CN106659753A - 包含龙眼肉提取物作为有效成分的骨疾病的预防、改善或治疗用组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含龙眼肉提取物作为有效成分的骨疾病的预防、改善或治疗用组合物。本发明的龙眼肉提取物能够促进成骨细胞的分化，并且向来用作中药材而安全性优秀。因此，本发明的包含龙眼肉提取物的组合物可以开发为骨疾病的预防、改善或治疗剂。

Description

包含龙眼肉提取物作为有效成分的骨疾病的预防、改善或治 疗用组合物

技术领域

本发明是在韩国农林畜产食品部的援助下基于课题编号114030-3而提出的，上述课题的研究管理专门机构为农林水产食品技术企划评价院，研究项目名称为“高增食品技术开发项目”，研究课题名称为“具有骨形成促进作用的骨健康(骨质疏松症)改善功能性食品材料开发”，主管机构为安德太生物科技株式会社，研究期间为2014年08月01日至2014年07月31日。

本专利申请主张2014年4月4日向韩国特许厅提交的韩国专利申请第10-2014-0040678号的优先权，上述专利申请的揭示内容均作为参照插入于本说明书。

本发明涉及骨质疏松症的预防、改善或治疗用组合物。

背景技术

骨密度的减少在闭经期之后的女性中发生较多，65岁以上的女性中有2名中的1名，男性的情况下有5名中的1名发生骨密度的减少，并诱发骨质疏松症。骨质疏松症在世界上发病率仅次于心血管类疾病且可能发生骨折的危险的疾病。

目前有多种骨质疏松症的治疗剂处于销售中，例如对闭经期的女性主要处方的雌性激素制剂、二膦酸盐(bisphosphonate)制剂及甲状旁腺激素制剂等，然而存在乳腺癌的发病危险率上升或给药方式繁琐且导致消化系统的异常反映等副作用的问题。

骨质疏松症治疗剂分为骨形成抑制剂和骨形成促进剂。骨形成抑制剂作为用于调节起到破坏骨质的作用的破骨细胞(osteoclast)的形成或活性的治疗剂，包括二膦酸盐(bisphosphonates)、选择性雌激素受体调节剂(SERM)、降血钙素(calcitonin)等，骨形成促进剂包括甲状旁腺激素剂(parathyroid hormone，PTH)、氟素剂等。然而，至今开发出的骨质疏松症治疗剂中除了甲状旁腺激素剂以外，骨形成作用微乎其微，只不过是预防、改善症状的发展的效果，不能起到治疗效果。

可通过抑制破骨细胞(osteoclast)的活性或诱导参与骨的新生的成骨细胞(osteoblast)的活性增加来抑制骨密度的减少。其中，作为增加成骨细胞的活性的物质主要使用甲状旁腺激素类，然而在动物模型中发现可能诱发骨癌的可能性，因此使用期限限制为最长一年半。为了开发抑制骨密度的减少的治疗剂，目前正进行关于低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP-5)的拮抗剂(agonist)的研究，然而到目前为止还处于学术水平，且没有关于低分子化合物的报告。据报告，用于抑制GSK-3β的活性的LiCl或作为低分子化合物的Chir99021或LY603281-31-8促进成骨细胞的分化，然而到目前为止还是处于学术水平。因此，为了骨质疏松症患者，需要开发能够以骨形成过程的信号传递机制为基础促进成骨细胞的分化的新颖的物质。

本说明书全文中，参照多篇的论文及专利文献，并表示其引用内容。所引用的论文及专利文献的揭示内容，作为参照全部插入于本说明书中，而将更加明确地说明本发明所属技术领域的水准及本发明的内容。

发明内容

技术问题

本发明人为了开发用于治疗骨疾病的对人体安全且能够促进成骨细胞的分化的新颖的物质而努力研究。其结果，发现了龙眼肉提取物对细胞无毒性且能够促进成骨细胞的分化，由此完成了本发明。

因此，本发明的目的在于，提供骨疾病的预防、改善或治疗用组合物。

本发明的另一目的在于，提供骨疾病的预防、改善或治疗方法。

将通过发明的具体实施方式、发明要求保护范围及附图，更明确地说明本发明的其他目的及优点。

解决问题的手段

根据本发明的一实施方式，本发明提供包含龙眼肉提取物作为有效成分的骨疾病的预防、改善或治疗用组合物。

根据本发明的再一实施方式，本发明提供骨疾病的预防、改善或治疗方法，其包括向对象(subject)给药包含龙眼肉提取物或其分馏物的有效量的组合物的步骤。

本发明人为了预防、改善或治疗骨疾病，而努力研究开发能够促进成骨细胞的分化的物质。其结果，发现了龙眼肉提取物无毒性且能够促进成骨细胞的分化。

龙眼肉(Longan Arillus)为龙眼(Dimocarpus longan Loureiro)的假种皮(aril)，通常黏糊附着有多个纵向破裂的不规则的薄片，长度为2-4cm，宽度为1-2cm，厚度为2-4mm。外部面为深赤褐色或者黑褐色且半透明，一面褶皱而不均匀，另一面润泽并具有纵向皱纹。质感柔软且具有粘性。传统医学中，龙眼肉通常用于心重而心跳不规则或者健忘症、失眠症、消化不良及便稀等症状。药理作用包括疥疮(Scabies)抑制、强壮作用、抗氧化作用、免疫功能活性化作用等。龙眼肉又称为桂圆、鲛泪、蜜脾、亚荔枝、骊珠、燕卵、龙眼、龙眼乾、圆眼、元眼肉、益智、川弹子及荔枝奴。

本发明的组合物包含龙眼肉提取物作为有效成分。本说明书中提及龙眼肉时所使用的术语“提取物”不仅意味着对龙眼肉进行提取溶剂处理而得的提取结果物，而且包括将龙眼肉制备成能够直接向动物给药的剂型化(例如，粉末化)的龙眼肉加工物。

本发明的组合物中利用的龙眼肉提取物可对龙眼肉进行多种提取溶剂处理而得。具体地，可利用极性溶剂及非极性溶剂。极性溶剂优选地包括(i)水；(ii)醇(甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、1-戊醇、2-丁氧基乙醇或乙二醇)；(iii)乙酸；(iv)二甲基甲酰胺(DMFO，dimethyl-formamide)以及(V)二甲亚砜(DMSO，dimethyl sulfoxide)。非极性溶剂优选地包括丙酮、乙腈、乙酸乙酯、乙酸甲酯、氟代烷、戊烷、己烷、2，2，4-三甲基戊烷、癸烷、环己烷、环戊烷、二异丁烯、1-戊烯、1-氯丁烷、1-氯戊烷、邻二甲苯、二异丙醚、2-氯丙醇、甲苯、1-氯丙醇、氯苯、苯、二乙醚、二乙硫、三氯甲烷、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、苯胺、二乙胺、醚、四氯化碳、四氢呋喃(THF)。进而优选地使用水或C1至C4的醇，最优选地使用水、乙醇或甲醇来提取。并且，上述提取溶剂优选地添加原材料的总量的两倍至十倍来提取，更加优选地添加三倍至五倍来提取，但并不局限于此。

如上所示，本说明书中所使用的术语“提取物或其分馏物”意味着本领域中的对粗提物(crude extract)及提取物的追加分馏(fractionation)的分馏物。即，龙眼肉提取物不仅包括利用如上所示的提取溶剂得到的，还包括对此追加地进行提纯过程的。例如，使上述提取物通过具有规定的分子量截留(cut-off)值的超滤膜获得的分馏物、利用多种层析法(基于根据大小、电荷、疏水性或亲水性的分离制造)的分离等通过追加实施的多种提纯方法获得的分馏物也包括在本发明的龙眼肉提取物。根据本发明的一例，利用甲醇提取之后，利用己烷、乙醚、二氯甲烷、丁醇来追加获得分馏物。

本发明中所利用的龙眼肉提取物可使用超临界提取、亚临界提取、高温提取、高压提取及超声波提取法等提取装置的方法或者利用包含XAD及HP-20的吸附树脂的方法等本领域中的常规提取方法来制备。具体地，可进行加温并进行回流提取或常温提取来制备，但并不局限于此。另一方面，提取次数优选为一次至五次，进而优选为三次，但并不局限于此。

本发明的组合物中，对龙眼肉提取物的含量不进行限制。

本发明的组合物可制备为药剂学组合物。

具体地，本发明的组合物是一种药剂学组合物，其包含：(a)本发明的龙眼肉提取物的药剂学有效量；以及(b)药剂学上可接受的载体。本说明书中的术语“药剂学有效量”能够达成龙眼肉提取物的功效的充分的量。

在本发明的组合物制备为药剂学组合物的情况下，本发明的药剂学组合物包含药剂学上可接受的载体。本发明的药剂学组合物中所包含的药剂学上可接受的载体为在制剂通常利用的载体，包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿胶、磷酸钙、藻酸盐、凝胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、丙基苯甲酸甲酯、滑石、硬脂酸镁以及矿油等，但并不局限于此。除了上述成分以外，本发明的药剂学组合物还可包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂等。优选地，药剂学上可接受的载体及制剂详细记载于雷明顿制药科学(Remington'sPharmaceutical Sciences，19th ed.，1995)。

本发明的药剂学组合物能够以口服或非口服方式进行给药，优选为利用口服给药方式。

本发明的药剂学组合物的合适的给药量能够根据制剂化方式、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应敏感性等因素，以多种方式进行处方。本发明的药剂学组合物的普通给药量为以成人为基准，在0.001mg/kg-1000mg/kg的范围内。

本发明的药剂学组合物根据本发明所属技术领域的普通技术人员可容易实施的方法，并利用药剂学上可接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，由此能够以单位容量形态制备或者内装于多容量容器内进行制备。此时，剂型可以是油性或者水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆剂或者乳化液形态，还可以是浸膏剂、散剂、粉末剂、颗粒剂、锭剂或者胶囊剂形态，还可以包含分散剂或者稳定化剂。

本发明的组合物可提供为功能性食品组合物。

具体地，本发明的组合物是食品学组合物，其包含：(a)本发明的龙眼肉提取物的食品学有效量；以及(b)食品学上可接受的载体。

本发明的组合物制备为食品组合物的情况下，作为有效成分不仅包含龙眼肉提取物，还包含制备食品时通常添加的成分，例如，包含蛋白质、碳水化合物、脂肪、营养素、调味剂及香味剂。上述碳水化合物的例子包含：单糖，例如葡萄糖、果糖等；二糖，例如麦芽糖、蔗糖、低聚糖等；以及多糖，例如糊精、环糊精等常规的糖以及木糖醇、山梨糖醇及赤藓糖醇等糖醇。作为香味剂可使用天然香味剂(索马甜、甜叶菊提取物(例如，莱鲍迪甙A、甘草素等))及合成香味剂(糖精、阿斯巴甜等)。例如，在本发明的食品组合物制备为保健饮料的情况下，除了本发明的龙眼肉提取物以外，还可包含柠檬酸、液态果糖、食糖、葡萄糖、醋酸、苹果酸、果汁、杜仲提取液、大枣提取液、甘草提取液等。

发明的效果

本发明的简要特征及优点如下：

(ⅰ)本发明提供利用龙眼肉提取物的骨疾病的预防、改善或治疗用组合物。

(ⅱ)本发明的组合物中作为有效成分的龙眼肉提取物向来用作中药材，因此安全性优秀。

附图说明

图1为示出从龙眼肉甲醇提取物制备多种分馏物的整个过程的图表。

图2是为了分析龙眼肉甲醇提取物对细胞的毒性而分析根据龙眼肉甲醇提取物的浓度的细胞生存率的图表。

图3a是为了分析Saos-2细胞中龙眼肉甲醇提取物的成骨细胞分化促进效果而测定根据龙眼肉甲醇提取物的浓度的碱性磷酸酶活性的图表。

图3b是为了分析MC-3T3-E1细胞中龙眼肉甲醇提取物的成骨细胞分化促进效果而测定根据龙眼肉甲醇提取物的浓度的碱性磷酸酶活性的图表。

图3c是为了分析MC-3T3-E1细胞中龙眼肉水或乙醇提取物的成骨细胞分化促进效果而对龙眼肉的水、30％乙醇或50％乙醇提取物进行处理后测定碱性磷酸酶活性的图表。

图3d是为了分析MC-3T3-E1细胞中龙眼肉水、乙醇提取物的成骨细胞分化促进效果而对多种浓度的龙眼肉水、乙醇提取物进行处理后测定碱性磷酸酶活性的图表。

图3e是示出MC-3T3-E1细胞中利用多种溶剂分析龙眼肉提取物的成骨细胞分化促进效果的图表。龙眼肉M是龙眼肉甲醇提取物，龙眼肉H是龙眼肉己烷分馏物，龙眼肉E是龙眼肉乙酸乙酯分馏物，龙眼肉D是龙眼肉二氯甲烷分馏物，龙眼肉B是龙眼肉丁醇分馏物。

图4a是为了分析C2C12细胞中在Wnt3a的存在下龙眼肉甲醇提取物的成骨细胞分化促进效果而测定根据龙眼肉甲醇提取物的浓度的碱性磷酸酶活性的图表。

图4b是为了分析MC-3T3-E1细胞中在Wnt3a的存在下龙眼肉甲醇提取物的成骨细胞分化促进效果而测定根据龙眼肉提取物的浓度的碱性磷酸酶活性的图表。

图5是为了分析利用龙眼肉提取物的成骨细胞的钙无机物的沉积而实施茜素红染色试验(Alizarin Red S assay)的图片。

具体实施方式

以下，通过实施例对本发明进行更详细地说明。这些实施例仅用于更具体地说明本发明，根据本发明的主旨，对于本发明所属技术领域的普通技术人员而言本发明的范围不局限于这些实施例是显而易见的。

实施例

实施例1：从龙眼肉制备甲醇提取物

对细致粉碎的龙眼肉(韩国京东市场)原材料20g中添加200ml的甲醇，在65℃进行4小时的一次回流提取之后，在常温下冷却30分钟，利用过滤纸(Whatman No.4filterpaper)来去除杂物。接着，利用减压浓缩机(冰冻干燥器，爱德华兹，美国(Freeze dryer，Edwards，USA))使过滤的提取液完全干燥，结果得到12.5g的浓缩物，提取效率为62.5％。之后，以适当浓度在蒸馏水中溶解完全干燥的浓缩物，并用于成骨细胞的分化促进试验。

实施例2：从龙眼肉制备水、乙醇提取物

将龙眼肉20g细致粉碎后，对粉碎物分别添加水、30％乙醇、50％乙醇或100％乙醇后，在100℃的温度下对水提取物进行6小时的一次回流提取，在90的温度下对30％乙醇、50％乙醇或100％乙醇提取物进行6小时的一次回流提取。使提取物冷却后进行过滤来去除杂质。接着，利用减压浓缩机使过滤的提取液进行完全干燥，算出最终干燥物的提取效率，水、30％乙醇、50％乙醇或100％乙醇提取物的提取效率分别为54.1％，59.5％，58.6％，57.2％。

实施例3：从龙眼肉制备甲醇提取物的分馏物

从龙眼肉甲醇提取物制备多种分馏物，整个制备过程如图1。将龙眼肉20g细致粉碎后，添加200ml的甲醇，在65℃的槽(bath)进行4小时的回流提取。利用减压浓缩机来在上述甲醇总提取液中完全去除溶剂后，分别添加200ml的己烷(Hexane)和蒸馏水(DW)，进行层分离来回收己烷层。利用回收后留下的残留水层，分别通过如下的方法制备分馏物。

对残留水层添加200ml的乙酸乙酯(Ethyl acetate)，通过相同的方法进行层分离来回收乙酸乙酯层。对残留水层添加200ml的二氯甲烷(Dichloromethane)并进行层分离来回收二氯甲烷层。对残留水层添加200ml的丁醇(n-Butanol)并进行层分离来回收丁醇层和水层。

为了算出不同溶剂的提取效率，对各个步骤中获得的分馏物进行减压干燥，以浓缩物的重量为基准算出提取效率(表1)。

表1

提取溶剂	浓缩物重量(g)	提取效率(yield)
			甲醇	12.5	62.5％
丁醇	0.16	2.8％
			二氯甲烷	0.08	0.4％
乙酸乙酯	0.1	0.5％
			己烷	0.14	0.7％

实施例4：龙眼肉提取物的细胞毒性测定

试验中所使用的C2C12细胞株来自韩国细胞株银行(KCLB)。C2C12细胞的培养所需的培养基使用杜尔伯科改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagles medium，DMEM)，培养基中添加的抗生剂(120μg/ml青霉素、200μg/ml链霉素)及胎牛血清(fetal bovineserum，FBS)使用海克隆(Hyclon，Logan，UT)的产品，在37℃、5％的CO₂条件下进行培养。

将C2C12细胞以2×104/孔分株在96孔板(Greiner bio-one)并培养24小时后，分别以0.1％、0.5％及1.0％浓度处理龙眼肉甲醇提取物(50㎎/ml)。之后再培养48小时后，使用细胞生存率分析试剂盒(Luminescent Cell Viability Assay kit，Promega)分析细胞生存率。利用VICTORTMX3(珀金埃尔默，PerkinElmer)测定发光，以百分比表示对照组的细胞生存率。试验结果，将龙眼肉甲醇提取物的浓度提高至1.0％处理也对细胞生存率几乎没有影响(图2)。由此确认到本发明的龙眼肉甲醇提取物至少1.0％的浓度细胞无毒性。

实施例5：测定利用龙眼肉提取物的成骨细胞分化促进效果

为了测定通过多种方法测定的龙眼肉提取物的成骨细胞分化促进效果，分析了在细胞株中利用龙眼肉提取物的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的活性变化。碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)存在于所有组织，尤其在骨组织中存在的碱性磷酸酶的活性在骨成长活泼时会增加，因此碱性磷酸酶的活性用作得知成骨细胞的活性的生物标记。对作为骨癌(osteosarcoma)的Saos-2细胞株及作为成骨细胞前体(osteoblastprecursor)的MC-3T3-E1细胞株进行龙眼肉提取物处理后，测定碱性磷酸酶活性来分析龙眼肉提取物对成骨细胞的活性产生的影响。

实验中所使用的Saos-2细胞株及MC-3T3-E1细胞株来自韩国细胞株银行(KCLB)。Saos-2细胞的培养所需的培养基使用RPMI1640培养基，培养基中添加的抗生剂(120μg/ml青霉素、200μg/ml链霉素)及胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)使用海克隆(Hyclon，Logan，UT)的产品，MC-3T3-E1细胞的培养所需的MEM-α培养基使用赛默飞世尔(LifeTechnologies)的产品。所有细胞都在37℃、5％的CO2条件下进行培养。

将Saos-2细胞或MC-3T3-E1细胞以2×104/孔分别分株在96孔板(Greiner bio-one)并培养24小时后，利用多种方法提取的龙眼肉提取物进行处理。之后再培养72小时后，去除培养基并使用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗一次后，利用被动裂解液(Passive lysisbuffer，Promega)使细胞溶解30分钟。使用Phospha-LightTM报告基因检测系统(ReporterGene Assay System)(美国应用生物系统公司，Applied Biosystem)来分析溶解的上清液的碱性磷酸酶活性。利用VICTORTMX3(PerkinElmer)测定发光。此时，细胞数的差异可能影响碱性磷酸酶活性度，因此利用剩下的上清液实施蛋白质定量，利用蛋白质浓度补正来算出碱性磷酸酶活性度。

以0.5％、1％的浓度处理实施例1的龙眼肉甲醇提取物(50mg/ml)的情况下，确认到Saos-2细胞(图3a)及MC-3T3-E1细胞(图3b)均浓度依赖性地促进碱性磷酸酶活性。

实施例2中制备的龙眼肉提取物(50mg/ml)或30％、50％乙醇提取物(50mg/ml)分别以最终浓度0.2％、0.5％处理，其结果，在MC-3T3_E1细胞可确认到碱性磷酸酶的促进活性增加1.5-2倍(图3c)。为了进而分析水或乙醇提取物的效果，利用多种浓度的水或乙醇(100％)提取物处理MC-3T3_E1细胞后，测定了碱性磷酸酶活性(图3d)。分析结果，确认到水或乙醇(100％)提取物的情况下，均浓度依赖性地促进碱性磷酸酶活性。

并且，实施例3中制备的龙眼肉己烷分馏物(50mg/ml)、乙酸乙酯分馏物(50mg/ml)及二氯甲烷分馏物(50mg/ml)分别以最终浓度0.5％处理，其结果，在MC-3T3-E1细胞可确认到碱性磷酸酶的促进活性增加(图3e)。

这种结果表示使用多种溶剂提取的龙眼肉提取物或分馏物对成骨细胞的分化促进有效果。

实施例6：测定Wnt3a的存在下利用龙眼肉甲醇提取物的成骨细胞分化促进效果

为了测定据知为对骨细胞的分化起到重要作用的Wnt信号传递机制和龙眼肉提取物之间的协同效应，对C2C12细胞株及MC-3T3-E1细胞株同时处理龙眼肉提取物和包含Wnt3a的培养基，并测定了碱性磷酸酶活性。

试验中所使用的C2C12细胞株、MC-3T3-E1细胞株及分泌Wnt3a的L细胞株来自韩国细胞株银行(KCLB)。C2C12细胞及MC-3T3-E1细胞以如上所示的方式培养。分泌Wnt3a的L细胞株利用包含10％的胎牛血清的杜尔伯科改良伊格尔培养基来培养4天后，收集培养液并利用0.22-㎜过滤器进行灭菌。利用新鲜的培养基替换再培养3天之后，收集培养液并利用0.22-㎜过滤器进行灭菌，与之前收集的培养液混合来制备Wnt3a条件培养基(CM，conditioned media)。

将C2C12细胞或MC-3T3-E1细胞以2×104/孔分别分株在96孔板(Greiner bio-one)并培养24小时后，利用0.5％及1.0％龙眼肉提取物和通过上述方法制备的Wnt3a条件培养基(CM，conditioned media)进行处理。之后再培养72小时后，去除培养基并使用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗一次后，利用被动裂解液(Passive lysis buffer，Promega)使细胞溶解30分钟。使用Phospha-LightTM报告基因检测系统(Reporter Gene Assay System)(美国应用生物系统公司，Applied Biosystem)来分析溶解的上清液的碱性磷酸酶活性。利用VICTORTMX3(PerkinElmer)测定发光。此时，细胞数的差异可能影响碱性磷酸酶活性度，因此利用剩下的上清液实施蛋白质定量，利用蛋白质浓度补正来算出碱性磷酸酶活性度。试验结果，对MC-3T3-E1细胞仅利用Wnt3a处理的情况下碱性磷酸酶活性的增加程度微乎其微，然后与实施例1的龙眼肉甲醇提取物一同处理的情况下，与对照组相比碱性磷酸酶活性增加将近5倍(图4a)。对C2C12细胞仅利用Wnt3a处理的情况下碱性磷酸酶活性的增加程度微乎其微，然后与实施例1的龙眼肉甲醇提取物一同处理的情况下，与对照组相比碱性磷酸酶活性增加将近2倍(图4b)。这种结果表示龙眼肉提取物在MC-3T3-E1细胞及C2C12细胞存在Wnt3a的情况下也促进碱性磷酸酶的活性，即，表示龙眼肉提取物在Wnt信号传递机制作用的情况下也可促进成骨细胞的分化。

实施例7：评价利用龙眼肉甲醇提取物的成骨细胞的钙沉积(茜素红染色)

为了分析利用龙眼肉提取物的成骨细胞的钙无机物沉积，对MC-3T3-E1细胞处理多种浓度(0％、0.1％、0.5％、1.0％)的龙眼肉甲醇提取物之后，使细胞培养20天后，利用相差显微镜观察钙化结节。并且，为了确认成骨细胞的分化与否，利用阴性对照组来分析未包含分化培养基的情况。为了重新确认在显微镜上观察的结节是否为钙化结节，利用如下的方法实施茜素红染色试验。利用3.7％甲醛溶液(formaldehyde)固定MC-3T3-E1细胞后，利用2％茜素红染色溶液(10％的氢氧化铵(ammonium hydroxide)，PH为4.2)对所固定的细胞进行20分钟的染色，利用三次蒸馏水清洗后，肉眼与对照组比较观察红色的钙化结节形成与否。分析结果，阴性对照组几乎观察不到钙化结节，未处理龙眼肉的细胞分化对照组及龙眼肉提取物0.1％或0.5％的处理组观察到的结节程度不显著。然而，在龙眼肉提取物1.0％处理组的情况下，可确认到与对照组相比结节程度大大增加。通过这种结果可确认到龙眼肉提取物具有在成骨细胞增加钙无机物沉积且增加骨分化的效果(图5)。

以上，详细说明了本发明的特定部分，对于本发明所属技术领域的普通技术人员而言，这些具体的说明仅作为优选实例，本发明的范围并不局限于此是显而易见的。因此，应视为本发明的实质性范围根据所附的发明要求保护范围及其等同物来定义。

Claims (11)

1.一种骨疾病的预防、改善或治疗用组合物，其特征在于，包含龙眼肉提取物或其分馏物作为有效成分。

2.根据权利要求1所述的骨疾病的预防、改善或治疗用组合物，其特征在于，上述骨疾病为骨质疏松症、骨石化病、骨硬化病、关节炎、派杰氏病、代谢性骨疾病、多发性骨髓瘤、牙周病或成骨不全症。

3.根据权利要求1所述的骨疾病的预防、改善或治疗用组合物，其特征在于，上述骨疾病为骨质疏松症。

4.根据权利要求1所述的骨疾病的预防、改善或治疗用组合物，其特征在于，上述骨疾病的预防、改善或治疗用组合物为药剂学组合物。

5.根据权利要求1所述的骨疾病的预防、改善或治疗用组合物，其特征在于，上述骨疾病的预防、改善或治疗用组合物为功能性食品组合物。

6.一种骨健康改善用功能性食品组合物，其特征在于，包含龙眼肉提取物或其分馏物作为有效成分。

7.一种骨疾病的预防、改善或治疗方法，其特征在于，包括向对象给药包含龙眼肉提取物或其分馏物的有效量的组合物的步骤。

8.根据权利要求7所述的骨疾病的预防、改善或治疗方法，其特征在于，上述骨疾病为骨质疏松症、骨石化病、骨硬化病、关节炎、派杰氏病、代谢性骨疾病、多发性骨髓瘤、牙周病或成骨不全症。

9.根据权利要求7所述的骨疾病的预防、改善或治疗方法，其特征在于，上述骨疾病为骨质疏松症。

10.根据权利要求7所述的骨疾病的预防、改善或治疗方法，其特征在于，上述组合物为药剂学组合物。

11.根据权利要求7所述的骨疾病的预防、改善或治疗方法，其特征在于，上述组合物为功能性食品组合物。