 wt%, 바람직하게는 약 50 내지 약 99 wt%, 가장 바람직하게는 약 75 내지 약 99 wt% 포함한다.

또한, 본 발명의 조성물의 별개의 성분은 미리 블렌딩될 수 있거나, 각각의 성분은 목적하는 농도 수준의 치료 성분을 달성하기 위한 목적으로, 그리고 성분이 궁극적으로 서로 긴밀하게 혼합되는 한, 소정 용량에 따라 동일한 환경에 별개로 첨가될 수 있다. 또한, 본 발명은 연속 또는 간헐적 기준으로 투여되거나 전달될 수 있다.

일부 구체예에서, 약학 조성물은 수계 제형이 아니다.

일부 구체예에서, 약학 조성물은 약 40%(w/w)의 프로필렌 글리콜 및 약 60%(w/w)의 무수 절대 에탄올(200 proof, U.S.); 약 30%(w/w)의 프로필렌 글리콜, 약 10%(w/w)의 에톡시디글리콜 또는 트랜스큐톨, 및 약 60%(w/w)의 무수 절대 에탄올(200 proof, U.S.)의 비이클 중 비타민 D 화합물을 포함한다.

한 구체예에서, 제형은 선택적으로는 기타 소량의 약학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 약 0.4%(w/v)의 포스폴리폰 90G와 같은 희석제와 함께, 약 40%(w/w) 프로필렌 글리콜 및 약 60%(w/w) 무수 절대 에탄올(200 proof, US)에서 제형화되는, 비타민 D 활성 성분을 포함한다. 다른 구체예에서, 제형은 선택적으로는 기타 소량의 약학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 약 0.4%(w/v)의 포스폴리폰 90G와 같은 희석제와 함께, 약 30%(w/w) 프로필렌 글리콜, 약 10%(w/w) 에톡시디글리콜 또는 트랜스큐톨, 및 약 60%(w/w) 무수 절대 에탄올(200 proof, US)에서 제형화되는, 비타민 D 활성 성분을 포함한다. 일부 구체예에서, 에탄올은 무수 절대 200 proof (U.S.) 비변성 에탄올(USP)이다. 본원에 기재된 제형은 활성 비타민 D 화합물의 진피 침투 및 전달의 수준을 제공하고, 탈모증, 특히 화학요법-유발 탈모증을 예방하거나 중증도를 감소시키기 위한 효과적인 수단을 제공한다.

소정 구체예에서, 약학 조성물은 약 40% (w/w) 프로필렌 글리콜 (USP 등급) 및 약 60% (w/w) 무수 절대 에탄올 (200 proof, US), 비변성 USP를 포함한다.

일부 구체예에서, 약학 조성물은 약 40% (w/w) 프로필렌 글리콜 (예, USP 등급 이상) 및 약 60% (w/w) 무수 절대 에탄올 (200 proof, US), 비변성 (예, USP 등급 이상)을 포함한다.

다른 구체예에서, 약학 조성물은 약 30%(w/w)의 프로필렌 글리콜, 약 10%(w/w)의 에톡시디글리콜 또는 트랜스큐톨, 및 약 60%(w/w)의 무수 절대 에탄올(200 proof, U.S.)를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 약학 조성물은 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, or 1% 포스포리폰, 예를 들면, 포스포리폰 90G를 포함한다.

다른 구체예에서, 프로필렌 글리콜 및/또는 무수 절대 에탄올의 정밀한 백분율(w/w)은 40%:60% 비율에 기반하여 변화할 수 있다. 예를 들어, 프로필렌 글리콜 대 무수 절대 에탄올의 %비는 20:80; 25:75; 30:70; 35:65; 36:64; 37:63; 38:62; 39:61; 41:59; 42:58; 43:57; 44:56; 45:55 등일 수 있다. 이러한 기타 제형의 유효성은, 실시예 I에 기재된 과정과 같은, 당해 분야에서 인지된 기술을 이용하여 확인할 수 있다.

소정 구체예에서, 제형 내의 무수 절대 에탄올은 95% 에탄올, 96% 에탄올, 97% 에탄올, 98% 에탄올, 또는 99% 에탄올로 대체될 수 있다.

소정 구체예에서, 약학적 조성물은 또한 미량의 기타 불활성 성분, 부형제 또는 성분을 포함할 수 있다. 이러한 성분의 존재는 실질적으로 비타민 D 화합물의 유효성 또는 이의 진피 침투/축적 거동에 영향을 주지 않는다.

본 발명의 비타민 D 화합물은 실질적으로 진피층을 침투하지 않고 표피로 전달되도록 제형화된다. Roche Dermatology에 의해 개발된 종전의 상이한 제형은 적용당 약 500 내지 1000㎍의 투여량으로 사용될 경우 CIA으로부터 보호하는데 비효과적이었고, I기 연구에 있는 사람 대상체 대부분에서 피부염을 유발시켰다. 또한, 동일한 Roche 제형이 래트 녹색백혈병 모델(하기)에서 효과를 나타내지 않았다.

본 발명의 예시적 제형 중의 하나는 다음 (비-제한적) 과정에 따라 제조할 수 있다:

제형 II: 칼시트리올 5, 10, 20 ㎍/g

제형 II를 하기 실시예 17의 4.0절 치료제/ 진단제에 기재된 프로토콜에 따라 제조한다.

제형 III: 칼시트리올 1.2 ㎍/g (1.2 ppm)

성분	% w/w
100 ppm 칼시트리올 농도	1.2
200 proof 에탄올	58.8
프로필렌 글리콜	40
총	100

제형 III은 다음과 같이 제조한다: 칼시트리올을 에탄올에 용해시킨 다음; 프로필렌 글리콜을 첨가하고, 그 결과의 용액이 외관상 투명하고 균질해질 때까지 혼합한다. 상기 제형의 비중은 약 0.875g/mL이다. w/v로 표현된 상기 화학식의 표적 농도는 1.05㎍/mL이다.

제형 IV: 칼시트리올 3.6 mg/g (3.6 ppm)

성분	% w/w
100 ppm 칼시트리올 농도	3.6
200 proof 에탄올	56.4
프로필렌 글리콜	40
총	100

제형 IV는 다음과 같이 제조한다: 칼시트리올을 에탄올에 용해시킨 다음; 프로필렌 글리콜을 첨가하고, 그 결과의 용액이 외관상 투명하고 균질해질 때까지 혼합한다. 상기 제형의 비중은 약 0.875g/mL이다. w/v로 표현된 상기 화학식의 표적 농도는 3.12㎍/mL이다.

사용된 시약은 모두 USP 등급 시약(U.S. 약전의 요건 충족)이다.

본 발명의 제형을 사용하여, 약 0.2㎍의 용량(100 μL의 2㎍/mL 국소 용액으로서 투여됨)은 신생아 래트에서 CIA로부터 보호성이다. 이 정보에 기초하여, 당업자는 치료될 포유동물의 평균 체중에 기초하여 적절한 용량 수준을 용이하게 조절할 수 있다. 예를 들어, 사람 대상체에서, 칼시트리올 총 투여량 약 2.5 ㎍, 5 ㎍, 10 ㎍, 20 ㎍, 25 ㎍, 40 ㎍, 50 ㎍, 60 ㎍, 70 ㎍, 75 ㎍, 80 ㎍, 90 ㎍, 또는 100 ㎍을 이용할 수 있다. 한 구체예에서, 칼시트리올 총 투여량은 약 11~24 ㎍, 26~49 ㎍, 51~74 ㎍, 또는 76~99 ㎍이다. 다른 구체예에서, 칼시트리올 총 투여량은 약 15~25 μg, 16~24 ㎍, 17~23 ㎍, 18~22 ㎍, 19~21 ㎍, 31~49 ㎍, 32~48 ㎍, 33~47 ㎍, 34~46 ㎍, 35~45 ㎍, 36~44 ㎍, 37~43 ㎍, 38~42 ㎍, 39~41 ㎍, 51~69 ㎍, 52~68 ㎍, 53~67 ㎍, 54~66 ㎍, 55~65 ㎍, 56~64 ㎍, 57~63 ㎍, 58~62 ㎍, 59~61 ㎍, 65~74 ㎍, 66~73 ㎍, 67~72 ㎍, 68~71 ㎍, 69~70 ㎍, 76~85 ㎍, 77~84 ㎍, 78~83 ㎍, 79~82 ㎍, 80~81 ㎍, 81~99 ㎍, 82~98 ㎍, 83~97 ㎍, 84~96 ㎍, 85~95 ㎍, 86~94 ㎍, 87~93 ㎍, 88~92 ㎍, 또는 89~91 ㎍이다. 예비 동물 독물학 연구는 약 100㎍의 투여량이 진피 자극을 일으키기 않고, 실질적인 진피 침투 없이(예, 매우 낮은 진피 침투) 우수한 표피 침투를 나타낸다는 것을 보여준다. 추가의 용량 정보에 대해 상기 내용을 참조한다.

한 양태에서, 본 발명은 국소 투여용으로 적합한 약학 조성물을 포함하는 키트로서, 화학요법 유발 탈모증을 예방하거나 완화하기 위한 치료학적으로 유효한 양의 비타민 D 화합물; 및 상기 양태 중 하나 이상 및 본 발명의 구체예에 따른, 화학요법 유발 탈모증을 예방하거나 완화하기 위한 방법을 실시하기 위한 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.

설명서는 종이 또는 전자 매체를 통하여, 예를 들면, 보건의료 제공자 또는 제작자에 의하여 서면 또는 구두 형식으로 제공될 수 있다. 설명서는 승인된(예, FDA 또는 기타 관리 기관 승인) 참조 또는 처방 정보 및 이의 중요 부분 또는 요약을 포함한다. 또한, 설명서는 논문, 교과서와 교과서 장/절, 팜플렛, 약물 라벨과 라벨의 보충, 인가 및 비인가 약품 사용에 관한 것들을 포함하는 임상 연구 프로토콜을 포함한다.

실시예

하기 실시예는 본 발명의 소정 양태를 기술하고 있으며, 임의의 양태를 한정하려는 것은 아니다. 실시예는 명확한 예시를 위해 좀 더 상세하게 설명하였지만, 당업자는 본 발명의 진정한 범위를 벗어나지 않고도 방식 및 세부 사항에서 다양한 변화가 이루어질 수 있음을 알 수 있을 것이다. 발명의 다양한 양태는 상기에서 제공된 하나 이상의 구체예 및 특징을 포함하는 것과 마찬가지로, 하기 실시예에서 제공된 하나 이상의 구체예 및 특징을 포함할 수 있다.

실시예 1: 프란츠(Franz) 인간 피부 유한 투여량 모델을 이용한 시험관내 칼시트리올의 경피 흡수 평가

본 실시예는 다양한 칼시트리올 제형의 경피 흡수 약물동력학을 평가하도록 설계하였다. 유한 투여량 기술 및 프란츠 확산 세포를 이용하여 시험관내에서 인간 사체 피부에서 흡수를 측정하였다. 시험관내 인간 사체 피부 모델은 국소적으로 적용된 약물의 경피 흡수의 연구하고 약물동력학을 측정하기 위한 유용한 도구인 것이라 입증되었다. 당해 모델은 통상적인 생체내 조건에 부합하는 온도 및 습도에서 피부를 유지시키도록 특별하게 설계된 확산 세포에 적재된 인간 사체 피부를 사용하였다. 유한 투여량(예, 4~7mg/cm²)의 제형을 피부의 외부 표면에 적용하고, 이의 겉보기 비율을 피부의 내부 표면을 침지하는 수용체 용액에서 모니터링하여 약물 흡수를 측정하였다. 이어서, 총 흡수, 흡수율, 뿐만 아니라 피부 함량을 규정하는 데이터를 당해 모델에서 정확하게 측정하였다. 이 방법은 생체내 경피 흡수 동력학을 정확하게 예측하기 위한 이력적 선례를 가진다. 따라서, 인가 피부에 대한 시험관내 유한 투여량 모델은, 칼시트리올과 같은 비타민 D 화합물의 경피 흡수 약물동력학의 특성화를 가능하게 하였다.

본 실험에서, 칼시트리올을 함유하는 6개 제형을 48시간 투여 기간에 걸쳐 칼시트리올의 경피 흡수에 대해 각각의 상이한 3개의 사체 피부 공여자에게 제형당 3개의 복제 피부 절편으로 시험하였다. 투여량 적용 후에 미리 선택된 시점에서, 피부 수용체 용액을 전체로 제거하고, 새로운 수용체 용액으로 대체하고, 분취량을 후속 분석을 위해 저장하였다. 또한, 각질층, 표피 및 진피를 회수하고, 약물 함량을 평가하였다. 이 샘플에 대하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 칼시트리올 함량을 분석하였다. 본원에 사용된 프로토콜의 간단한 설명은 하기에 제공된다.

사후 24~48 시간 내에 수득한, 피부 질환의 명백한 흔적이 없는 인간 사체 몸통 피부를 본 연구에서 사용하였다. 상기 피부를 수거하고, 동결보존하고, 수-불침투성 플라스틱 백에 밀봉하고, 실험일까지 < -70℃에서 저장하였다. 사용 전에, 이 피부를 약 37℃ 물에서 해동시킨 다음, 수돗물로 세정하여 표면에서 임의의 부착 혈액 또는 기타 물질을 제거하였다. 단일 공여자의 피부를 정적 2.0cm² 프란츠 확산 세포 상에 맞도록 충분하 큰, 다수의 보다 작은 절편으로 절단하였다. 공여자당 3개의 복제물을 각 제형에 대해 시험하였다. 피부 챔버를 포스페이트-버퍼 등장성 염수(phosphate-buffered isotonic saline, PBS)(pH 7.4 ±0.1)의 저장 용액으로 수용량까지 채우고, 표피 챔버를 주위 실험실 환경에 개방하여 두었다. 수난용성 화합물의 수용해도를 증가시키는 것으로 알려진 비이온성 계면활성제인, 볼포(Volpo)(Oleth-20)를 PBS에 첨가할 수 있다. 저장 용액 중의 Volpo는 경피 흡수 동안 확산 싱크(sink) 조건을 확보하며, 시험 피부의 차단 특성에 영향을 미치지 않는 것으로 알려져 있다. 이어서, 세포를 확산 장치에 위치시키고, 피부 저장 용액을 약 600 RPM에서 자기 교반하고, 이의 온도가 32.0±1.0℃의 피부표면 온도가 되도록 유지시켰다.

각 피부 절편의 온전성(integrity)을 확보하기 위해, 삼중수소수에 대한 이의 투과도를 시험 생성물의 적용 전에 측정하였다. 단시간 (0.5~1시간) 평형 기간 후, ³H₂O(NEN, Boston, MA, sp. Act. ~ 0.5μCi/mL)를 점적기에 의해 피부 상부에 걸쳐 적층시켜, 전체 노출된 표면을 피복시켰다(약 250~500μL). 5분 후, ³H₂O 수성층을 제거하였다. 30분 후, 저장 용액을 수거하고, 액체 신틸레이션 계수로 방사성 함량에 대해 분석하였다. ³H₂O 흡 수가 약 0.50μL-equ/cm² 미만인 피부 샘플은 허용가능한 것으로 본다. 사용된 모든 피부 샘플은 약 0.50μL-equ/cm² 미만의 ³H₂O 흡수를 가졌다(결과는 도시하지 않음).

투여량 투여 및 샘플 수거: 투여 직전, 예비-투여량 샘플을 채취하고, 저장 용액을 0.2% Volpo (Oleth-20으로도 알려짐, 수용액에서 약물의 혼화성을 확보하기 위해 사용된 비이온성 계면활성제)를 함유하는 0.1×PBS의 새로운 용액으로 대체하였다. 침니(chimney)를 프란츠 세포로부터 제거하여 피부의 표피 표면에 충분히 접근하게 하였다. 이어서, 모든 제형을 10μL 제형/cm²를 전달하도록 전방 이동 피펫 세트(positive displacement pipette set)를 사용하여 피부 절편에 적용하였다. 이 투여량을 피펫의 테플론 팁(Teflon tip)으로 표면을 통해 확산시켰다. 적용 5 내지 10분 후, 프란츠 세포의 침니 부분을 대체하였다. 투여 후 미리 선택된 시간(6, 12, 24 및 48시간)에, 저장 용액을 전체 제거하고, 새로운 저장 용액으로 대체하고, 소정의 부피 분취량을 후속 분석을 위해 저장하였다.

각 공여자의 단일 피부 절편을, 투여하지 않고서 피부 외부로 확산하는 물질의 외관을 평가하는데 사용된 세포에 적재하는데, 이는 내인성 칼시트리올을 나타낼 수 있다. 최종 샘플을 수거한 후, 피부 표면을 80:20 에탄올:물로 2회(각각 1.0mL 부피) 세척하여 흡수되지 않은 제형을 피부 표면에서 수거하였다. 세척 후, 피부를 챔버로부터 제거하고, 표피와 진피로 분리하였다. 각 층을 밤새 80:20 에탄올:물로 추출하였다.

칼시트리올의 정량화는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 수행하였다. 요약하면, HPLC는 Agilent 1100 시리즈 LC/MSD를 이용한 Hewlett-Packard 1100 시리즈 HPLC 시스템으로 수행하였다. A) 물 중 0.1% 암모늄 아세테이트 및 B) 메탄올 중 0.1% 암모늄 아세테이트로 이루어진 용매 시스템을 0.550mL/분의 유속으로 Phenomenex Luna C18(2) 컬럼(100A, 3μ 100 × 4.6 mm)을 통해 작동시켰다. 피크 면적은 순수한 표준물로부터 매일 제조한 외부 표준 곡선을 사용하여 농도에 대해 정량화하였다. 수거일에 분석하지 않은 샘플은 -20℃ 이하에서 저장하였다.

시범 연구(pilot study)에서, 당해 그룹으로부터의 단일 제형을 단일 공여자에 대해 약 5μL/cm² 투여량으로 6개 챔버에 투여하였다. 수용체 용액을 0, 2, 4, 8, 12, 24, 32, 및 48시간에 수거하였다. 마지막 수용체 용액 샘플 후, 표면을 세척하고, 전술한 바와 같이 분석을 위해 피부를 수거하였다. 모든 샘플을 처리하고, 칼시트리올 함량에 대해 분석하였다.

임상 연구(pivotal study)의 최종 설계는 시범 연구, 특히 적용된 투여량, 수용체 용액 샘플링 스케쥴, 및 샘플 처리 방법에서 관찰된 결과에 기초하였다. 이러한 변형은 임상 연구 샘플에서 칼시트리올의 검출 및 정량화를 최적화하기 위하여 실시하였다. 예를 들면, 시범 프로토콜이 저장 샘플을 2, 4, 8, 12, 24, 32 및 48시간에서 채취하라고 기술되어 있더라도, 이는 저장 샘플 중의 칼시트리올의 수준을 용이하게 검출하기 위하여 저장샘플을 6, 12, 24 및 48시간에서 수거할 수 있음을, 시범 연구 후에 측정되었다. 또한, 시범 연구 후, 2cm²에 20μL를 투여(이 경우, 투여량은 10μL/cm²임)하면, 저장 용액 샘플에서 칼시트리올의 검출을 향상시킬 수 있었다. 그러나, 비-투여 챔버는 1cm²에서 유지되었다. 하기 파라미터를 계산하였다: a) 총 흡수(모든 저장용액의 합계); b) 연구 기간에 걸친 투과율 및 투과 정도; 및 c) 적용된 투여량의 질량 수지. 데이타 평가를 위해, a) 임의의 샘플 < LLQ(정량화 하한치, Lower Limit of Quantification)인 경우, 당해 샘플은 비-데이타 값으로서 처리될 수 있다. 방사성 샘플(예, 물 온전성 시험(water integrity test))의 경우, LLQ는 블랭크 샘플의 소정 평균 배경으로서 정의된다. 연구자의 재량으로, 모든 값 <LLQ인 경우, 제로값으로 공표하거나 주요 파라미터를 계산하기 위해 실제 값을 측정하고; b) 추정된 이상치(outlier)는 잔류하는 복제물 챔버 세트로부터의 동일한 값의, 또는 딘 및 딕손 이상치 시험(Dean and Dixon Outlier test)에 의해 측정된 것과 동일한 값의 평균±3SD 범위보다 큰 것인지를 확인하였다. 연구자의 재량으로, 이상치로서 언급된 값을 데이타의 총 합계로부터 제거하고(그러나, 텍스트 또는 데이타 표에서는 자체로 주목된다); c) 챔버 내에서, 소정 시점 값이 비-데이타 값으로 언급하거나, 다른 이유로 부재하는 경우, 시점 값을 내삽 값으로 대체하여 관련 파라미터를 계산하였다. 내삽 값은 다음과 같이 인접 값을 연결하는 라인 상에서 계산한다:

■ 소정 3 시점: (B) 부재와 함께 (T1, A), (T2, B) 및 (T3, C)

■ 여기서, T는 시간이고, A-C는 측정된 데이타 값이다.

■ 평가된 B = A-[((A-C)/│T1-T3│)×(│T1-T2│)]

통계학적 평가를 위해, 공여자 내의 복제물을 평균하고, 표준 편차를 각각의 중요 파라미터에 대해 계산하였다. 이어서, 공여자 내에서 평균을 모으고, 표준 오차를 갖는 공여자 모집단에 걸쳐 평균을 계산하였다. 시험 물품 사이의 차이는 스튜던트 t-시험(Student's t-test)을 사용하여 평가하였다.

이 프로토콜을 사용하여, 하기 시험 제형을 평가하였다:

A: (1ppm): 0.2mL(1%(w/v))의 100ppm 칼시트리올 농축물(롯트 번호 H, 하기)을 19.8mL(99%(w/v))의 200 proof 에탄올(1㎍/mL)에 용해시킨다.

B(1ppm): 먼저, 0.2mL(1%(w/v))의 100ppm 칼시트리올 농축물(롯트 번호 H, 하기)을 11.8mL(59%(w/v))의 200 proof 에탄올에 용해시킨 다음, 8mL(40%(w/v))의 프로필렌 글리콜을 첨가하고, 투명하고 균질해질 때까지 혼합한다(1㎍/mL).

C(1ppm): 먼저, 0.2mL(1%(w/v))의 100ppm 칼시트리올 농축물(롯트 번호 H, 하기)을 11.8mL(59%(w/v))의 200 proof 에탄올에 용해시킨 다음, 6mL(30%(w/v))의 프로필렌 글리콜 및 2mL(10%(w/v))의 에톡시디글리콜을 첨가하고, 투명하고 균질해질 때까지 혼합한다(1㎍/mL).

D(3ppm): 먼저, 0.6mL(3%(w/v))의 100ppm 칼시트리올 농축물(롯트 번호 H, 하기)을 11.4mL(57%(w/v))의 200 proof 에탄올에 용해시킨 다음, 6mL(30%(w/v))의 프로필렌 글리콜을 첨가하고, 투명하고 균질해질 때까지 혼합하고, 마지막으로 2mL(10%(w/v))의 에톡시디글리콜을 첨가하고, 투명하고 균질해질 때까지 혼합한다(3㎍/mL).

E(1ppm): 먼저, 0.2mL(1%(w/v))의 100ppm 칼시트리올 농축물(롯트 번호 H, 하기)을 11.72mL(58.6%(w/v))의 200 proof 에탄올(DP-04-099)에 용해시키고, 6mL(30%(w/v))의 프로필렌 글리콜을 첨가하고, 투명하고 균질해질 때까지 혼합한 다음, 2mL(10%(w/v))의 트랜스큐톨 P를 첨가하고, 투명하고 균질해질 때까지 혼합하고, 마지막으로, 0.08mL(0.4%(w/v))의 포스포리폰 90G 농축물(롯트 번호 G, 하기)을 첨가하고, 용액으로 분산시키고, 투명하고 균질해질 때까지 혼합한다(1㎍/mL).

F(3ppm): 먼저, 0.6mL(3%(w/v))의 100ppm 칼시트리올 농축물(롯트 번호 H, 하기)을 11.32mL(56.6%(w/v))의 200 proof 에탄올에 용해시킨 다음, 6mL(30%(w/v))의 프로필렌 글리콜을 첨가하고, 투명하고 균질해질 때까지 혼합한 다음, 2mL(10%(w/v))의 트랜스큐톨 P를 첨가하고, 투명하고 균질해질 때까지 혼합하고, 마지막으로, 0.08mL(0.4%(w/v))의 포스포리폰 90G 농축물(롯트 번호 G, 하기)을 첨가하고, 용액으로 분산시키고, 투명하고 균질해질 때까지 혼합한다(31㎍/mL).

G: 50g(50%(w/v))의 200 proof 에탄올을 50g(50%(w/v))의 포스포리폰 90G와 혼합하고, 투명하고 균질해질 때까지 혼합한다.

H: 0.01mg(0.01%(w/v))의 칼시트리올을 100mL(99.99%(w/v))의 200 proof 에탄올에 완전히 용해시킨다.

당해 연구에 사용된 모든 시약은 분석학적 시약 등급 이상이었다. 유일한 시약의 공급원은 최종 보고서의 텍스트 내에서 각 화학 물질의 최초 언급 후에 기재될 것이다.

당해 연구의 결과는 하기 요약 표에 요약되어 있다:

요약 표: 표피, 진피 및 전체 흡수에서 칼시트리올 함량에 대한 공여자의 평균 결과; 단일 적용으로부터 48시간 에 걸쳐 사람 사체 피부를 사용한 칼시트리올의 경피 흡수. 전체 질량(ng)으로서 평균 ± SE

시험 물품	표피 (ng/cm²)	진피 (ng/cm²)	총 흡수 (ng/cm²)
Lot A	0.98 ± 0.19	0.11 ± 0.11	9.85 ± 0.62
Lot B	1.63 ± 0.44	0.19 ± 0.19	9.84 ± 0.67
Lot C	1.89 ± 0.54	0.00 ± 0.00*	9.74 ± 0.43
Lot D	6.44 ± 0.74	0.00 ± 0.00	10.51 ± 0.10
Lot E	2.19 ± 0.14	0.00 ± 0.00	9.96 ± 0.32
Lot F	4.83 ± 0.42	0.00 ± 0.00	8.80 ± 0.25
비-투여 블랭크 세포	0.37 ± 0.37	0.00 ± 0.00	13.75 ± 0.59**

* 제로 값은 검출 하한치 이하의 결과를 나타낸다.

** 피부로부터 방출되는 내인성 칼시트리올인 것으로 추정한다.

상기 데이터는 칼시트리올이 평가된 시험 제형으로부터 시험관 내에서 인간 사체 피부 내로 침투하였음(피부를 통과하는 것이 필수적이지는 않지만)을 나타낸다. 각 공여자로부터 비-투여된 블랭크 피부 절편은 내인성 칼시트리올과 일치하는 HPLC/MS 공용출 피크를 증명하였다. 실질적으로 모든 시험 제형에 대해 동일한, 저장 용액에 존재하고 비-투여된 피부 절편과 유사한 양은, 피부 절편으로부터 방출되는 내인성 칼시트리올을 확산시키는 것 같았다. 시험 제형 및 비-투여된 챔버에서 차이가 거의 보이지 않기 때문에, 저장 용액에서 관찰된 양은 국소적으로 적용된 시험 제형으로부터 유래하는 칼시트리올을 나타내는 것 같지 않다.

칼시트리올 흡수의 증거는, 2개의 제형(A 및 B)을 투여한 피부 절편에서, 피부 함량으로서, 관찰되었고, 도 1에 도시되어 있다. 진피 피부 층에서 어떠한 측정가능한 수준도 비-투여 피부 절편으로부터 나타나지 않기 때문에, 이들 2개의 시험 제형으로부터 측정가능한 진피 수준은 적용된 투여량으로부터의 흡수를 나타내는 것으로 해석된다. 또한, 시험 제형을 투여한 모든 표피 샘플은 비-투여 피부 절편보다 큰(약 3배 내지 약 17배) 칼시 트리올 수준을 입증하였다. 표피 칼시트리올 함량에 기초한 등급 서열은 다음과 같이 시험 제형을 정렬한다:

D > F > E > C > B > A >>> 비-투여 피부

이 등급 서열과 일치하는 것은, 시험 제형은 표피 함량이 클수록 고농도(3㎍/mL 대 1㎍/mL)의 칼시트리올(D 및 F) 을 함유하는 것을 나타난다. 매우 유사한 등급 서열은 표면 세척 결과에서 관찰된다(피부 표면으로부터 잔류 시험 물품의 회수). 어떠한 칼시트리올도 비-투여 블랭크 피부 절편의 표면 세척물에서 관찰되지 않았다.

실시예 2: 칼시트리올에 대한 표피 세포 배양물 반응과 관련된 중요 단백질의 동정 - 실시간 PCR ( RTPCR )

본 실시예 및 하기 몇몇 실시예는 칼시트리올에 대한 활성화 경로에서 단백질 또는 유전자의 동일성에 관한 추가의 정보를 제공한다. 이 실험들은 비타민 D 화합물에 대한 표피 세포의 세포상 반응에 관련된 작용 메카니즘 및 중요 단백질/유전자를 동정한다.

구체적으로, 케라티노사이트 세포주 HEKa를 칼시트리올에 노출시키는 것은 세포 과정에 대한 현저한 영향을 주는 것으로 밝혀졌다. 본원에 기재된 실험은 칼슘 채널 수송에서 칼시트리올 유도 변화 및 열 충격 단백질의 조절에서의 변화와 관련된 중요 단백질/유전자의 동정에 초점을 맞춘다. 실시간 중합효소 연쇄 반응(RTPCR; Real-time polymerase chain reaction) 방법은 이온 채널, 수송 단백질, 및 열 충격 단백질과 관련된 유전자에 대한 mRNA 수준의 변화를 확인하기 위해 본 실시예에서 사용되었다.

스크리닝 도구로서 PCR 어레이를 사용하여, 세포 내에서 칼시트리올의 생물학적 작용 방식에 대한 통찰을 잠재적으로 제공할 수 있는 분자 표적 범위를 평가하였다. mRNA 수준의 변화는 실시간 PCR 정량화를 사용하여 평가하여, 80 경로 특이적 표적(첨부 참조)을 함유하는 사전 선별된 서브세트에서 mRNA 수준을 평가하였다. PCR 어레이 분석은 2개의 유전자 그룹, 즉 열 충격 단백질과 관련된 것들(SABiosciences) 및 뉴로사이언스 이온 채널 및트랜스포터와 관련된 것들(SABioscience)을 사용하였다.

세포 배양: 1차 인간 표피 케라티노사이트(HEKa)를 인간 케라티노사이트 성장 보충제(Cascade Biologics, Inc., Portland OR)와 함께 에피라이프 배지(Epilife Medium)(Cascade Biologics, Inc., Portland OR)에서 유지시켰다. 세포를 5% CO₂ 및 37℃에서 성장시켰다.

HEKa 세포의 D3 처리: HEKa 세포를 0.1㎍/mL의 칼시트리올 또는 대조군 비이클로 처리하였다. 최종 농도 0.1㎍/mL의 칼시트리올을 수득하기 위해, 1mg의 칼시트리올을 2mL의 에탄올에 용해시키고, 1μL의 결과의 스톡을 5mL의 배지에 첨가하였다. 세포의 비이클 대조군 그룹을 1μL의 에탄올을 함유하는 5mL 배지로 처리하였다. 세포를 처리 시작 3, 6, 16, 24, 48, 또는 72시간 후에 획득하였다.

RNA 분리: 세포를 제조업자의 지시에 따라 RNeasy Mini 키트(Qiagen, Inc., Valencia CA)를 사용하여 상이한 처리 시간에서 RNA 분리를 위해 용해시켰다. RNA는 260nm에서 광학 밀도를 측정하여 정량화하였다. 제1 가닥 합성: 제1 가닥 cDNA는 제조업자의 조언에 따라 RT2 제1 가닥 합성 키트(SABiosciences, Frederick MD)를 사용하여 1㎍의 전체 RNA로부터 합성하였다.

실시간 PCR: 제1 가닥 합성으로부터의 생성물을 물로 희석하고, SYBR 그린 마스터 혼합물(SABiosciences., Frederick MD)과 혼합하고, PCR 어레이에 적재하였다. 실시간 PCR은 Biorad CFX96 상에서 PCR 어레이(Heat Shock Protein Arrays, and Neuroscience and Ion Channel Arrays)(SABiosciences, Frederick MD)로 작동시켰다. 데이타 분석은 SABiosciences 웹사이트에서 이용가능한 PCR 어레이 데이타 분석 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.

하기 표 4는 칼시트리올 처리 후 HEKa 세포에서 조절되는 열 충격 단백질 유전자 어레이 상의 유전자를 나 타낸다. 결과는 2개의 독립적인 실험에서 조절되는 유전자만을 나타낸다.

비타민 D3 처리에 의해 조절된 열 충격 단백질 어레이의 유전자

유전자 기호	단백질	조절 패턴
HSPB1	열 충격 27 kDa 단백질 1	48시간에서 하향 조절
DNAJC6	DnaJ (Hsp40) 동족체, 서브패밀리 C, 멤버 6	하향 조절
HSPA2	열 충격 70kDa 단백질 2	48시간에서 상향 조절
HSF4	열 충격 전사 인자 4	48시간에서 상향 조절

HEKa 세포에서 칼시트리올 처리에 의해 mRNA 수준에서 조절된 2개의 유전자는 HSPB1 및 HSPA2이었다. HSPB1은 세포막 뿐만 아니라 시토졸, 미토콘드리아 및 골지체에서 발현되는 27 kDa 단백질이다. HSPA2는 세포막 및 핵에 존재하는 70 kDa 단백질이고, HSF1에 의해 조절된다. HSPB1 및 HSPA2 둘 다 세포자멸과 관련이 있다. HSF4는 레틴산에 의해 조절되고, 세포 분화에 관여한다. DNAJC6은 HSP40 그룹 단백질에 속한다. 이는 클라트린 피복 소낭 및 세포질에 존재한다.

유사하게는, 3개의 독립적인 실험으로부터 일치하는 뉴로사이언스 및 이온 채널 어레이(Neuroscience and Ion Channels Array)로부터 수득한 결과가 하기 표 5에 요약되어 있다.

비타민 D3 처리에 의해 조절된 신경과학 및 이온 채널 어레이의 유전자

유전자 기호	유전자	조절 패턴
SLC1A1	용질 담체 패밀리 1 (신경/표피 고친화성 글루타메이트 수송체, 시스템 Xag), 멤버 1)	16시간에서 상향 조절
KCNB2	칼륨 전압-게이트 채널, Shab-관련 서브패밀리, 멤버 2	24시간까지 상향 조절
KCNN4	칼륨 중간체/작은 전도성 칼슘-활성화 채널, 서브패밀리 N, 멤버 4	48시간에서 상향 조절
SLC1A3	용질 탐체 패밀리 1 (신경아교 고친화성 글루타메이트 수송체), 멤버 3	48시간에서 하향 조절

글루타메이트 수송체 및 칼륨 채널의 변화가 일관되게 관찰되었다. SLC1A1(EAAC1 또는 EAAT3라고도 알려짐)은 막을 통과하는 흥분성 신경전달물질 글루타메이트의 수송에 주로 관여하는 것으로 알려져 있다. 이러한 용질 담체 단백질은 심장 및 피부와 같은 조직 중의 신경계 외부에서 발견되었다. 래트 케라티노사이트에서는, 상처 치유시에 글루타메이트 시그널링 및 SLC1A1의 관여를 나타내는 증거가 있다(Genever et al., 1999). 현재 흑색종에 대한 상처 임상 시험에 있어서 약물(Clinical Trials. gov, Mosby's Drug Consult, 13th Edition)인 리루졸에 의한 SLC1A1의 억제는 피부 세포에서 SC1A1의 생물학적 역할을 나타낸다. SLC1A1 이 손상된 운동 뉴런에서 항-세포자멸 메카니즘에 관여하는 경우(Kiryu-Seo et al., 2006), SLC1A1이 HEKa 세포에서 D3 처리에 의해 상향 조절되는 본 실험에서의 관찰은 잠재적 보호 메카니즘 경로 연관성을 시사한다.

SLC1A3(EAAT1 또는 EA6라고도 알려짐)은 나트륨 의존성 글루타메이트 및 아스파르테이트 수송을 가능하게 하는 또 다른 용질 담체이다. 통상 뇌의 신경아교 세포에서 발견되는 이러한 수송체는 글루타메이트의 시냅스 공간을 청소하는데 관여함으로써, 시냅스후 뉴런의 연장된 분극을 방지한다. SLC1A3은 신경아교 유도된 향신경성 인자(glial derived neurotropic factor, GDNF) 및 포스포디에스테라제 6B(PDE6B)와 상호작용하는 것으로 알려져 있다. SLC1A3가 세포독성의 감소에 관여하는 것은 가능하다.

KCNN4는 칼륨 중간체/소형 전도성 칼슘 활성화 채널, 서브패밀리 N, 구성원 4이다. 이의 활성화 후, 세포막은 과분극화되고, 세포 내로의 칼슘 유입이 증가된다. 이러한 칼륨 채널은 신경계 외부의 다수의 조직에 편재되어 있다.

칼륨 전압-게이트 채널, Shab-관련 서브채널, 구성원 2인 KCNB2는 칼시트리올 처리후 약 24시간에 상향 조절된다. 이러한 칼륨 채널은 신경전달인자 방출, 인슐린 분비, 및 평활근 수축을 조절하는 데 있어서 중요하다.

칼시트리올은 이들 실험에서 사용되었지만, 당업자는 본 발명의 또 다른 비타민 D 화합물(예를 들어, 본원에서 기재기 것들)도 표적 유전자 발현을 조절하는데 있어서 유사한 활성을 나타낼 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 소정 구체예에서, 본 발명의 비타민 D 화합물은 이들 실험에서 칼시트리올의 프로파일과 유사하거나 동일한 유전자 조절 프로파일, 예를 들면, 칼시트리올에 의해 유사하게 상향 조절된 하나 이상의 표적 유전자의 발현(mRNA 및/또는 단백질)의 상향 조절, 또는 칼시트리올에 의해 유사하게 하향 조절된 하나 이상의 표적 유전자의 발현(mRNA 및/또는 단백질)의 하향 조절을 나타내는 것으로 생각된다.

실시예 3: 칼시트리올 -항체 어레이에 대한 표피 세포 배양 반응과 관련된 중요 단백질의 동정

칼시트리올 자극 시 단백질 변화에 대한 평가도, 700개 이상의 잠재적 표적 단백질의 변화를 스크리닝할 수 있는 항체 마이크로어레이를 활용하여 평가하였다.

본 실험에서, 700개 이상의 표적 단백질에 대한 항체를 포함하는 항체 마이크로어레이(Panorama XP725 Antibody Array, Sigma)를 사용하여, 각각 약 3, 6 또는 24시간 동안 칼시트리올로 처리된 HEKa 세포에서 단백질 농도/수준의 변화를 평가하였다. 요약하면, 처리된 HEKa 세포를 먼저 수득한 다음, 추출하여 가용성 단백질 상청액을 수득하였다. 각 샘플(1mg/mL)로부터 추출된 단백질 샘플(~ 총 1mg)의 2개 부분을 각각 형광 염료(각각 Cy3 및 Cy5)로 표지하였다. 과다한 염료를 단백질 샘플로부터 제거하고, 그 결과의 표지된 단백질 샘플을 마이크로어레이 배양에 사용하였다.

초기 시점(예, 3시)에서의 특정 표적 단백질과 비교하여 후기 시점(예, 6시 또는 24시)에서 특정 표적 단백질의 발현 수준을 측정하기 위해, 샘플을 상이한 표지로 표지하였다(예, Cy3으로 표지된 3시 추출물, Cy5로 표지된 6시 또는 24시 추출물). 이어서, 동일한 양의 전체 단백질을 함유하는 2개의 표지된 샘플을 혼합하였다(예, Cy3 표지된 3시 샘플을 Cy5 표지된 6시 또는 24시 샘플과 각각 혼합하였다). 마이크로어레이 칩과 함께 배양(제조업자가 권장한 프로토콜에 따라)한 후, 칩을 세척하여 건조하였다. 이어서, 마이크로어레이를 형광 레이저 스캐너로 스캐닝하여 Cy3 및 Cy5 염료의 상대 형광 강도를 측정하였다.

특정 형태의 표적 단백질의 양이 시간에 따라 증가(또는 감소)하는 경우, 후기 시점(예, Cy5)과 관련된 보다 많은(또는 보다 적은) 염료가 마이크로어레이에 체류될 것이다. 예를 들어, 본 실험에서, 최초의 시점(예, 3시)은 기준선으로 사용되어 2개의 후기 시점(예, 6시 vs. 24시)에서 상대 단백질 발현 수준을 측정한다. 보다 많은 Cy5가 6시 내지 24시에 어레이에 의해 체류되는 경우, 표적 단백질의 발현 수준은시간 기간에 따라 증가하였다. 반대로, 6시 내지 24시 사이에 체류된 Cy5가 감소되는 경우, 표적 단백질 발현 수준은 감소된다.

이 방법을 이용하는 초기 분석은 상대 발현 수준 변화(증가 또는 감소) > 2배를 나타내는 이들 표적 단백질에 초점을 맞췄다. 전체적으로, 칼시트리올 처리된(24시간) HEKa 세포를 사용한 항체 어레이 실험은 비타민 칼시트리올에 대한 반응에 있어서 발현 수준이 현저히 변화된 하기 표적 단백질(표 6 및 7에서)을 동정하였다.

칼시트리올 처리 후 단백질 수준이 증가(> 2배)한 표적 단백질

아밀로이드 전구체 단백질	HDAC2
ARTS	HDAC6
ASAP1 Centaurin b4	ILK
BACH1	MAP 키나제 활성화 단백질 키나제2 MAPKAPK2
Bclx	MAP 키나제 ERK1
BclxL	멜라노코르틴3 수용체
BID	미오신 IX Myr5
Bmf	신경필라멘트 200
CENPE	산화 질소 합성 효소 bNOS
cMyc	p120ctn
Cofilin	PAD14
Connexin 32	Par4 전립선 세포자멸 반응 4
Csk	프레세닐린1
CtBP1	증식 세포 단백질 Ki67
DcR2	단백질 키나제 Ba
디메틸 히스톤 H3 diMeLys4	PUMA bbc3
디메틸 히스톤 H3 diMeLys9	ROCK1
디스트로핀	S100
ERK5 BIG MAPKBMK1	SHPTP2
에스트로겐 수용체	Sin3A
FKHRL1 FOXO3a	물질 P 수용체
병소 포착 키나제 pp125FAK	시냅토포딘
FOXP2	종양 괴사 인자 a
글루탄산 디카르복실라제 65	유비퀴틴 C 말단 하이드롤라제 L1
글루탐산 디카르복실라제 GAD65 67	유보모룰린 ECadherin
G튜불린	비트로넥틴

칼시트리올 처리 후의 단백질 수준이 감소(> 2배)된 표적 단백질

Crk II

성장 인자 독립 1

세린 트레오닌 단백질 포스파타제 1b

카텝신 D

형질전환 성장 인자 b pan

WAVE

단백질 티로신 포스파타제 PEST

CD40

동일한 단백질 항체 어레이 방법을 이용하여 24 시간에 칼시트리올 처리된 HEKa 세포의 평가는 현저히 상향 조절된 약 50개 단백질을 동정하였다. 이들 단백질은 일반적으로 4개 범주에 속한다: (i) 전사 및 세포 주기 대조군(표 8); (ii) 구조, 세포골격, 및 부착 단백질(표 9); (iii) 세포자멸 조절 단백질(표 10); 및 (iv) 신경 세포 분화 및 알츠하이머 질환(표 11).

세포 주기 및 전사 대조군 관련 과발현된 단백질 (칼시트리올 처리 24 시간 후)

단백질	기능
BACH1	전사 인자 (알츠하이머 질환)
CENPE	세포 주기의 상 G2에서 축적되는 동원체 단백질
cMyc	전사 인자 (암 종양 유전자)
C-src 트리오신 키나제 (Csk)	세포 성장 (암)
CtBP1	전사 억제인자
디메틸 히스톤 H3 diMeLys4	전사 조절
디메틸 히스톤 H3 diMeLys9	전사 조절
에스트로겐 수용체	리간드 의존성 핵 수용체
FKHRL1 FOXO3a	ROCK 키나제 및 NO 시그널링 관련 전사 인자
FOXP2	뇌, 폐, 장 발병의 전사 조절인자
HDAC2	유전자 발현 조절
MAP 키나제 활성화 단백질 키나제2 MAPKAPK2	많은 세포 과정(스트레스 및 염증 반응, 핵 전달, 유전자 발현 조절 및 세포 증식)에 연관된 키나제. 열 충격 단백질 HSP27은 기질의 하나인 것으로 밝혀졌다.
MAP 키나제 ERK1	다양한 세포외 시그날에 대한 반응에서, 증식, 분화, 및 세포 주기 진행과 같은, 다양한 세포 과정을 조절하고, 핵 단백질을 인산화하는 시그널링 캐스캐이드에서 작용함
멜라노코르틴3 수용체	호르몬 수용체
증식성 세포 단백질 Ki67	증식 마커
S100	다중 세포 과정의 조절과 관련된 칼모둘린-유사 칼슘 결합 단백질
SHPTP2	다양한 세포 시그널링에서 조절 역할을 하는 키나제
Sin3A	전사 조절 단백질

구조, 세포 골격, 및 부착 관련 과발현 단백질 (칼시트리올 처리 24시간 후)

단백질	기능
ARTS	세포골격 구성을 조절함
ASAP1 센타우린b4	액틴 세포골격을 조절함
코필린	액틴 필라멘트를 가장함
콘넥신 32	말초 미엘린의 주성분
디스트로핀	세포골격 결합의 거대 단백질
병소 부착 키나제 pp125FAK	병소 부착 키나제의 인산화는 이동을 위해 유도된 케라티노사이트에서 증가된다.
G 튜불린	미세소관, 방추체 극
미오신 IX Myr5	운동 단백질
신경필라멘트 200	신경 세포 관련 구조 단백질
p120ctn	부착 및 시그날 전도
PAD14	아르기닌 잔기를 시트룰린 잔기로 전환함; 퇴행성 과정을 경험한 세포에서, 중간 필라멘트 단백질 및 중간 필라멘트-관련 단백질을 조절할 수 있음
ROCK1	액틴 안정성에 기여하는 키나제
유보모룰린 ECadherin	Ca-의존성 세포 부착 분자, 표피 세포 인지 및 부작을 조절하는 기능을 가진 막관통 당단백질
비트로넥틴	세포 부착 및 확산을 촉진함

세포자멸 조절 관련 과발현 단백질 (칼시트리올 처리 24시간 후)

단백질	기능
Bclx	세포자멸 조절
BclxL	세포자멸 조절
BID	세포자멸 조절
Bmf	세포자멸 조절
DcR2	수용체는 세포외 TRAIL-결합 도메인, 막관통 도메인, 및 결절된 세포질 사멸 도메인을 함유한다. 이 수용체는 세포자멸을 유도하지 않고, TRAIL-유도 세포자멸을 억제하는 것으로 밝혀짐.
ERK5 BIG MAPKBMK1	배드(Bad)의 인산화로 인한 세포자멸으로부터 내피 세포를 보호함.
인테그린-결합 키나제 (ILK)	인테그린-매개 시그날 전도의 조절은 PKB/Akt 경로에 관련된 세포자멸을 방지할 수 있음.
단백질 키나제 Ba	세포 생존 및 세포자멸의 억제와 관련된 (Akt)
PUMA bbc3	세포자멸 조절인자

신경 세포 분화 및 알츠하이머 질환과 관련된 과발현 단백질 (칼시트리올 처리 24시간 후)

단백질	기능
아밀로이드 전국체 단백질	아밀로이드 전구체 단백질(APP)은 많은 조직에서 발현된 통합 막 단백질이고, 뉴론의 시냅스에서 농축된다. 이의 주요 기능은 공지되지 않았지만, 시냅스 형성[2] 및 신경 가소성[3]의 조절 인자로서 관련된다.
BACH1	전사 인자 (알츠하이머 질환)
프레세닐린1	APP(알츠하이머 질환에서 관찰된 돌연변이)의 절단에 책임이 있는 감사 세크라타제의 부성분
글루탐산 디카르복실라제 65	신경전달인자 생성 (정신분열병)
글루탐산 디카르복실라제 GAD65 67	신경전달인자 생성 (정신분열병)
신경필라멘트 200	신경 세포 관련 구조 단백질
산화질소 합성효소 bNOS	유도성, 세포 시그널링, 면역계
물질 P 수용체	신경펩티드 수용체
시냅토포딘	신경세포에서 척추 장치 형성에 관련된 액틴 결합 단백질
콘넥신 32	말초 미엘린의 주성분
종양 괴사 인자 a	면역 세포 조절
유비퀴틴 C 말단 하이드롤라제 L1	신경세포 특이성 (알츠하이머 및 파키슨 질환)

실시예 4: 칼시트리올 -프로테옴 분석( Calcitriol - Proteomic Analysis)에 대한 표피 세포 배양 반응과 관련된 주요 단백질의 동정

일련의 HEKa 배양물을 칼시트리올로 처리하고, 세포 펠렛을 칼시트리올3 노출 한지 3, 6 및 24시간 후에 수거하였다. 이어서, 세포 펠렛은 2-D 겔 및 웨스턴 블롯 분석과 같은 프로테오믹 방법을 사용하여 분석하였다. 하기에 기재된 실험에서, HEKa 세포를 0.1㎍/mL 칼시트리올로 처리하고, 3, 6 및 24 시간에서 수득한 샘플을 2-D 겔 전기영동 및 관련된 비교 분석(결과는 도시하지 않음)에 의해 처리하였다.

모두에서, 비교 연구에서의 약 458개 단백질 스폿의 분석을 3, 6 및 24시간 처리 샘플에 대해 대조군 샘플과 비교하여 수행하였다. 통계학적으로 유의적인 차이 변화를 나타내는 6개 스폿을 동정하였다. 이들 스폿을 잘라내고, 이들의 단백질 함량은 트립신 소화 및 질량 분석 특징화에 의하여 서열을 확인하였다.

결과(표 12)는, HEKa 케라티노사이트 샘플로부터의 6개 스폿 세트가, 통상의 오염물로 종종 관찰된 케라틴과는 반대로, 순수한 내인성 케라틴을 함유한다는 것을 보여 주었다. 2개의 S100 단백질은 글루타티온 S-트랜스퍼라제 및 갈렉틴 1과 함께, 강력하게 조절되는 것으로 확인되었다. 갈렉틴 1은 글루코실화되었음을 입증하였다.

2-D 겔 전기영동 연구에 기초한 칼시트리올에 의해 강하게 조절되는 것으로 확인된 단백질

스폿	확인된 단백질	명칭	반응	기능	세포 위치
4	글루타티온 S-트랜스퍼라제	GST	3, 6, 및 24 시간에서 상향	GST 수송	세포질
2	케라틴 1	KRT1	6 시간에서 상향 및 24 시간에서 하향	중간체 필라멘트	세포질
8	케라틴 17	KR17	24 시간에서 하향	중간체 필라멘트	세포질
10	S100 A9 (칼프로텍틴)	S100A9	6 및 24 시간에서 하향	칼슘 결합 단백질	세포질
14	S100 A13	S100A13	6 및 24 시간에서 상향	칼슘 결합 단백질	세포질
27	갈렉틴 1	LGALS1	6 및 24 시간에서 상향	베타-갈락토시드-결합 단백질	세포외

2개의 S100 단백질(A9 및 A13)은 칼프로텍틴 패밀리(calprotectin family)의 단백질에 속한다. 이 패밀리에는 21개 유형의 상이한 이들 저분자량 단백질이 있다. 이들 S100 단백질은 칼슘(EF-핸드 모티프)를 결합하고, 각 유형은 세포 특이적 방식으로, 그리고 환경 인자에 의존적인 수준으로 발현된다. 다양한 질환이 변경된 S100 단백질 수준과 관련이 있다 (심근증, 신경변성 및 염증 질환, 및 암). S100 단백질도 칼시트리올과 접촉시에 상향 조절되는 것으로 항체 어레이 결과에서 확인되었음을 주목한다.

실시예 5: 케라티노사이트 성장에 대한 칼시트리올의 효과

일련의 HEKa 배양물을 상이한 농도의 칼시트리톨로 처리하고, HEKa 세포의 성장 거동을 소정의 성장 기간 후에 분석하였다. 모든 실험은 96웰 플레이트 포맷으로 수행하였다. 각 웰은 동일한 양의 HEKa 세포를 약 100μL의 배지(통상 2000~5000 세포/웰)에 함유하였다. 칼시트리올을 에탄올에 용해시켜 스톡 용액을 제조하였다. 스톡 용액을 4.0 ㎍/mL 내지 약 15.5ng/mL(9개 시험 농도)의 범위를 포함하는 성장 배지에서 1:2 로 계열 희석하였다. 약 100μL의 각 시험 농도의 칼시트리올을 상응하는 시험 웰에 첨가하여, 최종 부피 약 200μL/웰을 수득하였다. 시험된 칼시트리올 농도는 2.0 내지 0.008㎍/mL 범위에 있다(예, 96웰 플레이트에서 컬럼 2 내지 10에 상응함). 컬럼 11은 네가티브 대조군(칼시트리올 비함유)으로서 사용하였다. 모든 실험은 이중으로 수행하였다.

도 2에 보인 바와 같이, 칼시트리올은 약 0.008 내지 2.0㎍/mL의 농도 범위에 걸쳐 HEKa 세포 내에서 적정하였다. 최저 수준의 칼시트리올은 HEKa 세포가 우수한 내성을 가지고 있고, 칼시트리올은 HEKa 세포 성장을 온화하게 자극하는 것으로 나타났다(~ 10 내지 20%). 그러나, 약 1.0㎍/mL 이상의 칼시트리올 농도에서, 세포 성장은 억제된다. 칼시트리올에 대한 HEKa의 전체 투여량 반응은 약 6주 동안에 걸쳐 일련의 19개 독립적 실험에 걸쳐 일정하였다(데이타는 도시하지 않음).

실시예 6: 암 세포 성장에 대한 칼시트리올의 효과

정상 케라티노사이트 HEKa에서 관찰된 것과는 달리, 현저한 성장 촉진 또는 성장 억제 효과가, SkBr-3(유방 선암 암, Her2 과발현), SKMEL-28(흑색종), PaCa2(췌장 암종), NCI-ES-0808, 및 NIH-3T3(비사멸 섬유아세포)을 포함하는, 시험된 대부분의 암 또는 비사멸 세포주에서 관찰되지 않았다. 그러한 암/비사멸 세포주에 의해 나타난 한 가지 예시적 성장 곡선은 췌장 암종 세포주 PaCa2에 대해 도 3에 도시되어 있다. PaCa2의 성장은 광범위한 칼시트리올 농도에 대해 영향을 미치지 않음에 주목한다.

2개의 시험된 암 세포주, MCF-7(p53 돌연변이를 갖는 유방암) 및 HepG2(간암)는 낮은 비타민 D3 농도(0.05 내지 0.25㎍/mL)에서 칼시트리올 자극 및 높은 칼시트리올 농도(> 0.5㎍/mL)에서 칼시트리올 억제에 유사하게 반응하였다. 도 4 참조.

이들 데이타는, 소정 농도 한계까지 정상 케라티노사이트(예를 들면, HEKa)에 적용하는 경우, 대상 비타민 D 화합물이 암 세포 성장을 동시에 촉진시키지 않고서 이들 정상 케라티노사이트의 성장을 촉진시킬 수 있음을 시사한다. 실제, 농도 한계를 초과하면, 비타민 D 화합물은 정상 케라티노사이트의 성장을 억제할 수 있다.

실시예 7: 다양한 화학요법 약물로부터 HEKa 세포에 대한 칼시트리올의 보호 효과

이 실시예는, 몇 개의 예외와 함께, 본 발명의 비타민 D 화합물이 대부분 형태의 최전방 화학요법 약물의 세포독성 효과로부터 정상 케라티노사이트(예를 들면, HEKa)를 보호할 수 있음을 증명한다. 구체적으로, 17개 항암약물을 시험하여 이들 약물의 세포독성 효과에 대한 칼시트리올의 영향을 평가하였다. 약물 명칭 및 이들 각각의 작용 메카니즘이 하기 표에 열거되어 있다.

HEKa 세포에서 칼시트리올의 화학보호 활성에 대해 시험된 약물

시험된 약물	메커니즘
독소루비신	세포독성
5-FU	피리미딘 항대사물질
타목시펜	에스트로겐 수용체에 결합함
이리노테칸	토포이소머라제 1 저해제
파클리탁셀	유사분역 저해제
카르보플라틴	DNA 알킬화제
에토포시드	토포이소머라제 2 저해제
사이클로포스파미드	알킬화제
시스플라틴	DNA 알킬화제
에를로티니브(타르세바)	EGFR 티로신 키나제 저해제
겜시타빈	피리미틴 항대사물질
스타우로스포린	비특이적 키나제 저해제
빈크리시딘	미세소관 저해제
이마티니브(글리벡)	티로신 키나제 저해제 (abl, c-kit, PDGF-R)
게피티니브 (이레사)	EGFR 티로신 키나제 저해제
소라페니브	티로신 키나제 저해제 (Raf, VEGF-R2, c-kit, PDGF-R)
다사티니브	티로신 키나제 저해제 (BCR/ABL)

처음 일련의 실험에서, 다수의 키나제 저해제 기반 약물을, HEKa 세포에 대한 보호 효과를 제공하는 0.1㎍/mL 칼시트리올의 능력을 평가하도록 설계된 분석에서 사용하였다. 이것들은 에를로티니브(타르세바), EGFR Tyr 키나제 저해제; 게푸투비브(이레사), EGFR Tyr 키나제 저해제; 소라페니브, 몇몇 Tyr 키나제의 저해제(Raf, VEGF- R2, c-키트, PDGR-R); 다사티니브, BCR/ABL Tyr 키나제 저해제; 및 비교적 비특이적 키나제 저해제인 스타우로스포린을 포함한다.

이들 실험에서 수득된 투여 곡선은, 낮은 약물 용량 수준(전신으로 전달된 화학요법을 받은 환자 피부에 영향을 미치는 것과 다르지 않음)에서 칼시트리올은 소정 성장 자극을 제공하고 HEKa 세포를 보호하는 일반적 동향을 나타낸다(도 5 내지 9 참조). 또한, 칼시트리올은 보다 비특이적 키나제 저해제와 비교하여 보다 특이적 키나제 저해제 대한 보다 현저한 보호 효과를 갖는 것으로 나타났다.

유사하게는, 칼시트리올도 시스플라틴 및 카보플라틴과 같은, 알킬화제의 저용량 수준에 대하여 중간 보호 수준을 나타내었다(도 10 및 11 참조).

이리노테칸은 아마도 토포이소머라제 I과의 상호작용을 통해 세포 성장을 억제하는 것 같다. 이리노테칸에 대한 양성 보호 효과도 칼시트리올의 존재하에 관찰되었다(도 12 참조).

파클리탁솔은 유사분열 억제제이다. 0.1㎍/mL의 칼시트리올의 존재는 파클리탁솔에 대하여 일부 보호 효과를 제공한다(도 13).

5-플루오로우리실(5-FU)과 같은, 피리미딘 항대사물질 기반 약물은 다양한 방식으로 작용하지만, 원칙적으로 티미딜레이트 합성효소 저해제로서 작용한다. 5-FU는, DNA 복제에 필요한 티민딘의 합성을 차단한다. 따라서, 5-플루오로우라실은 피부의 화학선(일광) 각화증 및 일부 형태의 기저 세포 암종을 치료하는데 국소적으로 사용되었다. 5-FU에 대하여 적어도 중간 보호 효과가 0.1㎍/mL의 칼시트리올이 존재할 때에 보인다(도 14).

겜시타빈은, 데옥시시티딘의 2' 탄소 상의 수소원자가 불소원자로 치환된 뉴클레오사이드 유사체이다. 플루오로 우라실 및 기타 피리미딘 유사체와 유사하게, 겜시타빈은 DNA 복제 동안 핵산(이 경우, 시티딘)의 빌딩 블록 중의 하나를 대체한다. 겜시타빈은 다양한 암종: 비소형 세포 폐암, 췌장암, 방광암 및 유방암의 치료에 사용된다. 도 15는, 0.1㎍/mL의 칼시트리올이 존재할 때, 겜시타빈에 대하여 적어도 중간 보호 효과가 관찰됨을 나타낸다.

한편, 칼시트리올은 독소루비신의 세포독성 효과에 대하여 현저한 보호 효과를 제공하는 것으로 나타나지 않았다 (도 16). 또한, 타목시펜에 대하여 임의의 보호 효과는 약하다(도 17). 타목시펜은 종양 및 기타 조직 표적물상의 에스트로겐 수용체에 경쟁적으로 결합하여, DNA 합성을 감소시키고 에스트로겐 효과를 억제시키는 핵 복합체를 생성한다.

상기 데이타와 일치하게, 도 18 중의 데이타는, HEKa 케라티노사이트가 칼시트리올에 의해 성장이 자극되었고, 5- FU에 대한 일부 보호 수준이 HEKa 세포에서 관찰되었음을 나타낸다. 흥미롭게도, 3개의 시험된 암 세포주, 즉 Hep-G2, PaCa-2 및 SKMEL-28에서, 5-FU 처리의 ED50 곡선은 0.1㎍/mL 칼시트리올 보충물도 갖는 것들과 현저히 상이하지 않았다. Hep-G2 세포는 칼시트리올 처리에 의해 완만하게 자극되었지만, 이의 5-FU ED50 곡선은 칼시트리올의 존재하에도 실질적으로 변화하지 않았음에 주목한다.

유사하게는, 2 계대 동안 2 내지 0.1㎍/mL의 칼시트리올에 대한 하기 4개 시험된 암 세포주: Hep-G2, MCF-7, PC-2 및 PaCa의 노출은 다른 약물(예, 독소루비신, 시스플라틴, 및 에를로티니브)에 대한 이들 세포의 반응을 변경시키지 않았다.

상기 결과들은, 칼시트리올이, 암세포에 대한 화학요법의 효과를 길항시키지 않고서, 화학요법(예를 들면, 5-FU 사용)동안 정상 케라티노사이트(예를 들면, HEKa)를 보호할 수 있음을 시사한다.

HEKa 세포에서 관찰된 것과 같이, 칼시트리올은 SkBr-3, SKMEL-28, PaCa-2, MCF-7, NCI-ES-0808, Hep-G2 및 NIH-3T3과 같은, 암/비사멸 세포에 대한 독소루비신의 세포독성 효과를 인지가능하게 변경시키는 것으로 나타내지 않았다(도 19 참조).

또한, 시판 약물의 칼시트리올과의 가능한 상승작용 효과가 연구되었다. 이들 실험에서, 선택된 시판 약물은 세포 배양을 위한 최종 목적 농도보다 4배 높은 농도에서 시작하여 연속으로 희석시킨다. 한편, 0.4㎍/mL 칼시트리올의 스톡을 제조한 다음, 연속 희석된 약물(1:1의 비율)과 혼합하였다. 이어서, 약물/칼시트리올 혼합물을 적어도 15분 동안 배양하고, 세포 배지에 (100μL 대 100μL의 비율로) 첨가하였다. 따라서, 최종 칼시트리올 농도는 0.1㎍/mL이었다.

약물 처리 기간은 통상 3일이었다. 3일 말기에, 96웰 플레이트의 배경 OD를 280nm에서 판독한 후, 20μL의 "기질 세포 역가 96 수성 1성분 용액 시약(Substrate Cell Titer 96 Aqueous One Solution Reagent)"(Promega)을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃ 배양기로 돌리고, 490nm에서 이의 OD를 대략 1.5의 OD에 도달할 때까지 매 시간 판독하였다. 순 OD 증가는 예비 기질 OD 판독치를 감하여 계산하였다.

세포에 대한 약물의 영향은, 대조군 웰(약물 비함유)의 OD와 관련하여 상이한 농도에서의 OD를 비교하여 계산하였다. 약물 농도의 함수로서 순 OD의 결과를 플롯팅하고, 이를 이용하여 ED50 값을 측정하였다.

HEKa 세포 결과의 분석은 5-FU, 독소루비신, 타목시펜, 이리노테칸, 파클리탁셀, 카보플라틴, 스타우로스포린, 빈크리스틴, 시스플라틴, 에를로티니브, 겐시타빈, 이미티니브, 게피티니브, 소라피니브 및 다사티니브를 포함하는 대부분 시험 약물과 칼시트리올 사이에 어떠한 상호작용도 없음을 나타낸다. 또한, 약물 병용물을 다른 세포에 대해 시험하는 경우에도 동일한 결과를 얻었다. 따라서, 어떠한 특정 이론에 국한시키고자 하는 것은 아니지만, 칼시트리올 및 상기 약물의 작용 메카니즘은 상이한 것으로 나타났다.

실시예 8: 칼시트리올을 사용한 세포의 전처리: 화학요법 약물의 존재 및 부재 하에 칼시트리올의 세포-기반 분 석 시험

세포 생존율을 평가하는 상기 세포-기반 분석을 본 실시예에 사용하여, 선택된 화학요법 약물의 작용에 대한 칼시트리올의 잠재적 보호 효과를 평가하였다. 각 세포주는 0.1㎍/mL 칼시트리올의 존재 하에 2개 세포 계대 동안 성장시켰다. 이어서, 이들 전처리된 세포를 사용하여 세포-기반 분석을 설정하였다. 또한, 비처리 세포를 사용하여 이중 약물/칼시트리올 농도 하에 병행 실험을 확립하였다. 이는 화학요법 약물의 투여 전에 연장된 칼시트리올 노출의 잠재적 효과에 대한 병행 비교를 가능하게 하였다.

5개 세포주 각각을 0.1㎍/mL 칼시트리올의 존재 하에 2개 세포 계대 동안 성장시킨 후, HEKa 세포만이 이들의 전체 성장 및 형태에 있어서 현저히 영향받았다. 4개의 암 세포주는 계속 성장하고, 이들의 일반적인 형태학적 외관은 변화되지 않았다. 그러나, HEKa 세포는 연장된 칼시트리올 노출 후에 성장을 멈췄고, 이들의 형태는 칼시트리올 처리 전의 보다 분지된 외관과는 반대로, 한 방향으로 신장된 것으로 변하였다. 이러한 세포주의 경우, 새로운 세포 배치를 시작하고, 화학요법 약물의 존재 하에 시험하기 전에, 칼시트리올의 존재 하에 단일 계대에만 노출시켰다.

3개의 통상적으로 사용된 화학요법 약물(독소루비신, 시스플라틴, 및 에를로티니브)을 선별하여 칼시트리올 처리된 세포를 평가하였다. 시판 약물의 칼시트리올과의 가능한 상승 효과 또는 보호 효과를 조사하였다. 이들 실험에서, 시판 약물은 세포 배양을 위한 최종 목적 농도보다 4배 높은 농도에서 개시하여 연속으로 희석하였다. 0.4㎍/mL의 칼시트리올의 스톡을 제조하고, 연속 희석된 약물에 (1:1 비율로) 첨가하였다. 약물과 칼시트리올의 혼합물을 적어도 15분 동안 항온 처리하고, 세포에 (100μL 대 100μL의 비율로) 첨가하였다. 따라서, 최종 칼시트리올 농도는 0.1㎍/mL이었다.

일관성을 제공하고 직접 비교가 가능하도록, 상기 기재된 방법에 따라 분석을 수행하였다. 결과는 생존 새포의 총 수의 측정에 기반하였다. 결과(도시하지 않음)는 칼시트리올 전처리가 세포 배양물에 대한 화학보호 효과에 필수적이지 않음을 나타낸다. 결과는 전처리 그룹과 동시 처리 그룹 사이에서 거의 동일하였다. 따라서, 칼시트리올의 국소 적용은 화학요법의 전신적 전달과 동시에 적용될 수 있다. 단계적 적용은 필요하지 않다.

실시예 9: 새로운 칼시트리올 제형에 의한 화학요법-유발 탈모증(CIA)으로부터의 보호

탈모증은 현재 치료적 개입이 없는 화학요법의 가장 골치아픈 부작용 중의 하나이다. 신생아 래트는, 성장기 모공 패턴이 사람과 유사하기 때문에, 화학요법-유발 탈모증(CIA)를 연구하기 위한 우수한 모델인 것으로 입증되었다.

본 연구에서, 세코스테로이드 칼시트리올(USP 등급)을 국소 제형(40%(w/w) 프로필렌 글리콜, USP; 및 60%(w/w) 탈수 알콜, 200 proof, 비변성 USP)으로 전달되어 용량 및 시간 의존적 방식으로 CIA를 치료/예방하였다.

구체적으로, 새끼를 가진 롱 에반스(Long Evans) 및 스프라그 다울리(Sprague Dawley) 래트를 Harlan Laboratories, Inc.로부터 구입하였다. 이들을 수용하고, 적용가능한 동물 취급 규칙 및 규정에 따라 먹이를 주었다. 새끼는 실험 개시 전에 48시간 동안 순응시켰다. 세코스테로이드 칼시트리올 제형(상기 참조) 또는 비이클 대조군(칼시트리올 비함유)을 두경부 상에 5일째에 개시하여 연속 6일 동안 매일 국소 적용하였다. 래트를 6시간 동안 이들의 한배 새끼 및 어미로부터 격리시켰다. 이어서, 처리된 부분은 비누 및 물로 세정하고, 새끼를 이들의 한배 새끼에게 돌려놓았다. 13일째에, 래트에게 에토포시드(3 일 동안 매일 1.5mg/kg), 사이클로포스파미드(CTX)(37.5mg/kg 1회), 또는 병용의 사이클로포스파미드(35mg/mg 1회) 및 독소루비신(3일 동안 매일 2.5mg/kg)을 제공하였다. 모든 화학요법제는 시그마(Sigma)로부터구입하였고, 0.1mL의 전체 부피로 복강내(i.p.) 제공하였다. 탈모증은 화학요법의 최종 투여 10일 후에 기록하였다.

생후 5일째에, 녹색백혈병이 이식된 래트의 실험의 경우, 래트를 각각 45마리의 3개 그룹으로 무작위로 나누었다. 모든 래트에게 0.1mL의 무혈청(SF) RPMI 중 1×105 녹색백혈병 세포주 MIAC51(i.p.)을 투여하였다. MIAC51을 L-글루타민 및 10% 소 태아 혈청으로 보충된 RPMI 1640에서 37℃ 5% CO₂, 100% 습도 배양기에서 배양하였다. 세포는 50% 컨플루언시(1.5 × 106mL)가 될때까지 성장시키고, 제50mL 원추형 튜브에 수집거고, 600g × 10분으로 실온에서 원심분리하고, 1 × 106/mL의 농도로 SF-RPMI에 재현탁하였다. 그룹 1 래트는 추가 처리가 없었다. 그룹 2 래트는 13일째에 국소 비히클 및 CTX를 제공하였다. 그룹 3 래트는 13일째에 국소 칼시 트리올 제형(0.1㎍) 및 CTX가 제공되었다. 국소 적용은 상기한 바와 같이 수행하였다.

생후 23일째에, 혈액 샘플을 모든 래트로부터 채취하고, 분별을 수행하였다. 백혈병을 갖는 래트를 희생시키고, 백혈병이 없는 래트를 유지시키고, 제2 분별을 31일째에 백혈병이 검출되는 임의 시점에서 수행하고, 동물을 CO₂ 질식으로 희생시켰다.

에토포시드를 받은 그룹에서 전체 신체 탈모증이 관찰되었음을 결과가 입증하였다. 이와는 대조적으로, 6시간 동안 0.1㎍의 칼시트리올로 처리한 래트에서는, 부분 국지화 보호(partial localized protection)가 모든 동물에서 관찰되었다. 0.3㎍ 칼시트리올을 받은 그룹에서는, 전체 신체 보호를 이루었다. 도 20a 및 20b 참조.

사이클로포스파미드를 받은 그룹에서는, 대조군 래트가 전체적으로 탈모증으로 된 반면, 0.1㎍ 칼시트리올을 받은 래트는 에토포시드에서 관찰된 것과 유사한 보호를 이루었다. 마찬가지로, 0.3㎍ 칼시트리올의 투여는 사이클로포스파미드-처리된 래트에서 완전한 신체 보호를 이루었다. 도 21 참조. 기타 화학요법 또는 병용 화학요법 용법을 사용한 유사한 결과가 도 22a, 22b, 22c 및 23에 보인다.

래트에게 녹색백혈병을 이식한 별도의 실험에서, 예비 결과는 칼시트리올의 국소 적용에 의해 사이클로포스파미드로부터 암 세포의 보호를 나타내지 않았다. 도 24 참조.

결론적으로, 대상 제형 중의 칼시트리올에 의한 전처리는 암 세포의 보호 없이 CIA으로부터 보호를 나타냈다. 국소 칼시트리올은 병용 화학요법 뿐만 아니라 단일 화학요법에 의해 유발된 CIA로부터, 용량 의존 방식으로 CIA를 예방하였다. 또한, 국소 칼시트리올은 CIA를 예방하면서, 화학요법의 세포독성 효과로부터 암 세포를 보호하지 않았다.

실시예 10: 다중 화학요법 용법을 받은 녹색백혈병 래트에서 국소 칼시트리올에 의한 CIA의 예방

본 연구는 다중-코스 화학요법-유발 탈모증의 동물 모델에서 국소 칼시트리올 용액의 보호 효과를 확인한다. 본 연구에 사용된 래트는, 래트 신생아에게 20-메틸콜라트렌의 위장 주입(instillation) 후 녹색백혈병 세포의 주입에 의해 발병시킨 래트 녹색백혈병 세포주인, MIAC51을 가지고 있다. MIAC51 세포주는 인간 녹색백혈병(백혈병, 백혈성 복수, 및 골수성녹색종 형성)의 특징을 갖는 악성 골수성 백혈병을 유발한다. Jimenez et al., Science 238: 1278~1280 (1987)을 참조.

현재까지, 화학요법-유발 탈모증(CIA)을 시험하기 위한 효과적인 시험관내 또는 무척추 모델은 없다. 사용된 모델 대부분 중에서, Jimenez 등에 의해 개발된 신생아 래트는 인간과 직접 상관관계가 있음을 입증하였다 (Int J Cancer 1996; 65: 97~103, 참조로서 포함됨). 이어서, 제2 성장기가 모발을 깍아서 유도될 수 있고, 따라서 화학요법의 다중 과정을 시험할 수 있는 래트 모델을 개발하였다. 이 모델을 사용하여, 사이클로포스파미드, 독소루비신, 파클리탁셀, 에토포시트, 및 시타라빈 및 이들의 조합을 포함하여, 빈번하게 사용된 탈모증 화학요법을 시험할 수 있다.

화학요법-유발 탈모증용 예방제를 시험하는 경우, 시험 물품이 모낭 및 또한 암 세포를 화학요법으로부터 보호하고/하거나 치료를 간섭하는지를 측정하는 것이 바람직하다. Jimenez 등에 의해 개발된, 신생아 래트 백혈병 모델은 백혈병의 발병, 백혈병의 치료, 화학요법제와의 잠재적 상호작용에 대한 비타민 D 화합물의 임의의 효과 및 화학 유발 탈모증의 예방에 대한 비타민 D 화합물의 효과를 동시에 시험할 기회를 제공한다. 또한 이 모델은 동일한 동물에서 시험 제제의 다중 사이클이 수회 모낭을 보호할 것인지의 문제에 답을 준다. 또한, 착색된 롱 에반스 래트를 사용함으로써, 본 연구도 시험 제제가 모발 색을 보호하는지를 측정할 수 있게 한다.

칼시트리올 제형은, USP 등급의 프로필렌 글리콜(40% w/w) 및 무수의 절대 에탄올, 200 proof(60% w/w)를 함유하는 비이클 중에 USP 등급의 칼시트리올을 함유하는 투명한 무수 액체이다. 이들 연구에서 칼시트리올의 농도는 약 0.2㎍/100μL(2㎍/μL)이하이다. 시험 물품은 얼음 위에서 제공 받고, 도착시 4~5℃에서 즉시 저장하였다. 이어서, 롯트를 4.5mL 튜브로 세분하고, 얼음 위에 유지시킬 것이다. 동물 그룹은 변수당 40개 이상일 것이며, 각 4.5mL 단위의 시험 물품은 롯트 번호와 함께 4~5℃에서 폴리프로필렌 튜브에 포장될 것이다. 4.5mL 튜브의 시험 물품은 암실 박스에 유지시키고, 실험당 필요한 양만을 냉장고에서 꺼낼 것이다. 4.5mL 튜브에 포장된 시험 물품 샘플을 칼시트리올 수준을 측정하기 위해 일정한 간격으로 분석할 것이다. 실험시, 튜브를 얼음 위에 있는 상태에서, 래트를 처리한다.

비이클은 USP 등급의 프로필렌 글리콜(40% w/w) 및 USP 등급의 무수의 비변성 절대 에탄올, 200 proof(60% w/w)으로 구성된다. 실험시, 대조군 비이클을 시험 물품으로서 정확히 취급한다.

시험 물품 뿐만 아니라 비이클 자체 둘 다를 시험한다. 각 시험 그룹은 40마리 동물로 이루어지고, 이는 본 연구를 위해 통계학적으로 유의하다. 이 숫자는 모델 감소를 포함하고, 궁국적으로 동물 수의 감소를 설명한다. 모든 동물은 5일령이 된 때에 MIAC51을 주사한다. 5가지 화학요법 용법을 시험한다: 사이클로 포스파미드, 사이클로포스파미드/독소루비신, 사이클로포스파미드/독소루비신/시타라빈, 사이클로포스파미드/파클리탁셀/에토포시드, 및 독소루비신/파클리탁셀/에토포시드. 시험 그룹은 다음과 같다: 화학요법 없음, 화학요법 단독, 화학요법 + 비이클, 화학요법+시험 물품 = 화학요법 용법 당 160마리 동물. 그러므로, 사용된 동물의 최종 평가된 수는 다음과 같다: 5가지 병용 화학요법 용법 × 160마리 동물 = 800마리 새끼/래트. 제2 성장기 성숙한 래트 모델을 사용한 실험의 경우, 암이 없는 동물(예, 화학요법에서 생존한 동물들)만을 사용하는 반면에, 백혈병의 초기 징후를 나타내는 동물은 안락사시킨다.

샤이 (Shay) 녹색백혈병 MIAC51 세포주의 배양: 샤이(Shay) 녹색백혈병 MIAC51 세포주의 배양: MIAC51을 전술한 바와 같이 37℃에서 100% 습도로 5% CO₂ 배양기에서 배양한다 (Science 1987; 238:1278~80). 세포는 L-글루타민 및 10% 소 태아 혈청(Gibco Invitrogen, CArlsbad, CA)이 보충된 RPMI 1640 배지(Gibco Invitrogen, Carlsbad, CA) 중의 비조직 배양-처리된 플라스크(Falcon)에서 성장시킨다. 세포를 동물에게 주입하기 전에, 50% 컨플루언시까지 성장시키고, 원추형 튜브에 수거하였다. 이어서, 세포를 10분 동안 실온에서 600g으로 원심분리하고, 소 태아 혈청이 없는 RPMI 1640에서 농도 1 × 106으로 재현탁시켰다. 이어서, 세포 현탁액을 멸균 조건하에 29 게이지(ga). 1/2cc 인슐린 시린지로 옮겼다.

MIAC51의 주입: 모든 새끼는 MIAC51의 주입시에 5일령이고, 수동으로 제지된다. 우측 다리를 부드럽게 잡아당기고, 이 부분을 알콜 면봉으로 세정한다. 이어서, MIAC51을 복강내 주사한다. 시린지 내의 바늘, 경로 및 세포는 멸균시키고, 각 주사때마다 새로운 시린지를 사용한다. 백혈병의 초기 징후의 발병은 통상 21 내지 33일 동안 관찰된다. 따라서, 혈액 도말표본은 23일째 및 31일째에 수행한다. 암이 없는 동물만을 31일째에 제모하고, 나머지는 안락사시킨다.

신생아 래트에서 제1 성장기에 시험 및 대조군 물품 투여: 각각의 한배 새끼에게 약 2cm²의 두경부 상에 국소적으로 비이클 또는 시험 물품을 투여한다. 5일 및 6일령 래트의 경우, 100μL를 더 작은 크기를 위해 4개 분취량 25μL로 4회 적용한다. 시험 물품 또는 비이클은 200μL 멸균 팁을 사용하여 보정된 마이크로피펫으로 적용한다. 시험 물품 또는 비이클이 머리 표면에 존재하는 경우, 이를 완전히 흡수될 때까지 장갑을 낀 손가락으로 문지른다. 즉시, 또 다른 분취량을 두부에 적용하고, 본 방법을 100μL 총 시험 물품 또는 비이클이 적용될 때까지 반복한다. 7일, 8일, 9일, 및 10일령 동물의 경우, 제50μL 분취량을 2회 적용한다. 보다 성숙한 동물에게는, 100μL를 1회 용량으로 적용할 수 있다. 시험 물품의 적용은 두경부에 적용하고, 우측 집게 손가락으로 10초 동안 용매-내성 니트릴 장갑을 사용하여 문지른다. 이러한 적용 용법에 대한 이유는 상이한 연령에서 포화 속도가 상이할 수 있고, 시험 물품 또는 비이클의 전달 또한 상이할 수 있기 때문이다. 용액이 피부에 완전히 침투되면, 새끼를 특별하게 설계된 격리 구획을 갖는 케이지에 6시간 공안 격리하여 유지시킬 것이다. 이어서, 새끼를 순한 실험실용 손 비누(Soft-Cide EC, VWR International)로 씻기고, 종이 타월로 조심히 건조시킨다.

신생아 래트의 제1 성장기에서 화학요법의 투여: 40마리 새끼에게 각각 화학요법 용법을 제공하고, 40 마리에게 각각의 화학요법 용법 및 시험 물품을 투여하고, 40마리에게 각각의 화학요법 용법 및 비이클을 투여한다. 대조군으로서, 40마리 동물은 화학요법을 받지 않는다. 각 한배 새끼의 중량 평균을 얻고, 이를 이용하여 적절한 농도의 화학요법을 제조한다. 화학요법은 29 게이지. 1/2cc 인슐린 시린지를 사용하여 동물의 중량에 따라 대략 100μL의 부피로 복강내 주사한다. 주사할 때, 각 새끼의 우측 다리를 부드럽게 잡아당긴 다음, 이 부분을 알콜 면봉으로 세정한다.

성숙한 래트의 제2 성장기에서 시험 및 대조군 물품 투여: 혈액 도말의 혈액학적 분석에 따라 31일째에 암이 없는 것으로 증명된 생존자를 수동으로 저지하고, 두경부 영역(2~3cm²)을 제모하였다. 9일 후, 래트가 포괄적으로 40일령 내지 45일령인 경우, 비이클 또는 시험 물품을 두경부에 적용한다. 100μL의 양을 두경부에 1회 용량으로 적용하고, 용매 내성 니트릴 장갑으로 10초 동안 우측 집게손가락으로 문지른다. 용액이 피부를 완전히 침투하며, 단일 래트를 케이지에 격리하여 유지시킨다. 이어서, 래트를 순한 실험실용 손 비누 (Soft-Cide EC, VWR International)로 씻기고, 종이 타월로 조심하게 건조시킨다.

제2 성장기 성숙한 래트에서 화학요법의 투여: 각 그룹에게, 병용 시타라빈을 제공한 것들에 대해, 47일째에 개시하여 53일째에 종료하는, 5개의 상이한 화학요법 용법 중의 하나를 제공한다. 중량 평균을 얻고, 이를 사용하여 적절한 농도의 화학요법을 제조한다. 화학요법제를 29게이지. 1/2cc 인슐린 시린지를 사용하여 동물의 중량에 따라 약 100μL의 부피로 복강내 주입한다. 화학요법제 투여를 위해, 마취제를 사용하지 않고서 래트를 수동으로 저지한다. 주사 부분은 알콜 면봉으로 세정한다.

투여 경로: 시험 물품 및 비이클을 피부 적용한다. 화학요법을 복강내 주사한다.

투여 빈도 및 투여 기간 및 용량 수준 및 부피: 시험 물품 및 비이클은 제1 및 제2 성장기 사이클 둘 다에서, 6일 동안 매일 투여한다. 시험 물품은 프로필렌 글리콜/에탄올 중 2㎍/mL 칼시트리올의 농도를 함유하고, 비이클은 프로필렌 글리콜/에탄올 비이클만을 함유한다. 화학요법은 중량 기준으로 약 100μL의 부피로 복강내 투여한다.

겉보기 관찰 및 탈모증의 등급화: 전체(두경부) 또는 완전한 신체 탈모증은 다음 척도를 사용하여 등급화한다: 0 = 탈모증 없음; 1+ = 0 내지 25% 탈모증; 2+ = 25 내지 50% 탈모증; 3+ = 50 내지 75% 탈모증; 4+ = 75 내지 100% 탈모증. 통상의 케이지 관찰을 수행하면서, 겉보기 관찰 척도를 매일 사용하여 탈모증을 등급화한다. 또한, 이러한 척도는 전체 한배 새끼 또는 성숙한 래트가 모발을 소실하는 경우에 사진 증거를 보충한다.

실시예 11: 피부 흡수 연구: Gottingen Minipigs ^® 에서 칼시트리올 용액의 국소 적용 및 생체외 돼지 피부에서 칼시트리올의 정량화

돼지의 피부가 인간의 피부와 매우 유사하기 때문에, 돼지는 피부 전달 경로를 수반하는 독성 연구에 빈번히 사용된다. 따라서, 본 연구에서 돼지를 사용하여, 피부 투여 7일 후, Gottingen minipigs^® 중 칼시트리올 국소 제형의 피부 내성 및 피부 침투성을 평가하였다.

3마리 수컷 및 3마리 암컷의 Gottingen minipigs^®의 하나의 처리 그룹에게 0(위약), 1, 3, 10, 및 30㎍/mL의 투여 농도로 5개의 별개의 투여 부위에 시험 또는 위약 물품을 피부로 투여하였다. 1마리 수컷 미니피그의 추가 처리 그룹에게 각각 0(위약) 및 100㎍/mL의 투여 농도로 2개의 별개 투여 부위에 시험 또는 위약 물품을 피부로 투여하였다. 위약 또는 시험 물품은 두 그룹에게 각종 농도의 활성 성분 및 비이클을 함유하는 시험 용액을 적용 부위당 4mg/cm²(6cm × 6cm 시험 부분에서 144mg와 등가), 또는 166μL의 적용 비율로 연구 동안 7일간 약 6시간 간격으로 매일 2회 투여하였다.

질병률, 사망률, 손상 및 식품 및 물의 접근 가능성에 대한 관찰을 모든 동물에 대해 매일 2회 수행하였다. 임상적 관찰은 매일 수행하였다. 피부 반응 평가는 시험전, 및 투여 전에 매일 수행하였다. 체중을 측정하고, 시험 전 및 말기(7일째)에 기록하였다. 신체 검사는 시험 전에 수행하였다. 연구 말기에, 부검 조사를 수행하고, 처리 및 미처리 피부의 절편을 수거하여 보존하였다. 처리 부위 근처의 미처리 피부 부위뿐만 아니라 피부 부위 각각에 대한 현미경 검사를 수행하였다.

결과는 Gottingen minipigs^®에 대한 0, 1, 3, 10, 30, 및 100㎍/mL의 농도로 칼시트리올 국소 제형의 피부 투여가 충분히 내성이 있음을 결과가 보여준다. 임의의 처리 부위에서 생존률, 임상 결과, 피부 자극, 체중, 피부의 육안 또는 현미경 검사에서 처리 효과가 관찰되지 않았다(데이타는 도시하지 않음). 조직 분포 연구 데이타는, 칼시트리올이 대부분의 각질층 및 표피 샘플의 기타 부분에서 측정가능했지만, 진피 샘플에서 측정불가능하다(단일 수컷 미니피그에 대한 100㎍/mL 투여량 적용의 경우는 유일하게 예외)는 것을 알려준다. 이 실험 세트에서, 수컷은 암컷보다 칼시트리올 조직 수준이 더 크다는 것을 증명하는 것으로 나타났다. 조직 수준에 대하여 가장 명백하게 적용된 투여량 상관관계는 표피에서 관찰되었으며, 3㎍/mL에서 100㎍/mL로 칼시트리올 농도가 증가함에 따라 거의 선형 증가를 가진다.

구체적으로, 위약(프로필렌 글리콜(USP) 및 무수 에탄올(비변성), 200 proof ~ U.S., USP의 40/60 혼합물 (w/w)) 및 칼시트리올 국소 제형을 1, 3, 10, 30, 및 100㎍/g의 예비 제형화된 농도로 사용하였다. 시험 물품을 순수하게 (희석하지 않고) 투여하였다. 위약 및 시험 물품의 제형은 1일 사용을 위해 한번 각 요구되는 농도로 분주하고, 실온에서 저장하였다.

총 3마리 수컷 및 3마리 암컷의 실험적으로 순수한(naive) Gottingen minipigs^®(대략 4 내지 5개월령)를 Marshall BioResources(North Rose, New York)로부터 구하였다. 추가의 수컷(수령시 대략 4.5개월령)을 후에 스톡 콜로니에서 옮겼다. 단일 랜덤화 절차를 사용하여, 4마리 수컷 및 3마리 암컷 동물(무작위로, 각각 체중 11.75 내지 15.55kg 및 14.50 내지 16.65kg)을 위약 및 처리 그룹으로 할당하였다. 연구 기간 동안, 위약 및 시험 물품을 7일간 대략 6시간 간격으로 매일 2회 피부로 투여하였다. 투여 농도는 0, 1, 3, 10, 30, 및 100㎍/mL이었고, 4mg/cm²(시험 용액 144mg 또는 166μL에 등가)의 적용율로 투여하였다. 투여 개시 전(각각 그룹 1 및 2에서 -4일째 및 -5일째), 모발을 전기 클리퍼를 사용하여 적용 부위에서 깍았다. 피부의 침식을 피하도록 주의해야 했다. 각 동물의 척추 표면을 그룹 1에서 5개의 적용 부위로, 그룹 2에서 2개의 적용 부위로 나눈다. 각 적용 부위는 각 부위 사이에 적어도 2cm 공간을 갖는 대략 6 × 6cm 이었다. 위약 및 시험 물품 제형을 유리 교반 막대 또는 적절한 장치로 명시된 적용 부위에 균일하게 적용하였다. 투여 전에, 이전 투여에서의 잔류 시험 물품은 수돗물로 습윤된 연질 종이 타월(즉, WyPall^®)을 사용하여 부드럽게 제거하였다.

연구 말기에, 피부를 복부 중앙 절개로부터 접고, 처리 및 비처리 피부의 절편을 수거하여 보관하였다. 각각 6 × 6cm 투여 부위의 절편을 순한 비누 및 물 혼합물(예, 물 중 1% Ivory Soap 또는 등가물)로 우선 전체적으로 표면 세척하여 임의의 잔류하는 국소 시험 제형을 제거하였다. 이어서, 세척된 피부 절편을 에탄올로 깨끗하게 세정하고, 지방 층을 포함하도록 하향 절개하였다. 절개된 부분이 투여 부분보다 큰 경우, 투여 부분은 지울수 없는 잉크로 경계를 지정하여, 투여된 피부 영역을 표시하였다. 1.5cm × 1.5cm 절편을 평편하게 놓고, 2개 층의 사란(Saran) 랩(또는 등가물)으로 감싸고, 액체 질소로 순간 동결시켰다. 샘플은 -70℃에서 저장하고, 분석을 위해 밤새 택배를 통해 드라이 아이스 상에서 운송하였다. 각 피부 절편은 적절하게 식별하였다(예를 들면, 동물 동정, 연구 번호, 날짜 등).

분석 부위에 도달시, 피부 절편을 수밀(water tight) 플라스틱 백에 놓고, 온수(약 30℃ 내지 35℃)에 담가 해동시켰다. 각 피부 절편을 증류된 탈이온수로 서서히 세정하여 임의의 잔류 시험 물품 및 혈액을 제거하였다. 모든 피하 조직(예, 지방)을 수동 메스 삭마에 의하여 제거하였다. 투여된 부분의 중심 영역 내에서, 4개의 개별적인 1cm² 원(복제물)을 경계 표시하고, 이어서 각 부위를 식별하고, 실제 부분을 기록하였다. 이어서, 복제 시험 부위를 1cm² 펀치를 사용하여 피부 시트에서 절제하였다. 피부 절편을 칭량하고, 중량을 기록하였다. 각 복제 경계 표시된 영역은 영역 표면의 약 10% 내지 25%가 반짝거릴 때까지 충분한 횟수(약 10회 내지 약 20회)로 테이프를 벗겼다(TransporeTM, 3M). 이 방법은 각질층 및 임의의 잔류 표면 투여량을 제거하였다.

테이프를 벗긴 후, 피부를 약 1 내지 1.5분 동안 60℃로 가열 노출시켜 표피(각질층 없는, 이후 본원에서 단순히 "표피"로서 칭명됨) 및 진피로 분리하였다. 이어서, 피부층을 파인-팁 겸자 및 메스를 사용하여 별도로 분리시켰다. 표피 및 진피를 칭량하고, 중량을 기록하였다.

추출을 위해, 모든 피부 샘플을 1mL의 절대 에탄올(Sigma-Aldrich, USP/NF 등급)에서 추출하였다. 테이프 스트립을 5mL 아세토니트릴(EMD, HPLC 등급)에서 추출하였다. 모든 추출은 실온에서 약 24시간 동안 수행하였다. 500㎕의 테이프 스트립 추출물을 진공 원심분리로 건조시키고, 100㎕ 절대 아세토니트릴에서 재구성하였다. 표피 추출물도 건조시키고, 100㎕의 80:20 에탄올:물에서 재구성하였다.

칼시트리올의 정량화는 자외선 및 질량 분석 검출기를 갖는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 수행하였다. 검출 하한치는 0.4ng/mL에서 추정된다.

각질층(테이프 스트립), 표피, 및 진피로부터 칼시트리올의 정량화 결과는 표 13-1 내지 13-4에 요약된다. 도25a 및 25b는 각각 각질층 및 표피에서의 수준을 나타내고, 도 26은 수컷에서만의 표피 수준을 나타낸다. 각질층 데이터는 샘플 면적의 함수로서 테이프 박리된 샘플에서 회수된 칼시트리올의 양을 반영하기 위하여, 두 개의 상이한 단위, ng/cm² 및 ㎍/mg로 제공된다. 그러나, ㎍/mg으로 기록된 농도는 (테이프 스트립에 대한 이의 부착성에 기인하여 실제 중량보다는) 층 분리 전 총 샘플 중량에서 그 샘플의 표피 및 진피의 중량을 뺀 값으로 측정된다. 표피 및 진피 샘플은 피부 층의 실제 습윤 중량으로 나누어진 샘플로부터 측정된 양을 사용하여 조직 농도(ng/mg)로서 기록된다.

표 13-1. 회수된 칼시트리올의 각질층(ng/cm²) 평균 ± SD (n = 동물의 수 [4 개의 복제물/동물])

* 제로 값은 하한치 이하의 결과를 나타냄

* na = 적용 불가능

표 13-2. 회수된 칼시트리올의 추정 각질층(ng/mg) 평균 ± SD (n = 동물의 수 [4 개의 복제물/동물])

* 제로 값은 하한치 이하의 결과를 나타냄

* na = 적용 불가능

표 13-3. 회수된 칼시트리올의 표피(ng/mg) 평균 ± SD (n = 동물의 수 [4개의 복제물/동물])

* 제로 값은 하한치 이하의 결과를 나타냄

* na = 적용 불가능

표 13-4. 회수된 칼시트리올의 진피(ng/mg) 평균 ± SD (n = 동물의 수 [4개의 복제물/동물])

* 제로 값은 하한치 이하의 결과를 나타냄

* na = 적용 불가능

데이터는, 칼시트리올이 대부분의 각질층 및 표피 샘플 뿐만 아니라 진피 샘플에서도(단일 수컷 미니피그에게 100㎍/mL 투여량 적용한 경우만을 제외함) 측정가능하였다는 것을, 알려준다. 이는 실시예 1에서 상기 기술된 Franz 인간 피부 유한 투여량 모델에서 얻은 결과와 일치한다.

평가된 조직 샘플에 걸쳐, 수컷 미니피그는 일반적으로 암컷 미니피그보다 더 큰 칼시트리올 조직 수준을 나 타내는 것으로 보였다.

칼시트리올의 최고 농도는 각질층에 존재하는 것으로 관찰되었다. 각질층 함량이 추정된 값이지만, 이의 보다 높은 농도는 표면 세척 작업에 의해서 제거되지 않은, 피부 모공 깊이 칼시트리올의 존재를 반영할 수 있거나, 각질층의 강한 친지성 매트릭스에서의 칼시트리올의 용해도에 기인할 수 있다.

그러나, 조직 수준에 대한 가장 명료한 적용 투여량 상관관계는 3㎍/mL 부터 100㎍/mL까지의 칼시트리올 농도의 적용에서 거의 선형으로 증가하는 것으로, 표피에서 관찰되었다.

실시예 12. 다중 코스 화학요법을 받은 녹색백혈병 래트에서 국소 용액 연구

롱 에반스 래트(Harlan Laboratories, Inc)는 도착시 3일령이었다. 동물의 체중은 도착시 및 실험 결론까지 매일 전자 저울(American Scientific Products TL 410s)을 사용하여 얻었다. 래트를 실험 시작 전 2일 동안 가두었다. 이어서, 동물들을 4 그룹으로 무작위 추출하였다. 모든 래트에게 이하 기술된 바와 같이 MIAC51을 받았다.

그룹 1(n=27)은 추가 처리를 받지 않았다.

그룹 2(n=40)는 화학요법만을 받았다.

그룹 3(n=40)은 화학요법 및 하기 기술된 국소 비이클을 받았다.

그룹 4(n=40)는 화학요법 및 국소 칼시트리올을 받았다.

생후 6일째 처리를 시작하였다. 0.1mL의 국소 칼시트리올을 래트의 두경부 상부에 국소 적용하였다. 제1 성장기 사이클을 위해, 6일 및 7일째에, 포화를 피하기 위해 비이클 또는 칼시트리올을 25㎕ 부피를 4회 적용하였다. 8, 9, 10 및 11일째에 50㎕ 부피를 2회 적용하였다. 제2 성장기 사이클을 위해, 래트를 40 내지 45 일째에 매일 0.1mL의 비이클 또는 칼시트리올로 처리하였다. 각 적용은 10초 동안 니트릴 시험 장갑으로 덮힌 오른쪽 집게 손가락으로 2cm² 영역을 문질렀다. 처리 완료 후, 각 래트를 6시간 동안 개별적으로 분리하였다. 이어서, 각 래트의 머리 및 등을 순한 손 비누(Soft CIDE-EC; VWR International) 및 증류수로 세척하였다. 이어서, 어미와 함께 두었던 새끼를 동물 사육실로 다시 옮겼다. 제2 성장기 사이클을 위해, 성숙한 래트를 그들의 한배 새끼와 함께 케이지에 다시 두고, 다시 동물 사육실로 옮겼다.

생후 5일째에, 모든 래트에게 0.1mL의 무혈청(SF) RPMI 중 1x105 MIAC51을 복강내로 제공하였다. MIAC51을 5% CO₂, 100% 습도 배양기에서 370에서 L-글루타민 및 10% 소 태아 혈청으로 보충된 RPMI 1640에서 배양하였다. 세포를 50% 컨플루언시(1.5x106mL)로 성장시키고, 50mL 원뿔형 튜브에서 수거하고, 실온에서 10분 동안 600g로 원심분리하고, 주사 전에 1x106/mL의 농도로 SF-RPMI에 재현탁시켰다.

생후 23일째에, 혈액 샘플을 모든 래트에서 채취하고, 분별을 수행하였다. 백혈병을 갖는 래트는 희생시킨 반면, 백혈병을 갖지 않는 래트는 추가 실험에 사용하였다. 제2 분별을 31일째에 수행하였고, 백혈병 동물은 희생시켰다. 생존 동물은 제2 세트의 비이클 투여 또는 칼시트리올 처리 전에 2cm² 영역을 제모하고, 제2 과정의 화학요법을 15일 후에 제공하였다. 제2 및 제1 성장기 모두에서, 화학요법 처리 후 10일에 탈모증을 기록하였다.

각 래트에서 탈모증 정도는 다음 척도로 측정하였다:

0 = 탈모증 없음

1+ = 0 내지 25% 탈모증

2+ = 25 내지 50% 탈모증

3+ = 50 내지 75% 탈모증

4+ = 75 내지 100% 탈모증

실험 화합물

2.3㎍/g 칼시트리올 제형을 비이클(40중량% 프로필렌 글리콜 및 60중량% 무수 200 proof 에탄올)로 최종 농도 2㎍/ml로 희석시켰다. 1mL의 바이알(vial)을 세분화하고, 4℃ 냉장고에 유지시켰다. 각 실험에 대해, 한 바이알의 2.3㎍/g 칼시트리올 및 비이클을 꺼내어 실험 과정 동안 얼음 위에 두었다. 사용되지 않은 제제는 폐기하였다.

A. 사이클로포스파미드 단독

화학요법의 투여

어린 래트 : 13일째에, 모든 래트에게 사이클로포스파미드(CTX)(Sigma Aldrich, Lot #068k1131) 37.5mg/kg을 총 부피의 0.1mL H₂O/만니톨 혼합물 중 ½cc 인슐린 시린지 29G ½"(B-D)를 사용하여 복강 내로 투여하였다.

성숙한 래트 : 화학요법의 제2 과정을 위해, 150mg/kg 사이클로포스파미드를 총 부피의 0.1mL H₂O/만니톨 혼합물 중 ½cc 인슐린 시린지 29G ½"(B-D)를 사용하여 마취된(50mg/kg 케타민/5mg/kg 크실라진) 47일령 래트에게 복강내 투여하였다.

결과가 표 13-5 및 13-6에 도시되어 있다. 구체적으로, 제1 라운드 화학요법 후(표 13-5 및 도 27), 사이클로포스파미드 단독 또는 비이클과 조합한 사이클로포스파미드를 투여한 모든 래트는 심각한 탈모증(+4)을 가지고 있었다. .대조적으로, 칼시트리올과 병용된 사이클로포스파미드를 투여한 모든 래트는 대조군 그룹과 유사하게 어떤 탈모증 징후도 나타내지 않았다. 유사한 결과가, 표 13-6(도 28도 참조)에 보인 바와 같이, 제2 라운드 화학요법 후에 얻었다.

표 13-5. 제1라운드 화학요법 후 사이클로포스파미드(CTX)로 처리된 래트의 탈모증의 정도

표 13-6. 제2라운드 화학요법 후 사이클로포스파미드(CTX)로 처리된 래트의 탈모증의 정도

또한, 이 실험은 칼시트리올의 국소 제형을 받은 래트의 생존률이 화학요법 단독으로 또는 비이클과 조합하여 받은 래트의 생존률과 실질적으로 유사하다는 것을 나타내었다. 표 13-7에서 제시된 바와 같이, 사이클로포스파미드 및 칼시트리올의 국소 제형으로 처리된 동물들의 생존률(25%)은 사이클로포스파미드 단독으로 처리된 래트의 생존률(20%) 및 사이클로포스파미드 및 비이클로 처리된 래트의 생존률(23%)과 유사하였다.

표 13-7. 두 라운드의 화학요법 후 사이클로포스파미드(CTX)로 처리된 래트의 탈모증의 정도

요약하면, 사이클로포스파미드 그룹에서, 칼시트리올은 둘 다의 사이클에서 CIA로부터 100% 보호하고, 20 내지 25% 범위내에 있는 치유율을 방해하지 않았다.

B. 사이클로포스파미드 및 독소루비신

화학요법의 투여

어린 래트 : 13일째에, 모든 래트에게 사이클로포스파미드(CTX)(Sigma Aldrich, Lot #068k1131) 37.5mg/kg을 총 부피 0.1mL H₂O/만니톨 혼합물 중 ½cc 인슐린 시린지 29G ½"(B-D)를 사용하여 복강내로 투여하였다. 13, 14 및 15일째에, 래트에게 0.1ml 증류수 중 독소루비신 하이드로클로라이드(Sigma Aldrich, Lot #038k1349)(ADM) 2.5mg/kg을 복강내로(I.P.) 투여하였다.

성숙한 래트 : 제2 과정의 화학요법의 경우, 47일째에 150mg/kg 사이클로포스파미드를 총 부피 0.1mL H₂O/만니톨 혼합물 중 ½cc 인슐린 시린지 29G ½"(B-D)를 사용하여 마취된(50mg/kg 케타민/5mg/kg 크실라진) 래트에게 복강내 투여하였다. 제2 과정의 화학요법의 경우, 래트에게 상기한 바와 같이 47일 내지 49일째에 20mg/kg ADM을 투여하였다.

결과가 표 13-8 및 13-9에 보인다. 구체적으로, 제1 라운드 화학요법후(표 13-8 및 도 29), 사이클로포스파미드 및 독소루비신 단독으로 또는 비이클과 조합하여 받은 모든 래트는 심각한 탈모증(+4)을 가지고 있었다. 대조적으로, 칼시트리올과 병용된 사이클로포스파미드 및 독소루비신을 받은 모든 래트는 대조군 그룹과 유사하게 어떠한 탈모증 징후도 나타내지 않았다. 유사한 결과가 표 13-9(도 30도 참조)에 보인 바와 같이, 제2 라운드 화학요법 후에 얻었다.

표 13-8. 제1라운드 화학요법 후 사이클로포스파미드(CTX)와 독소루비신(ADM)으로 처리된 래트의 탈모증의 정도

표 13-9. 제2라운드 화학요법 후 사이클로포스파미드(CTX)와 독소루비신(ADM)으로 처리된 래트의 탈모증의 정도

또한, 이 실험은, 칼시트리올의 국소 제형을 받은 래트의 생존률이 화학요법 단독으로 또는 비이클과 조합하여 받은 래트의 생존률과 실질적으로 유사하다는 것을, 나타내었다. 표 13-10에서 보인 바와 같이, 칼시트리올의 국소 제형과 병용된 사이클로포스파미드 및 독소루비신으로 처리된 동물들의 생존률(50%)은 화학요법 단독으로 처리된 래트의 생존률(53%) 및 화학요법 및 비이클로 처리된 래트의 생존률(55%)과 유사하였다.

표 13-10. 두 라운드의 화학요법 후 사이클로포스파미드(CTX)와 독소루비신(ADM)으로 처리된 래트의 탈모증의 정도

요약하면, 사이클로포스파미드 및 독소루비신 그룹에서, 칼시트리올은 둘 다의 사이클에서 CIA로부터 100% 보호하고, 50 내지 55% 범위 내에 있는 치유율을 방해하지 않았다.

C. 사이클로포스파미드 , 독소루비신 및 시타라빈

화학요법의 투여

어린 래트 : 13일째에, 모든 래트에게 사이클로포스파미드(CTX)(Sigma Aldrich, Lot #068k1131) 30mg/kg을 총 부피 0.1mL H₂O/만니톨 혼합물 중 ½cc 인슐린 시린지 29G ½"(B-D)를 사용하여 복강 내로 투여하였다. 13, 14 및 15일째에, 래트에게 0.1ml 증류수 중 2.0mg/kg 독소루비신 하이드로클로라이드(Sigma Aldrich, Lot #038k1349)(ADM)를 복강내로 투여하고, 13 내지 19일째에, 래트에게 50mg/kg 시타라빈을 투여하였다.

성숙한 래트 : 제2 과정의 화학요법의 경우, 1일 동안 100mg/kg 사이클로포스파미드를 마취된(50mg/kg 케타민/5mg/kg 크실라진) 래트에게 투여하고, 3일 동안 20mg/kg 독소루비신을, 7일 동안 100mg/kg 시타라빈을 투여하였다.

결과가 표 13-11 및 13-12에 보인다. 구체적으로, 제1 라운드 화학요법 후(표 13-11 및 도 31), 사이클로포스파미드, 독소루비신 및 시타라빈 단독으로 또는 사이클로포스파미드, 독소루비신 및 시타라빈을 비이클과 병용하여 받은 모든 래트는 심각한 탈모증(+4)을 가지고 있었다. 대조적으로, 칼시트리올과 병용된 사이클로포스파미드, 독소루비신 및 시타라빈을 받은 모든 래트는 대조군 그룹과 유사하게 어떤 탈모증 징후도 나타내지 않았다. 유사한 결과가 표 13-12(도 32 참조)에 보인 바와 같이, 제2 라운드 화학요법 후에 얻었다.

표 13-11. 제1라운드 화학요법 후 사이클로포스파미드(CTX), 독소루비신(ADM), 및 시타라빈(ARA-C)으로 처리된 래트의 탈모증의 정도

표 13-12. 제2라운드 화학요법 후 사이클로포스파미드(CTX), 독소루비신(ADM), 및 시타라빈(ARA-C)으로 처리된 래트의 탈모증의 정도

또한, 이 실험은, 칼시트리올의 국소 제형을 받은 래트의 생존률이 화학요법 단독으로 또는 비이클과 병용하여 받은 래트의 생존률과 실질적으로 유사하다는 것을, 나타내었다. 표 13-13에 보인 바와 같이, 칼시트리올의 국소 제형과 병용된 사이클로포스파미드, 독소루비신, 및 시타라빈으로 처리된 동물들의 생존률(78%)은 화학요법 단독으로 처리된 래트의 생존률(80%) 및 화학요법 및 비이클로 처리된 래트의 생존률(75%)과 유사하였다.

표 13-13. 두 라운드의 화학요법 후 사이클로포스파미드(CTX), 독소루비신(ADM), 및 시타라빈(ARA-C)으로 처리된 래트의 탈모증의 정도

요약하면, 사이클로포스파미드, 독소루비신, 및 시타라빈 그룹에서, 칼시트리올은 둘 다의 사이클에서 CIA로부터 100% 보호하고, 75~80% 범위 내에 있는 치유율을 방해하지 않았다.

D. 사이클로포스파미드 , 파클리탁셀 및 에토포사이드

화학요법의 투여

어린 래트 : 13일째에, 모든 래트에게 사이클로포스파미드(CTX)(Sigma Aldrich, Lot #068k1131) 37.5mg/kg을 총 부피 0.1mL H₂O/만니톨 혼합물 중 ½cc 인슐린 시린지 29G ½"(B-D)를 사용하여 복강내로 투여하였다. 11 내지 13일째에, 래트에게 0.1ml 디메틸 설폭사이드 중 2.5mg/kg 파클리탁셀(탁솔)(Sigma Aldrich, Lot #078K1428) 및 특수한 용매(Standard Operating Procedures 참조) 및 HBSS로 희석된 1.5mg/kg 에토포시드(VP-16)(Sigma Aldrich, Lot #047K1162)를 동시에 투여하였다.

성숙한 래트 : 제2 과정의 화학요법의 경우, 47일에 150mg/kg 사이클로포스파미드를 총 부피 0.1mL H₂O/만니톨 혼합물 중 ½cc 인슐린 시린지 29G ½"(B-D)를 사용하여 마취된(50mg/kg 케타민/5mg/kg 크실라진) 래트에게 복강내 투여하였다. 제2 과정의 화학요법의 경우, 상술한 바와 같이, 래트에게 45 내지 48일째에 10mg/kg 탁솔 및 15mg/kg VP-16을 투여하였다.

결과가 표 13-14 및 13-15에 보인다. 구체적으로, 제1 라운드 화학요법 후(표 13-14 및 도 33), 사이클로포스파미드, 파클리탁셀, 및 에토포사이드 단독으로 또는 사이클로포스파미드, 파클리탁셀, 및 에토포사이드를 비이클과 병용하여 투여한 모든 래트는 심각한 탈모증(+4)을 가지고 있었다. 대조적으로, 칼시트리올과 병용된 사이클로포스파미드, 파클리탁셀, 및 에토포사이드를 투여한 모든 래트는 대조군 그룹과 유사하게 어떤 탈모증 징후도 나타내지 않았다. 유사한 결과가 표 13-15(도 34 참조)에 보인 바와 같이, 제2 라운드 화학요법 후에 얻었다.

표 13-14. 제1라운드 화학요법 후 사이클로포스파미드(CTX), 파클리탁셀, 및 에토포시드로 처리된 래트의 탈모증의 정도

표 13-15. 제2라운드 화학요법 후 사이클로포스파미드(CTX), 파클리탁셀, 및 에토포시드로 처리된 래트의 탈모증의 정도

또한, 이 실험은, 칼시트리올의 국소 제형을 투여한 래트의 생존률이 화학요법 단독으로 또는 비이클과 조합하여 투여한 래트의 생존률과 실질적으로 유사하다는 것을, 나타내었다. 표 13-16에 보인 바와 같이, 칼시트리올의 국소 제형과 병용된 사이클로포스파미드, 파클리탁셀, 및 에토포사이드로 처리된 동물들의 생존률(83%)은 화학요법 단독으로 처리된 래트의 생존률(83%) 및 화학요법 및 비이클로 처리된 래트의 생존률(78%)과 유사하였다.

표 13-16. 두 라운드의 화학요법 후 사이클로포스파미드(CTX), 파클리탁셀, 및 에토포시드로 처리된 래트의 탈모증의 정도

요약하면, 사이클로포스파미드, 파클리탁셀 및 에토포시드 그룹에서, 칼시트리올은 둘 다의 사이클에서 CIA로 부터 100% 보호하고, 78~83% 범위 내에 있는 치유율을 방해하지 않았다.

E. 독소루비신 , 파클리탁셀 및 에토포시드

화학요법의 투여

어린 래트 : 13일 내지 15일째에, 모든 래트에게 0.1ml 증류수 중 독소루비신 하이드로클로라이드(Sigma Aldrich, Lot #038k1349)(ADM) 2.5mg/kg을 ½cc 인슐린 시린지 29G ½"(B-D)를 사용하여 복강내로 투여하였다. 동시에, 래트에게 2.5mg/kg 파클리탁셀(탁솔)(Sigma Aldrich, Lot #078k1428) 및 1.5mg/kg 에토포시드(VP- 16)(Sigma Aldrich, Lot #047k1162)를 투여하였다.

성숙한 래트 : 제2 과정의 화학요법의 경우, 상기 화학요법을 47 내지 49일째에 총 부피 0.1mL로 ½cc 인슐린 시린지 29G ½"(B-D)를 사용하여 마취된(50mg/kg 케타민/5mg/kg 크실라진) 래트에게 복강내 개시하였다. 제2 과정을 위한 용량은 다음과 같다: 20mg/kg ADM, 10mg/kg 탁솔, 및 15mg/kg VP-16.

결과가 표 13-17 및 13-18에 보인다. 구체적으로, 제1 라운드 화학요법 후(표 13-17 및 도 35), 독소루비신, 파클리탁셀, 및 에토포시드 단독으로 또는 독소루비신, 파클리탁셀 및 에토포시드를 비히클과 병용하여 투여한 모든 래트는 심각한 탈모증(+4)을 가지고 있었다. 대조적으로, 칼시트리올과 병용된 독소루비신, 파클리탁셀, 및 에토포시드를 투여한 모든 래트는 대조군 그룹과 유사하게 어떤 탈모증 징후도 나타내지 않았다. 유사한 결과가 표 13-18(도 36 참조)에 보인 바와 같이 제2 라운드 화학요법 후에 얻었다.

표 13-17. 제1라운드 화학요법 후 독소루비신(ADM), 파클리탁셀, 및 에토포시드로 처리된 래트의 탈모증의 정도

표 13-18. 제2라운드 화학요법 후 독소루비신(ADM), 파클리탁셀, 및 에토포시드로 처리된 래트의 탈모증의 정도

또한, 이 실험은, 칼시트리올의 국소 제형을 투여한 래트의 생존률이 화학요법 단독으로 또는 비히클과 병용하여 투여한 래트의 생존률과 실질적으로 유사하다는 것을, 나타내었다. 표 13-19에 보인 바와 같이, 칼시트리올의 국소 제형과 병용된 독소루비신, 파클리탁셀, 및 에토포시드로 처리된 동물들의 생존률(80%)은 화학요법 단독으로 처리된 래트의 생존률(80%) 및 화학요법 및 비히클로 처리된 래트의 생존률(83%)과 유사하였다.

표 13-19. 두 라운드의 화학요법 후 독소루비신(ADM), 파클리탁셀, 및 에토포시드로 처리된 래트의 탈모증의 정도

요약하면, 독소루비신, 파클리탁셀, 및 에토포시드 그룹에서, 칼시트리올은 둘 다의 사이클에서 CIA로부터 100% 보호하고, 80~83% 범위 내에 있는 치유율을 방해하지 않았다.

실시예 13. 고팅켄 미니피그 ^® 에서 국소 칼시트리올의 4주 피부 독성 연구

대조군, 비이클 및 시험 물품 준비: 새로운 대조군 물품, 0.9% 주사용 염화나트륨, USP를 주간 연구에 사용하기 위해 분주하고, 냉장고에 저장하였다. 비이클, 프로필렌 글리콜, USP 및 에탄올(비변성됨, 무수) 200 proof USP의 40/60 중량(w/w) 혼합물, 및 비중이 0.875인 칼시트리올, USP를 함유하는 시험 물품을 받은 대로 사용하고, 순도에 대해 어떤 조절도 하지 않았다. 시험 물품은 5.07, 10.31 및 55.34㎍/mL의 농도로 투여하였다. 시험 물품은 순수하게 (희석하지 않고) 투여하였다. 비이클 및 시험 물품을 주간 연구에 사용하기 위해 분주하고, 냉장고에 저장하였다. 가끔, 연구 과정 동안 필요에 따라 추가의 시험 물질을 분주하였다.

투여: 투여 전, 모발을 동물의 등으로부터 깍았다. 대조군 동물은 2개의 시험 부위를 가졌다: 부위 1은 비이클로 처리하고, 부위 2는 염수로 처리하였다. 각 부위는 450cm²이고, 척추에 의해 쌍방으로 나눠지고, 지워지지 않는 마커로 코너에 표시하였다. 대조군 그룹을 위한 두 시험 부위를 균일하게 분배하였다. 모발의 반복 깍기를 필요에 따라 수행하였다. 피부 침식을 피하기 위해 주의를 기울였다. 대조군 물품, 비이클 및 시험 물품을 연구 동안 4주간(29일 연속) 1일당 2회 약 6시간 간격으로 피부로 투여하였다. 제형은 유리 교반 막대 또는 적합한 기구를 사용하여 적용 부위에 균일하게 적용하였다. 임의의 잔류 시험 물질은 다음 투약 전에 수돗물로 습윤된 와이폴(Wypall)로 서서히 제거하였다. 필요하면, 부위를 깨끗하고 건조된 와이폴로 건조시켰다. 모든 동물에게 투여된 투여량은 1800mg의 적합한 제형이었다. 투여 농도는 5.07, 10.31 및 55.34㎍/mL였고, 용량 부피 2.1mL로 투여하였다. 대조군 물품 및 비이클을 처리 그룹과 동일한 방식으로 대조군에 투여하였다. 대조군 동물을 위한 투여 부피는 비이클 1.0mL 및 염수 0.9mL였다. 관찰된 임상적 징후의 중증도에 기인하여, 23일째에 55.34㎍/mL에서의 모든 동물에게 투여하지는 않았다. 24일에 모든 동물에게 다시 투여를 개시하였다.

결과 : 이 연구는 4주 동안 피부 적용을 통해 하루에 2회 투여될 경우, 칼시트리올 국소 용액의 잠재적인 아-만성 독성(sub chronic toxicity)을 평가하기 위해 수행하였다. 고팅켄 미니피그^®의 4개의 동물/성/그룹 중 세 개의 처리 그룹에 칼시트리올 국소 용액을 각각 투여 농도 5.07, 10.31 및 55.34㎍/mL로 투여하였다. 4마리 동물/성 중 하나의 추가 그룹은 대조군으로 작용하고, 비이클, 프로필렌 글리콜, USP 및 에탄올(비변성됨, 무수) 200 proof USP의 40/60 중량(w/w) 혼합물 및 대조군 물품, 0.9% 주사용 염화나트륨, USP를 투여받았다. 칼시트리올 국소 용액 또는 비이클을 모든 그룹에게 피부 적용을 통해 29일 연속하여 하루에 2회 450cm² 시험 부위에 대해 4mg/cm²의 투여 부피로 투여하였다.

질병률, 사망률, 손상, 및 식품 및 물의 접근 가능성에 대한 관찰을 모든 동물에 대해 매일 2회 수행하였다. 임상적 관찰을 매주 수행하였다. 체중을 매주 측정하고 기록하였다. 피부 자극 득점은 적용 부위에서 변화에 있어서, 1 주 동안에는 각 투여 후, 이어서, 2 내지 4주 동안에는 주당 2회(제2 투여 후) 수행하였다. 검안경 검사는 시험 전에 수행하였고 말기 부검 전 모든 생존자에 대해 수행하였다. 신체 검사는 시험 전에 수행하였다. 심전도 기록 검사는 시험 전, 투여 전, 1일째 제1 투여 후 1 내지 2시간, 및 마지막 주 투여 동안 수행하였다. 임상 병리학 평가를 위한 혈액 및 뇨 샘플을 시험 전 및 말기 부검 전에 모든 동물에게서 수거하였다. 시험 물품의 혈장 농도를 측정하기 위한 혈액 샘플을 1일 및 27일째 지정된 시점에서 모든 생존 동물로부터 수거하였다. 시험 물품의 독성동태학(TK) 파라미터를 시험 종의 농도-시험 데이터로부터 측정하였다. 연구 종료시, 부검 검사를 수행하고, 기관의 중량을 기록하고, 선별된 조직을 현미경 조사하였다.

55.34㎍/mL 농도에서 한 마리 수컷을 연구 28일째에 극한 상태라서 안락사시켰다. 안락사 전에 이 동물에게서 감소된 활성, 식욕 부진 및 떨림을 관찰하였다. 이 동물의 질병의 원인은 치사율에 근접한 높은 칼슘 혈액 수준인 것으로 생각되었다. 모든 잔류 미니피그는 연구 30일째에 이들의 일정 종료 시까지 생존하였다. 감소된 활성, 식욕부진, 구토 및 떨림이 연구 3주 및 4주 동안 55.34㎍/mL 농도에서 대부분의 미니피그에서 관찰되었다. 완만한 자극은 연구 마지막 주 또는 2일 동안 55.34㎍/mL 농도에서 수컷 및 암컷에서 관찰되었다. 5.07 및 10.31㎍/mL 에서 처리된 수컷 및 암컷의 평균 체중 및 체중 증가는 대조군에 필적할 만하였다. 55.34㎍/mL 농도에서 모든 수컷 및 암컷은 연구 마지막 2주 동안 상당량의 체중이 감소되었고, 이 시간 동안 수컷 및 암컷에게서 평균 체중은 상당히 감소하였다.

예비 시험 및 말기 검안경 검사에서, 임의 동물에서는 어떤 검안경 이상도 관찰되지 않았다. 칼시트리올 국소 용액은 정량적 심전도 이상을 일으키지 않았지만, 말기 투여 전 및 투여 후 간격에서 그룹 평균 심박수가 완만하게 증가하였다. 이러한 심박수의 증가는 연구 동안 이들 미니피그의 칼슘 수준의 현저한 증가와 확실하게 관련되어 있다. 정량적 심전도 파라미터에 대한 칼시트리올 국소 용액의 기타 투여량-관련 효과는 없었다. 어떤 칼시트리올 국소 용액-관련 혈액학, 응고 또는 뇨 분석 변경도 말기 평가에서 수컷이나 암컷에게서 관찰되지 않았다. 일부 임상적 화학 변경이 55.34㎍/mL 농도에서 관찰되었고, 가장 현저한 것은 거의 치명적인 수준인 것으로 관찰된 높은 칼슘 수준이었다. 제시된 기타 변화는 더 낮은 클로라이드 값, 및 더 높은 콜레스테롤, 글루코스, 우레아 질소, 및 트리글리세라이드 값이었다.

칼시트리올 국소 용액-관련 육안 병리학 결과는 55.34㎍/mL 농도에서 완만하고 불규칙한 표면으로 이루어진 한 마리 암컷의 위 점막으로 한정되었다. 신장의 절대적 및 상대적 증가 중량 및 흉선의 감소된 중량이 대조군과 비교하여 55.34㎍/mL 농도에서 두 성별에서 관찰되었다. 직접적인 칼시트리올 국소 용액-관련 현미경 결과는 골, 신장, 심장, 처리된 피부, 흉선 및 갑상선에서 있었다. 또한, 직접적인 칼시트리올 국소 용액-관련 결과는 다중심적 혈관 변화 및 다중심적 점막 광화 작용(mineralization)을 포함한다. 간접적인 시험 물품 관련 현미경 결과가 췌장에서 보였다. 이러한 현미경 결과는 두 성별에서 존재하였고, 55.34㎍/mL 농도에서 투여된 동물에게 한정되었다.

대퇴골, 흉골, 및 늑골 뼈의 현미경 변화는 골간 피질골 및 골 공동(cavity)에 한정되었다. 이들은 골형성 이상증 및 호염기성 기질의 침착을 특징으로 하였다. 신장 현미경 관찰은 무기질화 작용, 관 퇴화/재생 및 아급성 염증을 특징으로 하였다. 심근의 현미경 관찰은 근섬유 광화 작용, 아급성 염증, 및 혈관 변화였다. 또한, 한 마리 수컷 및 한 마리 암컷은 심장내 광화 작용을 가졌다. 다중심성 점막/표피 광화 작용은 감소하는 순서로 위점막, 폐, 후두, 기관, 전립선, 턱밑 침샘 및 방광 내에서 관찰되었다. 칼시트리올 국소 용액-관련 혈관 변화는 광범위하였고, 주로 소형 내지 중간형 크기의 혈관에 영향을 미쳤다. 이들은 주로 심장 및 골 공동 내에서 및 산발적으로는 상이한 기관/시스템 내에서 관찰되었다. 처리된 피부의 현미경 변화는 표피 과형성 및 과각화증과 표면적 진피를 갖는 혈관 주위 혼합 세포 염증을 특징으로 하였다. 흉선, 갑상선 및 췌장의 현미경 변화는 각각 림프성 소모, 소낭 세포 비대 및 과형성, 및 단세포 괴사를 특징으로 하였다.

이 연구 결과를 토대로 하여, 무독성량(no-observed-adverse-effect-level; NOAEL)은 55.34㎍/mL 농도에서 보여진 임상 화학 및 현미경 변화에 기초하여 10.31㎍/mL인 것으로 여겨졌다.

실시예 14. 전임상 연구; 래트 및 마우스 실험

신생아 래트 모델 및 PCA 모델 스프라그 다울리(Sprague Dawley) 래트를 Charles River Laboratories(Wilmington, MA)로부터 구입하였다. C3H/HeJ 마우스는 Jackson Laboratories(Bar Harbour, ME)로부터 구입하였다. 설치류를 NIH 가이드라인에 따라 수용하고 먹이를 제공하였다. 화학요법을 수반하는 실험에서, 사이클로포스파미드는 Mead Johnson(Evansville, IN)에서 구입하고, 에토포시드는 Bristol-Myers(Evansville, IN)에서 구입하였다. 1,25(OH)2D3 분말은 Uskokovic 박사(Hoffman-La Roche, Nutley, NJ)에게서 제공받았다. C3H/HeJ 마우스를 포함하는 실험에서, 1,25(OH)2D3는 Sigma(St. Louis, MO)에서 구입하였다.

1, 25(OH)2D3의 국소 적용. 1,25(OH)2D3를 절대 에탄올에 용해하고 어플리케이터를 이용하여 국소적으로 적용하였다. 대조군 동물은 비이클만으로 유사하게 처리하였다. 이어서, 처리 영역을 비누와 물로 세척하고 건조시킨 후, 동물을 3 시간 격리시켰다. CIA 실험에서, 1,25(OH)2D는 생후 5일째부터 매일 투여하여 10일째에 끝냈다. PCA 실험에서, 1,25(OH)2D3는 22일째부터 매일 투여하여, 동물이 완전히 탈모가 되었을 경우에는 35일째에 끝냈다. CIA 및 PCA에서, 실험 그룹은 두경부에 걸쳐서 150 μL 절대 에탄올 중 0.2 ㎍의 1,25(OH)2D3을 국소적으로 적용하였다. 둘 다, 대조군은 에탄올 비이클만을 투여받았다. 사이클로포스파미드(35 mg/kg)는 하루 동안만 복강내 투여하였다. 에토포시드(1.5 mg/kg)는 3일 동안 복강내 투여하였다. 두 화학요법은 11일령에 시작하였다. 화학요법 제 1 투여 후 11일째에 탈모증을 기록하였다.

제 1 실험에서, 사이클로포스파미드-유발 탈모증으로부터의 보호를 검사하여 1,25(OH)2D3의 효능을 평가하였다. 래트를 10마리씩 두 그룹으로 무작위로 나누었다. 한 그룹은 비이클 대조군을 받은 반면에, 다른 그룹은 0.2 ㎍ 1,25(OH)2D3를 받았다. 대조군의 10마리 래트 모두는 화학요법 후 10일 내에 완전히 탈모가 되었다. 대조적으로, 1,25(OH)2D3로 전처리한 모든 동물은 탈모증을 발병시키기 않았다. 제2 실험에서, 미리 투여한 사이클로포스파미드에 의하여 유발된 완전한 신체 탈모(전신성 탈모)를 갖는 22일령 래트 20마리를 각각 10마리씩 두 그룹으로 무작위로 나누었다. 또한, 에토포시드 투여에 의하여 유발된 전신성 탈모를 갖는 22일령 래트 20마리도 각각 10마리씩 두 그룹으로 무작위로 나누었다. 사이클로포스파미드- 및 에토포시드-유발 탈모증에서, 한 그룹은 1,25 (OH)2D3를 받은 반면에, 다른 한 그룹은 비이클 대조군을 받았다. 모발이 완전히 재성장할때까지 동물을 관찰하였다. 두 대조군에서, 동물들 100%가 42일 이내에 충분한 모발 재성장을 나타냈다. 대조적으로, 1,25(OH)2D3로 처리된 래트에서는, 50일째까지 총 신체 모발 재성장이 늦쳐졌다.

C3H / HeJ 원형탈모증 모델. 리타이어 브리더(retired breeders, 8개월령)를 AA 병변을 발병시키기 위하여 매일 관찰하였다. 10월령에, 등 부분에 국지화된 탈모 발생 부위를 나타내는 6 마리의 동물을 선택하여, 각각 3마리씩 두 그룹으로 무작위로 나누었다. 15일 동안 한 그룹은 에탄올 비이클 대조군을 받은 반면에, 다른 그룹은 탈모 병변에 0.2 ㎍의 1,25(OH)2D3을 받았다. 총 30일 동안 동물을 관찰하였다. 대조군 또는 실험군에서 모발 재성장을 관찰하지 못했다.

5일령 롱 에반스 래트에게 MIAC51 세포(래트 녹색백혈병 세포주)를 복강내(IP) 주입하여 녹색백혈병을 유발시켰다. 모발 성장에 대한 칼시트리올(2 ㎍/mL)의 효과를 신생아 동물(6일 내지 11일째에 노출)뿐만 아니라 성숙한 동물(40 내지 45일째에 노출)에서 평가하였다. 칼시트리올의 국소 적용 후에, 두 동물 그룹에 다양한 화학요법제(사이클로포스파미드; 사이클로포스파미드와 독소루비신; 사이클로포스파미드, 독소루비신, 및 시토신 베타-D 아라비노퓨라노사민; 사이클로포스파미드, 파클리탁셀, 및 에토포시드; 및 독소루비신, 파클리탁셀, 및 에토포시드)를 투여하였다. 각 실험에서, 칼시트리올은 두 제1 및 제2 화학요법 사이클 후(즉, 신생아 동물뿐만 아니라 성숙한 동물에서), CIA로부터의 100% 보호를 나타냈다. CIA는 칼시트리올(녹색백혈병 대조군, 화학요법제 단독, 화학요법제+비이클)로 처리하지 않은 다른 그룹에서는 영향 받지 않았다. 또한, 칼시트리올은 화학요법제의 효능에 영향을 주지 않았다(백혈병이 없는 동물의 수는 화학요법 그룹 단독, 화학요법 그룹+비이클, 화학요법 그룹+칼시트리올 국소 용액에서 유사하였음)는 것이 관찰되었다.

5일령 스프라그 다울리 또는 롱 에반스 래트에게 수행하여, CIA으로부터 보호하는 칼시트리올의 능력을 평가하였다. 5 내지 10일째에 CIA에 1, 2, 또는 3 ㎍/mL 농도로 국소 투여한 다음, 다양한 화학요법제(에토포시드; 사이클로포스파미드; 독소루비신 및 사이클로포스파미드; 시토신 베타-D 아라비노퓨라노사민; 시토신 베타-D 아라비노퓨라노사민 및 독소루비신; 및 파클리탁셀)을 투여하였다. 한 실험에서, 5일째에 MIAC51 세포에 투여하여 녹색백혈병을 유발한 다음, 동물에게 칼시트리올+사이클로포스파미드를 투여하였다. CIA으로부터의 보호는 시간-의존적이다: 1.5 시간 노출 후에 보호는 일어나지 않았으나, 6시간 노출 후에는 완전한 보호를 관찰하였다. 칼시트리올은, 모든 시험 농도(즉, 1 to 3 ㎍/mL)에서, 6시간 적용되었을 경우, 시험된 모든 화학요법제에 의해 유발된 CIA으로부터 100% 보호하였다. 또한, 1 ㎍/mL에서 모발 성장은 처리된 부분(두경부)에 한정된 반면에, 3 ㎍/mL에서 모발 성장도 동물의 등 부위(비처리 부분)에서 관찰되었음을 확인하였다. 마지막으로, 칼시트리올 투여는, 녹색백혈병을 유발하였을 때, 사이클로포스파미드와 관련된 치유율(또는 백혈병이 없는 동물의 수)에 영향을 주지 않았다.

칼시트리올의 2차 약물동력학적 효과는 잘 이해되며, 골, 장, 면역계, 및 부갑상선 변화를 포함한다.

결론. 본원에서 제시된 결과는, 1,25(OH)2D3가 화학요법-유발 탈모증을 예방하는 효과를 발휘한다고 강력하게 시사하고 있지만, 탈모증 자체를 치료하는 것은 아니다. CIA에서 1,25(OH)2D3의 예방 효과의 이유는, 건강한 모낭이 정지되어 화학요법에 내성을 가지기 때문이다. 그러나, 이미 세포자멸적인 모낭에서는, 1,25(OH)2D3 처리가 아무런 이득을 제공하지 못했다.

또 다른 동물 연구의 결과는, 국소 칼시트리올의 적용이 CIA의 발생을 감소시킨다는 잠재적 메커니즘을, 입증하였다. 칼시트리올 국소 처리는, C57BL/6 마우스에서 사이클로포스파미드에 의하여 유발된 소낭의 세포자멸 정도를 유의적으로 감소시킨다는 것이 입증되었다. 제1 성숙한 성장기에서 모낭을 확인하게 하고 성별 차이를 평가하는 동물 모델인, BALB/c 마우스에 대하여 또 다른 실험을 수행하였으며, 수컷 마우스에서 사이클로포스파미드의 복강내 투여 전 5일 동안 칼시트리올의 국소 적용이 CIA의 정도를 유의적으로 투여량-의존적으로 감소시킨다는 것을 입증하였다. EMT-6 뮤린 유방 종양 세포가 주입되어 종양을 가지고 있는 수컷 마우스에서는, 국소 칼시트리올의 보호 효과가 감소하였다. 대조적으로, EMT-6 뮤린 유방 종양 세포가 주입되어 종양을 가지고 있는 암컷 마우스에서 국소 칼시트리올의 전처리는, 종양이 없는 암컷 마우스와 종양을 가지고 있는 수컷 마우스에 비교하여, 사이클로포스파미드 유발 탈모증으로부터의 더욱 효율적인 보호 효과를 나타냈다. 사후 피부의 병리조직학적 검사는, 모낭에서 사이클로포스파미드에 의하여 유발된 형태 변형의 현저한 감소 및 사이클로포스파미드-유발 소낭 손상으로부터의 보호 효과를 입증하였다. 그러나, 이러한 모델에서, 국소 칼시트리올로 처리된 마우스와 그 용액에 노출되지 않은 마우스 사이에서 유의한 세포자멸 염색 패턴 차이를 나타내지 않았다.

한편, 신생아 래트 모델 대신 암컷 C57BL/6 미성숙한 마우스를 이용한 또 다른 동물 연구는, 사이클로포스파미드-유발 탈모증의 예방에 있어서 국소 칼시트리올의 효능을 입증하지 못했다. 그러나, 흥미롭게도, 착색된 모간의 재성장이 유의적으로 가속화되고, 강화되고, 정량적으로 향상되었다. 조직병리학적 연구는, 이것이 화학적 손상에 반응하는 "이영양성 퇴행기 경로(dystrophic catagen pathway)"를 선호하는 모낭, 즉, 새로운 손상되지 않은 성장기 모발 망울(hair bulb)의 비정상적인 빠른 재건을 허용하는 소낭 수리 전략에 기인한 것이라고 시사하였다.

다중적 생체내 동물 연구는 암 세포에 대한 화학요법의 세포독성을 방지하는 칼시트리올의 잠재적 효과를 입증하지 못했다. 녹색백혈병 C51 세포가 이식되고, 0.2㎍의 1,25(OH)2D3로 전처리한 스프라그 다울리 래트와 사이클로포스파미드 처리 전 에탄올 비이클로 전처리한 스프라그 다울리 래트 사이에는, 통계적으로 유의한 생존율 차이를 발견하지 못했다. 더 중요한 것은, 사이클로포스파미드의 복강내 투여 전 EMT-6 뮤린 유방 종양을 가지는 수컷 마우스를 국소 칼시트리올로 전처리하면, 둘 중 하나의 제제 단독으로 처리한 마우스에 비하여, 종양 성장 속도가 크게 감소하였으며, 이는 칼시트리올의 잠재적 항-종양 효과를 나타낸다. 유사하게, 편평 세포 암종 및 인간 전립선 세포 암종을 가지고 있는 마우스에, 2.5㎍의 칼시트리올을 3일간 매일 3회 투여하는 전처리 후, 다양한 농도의 파클리탁셀을 투여하면, 종양이 유의하게 퇴행하였다.

실시예 15. 기니 피그에서 칼시트리올의 피부 감작화 연구

유도기(Induction phase). 수컷 10마리와 암컷 10마리의 기니 피그의 한 그룹을 6시간 동안 국소 패치 적용을 통하여 시험 물품(양호한 내성을 가지는 범위-검색 스크린(range-finding screen)에서 결정된 최고 농도)에 노출을 유도하였다. 상기 유도 노출을 2주간 일주일에 한번씩 동일한 피부 부위에 반복하였다. 5마리의 수컷과 5마리의 암컷 기니 피그로 구성된 비이클 및 양성 대조군 각각을 상기 처리군과 동일한 방식으로 프로필렌 글리콜/무수 에탄올 또는 헥실신나믹 알데히드(공지된 경도 내지 중등도의 피부-감작제)에 노출시켰다. 유도기 동안 패치를 제거 대략 24시간 후에 피부 반응을 채점하고 기록하였다. 마지막 유도 노출 후, 동물을 2추 동안 처리하지 않은 채 놔둔 다음, 검사 노출을 하였다.

접종기 (Challenge phase). 최종 국소 유도 2주 후에 접종 노출을 실시하였다. 시험 물품을 자극 스크린에서 비자극적이라고 결정된 농도로 비이클 대조군 및 시험군에 국소적으로 적용하였다. 비이클 대조군도 비이클로 접종하였다. 양성 대조군은 양성 대조군 물품을 받았다. 패치 제거 대략 24 및 48시간 후 접종 적용 부위를 채점하였다. 이 연구 상태에서, 칼시트리올 5.7 ㎍/g이 감작제가 아니라고 결정하였다.

실시예 16. 래빗에서 칼시트리올 국소 용액 눈 자극 연구

본 연구를 수행하여 칼시트리올 국소 용액의 잠재적 안구 자극 및/또는 부식 효과를 평가하였다. 세 마리의 수컷 New Zealand White Hra:(NZW)SPF 래빗의 한 처리 그룹에 1일째에 우안을 통하여 한 번 테스트 물품을 0.1 mL/동물의 각 투여량 수준으로 투여하였다. 좌안을 처리하지 않은 채 놔두었으며, 대조군으로 사용하였다.

질병률, 사망률, 손상, 및 식품 및 물의 접근 가능성에 대한 관찰을 모든 동물에 대해 매일 2회 수행하였다. 안구 관찰 및 자극 스코어링(scoring)을 5, 8, 10, 및 15일째에 투여한 지 1, 24, 48, 및 72 시간 후에 수행하였다. 투여 평가한 지 24시간 후에, 각각의 눈을 미지근한 물로 세척하였다. 투여 전, 체중을 측정하고 기록하였다. 연구 말기에, 추가 평가 없이 모든 동물을 안락사 시켰다.

자극 점수는 10일 내내 존재하였다. 가장 심한 점수는 일반적으로 투여 관찰한 지 1시간 내로 한정되었다. 안구 자극 증상은 투여한 지 24 시간 후에 여전히 존재하였으나, 투여 관찰한 지 1 시간 후보다 일반적으로 낮은 중증도를 가졌다. 3일째까지, 붉은 것을 제외하고는 모든 스코어링을 0으로 돌려놓았다. 점수 1(일부 혈관이 확실하게 충혈)이 10일 내내 관찰되었다. 15일째까지 모은 안구 자극 신호가 가라앉았다. 이 연구의 결과를 토대로, 칼시트리올 국소 용액은 눈에 중등도 자극을 일으켰으며, 3일째까지는 대부분 가라앉았으며, 15일째까지 완전히 가라앉았다.

동물 연구 요약(Summary of animal studies). 상기에서, 예컨대, 실시예 1, 9, 10, 11, 13, 14, 15 및 16에서 제시된 동물 연구를 실시하여 탈모증에서 비타민 D 화합물의 효과 및, 본 발명에서는, 비타민 D 화합물의 CIA를 예방하거나 완화시키는 적용가능성을 특징화하였다.

CIA 및 원형 탈모증(AA) 둘 다는, 인간의 질병을 가깝게 모사하는 동물 모델의 유용성으로 인해 광범위하게 연구되었다. 이와 관련하여, 이전에 탈모 화학요법(시타라빈, 사이클로포스파미드, 독소루비신, 독소루비신/사이클로포스파미드, 에토포시드)이 신생아 래트 모델(스프라그 다울리 래트)에서 탈모증을 유발하였다는 것을 입증하였다. 이 모델에서, 8 내지 11 일령 래트에 화학요법을 복강 내로 주입하였다. 탈모증은 5~7일 후에 계속되고, 관찰된 모발 손실에 따라 등급화한다. 보호성 화합물은 생후 5일째에 6일동안 투여하였다. 이 모델은 CIA를 연구하는데 유용한데, 이는 이 단계의 모낭이 100% 성장기이고, 모낭들을 화학요법 독성에 민감하게 하여 인간 셋팅에 필적하기 때문이다. 이것은 매우 효과적이며 재현성이 있는 모델이며, CIA으로부터의 보호성 제형을 연구하는데 이용될 수 있다. 이 모델의 한 가지 단점은, 모낭이 생후 첫 모발 성장 사이클에 있으며 래트가 하얀 모발이 있으며 색소침착이 결여되어 있다는 것이다. 대조적으로, 신생아 롱 에반스 래트를 사용하면 색소침착된 모발을 연구할 수 있다. 화학요법의 효과를 연구하는데 광범위하게 이용되는 또 다른 모델은 성숙한 C57BL/6 마우스 모델이다. 이 모델에서 모낭은, 인간 두피와 유사하게, 여러 번의 출생후 성장 사이클을 거치며 모간이 색소가 침착되어 있다. 이러한 특정 모델에서의 성장기 사이클은 탈모에 의해 유도되며, 과정 후 8 내지 9일에 관찰된다. 이 모델과 사이클로포스파미드를 사용하여, 화학요법의 세포독성에 반응으로서, 모낭은 두 경로, 즉 화학요법-유발 탈모증 발병 및 모발 재성장의 패턴을 결정하는, 이영양성 성장기 또는 이영양성 퇴행기를 이용한다는 것을 입증하였다. CIA를 조사하기 위해 사용되는 새로운 모델은 성숙한 롱 에반스 래트 모델이며, 이는 여러 주기를 거친 모낭을 연구할 수 있게 하고, 래트는 색소침착 및 비-색소침착된 모발을 갖는다. 또한, 클리퍼로 모발을 면도하여 성장기를 유도하며, 이 방법은 탈모에 의하여 유도된 모낭에 외상을 주는 것을 회피할 수 있다. 탈모증, 더 상세하게는, AA를 연구하기 위한 또 다른 우수한 모델은 C3H/HeJ 마우스 모델26이다. 이 모델에서, 동물의 20%가 18 개월령이 될 때까지 자발적으로 탈모증이 듬성듬성 발생하거나 전신에 발생한다. 탈모증 패턴과 조직병리학적 분석은, 이 동물의 병리가 인간의 것과 거의 동일하다는 것을 보여준다.

1,25-디하이드록시비타민 D3는, 모낭 케라티노사이트의 분화를 조절하여, 화학 요법의 독성 대사 물질에 내성을 가지게 함으로써, 보호 작용을 한다.

실시예 17. 진행성 또는 재발성 질환의 치료를 위한 탁산 계열 화학요법 용법을 받은 성인 암 환자에 있어서 국소 칼시트리올의 안전성, 내성, 및 약물동력학을 평가하기 위한, 제I상 투여량-증가 연구

1.0. 개요

이 실시예는 전이성 또는 재발성 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 난관암, 1차 복막암, 또는 연부 조직암과 뼈 육종을 가지고 있으며, 탁산 계열(파클리탁셀/나노입자 알부민-결합 파클리탁셀/도세탁셀) 용법의 화학요법을 받고 있는 환자에게서, 국소 칼시트리올의 최대 허용 투여량(MTD) 및 전반적인 안전성과 내성을 측정하기 위한 투여량 증가 연구가 될 것이다. 표준 3+3 투여량 증가 설계가 3 내지 6명의 환자에게 각 투여량 레벨로 이용될 것이다. 나이>18세이고 의사의 판단에 따라 치료 중단과 탁산 계열 요법을 받을 예정인 적격 환자가 화학요법 개시 2주 전에 각 코호트 투여량 수준에서 하루에 2회 일 국소 용액 적용을 시작할 것이며, 3개월간 또는 화학요법 치료가 종료될 때까지 매일 두 번 이어질 것이다. 국소 칼시트리올이 사진 평가 및 환자 자체의 평가에 의해 결정되는 바와 같이 탁산 계열 화학요법-유발 탈모증을 예방 및/또는 감소시키는데 효과적이라고 밝혀지면, 국소 제제와 관련된 투여량 제한 독성(dose limiting toxicities, DLTs)이 관찰되지 않는다는 가정하에, 환자들은 화학요법 치료의 지속 기간에 대한 국소 적용이 계속될 것이다. 국소 칼시트리올에 대한 독성을 국소 처리의 첫 28일 동안 매주, 이어서 4주마다 한 번씩, 연구 임상의, 의사, 또는 간호사에 의하여 평가하였다. 약물동력학 연구(PKs) 목적을 위하여, 혈액 샘플을 다음 시점에서 국소 처리의 1일째에 수거하였다: 투여전, 1일째 아침 1회 적용 2시간(+/~ 30분), 4시간(+/~ 30분), 및 8시간(투여후 +/~ 1시간). 약물 제품의 제2 적용은 최초 적용 10~14시간 후 그리고 8시간 PK 샘플 후에 수행할 것이다. 이후, 국소 적용을 하루에 2회, 아침과 저녁에 수행할 것이다. 계속해서, 각 28일 처리의 마지막 투여 12시간(+/- 2시간) 후, 다음 28일 처리 사이클의 1일째의 첫 적용 전에, PK 샘플을 채취할 것이다. 이러한 스케쥴은 3회의 연속적인 28일 국소 처리 사이클 동안 계속할 것이다(PK는 1, 5, 9, 13주째에 회수할 것이고, 환자가 아직 연구 중에 있다면, PK를 54주째에도 회수할 것이다)

두 번째 과제로서, 국소 칼시트리올의 잠재적 효능을 사진 평가에 의하여 평가할 것이다. 사진 평가는 Canon Power Shot G12 카메라 시스템을 이용하여 수행하여, 등록된 모든 환자의 표준화 및 균일성을 확보할 것이다. 각 사진 평가에서 다음 5가지 뷰를 얻을 것이다: 머리/두피의 양측 뷰, 머리/얼굴의 앞면 뷰, 머리/두피의 뒷면 뷰, 및 머리/두피의 상부 뷰. 또한, 근접 촬영 사진을 동일한 시점에 회수할 것이다. 그것들은 중앙에서 분리되어 중앙부로부터 빗질한 상부 뷰 및 정점 뷰에서의 두피의 중간 패턴을 포함할 수 있을 것이다. 사진은 조명, 카메라 각도, 참여자 머리의 위치를 표준화할 것이다. 이러한 평가는 다음 시점에서 수행할 것이다: 기준점, 7, 15, 27, 및 54주. 각 코호트의 환자 사진이 기준점을 나타내고, 적어도 3명의 환자가 15주 처리를 완료한 후에 7 및 15주 처리가 연구 책임자에게 블라인드로 제시될 것이다. 또한, 연구 27주 및 54주째에 사진을 얻을 것이나, 2차 정보로서 최종 사진 평가에 포함될 것이다. 또한, 모든 환자는 치료 전반에 걸쳐 적용을 유지하도록 요청받고 준수를 보장할 수 있다. 또한, 환자는, 아날로그 10 점 만점으로 하여, 모발 두께, 모발 풍성함, 모발 파손, 모발 화장품 품질(스타일링의 용이성 등) 평가를 요구할 자기 평가 일기를 써서 환자-기록 효능을 평가할 것이다. 연구 책임자 임상 기준 평가, 7주 및 25주 사진을 환자 일기 정보와 함께 이용하였다. 스크리닝 기간을 포함한 대략 12개월의 기간 이상 본 연구를 수행할 것이라 기대된다.

2.0. 과제 및 과학적 목표

제1 과제: 탁산 계열 화학요법 용법을 받은 성인 암 환자에서 국소 칼시트리올의 최대 허용 투여량(MTD) 및 전반적인 안전성과 내성을 결정하는 것

제 2과제: 상이한 투여량 레벨의 칼시트리올의 단일 및 다중 투여 약물동력학을 결정하고; 화학요법-유발 탈모증을 예방하기 위한 칼시트리올 국소 용액의 효능을 미리 평가하는 것

3.0. 연구 설계/조정 개요

짧은 치료 기간은 두피 모낭에서 성장기를 유도하는데 충분하지 않을 것이며, 이는 결과적으로 모낭을 화학요법의 세포독성에 더 민감하게 할 것이다. 이를 다루기 위해, CIA를 예방하리라 기대되는 퇴행기를 유도하고자 화학요법 개시의 적어도 5~7일 전(예, 바람직하게는 적어도 2주 전)에 국소 칼시트리올 적용을 시작할 것이다. 매일 지속적으로 적용하여 퇴행기를 유지하고 탁산 함유 용법의 다중 투여량의 투여를 통하여 보호를 연장할 것이다.

3.1 설계. 이것은 단일군, 투여량-증가 제I상 연구이다. 적격 환자는 화학요법의 제1 투여의 2주 전에 매일 2회씩 두피에 칼시트리올 국소 제형의 투여를 시작하여, 화학요법 처리의 종료 때까지 매일 2회 적용을 계속할 것이다. 이 제제의 MTD를 결정하기 위하여, 국소 칼시트리올에 기인한 3 등급 이상의 독성의 부재 하에, 투여량 증가는 투여 직전 계단식 증가로 일어날 것이다. 최대 허용 독성(DLT)는 가능하면, 아마도, 또는 확실히(9.2절에서 정의됨) 국소 칼시트리올과 관련되어 있으며, 참여 연구자가 결정한 탁산 계열 용법과는 관련되어 있지 않다. 유사하게는, 화학요법 용법의 적절한 투여량 변형 또는 처리 중단은 미리 정의된 가이드라인(9.2.2 내지 9.2.7절에서 정의됨) 및 현재 치료 기준에 따라 구성될 것이다. 국소 칼시트리올 제형의 DLT 결정은 국소 제제 적용 첫 28일 동안 행해질 것이다. 노출 수준을 결정하기 위하여, 대상체는 적절한 안전 모니터링 및 실시간 PK 분석으로 관리될 것이다. 각각의 다음 코호트가 전진하기 전에 PK 분석을 수행할 것이다. 약물동력학(PK) 목적을 위하여, 혈액 샘플을 국소 처리 1일째에 다음 시점에서 수거할 것이다: 투여 전, 1일째 아침 단회 적용 2시간(+/- 30분), 4시간(+/- 30분), 및 8시간(투여 후 +/-1시간) 후. 약물 제품의 제2 적용은 최초 적용 10-14시간 후 그리고 8시간 PK 샘플 후에 수행할 것이다. 이후, 국소 적용을 하루에 2회, 아침과 저녁에 수행할 것이다. 계속해서, 각 28일 처리의 마지막 투여 12시간(+/- 2시간) 후, 다음 28일 처리 사이클의 1일째의 첫 적용 전에, PK 샘플을 채취할 것이다. 이러한 스케쥴은 세 번의 연속적인 28일 국소 처리 사이클 동안 계속할 것이다(PK는 1, 5, 9, 13주째에 회수할 것이고, 환자가 아직 연구 중에 있다면, PK를 54주째에도 회수할 것이다)

3.2 조정 전이성 또는 재발성 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 난관암, 1차 복막암, 또는 연부 조직암과 뼈 육종을 가지고 있으며, 탁산 계열(파클리탁셀/나노입자 알부민-결합 파클리탁셀/도세탁셀) 용법의 화학요법을 받고 있는 환자를 참여 자격에 있어서 스크린할 것이다. 모든 적격 환자는 0.25mL 칼시트리올을 두피의 사분면-우전측부, 좌전측부, 우후측부, 좌후측부를 계량 펌프 스프레이 기구를 사용하여 화학요법의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13일 전(바람직하게는 적어도 2주전) 하루에 2번씩 적용하기 시작하여, 화학요법 종료 때까지 매일 2번 계속하였다. 국소 칼시트리올이 사진 평가 및 환자 자체 기록에 의해 결정되는 바와 같이 탁산 계열 화학요법-유발 탈모증을 예방 및/또는 감소시키는데 효과적이라고 밝혀지면, 국소 제제와 관련된 DLT이 관찰되지 않는다는 가정하에, 환자들은 화학요법 치료의 지속 기간에 대한 국소 적용이 매일 2회 계속될 것이다. 화학요법 치료 전 또는 그 동안에 모발 면도를 선택하는 환자는 시험에서 제외할 것이다. 국소 용액을 두피에 적용할 것이다. 모발 및 두피는 건조되어야 하거나, 적용이 삼푸 직후에 이루어지면, 국소 용액 투여 전에 모발 및 두피를 첫 번째 타월 건조시켜 만질 때 모발 및 두피가 젖지는 않고 축축해져야 한다. 모발 및 두피는 각 적용 후 적어도 8시간 동안은 세척하거나 샴푸하지 않아야 할 것이다. 세정 또는 샴푸 전 칼시트리올 2회 이하의 연속적인 투여를 적용하도록 권고 받을 것이다. 처리는 모발 주기의 퇴행기를 유도하여 마지막 적용의 2-3주 동안 지속될 것이다. 약물 적용은 다중 화학요법 처리를 통하여 이러한 퇴행기 보호를 확보할 것이다.

4.0. 치료제 / 진단제

연구 제품: (칼시트리올, USP) 국소 용액

화학명: (5Z,7E)-9,10-세콜레스타-5,7.10(19)-트리엔-1 a,33.25-트리올

IUPAC명: (1a.3B.5Z.7E)-9.10-세코콜레스타-5,7.10(19)-트리엔-1.3,25-트리올

이명: 칼시트리올은 다음으로 알려짐: 1a,25-디하이드록시콜레칼시페롤, 1a,25-디하이드록시비타민 D3,1(S),25-디하이드록시비타민 D3, 1,25-DHCC, 1,25-(OH)2D3

분자식: C27H44O3:

CAS 번호: 32222-06-3

분자량: 416.6

융점: 129-131℃

화학적 안정성: 실온에서 안정함

투여 경로: 국소

공급 방법: LDPE 라이너를 갖는 18mm 블랙 페놀 스크류 캡이 있는 33mL 앰버 유리병(유형 III유리) 별도로 포장된 파이퍼(Pfeiffer) 국소 분무 펌프(0.25 mL)(흰색)(연구 전용)

임상 시험 제형: 칼시트리올 국소 용액용으로 제안된 임상 시험 제형은 프로필렌 글리콜, USP,의 비이클 중 칼시트리올, USP, 및 무수 200 proof, 비변성 알코올, USP을 40/60 중량 프로필렌 글리콜/알코올 비율로 함유한다. 인간 연구용 국소 용액 비이클 중 칼시트리올 농도는 비임상적 독성의 완료를 기반으로 결정한다. 제안된 제I상 연구는 칼시트리올 5, 10, 및 20 ㎍/mL을 활용할 것이다.

포장(packaging): 제안된 제I상 임상 약물 제품은 블랙 페놀 스크류 캡이 설치된 33mL 용량 유형 III 앰버 유리병에 포장하고자 한다. 또한, 제안된 약물 제품은 개별적으로 포장된 계량 투여 분주 어플리케이터 시스템(metered dose dispensing applicator system)을 포함할 수 있는데, 이것은 매 어플리케이터 압축시 0.25 mL를 균일하게 분주할 수 있다. 약물 제품의 총 용량은 1.0 mL이거나 4회의 반복적인 계량 기구를 적용한다. 총 1.0 mL 약물 제품의 적용은 매일 2번, 아침과 저녁에, 적용 사이에는 10-14시간 간격을 두고 수행할 것이다.

약물 제품 28 mL(0.25 mL x 4회 적용 x 2번/일 x 14일=28 mL)을 충분히 분주하도록 하는 국소 용액 약물 제품 대략 31.5 mL를 함유하는 칼시트리올 국소 용액의 단회 앰버 유리병이 환자에게 제공될 것이다. 유리병 기구는 사용 설명서, 사용시 경고사항, 및 임상 사이트에 의해 할당될 환자 ID용 부분으로 적절하게 표지될 것이다. 각 기구는 병 캡과 병의 상부를 덮는 플라스틱 안전 밀봉제로 안전하게 될 것이다. 칼시트리올 적용 방법 및 각 적용 날짜와 시간 기록 방법에 관한 설명이 있는 적용 일지가 환자에게 제공될 것이다. 연구팀은, 환자에게 병원 방문시 그들이 사용한 유리병, 적용 일지, 자기-평가 일기를 가져오도록 요청하여, 순응도를 모니터할 것이다. 연구팀은 병 및 적용 일지를 검토하여, 국소 처리 투여의 순응도를 확인하고, 매 검토시 환자들의 말, 이니셜, 및 날짜를 기록한 문서 관리를 확인할 것이다.

사용시, 환자는 안전 밀봉제를 뜯어서 병 캡을 제거하고, 특별하게 설계된 펌프 스프레이 도구를 병에 삽입하고 병에 들어서 있는지를 확인한다. 펌프를 세번 눌러서 펌프를 준비시킨 다음, 두피의 각 사분면에 별도로 4번씩 0.25mL 약물 제품을 스프레이한 후, 두피를 맛사지하여 제품의 골고루 분포할 수 있도록, 환자에게 알려줄 것이다. 이러한 투여 용법은, 화학요법 개신 전 14일 연속하여, 매일 2회 아침과 저녁에, 그리고 후속하여 매일 2번씩 반복될 것이다. 임상 약물 제품은 환자에게 사용될 때까지 냉장 온도(5-8℃)에서 저장될 것이다. 사용하는 동안, 환자는 약물 제품을 실온에서 보관할 것이다.

저장: 제안된 임상 Phase 1 배치를 평가할 수 있는 안정성 저장 조건은 하기 표에 제시되어 있다.

제I상 임상 연구에서 제안된 안정성 저장 조건

저장 조건:	장기간 저장: 25℃ ± 2℃/ 60%RH ± 5%RH 가속 저장: 40℃ ± 2℃/ 75%RH ± 5%RH 조절 저장 2-8℃
저장 위치:	수평
강도:	5 ㎍/mL, 10 ㎍/mL, 20 ㎍/mL
포장:	1. LDPE 라이너를 갖는 18mm 블랙 페놀 스크류 캡이 있는 33mL 앰버 유리병(유형 III유리) 2. 별도로 포장된 파이퍼(Pfeiffer) 국소 분무 펌프(0.25 mL)(흰색)(연구 전용)
목표 투여량:	매 작동시 5 ㎍/mL~1.25 ㎍ 매 작동시 10 ㎍/mL~2.5 ㎍ 매 작동시 20 ㎍/mL~5 ㎍

투여 근거: 비-임상적 동물 연구에서 무독성량(NOAEL)은 10.31㎍/mL이었다. 동물 및 인간 칼시트리올 투여량을 비교하기 위하여, 4주령 미니피그 연구에서의 NOAEL 투여량과 곧 있을 임상 시험에서의 최초 투여량을 이용하여 안전 여유도(margin of safety, MOS)를 계산하였다. 미니피그에서, NOAEL 10.31㎍/mL은 3.33㎍/kg 투여량과 등가이다(10.31㎍/mL x 2.1mL (투여량 부피) x 2X/일 + 13kg [4주 미니피그의 평균 체중]). 인간에게는 5 ㎍/mL x 1 mL x 2X/일 * 60kg이다). 이 투여량을 기반으로, MOS는 20이며, 이는 최초 임상 투여량을 넘는 적절한 여유도이다. 최초 투여량이 독성을 일으킨다면, 환자는 본 연구에서 제외할 것이다.

5.0. 대상체 자격 기준

본 연구는, 국부적으로 진행성이며 절제불가능 및/또는 전이성 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 난관암, 1차 복막암, 또는 연부 조직암과 뼈 육종을 진단받으며, 의사의 재량에 따라 탁산 계열(파클리탁셀/나노입자 알부민-결합 파클리탁셀/도세탁셀) 용법의 화학요법을 받고 있는 환자에 대하여 실시할 것이다.

5.1 대상체 포함 기준:

ㆍ 적어도 18세의 성인 환자.

ㆍ 동의서를 충분히 이해하여 참여할 수 있음.

ㆍ 병리학적으로 확정되는, 국부적으로 진행성이며 절제불가능 및/또는 전이성 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 난관암, 1차 복막암, 또는 연부 조직암과 뼈 육종의 이력이 있음.

ㆍ 의사의 재량에 따라 탁산 계열(파클리탁셀/나노입자 알부민-결합 파클리탁셀/도세탁셀) 용법을 받을 예정.

ㆍ 탈모증 또는 경도 탈모증의 흔적이 없음(멀리서 뿐만 아니라 가까운 검사에서 분명하지 않은 개인에서 정상의 <50%의 모발 손실로 정의되는 NCI CTCAE 등급 1 탈모증; 상이한 헤어 스타일은 모발 손실을 커버하도록 요구 될 수 있지만, 위장을 위한 가발 또는 헤어 피스를 필요로 하지 않음). NCI-CTCAE v.4.0에서 등급 1이하인 경우, 여성/남성-패턴 대머리 또는 연령-관련 모발 손실은 허용됨. 대상체가 현재 등급 0 또는 등급 1 탈모증이 있다면, 이전에 자신의 모발이 손실되는 대상체를 등록할 수 있음.

ㆍ 등록 전 14일 이내에 ECOG 성능 점수 0 또는 1

ㆍ 등록 전 72 시간 내에 > 1500세포/mm³의 기준 호중구 수를 가짐.

ㆍ 등록 전 72시간 내에 혈청 칼슘<ULN (3.0보다 낮은 알부민을 갖는 환자, 정정 칼슘 혈청 칼슘 = 혈청 칼슘 +[0.8][3.5- 혈청 알부민])을 가짐.

5.2 대상 배제 기준:

ㆍ 국소 칼시트리올 개시 4주 이내에 칼슘-저하 요법 또는 칼슘 레벨에 영향을 줄 수 있는 칼슘-저하 약물(예, 칼시토닌, 미트라마이신, 포스페이트, 데노수맙)을 받은 환자. 시험 시작 전 3개월 이상 동안 비스포스포네이트 또는 칼슘-저하 치료로 관리되고 칼슘 대사의 안정성에 대하여 증명한 환자는 시험에 참여할 자격이 있는 것으로 본다.

ㆍ 연구자에 의해 결정되는, 연구 등록 1년 이내에 약물 또는 알코올 남용의 이력을 가짐.

ㆍ 화학요법의 개시 이전 두피 모발 면도를 선택하거나 화학요법 처리 동안 그렇게 하는 것을 계획한 환자

ㆍ 연구자의 견해에 있어서, 연구 약물의 흡수에 영향을 줄 것 같은 모든 피부 조건, 예컨대, 아토피성 피부염 등등.

ㆍ 연구 시작 전, 30일 이내 또는 생물학적 활성의 여섯 반감기 중 더 긴 시간 이내에 연구 제제(investigational agent)로 처리됨 (환자는 또 다른 시험에 현재 등록되지 않거나 현재 또 다른 연구 제제로 처리될 수 없음).

ㆍ 현재 또는 연구자에 의해 결정된 연구 시작 30일 이내 고칼슘혈증 또는 비타민 D 독성의 이력, 또는 협심증, 심근 경색, 울혈성 심부전, 또는 정신 질환의 치료를 위한 입원한 환자.

ㆍ 연구자에 의하여 결정되는 칼시트리올에 유의한 알러지의 이력이 있음.

ㆍ 연구의 요건을 이해하거나 준수하는 대상체의 능력을 방해하는 조건을 가짐.

ㆍ 환자가 국소 투여 시작 전 30일 이상 동안 비타민 D 보충제를 섭취하고 연구에 걸쳐 비타민 D 보충제의 투여량이 동일하게 남아있지 않는다면, 연구 동안 비타민 D 보충제를 섭취한 환자.

ㆍ 6개월 이상의 안정된 치료 기간에 대한 대상체를 제외하고, 국소 치료 개시의 4주 이내에 칼슘 레벨에 영향을 준다고 알려진 의약물( > 500 IU 비타민 A, 칼슘 보충제, 플루라이드, 항간질제)로 처리된 환자.

ㆍ 6개월 이상 동안 안정적인 투여량을 받고 치료 중에 있는 대상체를 제외하고, 티아지드 또는 푸로세미드 이뇨제를 받고 있는 환자.

ㆍ 고칼슘혈증 또는 신장 결석을 갖는 환자.

ㆍ 과산화물 적용, 영구 모발 염색, 탈색, 모발 탈색, 펌, 완화제 및/또는 헤어 산화 염료로 인하여, 지난 30일 이내에, 과정을 통하여, 유의한 모발 파손, 모발 손상, 및 관련 모발 손실이 있는 것으로 나타낸 환자.

ㆍ NCI-CTCAE v.4.0 에서 탈모증 등급 2 이상 또는 유의한 모발 손실 또는 모발 파괴가 있는 환자.

ㆍ 두개골에 방사선 경험이 있는 환자

ㆍ 임신 또는 모유 수유 중인 환자

6.0. 모집 계획

환자들은 자격 기준을 만족한다면 참여할 기회를 얻게 될 것이다. 소수자에 대한 차별은 없을 것이다. 동의서를 환자에게서 수집할 것이다. 동의서를 수집할 권한이 있는 연구자가 동의서를 수집할 것이다. 환자는 본 연구에 대한 참여의 대가를 받지 않을 것이다.

7.0. 전처리 평가

칼시트리올 시작의 적어도 5-9일 전(예컨대, 적어도 4일전, 적어도 5일전, 적어도 6일전, 적어도 7일전, 적어도 8일전, 적어도 9일전, 또는 적어도 2주전)에 다음 사항이 요구된다:

ㆍ 병용 약물 치료를 포함하여, 병력과 신체 검사를 완료한다.

ㆍ 차등 CBS, 종합적인 화학 패널, 혈청 인 수준, 및 소변 분석

ㆍ 혈청 1, 25 디하이드록시 비타민 D.

ㆍ 임신 검사(본원에 개요된 임신 검사는 가임 여성(women of childbearing potential, WCBP)만을 위한 것임). WCBP 기준을 충족하지 않고 비가임 여성 기준을 충족하는 모든 여성을 제외한다. 가임 여성 정의: 초경을 경험하고 "비가임 여성" 기준을 충족하지 않는 임의의 여성. 비가임 여성 정의: 영구적으로 불임(예컨대, 난관 폐색, 자궁적출술, 양측 난관 절제술, 양측 난소 절제술)인 여성; 나이>45세이고, 호르몬 대체 요법을 사용하지 않은 여성으로서, 적어도 1년 월경 전체 중단을 경험하거나, 난포 자극 호르몬(FSH) 값 > 40 mIU/mL이고 에스트라디올 값 < 40pg/mL (140pmol/L)인 여성; 및 > 45세이고, 호르몬 대체 요법을 사용한 여성으로서, 적어도 1년 월경 전체 중단을 경험하거나, 호르몬 대체 요법의 개시 전에 FSH > 40 mIU/mL에 기반한 폐경의 흔적이 기록되고, 에스트라디올 < 40 pg/mL인 여성.

ㆍ 화학요법 전의 모발 및 두피의 사진 기록 (연구에서 기준 평가로서 기능할 것임).

ㆍ 모발 조건에 대한 환자 자기-평가.

8.0. 처리 /조정 계획

적격 환자는 0.25mL 국부 칼시트리올을 두피의 사분면-우전측부, 좌전측부, 우후측부, 좌후측부 각각에, 제공된 계량 펌프 스프레이 기구를 사용하여 화학요법 치료의 적어도 5-9일전(예컨대, 바람직하게는 적어도 5일전, 적어도 6일전, 적어도 7일전, 적어도 8일전, 적어도 9일전, 또는 적어도 2주일전)에 하루에 2번씩 적용하도록 설명을 들을 것이다. 계속해서, 3달 동안 또는 화학요법의 종료 때까지 매일 2번 수행할 것이다. 국소 용액을 두피에 적용할 것이다. 모발 및 두피는 건조되어야 하거나, 적용이 삼푸 직후에 이루어지면, 국소 용액 투여 전에 모발 및 두피를 첫 번째 타월 건조시켜 만질 때 모발 및 두피가 젖지는 않고 축축해져야 한다. 모발 및 두피는 각 적용 후 적어도 8시간 동안은 세척하거나 샴푸하지 않아야 할 것이다. 세정 또는 샴푸 전 칼시트리올 2회 이하의 연속적인 투여를 적용하도록 권고 받을 것이다. 한편, 환자들은 칼시트리올 2회 적용마다 한번씩 모발을 세정해야 할 것이다. 환자는 본 연구 전체에 걸쳐 국소 용액을 자가-투여할 것이나, 첫 번째 투여 및 약물동력학 연구가 수행되는 날은 제외하며, 그 경우에 국소 칼시트리올의 적용은 연구자가 행할 것이다.

8.0.1 탁산 계열( 파클리탁셀 /나노입자 알부민-결합 파클리탁섹 / 도세탁셀 ) 화학요법 투여

심한 과민 반응을 방지하기 위해, 모든 환자는, 기관 가이드 라인에 따라, 화학요법제의 투여 전에 사전 투여 받는다.

유방암 환자를 위한 권장 용법의 예:

1. 전이성 유방암 치료를 위하여, 파클리탁셀/nab-파클리탁셀/도세탁셀 기반이거나 카르보플라틴과의 병용 용법이 권장된다.

부인암 환자를 위한 권장 용법의 예:

1. 난소암 치료를 위하여, 파클리탁셀/도세탁셀 기반이거나 카르보플라틴과의 병용 용법이 권장된다.

2. 자궁내막암 치료를 위하여, 파클리탁셀 기반이거나 카르보플라틴과의 병용 용법이 권장된다.

3. 자궁 육종 치료를 위하여, 도세탁셀 기반이거나 겜시타빈과의 병용 용법이 권장된다.

4. 자궁경부암 치료를 위하여, 파클리탁셀 기반이거나 시스플라틴/토포테칸과의 병용 용법이 권장된다.

육종 환자를 위한 권장 용법의 예:

1. 연조직 또는 골 육종 치료를 위하여, 파클리탁셀/도세탁셀 기반이거나 겜시타빈과의 병용 용법이 권장된다.

8.1 투여량 증가(Dose Escalation) 투여량 레벨 1(5 ㎍/mL)에서 시작하여 크기 3 내지 6의 코호트에서 국소 칼시트리올로 환자를 처리할 것이다. 임상 독성이 허용할 정도라고 공표되면 용량을 증가시킬 것이다(아래 참조). 두 투여량 레벨이 증가를 위하여 고려될 것이다(10 및 20 ㎍/mL). 투여량 제한 독성(DLT, 8.2절에서 정의됨)의 결정은 국소 처리 첫 28일 동안 이루어질 것이다. 환자 내 투여량 증가는 수행하지 않을 것이다. DLT는 가능하면, 아마도, 또는 확실히(8.2절에서 정의됨) 국소 칼시트리올과 관련되어 있으며, 참여 연구자가 최선으로 결정한 화학요법 용법과는 관련되어 있지 않다. 용량 증가 계획(표 15)은 다음과 같다:

1회 28일 사이클의 처리를 실시하며, PK 데이터 평가는 다음 투여량 레벨로 증가시키기 전에 수행할 것이다.

코호트의 처음 세 환자 중 어느 누구도 투여량 제한 독성(DLT)을 경험하지 않았다면, 새로운 코호트의 세 환자를 다음 더 높은 투여량 레벨로 처리할 것이다.

코호트의 세 환자 중 한 명이 DLT를 경험한다면, 세 명까지의 추가 환자를 동일한 투여량 레벨로 처리할 것이다. 여성 환자 중 한 명만이 DLT를 경험한다면, 계속해서 증가시킬 것이다.

코호트의 둘 이상의 환자가 DLT를 경험한다면, 최대 허용 투여량(maximum tolerated dose, MTD))을 초과한 것이고, 더 이상의 투여량 증가는 일어나지 않을 것이다. 이전 투여량 레벨이 MTD로 여겨질 것이다.

세 명의 환자만을 MTD로 여겨지는 투여량 레벨에서 처리했다면, 세 명까지 추가 환자를 그 투여량 레벨로 누적될 것이다. 그 투여량 레벨에서 여섯 명 이하의 환자가 DLT를 경험한다면, 그 투여량 레벨은 MTD로 확인할 수 있을 것이다. 그 코호트의 둘 이상의 환자가 DLT를 경험한다면, 이전 투여량 레벨을 동일한 방식으로 연구할 것이다.

MTD는, 대상체의 2/3 또는 2/6가 DLT를 경험한 투여량 이하에서 첫 28일 치료 사이클 동안 대상체의 0/3 또는 1/6가 DLT를 경험한 투여량 레벨로 정의된다. 따라서, 대상체의 > 30% (2/3 or 2/6)가 임의의 투여량 레벨에서 DLT를 발전시키면, MTD를 초과한 것이다. MDT를 투여량 증가의 세 코호트에서 완료한 후에 설정하지 못한다면, 연구 후원자가 피부과의 FDA 부문과 연구 결과를 검토하여 연구 프로토콜을 보정하여 추가 투여량 증가 코호트에 추가하는 것에 관한 지침을 구할 것이다.

코호트 심의 위원회(cohort review committee, CRC)는 임상 및 실험실 데이터를 충분히 인식할 것이며, 다음 코호트에 대한 투여량 상승이 적절한 것인지 동의해야 한다. 각 치료 코호트로부터의 약물동력학 데이터도 CRC에 의해 검토되며, 투여량 증가에 대한 임의의 결정을 고려될 것이다. 처리 연장 기간으로 인한 부작용은, 가능하면(적어도 월 단위), CRC에 제시될 것이다. 이들 데이터는 투여량 증가 결정에서 고려될 것이다. 세 개의 코호트가 처리된 후 MTD에 도달되지 않은 경우, 추가 투여량 증가를 위해 프로토콜 개정이 필요할 것이다.

CRC는 이전 코호트로부터의 사용 가능한 모든 데이터를 검토하여, 이러한 방식으로 결정된 실제 투여량 증가가 환자를 터무니없는 위험에 노출시키지 않는다는 것을 확인한다. CRC는 임의의 이유(예, 비선형 PK의 관찰, 칼시트리올 국소 용액 1회분 이상을 받은 대상체 내의 AE)로 투여량 증가를 감소시키거나 중지할 수 있다. 다음 코호트에 계속 진행할 것인지에 대한 결정은 CRC 회원들의 만장 일치 동의를 요한다.

비임상 독성이 검토되었으며, 코호트 1 약물 농도는 비임상 연구에 기초하여 예측 MTD의 약 1/20 이하이다. 제I상 프로토콜에 상술된 코호트 1 투여시 투여량 제한 독성의 전제 위험이 없기 때문에, -1 투여 코호트가 없을 것이라 판단된다. 초기 환자 중 두 명 이상이 초기 칼시트리올 투여량에서 허용될 수 없는 독성을 경험한다면, CRC는 사용 가능한 모든 데이터를 검토하고, 연구를 중단하도록 선택할 수 있다.

처리 기간 동안 DLT를 갖는, 코호트당 대상체 수:	투여량 증가 결정 규칙:
3명 중 0명	다음 투여량 레벨에서 3명의 대상체가 들어감.
3명 중의 1명	당해 투여량 레벨에서 적어도 3명의 대상체가 들어감. * 3명의 추가 대상체가 DLT를 가지지 않는다면, 다음 투여량 레벨로 진행함. * 3명의 추가 대상체 중 한 명 이상이 DLT를 갖는다면, 투여량 증가를 정지시키고, 해당 투여량이 최대 투여량(maximum administered dose, MAD)임을 공표함. 3명의 대상체만이 이전에 다음 최저 투여량 레벨에서 처리된 경우, 3명의 추가 대상체가 다음 최저 투여량 레벨로 들어갈 것이다.
2명	투여량 증가를 정지할 것이다. 해당 투여량 레벨이 MAD임을 공표할 것이다(최고 투여량 투여). 3명의 대상체만이 이전에 다음 최저 투여량 레벨에서 처리된 경우, 3명의 추가 대상체가 다음 최저 투여량 레벨로 들어갈 것이다.
최대로 투여된 투여량 미만 중 최고 투여량 레벨에서 6명 중 1명	이 경우, 제2상 투여량이 일반적으로 권장된다.

약물동력학(모든 환자) 약물동력학(PK) 목적을 위하여, 혈액 샘플을 국소 처리 1일째에 다음 시점에서 수거할 것이다: 투여 전, 1일째 아침 단회 적용 2시간(+/- 30분), 4시간(+/- 30분), 및 8시간(투여 후 +/-1시간) 후. 약물 제품의 제2 적용은 최초 적용 10-14시간 후 그리고 8시간 PK 샘플 후에 수행할 것이다. 이후, 국소 적용을 하루에 2회, 아침과 저녁에 수행할 것이다. 계속해서, 각 28일 처리의 마지막 투여 12시간(+/- 2시간) 후, 다음 28일 처리 사이클의 1일째의 첫 적용 전에, PK 샘플을 채취할 것이다. 이러한 스케쥴은 3회의 연속적인 28일 국소 처리 사이클 동안 계속할 것이다(PK는 1, 5, 9, 13주째에 수집할 것이고, 환자가 아직 연구 중에 있다면, PK를 54주째에도 수집할 것이다). 각 혈액 수거 약 5분전에 생체 신호를 얻을 것이고, 실제 수거 시간을 기록할 것이다.

매 수집시, 혈청 분리관 내에서 정맥천자로 혈액을 수집한다. 10 ± 5분 동안 1200 RCF로 원심분리하고, 혈청 분취액1.5 mL 각각을 2개의 표지된 외부 나사산이 있는 극저온 바이알에 넣고 즉시 냉동한다. 혈청 내 칼시트리올 농도를 분석적으로 측정하기 위하여, 각 코호트에서 수집된 샘플을 드라이 아이스 상에서 냉동된 상태로 실험실에 보낼 것이다. 혈청 샘플을 충분한 양의 드라이 아이스와 함께 운반하여, 도착 때까지 샘플이 냉동되어 있도록 한다.

칼시트리올의 PK 혈청은 칼시트리올을 받은 모든 대상체에서 수집된 혈청으로부터 계산할 것이다. 다음의 혈청 PK 파라미터는 비-구획 분석을 이용하여 계산할 것이다:

UC_o _-t: 최종 측정 농도까지의 농도-시간 곡선 하에서의 면적, 사다리꼴 법칙으로 계산, 농도-시간 단위로 표시.

AUC_o _- _inf: 투여시 부터 무한대까지의 혈청 농도-시간 곡선 하에서의 면적, 최종 정량성 농도를 Kel로 나눈 결과를 UC_o _-t에 더하여 계산되고, 농도-시간 단위로 표시.

Cmax: 내삽 없이 실험 데이터로부터 직접 얻은 관찰 피크 약물 농도, 농도 단위로 표시.

Tmax: 내삽 없이 실험 데이터로부터 직접 얻은 피크 약물 농도에 도달하는 관찰 시간, 시간 단위(시)로 표시.

Kel: 겉보기 제거 속도 상수, 혈청 농도-시간 곡선의 로그-선형 부분의 회귀 분석에 의해 결정, 시간^-1 단위로 표시.

T_1/2: 소실기 반감기, -In 2/Kel로 계산, 시간 단위(시)로 표시.

CL: 약물 투여량/AUC_o _- _inf로 계산되는 클리어런스(clearance), 흐름 단위(L/시)로 표시.

Vd: CL을 Kei로 나누어 계산되는 분포 부피, 부피 단위(L)로 표시

PK 파라미터용 기술 통계(수, 평균, 평균, 표준 편차, 및 범위를 포함)를 투여량 수준에 의하여 표로 나타낼 것이다. 예측 신장 제거를 투여량 수준에 의하여 표로 나타낼 것이다.

8.2 투여량-제한 독성(DLT) 정의 및 처리 변형 Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE v 4.0)에 따라 독성을 등급화할 것이다.

8.2.1 국소 칼시트리올 관련 투여량-제한 독성 투여량 제한 독성은, 국소 제제 적용의 첫 번째 28-일 처리 사이클 동안에 발생하는 임상학적으로 중요한 3 또는 4 등급 비-혈액학적 독성으로 정의되며, 가능하면, 아마도, 또는 확실히, 연구자에 의해 최선으로 결정된 칼시트리올과 관련되어 있다(화학요법 용법과는 관련이 없음). 과도한 용량의 칼시트리올은 고칼슘혈증을, 어떤 경우에는 고칼슘뇨증을 유발한다. 환자가 고칼슘혈증 증상을 나타낸다면, 혈청 칼슘을 결정하여야 하고, 즉시 처리를 중단하여야 한다. 고칼슘혈증은 CTCAE 버전 4.0 3 급 (이상)을 사용하여 정의될 것이며, 이는 혈청 칼슘 > 12.5-13.mg/dL; > 3.1-3.4 mmol/L, 또는 이온화 칼슘 > 1.6-1.8 mmol/L, 및 입원을 지시한다. 증가된 혈청 칼슘에 의해 결정되는 무증상 고칼슘혈증 환자는, 자신의 이온화 칼슘 레벨을 먼저 체크할 것이다. 이온화 칼슘 레벨이 실제로 증가하고 있다면, 본 연구 약물을 중단할 것이다. 이온화 칼슘 레벨이 정상이면, 환자는 연구 중에 남아있을 것이며, 혈청 칼슘이 이온화 칼슘을 따를 것이다. 칼시트리올 이러한 이유로 중단되어야 한다면, 혈청 칼슘 및 포스페이트 수준이 이틀 연속적으로 정상이 될 때까지, 시험 센터에서 매일 혈액을 채취하여 체크할 것이다.

8.2.2 투여량-제한 독성 환자가 화학요법 용법과 관련된 독성을 발병한다면, 기관 가이드라인에 따라, 투여량 감소가 이뤄질 것이다. 화학요법 용법을 변형하는 동안, 변형이 연구자가 필요하다고 인정되지 않는다면, 칼시트리올 투여량은 안정적으로 유지할 것이다.

9.0. 처리 /조정 중 평가

임상. 이력 및 신체 검사는 아래 표에서 설명하는 대로 수행할 것이다. 화학요법 개시의 적어도 5-7일(예를 들면, 약 2 주) 전에 국소 칼시트리올의 적용을 시작한 다음, 환자는 연구자를 통해 중간 병력, 병용 약물, 체중과 생체 신호(혈압, 온도, 호흡 속도, 심박수)를 포함한 신체 검사에 대하여 알게 될 것이고, 1, 2, 3, 5, 7, 11, 15, 27, 및 54주에 부작용에 대하여 알게 될 것이다.

실험실. 실험실 평가는 하기 표에 기술된 바와 같이 실시될 것이다.

연구 평가 스케쥴 파트 A - 기본 정보

모든 연구 평가는, 달리 언급되어 있지 않으면, 예정된 날짜에서 +/- 72시간에 실시할 것이다.

연구 평가 스케쥴 파트 B - 시험 및 연구 약물 적용

┼ PK를 다음 방식으로 수집할 것이다:

국소 처리 1일째: PK를 투여 전 (첫 투여 전), 및 2시간(+/- 30분), 4시간(+/- 30분), 및 8시간(투여 후 +/- 1시간). 칼시트리올 연구 5, 9, 13, 및 54주에서, PK를 투여 전 1일째에 수집할 것이다. 이는 국소 칼시트리올 최종 적용한 지 12시간(+/- 2시간) 후일 것이다.

+┼+ 2주째 방문에서, 환자는 일주일에서 월요일, 수요일, 또는 목요일에 피부과 클리닉 피부과 전문의에 의해 요청 받을 것이다.

┼┼┼ 모든 환자는 연구 약물의 초기 적용부터 약 6 개월까지 동안 자기-평가를 하도록 요청 받을 것이다. 일기는 칼시트리올 개시 후 첫 15주 동안 매주 그리고 19, 13, 및 27주에 작성될 것이다.

┼┼┼┼ 일부 환자는 3주 기록하고 한 주 쉬는 계획에 배치될 수 있음을 알아 둔다. 표시된 주는 화학요법 주가 없을 것이다.

┼┼┼┼┼ 기준점을 나타내는 각 코호트의 환자 사진, 적어도 3명의 환자가 15주 처리를 완료한 후에 7 및 15주 처리가 연구 PI에게 블라인드로 제시될 것이다. 또한, 연구 27주 및 54주째에 사진을 얻을 것이나, 2차 정보로서 최종 사진 평가에 포함될 것이다. 탈모증 1차 평가를 위하여, PI 임상 기준 평가, 및 7주 및 25주 사진을 환자 자기-평가 일기 정보와 함께 이용할 것이다.

┼┼┼┼┼┼ 처리가 15주 이상 계속되면, 이 주에 환자 자기 평가가 요구된다.

┼┼┼┼┼┼┼ 연구 평가를 스케줄 당일부터 +/- 7일에 수행할 것이다.

모발 및 두피 사진 평가. 탈모증은 모발 손상으로 정의된다. 본 연구에서는, 연구 간호사에 의하여 획득될 Canfield Clinical Photography 평가 사진을 이용하여 종합 사진 검토를 수행하여, 등록된 모든 환자 중에서 표준화 및 균일성을 확인할 것이다. 각 사진 평가에서 다음 5가지 뷰를 얻을 것이다. 머리/두피의 양측 뷰, 머리/얼굴의 앞면 뷰, 머리/두피의 뒷면 뷰, 및 머리/두피의 상부 뷰. 또한, 근접 촬영 사진을 동일한 시점에 회수할 것이다. 그것들은 중앙에서 분리되어 중앙부로부터 빗질한 상부 뷰 및 정점 뷰에서의 두피의 중간 패턴을 포함할 수 있을 것이다. 사진은 조명, 카메라 각도, 참여자 머리의 위치를 표준화할 것이다. 종합 사진 평가를 한 피부과 전문의 검토자에 의하여 실시할 것이고, 사진은 모발 부피에서 7-점 평가 저울을 이용하여 평가할 것이다(-3 = 크게 감소, -2 = 중간 감소, -1 = 약간 감소, 0 = 변화 없음, +1 = 약간 증가, +2 = 중간 증가, +3 = 크게 증가). 검토자는 1개월의 화학요법 후 그리고 3개월의 화학요법 처리 후에 기준 화학요법에서 얻은 사진을 비교할 것이다. 사진을 채점한 피부전문의 검토자는 모든 다른 사람과 비교될 기준 사진을 제외하고 시간별 사진에 대하여 블라인드로 표시할 것이다.

모발 및 두피의 주관적 평가 또한, 탈모증을 환자 자기-기록 일기를 통하여 주관적으로 기록할 것이다. 환자는, 아날로그 10 점 만점으로 하여, 모발 두께, 모발 풍성함, 모발 파손, 모발 화장품 품질(스타일링의 용이성 등) 평가를 요구할 이러한 자기-평가 일기를 매주 작성하도록 요구 받아 연구 약물의 환자-기록 효능을 평가할 것이다. 이것은 칼시트리올 동안 매주 완성할 것이고, 매 방문 시에 연구팀에 돌려줄 것이다. 스크리닝 기간을 포함한 대략 12개월의 기간 이상 본 연구를 수행할 것이라 기대된다.

10. 0. 처리 -후 평가

처리-후 신체 검사는 연구자에 의하여 수행될 것이며, 연구 처리 완료일의 12주 후에 진행할 것이다. 검사는 다음을 포함할 것이다: 체중 측정, 생체 신호, 혈액 샘플 채취(완전 혈구 수치, 종합적인 화학 패널, 혈청 인, 및 혈청 비타민 D) 및 부작용 평가.

11. 0. 독성 /부작용

NCI CTCAE 버전 4.0을 이용하여 모든 독성을 등급화할 것이다. 하기는 관찰될 수 있는 일부 부작용이다:

공통 부작용(20-30%)

ㆍ 소양증

ㆍ 피부 통증

ㆍ 피부 아림 또는 화끈거림

ㆍ 눈 자극 또는 아림

공통 부작용 효과보다 덜 함(< 20%)

ㆍ 두피 건조증 및 박리

ㆍ 홍진

ㆍ 자극성 피부염

드물지만 심각한 부작용(1~5%)

ㆍ 고칼슘혈증

ㆍ 고칼슘뇨증

ㆍ 신장 결석

ㆍ 갈증 심화

ㆍ 배뇨 빈도 증가

ㆍ 맥박수 변화

ㆍ 약함

ㆍ 졸림

ㆍ 뼈 통증

ㆍ 신장 부전

12. 0. 치료 반응/결과 평가 기준

이 연구는 제I상 연구이며, 따라서, 전이성 또는 재발성 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 난관암, 1차 복막암, 또는 연부 조직암과 뼈 육종을 가지고 있으며, 탁산 계열(파클리탁셀/나노입자 알부민-결합 파클리탁셀/도세탁셀) 용법의 화학요법을 받고 있는 환자에게서, 칼시트리올 국소 용액의 안전성 평가를 주로 한다. 이 연구는 칼시트리올 국소 용액의 MTD 및 치료 반응을 결정하는데 초점을 맞출 것이다.

13. 0. 연구에서 제외 기준

DLT가 기록되어 있지 않다면, 모든 환자는 치료를 계속할 것이다. 사망의 경우, 사망의 원인을 기록해야 한다. 독성이 투여량 제한적이지 않으나 환자가 처리를 계속할 수 없다면, 이 케이스는 IRB에 보고되며, 각각의 경우에 대해, 환자의 독성이 DLT로서 자격이 있는지 또는 환자가 사용할 수 없는 것으로 간주하고 동일한 투여량 레벨로 등록된 다른 환자로 교체해야 하는지를 결정할 것이다.

다음은 연구 약물 치료를 중단하기에 충분한 이류가 고려될 수 있다:

ㆍ NCI Common Terminology Criteria for Adverse Events v4.0에 따라 등급화된 연구 약물로 인한 심각한 독성.

ㆍ 프로토콜에 의해 허용되지 않는 치료 개입을 필요로 하는 조건.

ㆍ 특히 달리 정의되지 않는다면, 환자나 연구자의 의견에서 허용되지 않는 독성.

ㆍ 임의의 이유로 인한 환자의 개인적인 선호.

ㆍ 정의된 치료 계획을 준수하지 않는 대상체.

ㆍ 의료 또는 정신 질환, 연구자의 의견으로는, 연구에 계속적인 참여가 환자의 최선의 이익이 아니고 추가 치료가 불가능한 임의의 상황.

ㆍ 임신.

ㆍ 첫 번째 세 번의 국소 칼시트리올 적용 사이클 후 환자의 모든 모발 손실.

대상체는 편견 없이 언제든지 연구 참여 동의서를 철회할 수 있다. 만약, 자신의 임상적 판단에, 대상체의 최선의 이익이 되거나 대상체가 프로토콜을 준수할 수 없다면, 연구자는 대상체를 철회할 수 있다. 가능하면, 종료 방문을 위하여 열거된 시험 및 평가는 실시해야 한다. 대상체가 프로토콜이 정의한 방문에서 돌아가지 못한다면, 그 이유를 판단하는 노력을 해야 한다. 대상체가 전화기, 등록된 문자를 받을 수 없다면, 최소한 클리닉과의 접촉을 요하는 대상체(또는 대상체 보호자)에게 전송해야 한다. 이 정보는 CFR에 기록되어야 한다.

또한, 의뢰자의 요청에 따라 또는 의뢰자가 연구를 종료하려 한다면, 연구자는 대상체를 철회할 수 있다. 심각하거나 허용할 수 없는 부작용의 발생시, 연구 연구자는 의뢰자와 협의할 것이다. 피사체가 부작용으로 인해 중단한다면, 부작용이 가라앉을 때까지, 또는 적정한 시간(약 30일) 내에 가라앉지 않으면, 임상 관련성 및 원인이 논리적으로 설명될 때 까지, 계속해서 중단할 것이다. 대상체는 연구 기간 동안 언제든지 동의서를 철회할 수 있다.

대상체가 언제든지 또는 그의 요청에 따라 혹은 책임 연구자의 판단에 따라 연구에서 빠진다면, 그 이유를 CRF에 기록할 것이다. 가능하면, 조기 연구에서 빠진 모든 대상체는 모든 연구 끝 평가를 받을 것이다.

프로토콜-지정 안전성 후속 절차를 착수하기 위한 모든 노력을 해야 한다.

14. 0. 생물 통계

이것은 CIA 환자에서 국소 칼시트리올의 최대 허용 투여량(MTD) 측정을 위하여 설계된 제I상 연구이다. 세 개의 제안된 국소 칼시트리올 투여량은 5㎍/mL, 10㎍/mL, 및 20㎍/mL이다.

환자들은 크기 3 내지 6의 코호트에서 처리될 것이며, 임상적 독성이 허용한다면, 용량은 증가시킬 것이다. 만약 환자들이 투여량 제한 독성(DLT)를 경험하지 않고 국소 제제 적용 첫 번째 달을 완료한다면, 시험을 위하여 독성이 없다고 간주될 것이다. 독성이 아닌 이유로 첫 번째 달 동안에 국소 제제가 중단된다면, 추가 환자가 그 투여량 수준에 등록되어 독성에 대한 적절한 평가를 확인할 것이다. 환자 내에서 투여량 증가는 수행하지 않을 것이다. 국소 처리가 4주 후 계속되는 것을 포함하는 모든 경우에, MTD 평가는 그 달 동안 기록된 DLT만을 기반으로 할 것이다. 두 개의 투여량 수준은 증가로 간주될 것이다. DLT는 8.2 절에 정의되어 있고, DLT의 가능성이 높은 경우, 투여량을 증가시킬 기회를 최소화하도록 설계하며, DLT의 가능성이 낮은 경우, 투여량을 증가시킬 기회를 최대화하도록 설계한다., 투여량 증가 계획은 다름과 같다:

1. 주어진 투여량 수준에서 초기 3명의 환자 중 어느 누구도 DLT를 경험하지 못한다면, 다음 투여량 수준이 연구될 것이다.

2. 주어진 투여량 수준에서 초기 3명의 환자 중 1명이 DLT를 경험하는 경우, 3명의 추가 환자를 동일한 투여량 수준에서 처리할 것이다. 추가 DLT가 관찰되지만 않는다면, 증가를 계속할 것이다..

3. 주어진 투여량에서 2명 이상의 환자가 DLT를 경험한다면, 이전 투여량은 MTD라고 공표할 수 있다.

4. MTD라고 여겨지는 투여량에서 3명의 환자만이 처리된다면, 추가로 3명의 환자를 이전 결과를 확인하는 그 수준에서 처리할 것이다. MTD 결정 동안, 임의의 단계에서 용량 증가의 확률은 현재 투여량 수준에서 기본 DLT 속도의 함수이다. 이 확률은 일어날 증가를 허용하게 되는 다음 2가지 결과의 이항 확률의 합으로 계산될 수 있다. (1) 처음 3명의 환자에게서 DLT가 관찰되지 않음. (2) 하나의 DLT는 처음 3명의 환자에게서 관찰되고, 이어서 동일한 투여량 레벨에서 3명의 추가 환자에게서 DLT가 관찰되지 않음.

진정한 독성 위험은 10% - 50% 범위로 예측된다. 다음 표는 투여량 증가의 해당 확률을 보여 준다.

독성 위험	0.10	0.20	0.30	0.40	0.50
증가 확률	0.91	0.71	0.49	0.31	0.17

하부 독성률이 작으면, 이들 숫자는 다음 투여량 수준으로 증가할 확률이 크다는 것을 보여 주며, 독성률이 증가할수록, 증가 확률이 적절히 감소한다.

안전성 분석. NCI Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE Version 4.0)에서 측정되는, 선택된 비-혈액학적 및 혈액학적 독성은 환자에 따른 개요 측정으로 이용된 모든 사이클을 통해 최대 등급을 가지며, 사이클과 모든 사이클에서, 주파주와 등급에 의해 설명될 것이다.

CRF에 기록된 부작용 용어는, medical dictionary for regulatory activities (MedDRA) 사전을 이용하여 바람직한 용어와 매핑할 것이다. 신체 기관계 분류(system organ class) 및 바람직한 용어에 따라, 모든 발생경우에 대하여, 각 투여 코호트의 발생경우, 가장 심한 중증도, 및 연구 처리에 대한 관계에 있어서 모든 부작용 사례(adverse events, AEs)를 열거하고 표로 작성할 것이다. 심각한 부작용 사례(serious adverse events, SAEs)가 유사하게 정리될 것이다. 연구 처리를 조기 종료시키거나 시험에서 조기에 철수하게 하는, 사망, SAEs, DLTs, 및 AEs의 리스트도 제공될 것이다.

각 투여량 코호트에 있어서 기준 시점부터 다양한 시점에서의 평균값 변화를 이용하여 실험실 변수를 조사한다. 실험실 값도 CTCAE 4.0에 따라 카테고리화될 것이다; 목록 또는 표가 연구 중 가장 심한 독성 등급, 투여 코호트, 및 관계에 의해 카테고리화될 것이다. 시프트 표는, 기준선과 최종 평가에서 높은, 보통, 낮은 (또는 정상/비정상) 실험 결과로 대상체의 수 및 퍼센트를 보여주도록 제시될 것이다.

병용 약물은, 투여량 코호트에 따른 요약을 포함하여, 모든 대상체에 대하여 요약될 것이다.

유의한 수준. 종합 사진 검토 및 환자의 자기-보고 일기는 예비 통계 분석에 사용될 것이다. 분석을 통하여 국소 칼시트리올의 효능을 살펴 볼 것이다. 이것은 국소 칼시트리올의 효능을 더 자세히 보기 위한 추가 연구에서 도움이 될 것이다. 이 연구를 위해 공식적인 통계 테스트가 계획되지 않았지만, 95% 신뢰 구간이 선택 안전 변수에 대해 계산될 수 있다. 이러한 제I상 시험이 코호트 당 3명의 환자에게만 누적될 것이고, 이는 통계적으로 유의한 환자 수가 아니며, 효능을 입증하기에 충분한 객관적인 통계학적 데이터를 제공하기에 적합한 시험 설계가 아니다.

탐색적 분석. 각 대상체에서 탐색적 변수를 평가할 것이고, 기술 통계(수, 평균, 중간값, 표준 편차, 및 범위를 포함)는 투여량 수준에 따라 대상체에서 계산할 것이다.

중간 분석. 중간 분석은 계획되지 않는다.

샘플 크기/ 증가율 연구의 제I상 부분은 각 투여량 레벨에서 처리될 3-6명의 환자에 대한 것이다. 적어도 3개의 투여량 레벨을 가정하면, 이 시험은 최소 2명 최대 18명의 환자를 필요할 것이다. 이 임상 시험은 단일 임상 현장에서만 실시할 것이다. 치료 코호트 당 약 3-6명의 자격이 있는 환자의 예상 증가율을 고려하면, 시험의 제I상 부분이 1 년 미만이 걸릴 것으로 예상된다. 이는 각 3명 환자 코호트를 28일 동안 관찰할 수 있도록 하는데, 추가 환자 이전의 하나의 치료 사이클의 치료 시간 길이가 누적된다.

참조문헌:

Diker-Cohen T, Koren R, Liberman UA, Ravid A Vitamin D protects keratinocytes from apoptosis induced by osmotic shock, oxidative stress, and tumor necrosis factor." Ann N Y Acad Sci. 2003 Dec;1010:350-3.

(ClinicalTrials.gov, Mosby's Drug Consult, 13th Edition).

Genever PG, MAxfield, SJ, Kennovin GD, Maltman J, Bowgen CH, Raxworthy MJ, Skerry TM. Evidence for a novel glutamate-mediated signaling pathway in keratinocytes. J Invest Dermatol. 1999 Mar; 112 (3): 337-42.

Kiryu-Seo S, Gamo K, Tachibana T, Tanaka K, Kiyama H. Unique anti apoptotic activity of EAAC1 in injured motor neurons. The EMBO Journal (2006) 25, 3411-3421.

Nollen EA, Bruntsing JF, Roelofsen H, Weber La, Kampinga HH. In vivo chaperon activity of heat shock protein 70 and thermotolerance. Mol Cell Biol 1999; 19: 2069-79.

Rocchi P, Jugpal P, SoA, Sinneman S, Ettinger S, Fazli L, Nelson C, Gleave M. Small interence RNA targeting heat shock protein 27 inhibits the growth of prostatic cell lines and induces apoptosis via caspase 3 activation in vitro BJU Int 2006.

Marenholz I, Heizmann CW, Fritz G (2004). S100 proteins in mouse and man: from evolution to function and pathology (including an update of the nomenclature). Biochem. Biophys. Res. Commun. 322 (4): 1111-22.

본원에 언급된 모든 참조 문헌은 참조로서 본원에 병합된다.

Claims

인간 대상체에서 화학요법-유발 탈모증을 예방하거나 완화하는 방법으로서,
(1) 암이 있으며, 화학요법을 받을 예정이거나 받고 있는 인간 대상체를 선택하는 단계; 및
(2) 치료학적으로 유효한 양의 비타민 D 화합물을 포함하는 약학 조성물을 상기 대상체의 두피에 국소적으로 투여하는 단계
를 포함하며,
상기 단계 (2)는 상기 화학요법 전에 및/또는 이와 동시에 실시하여, 상기 대상체에서 화학요법-유발 탈모증을 예방하거나 완화하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 (2)는 상기 화학요법의 개시 전에 실시하는 방법.
제1 항 및 제 2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (2)는, 상기 대상체의 치료 영역에 모낭의 퇴행기가 유도되도록, 상기 화학요법 개시 전에 충분한 시간 동안 실시하는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 단계 (2)는 상기 화학요법의 개시의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13일 전에 실시하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 단계 (2)는 상기 화학요법의 개시의 적어도 2주전에 실시하는 방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학 조성물은 상기 비타민 D 화합물 1일 총 투여량 약 10~40 ㎍으로 투여하는 방법.
제 6항에 있어서, 상기 약학 조성물은 상기 비타민 D 화합물 1일 총 투여량 약 20 ㎍ 또는 약 40 ㎍으로 투여하는 방법.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학 조성물은 약 1.0 mL 투여량으로 투여하는 방법.
제 8항에 있어서, 상기 두피의 사분면 각각에 약 0.25 mL 투여하는 방법.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학 조성물은 상기 비타민 D를 약 5, 10, 또는 20 ㎍/mL의 농도로 포함하는 방법.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (2)는 하루에 2회 실시하는 방법.
제 11항에 있어서, 상기 1일 2회 투여는 약 10~14 시간 간격을 가지는 방법.
제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 고형 종양이 있는 방법.
제 13항에 있어서, 상기 대상체는 진행성 또는 재발성 암이 있는 방법.
제13 항 및 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 자궁 경부암, 자궁 내막암, 난소암, 난관암, 1차 복막 암종, 연조직 육종, 또는 골 육종이 있는 방법.
제13 항 또는 제 14항에 있어서, 상기 대상체는 유방암이 있는 방법.
제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체를 다음의 추가 기준 중 하나 이상에 기반하여 선택하는 방법:
상기 대상체는 적어도 18세인 인간일 것;
상기 대상체는 탈모증 또는 경도 탈모증의 흔적이 없을 것;
상기 대상체는 세포 자멸적이지 않은 모낭을 가질 것;
상기 대상체는 국소 투여 시작 전 14일 이내에 Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) 기능 점수가 0 또는 1점일 것;
상기 대상체는 국소 투여 시작 전 72시간 이내에 1500 세포/mm³ 초과의 기준 호중구 수(baseline neutrophil count)를 가질 것; 및
상기 대상체는 국소 투여 시작 전 72시간 이내에 정상치 상한(upper limit of normal, ULN) 이하의 혈청 칼슘 레벨을 가질 것.
제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체를 다음의 추가 기준 중 하나 이상에 기반하여 선택하는 방법:
상기 대상체가 국소 투여 시작 전 3개월 이상 동안 비스포스포네이트 또는 칼슘 저하 요법으로 관리되고 칼슘 대사 안정성에 대하여 증명하지 않는다면, 상기 대상체는 국소 투여 시작 4주 이내에 칼슘 저하 요법, 또는 칼슘 레벨에 영향을 줄 수 있는 약물을 받지 않을 것;
상기 대상체는 국소 투여 시작 30일 이내에 고칼슘혈증 또는 비타민 D 독성의 이력이 없을 것;
상기 대상체는, 국소 투여 시작 30일 이내에 협심증, 심근 경색, 또는 울혈성 심부전 또는 정신 질환의 치료를 위하여 입원한 이력이 없을 것;
상기 대상체가 국소 투여 시작 전 30일 이상 동안 비타민 D 보충제를 섭취하고 국소 투여에 걸쳐 동일한 투여량을 유지하지 않는다면, 상기 대상체는 국소 투여 동안 비타민 D 보충제를 섭취하지 않을 것;
6개월 초과 동안 안정적 치료를 받은 대상체를 제외하고, 상기 대상체는 국소 투여 시작 4주 이내에 칼슘 레벨에 영향을 주는 것으로 알려진 약물로 치료받고 있지 않을 것;
6 개월 초과 동안 안정적인 투여량을 받고 치료 중에 있는 대상체를 제외하고, 티아지드 또는 푸로세미드 이뇨제를 받고 있지 않을 것;
상기 대상체는 고칼슘혈증 또는 신장 결석이 없을 것; 및
상기 대상체는 National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events(NCU-CTCAE) v4.0에 따른 탈모증 등급이 2 이상이 아니거나 유의한 모발 손실 또는 모발 파손이 없을 것.
제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (2)는 상기 화학요법의 개시 후 적어도 3 개월 동안 실시하는 방법.
제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (2)는 상기 화학요법의 완료 후 적어도 3 개월 동안 실시하는 방법.
제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (2)는 상기 화학요법의 기간 중에 실시하는 방법.
제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학 조성물은, 비타민 D 화합물이 실질적으로 피부 전달을 회피하면서 피부에 전달되도록, 제형화하는 방법.
제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학 조성물은 무수인 방법.
제 23항에 있어서, 상기 약학 조성물은 약 40%(w/w)의 프로필렌 글리콜 및 약 60%(w/w)의 무수 에탄올의 비이클(vehicle)을 포함하는 방법.
제 23항에 있어서, 상기 약학 조성물은 약 30%(w/w)의 프로필렌 글리콜, 약 10%(w/w)의 에톡시디글리콜 또는 트랜스큐톨, 및 약 60%(w/w)의 무수 절대 에탄올(200 proof, U.S.)의 비이클을 포함하는 방법.
제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (2)를 실시하는 것은 화학요법의 효능을 실질적으로 감소시키지 않는 방법.
제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비타민 D 화합물은 칼시트리올인 방법.
제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비타민 D 화합물은 식 (1)으로 표현되거나 이의 약학적으로 허용되는 염인 방법:

(1)
여기에서,
a 및 b는 각각 독립적으로 단일 또는 이중 결합이고;
X는, a가 이중 결합일 경우, -CH₂이거나, X는, a가 단일 결합일 경우, 수소 또는 하이드록실 치환 알킬이고;
R¹은 수소, 하이드록실, 알콕실, 트리-알킬 실릴, 또는 1 내지 3개의 할로겐, 하이드록실, 시아노 또는 -NR'R" 부분으로 선택적으로 치환된 알킬이고;
R²은 수소, 하이드록실, -O-트리알킬 실릴, 또는 1 내지 3개의 할로겐, 하이드록실, 시아노 또는 -N R'R" 부분으로 선택적으로 치환된 알킬, 알콕실, 또는 알케닐이고;
R³은, b가 이중 결합일 경우, 부재하거나, b가 단일 결합일 경우, R³은, 수소, 하이드록실 또는 알킬이거나, R³ 및 R¹은 이들이 부착된 탄소원자들과 함께 결합하여 5- 내지 7-원 카르보사이클릭 고리를 형성할 수 있고;
R⁴는, b가 이중 결합일 경우, 부재하거나, b가 단일 결합일 경우, 수소, 할로겐 또는 하이드록실이고;
R⁵는, a가 이중 결합일 경우, 부재하거나, R⁵는, a가 단일 결합일 경우, 수소, 할로겐, 또는 하이드록실이고;
R⁶은 1 내지 5개의 하이드록실, 옥소, 할로겐, 알콕실, 아릴, 헤테로아릴, 시아노, 니트로, 또는 -NR'R" 부분으로 선택적으로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클리실(heterocyclicyl), 알킬-O-알킬, 알킬-CO₂-알킬이고;
R⁷은 1 내지 3개의 하이드록실, 할로겐, 알콕실, 아릴, 헤테로아릴, 시아노, 니트로, 또는 -NR'R" 부분으로 선택적으로 치환된 알킬이고; 및
R' 및 R"는 각각 독립적으로 수소, 하이드록실, 할로겐, 알킬 또는 알콕실 이다.
제 28항에 있어서, 상기 비타민 D 화합물은 식 (2)로 표현되거나, 이의 약학적으로 허용가능한 염인 방법:

(2)

여기에서,
c는 단일 결합 또는 이중 결합이고;
R^1a은 수소, 트리-알킬 실릴, 또는 1 내지 3개의 할로겐, 하이드록실, 시아노 또는 -NR'R" 부분으로 선택적으로 치환된 알킬이고;
R^2a은 수소, 하이드록실, -O-트리알킬 실릴, 또는 1 내지 3개의 할로겐, 하이드록실, 시아노 또는 -NR'R" 부분으로 선택적으로 치환된 알킬, 알콕실, 또는 알케닐이고;
R^3a 및 R^4a는, c가 이중 결합일 경우, 부재하거나, c가 단일 결합일 경우, 각각 독립적으로 수소, 하이드록실, 할로겐, 알콕실, 또는 1 내지 3개의 하이드록실 또는 할로겐 부분으로 선택적으로 치환된 알킬이고;
R^3b, R^4b, R^5a, R^6a, R^7a 및 R^8a는 각각 독립적으로 수소, 하이드록실, 할로겐, 알콕실, 또는 1 내지 3개의 하이드록실 또는 할로겐 부분으로 선택적으로 치환된 알킬이거나, R^6a, R^7a 및 R^8a 중의 임의의 두 개는 결합하여 3- 내지 7-원 카르보사이클릭 고리를 형성할 수 있다.
제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비타민 D 화합물은 1,25-디하이드록시비타민 D3; 1,25-디하이드록시-16-엔-23-인-콜레칼시페롤; 1,25-디하이드록시-16-엔-인-콜레칼시페롤; 1α-하이드록시비타민 D3; 1α,24-디하이드록시비타민 D3, 또는 MC 903인 방법.
제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비타민 D 화합물은 1,25-디하이드록시비타민 D3; 1,25-디하이드록시-16-엔-23-인-콜레칼시페롤; 1,25-디하이드록시-16-엔-인-콜레칼시페롤; 1α-하이드록시비타민 D3; 1α,24-디하이드록시비타민 D3, 또는 MC 903이 아닌 방법.
제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학 조성물을 계량 스프레이 기구를 이용하여 투여하는 방법.
국소 투여용으로 적합하고, 제 1항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 따른 화학요법 유발 탈모증을 예방하거나 완화하기 위한 치료학적으로 유효한 양의 비타민 D 화합물을 포함하는 약학 조성물.
국소 투여용으로 적합한 약학 조성물을 포함하는 키트로서, 화학요법 유발 탈모증을 예방하거나 완화하기 위한 치료학적으로 유효한 양의 비타민 D 화합물; 및
제 1항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 따른 화학요법 유발 탈모증을 예방하거나 완화하기 위한 방법을 실시하기 위한 설명서를 포함하는 키트.
비타민 D 화합물을 0.1-400 ㎍/mL의 농도로 포함하는 약학 조성물을 포함하는 계량 스프레이 기구.
제 35항에 있어서, 상기 계량 스프레이 기구는 4회 중 1회 또는 다수회 동안 약 0.25-ml 투여량을 분주하도록 설계되는 계량 스프레이 기구.
제 36항에 있어서, 상기 계량 스프레이 기구는 112회 동안 약 0.25-ml 투여량을 분주하도록 설계되는 계량 스프레이 기구.