KR20150115638A

KR20150115638A - 용안육 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20150115638A
Application number: KR1020150043484A
Authority: KR
Inventors: 권순창; 박상진; 구민지
Original assignee: (주)내츄럴엔도텍
Priority date: 2014-04-04
Filing date: 2015-03-27
Publication date: 2015-10-14
Also published as: CN106659753A; KR101698926B1; WO2015152682A1

Abstract

본 발명은 용안육 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 용안육 추출물은 조골세포의 분화를 촉진시킬 수 있으며, 또한 한약재로 종래부터 사용되고 있는 것으로서, 안전성도 우수하다. 따라서 본 발명의 용안육 추출물을 포함하는 조성물은 골다공증의 예방, 개선 또는 치료제로 개발될 수 있다.

Description

용안육 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Compositions Comprising Extracts of Longan Arillus as Active Ingredients for Preventing or Treating an Osteoporosis}

본 발명은 골다공증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

골밀도의 감소는 폐경기 이후 여성에서 두드러지게 발생되어 65세 이상의 여성 2명 중 1명, 남성의 경우 5명 중 1명에서 나타나며 골다공증을 유발한다. 골다공증은 전 세계적으로 심혈관계 질환 다음으로 발병률이 높으며 골절이 발생할 수 있는 위험한 질환이다.

폐경기 여성에게 주로 처방되는 여성호르몬 제제, 비스포스포네이트 (bisphosphonate)제제 및 부갑성선호르몬 제제 등, 현재 여려 종류의 골다공증 치료제가 시판되고 있으나 유방암의 발병 위험률을 높이거나 투여 방법이 까다롭고 소화기계 이상 반응 등의 부작용을 동반하는 문제점이 있다.

골다공증 치료제는 골 흡수 억제제와 골 형성 촉진제로 분류된다. 골 흡수 억제제에는 뼈를 파괴하는 작용을 하는 파골세포(osteoclast)의 형성과 활성을 조절하는 치료제로서 비스포스포네이트, 선택적 에스트로겐 수용체 조절자(SERM), 칼시토닌 등이 있으며, 골 형성 촉진제에는 부갑상선 호르몬제(parathyroid hormone, PTH), 불소제 등이 있다. 그러나 현재까지 개발된 골다공증 치료제들은 부갑상선 호르몬제를 제외하고는 골형성 작용이 미미하여 치료효과보다는 증상의 진행을 예방, 개선하는 효과에 그치고 있다.

골밀도의 감소는 파골세포(osteoclast)의 활성을 억제하거나 뼈의 신생에 관여하는 조골세포(osteoblast)의 활성 증가를 유도함으로써 억제할 수 있다. 이 중 조골세포의 활성을 증가시키는 물질로는 부갑상선 호르몬계가 주종을 이루고 있으나 동물모델에서 골육종 유발 가능성이 제기되어 사용기간이 최대 1년 6개월로 제한되어 있다. 골밀도 감소를 억제하기 위한 치료제로는 현재 LRP-5에 대한 아고니스트(agonist)에 관한 연구가 진행되고 있으나 아직까지는 학문적인 수준에 머물고 있으며 저분자 화합물에 관하여는 보고된 바가 거의 없다. GSK-3β의 활성을 억제하는 LiCl이나 저분자 화합물인 Chir99021 또는 LY603281-31-8은 조골세포 분화를 촉진한다고 보고되고 있으나 역시 아직까지는 학문적인 수준에 머물고 있다. 따라서 골다공증 환자들을 위해 골형성 과정의 신호전달 기작을 기초로 하여 조골세포 분화를 촉진시킬 수 있는 새로운 물질의 개발이 요구되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용은 괄호 내에 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준과 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 골다공증의 치료를 위해 인체에 안전하면서도 조골세포의 분화를 촉진시킬 수 있는 새로운 물질을 개발하고자 연구 노력하였다. 그 결과, 용안육 추출물이 세포에 독성이 없으면서 조골세포의 분화를 촉진시킬 수 있다는 것을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다

따라서 본 발명의 목적은 용안육 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 용안육 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 골다공증의 예방, 개선 또는 치료를 위해 조골세포의 분화를 촉진시킬 수 있는 물질을 개발하고자 연구 노력하였다. 그 결과, 용안육 추출물이 독성이 없으면서도 조골세포의 분화를 촉진시킬 수 있다는 것을 발견하였다.

용안육은 용안(龍眼, Dimocarpus longan Loureiro)의 헛씨껍질로 세로로 파열된 불규칙한 박편이 보통 여러 개가 끈끈하게 붙어 있으며, 길이는 2-4 cm, 너비는 1-2 cm이며 두께는 2-4 mm이다. 바깥면은 진한 적갈색 또는 흑갈색으로 반투명한데 한 면은 주름이 지어 고르지 않고 다른 면은 윤기가 있으며 세로 주름이 있다. 질은 부드럽고 점착성이다. 용안육은 전통의학에서 지나치게 생각을 많이 하여 심장이 불규칙하게 뛰거나 건망증, 불면증, 소화불량 및 묽은 변을 볼 때 사용하고 있다. 약리작용으로는 옴균억제, 강장작용, 항산화작용 및 면역 기능 활성화작용 등이 있다. 다른 이름으로 계원(桂圓), 교루(鮫淚), 밀비(蜜脾), 아려지(亞枝), 여주(驪珠), 연란(燕卵), 용목(龍目), 용안(龍眼), 용안건(龍眼乾), 원안(圓眼), 원안육(元眼肉), 익지(益智), 천탄자(川彈子) 및 여지노(枝奴)가 있다.

본 발명의 조성물은 유효성분으로서 용안육 추출물을 포함한다. 본 명세서에서 용안육을 언급하면서 사용되는 용어 ‘추출물’은 용안육에 추출용매를 처리하여 얻은 추출 결과물뿐만 아니라 용안육 자체를 동물에게 투여할 수 있도록 제형화(예컨대, 분말화)한 용안육 가공물도 포함하는 의미를 갖는다.

본 발명의 조성물에서 이용되는 용안육 추출물을 용안육에 추출용매를 처리하여 얻는 경우, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 바람직하게는, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것에는 (i) 물, (ii) 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO(dimethyl sulfoxide)가 포함된다. 비극성 용매로서 적합한 것에는 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF가 포함된다. 더 바람직하게는, 물 또는 C1 내지 C4의 알코올인 것이 적합하고, 가장 바람직하게는 물, 에탄올 또는 메탄올로 추출하는 것이 적합하다. 또한 상기 추출용매는 바람직하게는 원재료 중량의 2배 내지 10배로 첨가하여 추출하는 것이 적합하고, 가장 바람직하게는 3배 내지 5배로 첨가하여 추출하는 것이 적합하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 용어 ‘추출물 또는 그의 분획물’은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract) 및 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물을 의미한다. 즉, 용안육 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 용안육 추출물에 포함되는 것이다. 본 발명의 어떤 예에 따르면, 메탄올로 추출한 후, 헥산, 에틸아테르, 디클로로메탄올 또는 부탄올을 이용하여 추가로 분획물을 얻을 수 있었다.

본 발명에서 이용되는 용안육 추출물은 초임계추출, 아임계추출, 고온추출, 고압추출 및 초음파추출법 등의 추출장치를 이용한 방법 또는, XAD 및 HP-20을 포함한 흡착수지를 이용하는 방법 등 당업계의 통상적인 추출방법을 사용하여 제조할 수 있다. 바람직하게는 가온하며 환류 추출 또는 상온에서 추출하여 제조할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 한편, 추출 회수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 3회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에서 용안육 추출물의 함량은 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제공될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 본 발명의 용안육 추출물의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 명세서의 용어 “약제학적 유효량”은 용안육 추출물의 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 적용된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001-1000 ㎎/kg 범위 내이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 기능성 식품 조성물로 제공될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 본 발명의 용안육 추출물의 식품학적 유효량; 및 (b) 식품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 식품학적 조성물이다.

본 발명의 조성물이 기능성 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 용안육 추출물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물에는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 해당된다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 용안육 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 용안육 추출물을 이용한 골다공증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 조성물에서 유효성분인 용안육 추출물은 한약재로 종래부터 사용되고 있는 것으로서, 안전성도 우수하다.

도 1은 용안육 메탄올 추출물로부터 다양한 분획물을 제조하는 전체적인 과정을 보여주는 도표이다.
도 2는 용안육 메탄올 추출물의 세포에 대한 독성을 분석하기 위하여 용안육 메탄올 추출물의 농도에 따른 세포생존율을 분석한 도표이다.
도 3a는 Saos-2 세포에서 용안육 메탄올 추출물의 조골세포 분화촉진 효과를 분석하기 위하여 용안육 메탄올 추출물의 농도에 따른 ALP 활성을 측정한 도표이다.
도 3b는 MC-3T3-E1 세포에서 용안육 메탄올 추출물의 조골세포 분화촉진 효과를 분석하기 위하여 용안육 메탄올 추출물의 농도에 따른 ALP 활성을 측정한 도표이다.
도 3c는 MC-3T3-E1 세포에서 용안육 물 또는 에탄올 추출물의 조골세포 분화촉진 효과를 분석하기 위하여 용안육 물 30% 에탄올 또는 50% 에탄올 추출물을 처리하고 ALP 활성을 측정한 도표이다.
도 3d는 MC-3T3-E1 세포에서 용안육 물 또는 에탄올 추출물의 조골세포 분화촉진 효과를 분석하기 위하여 다양한 농도의 용안육 물 또는 에탄올 추출물을 처리하고 ALP 활성을 측정한 도표이다.
도 3e는 MC-3T3-E1 세포에서 다양한 용매를 이용한 용안육 추출물의 조골세포 분화촉진 효과를 분석한 도표이다. 용안육 M은 용안육 메탄올 추출물, 용안육 H는 용안육 헥산 분획물, 용안육 E는 용안육 에틸아세테이트 분획물, 용안육 D는 용안육 디클로로메탄 분획물, 용안육 B는 용안육 부탄올 분획물이다.
도 4a는 C2C12 세포에서 Wnt3a 존재 하에서 용안육 메탄올 추출물의 조골세포 분화촉진 효과를 분석하기 위하여 용안육 메탄올 추출물의 농도에 따른 ALP 활성을 측정한 도표이다.
도 4b는 MC-3T3-E1 세포에서 Wnt3a 존재 하에서 용안육 메탄올 추출물의 조골세포 분화촉진 효과를 분석하기 위하여 용안육 추출물의 농도에 따른 ALP 활성을 측정한 도표이다.
도 5는 용안육 추출물에 의한 조골세포에서의 칼슘 무기물 침착을 분석하기 위해, Alizarin Red S assay를 수행한 사진이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 용안육으로부터 메탄올 추출물의 제조

잘게 분쇄한 용안육(경동시장, 대한민국) 원재료 20 g에 메탄올 200 ㎖를 가하고 65 ℃에서 4시간 동안 1회 환류 추출한 다음, 30분 동안 상온에서 냉각시켰으며, 여과지(Whatman No. 4 filter paper)를 이용하여 불순물 등을 제거하였다. 이후 여과된 추출액을 감압농축기(Freeze dryer, Edwards, USA)를 이용하여 완전히 건조한 결과, 12.5 g의 농축물을 얻었으며 추출 효율은 62.5 % 이었다. 이후 완전 건조된 농축물을 적정농도로 증류수에 용해하여 조골세포 분화촉진 실험에 사용하였다.

실시예 2: 용안육으로부터 물, 에탄올 추출물의 제조

용안육 20 g을 잘게 분쇄한 다음, 분쇄물에 각각 물, 30%, 50% 또는 100% 에탄올을 200 ㎖씩 첨가한 후, 물 추출물은 100℃에서, 30%, 50% 또는 100% 에탄올 추출물은 90℃에서 6시간 동안 1회 환류 추출 하였다. 추출액을 냉각시킨 후 여과하여 불순물을 제거하였다. 이후 여과된 추출액을 감압농축기를 이용하여 완전히 건조하였으며, 최종 건조물의 추출효율을 계산한 결과, 물, 30%, 50% 또는 100% 에탄올 추출물에서 각각 54.1 %, 59.5 %, 58.6 %, 57.2%의 추출효율을 얻었다.

실시예 3: 용안육으로부터 메탄올 추출물의 분획물 제조

용안육 메탄올 추출물로부터 다양한 분획물을 제조하고자 하였으며 전체적인 제조과정은 도 1과 같다. 용안육 20 g을 잘게 분쇄 후, 200 ml의 메탄올을 넣어 65 ℃ 중탕에서 4시간 동안 환류 추출하였다. 감압농축기를 이용하여 상기에서 얻은 메탄올 총 추출액으로부터 용매를 완전히 제거한 다음, 헥산(Hexane)과 증류수(DW)를 각각 200 ㎖씩 넣고 층 분리를 실시하여 헥산층을 회수하였다. 회수 후 남은 잔류 물층을 이용하여 각각 다음과 같은 방법으로 분획물을 제조하였다:

잔류 물층에 에틸아세테이트(Ethyl acetate)를 200 ㎖ 넣고 동일한 방법으로 층 분리를 실시하여 에틸아세테이트 층을 회수하였다. 잔류 물층에 디클로로메탄(Dichloromethane)을 200 ㎖ 넣고 층분리를 실시하여 디클로로메탄 층을 회수하였다. 잔류 물층에 부탄올(n-Butanol)을 200 ㎖ 넣고 층 분리를 실시하여 부탄올 층과 물 층을 회수하였다.

용매 별 추출 효율을 계산하기 위하여, 각 단계에서 수득한 분획물을 감압 건조하여, 농축물의 중량을 기준으로 추출 효율을 계산하였다(표 1).

추출 용매	농축물 무게(g)	추출 효율( yield )
메탄올	12.5	62.5%
부탄올	0.16	2.8%
디클로로메탄	0.08	0.4%
에틸아세테이트	0.1	0.5%
헥산	0.14	0.7%

실시예 4: 용안육 추출물의 세포 독성 측정

실험에 사용한 C2C12 세포주는 한국세포주은행 (KCLB)로부터 분양받았다. C2C12 세포배양에 필요한 배지 Dulbecco's modified Eagles medium (DMEM), 배지에 첨가하는 항생제(120 ㎍/㎖ 페니실린, 200 ㎍/㎖ 스트렙토마이신) 및 소 태아 혈청(fetal bovine serum,FBS)은 Hyclon (Logan, UT) 제품을 사용하였고, 37 ℃, 5 % CO₂ 조건에서 배양하였다.

C2C12 세포를 96웰-플레이트(Greiner bio-one)에 2 × 10⁴/well로 분주하고 24시간 동안 배양한 다음, 용안육 메탄올 추출물(50 ㎎/㎖)을 각각 0.1 %, 0.5 % 및 1.0 % 농도로 처리하였다. 다시 48시간 배양한 다음, 세포 생존율 분석키트(CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay kit, Promega)를 사용하여 세포 생존율을 분석하였다. 발광을 VICTOR^TMX3( PerkinElmer)로 측정하여, 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다. 실험결과, 용안육 메탄올 추출물을 1.0 % 농도까지 농도를 높이면서 처리하여도 세포 생존율에 거의 영향을 미치지 않았다(도 2). 따라서 본 발명의 용안육 메탄올 추출물은 적어도 1.0 % 농도까지는 세포에 독성이 없다는 것을 확인하였다.

실시예 5: 용안육 추출물에 의한 조골세포 분화촉진 효과 측정

다양한 방법으로 추출한 용안육 추출물의 조골세포 분화촉진 효과를 측정하기 위하여 세포주에서 용안육 추출물에 의한 알카라인 포스파타아제(alkaline phosphatase, ALP) 활성변화를 분석하였다. 알카라인 포스파타아제(alkaline phosphatase, ALP)는 모든 조직에 존재하며, 특히 골 조직에 존재하는 ALP는 골 성장이 활발할 때 그 활성이 증가하므로 조골세포의 활성을 알아보는 바이오 마커로 사용된다. 골육종(osteosarcoma) 세포주인 Saos-2 세포주 및 조골세포 전구체(osteoblast precursor)인 MC-3T3-E1 세포주에 용안육 추출물을 처리한 후, ALP 활성을 측정함으로써 용안육 추출물이 조골세포 활성에 미치는 영향을 분석하였다.

실험에 사용한 Saos-2 세포주 및 MC-3T3-E1 세포주는 한국세포주은행 (KCLB)로부터 분양받았다. Saos-2 세포 배양에 필요한 RPMI 1640 배지, 배지에 첨가하는 항생제(120 ㎍/㎖ 페니실린, 200 ㎍/㎖ 스트렙토마이신) 및 소 태아 혈청(fetal bovine serum,FBS)은 Hyclon (Logan, UT) 제품을 사용하였고, MC-3T3-E1 세포 배양에 필요한 MEM-α 배지는 Life Technologies 제품을 사용하였다. 모든 세포는 37 ℃, 5 % CO₂ 조건에서 배양하였다.

Saos-2 세포 또는 MC-3T3-E1 세포를 각각 96웰-플레이트(Greiner bio-one)에 2 × 10⁴/well로 분주하여 24시간 동안 배양한 다음, 다양한 방법으로 추출한 용안육 추출물을 처리하였다. 다시 72시간 동안 배양한 다음, 배지를 제거하고 PBS로 한 번 씻어준 후, 패시브 라이시스 버퍼(Passive lysis buffer, Promega)로 30분간 세포를 용해시켰다. 용해시킨 상층액의 ALP 활성을 Phospha-Light^TM SEAP Reporter Gene Assay System (Applied Biosystem)을 사용하여 분석하였다. 발광을 VICTOR^TMX3( PerkinElmer)로 측정하였다. 이때 세포 수의 차이가 ALP 활성도에 영향을 미칠 수 있으므로 남은 상층액으로 단백질 정량을 실시하였고, 단백질 농도로 보정함으로써 ALP 활성도를 계산하였다.

실시예 1의 용안육 메탄올 추출물(50 ㎎/㎖)을 0.5%, 1% 농도로 처리한 경우, Saos-2 세포(도 3a) 및 MC-3T3-E1 세포(도 3b)에서 모두 농도 의존적으로 ALP 활성을 촉진시키는 것을 확인하였다.

실시예 2에서 제조한 용안육 물 추출물(50 ㎎/㎖) 또는 30%, 50% 에탄올 추출물(50 ㎎/㎖)을 각각 최종 농도 0.2%, 0.5%로 처리한 결과, MC-3T3_E1 세포에서 ALP 촉진 활성이 1.5-2배 정도 증가되는 것을 확인할 수 있었다(도 3c). 물 또는 에탄올 추출물의 효과를 더 분석하기 위하여 다양한 농도의 물 또는 에탄올(100%) 추출물을 MC-3T3_E1 세포에 처리한 후 ALP 활성을 측정하였다(도 3d). 분석결과, 물 또는 에탄올(100%) 추출물의 경우, 모두 농도 의존적으로 ALP 활성을 증가시키는 것을 확인하였다.

또한 실시예 3에서 제조한 용안육 헥산 분획물(50 ㎎/㎖), 에틸아세테이트 분획물(50 ㎎/㎖) 및 디클로로메탄 분획물(50 ㎎/㎖)을 각각 최종 농도 0.5%로 처리한 결과, MC-3T3-E1 세포에서 ALP 활성을 촉진 활성이 증가되는 것을 확인할 수 있었다(도 3e).

이러한 결과는 다양한 용매를 사용하여 추출한 용안육 추출물 또는 분획물이 조골세포의 분화촉진에 효과가 있음을 나타내는 것이다.

실시예 6: Wnt3a 존재 하에서 용안육 메탄올 추출물에 의한 조골세포 분화촉진 효과 측정

골세포 분화에 중요하다고 알려져 있는 Wnt 신호전달 기작과 용안육 추출물 사이의 시너지 효과를 측정하기 위하여 C2C12 세포주 및 MC-3T3-E1 세포주에 용안육 추출물과 Wnt3a가 포함된 배지를 함께 처리하고 ALP 활성을 측정하였다.

실험에 사용한 C2C12 세포주, MC-3T3-E1 세포주 및 Wnt3a를 분비하는 L 세포주는 한국세포주은행 (KCLB)로부터 분양받았다. C2C12 세포 및 MC-3T3-E1 세포는 상기 기재한 바와 같이 배양하였다. Wnt3a를 분비하는 L 세포주는 10%의 소 태아 혈청이 포함된 DMEM 배지를 사용하여 4일간 배양한 다음, 배양액을 수집하여 0.22-㎜ 필터로 멸균하였다. 신선한 배지로 교체하여 3일간 더 배양한 다음, 배양액을 수집하여 0.22-㎜ 필터로 멸균하고 이전에 수집한 배양액과 혼합하여 Wnt3a CM (conditioned media)을 제조하였다.

C2C12 세포 또는 MC-3T3-E1 세포를 각각 96웰-플레이트(Greiner bio-one)에 2×10⁴/well로 분주하여 24시간 동안 배양한 다음, 각각 0.5 % 및 1.0 % 용안육 메탄올 추출물을 상기 방법대로 제조한 Wnt3a CM (conditioned media)과 함께 처리하였다. 다시 72시간 동안 배양한 다음, 배지를 제거하고 PBS로 한 번 씻어준 후 패시브 라이시스 버퍼(Passive lysis buffer, Promega)로 30분간 세포를 용해시켰다. 용해시킨 상층액의 ALP 활성을 Phospha-Light^TM SEAP Reporter Gene Assay System(Applied Biosystem)을 사용하여 분석하였다. 발광을 VICTOR^TMX3(PerkinElmer)로 측정하였다. 이때 세포 수의 차이가 ALP 활성도에 영향을 미칠 수 있으므로 남은 상층액으로 단백질 정량을 실시하였고, 단백질 농도로 보정함으로써 ALP 활성도를 계산하였다. 실험 결과, MC-3T3-E1 세포에서는 Wnt3a만 처리한 경우 ALP 활성의 증가 정도가 미미하였지만, 실시예 1의 용안육 메탄올 추출물을 함께 처리한 경우 대조군에 비해 ALP 활성이 5배 가까이 증가하였다(도 4a). C2C12 세포에서는 Wnt3a만 처리한 경우 ALP 활성의 증가 정도가 미미하였지만, 실시예 1의 용안육 메탄올 추출물을 함께 처리한 경우 대조군에 비해 ALP 활성이 2배 가까이 증가하였다(도 4b). 이러한 결과는 용안육 추출물이 MC-3T3-E1 세포 및 C2C12 세포에서 Wnt3a의 존재 하에서도 ALP의 활성을 촉진시킨다는 것을 보여주는 것으로서, 용안육 추출물이 Wnt 신호 전달 기작이 작용하는 중에도 조골세포의 분화를 촉진시킬 수 있다는 것을 보여주는 것이다.

실시예 7: 용안육 메탄올 추출물에 의한 조골세포 칼슘침착도 평가 ( Alizarin Red Assay )

용안육 추출물에 의한 조골세포에서의 칼슘 무기물 침착을 분석하기 위해, Alizarin Red S assay를 수행하였다. MC-3T3-E1 세포에 다양한 농도(0%, 0.1%, 0.5%, 1.0%)의 용안육 메탄올 추출물을 처리한 다음, 세포를 20일간 배양한 후 위상차 현미경으로 석회화 결절의 형성을 관찰하였다. 또한, 조골세포의 분화유무를 확인하여 위하여 음성 대조군으로서 분화배지를 포함하지 않은 것을 함께 분석하였다. 현미경 상에서 관찰한 결절이 석회화 결절인지 재확인하기 위하여 다음과 같은 방법으로 Alizarin Red S assay을 실시하였다: MC-3T3-E1 세포를 3.7 % 포름알데히드 용액으로 고정한 다음, 고정된 세포를 2 % Alizarin Red S 용액(10 % ammonium hydroxide로 pH 4.2)으로 20분간 염색하고 3차 증류수로 세척한 후, 육안으로 붉은 색의 석회화 결절 형성여부를 대조군과 비교하여 관찰하였다. 분석결과, 음성대조군에서는 석회화 결절을 거의 관찰할 수 없었으며, 용안육을 처리하지 않은 세포분화 대조군 및 용안육 추출물 0.1 % 또는 0.5 % 처리군에서는 석회화 결절을 미미하게 관찰할 수 있었다. 하지만 용안육 추출물 1.0 % 처리군의 경우, 대조군에 비하여 결절화 정도가 크게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해 용안육 추출물이 조골세포에서 칼슘 무기물 침착을 증가시키며, 골분화를 증가시키는 효과를 가지고 있다는 것을 확인할 수 있었다(도 5).

Claims

용안육 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 골 질환은 골다공증, 골화석증, 골경화증, 관절염, 파제트병(Paget's disease), 대사성 골질환, 다발성 마이엘로마, 치주질환 또는 골형성 부전증인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 골 질환은 골다공증인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 기능성 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
용안육 추출물을 유효성분으로 포함하는 골 건강 개선용 기능성 식품 조성물.