KR20130058791A

KR20130058791A - 골다공증의 예방 및 개선 효과가 있는 형개 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품

Info

Publication number: KR20130058791A
Application number: KR1020110124721A
Authority: KR
Inventors: 김복득; 이주엽; 이양범; 김성용
Original assignee: 주식회사 진생사이언스
Priority date: 2011-11-28
Filing date: 2011-11-28
Publication date: 2013-06-05

Abstract

본 발명은 형개(Schizonepeta tenuifolia var. japonica)의 추출물을 유효성분으로 함유하는 발육 성장 촉진용 또는 골다공증의 예방 및 개선을 위한 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 형개 추출물은 골세포의 분열능, 알칼리 포스파타아제(Alkaline phosphatase) 활성, 콜라겐 합성 측정을 통해 골형성 증가 활성이 탁월함을 확인함으로써, 발육 성장 촉진용 또는 골다공증의 예방 및 개선용 건강기능식품에 이용될 수 있다.

Description

골다공증의 예방 및 개선 효과가 있는 형개 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품 {Health functional food comprising the extract of Schizonepeta tenuifolia var. japonica for preventing and treating osteoporosis}

본 발명은 골다공증의 예방 및 개선 효과가 있는 형개 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품에 관한 것이다.

[문헌 1] 동의 신계학(下), 두호경, 성보사, p.1239, p.1241, p.1243, p.1248, 2003.

[문헌 2] 대한병리학회 : 병리학 PATHOLOGY, 고문사, pp.1001~1008, 2000.

[문헌 3] Glucocorticoid-induced osteoporosis., Trends Endocrinol . Metab., Manelli, F. and Giustina, A., 11, pp.79~85, 2000.

[문헌 4] Canalis E., Mechanisms of glucocorticoid Action in Bone: Implications to glucocorticoid- induced Osteoporosis. J. Clin . Endocri . Met., 81, pp.3441-3447, 1996.

[문헌 5] Perspectives on glucocorticoid-induced osteoporosis., Bone, Canalis, E. et al., 34, pp593-598, 2004.

[문헌 6] Zhang YH, et al., Studies on chemical constituents in spikes of Schizonepeta tenuifolia . Zhongguo Zhong Yao Za Zhi., 31(15), pp1247-57, 2006 Aug.

[문헌 7] Tohda C, et al., Inhibitory effects of methanol extracts of herbal medicines on substance P-induced itch-scratch response. Biol Pharm Bull., 23(5), pp599-601, 2000.

[문헌 8] Park IK. et al., Fumigant activity of plant essential oils and components from Schizonepeta tenuifolia against Lycoriella ingenua ( Diptera : Sciaridae ). J Econ Entomol., 99(5), pp1717-21, 2006 Oct.

[문헌 9] Harborne J.B., A guide to modern techniques of plant analysis. 3, pp 6-7, 1998.

[문헌 10] Kapur S, Mohan S, Baylink DJ, Lau KH. Fluid shear stress synergizes with insulin-like growth factor-I (IGF-I) on osteoblast proliferation through integrin-dependent activation of IGF-I mitogenic signaling pathway. J Biol Chem. 2005;280(20):20163-70.

골은 골 형성 세포인 조골세포(osteoblast)와 골 흡수 세포인 파골세포(osteoclast) 및 골세포(osteocyte)에 의해 끊임없이 형성되고 흡수되는 동적인 조직(dynamic tissue)이다. 골다공증은 파골 세포의 기능 및 작용 시간 증가, 또는 조골 세포의 기능 및 작용 시간 감소와 같이 골 형성이 골 흡수보다 상대적으로 저하되어 나타난다(동의 신계학(下), 두호경, 성보사, p.1239, p.1241, p.1243, p.1248, 2003).

골다공증은 발병원인에 따라 에스트로겐 결핍으로 인한 I형 골다공증, 노인성인 II형 골다공증, 약물 및 기타 질병으로 인한 속발성 골다공증으로 나눌 수 있다. 여성 폐경기 이후에 나타나는 I형 골다공증에서는 에스트로겐 결핍으로 파골세포에 대한 부갑상선 호르몬(PTH)의 작용이 증가되어 골 기질물질의 파괴와 칼슘 흡수가 증가된다. 이로 인해 높아진 혈중 칼슘은 피드백(feedback) 억제를 통해 PTH 유리가 억제하고, 동시에 Vit D 활성형인 1,25(OH)D 감소와 장내 칼슘 흡수 감소를 가져온다. 한편, 노인성 골다공증인 II 형 골다공증의 원인으로는 신장에서의 Iα-수산화효소 활성 감소와 Vit D의 활성화 감소 및 그에 따른 장내 칼슘 흡수의 저하, PTH 증가가 그 원인으로 알려져 있다 (대한병리학회 : 병리학 PATHOLOGY, 고문사, pp.1001~1008, 2000).

골다공증의 주요한 원인중 하나인 속발성인 경우, 주로 부신피질호르몬 투여로 나타나는데(자가면역질환, 호흡기계 질환, 소화기계 질환, 장기이식, 종양 환자 등 부신피질호르몬이 쓰이는 질병에서 골다공증이 지속적으로 증가된 보고가 있다(Glucocorticoid-induced osteoporosis., Trends Endocrinol. Metab ., Manelli, F. and Giustina, A., 11, pp.79~85, 2000). 부신피질호르몬은 조골세포(osteoblast)에 작용하여 세포 증식을 억제시키고 조골세포 분화를 감소시킨다. 또한, 부신피질호르몬은 골세포 증식능을 증가시키는 성장 인자인 IGF-I(insulin like growth factor I), IGF-II(insulin like growth factor II), PDGF(platelet derived growth factor), IGFBP-5 등을 억제시키는 것으로 보고되었다(Canalis E., Mechanisms of glucocorticoid Action in Bone: Implications to glucocorticoid-induced Osteoporosis. J. Clin . Endocri . Met., 81, pp.3441-3447, 1996). 이 결과, 비교원질 단백질로 칼슘과 결합하는 오스테오칼신(osteocalcin) 생합성과 교원질인 콜라겐 합성 억제와 골 형성이 저하된다. 이와는 별도로, 부신피질호르몬은 파골세포(osteoclast) 에 작용하여 세포분화를 촉진하고, 교원질 분해효소(collagenase)를 활성화시켜 골 재흡수(bone resoprtion)를 증가시킨다. 또한, 부신피질호르몬은 Vit D 작용을 억제하고 PTH 분비를 촉진하여, 장관내 칼슘 흡수 억제, 신 세뇨관 칼슘 재흡수 억제, 뼈에 칼슘 침착을 억제하여 골다공증을 유발할 수 있다(Perspectives on glucocorticoid - induced osteoporosis ., Bone , Canalis, E. et al., 34, pp593-598, 2004).

형개(Schizonepeta tenuifolia var. japonica)의 성미는 성온(性溫) 무독(無毒)하고 신미(辛味)하다고 알려져 있다. 주성분은 정유성분으로 d-멘톤(d-menthone), d1-멘톤(dl-menthone)과 소량의 d-레모넨(d-limonene)이 있으며, 그 밖에 헤페리딘(heperidine), 우르손(ursolic acid), 루테올린(luteolin), 다우세스테롤(daucesterol)등이 보고되었다(Zhang YH, et al., Studies on chemical constituents in spikes of Schizonepeta tenuifolia . Zhongguo Zhong Yao Za Zhi., 31(15), pp1247-57, 2006).

최근에는 형개 추출물이 항히스타민 작용과 항소양증 작용을 나타낸다고 보고되었고(Tohda C, et al., Inhibitory effects of methanol extracts of herbal medicines on substance P- induced itch-scratch response . Biol Pharm Bull ., 23(5), pp599-601, 2000 May), 주성분인 필수지방은 항충작용 및 항진균 작용을 나타내었다(Park IK. et al., Fumigant activity of plant essential oils and components from Schizonepeta tenuifolia against Lycoriella ingenua ( Diptera : Sciaridae). J Econ Entomol ., 99(5), pp1717-21, 2006 Oct).

본 발명자들은 골다공증 예방 및 치료 방법을 개발하기 위하여, 부신피질호르몬에 의해 감소되는 조골세포의 기능을 활성화시켜 골 형성을 증가시키는 약물을 찾고자 하였다. 이를 위하여 랫드의 두개골로부터 분리 배양한 골세포에 각각 형개 추출물 부탄올 분획을 투여한 후, 조골세포의 분열능과 골형성을 나타내는 생화학적 지표에 미치는 영향을 측정하였고, 골세포에서의 분열능 증가, 알칼리 포스파타아제 활성 및 콜라겐 합성량 증가 효과를 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 형개의 조추출물, 극성용매 가용추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 유효성분으로 함유하는 발육 성장 촉진용 또는 골다공증의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 조추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 메탄올에 가용한 추출물을 의미한다.

본원에서 정의되는 극성용매 가용 추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 부탄올에 가용된 추출물이고, 비극성용매 가용추출물은 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 글리세린, 부틸렌글리콜, 바람직하게는 클로로포름에 가용한 추출물을 의미한다.

이하, 본 발명의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성 용매 가용 추출물을 수득하는 방법을 상세히 설명한다.

본 발명의 형개의 조추출물은, 건조된 형개을 세절하여 무게(㎏)의 약 1배 내지 20배, 바람직하게는 약 5배 내지 15배의 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 메탄올로, 20℃ 내지 100℃, 바람직하게는 50℃ 내지 100℃의 추출온도에서 약 0.5 내지 20시간, 바람직하게는 약 1 내지 10시간 동안 냉침, 열수추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출방법을 이용하여, 바람직하게는 환류 추출한 후, 수득한 추출액을 여과, 감압농축 또는 건조하여 수득할 수 있다.

또한 본 발명의 비극성 용매 가용 추출물은 상기 조추출물을 증류수에 현탁한 후, 이를 현탁액이 약 1 내지 100배, 바람직하게는 약 1 내지 5배 부피의 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 바람직하게는 클로로포름과 같은 비극성 용매를 가하여 1회 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 5회 비극성용매 가용층을 추출, 분획하여 비극성 용매에 가용한 비극성용매 가용 추출물을 얻고, 극성용매에 가용한 극성용매 가용 추출물을 분리할 수 있다. 또한 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다(Harborne J.B., A guide to modern techniques of plant analysis . 3, pp 6-7, 1998).

상기와 같은 방법으로 수득한 형개 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물은 랫드의 두개골로부터 분리 및 배양한 골세포에서 분열능 증가, 알칼리 포스파타아제 활성 및 콜라겐 합성량 증가 효과를 나타냄으로써, 발육 성장 촉진용 또는 골다공증의 예방 및 개선 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

본 발명은 상기 제조방법으로 얻어지는 형개 추출물을 유효성분으로 함유하는 발육 성장 촉진용 또는 골다공증의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 발육 성장 촉진용 또는 골다공증의 예방 및 치료용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50% 중량으로 포함한다.

그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 형개 추출물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 발육 성장 촉진용 또는 골다공증의 예방 및 개선 효과를 나타내는 형개의 조추출물, 극성용매 또는 비극성용매 가용추출물을 유효성분으로 함유하는 발육 성장 촉진용 또는 골다공증의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 발육 성장 촉진용 또는 골다공증의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 형개의 극성용매 및 비극성용매 가용추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 형개의 조추출물, 극성용매 또는 비극성용매 가용추출물 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명의 상기 추출물은 발육 성장 촉진용 또는 골다공증의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 형개 추출물은 랫드의 두개골로부터 분리 및 배양한 골세포에서의 분열능 증가, 알칼리 포스파타아제 활성 및 콜라겐 합성량 증가 효과를 나타냄으로써, 발육 성장 촉진용 또는 골다공증의 예방 및 개선용 건강기능식품에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 형개 추출물(ST) 처리 시, 골세포 분열능을 측정하여 나타낸 도이고,
도 2는 본 발명의 형개 추출물(ST) 처리 시, 알칼리 포스파타아제 활성을 측정하여 나타낸 도이며,
도 3은 본 발명의 형개 추출물(ST) 처리 시, 콜라겐 합성량을 측정하여 나타낸 도이고,
도 4는 본 발명의 형개 추출물(ST) 처리 시, 골세포의 세포 생존율을 측정하여 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 형개 조추출물의 제조

1-1. 형개 메탄올 추출물의 제조

경원대학교 한방병원에서 얻은 형개 100g에 메탄올 1,000ml를 가하고 6시간 이상 가열하여 환류추출하였다. 여과지를 이용하여 여과한 다음, 여액을 증발기(EYERA, 일본)를 이용하여 감압 농축한 다음 건조하여 형개 메탄올 추출물 18g을 얻었다(수득률 : 18%).

실시예 2. 형개 비극성용매 및 극성용매 가용 추출물의 제조

2-1. 형개 부탄올 가용 추출물의 제조

상기 실시예 1-1의 메탄올 가용 추출물 18g을 물 500 ml에 녹여 클로로포름으로 3회 추출, 분획하고, 다시 남은 층(상층액)을 부탄올로 3회 추출, 분획하고, 부탄올 가용층을 합한 다음, 회전증발기로 용매를 증발시켜 부탄올 가용 추출물 5.7g을 얻었고(수득률 : 5.7%), 동결 건조하여 실험 대상에 적용할 때까지 -20℃에서 냉동보관 하였다. 실험시 검액(부탄올 추출분획 분말)을 배지에 녹인 후 크기 (pore size) 0.45μm의 여과지에 통과시킨 후 실험예의 시료로 사용하였다(이하, "ST"라 함).

참조예 1. 실험동물의 준비

실험동물은 임신한 암컷 S.D. 랫드를 대한 바이오링크에서 구입하여 실험실에 적응시킨 후 사용하였다. 실험기간동안 고형사료와 물을 충분히 공급하여 자유롭게 섭취하도록 하였다.

참조예 2. 약물 처리

상기 실시예 2-1에서 수득한 형개 부탄올 추출물 시료(ST)를 정상군(NC), 정상군에 1μg/ml의 ST를 첨가한 군(ST1), 정상군에 10μg/ml의 ST를 첨가한 군(ST10)으로 나누어 투여하였고, 이를 실험예에서 사용하였다.

참조예 3. 태아 두개골 세포 배양 (Fetal calvarial cell culture ( FCS ))

임신 21일 된 쥐의 자궁을 절개하여 태아를 꺼낸후, 후두부를 절개하고 두개골을 적출하였다. 두개골에 붙어있는 결체조직을 제거하고, HBSS로 세척했다. 두개골을 1.5ml의 콜라게나아제, 트립신, 0.5mM EDTA 용액에 넣어 37^oC에서 반응시켰다. 상등액을 취하여 500rpm에서 원심분리하여 침전된 골세포를 얻었다. PBS에 재현탁하여 1500rpm에서 원심분리하여 세척한 후, 이를 DMEM 배지에 넣어 현탁한 후 37^oC, 5% CO₂에서 배양하였다. 상등액을 제거하고 남은 두개골에 다시 1.5ml의 효소를 넣고, 상기 반응을 수회 반복하였다. 세포의 배지는 3일에 한 번씩 교환하였다. 배양한 세포는 2주후 트립신 처리하여 세포수를 측정한 후 실험에 사용하였다.

참조예 4. 통계처리

모든 실험 결과는 ANOVA(one way analysis of variance)를 이용하여 통계 처리하였고, 유의성이 인정될 경우 스튜던트-뉴만-케울스 검정법(Student-Newman-Keuls Test)을 사용하여 p < 0.05 수준 이하에서 유의성 검정을 실시하였다.

실험예 1. 골세포의 분열능 측정

상기 실시예 2-1에서 얻은 ST의 골세포 분열능 효과를 알아보기 위해 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Kapur S. et al., Fluid shear stress synergizes with insulin-like growth factor-I (IGF-I) on osteoblast proliferation through integrin-dependent activation of IGF-I mitogenic signaling pathway. J Biol Chem. 2005).

상기 참조예 3에서 수득한 태아 두개골 세포(FCS)의 경우 1.0-3.010⁵/웰로 나누었으며, 배양한 세포의 수를 세기 위하여 세포의 배지를 제거하고, HBSS로 세포를 세척하였다. 이후 콜라게나아제, 트립신, 0.5mM EDTA를 가하여 세포를 배양판으로부터 분리하였다. 세포를 Isoton-2 용액을 이용하여 20배 희석한 후 세포계수기(sysmax F-820)로 세포의 수를 측정하였고, 결과를 하기 도 1에 나타내었다 (하기 도 1 참조).

실험결과, 하기 도 1에서 나타나는 바와 같이, 랫드 태자의 두개골로부터 분리한 골세포를 10일간 배양한 결과, 정상 세포는 23.67x10⁵/웰이었으며, 1μg/ml의 ST를 처리한 경우에는 34.83x10⁵/웰로서 유의적인 증가를 나타내었다. 10μg/ml의 ST를 처리한 경우에는 33.83x10⁵/웰로서 정상에 비해 유의한 증가를 나타냄을 확인할 수 있었다.

실험예 2. 알칼리 포스파타아제( Alkaline phosphatase ) 활성 측정

상기 실시예 2-1에서 얻은 ST의 알칼리 포스파타아제 활성을 측정하기 위해 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Kapur S. et al., Fluid shear stress synergizes with insulin-like growth factor-I (IGF-I) on osteoblast proliferation through integrin-dependent activation of IGF-I mitogenic signaling pathway. J Biol Chem. 2005).

세포를 배양한 배양판을 냉각한 PBS로 세척한 후 세포를 스크레이퍼(scraper)로 긁어 내어 류펩틴(Leupeptin)이 함유된 냉각된 PBS에 현탁하였다. 이 현탁액을 냉각상태에서 초음파 분쇄기로 분해한 후 3000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리후 상등액을 취하여 0.56M 2-아미노-메틸 1-프로판올(2-amino-2-methy l-propanol), 1mM 염화마그네슘(MgCl₂ ₎, 10mM p-니트로페닐포스페이트(p-nitrophenylphosphate)를 함유한 반응액과 37^oC에서 10분간 반응시켰다. 0.2N 수산화나트륨(NaOH) 1ml를 가하여 반응을 중단시킨 후 405nm에서 흡광도를 측정하였고, 실험결과를 하기 도 2에 나타내었다 (하기 도 2 참조).

실험결과, 하기 도 2에서 나타나는 바와 같이, 랫드 태자의 두개골로부터 분리한 골세포를 10일간 배양한 결과, 정상 세포에서의 ALP 활성은 12.33unit/ml 이었으며, 1μg/ml의 ST를 처리한 경우에는 16.83unit/ml로서 유의적인 증가를 나타내었다. 10μg/ml의 ST를 처리한 경우에도 17.5unit/ml로서 정상에 비해 증가함을 확인할 수 있었다.

실험예 3. 콜라겐 합성량 측정

상기 실시예 2-1에서 얻은 ST의 콜라겐 합성량을 측정하기 위해 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Kapur S. et al., Fluid shear stress synergizes with insulin-like growth factor-I (IGF-I) on osteoblast proliferation through integrin-dependent activation of IGF-I mitogenic signaling pathway. J Biol Chem. 2005).

세포를 배양한 배양판을 PBS로 세척한 후 스크레이퍼(scraper)를 이용해 세포를 긁어내었다. 이를 5mM dithiothreitol이 함유된 50mM 트리스 완충용액에 현탁시킨 후 초음파 분쇄기로 분해시켰다. 이후, 100,000xg에서 30분간 원심분리하여 상등액을 제거한 후 펠렛에 6N HCl을 가하여 24시간동안 100^oC에서 가수분해 하였다. 이를 조심스럽게 6N 수산화나트륨(NaOH)으로 중화시킨 후, 물을 이용하여 적정한 농도로 희석하였다. 히드록시프롤린(Hydroxy-proline)은 아미노산 분석기(amino acid analyzer)를 이용하여 정량하였다.

실험결과, 하기 도 3에서 나타나는 바와 같이, 랫드 태자의 두개골로부터 분리한 골세포를 10일간 배양한 결과, 정상 세포에서의 콜라겐 생합성량은 2.0μg/웰이었으며, 1μg/ml의 ST를 처리한 경우에는 2.15μg/웰로서 약간 증가하는 경향을 나타내었다. 10μg/ml의 ST를 처리한 경우에는 2.5μg/웰로서 합성량을 증가시킴을 확인할 수 있었다(하기 도 3 참조).

실험예 4. 세포 생존율 측정

상기 실시예 2-1에서 얻은 ST의 세포 생존율을 측정하기 위해 MTT assay 방법을 이용하여 실험을 수행하였다

측정 결과, 하기 도 4에서 나타나는 바와 같이, 랫드 태자의 두개골로부터 분리한 골세포를 10일간 배양한 결과, 정상 세포에서의 생존율은 0.535 이었으며, 1μg/ml의 ST를 처리한 경우에는 0.51로서 약간의 감소하였으며, 10μg/ml의 ST를 처리한 경우에는 0.54이었으나 통계적으로 유의성은 없음을 확인할 수 있었다(하기 도 4 참조).

하기에 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

실시예 2-1의 ST 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

실시예 2-1의 ST 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

실시예 2-1의 ST 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 액제의 제조

실시예 2-1의 ST 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 5. 건강 식품의 제조

실시예 2-1의 ST 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 6. 건강 음료의 제조

실시예 2-1의 ST 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims

형개의 추출물을 유효성분으로 함유하는 발육 성장 촉진용 또는 골다공증의 예방 및 개선용 건강기능식품.
제 1항에 있어서, 상기 추출물은 형개의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물임을 특징으로 하는 건강기능식품.
제 2항에 있어서, 상기 조추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매에 가용한 추출물인 건강기능식품.
제 2항에 있어서, 상기 극성용매 가용 추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매에 가용한 추출물인 건강기능식품.
제 2항에 있어서, 상기 비극성용매 가용 추출물은 헥산, 클로로포름, 또는 에틸아세테이트로부터 선택된 용매에 가용한 추출물인 건강기능식품.
제 1항에 있어서, 조성물 총 중량에 대하여 상기 형개 추출물을 0.1 내지 50% 중량으로 포함됨을 특징으로 하는 건강기능식품.
제 1항에 있어서,
상기 건강기능식품은 산제, 정제, 칼셀제, 액상제제 제형인 건강기능식품.