KR20150138076A - 약독화된 살모넬라 변이주를 포함하는 돼지 흉막폐렴의 예방 또는 치료용 백신 조성물 - Google Patents

약독화된 살모넬라 변이주를 포함하는 돼지 흉막폐렴의 예방 또는 치료용 백신 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돼지의 흉막폐렴 원인균의 주요 병원성 인자를 더 포함하는, lon , cpxR 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라균 변이주, 상기 살모넬라균 변이주의 제조방법, 상기 살모넬라균 변이주를 포함하는 돼지의 흉막폐렴 예방 또는 치료용 백신 조성물 및 돼지 흉막폐렴의 예방 또는 치료를 위한 백신화 방법에 관한 것이다.

Description

약독화된 살모넬라 변이주를 포함하는 돼지 흉막폐렴의 예방 또는 치료용 백신 조성물{Vaccine composition for preventing or treating porcine pleuropneumonia comprising attenuated Salmonella mutant}
본 발명은 약독화된 살모넬라 변이주를 포함하는 돼지 흉막폐렴의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 돼지의 흉막폐렴 원인균의 주요 병원성 인자를 더 포함하는, lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라균 변이주, 상기 살모넬라균 변이주의 제조방법, 상기 살모넬라균 변이주를 포함하는 돼지의 흉막폐렴 예방 또는 치료용 백신 조성물 및 돼지 흉막폐렴의 예방 또는 치료를 위한 백신화 방법에 관한 것이다.
돼지 흉막폐렴은 액티노바실러스 플류로뉴모니애 (Actinobacillus pleuropneumoniae)라는 세균에 의해 일어나며, 급성으로 진행되면 식욕불량, 호흡곤란, 구토, 청색증, 고열, 코와 입의 출혈 등을 일으키며 24시간 내에 감염 동물이 폐사되는 질병이다. 이 질병은 중요한 돼지 세균성 호흡기 질병 중 하나이며, 양돈산업을 하는 나라에서는 대부분 발생한다. 이 질병의 발생은 폐사, 생산성 감소 및 치료비 또는 백신 비용의 증가 등으로 이어지기 때문에 양돈산업에 있어 많은 주의를 기울여야할 질병이다.
액티노바실러스 플류로뉴모니애에 의해 발생하는 돼지 흉막폐렴은 전염성, 섬유소성, 출혈성 그리고 괴사성 질병으로 급성으로 발생할 경우 돼지에서 이환율과 사망률이 매우 높으며, 출혈성, 괴사성 폐렴과 섬유소성 흉막염이 주요 특징인 질병이다. 그러나 만성형으로 감염된 경우에는 증체율 감소, 낮은 사료 효율성과 출하 지연 등으로 인해 양돈 산업에 경제적으로 막대한 피해를 주는 질병이다. 액티노바실러스 플류로뉴모니애는 다양한 병원성 인자들, 예를 들면, 내독소 (endotoxins), 리포폴리사카라이드 (LPS, lipopolysaccharide), 트렌스페린 결합 단백질 (transferrin-binding proteins), 외막 단백질 (OMPs, outer membrane proteins) 그리고 프로테아제 등이 알려져 있으며 이 중에서 RTX (repeats in toxins) 독소군에 속하는 Apx Ⅰ, Apx Ⅱ 및 Apx Ⅲ가 가장 중요한 병원성 인자에 해당한다.
가축의 질병을 예방하기 위해 사용되는 불활화 사균백신의 경우 특이 항원에 대한 면역반응이 잘 유도되지 않거나 선모 정제 백신의 경우 발현유도 및 정제과정이 번거롭고, 재조합 서브유닛 정제 백신의 경우 항원의 분리정제 및 면역성을 증강시켜야 하는 까다로운 제조 공정과정을 거쳐야 한다. 또한, 변성을 방지하고, 백신 부작용을 줄이기 위해 안정적으로 보관해야 하며 각 개체를 주사기를 이용해 접종해야 하는 불편함뿐만 아니라 주사기를 이용하여 항원을 투여하는 경우 소화기 관련 림프조직 또는 점막 관련 림프조직에 항원이 노출되지 않아 점막면역을 강력하게 활성화하지 못하는 단점이 있으며, 구강으로 정제 백신을 투여하는 경우에도 소화기관내 낮은 pH 조건 등에서 변성이 발생되므로 면역원성을 유지하기는 어려운 문제점이 있다.
이와 같은 문제점을 해결하기 위하여 생균백신을 이용한 동물질병예방 백신개발이 도입될 수 있는데, 생균백신 개발에 이용하는 미생물은 동물병원균으로 소화기관련 림프조직 또는 점막관련 림프조직에 부착, 침투한 후 집락을 이룰 수 있어야 한다. 주사기를 이용하는 경우에 비해 생균백신은 감염경로인 구강 또는 비강과 같은 점막부위에서 면역반응을 충분히 유도가능하여 병원균의 감염을 효과적으로 방어할 수 있게 된다. 생균백신을 사용하는데 있어 살모넬라균을 다가백신(multivalent)으로 개발하기 위해서는 살모넬라 자체의 병원성을 약화시키고, 외부항원을 발현하여 세포외로 분비할 수 있는 분비체계를 갖추는 방법 및 면역원성을 높이기 위해 림프조직 침투력이 증가될 수 있도록 하는 접근 등이 연구되어 왔다. 외부항원 발현과 균주 선택을 위해서는 asd 유전자를 근간으로 한 시스템이 개발되었는데, 약독화 살모넬라 균주의 펩티도글리칸 합성에 필요한 aspartate β-semialdehyde dehydrogenase (asd) 유전자를 결실하여 DAP (diaminopimelic acid) 요구주가 되게한 후, 외부항원 유전자를 갖는 asd 플라스미드로 형질전환함으로써 외부항원을 발현시킬 수 있고, 항생제 없이 해당균주를 선택할 수 있도록 하였다. 그러나, 발현항원에 대한 면역반응을 충분히 유도하기 위해서는 대량으로 분비될 수 있도록 세포외 분비능력이 더욱 향상되어야 한다.
한편, 한국등록특허 제1164045호에는 '돼지 흉막폐렴에 대한 독성약화 생백신'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2012-0054037호에는 '돼지 흉막폐렴에 대하여 유도된 백신 및 그러한 백신의 수득 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 약독화된 살모넬라 변이주를 포함하는 돼지 흉막폐렴의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 유전자 결실을 통해 약독화된 살모넬라균에 돼지 흉막폐렴의 원인균인 액티노바실러스 플류로뉴모니애의 주요 병원성 인자를 발현하는 형질전환 살모넬라균 변이주를 제작하고, 상기 살모넬라균 변이주를 생균 백신으로 준비하여 마우스에 접종한 결과, 상기 생균 백신이 동물의 면역반응을 우수하게 유도해내며, 액티노바실러스 플류로뉴모니애의 감염을 효과적으로 방어함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라균 변이주에 있어서, 돼지의 흉막폐렴 원인균의 주요 병원성 인자인 Apx ⅠA, Apx ⅡA, Apx ⅢA, OMPA, OmlA 및 ApfA로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 인자를 더 포함하는 살모넬라균 변이주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변이주 중 어느 하나 이상을 포함하는, 살모넬라균 변이주 혼합물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 살모넬라균 변이주 혼합물을 유효성분으로 포함하는 돼지의 흉막폐렴 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 약독화된 살모넬라균을 이용하여 돼지 흉막폐렴 원인균의 주요 병원성 인자인 Apx ⅠA, Apx ⅡA, Apx ⅢA, OMPA, OmlA 및 ApfA로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 유전자를 발현하는 돼지의 흉막폐렴 예방 또는 치료용 살모넬라균 변이주의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 백신 조성물을 모돈 또는 자돈에 접종하는 것을 특징으로 하는 돼지 흉막폐렴의 예방 또는 치료를 위한 백신화 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 살모넬라균 변이주 혼합물을 포함하는, 돼지의 면역증강용 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 살모넬라균 변이주는 돼지 흉막폐렴에 대한 주요 항원을 세포 밖으로 분비하여, 접종 동물의 세포성 및 체액성 면역반응을 효과적으로 활성화시키므로, 돼지 흉막폐렴 예방용 백신으로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 백신의 생산과 대량접종이 가능하고, 접종비용의 감소와 생산 및 보관이 용이한 경제적 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 살모넬라 변이주가 돼지 흉막폐렴의 항원 (Apx ⅠA, Apx ⅡA, Apx ⅢA 및 OMPA)을 발현하고 있음을 웨스턴 블롯팅을 통하여 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 단백 항원을 발현하는 각각의 살모넬라 변이주를 경구 및 비강내 접종 후 유도된 각 항원에 대한 혈청 IgG 항체 역가를 ELISA를 통해 분석한 결과이다. Intranasal immunization: 비강내 접종, oral immunization: 구강 접종.
도 3은 본 발명의 단백 항원을 발현하는 살모넬라 변이주를 혼합한 후 비강내로 접종한 후 각 항원에 대한 혈청 IgG 항체 역가를 ELISA를 통해 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명의 단백 항원을 발현하는 살모넬라 변이주를 혼합한 후 비강내로 접종한 후, 분변 (fecal sample)과 질 세척액 (vaginal washing)을 채취하여 시료 내 각 항원에 대한 점막의 IgA 항체 역가를 ELISA를 통해 분석한 결과이다.
도 5는 본 발명의 Apx ⅡA 또는 OMPA 항원을 발현하는 살모넬라 변이주를 비강내로 접종한 후, 비장을 적출하고 비장세포를 추출하여 살모넬라 변이주 항원에 대한 SPA (splenocytes proliferation assay) 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 살모넬라 변이주 각 항원에 대한 비장세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 살모넬라 변이주 각 항원으로 자극된 비장세포로부터 실시간 PCR을 이용하여 IFN-γ와 IL-4의 유전자 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 단백 항원을 발현하는 살모넬라 변이주를 혼합한 백신 조성물에 대한 최적의 백신 접종 횟수를 알아보기 위하여, 마우스에 백신을 접종한 후 횟수에 따른 혈청 IgG 항체 역가를 비교 분석한 결과이다. A, 백신 1회 접종; B, 백신 2회 접종; C, 백신 3회 접종; D, 대조군.
도 9는 본 발명의 단백 항원을 발현하는 살모넬라 변이주를 혼합한 백신 조성물을 마우스에 접종한 후 분변에서 각 항원에 대한 IgA 항체 역가를 분석한 결과이다. A, 백신 1회 접종; B, 백신 2회 접종; C, 백신 3회 접종; D, 대조군.
도 10은 본 발명의 단백 항원을 발현하는 살모넬라 변이주를 혼합한 백신 조성물을 마우스에 각기 다른 횟수로 접종한 후 21일 동안의 사료 섭취량의 변화를 나타낸 결과이다. Group A, 백신 1회 접종; Group B, 백신 2회 접종; Group C, 백신 3회 접종.
도 11은 본 발명의 단백 항원을 발현하는 살모넬라 변이주를 혼합한 백신 조성물을 마우스에 각기 다른 횟수로 접종한 후, 주 (week)에 따른 그룹별 마우스 무게를 나타낸 결과이다. Group A, 백신 1회 접종; Group B, 백신 2회 접종; Group C, 백신 3회 접종.
도 12는 본 발명의 단백 항원을 발현하는 살모넬라 변이주를 혼합한 백신 조성물을 마우스에 접종한 후, 폐 세척액에서의 각 항원에 대한 점막의 IgA 항체 역가를 나타낸 결과이다. Group A, 백신 1회 접종; Group B, 백신 2회 접종; Control, 대조군.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 lon , cpxR 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라균 변이주에 있어서, 돼지의 흉막폐렴 원인균의 주요 병원성 인자인 Apx ⅠA, Apx ⅡA, Apx ⅢA, OMPA, OmlA 및 ApfA로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 인자를 더 포함하는 살모넬라균 변이주를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 살모넬라균 변이주에 있어서, 상기 lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라균 변이주는 asd 유전자가 결실된 DAP 요구주로서 항생제 없이 항원 재조합 균주를 선택할 수 있도록 제작되었을 뿐만 아니라, cpxR을 결실시킴으로써 림프조직 침투력이 증가되어 면역원성을 높이고, lon 유전자를 결실하여 병원성이 약독화된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 살모넬라균 변이주에 있어서, 상기 돼지 흉막폐렴 원인균은 액티노바실러스 플류로뉴모니애 (Actinobacillus pleuropneumoniae)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또다른 일 구현 예에 따른 살모넬라균 변이주에 있어서, 상기 돼지 흉막폐렴 원인균의 주요 병원성 인자는 Apx 독소 I-IV (RTX 독소 내의 반복체), 외막 단백질 (OMP), LPS 또는 캡슐 폴리사카라이드 등일 수 있고, 바람직하게는 Apx ⅠA, Apx ⅡA, Apx ⅢA, OMPA, OmlA 및 ApfA로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 인자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 주요 병원성 인자는 lepB (signal peptidase), secA (ATPase) 및 secB (chaperone) 유전자가 발현되어 재조합 항원의 세포외 분비효율이 향상된 플라스미드 벡터에 유전자를 재조합하였다. 이렇게 재조합된 플라스미드 벡터를 전술한 약독화된 살모넬라에 형질전환하였다.
또한, 본 발명의 살모넬라균 변이주에 있어서, 상기 살모넬라균은 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 살모넬라 타이피 (Salmonella typi), 살모넬라 파라타이피 (Salmonella paratyphi), 살모넬라 센다이 (Salmonella sendai), 살모넬라 갈리나리움 (Salmonella gallinarium) 또는 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella enteritidis) 등일 수 있고, 바람직하게는 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 변이주 중 어느 하나 이상을 포함하는, 살모넬라균 변이주 혼합물을 제공한다.
본 발명의 상기 살모넬라균 변이주 혼합물은 lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라균이, Apx ⅠA, Apx ⅡA, Apx ⅢA, OMPA, OmlA 및 ApfA로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 돼지 흉막폐렴의 주요 병원성 인자를 발현 및 세포외로 분비하는 살모넬라균 변이주를 하나 이상 포함하고 있는 혼합물이다.
또한, 본 발명은 상기 살모넬라균 변이주 혼합물을 유효성분으로 포함하는 돼지의 흉막폐렴 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 백신 조성물은 유전자 결실에 의해 약독화된 살모넬라균에 돼지 흉막폐렴의 주요 병원성 인자 Apx ⅠA, Apx ⅡA, Apx ⅢA, OMPA, OmlA 또는 ApfA를 발현하는 살모넬라균 변이주를 하나 이상 포함하는 혼합물을 유효성분으로 포함하여, 상기 백신 조성물을 동물에 처리하여 돼지 흉막폐렴을 예방 또는 치료할 수 있는 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 백신 조성물에 있어서, 상기 살모넬라균 변이주 혼합물은 변이주 생균 또는 사균의 형태로 준비될 수 있고, 바람직하게는 변이주 생균의 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "백신"은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다. 생체 내 면역은 병원균의 감염 후에 생체 내 면역력이 자동으로 얻어지는 자동 면역과 외부에서 주입한 백신에 의하여 얻어지는 수동 면역으로 크게 나누어진다. 자동 면역은 면역에 관계하는 항체의 생성기간이 길고 지속적인 면역력의 특징이 있는 반면, 백신에 의한 수동 면역은 감염증 치료에 즉시 작용하나 지속력이 떨어지는 단점이 있다.
상기 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤 (iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 서브바이랄 (subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N,N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제 2 보조제를 추가로 함유할 수 있다.
또한, 상기 백신 조성물은 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어 "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원 보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착 지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.
또한, 상기 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 드립 (drip) 또는 스프레이 등의 비강용 제형 그리고 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리 에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 비강내 투여를 위한 제제에 적합한 침투제는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 그러한 적합한 제형물은 안정성과 순응도를 위해 바람직하게 무균, 등장 및 완충되도록 제형화된다. 비강내 투여를 위한 제제는 또한 정상적인 섬모 작용을 유지시키기 위해 점액 분비를 여러 측면에서 자극하도록 제조되며, 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA(1990))에 기술된 바와 같이, 적합한 제형이 바람직하게 등장성의, pH 5.5 내지 6.5를 유지하는 약간 완충된 제형이며, 가장 바람직하게 항미생물 방부제 및 적합한 약물 안정화제를 포함한다.
또한, 본 발명은
(a) 돼지 흉막폐렴 원인균의 주요 병원성 인자인 Apx ⅠA, Apx ⅡA, Apx ⅢA, OMPA, OmlA 및 ApfA로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 유전자를 증폭시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 증폭된 유전자를 lepB, secA 및 secB 유전자를 가진 플라스미드에 클로닝하는 단계;
(c) 살모넬라 균주의 염색체 DNA에서 lon, cpxR 및 asd 유전자를 결실시켜 약독화 살모넬라 균주를 제조하는 단계;
(d) 상기 (b) 단계의 클로닝된 플라스미드를 상기 (c) 단계의 약독화 살모넬라 균주에 형질전환시키는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계의 형질전환된 살모넬라균 변이주를 선별하는 단계를 포함하는 돼지의 흉막폐렴 예방 또는 치료용 살모넬라균 변이주의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 돼지 흉막폐렴 원인균은 액티노바실러스 플류로뉴모니애 (Actinobacillus pleuropneumoniae)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 살모넬라균은 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 살모넬라 타이피 (Salmonella typi), 살모넬라 파라타이피 (Salmonella paratyphi), 살모넬라 센다이 (Salmonella sendai), 살모넬라 갈리나리움 (Salmonella gallinarium) 또는 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella enteritidis) 등일 수 있고, 바람직하게는 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 백신 조성물을 모돈 또는 자돈에 접종하는 것을 특징으로 하는 돼지 흉막폐렴의 예방 또는 치료를 위한 백신화 방법을 제공한다.
본 발명의 백신 조성물은 전술한 바와 같이, 유전자 결실에 의해 약독화된 살모넬라균에 돼지 흉막폐렴의 주요 병원성 인자 Apx ⅠA, Apx ⅡA, Apx ⅢA, OMPA, OmlA 또는 ApfA를 발현하는 살모넬라균 변이주를 하나 이상 포함하는 혼합물을 유효성분으로 포함하며, 살모넬라균 변이주 생균 형태로 준비된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 백신화 방법에서, 백신 조성물의 접종은 경구, 비강내, 경피, 근육내, 복막내, 정맥내 또는 피하내 경로로 1차, 2차 및 3차 투여하여 접종할 수 있고, 바람직하게는 경구 또는 비강내로 1차, 2차 및 3차 투여하여 접종할 수 있으며, 가장 바람직하게는 비강내로 2차 투여하여 접종하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 살모넬라균 변이주 혼합물을 포함하는, 돼지의 면역증강용 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 상기 사료 첨가제는 돼지 흉막폐렴 원인균의 주요 병원성 인자들을 발현 및 분비하는 살모넬라균 변이주 혼합물을 유효성분으로 포함하여, 살모넬라균 변이주 혼합물이 감염증 원인균에 대한 보호 효과 뿐만 아니라, 돼지의 세포성 및 체액성 면역반응을 효과적으로 유도하므로 이를 사료 첨가제로 사용할 경우 돼지의 면역증강에 기여할 수 있다.
본 발명의 상기 사료 첨가제는 살모넬라균 변이주 혼합물을 원형 그대로 사용하거나 또는 추가적으로 가축에 허용되는 곡류 및 그 부산물 등의 공지된 담체, 안정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염 (중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있으며, 상기 사료첨가제를 공급하는 경우는 가축 등에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 단백 항원 준비
시판되는 발현용 벡터 (pQE31와 pET28a)와 숙주세포 (E. coli DH5α와 E. coli BL21)를 이용하여 각 해당 유전자 (Apx ⅠA, Apx ⅡA, Apx ⅢA 및 OMPA)를 발현용 벡터에 삽입한 후 해당 숙주세포에 형질전환시켜 단백 항원 발현 균주를 확보하였다. 정제된 PCR 증폭산물과 pQE31과 pET28a 벡터를 제한 효소로 각각 절단한 후 아가로스 겔에서 전기영동하였다. 절단된 각 절편을 AccuPrep® gel purification kit (Bioneer, 한국)를 이용하여 정제한 다음 T4 DNA ligase (Takara, 일본)로 두 산물을 라이게이션한 후 E. coli DH5α또는 E. coli BL21으로 형질전환하였다. 이들 형질전환 균주를 암피실린 (pQE31을 발현 벡터로 사용하였을 경우) 또는 카나마이신 (pET28a를 발현 벡터로 사용하였을 경우)이 각각 첨가된 LB 아가 플레이트에 골고루 펴서 말린 다음 37℃에서 하룻밤 배양하여 항생제 내성을 나타내는 형질전환된 E. coli DH5α 또는 E. coli BL21을 선택하였다. 각 단백 항원 유전자가 삽입된 벡터는 E. coli DH5α 또는 E. coli BL21으로부터 AccuPrep® plasmid extraction kit (Bioneer, 한국)를 이용하여 각 유전자가 삽입된 플라스미드를 추출하여 제한 효소로 절단하여 아가로스 겔에서 전기영동하여 확인하였다. 그리고 이렇게 확인된 콜로니를 각 발현 벡터에 맞는 항생제가 첨가된 LB 액체배지 5㎖에 접종하여 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 배양된 균액 중 1㎖를 LB 액체배지 200㎖에 접종하여 30℃에서 150rpm의 속도로 흔들어 주면서 하룻밤 배양하였다. 이 배양액에 IPTG의 최종농도가 1mM이 되도록 첨가하여 같은 조건으로 4시간 재배양하였다.
이 배양액을 8,000rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하였다. 상층액은 버리고 침전물은 PMSF(phenylmethanesulfonyl fluoride)가 1mM이 되도록 첨가된 10㎖의 멸균 PBS로 재부유시킨 다음 -70℃에서 냉동하였다. 냉동된 부유액을 다시 37℃ 항온수조 내에서 해동한 다음 -70℃에서 냉동하기를 2~3회 반복하였다. 마지막으로 해동한 후 부유액을 초음파처리하여 세포들을 분쇄한 다음 15,000rpm, 4℃에서 20분간 원심분리하여 상층액을 멸균 관에 옮겼다. 발현 단백질이 가용성일 경우에는 버퍼 B (100mM NaH2PO4, 10mM Tris-Cl, 8M Urea, pH 8.0) 4㎖를 상층액과 혼합하였고 불용성일 경우에는 6㎖의 버퍼 B로 침전물을 재부유시킨 후 실온에서 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 이 반응액을 15,000rpm, 4℃에서 20분간 원심분리한 후 상층액을 레진이 들어 있는 관으로 옮겨 단백질이 레진과 결합하도록 30분간 교반하였다. 이 반응액을 준비된 컬럼에 충전시키고 천천히 흘려보냈다. 흘려보낸 이 액으로 컬럼을 재충전한 다음 다시 천천히 흘려보냈다. 반응액을 흘려보낸 다음 버퍼 C (100mM NaH2PO4, 10mM Tris-Cl, 8M Urea, pH 6.3) 6㎖로 컬럼을 3회 세정하여 레진과 결합하지 않은 기타 불필요한 단백질을 제거하였다. 용출 버퍼 (100mM NaH2PO4, 10mM Tris-Cl, 8M Urea, pH 4.5) 2㎖로 컬럼을 충전시킨 후 20분간 반응시켜 발현 단백질을 레진으로부터 분리시킨 다음 용출 버퍼를 1㎖씩 첨가하여 단백질을 회수하였다. 회수된 단백질을 SDS-PAGE에서 전기영동하여 발현 단백질을 확인하였으며 정량한 후 -70℃에 보관하였고, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), SPA (spenocyte proliferation assay), FACS (flow cytometry) 및 실시간 PCR 분석을 위한 항원으로 사용하였다.
2. 약독화 살모넬라 백신균주의 제조
목적 항원 (Apx ⅠA, Apx ⅡA, Apx ⅢA 및 OMPA) 각각의 유전자를, 발현 단백질의 분비를 향상시킨 벡터인 pBP244에 클로닝한 후, pYA232(lacIq가 삽입)를 가지고 있는 E. coli 6212 균주에 형질전환하였다. 이 E. coli 균주에서 벡터를 추출하여 전기천공법 (electroporation)으로 약독화 살모넬라 균주 (JOL912)에 각각 형질전환하여 백신 후보 균주들을 제작하였다. 실험에 사용한 균주와 플라스미드의 특징은 하기 표 1에 나타내었다.
본 발명에 사용된 균주 및 플라스미드 정보
균주/플라스미드 설명 출처
균주
Escherichia coli
DH5α F’ Φ80lacZΔM15f(lacZYA-argF)U169 deoR recA1 endA1 hsdR17(rk-, mk+) phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1 실험실 보유
BL21(DE3)pLysS F-, ompT, hsdSB(rB -,mB -), dcm, gal, λ(DE3), pLysS, Cmr 실험실 보유
JOL1076 BL21 with pET28a-Apx ⅠA gene
JOL1000 BL21 with pET28a-Apx ⅡA gene
JOL1007 DH5αwith pQE31-Apx ⅢA gene
JOL997 BL21 with pET28a-OMPA gene
HJL192 BL21 with pET28a-OmlA gene
HJL135 BL21 with pET28a-ApfA gene
χ6212 F- λ- φ80 Δ(lacZYA-argF) endA1 recA1 hadR17 deoR thi-1 glnV44 gyrA96 relA1 ΔasdA4
Samonella typhimurium
JOL401 S. typhimurium wild type 실험실 보유
JOL912 S. typhimurium JOL401 derivative △lon△cpxR△asd 실험실 보유
JOL1300 JOL912 with pBP244-Apx ⅠA
JOL1301 JOL912 with pBP244-Apx ⅡA
JOL1302 JOL912 with pBP244-Apx ⅢA
JOL1303 JOL912 with pBP244-OMPA
JOL1304 JOL912 with pBP244-OmlA
HJL72 JOL912 with pBP244-ApfA
JOL1075 JOL912 with pBP244
Actinobacillus pleuropneumoniae
JOL981 Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 2 실험실 보유
JOL982 Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 5 실험실 보유
플라스미드
pQE31 IPTG-inducible expression vector; Amr Qiagen
pET28a IPTG-inducible expression vector; Kmr Novagen
pBP244 pYA3493 derivative containing lepB, secA and secB genes 실험실 보유
pMMP65 Asd+ vector, pBRori,β-lactamase signal sequence-based periplasmic secretion plasmid, 6xHis 실험실 보유
3. 웨스턴 블랏을 통한 목적 항원 발현 확인
각 제조된 백신 후보균주를 LB 액체배지에 밤새 배양한 후 원심 분리하여 상층액과 펠렛 시료를 준비한다. 상층액은 10% TCA (trichloroacetic acid)로 얼음 위에서 밤새 반응시켜 SDS-PAGE 샘플 버퍼로 부유시켜 94℃에서 5분간 끓인 후 SDS-PAGE한 다음 PVDF 멤브레인에 옮긴 후 블로킹 버퍼 (1% bovine serum albumin in PBST)로 밤새 반응시킨 다음 각 항원에 대한 토끼의 다클론 (polyclonal) 항체를 1:500으로 희석하여 1시간 반응시킨다. 2차 항체 (goat anti-rabbit IgG(H+L) HRP)를 1:40,000으로 희석하여 1시간 반응시킨 후 발색시켜 목적 항원 단백질의 발현을 확인하였다.
웨스턴 블랏으로 목적 항원의 발현이 확인된 JOL1300, JOL1301, JOL1302 및 JOL1303의 4개 균주를 백신 후보 균주로 사용하였다.
[마우스 실험]
4. 실험동물 준비
5주령의 BALB/c 마우스를 구입(코아텍, 한국)하여 1주령의 적응 기간을 거친 후 실험에 사용하였다.
5. 생균 백신 준비 및 접종
5-1. 경구 접종용 생균 백신 준비
각 항원 단백의 발현이 확인된 약독화 살모넬라균을 LB 액체배지에 접종하여 37℃에서 하룻밤 배양한 후 새로운 LB 액체배지에 1:20의 배율로 첨가하여 37℃에서 광학밀도 OD600이 0.8이 될 때까지 배양하였다. 배양된 균주들은 4,000rpm에서 20분간 원심분리 하였으며, 침전된 균주들은 멸균 PBS로 재부유시켜 같은 조건으로 다시 원심분리하였다. 침전된 균주는 수크로스가 20%가 되도록 첨가된 PBS (PBS-sucrose)로 각 항원을 발현하는 균주들은 2.0x109 CFU(colony-forming units)/㎖가 되도록 재부유시켰다. 실험동물은 생균이 제조된 당일에 구강으로 접종되었다.
5-2. 비강내 접종용 생균 백신 준비
경구 접종과 마찬가지로 생균 백신 준비를 위해서는 각 항원 단백의 발현이 확인된 약독화 살모넬라균을 LB 액체배지에 접종하여 37℃에서 200rpm의 속도로 16시간 배양한 배양액을 1/20 (volume)의 비율로 LB 액체배지에 첨가하여 같은 조건에서 OD600 값이 0.8이 될 때까지 4시간 정도 배양하였다. 이 배양액을 4℃에서 4,000rpm으로 20분 동안 원심분리하여 멸균 PBS로 3번 세척한 후 다시 멸균 PBS로 부유시켜 총 균수가 1.0x105 CFU/㎖가 되도록 혼합하여 생균 백신으로 제조된 당일에 비강으로 접종되었다.
5-3. 접종
실험군별 각 마우스는 하룻밤 동안 절식시킨 후 한 마리당 20㎕에 2x109 CFU(in PBS-sucrose)가 되도록 조정하여 구강 접종하거나 10㎕에 1x105 CFU(in PBS)가 되도록 조정하여 비강내 (intranasal)로 접종하였으며, 대조군은 각각 멸균 PBS로 구강 또는 비강내로 접종한 다음 추가 30분간 절식시켰다.
6. 도전감염용 야외균주 준비 및 접종
6-1. 균주 배양
액티노바실러스 플류로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae, 이하 AP) 타입 2와 5의 한 콜로니를 LB 액체배지에 접종하여 37℃에서 200rpm으로 흔들어 주면서 하룻밤 배양하였다.
AP 타입 2와 5의 각 한 콜로니를 초콜렛 아가 (chocolate agar)에 접종하여 37℃에서 16시간 배양한 후 멸균 PBS에 균수가 5x107 CFU/20㎕가 되도록 부유시킨 후 각각 동량씩 혼합하여 도전감염 균주 (야외분리주)로 준비하였다.
6-2. 접종
실험군별 각 마우스는 하루밤 동안 절식시킨 후 한 마리당 20㎕에 5x107 CFU가 되도록 조정하여 비강내 접종하였으며, 폐사여부를 관찰하였다.
7. 접종 경로 결정 실험
각 항원 유전자가 삽입된 약독화 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 변이주를 경구 또는 비강내로 접종한 후 면역반응 및 관련 사이토카인 유도 여부를 확인하였고, 야외분리주로 도전감염 하고 이에 대한 방어 효과 여부를 확인하여 적합한 접종 경로를 결정하였다.
7-1. 생균 백신의 경구 및 비강내 접종
실험군별 각 마우스는 하루밤 동안 절식시킨 후 한 마리당 20㎕에 2x109 CFU가 되도록 조정하여 구강접종하거나 10㎕에 1x105 CFU가 되도록 조정하여 비강내로 접종하며 대조군은 멸균 PBS-수크로스와 PBS로 각각 구강 접종 또는 비강내로 접종한 다음 추가 30분간 더 절식시켰다(표 2 및 표 3). 같은 균수와 같은 방법으로 접종 후 21일째에 한 번 더 추가 접종하였다(표 4).
구강 접종 실험 계획
그룹 두수 균주 항원명 접종균수 도전감염
1 15


Samonella typhimurium 		Apx ⅠA 1차-2x109CFU/20㎕
2차-2x109CFU/20㎕
AP 타입 2와 AP 타입 5를 동량 혼합하여 도전감염
2 15 Apx ⅡA 1차-2x109CFU/20㎕
2차-2x109CFU/20㎕
3 15 Apx ⅢA 1차-2x109CFU/20㎕
2차-2x109CFU/20㎕
4 15 OMPA 1차-2x109CFU/20㎕
2차-2x109CFU/20㎕
5 15 Control 멸균 PBS-sucrose
비강내 접종 실험 계획
그룹 두수 균주 항원명 접종균수 도전감염
1 10


Samonella typhimurium 		Apx ⅠA 1차-1x105CFU/10㎕
2차-1x105CFU/10㎕
AP 타입 2와 AP 타입 5를 동량 혼합하여 도전감염
2 10 Apx ⅡA 1차-1x105CFU/10㎕
2차-1x105CFU/10㎕
3 10 Apx ⅢA 1차-1x105CFU/10㎕
2차-1x105CFU/10㎕
4 10 OMPA 1차-1x105CFU/10㎕
2차-1x105CFU/10㎕
5 10 Control 멸균 PBS
실험 개요
0주 3주 6주 9주 10주
1차 접종 2차 접종 도전감염 부검
접종 전 채혈 접종 전 채혈 2차 접종 후 3주 채혈 표3 및 표 4 참고 도전감염 후 생존한 마우스 대상
가검물 채취 가검물 채취 가검물 채취 가검물 채취 균 분리 (폐)
7-2. 가검물 채취
1차 접종 전, 2차 접종 전 및 도전감염 전에 각각 채혈하여 혈청을 분리 -80℃에 보관하며 실험에 사용하였다.
7-3. ELISA를 통한 항체 역가 측정
마우스에 구강 및 비강내 접종 후, 각 항원에 대해 형성된 항체의 역가를 측정하기 위해 접종 전, 1차 접종 후 3주, 2차 접종 후 3주와 6주에 각각 채취한 혈청을 대상으로 하여 IgG에 대한 항체 역가를 ELISA를 통해 측정하였다
7-4. 도전감염
실험군별 각 마우스는 하루밤 동안 절식시킨 후 한 마리당 20㎕에 5x107 CFU가 되도록 야외분리주를 조정하여 비강내로 접종하며 폐사여부를 확인하였다.
8. 단백 항원 발현 백신균주의 혼합 후 접종에 따른 각 항원에 대한 면역반응 유도와 도전감염에 대한 방어 시험
각 해당 항원 유전자가 삽입된 약독화 살모넬라 티피무리움 백신균주를 혼합한 후 비강내로 접종한 다음 각 개별 항원에 대한 면역반응 유도 여부와 야외분리주로 도전감염에 대한 방어여부를 통해 백신 가능성 여부를 결정하였다.
8-1. 실험동물 및 접종
1) 실험동물 : 5주령의 BALB/c 마우스를 구입하여 1주령의 적응 기간을 거친 후 실험에 사용하였다.
2) 접종 : 실험군별 각 마우스는 하루밤 동안 절식시킨 후 한 마리당 10㎕에 총 균수가 1x105 CFU가 되도록 조정하여 비강내로 접종하며 대조군은 각각 멸균 PBS로 비강내로 접종 하였다(표 5 및 표 6).
혼합 백신균주 비강내 접종 실험 계획
그룹 두수 항원명 접종균수 경로 도전감염
A 30 Apx ⅠA, Apx ⅡA, Apx ⅢA, OMPA 1x105CFU/10㎕ 멸균 PBS 비강내 접종 AP 타입 2
AP 타입 5
B 30 멸균 PBS 비강내 접종 AP 타입 2
AP 타입 5
[※ 콧구멍 한쪽에 5㎕씩 접종.
※ PBS 10㎕에 각 항원 발현 백신균주의 수가 1x105 CFU이 되도록 제조하고, 각 균주별로 2.5㎕씩 혼합하여 제조 당일에 접종.]
혼합 백신균주 비강내 접종 실험 개요
0주 2주 4주 4주 6주 8주 9주
1차 접종 1차 부검 도전감염 2차 부검
접종 전 채혈 IgG, sIgA IgG, sIgA LPA, FACs, cytokine 측정 IgG, sIgA IgG, sIgA 도전감염 후 생존한 마우스 대상
가검물 채취 가검물
채취		 가검물
채취		 CD3, CD4, CD8, B 세포 측정을 위해 가검물 채취
(그룹 별 5마리)		 가검물
채취		 가검물
채취		 균 분리 (폐)
비장세포 분리
8-2. 가검물 채취
1) 분변 채취 : 접종 전, 1차 접종 후 2주, 4주, 6주, 8주째에 그룹별로 분변을 모아 무게를 잰 후 소디움 아자이드 (sodium azide)가 0.1% 함유된 PBS로 100mg/㎖이 되도록 부유시킨 후 -80℃에 보관하며 실험에 사용하였다.
2) 질 세척액 채취 : 상기 분변 채취와 같은 시기에 멸균 PBS (pH 7.2) 100㎕를 질내로 투입한 후 마이크로피펫을 사용하여 회수하여 -80℃에 보관하며 실험에 사용하였다.
3) 채혈 : 상기 분변 및 질 세척액 채취와 같은 시기에 각각 채혈하여 혈청을 분리하여 -80℃에 보관하며 실험에 사용하였다.
4) 비장세포 (splenocyte) 분리 (SLP 용) : 각 그룹별로 5마리의 마우스를 접종 후 4주째에 무균적으로 비장 (spleen)을 채취하여 RPMI 1640에 모았다. 0.8% 염화암모늄 (ammonium chloride, w/v)을 이용하여 적혈구를 용해한 후, 380xg, 4℃, 10분간 원심분리한 후 침전물을 멸균 PBS로 3번 세척하였다. 마지막 원심분리 후 complete medium (RPMI 1640 supplemented with 100IU/㎖ penicillin, 100㎍/㎖ streptomycine and 10% FCS)으로 재부유시켰다. 세포수를 계산하여 5x106 cells/100㎕씩 분주한 다음 각 항원이 100㎕에 10~15㎍/㎖의 농도가 되도록 희석하여 첨가한 후 37℃, 5% CO2 하에서 48시간 반응시킨 후 ViaLight Plus Kit (LONZA, 스위스)를 이용하여 비장세포 세포증식을 측정하였다.
5) 비장세포 분리 (FACS 및 ELISA 용) : 각 그룹별로 5마리의 마우스를 1차 접종 후 4주째에 무균적으로 비장을 채취하여 RPMI 1640에 모은다. 0.8% 염화암모늄 (w/v)을 이용하여 적혈구를 용해한 후, 380xg, 4℃, 10분간 원심분리한 후 침전물을 멸균 PBS로 3번 세척하였다. 마지막 원심분리 후 complete medium으로 재부유시켰다. 세포수를 계산하여 각 항원으로 12시간 반응시킨 후 CD3, CD4, CD8 및 B 세포를 측정하였다. 또한 세포수를 계산하여 각 항원으로 48시간 반응시킨 후 380xg, 4℃, 10분간 원심분리한 후 얻어진 펠렛을 이용하여 세포로부터 mRNA를 분리하고 cDNA를 제작하여 실시간 PCR로 IL-6를 측정하였다.
8-3. 항체 역가 측정
1) IgG : 마우스에 백신균주를 비강내로 접종한 후, 각 항원에 대해 형성된 항체의 역가를 측정하기 위해 접종 전 그리고 1차 접종 후 2주, 4주, 6주, 8주째에 각각 채취한 혈청을 대상으로 하여 ELISA로 IgG의 역가를 측정하였다.
2) sIgA : 마우스에 백신균주 접종 후에 형성된 점막 및 전신성 면역반응 (systemic immune response) 중 체액성 면역반응 (mucosal immune response)을 확인하기 위해, 접종 전 그리고 1차 접종 후 2주, 4주, 6주, 8주째에 분변 및 질 세척액을 대상으로 하여 ELISA로 sIgA의 역가를 측정하였다.
8-4. Spenocyte proliferation assay
37℃, 5% CO2 하에서 48시간동안 각 항원에 반응한 비장세포를 ViaLight Plus Kit (LONZA, 스위스)를 이용하여 측정하였다(Matsuda et al., 2010, Veterinary Research, 41:51; Qu et al., 2008, Vaccine, 26:4541-4548).
8-5. Flow cytometry
백신 접종 후 면역유도와 밀접하게 관련된 면역 세포를 관찰하기 위해 1차 접종 후 4주째에 각 그룹별로 5마리의 마우스를 희생시켜 무균적으로 비장을 적출하고 비장세포를 분리시켜 실험에 사용하였다.
8-6. 사이토카인 IL-4, IL-6 및 IFN-γ 측정
백신 접종 후 4주째에 무균적으로 분리된 비장세포에 각 해당 항원을 자극시킨 후 원심분리하여 얻어진 세포 펠렛으로부터 분리된 mRNA를 대상으로 실시간 PCR 방법을 통해 각 사이토카인의 유전자 발현 수준을 측정하였다.
8-7. 도전감염
실험군별 각 마우스는 하루밤 동안 절식시킨 후 한 마리당 야외분리주를 20㎕에 5x107 CFU가 되도록 조정하여 비강내로 접종하며 폐사여부를 확인하였다.
9. 부스터를 통한 최적화 실험
각 해당 항원 발현 백신균주들의 혼합 후 비강내로 1회, 2회 및 3회 접종한 다음 유도된 면역반응과 도전감염에 대한 방어 여부를 통해 접종 횟수를 결정한다.
9-1. 백신 접종
6주령의 마우스에 각 항원을 발현하는 균주를 혼합한 후 비강내로 1회, 2회 및 3회 접종하였다. 상세하게는 실험군별 각 마우스는 하루밤 동안 절식시킨 후 한 마리당 10㎕에 총 균수가 1x105 CFU가 되도록 조정하여 비강내로 접종하며 대조군은 각각 멸균 PBS로 접종하였다(표 7 및 표 8).
부스터를 통한 최적화 실험 계획
그룹 두수 항원명 접종균수 도전감염
1차 2차 3차
A 15 Apx ⅠA, Apx ⅡA,
Apx ⅢA, OMPA		 1x105CFU/10㎕ AP 타입 5
B 15 Apx ⅠA, Apx ⅡA,
Apx ⅢA, OMPA		 1x105CFU/10㎕ 1x105CFU/10㎕ AP 타입 5
C 15 Apx ⅠA, Apx ⅡA,
Apx ⅢA, OMPA		 1x105CFU/10㎕ 1x105CFU/10㎕ 1x105CFU/10㎕ AP 타입 5
D 15 멸균 PBS - - - AP 타입 5
[※ 콧구멍 한쪽에 5㎕씩 접종.
※ PBS 10㎕에 각 항원 발현 백신균주의 수가 1x105 CFU이 되도록 제조하여 각 균주를 2.5㎕씩 혼합하여 제조 당일에 접종.]
부스터를 통한 최적화 실험 개요
0주 2주 3주 4주 6주 7주 8,10,12,14주 10주 16-17주
1차 접종 2차 접종 1차 부검 3차 접종 2차 부검 3차 부검 도전감염
접종 전 채혈 접종 후 2주차 채혈 SLA, 실시간 PCR, FACS, 접종 후 4주차 채혈 접종 후 6주차 채혈 SLA, 실시간 PCR, FACS 채혈 SLA, 실시간 PCR, FACS 도전감염 전 채혈 및 가검물 채취
가검물 채취 가검물 채취 비장, 가검물 채취 가검물 채취 비장 적출 가검물 채취 비장 적출 폐 적출
비장세포 분리 비장세포 분리 비장세포 분리 폐사율 및 임상 소견 관찰
9-2. 가검물 채취
1) 분변 채취 : 접종 전, 1차 접종 후 2주, 4주, 6주, 8주, 10주째에 그룹별로 분변을 모아 무게를 잰 후 소디움 아자이드가 0.1% 함유된 PBS로 100㎎/㎖이 되도록 부유시킨 후 -80℃에 보관하며 실험에 사용하였다.
2) 채혈 : 위와 같은 시기에 각각 채혈하여 혈청을 분리 -80℃에 보관하며 실험에 사용하였다.
3) 비장세포 분리 : 각 그룹별로 5마리의 마우스를 마지막 접종 후 4주째에 각각 무균적으로 비장를 채취하여 RPMI 1640에 모았다. 0.8% 염화암모늄 (w/v)을 이용하여 적혈구를 용해한 후, 380xg, 4℃, 10분간 원심분리한 후 침전물을 멸균 PBS로 3번 세척하였다. 마지막 원심분리 후 complete medium으로 재부유시켰다. 세포수를 계산한 후, 각 항원으로 72시간동안 반응시키고 380xg, 4℃, 10분간 원심분리한 후 상층액을 -80℃에 보관하며 ELISA를 통해 비장세포로부터 분비된 사이토카인을 측정하였다. 그리고 펠렛은 재부유시킨 후 키트를 이용하여 mRNA를 분리한 다음 cDNA를 제작하여 실시간 PCR로 IL-4 및 IFN-γ의 유전자 발현 수준을 측정하였다.
9-3. 항체 역가 및 사이토카인 측정
혈청, 분변, 질분비물을 대상으로 IgG 및 IgA에 대한 항체가를 ELISA를 통해 측정하였고, 백신 접종 후 4주째에 무균적으로 분리된 비장세포에 각 해당 항원을 자극시킨 후 원심분리하여 펠렛으로부터 분리된 mRNA를 대상으로 실시간 PCR로 IL-4 및 IFN-γ의 유전자 발현 수준을 측정하였다.
9-4. 도전감염
실험군별 각 마우스는 하루밤 동안 절식시킨 후 한 마리당 야외분리주를 20㎕에 5x107 CFU가 되도록 조정하여 비강내로 접종하며 폐사여부를 확인하였다.
10. 안전성 및 폐에서의 점막의 IgA 측정
각 해당 항원 발현 백신균주들을 혼합한 후 비강내로 1회 및 2회 접종한 다음 백신 접종에 따른 부작용 (설사, 침울, 체중감소)과 실질 장기 (간, 비장, 폐, 창자)에서의 백신균주의 잔존 여부 및 잔존 기간 그리고 분변으로의 배출 여부 등을 확인하여 백신의 안정성을 확인하고자 하였다.
10-1. 백신 접종
6주령의 마우스에 각 항원을 발현하는 균주를 1x105CFU/10㎕(in PBS)이 되도록 혼합하여 비강내로 1회 및 2회 접종하였다(표 9).
실험 계획
그룹 두수 접종균수 부검
1차 2차
A 12 1x105CFU/10㎕a 접종 후 1일, 1주, 2주, 3주
B 12 1x105CFU/10㎕ 1x105CFU/10㎕ 접종 후 1일, 1주, 2주, 3주
C 12 멸균 PBS 멸균 PBS 접종 후 1일, 1주, 2주, 3주
[※ 콧구멍 한쪽에 5㎕씩 접종.
※ a PBS 10㎕에 각 항원 발현 백신균주의 수가 1x105 CFU이 되도록 제조하여 각 균주를 2.5㎕씩 혼합하여 제조 당일에 접종.]
10-2. 임상증상 관찰
1) 백신 접종 후 설사, 발열 및 침울, 의기소침, 식욕감퇴 등의 임상 증상을 매일 하루에 두 번 (아침, 저녁) 관찰하였다.
a. 하루에 일정량의 사료를 대조군과 동일량 공급하여 사료 소비량으로 판단하였다.
b. 분변 채취시 설사 유무를 확인하였다.
c. 백신 접종 후 1주일 동안 매일 정해진 시간에 체온을 측정하였다.
2) 무게 측정 : 백신 접종 전, 접종 후 1주, 2주, 3주째에 모든 그룹의 마우스 무게를 측정하여 기록하였다.
10-3. 가검물 채취
백신 접종 전, 1차 접종 후 1일, 2일, 3일, 1주, 2주, 3주째에 그룹별로 무작위로 선택된 5마리의 마우스 분변을 모아 무게를 잰 후 멸균 BPW (Buffered Pepton Water)로 100㎎/㎖이 되도록 부유시킨 후 부유액 100㎕를 BGA 한천 플레이트와 LB 한천 플레이트에 직접 도말하여 백신균주를 분리한 후 PCR을 통해 백신균주의 배출여부를 확인하였다. 또한 나머지 부유액은 하룻밤 배양한 후 100㎕를 10㎖의 RV 액체배지에 첨가하여 24시간 배양하였다. 배양액 100㎕를 BGA 한천 플레이트에 도말접종하여 백신균주를 분리한 후 PCR을 통해 백신균주의 배출여부를 최종 확인하였다.
10-4. 부검(sacrifice) 후 실질 장기에서의 백신균주 분리 및 폐 세척액 준비
1) 시기 : 비강내 접종 후 1일, 1주, 2주, 3주에 마취제를 투여하여 죽이고 부검하였다.
2) 실질 장기의 임상 소견 : 부검 할 때 각 장기의 육안적 소견을 관찰하고 무게를 잰 후 기록하였다.
3) 대상 장기 : 폐, 간 및 비장.
4) 폐 세척액 준비 : 폐 전체를 절개하여 멸균 PBS 2㎖에 넣어 파쇄하였다. 이 파쇄액을 4℃에서 하룻밤 보관한 후 4℃, 12,000xg에서 10분간 원심분리하였다. 상층액을 회수하여 1㎖은 protein assay kit (BIO-RAD, 미국)를 사용하여 단백질 농도를 측정하여 1㎎/㎖으로 조정한 후 -20℃에 보관하며 실험에 사용하였고, 나머지 1㎖은 폐에서의 백신균주 분리를 위해 사용하였다.
5) 백신균주 분리 : BPW가 들어있는 50㎖ 시험 튜브에 상기의 조직을 하나씩 넣어 얼음에 보관하였고, 각 장기가 들어 있는 튜브의 무게를 달아 각 실질 장기의 실제 무게를 기록하였다. 멸균 일회용 페트리디쉬와 주사기를 이용하여 각 장기를 잘게 파쇄한 후 다시 50㎖ 시험 튜브에 옮기고, 이 용액 100㎕를 BGA 한천 플레이트와 LB 한천 플레이트에 직접 도말하여 백신균주를 분리한 후 PCR을 통해 백신균주의 배출 여부를 확인하였다. 또한 나머지 부유액은 하룻밤 배양 후 100㎕를 10㎖의 RV 액체배지에 첨가하여 24시간 배양하였다. 배양액 100㎕를 BGA 한천배지에 도말하여 백신균주를 분리한 후 PCR을 통해 백신균주의 배출 여부를 최종 확인하였다.
10-5. 면역 반응 측정
ELISA 키트를 이용하여 준비된 기관지 폐 세척액에서 각 항원에 대한 sIgA를 측정하였다.
[목적 동물인 돼지에서의 효능 실험]
11. 모돈에 접종 후 자돈에서 도전감염 균주에 대한 방어 여부를 통한 백신 효능 평가
분만 예정 8~9주 전인 모돈 중에서 살모넬라균 및 흉막폐렴에 감염된 병력이 없는 모돈과 흉막폐렴에 대한 예방접종이 실시되지 않았던 모돈과 그 모돈에서 출생한 자돈을 실험에 사용하였다.
각 해당 항원 유전자가 삽입된 약독화 살모넬라 티피무리움 백신균주를 혼합한 후 경구로 접종한 다음 각 개별 항원에 대한 면역반응 유도 여부와 야외분리주로 도전감염에 대한 방어여부를 통해 백신 가능성 여부를 결정하였다.
11-1. 경구접종용 생균 백신 준비
경구접종용 백신 준비를 위해 각 항원의 발현이 확인된 약독화 살모넬라균을 LB Broth에 접종하여 37℃에서 200rpm의 속도로 16시간 배양한 배양액을 1/20 (volume)의 비율로 LB Broth에 첨가하여 같은 조건에서 OD600 값이 0.8~1.0이 될 때까지 2~4시간 동안 배양하였다. 이 배양액을 4℃에서 4,000rpm으로 10분 ~ 20분간 원심분리하여 멸균 PBS로 3번 세척한 후 sucrose가 20% 함유된 멸균 PBS(PBS-sucrose)로 2x1010 CFU/10㎖가 되도록 부유시켜 생균 백신으로 준비하였다.
11-2. 접종
실험군별 돼지(모돈)는 한 마리당 10㎖에 2x1010 CFU(in PBS-sucrose)가 되도록 조정하여 경구 접종하였으며, 대조군은 각각 멸균 PBS로 경구로 접종하였다. 같은 균수와 같은 방법으로 접종 후 21일째에 한 번 더 추가 접종하였다 (표 10, 표 11).
경구 접종 실험 계획
그룹 두수 균주 항원명 접종균수 도전감염(자돈)
모돈 1차
(임신 8주)		 모돈 2차
(임신 11주)
1 3 Samonella typhimurium Apx IA, Apx ⅡA, Apx ⅢA, OMlA,
ApfA		 2x1010 CFU/10㎖ 2x1010 CFU/10㎖ AP 타입 2와 AP 타입 5를 동량 혼합하여 도전감염
2 3 Control 멸균 PBS-sucrose 멸균 PBS-sucrose
실험 개요
모돈 자돈
분만 8주전 분만 5주전 4주 5주
1차 접종 2차 접종 도전감염 부검
도전감염 후 생존한 돼지 대상
균 분리 (폐)
11-3. 도전감염용 야외균주 준비 및 접종
11-3-1. 균주 배양
AP 타입 2와 5의 각 한 콜로니를 초콜렛 아가 (chocolate agar)에 접종하여 37℃에서 16시간 배양한 후 멸균 PBS에 균수가 1x108 CFU가 되도록 부유시킨 후 각각 동량씩 혼합하여 도전감염 균주 (야외분리주)로 준비하였다.
11-3-2. 도전감염
실험군별 자돈이 4주령이 되었을 때 위에서 준비한 독성 야외균주를 IN으로 1,000㎕씩 두 번 접종하였다.
12. 모돈 및 자돈에 백신 접종 후 자돈에서 도전감염 균주에 대한 방어 여부를 통한 백신 효능 평가
각 항원 유전자가 삽입된 약독화 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 혼합 변이주를 모돈 및 자돈에 각각 경구로 접종한 후 면역반응 야외분리주로 도전 감염하고 이에 대한 방어 효과 여부를 확인하였다.
12-1. 생균 백신의 경구 접종
실험군별 돼지(모돈) 한 마리당 10㎖에 2x1010 CFU가 되도록 조정하여 경구 접종하거나 700㎕에 1x107 CFU가 되도록 조정하여 비강내로 접종하였으며, 대조군은 멸균 PBS-수크로스와 PBS로 각각 경구 접종하였다. 같은 균수와 같은 방법으로 접종 후 21일째에 한 번 더 추가 접종하였다. 자돈은 생후 5주에 한 마리당 10㎖에 2x109 CFU가 되도록 조정하여 경구 접종하였다.
12-2. 도전감염
실험군별 돼지(자돈)에 한 마리당 2x108 CFU가 되도록 야외분리주를 조정하여 비강내로 접종하며 폐사여부를 확인하였다.
※ 콧구멍 한쪽에 1,000㎕씩 두 번 접종.
※ PBS 10㎖에 App 2형, 5형 균주의 수가 1x107 CFU이 되도록 제조하고, 각 균주별로 50㎖씩 혼합하여 제조 당일에 접종.
13. 부검(sacrifice) 후 실질 장기에서의 백신균주 분리
1) 시기 : 도전감염 후 1주 뒤에 부검
2) 실질 장기의 임상 소견 : 부검할 당시에 흉막 및 폐의 육안적 소견을 관찰하였고, 사진을 찍어 기록하였다.
3) 대상 장기 : 흉막 및 폐.
4) 백신 균주 분리 : 병변이 있는 폐에 압출봉으로 압출하여 초콜렛 아가 (chocolate agar)에 그어 각각의 colony별로 PCR을 통해 확인하였다.
실시예 1. 접종 경로 결정
1-1. ELISA에 의한 혈청 IgG 항체 역가 분석
구강 또는 비강내 접종 경로와 상관없이 각 단백 항원에 대해 단백 항원 발현 백신균주 1차 접종 이후 3주 후부터 혈청 IgG의 역가가 증가함을 확인할 수 있었다(도 2).
1-2. 도전감염 후 폐사 여부
구강 또는 비강내 접종 경로별로 각 단백 항원 발현 백신균주의 접종군에서 도전감염 후 폐사 여부를 확인하였는데, 그 결과는 하기 표 12와 같았다.
도전감염 후 각 접종 경로별 폐사 두수
접종 경로 Apx ⅠA Apx ⅡA Apx ⅢA OMPA Control
경구 투여 2a/6b 1/6 3/6 3/6 3/6
비강내 투여 1/9 1/9 0/9 1/9 3/8
a폐사 두수/b접종 두수
1-3. 결론
혈청검사 결과 경구 접종보다는 비강내 접종에서 보다 높은 항체 역가가 유도되는 것이 확인되었으며, 도전감염 후 실험동물의 방어여부를 종합하여 본 결과 경구 접종 보다는 비강내 접종의 경우에서 방어 효과가 우수함이 관찰되었다.
실시예 2. 단백 항원 발현 백신균주를 혼합하여 비강내 접종 후 방어 여부 분석
2-1. ELISA에 의한 각 항원에 대한 항체 역가 측정
1) 혈청 IgG
각 단백 항원 발현 백신균주를 혼합하여 비강내로 접종한 후에 각 항원에 대해 혈청 내 항체 유도 여부를 ELISA로 측정하여 본 결과, 상기의 각 단백 항원 발현 백신균주를 단독 투여했을 경우에서와 같이, 백신균주를 혼합하여 접종하였을 경우에도 각 단백 항원에 대해 1차 접종 이후 2주 후부터 각 항원에 대한 혈청 IgG가 대조군에 비해 현저히 증가하고 있음이 확인되었다(도 3).
2) 점막의 IgA
각 단백 항원 발현 백신균주를 혼합하여 비강내로 접종한 후에 각 항원에 대한 분변(fecal sample)의 IgA 및 질 세척액(vaginal washing)에서의 IgA 항체 유도 여부를 ELISA로 측정하여 본 결과, 각 단백 항원에 대해 백신균주를 1차 접종한 이후 2주 후부터 각 항원에 대한 점막의 IgA가 대조군에 비해 현저히 증가하고 있음이 확인되었으며, 모든 항원에 대해 백신균주 접종 후 4주 째에 최고의 항체 역가를 보이다 점차 감소하는 결과를 보여주었다(도 4).
2-2. Splenocyte proliferation assay
세포성 면역반응을 측정하기 위해 백신균주 접종 후 4주차에 마우스의 비장에서 분리된 비장세포를 정제된 Apx ⅡA와 OMPA 항원으로 자극을 시켜 SPA를 하였다. 그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 모든 백신균주 접종군은 대조군의 비해 약 1.5배 정도 증가하였으며 이는 통계학적으로 의의가 있음이 관찰되었다(P < 0.05).
2-3. Flow cytometry
세포성 및 체액성 면역반응을 측정하기 위해 백신균주 접종 후 4주차에 마우스 비장을 적출하여 비장세포를 분리하고 T 림프구와 B 림프구의 구성을 검사하기 위해 Flow cytometry를 이용하여 CD4+와 CD8+ 그리고 CD45R+(B 세포)의 백분율을 조사하였다. 그 결과 각 항원에 대한 CD4+, CD8+, B 세포 모두 대조군에 비해 증가함이 관찰되었다(도 6).
2-4. 실시간 PCR
세포성 및 체액성 면역에 관여하는 사이토카인인 인터루킨-4 (이하, IL-4)와 인터페론-γ(이하, INF-γ)의 분비 정도를 측정하기 위해 백신접종 후 4주차에 무균적으로 백신 접종군과 대조군의 마우스의 비장을 분리하여 비장세포를 분리하고 각 단백 항원으로 비장세포에 자극을 주고 mRNA 를얻은 뒤 cDNA를 합성하여 해당 사이토카인에 특이적인 프라이머로 실시간 PCR을 수행하였다. 그 결과, 백신 접종군은 Th1 타입 면역반응에 관여하는 INF-γ의 유전자 발현 수준이 대조군에 비해 최소 180배 이상 증가한 반면, Th2 타입 면역반응에 관여하는 사이토카인인 IL-4의 발현 수준은 대조군에 비해 최소 12배 이상 증가하는 것으로 확인되었다(도 7). 상기의 결과는 본 발명의 백신을 비강내로 접종할 경우 Th1 타입의 면역반응이 주로 유도되지만 Th2 타입의 면역반응 또한 유도되는 것을 나타내었다.
2-5. 도전감염 후 폐사 여부
백신 접종군에서는 실험동물 10마리 중 3마리가 폐사하여 30%의 폐사율이 관찰된 반면, 대조군에서는 10마리 중 6마리가 폐사하여 60%의 폐사율이 관찰되었고, 이를 통해 백신 접종에 의해 감염에 대한 방어가 이루어졌음이 확인되었다.
실시예 3. 부스터를 통한 백신 효과의 최적화 조건
3-1. 백신 접종 후 유도된 면역반응
1) 혈청 IgG
상기 표 7에서와 같이 각 단백 항원 발현 백신균주들을 혼합한 후 비강내로 1회, 2회 또는 3회 접종한 다음 유도된 면역반응을 알아보기 위해, 각 항원에 대한 혈청 내 항체 역가를 ELISA로 측정하였다. 그 결과, 접종 횟수에 관계없이 접종 2주 후부터 대조군에 비해 유의성 있는 증가가 관찰되었다. 하지만 부스터를 통해 한번 접종한 경우보다 높은 항체 역가가 관찰됨을 확인할 수 있었다(도 8).
2) 점막의 IgA
도 9에서 보는 바와 같이, 총 2회 접종한 그룹 B의 분변 IgA 항체 역가는 8주 및 10주째에 대조군에 비해 유의성 있는 항체 역가의 증가가 관찰된 반면, 3회 접종한 군에서는 10주째에 대조군에 비해 유의성 있는 증가가 관찰되었다. 이 결과는 2회 백신 접종이 점막의 IgA 유도에 보다 효과적임을 나타낸다(도 9).
3-2. 사이토카인 분석
실시간 PCR을 이용하여 접종 횟수에 따른 IFN-γ와 IL-4의 발현을 대조군과 비교해 본 결과 하기 표 13 및 14에서 보는 바와 같이, Th1 타입 면역반응 유도와 밀접한 관련이 있는 IFN-γ의 경우에는 1회 접종 때에 최고의 발현율을 보이다 접종 횟수가 증가함에 따라 점차 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 이와는 반대로 Th2 타입 면역반응 유도와 밀접한 관련이 있는 IL-4의 경우에는 접종 횟수가 증가함에 따라 그 발현율도 증가하였다. 하지만, Apx ⅠA 및 Apx ⅢA 두 항원의 경우에는 3회 접종시에 IL-4의 수치가 낮게 확인되었는데, 이는 3회 접종시에 항원 자극에 대해 반응이 빨리 시작되어 IL-4를 빨리 생산하고 사라진 것으로 추측되었다.
IFN-γ : 대조군에 비해 증가 배율
항원명 1회 접종 2회 접종 3회 접종
Apx ⅠA 약 320배 약 38배 약 18배
Apx ⅡA 약 210배 약 49배 약 5배
Apx ⅢA 약 320배 약 65배 약 14배
OMPA 약 180배 약 51배 약 20배
IL-4 : 대조군에 비해 증가 배율
항원명 1회 접종 2회 접종 3회 접종
Apx ⅠA 약 11배 약 13배 약 18배
Apx ⅡA 약 24배 약 76배 약 100배
Apx ⅢA 약 15배 약 53배 약 18배
OMPA 약 31배 약 51배 약 150배
3-3. 도전감염 후 폐사 여부
하기 표 15에서 보는 바와 같이 부스터를 통한 백신 효과는 1회 접종(그룹 A) 및 3회 접종(그룹 C)의 경우 보다 2회 접종(그룹 B)시에 방어 효과가 더 우수한 것으로 확인되었다.
도전감염 후 폐사 여부
그룹 총 접종 두수 폐사 두수 폐사율(%)
Control 15 9 60.0
A 14 5 35.7
B 6 1 16.7
C 6 2 33.3
실시예 4. 백신의 안전성 및 폐에서의 점막의 IgA 분석
4-1. 백신 접종 후 임상 증상 관찰
백신 접종 후 3주 동안 매일 설사, 발열을 하루에 한번 확인하여 본 결과 백신을 접종한 마우스 모두에서 설사 및 발열은 확인되지 않았다. 또한, 백신 접종 후 식욕감퇴 여부를 확인하기 위해 하루에 일정량의 사료를 공급하여 남은 양을 조사해 본 결과 도 10에서 보는 바와 같이, 백신 1회 접종(그룹 A)의 경우는 백신 접종 이후 3일째까지 사료 섭취량이 감소하였으나, 이후 서서히 증가하여 백신 접종 이후 9일째 부터는 정상의 사료 섭취 수준을 나타내었다. 그리고 백신 2회 접종(그룹 B)의 경우는 1회 접종의 경우보다 빨리 회복되어 백신 접종 3일 후부터 정상의 사료를 섭취하여 4일 후부터는 정상의 사료 섭취 수준이 확인되었다. 또한 실험 동물의 무게를 분석한 결과, 백신 1회 접종군에서만 접종 1주 후에 약간의 몸무게 감소를 보였다가 이후 다시 회복되는 것으로 관찰되었으며, 백신 2회 및 3회 접종군에서는 체중의 변화가 관찰되지 않았다(도 11).
4-2. 분변으로의 백신균주의 배출 여부
생균 백신의 비강내 접종 후 분변으로부터 백신균주의 배출 여부를 확인하여 본 결과를 하기 표 16에 나타내었다. 백신 접종 1주 후부터는 백신 접종 횟수에 상관없이 분변에서 백신 균주의 배출이 확인되지 않았다.
백신 접종 후 분변에서의 쉐딩(shedding) 여부 결과
그룹 1일 2일 3일 1주 2주 3주
Direct Enrichment Direct Enrichment Direct Enrichment Direct Enrichment Direct Enrichment Direct Enrichment
1회 접종 4a/5b 1/1 0/5 0/5 1/5 1/4 0/5 4/5 0/5 0/5 0/5 0/5
2회 접종 1/3 0/2 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5
대조군 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5
[a분변에서 백신균주 확인된 두수/b총 접종 두수]
4-3. 백신 접종 후 실질 장기에서의 백신균주 검출 여부 확인
생균 백신의 비강내 접종 후 주요 실질 장기에서 백신균주의 분리 여부를 확인하였다. 그 결과 하기 표 17과 같이 1회 접종군에서는 백신 접종 3주 후까지 주요장기에서 백신균주가 분리되었으나 2회 접종군에서는 접종 3주 후부터는 백신균주가 분리되지 않았다.
백신 접종 후 주요 실질 장기에서의 백신균주 분리 여부 결과
그룹 1일 1주 2주 3주
Direct Enrichment Direct Enrichment Direct Enrichment Direct Enrichment
1회 접종 폐 0/3 2/3 0/3 1/3 0/3 1/3 0/3 0/3
간 0/3 1/3 0/3 1/3 0/3 3/3 0/3 1/3
비장 0/3 2/3 0/3 2/3 1/3 2/2 1/3 2/2
창자 0/3 2/3 0/3 1/3 0/3 1/3 0/3 0/3
분변 4/5 0/1 0/5 4/5 0/5 0/5 0/5 0/5
2회 접종 폐 0/3 2/3 0/3 1/3 0/3 0/3 0/3 0/3
간 1/3 0/2 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3
비장 0/3 3/3 0/3 1/3 0/3 1/3 0/3 0/3
창자 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3
분변 1/3 0/2 0/5 0/5 0/5 0/5 0/3 0/5
대조군 폐 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/5 0/3
간 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3
비장 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3
창자 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3
분변 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5
4-4. 폐 세척액에서의 점막의 IgA 측정
폐 세척액에서의 IgA 항체 역가를 확인한 결과, 단백 항원마다 다소의 차이는 있으나 1회 접종(그룹 A)보다는 2회 접종(그룹 B)시에 항체 역가가 높게 관찰되었다(도 12). 이 결과는 1회 접종보다는 2회 접종의 경우가 감염 방어에 있어 매우 중요한 폐에서의 IgA를 보다 잘 유도함을 의미하였다.
전술한 결과를 종합하면, 본 발명의 Apx ⅠA, Apx ⅡA, Apx ⅢA 및 OMPA를 각각 발현하는 백신균주를 혼합하여 비강내로 총 2회 접종할 경우 세포성 및 체액성 면역반응 모두를 잘 유도할 수 있으며, 2회 접종이 1회 및 3회 접종보다 방어효과가 더 좋은 것으로 관찰되었다.
실시예 5. 목적동물인 돼지에서의 백신의 효능 평가
5-1. 모돈에 예방 접종 후 자돈에서의 백신 효능 평가
하기 표 18에서 보는 바와 같이 대조군은 5마리 모두에서 흉막 폐렴의 증상이 관찰된 반면, 모돈에 백신을 접종하고 자돈에서 도전 감염을 수행한 5 두 중에서 3두의 자돈에서 흉막 폐렴의 증상이 관찰되었다.
모돈에 예방백신을 접종하고 자돈에 도전 감염시킨 후 부검을 통한 임상 증상
그룹 도전감염 두수 임상 증상 두수 정상 두수 비고
대조군 5 5 0
백신접종군 5 3 2
5-2. 모돈 및 자돈에 예방 접종 후 자돈에서의 백신 효능 평가
하기 표 19에서 보는 바와 같이 대조군은 5마리 모두에서 흉막 폐렴의 증상이 관찰된 반면, 모돈 및 자돈에 백신을 접종하고 자돈에서 도전 감염을 수행한 5두의 자돈 중에서 1두의 자돈에서 흉막 폐렴의 증상이 관찰되었다.
모돈 및 자돈에 예방백신을 접종하고 자돈에 도전 감염시킨 후 부검을 통한 임상 증상
그룹 도전감염 두수 임상 증상 두수 정상 두수 비고
대조군 5 5 0
백신접종군 5 1 4
5-3. 결론
이상의 결과를 종합하여 보면, 대조군으로 사용된 모든 자돈에서 흉막폐렴의 임상 증상이 관찰된 반면, 모돈에 예방백신을 접종하였을 경우에는 3두에서만 흉막 폐렴의 임상 증상이 관찰되어 백신의 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 더불어 모돈 및 자돈에 백신을 접종하고 자돈에서 도전감염을 실시한 경우에는 단지 1두에서만 경미한 흉막 폐렴의 증상이 관찰되어 모돈에 예방 백신을 접종하였을 때보다 효율적으로 돼지에서 흉막 폐렴을 방어할 수 있음을 확인할 수 있었다.

Claims (11)

  1. lon , cpxR 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라균 변이주에 있어서,
    돼지의 흉막폐렴 원인균의 주요 병원성 인자인 Apx ⅠA, Apx ⅡA, Apx ⅢA, OMPA, OmlA 및 ApfA로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 인자를 더 포함하는 살모넬라균 변이주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 살모넬라균은 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium)인 것을 특징으로 하는 살모넬라균 변이주.
  3. 제1항의 변이주 중 어느 하나 이상을 포함하는, 살모넬라균 변이주 혼합물.
  4. 제3항의 살모넬라균 변이주 혼합물을 유효성분으로 포함하는 돼지의 흉막폐렴 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 살모넬라균 변이주 혼합물은 생균인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  6. (a) 돼지 흉막폐렴 원인균의 주요 병원성 인자인 Apx ⅠA, Apx ⅡA, Apx ⅢA, OMPA, OmlA 및 ApfA로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 유전자를 증폭시키는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 증폭된 유전자를 lepB, secA 및 secB 유전자를 가진 플라스미드에 클로닝하는 단계;
    (c) 살모넬라 균주의 염색체 DNA에서 lon, cpxR 및 asd 유전자를 결실시켜 약독화 살모넬라 균주를 제조하는 단계;
    (d) 상기 (b) 단계의 클로닝된 플라스미드를 상기 (c) 단계의 약독화 살모넬라 균주에 형질전환시키는 단계; 및
    (e) 상기 (d) 단계의 형질전환된 살모넬라균 변이주를 선별하는 단계를 포함하는 돼지의 흉막폐렴 예방 또는 치료용 살모넬라균 변이주의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 돼지 흉막폐렴 원인균은 액티노바실러스 플류로뉴모니애 (Actinobacillus pleuropneumoniae)인 것을 특징으로 하는 살모넬라균 변이주의 제조방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 살모넬라균은 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium)인 것을 특징으로 하는 살모넬라균 변이주의 제조방법.
  9. 제4항 또는 제5항의 백신 조성물을 모돈 또는 자돈에 접종하는 것을 특징으로 하는 돼지 흉막폐렴의 예방 또는 치료를 위한 백신화 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 접종은 경구 또는 비강내로 투여되는 것을 특징으로 하는 백신화 방법.
  11. 제3항의 살모넬라균 변이주 혼합물을 포함하는, 돼지의 면역증강용 사료 첨가제.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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